Сравнительный анализ нейротоксического действия изоформ зервамицина из гриба

Дьяченко, Игорь Александрович

Диссертации по медицине → Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Сравнительный анализ нейротоксического действия изоформ зервамицина из гриба

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Дьяченко, Игорь Александрович Старая Купавна 2009 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.25

Автореферат диссертации по медицине на тему Сравнительный анализ нейротоксического действия изоформ зервамицина из гриба

На правах рукописи

ДЬЯЧЕНКО Игорь Александрович

сравнительный анализ неиротоксического действия изоформ зервамицина из гриба ЕтепсеИорягв ясйтоБуппетШа

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 С -'О1'

Старая Купавна - 2009

003472688

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (г. Москва), Филиале Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (г. Пущино) и Пущинском государственном университете

Научные руководители:

доктор биологических наук Мурашев Аркадий Николаевич кандидат химических наук Овчинникова Татьяна Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Яворский А.Н. доктор медицинских наук, профессор Каркищенко H.H.

Ведущая организация:

Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Зашита состоится «_»_2009 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 217.004.01 при ОАО «Всероссийский научный центр биологически активных веществ» по адресу: 142450, Московская область, г. Старая Купавна, ул. Кирова 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОАО «ВНЦ БАВ»

Автореферат разослан " "_2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Корольченко Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Антибиотики являются уникальной группой лекарственных средств, которые наряду с вакцинацией, больше, чем какие-либо другие, повлияли на продолжительность жизни человека. (Страчунский и др., 2007). Развитие резистентности микроорганизмов к антибиотикам требует постоянного пополнения их арсенала (Сидоренко и др., 2002). Таким образом, поиск новых антибиотиков является важной задачей современной фармакологии.

В 1973 Argoudelis и Johnson получили патент на новые антибиотики, выделенные из гриба Emericellopsis salmosynnemata, которые были названы зервамицинами. Зервамицины относятся к пептаиболам - пептидам, содержащим в своей структуре а,а-диалкиламинокислоты, например, а-аминоизомасляную кислоту, и С-концевые аминоспирты. Изучение биологических свойств зервамицинов показало, что они обладают не только выраженной активностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий (Argoudelis et al., 1974; Jen et al., 1987), но и проявляют антипротозойное действие по отношению к устойчивым формам возбудителя малярии Plasmodium falciparum (Nagaraj et al., 2001). Это позволяет рассматривать их как потенциальные антибиотические лекарственные средства. Однако, из культур различных штаммов гриба Emericellopsis salmosynnemata было выделено до 11 изоформ зервамицинов, среди которых преобладающими являлись зервамицин ПА (Zrv-IIA) и зервамицин ПВ (Zrv-,ПВ) (Argoudelis et al., 1974). Получение чистых изоформ зервамицинов является сложной методической задачей. В настоящее время такие работы проводятся под руководством Т.В.Овчинниковой в Институте биоорганической химии РАН.

Известно, что побочным действием антибиотиков является их влияние на центральную нервную систему (Сергеев и Шимановский, 1987). Было показано, что антибиотик-пептаибол ампуллоспорин из гриба Sepedonium ampullosporum снижает двигательную активность у экспериментальных животных (Ritzau et el., 1997). Влияние на поведение животных было обнаружено также и у зервамицина (Ovchinnikova et al., 2007; Овчинникова и Мурашев, 2007), однако, результаты данных работ не позволяют однозначно интерпретировать их воздействие на нервную систему. В связи с этим, нами было сделано предположение, что изменения в поведении животных под влиянием зервамицина могут быть связаны с их нейротоксическим действием. Таким образом, важность проведения комплексных исследований по изучению нейротоксических свойств зервамицина не вызывает сомнений.

Zrv-IIA и Zrv-IIB по своей структуре отличаются друг от друга только одним аминокислотным остатком в четвертом положении, поэтому исследования их нейротоксических свойств позволят расширить наши знания о фундаментальной проблеме - изучению зависимости токсичности фармакологических веществ от их структуры.

Цель и задачи работы

Целью данной работы явилось проведение сравнительного анализа нейротоксического действия двух изоформ зервамицина (Zrv-IIA и Zrv-IIB), выделенных из гриба Emericellopsis salmosynnemata.

Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: .

1) определить ЛД50 и максимальную толерантную дозу для Zrv-ПА и Zrv-IIB при однократном внутрибрюшинном введении мышам CD-I;

2) провести сравнительную оценку нейротоксического действия Zrv-IIA и Zrv-IIB на мышах CD-I, используя тест Ирвина;

3) оценить влияние зервамицинов на двигательную активность с помощью установки «ОРТО-VARIMEX» у мышей CD-I;

4) изучить влияние Zrv-IIA и Zrv-IIB на болевую чувствительность в тесте «Горячая пластина» у мышей CD-I;

5) оценить влияние Zrv-IIA и Zrv-IIB на температуру тела у мышей CD-I;

6) исследовать возможность прохождения зервамицина через гематоэнцефалический барьер.

Научная новизна

Показано, что побочные действия зервамицинов на ЦНС носят обратимый характер. Выявлено, что, несмотря на большую гомологию в структурах, различающихся лишь одним аминокислотным остатком, Zrv-IIB в высоких дозах проявляет более выраженные нейротоксические эффекты, чем Zrv-IIA. Максимальная толерантная доза для зервамицина составляет 4 мг/кг, а лд50 - 5,5 мг/кг. Впервые установлено, что зервамицины в дозе 0,01 мг/кг оказывают влияние на двигательную активность у мышей CD-I, что было выявлено с помощью установки «ОРТО-VARIMEX», тогда как нейротоксическое действие, обнаруженное в тесте Ирвина, антибиотики проявляли в дозе 2 мг/кг. Показана зависимость между структурой и активностью: при использовании дозы 0,01 мг/кг, Zrv-IIB на 20-ой минуте после введения снижал двигательную активность, a Zrv-IIA - нет. Напротив, на 60-ой минуте Zrv-IIA увеличивал двигательную активность, Zrv-IIB - нет. Обнаружено, что зервамицины в дозе 2 мг/кг и выше уменьшают болевую чувствительность и вызывают снижение температуры тела. Впервые установлено, что зервамицин может проникать через гематоэнцефалический барьер и накапливаться в головном мозге мышей.

Научно-практическое значение

зервамицины проявляют выраженные нейротоксические эффекты, указывают на необходимость проведения дальнейших доклинических испытаний.

Результаты диссертационного исследования используются в научно-исследовательской работе лаборатории биологических испытаний Филиала учреждения института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Учебно-научного центра учреждения института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН и кафедры физиологии человека и животных биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Положения, выносимые на защиту

1. Максимальная толерантная доза как для Zrv-IIA так и для Zrv-IIB составляет 4 мг/кг. ЛД50 - 5,5 мг/кг, и 5,4 соответственно.

2. Зервамицин IIB проявляет более выраженное нейротоксическое действие, чем зервамицин IIA, несмотря на высокую степень гомологии в их структурах, различающихся лишь одним аминокислотным остатком в четвертом положении.

3. Зервамицины оказывают влияние на двигательную активность мышей CD-I при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 0,01 мг/кг. Между Zrv-IIA и Zrv-IIB было обнаружено характерное различие в их действиях на двигательную активность.

4. Побочные эффекты зервамицинов носят обратимый характер и сопровождаются уменьшением болевой чувствительности и снижением температуры тела.

5. Зервамицин может проникать через гематоэнцефалический барьер и накапливаться в головном мозге.

6. К зервамицину как потенциальному антибиотику следует относиться с большой осторожностью в силу того, что у него обнаружено выраженное нейротоксическое действие.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: VII, VIII и XI международные Пущинские школы молодых ученных (2003, 2004, г. Пущино); VII чтения памяти академика Ю.А.Овчинникова (2003, г. Пущино); XI международная конференция «Ломоносов-2004» (2004, г. Москва); III российский симпозиум «Белки и пептиды» (2007, г. Пущино); конференция «Фармакология практическому здравоохранению» (2007, г. Санкт-Петербург), «Биомедицинская инженерия - 2007» школа-конференция молодых ученных (2007, Пущино), "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции" (2008. Пятигорск), Всероссийский

.конгресс студентов и аспирантов - биологов «Симбиоз Россия - 2008» (2008.Казань)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации '

Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 30 рисунков. Она состоит из введения, описания методов исследования, 6 глав собственных исследований, выводов, библиографического списка, включающего 134 источника, из них 113 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Для получения чистых изоформ зервамицинов (Zrv-ILA и Zrv-IIB) из культуры гриба Emericellopsis salmosynnemata (штамм 336, IMI 58330), была использована технология, разработанная под руководством Т.В.Овчинниковой. Выделение зервамицинов проводили путем экстракции н-бутанолом из культуральной жидкости, экстракты упаривали досуха на вакумном роторном испарителе, сухие остатки перерастворяли в метаноле. Разделение полученных смесей проводили методом гель-фильтрации на колонке (2,5 х 80 см) с Sephadex LH-20 (Pharmacia, Швеция) в метаноле при скорости потока элюента 0,2 мл/мин. Детектирование проводили по

Рис. 1. Хроматограмма гель-фильтрации метанольных экстрактов мицелия гриба на колонке Sephadex LH-20. Примечание: 1 - пик Zrv-IIA, 2 - пик Zrv-IIB.

Фракции, содержащие зервамицины, подвергали дальнейшей очистке с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращеннофазовой колонке (5 мкм, 4 х 250 мм) SGX RPS (Separon, Чехия) в течение 30 мин при скорости потока элюента 2 мл/мин в линейном градиенте растворов А и Б, содержащих метанол, ацетонитрил и воду. Детекция зервамицинов (рис.2) осуществлялась при длине волн 206 и 280 нм. Зервамицин IIA элюировался с колонки на 30-ой минуте Зервамицин IIB - на 32-ой минуте.

Рис.2 Хроматограмма разделения зервамицинов IIA и IIB на колонке Separon С-18.

Идентичность выделенных пептаиболов Zrv-IIA и Zrv-IIB была подтверждена с помощью ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, чистота полученных зервамицинов составляла 95%, молекулярная масса Zrv-IIA - 1840 KDa, a Zrv-IIB - 1861 кБа. Были определены их структурные формулы:

Zrv-IIA

Ac-Trp1-Ile2-Gln3-Aib4-Ile5-Thr6-Aib7-Leu8-Aib9-Hypl°-Gln11-Aibl2-Hypl3-Aibl4-Prol5.pheol16

Zrv-IIB

Ac-Trp1-ne2-Gln3-Iva4-Ile5-Thr6-Aib7-Leu8-Aib9-Hypl0-Gln11-Aib12-Hyp13-Aib 14-Pro15-Pheol16

Для изучения нейротоксических свойств в опытах на животных зервамицины растворяли в 30% этаноле и вводили внутрибрюшинно в объеме 2 мл/кг. Животные контрольных групп получали раствор 0,9% NaCl или раствор 30% этанола.

Исследования нейротоксических свойств зервамицинов выполнялись на самцах мышей CD-I 8-9 недельного возраста весом 30-35 г. Животные содержались в стандартных условиях (температура 18-26°С и влажность воздуха 30-70%, синхронизированная смена светового периода "день" с 8:00 до 20:00, "ночь" с 20:00 до 8:00). Животные получали стандартный корм и воду ad libitum.

Для подготовки доз в дальнейших исследованиях проведено определение ЛД50 и максимальной толерантной дозы (МТД) при однократном внутрибрюшинном введений мышам CD-I. Срок последующего наблюдения составил 3 суток, в течение которых учитывали характер и длительность симптомов интоксикации, сроки гибели и количество павших

животных от каждой введенной дозы. Количественные параметры токсичности с уточнением характеристик потенциальной опасности смертельного отравления рассчитывали пробит-анализом по методу Литчфилда и Уилкоксона.

Для оценки нейротоксического действия был использован тест Ирвина, зервамицины вводили внутрибрюшинно в дозах 0,5 мг/кг, 2 мг/кг и 4 мг/кг. Тест Ирвина заключался в комплексной оценке поведения мышей (Daughtrey et. al. 1997; Moser, 2000) на 20-ой, 60-ой и 120-ой минутах после введения веществ. Тестирование животных проводили в клетке содержания, на открытой площадке, а также осуществляли осмотр в руках. При обследовании животных в клетке содержания определяли следующие показатели: поза на боку, неспособность к передвижению, сгорбленость, застывшая поза, возбуждение, облизывание или покусывание лап, конвульсии, тремор, затрудненное дыхание. При тестировании животных на открытой площадке наблюдали: общую локомоторную активность, исследовательскую активность, обнюхивание, подёргивание головы, подергивание ушей, пошатывание, потерю равновесия, падение, стелющиеся движения, грумминг, уринации, дефикации. Осмотр животных в руках включал в себя определение гиперсаливации, пилоэрекции, закрытых век глаз, а также наблюдение за сенсорными рефлексами: визуализация объекта, сила хватания, координация движений в момент падения. Данные показатели оценивали в баллах от 0 до 3, выраженному эффекту присваивали максимальное количество баллов (Abou-Donia et al., 2002). Реакцию на резкий звук и ответ на прикосновение оценивали количеством баллов от 0 до 1, эти показатели определяли на открытой площадке (Moser, 2000).

Определение двигательной активности проводили с помощью компьютеризированной установки «OPTO-VARIMEX» и программы «AutoTrack» (Columbus Instruments, США). В данном исследовании животные были разделены на 12 групп:

Номер группы Вещество Доза, мг/кг Количество Животных

1 0,9% NaCl - 15

2 30% этанол - 15

3 Zrv-lIA 0,001 6

4 Zrv-IIB 0,001 6

5 Zrv-IIA 0,01 15

6 Ztv-IIB 0,01 15

7 Zrv-IIA 0,5 10

8 Zrv-IIB 0,5 10

9 Zrv-IIA 2,0 22

10 Zrv-IIB 2,0 22

11 Zrv-IIA 4,0 12

12 Zrv-IIB 4,0 12

Тестирование двигательной активности проводили на 20-ой и 60-ой минутах после введения веществ.

Для оценки болевой чувствительности был использован тест «Горячая пластина» (Columbus Instruments, США), зервамицины вводили также внутрибрюшинно в дозах 0,5 мг/кг, 2 мг/кг и 4 мг/кг. На 20-ой и 60-ой минуте после введения веществ, животных помещали на термостатируемую пластину, нагретую до 55,0±0,1°С, и отмечали латентное время облизывания передних или задних лап и латентное время первого подпрыгивания. После подпрыгивания животное сразу же убирали с пластины (Eddy and Leimbach, 1953). Для изучения влияния на температуру тела зервамицины вводили также внутрибрюшинно в дозах 0,5 мг/кг, 2 мг/кг и 4 мг/кг. Ректальную температуру у мышей измеряли с помощью датчика «MLT1404» и компьютеризированной системы «Chart ADInstruments» (ADInstruments, США). Во время измерения температуры тела животное помещали в клетку-пенал, где 20 минут осуществляли адаптацию животного к условиям эксперимента, затем вводили исследуемые вещества и продолжали измерения в течение 100 минут.

Для исследования возможности прохождения через гематоэнцефалический барьер, а также попадание и накапливание в органах и тканях был использован меченый тритием зервамицин, полученный методом, предложенным Золотаревым с соавторами (2006). Мышам CD-I внутрибрюшинно вводили смесь «холодного» и меченого зервамицина в суммарной дозе 2 мг/кг, при этом мышь получала 10 mkCL Мышей подвергали декапитации на 5-ой, 20-ой и 60-ой минутах после введения зервамицина. Исследуемые органы и ткани (кровь, кору головного мозга, мозжечок, ствол мозга, сальник, селезенку, почки, печень и скелетные мышцы) извлекали в течение 60-90 секунд и замораживали в жидком азоте. Образцы хранили при температуре -20°С. Замороженные ткани взвешивали, измельчали и добавляли по 1 мл жидкости для растворения тканей NCS-II (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden). Образцы встряхивали при 50°С до полного растворения. Радиоактивность каждого образца регистрировалась в 10 мл сцинтиллятора ACS II (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden) методом жидкостной сцинтилляции на спектрометре Beckman.

Полученные данные представлены как средние арифметические значения и их стандартные ошибки (Mean+SEM). Статистические сравнения результатов исследований проводили с использованием t-критерия Стьюдента, дисперсионного анализа ANOVA и Mann-Whitney U теста. Различия считали статистически значимыми при Р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Определение ЛД50 показало, что внутрибрюшинное введение зервамицинов вызывает практически однотипную клиническую картину отравления, которая не зависит от вводимых зервамицинов: через 1-3 минуты

после воздействия отмечается выраженное угнетение животных, резкое снижение локомоторной активности, урежение дыхания, кома в течение последующих 1-2 часов. Гибель животных регистрируется в течение первых двух часов. В дальнейшем у выживших животных общее состояние нормализуется. Результаты клинического осмотра показали, что у животного происходит угнетение дыхательного центра с выраженным угнетением центральной нервной системы.

Таблица 1. Гибель животных после внутрибрюшинного введения антибиотиков пептаиболов зервамицинов.

Исследуемое вещество Доза (мг/кг) Кол-во животных в группе Кол-во погибших животных

8 7 7

7 7 6

Zrv-IIA 6 7 5

5 7 2

4 7 0

8 7 . 7

7 7 6

Zrv-IIB 6 7 6

5 7 2

4 7 0

Таким образом, максимальная толерантная доза при однократном внутрибрюшинном введении мышам CD-I, как для Zrv-IIA так и Zrv-IIB составляет 4 мг/кг. ЛД50 - 5,5 мг/кг, и 5,4, соответственно.

Для изучения нейротоксичности в тесте Ирвина была использована максимальная толерантная доза, а также более низкие дозы. Результаты теста Ирвина (осмотра животных в клетке) представлены на рис.3. На 20-ой и 60-ой минутах после введения зервамицинов в дозе 4 мг/кг у животных наблюдались апатия, сгорбленная поза и покусывание лап. Эти изменения были обратимы и возвращались к норме на 120-ой минуте после введения препаратов. В дозе 2 мг/кг только Zrv-IIB статистически достоверно увеличивал у животных уровень апатии на 20-ой и 60-ой минутах после введения, Zrv-IIA в этой дозе не оказывал влияния на данный параметр. Оба зервамицина в дозе 0,5 мг/кг не вызывали статистически значимых изменений изучаемых параметров (рис.3).

При осмотре животных на открытой площадке были исследованы такие параметры, как локомоторная и исследовательская активности и обнюхивание. Как Zrv-IIA, так и Zrv-IIB статистически достоверно уменьшали данные параметры в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг на 20-ой и 60-ой минутах после введения. На 120-ой минуте только при введении Zrv-IIB

' было обнаружено снижение локомоторной активности и обнюхивания. При использовании дозы 0,5 мг/кг не было обнаружено статистически достоверных изменений параметров, изучаемых на открытой площадке, относительно таковых у животных, которые получали 30% этанол (рис.4).

2 -г

□ 1 И2 аз И4 Н5

* *

I *

т *

Г-МКИ 1-М I ' И f-шт fr-ВВФИ ■[ I Ш ЧД f—ЧЯ Zrv-ПА Zrv-IIB Zrv-IIA Ztv-IIB Zrv-IIA Zrv-IIB

20 мин 60 мин 120 мин

Рис.3. Апатия (А), сгорбленная поза (Б) и покусывание лап (В), обнаруженные в тесте Ирвина, под влиянием зервамицинов у мышей CD-I. Примечание: 1 - Интактные, 2 - 30% этанол, 3 - Зервамицин (0,5 мг/кг), 4 -Зервамицин (2 мг/кг), 5 - Зервамицин (4 мг/кг); # - Р<0,05 относительно группы «Интактные»; * - Р<0,05 относительно группы «30% этанол».

□ 1 132 ЕЗ И4 05

20 мин 60 мин 120 мин

Рис. 4 Локомоторная активность (А), исследовательская активность (Б), обнюхивание (В), обнаруженные в тесте Ирвина под влиянием зервамицина IIA и зервамицина IIB у мышей CD-I. •

Примечание: 1 - Интактные, 2 - 30% этанол, 3 - Зервамицин (0,5 мг/кг), 4 -Зервамицин (2 мг/кг), 5 - Зервамицин (4 мг/кг); # - Р<0,05 относительно группы «Интактные»; * - Р<0,05 относительно группы «30% этанол».

Осмотр животных на руках, показал, что как Zrv-IIA, так и Zrv-IIB в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг статистически достоверно уменьшали силу хватания

на 20-ой и 60-ой минутах после введения. Данные изменения носили обратимый характер, и на 120-ой минуте уже не выявлялись. Применение дозы 0,5 мг/кг не оказывало влияние на силу хватания. Затрудненное дыхание и стелящиеся движения были обнаружены только у животных, получавших зервамицины в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг (Табл. 1). Zrv-IIB оказывал более выраженное влияние на данные параметры, чем 2гу-ПА. Эти изменения также носили обратимый характер.

Таким образом, показано, что ггу-ПА и 7гу-ПВ в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг оказывают нейротоксическое действие, имеющее обратимый характер. Zrv-ИВ проявляет более выраженные нейротоксические эффекты, чем Хх\-\1К. Нейротоксические эффекты зервамицинов в дозе 0,5 мг/кг не выявлены. Доза 2 мг/кг является критической в проявлении нейротоксических свойств зервамицинов, обнаруженных в тесте Ирвина.

Таблица 2. Затрудненное дыхание и стелящиеся движения, обнаруженные в тесте Ирвина под влиянием и 2гу-ПВ у мышей СБ-

Параметр Группа 20-ая минута 60-ая минута 120-ая минута

Затрудненное дыхание Интактные 0 0 0

30% этанол 0 0 0

Zrv-IIA 2 мг/кг 0 0 0

Zrv-IIB 2 мг/кг 0,4±0,2 *# 0 0

Zrv-IIA 4 мг/кг 1,4±0,2*# 1,4±0,2 *# 0,2±0,1 *#

Zrv-IIB 4 мг/кг 2,1±0,1*# 1,8±0,1 *# 0,4±0,2 *#

Стелящиеся движения Интактные 0 0 0

30% этанол 0 0 0

Zrv-IIA 2 мг/кг 0 0 0

Zrv-IIB 2 мг/кг 0,2±0,1 *# 0 0

Zrv-IIA 4 мг/кг 1,4±0,3 *# 1,3±0,2 *# 0,6±0,2 *#

Zrv-IIB 4 мг/кг 1,8±0,1 *# 1,7±0,2 *# 0,4±0,1 *#

Примечание: * - Р<0,05 относительно группы «Интактные»; # - Р<0,05 относительно группы «30% этанол».

Для более детального изучения влияния зервамицинов на двигательную активность была применена компьютеризированная установка «ОРТО-VARIMEX» и программа «Auto-Track» (Columbus Instruments, США). Как показывают данные, приведенные на рис.5, на 20-ой минуте после введения, Zrv-IIA достоверно снижал двигательную активность относительно контрольных животных в дозах от 0,1 мг/кг до 4 мг/кг. Zrv-IIB также дозозависимо снижал двигательную активность, однако, в отличие от Zrv-IIA он начинал проявлять этот эффект в дозе 0,01 мг/кг. На 60-й минуте обнаружено, что достоверно пониженный уровень двигательной активности

сохраняется при введении Zтv-llA в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг, тогда как 2гу-ПВ - в дозах 0,5 мг/кг, 2 мг/кг и 4 мг/кг. Кроме того, характерной особенностью 2р/-ИА оказалось то, что при введении в дозе 0,01 мг/кг, он на 60-й минуте достоверно увеличивал двигательную активность как относительно контрольных животных, получавших 30% этанол, так и животных, получавших 2гу-НВ (рис.5).

И0.9%ЛаС1 ■ 30% этанол И^-ПА В^-НВ *#

1500

0.001 0,01 0,1 0,5 2,0 4,0

мг/кг мг/кг мг/кг мг/кг мг/кг мг/кг

Рис.5. Двигательная активность, измеренная на установке «ОРТО-VARIMEX», на 20-ой минуте (А) и 60-ой минуте (Б) после введения Zrv-IIA и Zrv-IIB у мышей CD-I.

Примечание: # - Р<0,05 относительно группы «0,9% NaCl»; * - Р<0,05 относительно группы «30% этанол»; S - Р<0,05 относительно Zrv-IIA.

Таким образом, показано, что у мышей CD-I под действием Zrv-IIA и Zrv-IIB двигательная активность дозозависимо снижалась на 20-й минуте после введения, при этом эффективная начальная доза для Zrv-IIA была 0,1

мг/кг, а для 7гу-ПВ - 0,01 мг/кг. Кроме этого, было обнаружено, что на 60-й минуте после введения в дозе 0,01 мг/кг Хту-НА увеличивал двигательную активность, тогда как Zтv-llB не оказывал такого действия. Полученные данные свидетельствуют о том, что ггу-ИА и ггу-ИВ обладают нейротропным действием, при этом они отличаются по эффективности несмотря на сходство в структурах.

Покусывание частей тела, обнаруженное в тесте Ирвина, может быть следствием проявления снижения болевой чувствительности. Свойство зервамицинов оказывать действие на болевую чувствительность оценивали в тесте «Горячая пластина». В ходе тестирования отмечали латентное время облизывания передних или задних лап и латентное время подпрыгивания. Показатели болевой чувствительности представлены на рис. 6. Латентное время облизывания лап и подпрыгивания у животных, получавших 30% этанол, достоверно не отличалось от таковых у животных, получавших 0,9% раствор №С1 как через 20 минут, так и через 60 минут после введения. Под действием зервамицинов в дозе 0,5 мг/кг не было обнаружено статистически достоверных изменений изучаемых параметров. В дозе 2 мг/кг только ггу-НВ через 20 мин после введения достоверно увеличивал латентное время облизывания передних лап с 5,5±0,2 сек до 8,2±1,1 сек (Р<0,05) и задних лап с 12,7±0,9 сек до 15,6±0,5 сек (Р<0,05), а также латентное время подпрыгивания с 46,8±4,3 сек до 59,5±0,4 сек (Р<0,05) по сравнению с животными контрольной группы («30% этанол»). У животных, получавших ггу-ПА, не было обнаружено достоверных изменений изучаемых параметров относительно контрольных групп. Снижение болевой чувствительности 2ту-НВ на 60-й минуте после его введения уже не наблюдалось. При увеличении дозы до 4 мг/кг зервамицины снижали болевую чувствительность не только на 20-й минуте, но и на 60-й минуте после введения (рис. 6).

Нейротоксическое действие зервамицинов, обнаруженное в тесте Ирвина, а также литературные данные о гипотермическом эффекте пептаибола ампуллоспорина (ЯНгаи й. а1. 1997) позволили предположить, что зервамицины могут снижать температуру тела. Эта гипотеза была проверена экспериментально. Исходная ректальная температура у мышей в разных экспериментальных группах составляла от 35,5°С до 36,ГС, статистически значимых различий между группами обнаружено не было. Данные, приведенные на рис.7, свидетельствуют о том, что введение зервамицинов в дозе 0,5 мг/кг не вызывало статистически достоверных изменений ректальной температуры у животных. В дозе 2 мг/кг только 7л\-ИВ статистически достоверно снижал температуру тела у мышей, начиная с 35-й минуты после введения. Снижение температуры тела под действием 2гу-ПВ стабилизировалось к 60-й минуте после введения, гипотермический эффект составлял около 3°С и сохранялся на этом уровне на протяжении 40 минут (до окончания эксперимента).

В дозе 4 мг/кг оба зервамицина снижали температуру тела у мышей, однако, они имели разную динамику развития гипотермического эффекта. ггу-ПА вызывал резкое снижение температуры тела, начиная с 4-ой минуты

после введения, затем на 15-ой минуте гипотермический эффект стабилизировался и сохранялся на этом уровне еще на протяжении 20 минут. Максимальное снижение температуры тела составило 4,8°С. Затем температура постепенно повышалась и к 65-ой минуте эксперимента уже не отличалась от исходного уровня. После введения ггу-ПВ в дозе 4 мг/кг также наблюдалось резкое снижение температуры тела мышей, однако, в отличие от 2гу-ПА пониженный уровень температуры тела сохранялся до окончания эксперимента.

□ 102ЙЗВ4И5

90 у

Zrv-IIA Zrv-IIB

Рис. 6. Латентное время подпрыгивания, обнаруженное в тесте «Горячая пластина» под влиянием Zrv-IIA и Zrv-IIB у мышей CD-I. Примечание: А — через 20 мин, Б - через 60 мин после введения веществ; 1 -0,9% NaCl, 2 - 30% этанол, 3 - зервамицины (0,5 мг/кг), 4 - зервамицины (2 мг/кг), 5 - зервамицины (4 мг/кг); * - Р<0,05 относительно 0,9% NaCl; # -Р<0,05 относительно 30% этанола.

At°C

-0.9%NaCl 30% этанол -^0,5 мг/кг -о- 2 мг/кг 4 мг/кг

Время (мин)

Рис.7. Изменение температуры тела мышей CD-I, получавших 0,9% NaCl и 30% этанол (А), зервамицин IIA (Б) и зервамицин IIB (В). Примечание: * - Р<0,05 относительно исходного уровня при введении зервамицинов в дозе 4 мг/кг; # - Р<0,05 относительно исходного уровня при введении зервамицинов в дозе 2 мг/кг; S - Р<0,05 при сравнении доз 2 мг/кг и 4 мг/кг..

Дозозависимое влияние Zrv-IIB проявилось не в уровне гипотермического эффекта, а в динамике его развития (при использовании дозы 2 мг/кг достоверное снижение температуры тела было обнаружено на 35-ой минуте после введения, а применение дозы 4 мг/кг вызывало снижение

температуры тела уже через 5 минут после введения препарата). Эти дозозависимые различия статистически достоверно наблюдались на протяжении 25 минут.

Таким образом, было показано, что зервамицины проявляют снижение показателей болевой чувствительности при однократном внутрибрюшинном введении: ЪтяЛШ в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг, 7т\'-ПА - только в дозе 4 мг/кг. Зервамицины также снижают температуру тела животных, что может свидетельствовать в пользу их нейролептических свойств. Снижение температуры тела наблюдали у 2ту-НВ в дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг, а у 2гу-НА -только в дозе 4 мг/кг.

В работе, посвященной исследованию нейротропных свойств ампуллоспорина, высказано предположение, что он может вызывать изменения состава нейротрансмиттерного рецептора, кальциевого сигнального каскада и системы вторичных мессенджеров и приводить тем самым к пластической реорганизации ткани мозга, изменению синапсов и метаболических путей, проникая через гематоэнцефалический барьер и накапливаясь в структурах головного мозга экспериментальных животных (Кл^е1 й. а1. 2006). Структурное сходство ампуллоспорина и зервамицинов позволяет предположить, что влияние последних на поведение экспериментальных животных может быть связано с аналогичным механизмом их нейротропного действия (Овчинникова и Мурашев, 2007).

В следующей серии экспериментов изучали распределение зервамицина в органах и тканях экспериментальных животных и прохождение его через гематоэнцефалический барьер. Как видно из данных, приведенных в Табл. 3, уже через 5 минут зервамицин был обнаружен во всех исследуемых органах и тканях. Максимальное его содержание было обнаружено в жировой ткани брюшной полости, однако, к 60-ой минуте оно уменьшилось более чем в 10 раз по сравнению с 5-ой минутой. Очевидно, такую динамику изменения содержания зервамицина в жировой ткани можно объяснить как его всасыванием, так и адсорбцией из брюшной полости, куда он был введен.

В крови наблюдалась следующая динамика изменения концентрации зервамицина: к 20-ой минуте - статистически значимое увеличение на 126% относительно 5-ой минуты, к 60-ой минуте - снижение в два раза относительно 20-ой минуты и тенденция к уменьшению на 12% относительно 5-ой минуты. Максимальная концентрация зервамицина в крови, обнаруженная на 20-ой минуте, совпадает по времени с проявлением его нейротропной активности, которая наблюдалась у экспериментальных животных. В селезенке обнаружена тенденция к постепенному увеличению содержания зервамицина. В печени содержание препарата не менялось на протяжении 60 минут. В почках обнаружено увеличение содержания зервамицина в 2 раза к 20-ой минуте относительно 5-ой минуты. Повышенный уровень содержания зервамицина в почках сохранялся на 60-й минуте. Динамика содержания зервамицина в почках свидетельствует о том, что он может принимать участие в его элиминации.

В скелетных мышцах наблюдалась сходная с кровью динамика изменения содержания зервамицина: увеличение на 20-ой минуте и снижение на 60-ой минуте до уровня 5-ой минуты.

Таблица 3. Содержание зервамицина в органах и тканях мышей CD-I через 5, 20 и 60 минут после его внутрибрюшинного введения (нг на г ткани).

Органы и ткани Время после введения зервамицина

5 минут 20 минут 60 минут

Кровь 0,59±0,П 1,33±0,21 * 0,52±0,05 #

Кора головного мозга 36±5 68±5 * 67±4 *

Мозжечок 29±3 44±2 * 64±8 * #

Ствол головного мозга 45±6 85±10 * 69±9

Жировая ткань брюшной полости 1869±428 2127±206 180±41 * #

Селезенка 120Ы5 232±12 205±43

Почки 148±13 296±15* 244±30 *

Печень 316±35 338±35 395±70

Мышечная ткань 91±19 154±32 90±8 #

Примечание: * - Р<0,05 относительно 5 минут; # - Р<0,05 относительно 20 минут.

В коре головного мозга обнаружено повышение содержания зервамицина на 92% на 20-ой минуте относительно 5-ой минуты. К 60 минуте уровень содержания зервамицина оставался таким же, как и на 20-ой минуте. В мозжечке с 5-ой по 60-ую минуты наблюдалось постепенное нарастание содержания зервамицина на 119%. В стволе головного мозга максимальное содержание зервамицина было отмечено на 20-ой минуте, на 60-ой минуте наблюдалась лишь тенденция к его снижению. Увеличение содержания зервамицина в структурах головного мозга указывает на возможное его связывание с клетками нервной ткани.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что зервамицин может проникать через гематоэнцефалический барьер и накапливаться в структурах головного мозга, показано также, что он по-разному распределяется по органам и тканям, что позволяет высказать предположение о его специфичности связывания. Наши данные о способности зервамицина проникать через гематоэнцефалический барьер и накапливаться в структурах головного мозга согласуются с результатами исследований ампуллоспорина (Кп^е1 е! а!., 2006), что свидетельствует о наличии общих механизмов их нейротропного действия.

выводы

1. Максимальная толерантная доза как для зервамицина ПА), так и для зервамицина (ггу-ПВ) составляет 4 мг/кг. ЛД50 для 2т\-НА составляет 5.5 мг/кг, для гту-ПВ - 5.4 мг/кг. Не обнаружено различий между зервамицинами ни по максимальной толерантной дозе, ни по величине ЛД50.

2. Несмотря на высокую степень гомологии, структуры Zrv-llA и ггу-ПВ различаются лишь одним аминокислотным остатком в четвертом положении. Показано, что они обладают характерными особенностями в действии на двигательную активность. В дозе 0,01 мг/кг 2п/-НА увеличивает двигательную активность, а 2п/-ПВ уменьшает. Дальнейшее увеличение дозы приводит к снижению двигательной активности, как под действием Zтv-llB, так и 2гу-ПА, однако, Zтv-llB проявляет более выраженный эффект.

3. Обнаружены различия в проявлении у зервамицинов нейротоксического действия. У животных, получавших зервамицин ПВ в дозе 2 мг/кг, наблюдали затрудненное дыхание и стелящиеся движения, тогда как при получении зервамицина НА эти признаки проявлялись только при использовании дозы 4 мг/кг. Зервамицин ПВ обладает более выраженным нейротоксическим действием, чем зервамицин ПА.

4. Побочные эффекты зервамицинов носят обратимый характер и сопровождаются уменьшением болевой чувствительности и снижением температуры тела. Болевая чувствительность под действием 2гу-ПВ снижалась при использовании дозы 2 мг/кг, а Хгу-ЕА. - 4 мг/кг. Обнаружены различия в характере изменения температуры тела под действием зервамицинов.

5. В коре головного мозга обнаружено содержание зервамицина на 5-ой минуте 36±5 нг/г ткани. В мозжечке с 5-ой по 60-ую минуты наблюдалось постепенное нарастание содержания зервамицина на 119%. В стволе головного мозга максимальное содержание зервамицина было отмечено на 20-ой минуте 85±10 нг/г ткани. Зервамицин проникает через гематоэнцефалический барьер и накапливается в головном мозге.

6. Учитывая высокую токсичность и выраженное нейротоксическое действие зервамицина, следует заключить о нецелесообразности разрабатывать его как потенциальное антибиотическое лекарственное средство.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исследование нейротропной активности антибиотика - пептаибола зервамицина / И.А. Дьяченко, В.А. Коршунов, А.Н. Мурашев и др. // Тез. докл. отчетной конф. ФИБХ РАН. - Пущино, 2003. - С. 7.

2. Исследование обезболивающей активности антибиотика - пептаибола зервамицина / И.А. Дьяченко, А.Н. Мурашев, Н.В. Свищева и др.// Тез. докл. 8-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых - Пущино, 2004. - С. 109-110.

3. Изучение влияния антибиотика пептаибола зервамицина на температуру тела/И.А. Дьяченко, А.Н. Мурашев, Н.В. Свищева и др.//Х1 международная конференция «Ломоносов-2004»-Москва,2004-С.44-45.

4. Изучение нейротропной активности антибиотика - пептаибола зервамицина / И.А. Дьяченко, А.Н. Мурашев, Н.В. Свищева и др. // Тез. докл. отчетной конф. ФИБХ РАН. - Пущино, 2004. - С. 16.

5. Изучение распределения по органам пептаибола зервамицина / И.А. Дьяченко, А.Н. Мурашев, Т.В. Овчинникова // Тез. докл. III Российского симпозиума «Белки и пептиды». - Москва, 2007. С. 70

6. Влияние антибиотика пептаибола зервамицина - ПВ на эфферентную иннервацию / И.А, Дьяченко, Д.И. Ржевский, А.Н. Мурашев и др. // Тез. докл. Фармакология практическому здравоохранению. - Санкт-Петербург, 2007. С. 1-1681 - 1-1682.

7. Особенности нейролептического действия зервамицинов ILA и ИВ / И.А. Дьяченко, А.Н. Мурашев, Т.В. Овчинникова // Тез. докл. Школа -конференция «Биомедицинская инженерия - 2007».-Пущино,2007.С. 111-114

8. Особенности анальгетической активности зервамицинов / И.А. Дьяченко, А.Н. Мурашев, Е.А. Калабина и др. // Научное издание: Тез. докл. Школа - конференция «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» Сборник научных трудов. -Пятигорск, 2008, выпуск 63, С. 417-420

9. Нейротоксические свойства антибиотиков пептаиболов зервамицинов Zrv-IIA и Zrv-IIB. / И.А. Дьяченко // Материалы I Всероссийского конгресса студентов и аспирантов - биологов «Симбиоз Россия - 2008» - Казань, 2008, С. 90.

Ю.Особенности нейротропной активности зервамицинов IIA и IIB / И.А. Дьяченко, А.Н. Мурашев, Т.В. Овчинникова // Доклады Академии наук. - 2008. - Т. 419, №3 - С. 403-405.

11 .Исследование нейротоксичности пептаиболов зервамицинов / И.А. Дьяченко, А.Н. Мурашев, Т.В. Овчинникова // Токсикологический вестник. - 2008. -№3 - С. 35-38.

Оглавление диссертации Дьяченко, Игорь Александрович :: 2009 :: Старая Купавна

Список использованных сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Антибактериальные средства - общее понятие.

1.2. Нежелательные реакции (HP) антибиотиков.

1.2.1. Аллергические реакции.

1.2.2. Токсические реакции.

1.3. Общее понятие нейротоксичности.

1.3.1. Нейротоксические признаки антибиотика — терапии.

1.4. Новая группа антибактериальных препаратов - пептаибол.

1.4.1. Формирование подсемейств (SFs) по структурным последовательностям.

1.4.2. Структура и формирование каналов SF.

1.4.3. Функциональные особенности пептаиболовых подсемейств.

1.4.4 Структурно — функциональные особенности зервамицина.

1.4.5. Нейротропные свойства зервамицинов.

Выводы по обзору литературы.

ГЛАВА II.Объекты и методы исследований.

2.1. Выделение и очистка пептаиболов группы зервамицинов из гриба Emericellopsis salmosynnemata (штамм 336, IMI 58330).

2.2. Объекты исследования.

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Методика оценки нейротоксичности в модифицированном тесте Ирвина.

2.3.2. Определение двигательной активности мышей.

2.3.3. Методика определения температуры тела у мышей.

2.3.4. Методика оценки болевой чувствительности в тесте «Горячая пластина».

-22.3.5. Количественное определение пептаибола Зервамицин в ^ органах и тканях лабораторных животных.

2.4. Протоколы исследования.

2.5. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Определение ЛД50 при внутрибрюшинном введений мышам

3.2. Влияние пептаибола зервамицин на параметры функциональной батареи тестов по оценке нейротоксичности в модифицированном 55 тесте Ирвина .'.

3.3. Влияние зервамицина на двигательную активность мышей CD-1.

3.4. Влияние пептаибола зервамицин на анальгетическую активность мышей CD-1 в тесте «Горячая пластина».

3.5. Влияние пептаибола зервамицин на гипотермическую реакцию мышей CD-1 в тесте «Ректальная температура».

3.5. Биораспределение зервамицинов по органам и тканям экспериметальных животных.

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Дьяченко, Игорь Александрович, автореферат

Актуальность проблемы

В 1973 Argoudelis и Johnson получили патент на новые антибиотики, выделенные из гриба Emericellopsis salmosynnemata, которые были названы зервамицинами. Зервамицины относятся к пептаиболам — пептидам, содержащим в своей структуре а,а-диалкиламинокислоты, например, а— аминоизомасляную кислоту, и С-концевые аминоспирты. Изучение биологических свойств зервамицинов показало, что они обладают не только выраженной активностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий (Argoudelis et al., 1974; Jen et al., 1987), но и проявляют антипротозойное действие по отношению к устойчивым формам возбудителя малярии Plasmodium falciparum (Nagaraj et al., 2001). Это позволяет рассматривать их как потенциальные антибиотические лекарственные средствам. Однако из культур различных штаммов гриба Emericellopsis salmosynnemata было выделено до 11 изоформ зервамицинов, среди которых преобладающими являлись зервамицин IIA (Zrv-IIA) и зервамицин IIB (Zrv-IIB) (Argoudelis et al., 1974). Получение чистых изоформ зервамицинов является сложной методической задачей. В настоящее время такие работы проводятся под руководством Т.В.Овчинниковой в Институте биоорганической химии РАН.

Известно, что побочным действием антибиотиков является их влияние на центральную нервную систему (Сергеев и Шимановский, 1987). Было показано, что антибиотик-пептаибол ампуллоспорин из гриба Sepedonium ampullosporum снижает двигательную активность у экспериментальных животных (Ritzau et el., 1997). Влияние на поведение животных было обнаружено также и у зервамицина (Ovchinnikova et al., 2007; Овчинникова и Мурашев, 2007), однако, результаты данных работ не позволяют однозначно интерпретировать их воздействие на нервную систему. В связи с этим, нами было сделано предположение, что изменения в поведении животных под влиянием зервамицина могут быть связаны с их нейротоксическим действием. Таким образом, важность проведения комплексных исследований по изучению иейротоксических свойств зервамицина не вызывает сомнений.

Zrv-IIA и Zrv-IIB по своей структуре отличаются друг от друга только одним аминокислотным остатком в четвертом положении, поэтому исследования их иейротоксических свойств позволят расширить наши знания по фундаментальной проблеме - изучению зависимости токсичности фармакологических веществ от их структуры.

Цель и задачи работы

Целью данной работы явилось проведение сравнительного анализа нейротоксического действия двух изоформ зервамицина (Zrv-IIA и Zrv-IIB) выделенных из гриба Emericellopsis salmosynnemata.

Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) определить ЛД50 и максимальную толерантную дозу для Zrv-IIA и Zrv-IIB при однократном внутрибрюшинном введений мышам CD-1;

2) провести сравнительную оценку нейротоксического действия Zrv-IIA и Zrv-IIB на мышах CD-I, используя тест Ирвина;

3) оценить влияние зервамицинов на двигательную активность с помощью установки «ОРТО-VARIMEX» у мышей CD-I;

-64) изучить влияние Zrv-IIA и Zrv-IIB на болевую чувствительность в тесте «Горячая пластина» у мышей CD-1;

5) оценить влияние Zrv-IIA и Zrv-IIB на температуру тела у мышей CD-I;

6) исследовать возможность прохождения зервамицина через гематоэнцефалический барьер.

Научная новизна

Показано, что побочное действие зервамицинов на ЦНС носят обратимый характер. Выявлено, что, несмотря на большую гомологию в структурах, различающихся лишь одним аминокислотным остатком, Zrv-IIB в высоких дозах проявляет более выраженные нейротоксические эффекты, чем Zrv-IIA. Максимальная толерантная доза для зервамицина составляет 4 мг/кг, а ЛД50 - 5,5 мг/кг. Впервые установлено, что зервамицины в дозе 0,01 мг/кг оказывают влияние на двигательную активность у мышей CD-I, которое было выявлено с помощью установки «ОРТО-VARIMEX», тогда как нейротоксическое действие, обнаруженное в тесте Ирвина, они проявляли в дозе 2 мг/кг. Показана зависимость между структурой и активностью: при использовании дозы 0,01 мг/кг Zrv-IIB на 20-ой минуте после введения снижал двигательную активность, a Zrv-IIA - нет, напротив на 60-ой минуте Zrv-IIA увеличивал двигательную активность, Zrv-IIB - нет. Обнаружено, что зервамицины в дозе 2 мг/кг и выше уменьшают болевую чувствительность и вызывают снижение температуры тела. Впервые установлено, что зервамицин может проникать через гематоэнцефалический барьер и накапливаться в головном мозге мышей.

Научно-практическое значение

Результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, углубляют и дополняют представления о нейротоксических свойствах зервамицинов, а также пептаиболов в целом. Полученные данные о том, что зервамицины проявляют выраженные нейротоксические эффекты, указывают на необходимость проведения дальнейших доклинических испытаний.

Положения, выносимые на защиту

1. Максимальная толерантная доза как для Zrv-IIA так и Zrv-IIB составляет 4 мг/кг, ЛД50 - 5,5 мг/кг, и 5,4 соответственно.

2. Зервамицин ИВ проявляет более выраженное нейротоксическое действие, чем зервамицин IIA, несмотря на высокую степень гомологии в их структурах, различающихся лишь одним аминокислотным остатком в четвертом положении.

3. Зервамицины оказывают влияние на двигательную активность мышей CD-I при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 0,01 мг/кг. Между Zrv-IIA и Zrv-IIB было обнаружено характерное различие в их действий на двигательную активность.

5. Зервамицин может проникать через гематоэнцефалический барьер и накапливаться в головном мозге.

Апробация работы

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах.

Заключение диссертационного исследования на тему "Сравнительный анализ нейротоксического действия изоформ зервамицина из гриба"

ВЫВОДЫ:

1. Максимальная толерантная доза как для зервамицина (Zrv-IIA), так и для зервамицина (Zrv-IIB) составляет 4 мг/кг. ЛД50 для Zrv-IIA составляет 5,5 мг/кг, для Zrv-IIB - 5,4 мг/кг. Не обнаружено различий между зервамицинами ни по максимальной толерантной дозе, ни по величине ЛД50.

2. Несмотря на высокую степень гомологии структуры Zrv-IIA и Zrv-IIB, они различаются лишь одним аминокислотным остатком в четвертом положении, показано, что они обладают характерными особенностями в действии на двигательную активность. В дозе 0,01 мг/кг Zrv-IIA увеличивает двигательную активность, a Zrv-IIB уменьшает. Дальнейшее увеличение дозы приводит к снижению двигательной активности, как под действием Zrv-IIB, так и Zrv-IIA, однако, Zrv-IIB проявляет более выраженный эффект.

3. Обнаружены различия в проявлении у зервамицинов нейротоксического действия. У животных, получавших зервамицин IIB в дозе 2 мг/кг, наблюдали затрудненное дыхание и стелящиеся движения, тогда как при получении зервамицина IIA эти признаки проявляются только при использовании дозы 4 мг/кг. Зервамицин IIB обладает более выраженным нейротоксическим действием, чем зервамицин IIA.

4. Побочные эффекты зервамицинов носят обратимый характер и сопровождаются уменьшением болевой чувствительности и снижением температуры тела. Болевая чувствительность под действием Zrv-IIB снижалась в использовании дозы 2 мг/кг, a Zrv-IIA - 4 мг/кг. Обнаружены различия в характере изменения температуры тела под действием зервамицинов.

-975. В коре головного мозга обнаружено содержания зервамицина на 5-ой минуте 36±5 нг/г ткани. В мозжечке с 5-ой по 60-ую минуты наблюдалось постепенное нарастание содержания зервамицина на 119%. В стволе головного мозга максимальное содержание зервамицина было отмечено на 20-ой минуте 85±10 нг/г ткани. Зервамицин проникает через гематоэнцефалический барьер и накакапливается в головном мозге. 6. Учитывая высокую токсичность и выраженное нейротоксическое действие зервамицина, следует заключить о нецелесообразности разрабатывать его как потенциальное антибиотическое лекарственное средство.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Дьяченко, Игорь Александрович

1. Адо А. Д., Общая аллергология, М., 1970; Т immunological diseases, 2 ed., V. 1—2, Boston, 1971.

2. Алехин E.K. Как действуют антибиотики. Соровский образовательный журнал. 2000. №4. С. 19-23.

3. Алиева Г.Д. Побочные эффекты длительной антибиотикотерапии при хронических бронхолегочных заболеваниях и муковисцидозе у детей: Дисс. . к.м.н. -М., 1991.

4. Альберт А. Избирательная токсичность: Физико-химические основы терапии: Пер. с англ. В 2 т. М.: Медицина, 1989. Т. 1. 400 е.; Т. 2. 432 с.

5. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рафф М., Роберте К. и Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1994. 2 изд. Гл. 18. "Иммунная система".

6. Белоусов Ю.Б., Шатунов С.М., "Антибактериальная химиотерапия", Москва, 2001 г

7. Благой Ю.П. Взаимодействие ДНК с биологически активными веществами (ионами металлов, красителями, лекарствами). Соросовский Образовательный Журнал. 1998. № 10. С. 18-24.

8. Замотаев И.П. Клиническая фармакология антибиотиков и тактика их применения. — Москва. 1978.

9. Кузин В.Б., Монахов А.А., Канышкина Т.М. и др. Антибиотики: макролиды. Н.Новгород, изд-во НГМА. 1997.

10. Куценко С.А. ОСНОВЫ ТОКСИКОЛОГИИ. Санкт-Петербург. 2002. Т. 4. С. 119.

11. Лужников Е.А. Клиническая токсикология. М. Медицина. 1994. С. 255.

12. Овчинникова Т.В., Мурашев А.Н. ДАН. 2007. Т. 414. №5. С. 1-3.

13. Сергеев П.В., Шимановский H.JI. Рецепторы физиологически активных веществ. М. Медицина. 1987. С. 399.

14. Сидоренко С.В. Резистентность микроорганизмов и антибактериальная терапия. Рус. мед. Журн. 1998. Т. 6, № 11. С. 717725.

15. Спирин А.С. Молекулярная биология: Структура рибосомы и биосинтез белка. М.: Высш. шк., 1986. С. 28-48.

16. Страчунский JI.C., Белоусов Ю.Б., Козлов С.Н. "Антибактериальная терапия. Практическое руководство" 2004, www.antibiotic.ru

17. Чумаков В.В. Токсикологический справочник для врачей Военно-морского флота. СПб. МО РФ. 1996. С. 130.

18. Яковлев С.В. Антибактериальные препараты. Специальный выпуск Рус. мед. журн. 1997. Т. 5, № 21.

19. Abou-Donia М.В., Goldstein LB, Shah D.U. at all. Pharmacol Biochem Behav. 2002. V. 72 № 4. P. 881-890.

20. Ackerman Z., Karmeli F., Pizov G., Ben-Dov I., Pappo O. Renal effects of gentamicin in chronic bile duct ligated rats. Dig Dis Sci. 2006. V. 51. P. 406-15

21. Aragwolla S., Mellor I.R., Samsom M.S., Karle I.L., Krishna K., Sucumar M., Balaram P. Zervamicins, a structurally characterised peptide model for membrane ion channels. Biochemistry and Byophysics Rus Comun. 1992. V. 186. P. 95-99

22. Archer S.L., Ellena J.F., Cafiso D.S. Dynamics and aggregation of the peptide ion channel alamethicin. Biophysics Journal. 1991. V. 60. P. 389398

23. Argoudelis AD, Jonson PL, Kalamazoo M. Antibiotics zervamicin I and zervamicin II and process for preparation the same. U.S. Patent 19. 33,907,990. 1975

24. Argoudelis AD, Dietz A, Johnson LE. Zervamicins I and II, polypeptide antibiotics produced by emericellopsis salmosynnemata. J Antibiot. 1974 V. 27 P. 321-8.

25. Ammer U., Natochin Y., Ullrich K.J. Tissue concentration and urinary excretion pattern of sulfofluorescein by the rat kidney. J Am Soc Nephrol. 1993. V. 8. P. 1474-87.

26. Amsden G.W., Schentag J.J. Mandell G.L., Bennet J.E., Dolin R. Tables of antimicrobial agent pharmacology. In: Principles and Practice of Infectious Diseases. 2000. 5th ed. Philadelphia etc.: Churchill Livingstone,. P. 566-589.

27. Artalejo A.R., Montiel C., Sanchez-Garcia P., Uceda G., Guantes J. M., Garcia A.G. Alamethicin-evoked catecholamine release from cat adrenal glands. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. V. 169. P. 12041210

28. Augeven-Bour I., Rebuffat S., Auvin C., Goulard C., Prigent Y., Bodo В. Mucronine J a 14-membered cyclopeptide alkaloid from Zizyphus mucronata. J. Chem. Soc. 1997. V. 10. P. 15g87-1594.

29. Bartlett J.G. Pocket Book of Infectious Disease Therapy. 11th ed. Baltimore etc.: Williams & Wilkins, 2000.

30. Balaram P., Krishna K., Sucumar M., Mellor I.R., Samsom M.S. The properties of in channels formed by Zervamicins. European Biophysics Journal. 1992 V. 23. P. 654-660

31. Beck S.A., Williams L.W., Shirrell M.A., Burks A.W. Egg hypersensitivity and measles-mumps-rubella vaccine administration. Pediatrics. 1991. V. 88. P. 913-917.

32. Boheim G. Statistical analysis of alamethicin channels in black lipid membranes. J. Membr. Biol. 1974. V. 19. P. 277-303.

33. Boyce S.T., Warden G.D., Holder I.A. Cytotoxicity testing of topical antimicrobial agents on human keratinocytes and fibroblasts for cultured skin grafts. J Burn Care Rehabil. 1995. V. 16. P. 97-103.

34. Bruckner H., Graf H., Bokel M. Paracelsin; characterization by NMR spectroscopy and circular dichroism, and hemolytic properties of a peptaibol antibiotic from the cellulolytically active mold Trichoderma reesei. Experientia. 1984. V. 40. P. 1189-1197.

35. Carson J.L., Strom BL., Duff A., Gupta A., Shaw M., Lundin F.E., Das K. Acute liver disease associated with erythromycins, sulfonamides, and tetracyclines. Ann Intern Med. 1993. V. 119. P. 576-83.

36. Chikanishi Т., Hasumi K., Harada Т., Kawaski N., Endo A. Clonostachin, a novel peptaibol that inhibits platelet aggregation. J. Antibiot. 1997. V. 50. P. 105-110.

37. Chugh J.K., Wallace B.A. Peptaibols: models for ion channels. Biochem Soc Trans. 2001. V. 29. P. 565-70.

38. Cox N.H., Forsyth A. Thiomersal allergy and vaccination reactions. Contact Dermatitis. 1988. V. 18. P. 229-233.

39. Cox CD, Rinehart KL Jr, Moore ML, Cook JC Jr. Pyochelin: novel structure of an iron-chelating growth promoter for Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 V. 78 P. 4256-60.

40. D'Arcy P.F. Nitrofurantoin. Drug Intell Clin Pharm. 1985. V. 19. P. 540-7.

41. Danner R.L., Joiner K.A., Rubin M., Patterson W.H., Johnson N., Ayers K.M., Parrillo J.E. Purification, toxicity, and antiendotoxin activity of polymyxin В nonapeptide. Antimicrob Agents Chemother. 1989. V. 33(9). P. 1428-34.

42. Daughtrey W.C., Gill M.W., Pritts I.M. at all. //J Appl Toxicol. 1997. V. 17 Suppl 1: P. 57-64.

43. Demoly P., Messaad D., Sahla H., et al. Six-hour trimetoptim-sulfamethoxarole-graded challenge in HIV-infected patients. J. Allergy. Clin. Jmmunol. 1998. V. 102 P. 1033-1036.

44. Duclohier H., Snook C.F., Wallace B.A. Antiamoebin can function as a carrier or as a pore-forming peptaibol. Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1415. P. 255-260.

45. Dunagan W.C., Woodward R.S., Medoff G., et al. Antibiotic misuse in two clinical situations: positive blood culture and administration of aminoglycosides. Rev Infect Dis. 1991. V.13 P. 405-412.

46. Eddy NB, Leimbach D. Synthetic analgesics. II. Dithienylbutenyl-Dithienylbutyl-amines. J. Pharmacol Exp Ther. 1953; 107: 385-93.

47. File S.E. Recent developments in anxiety, stress, and depression. Pharmacol Biochem Behav. 1996. V. 54. P. 3-12.

48. Fonteriz R.I., Lopez M.G., Garcia-Sancho J., Garcia A.G. Alamethicin channel permeation by Ca2+, Mn2+ and Ni2+ in bovine chromaffin cells. FEBS Lett. 1991. V. 283. P. 89-92.

49. Fox R.O., Richards F.M. A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-A resolution. Nature. 1982. V. 300. P. 325-330.

50. Gonzalez B.E. Azithromycin compared with beta-lactam antibiotic treatment failures in pneumococcal infections of children. Pediatr Infect Dis J 2004; 23:399-405

51. Gladtke E. Tolerable and intolerable side effects of antibiotic therapy. Monatsschr Kinderheilkd. 1984. V. 132. P. 760-4.

52. Goulard C., Hlimi S., Rebuffat S., Bodo B. Trichorzins HA and MA, antibiotic peptides from Trichoderma harzianum. I. Fermentation, isolation and biological properties. J. Antibiot. 1995. V. 48. P. 1248-1253.

53. Grieco A., Miele L., Giorgi A., Civello I.M., Gasbarrini G. Acute cholestatic hepatitis associated with celecoxib. Ann Pharmacother. 2003. V. 37. P. 748-9.

54. Hernandez-Trujillo V.P., Lieberman P.L., Chowdhury B.A. Drug allergens, haptens, and anaphylatoxins. Clin Allergy Immunol. 2004. V. 18. P. 387-419.

55. Ishiyama D., Satou Т., Senda H., Fujimaki Т., Honda R., Kanazawa S. Ishiyama D., Satou Т., Senda H., Fujimaki Т., Honda R., Kanazawa J. Antibiot. 2000. V. 53. P. 728-732.

56. Juntunen-Backman K., Peltola H., Backman A., Salo O.P. Safe immunization of allergic children against measles, mumps, and rubella. Am J Dis Child. 1987. V. 141. P. 1103-1105.

57. Kaaber K., Nielsen A.O., Veien N.K. Vaccination granulomas and aluminium allergy: course and prognostic factors. Contact Dermatitis.- 1992. V. 26. P. 304-306.

58. Karle I.L., Flippen-Anderson J.L., Agarwalla S., Balaram P. Conformation of the flexible bent helix of Leul-zervamicin in crystal С and a possible gating action for ion passage. Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. V. 88. P. 5307-5311.

59. Karle I.L., Perozzo M.A., Mishra V.K., Balaram P. Crystal structure of the channel-forming polypeptide antiamoebin in a membrane-mimetic environment. Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. V. 95. P. 5501-5504.

60. Karle IL, Flippen-Anderson JL, Sukumar M, Balaram P. Differences in hydration and association of helical Boc-Val-Ala-Leu-Aib-Val-Ala-Leu-(Val-Ala-Leu-Aib)2-0Me.xH20 in two crystalline polymorphs. J Med Chem. 1992 V. 35 P. 3885-9.

61. Kelkar P., Li J. Cephalosporin Allergy. N. Engl. J. Med. 2001. V. 345. P. 804-809.

62. Kelley A.E., Gauthier A.M., Lang C.G. Amphetamine microinjections into distinct striatal subregions cause dissociable effects on motor and ingestive behavior. Behav. Brain Res. 1989. V. 35. P. 27-39.

63. Kiec-Swierczynska M. Allergic reaction to merthiolate (a disinfectant) based on material from the Occupational Medicine Institute in Lodz. Med Pr. 1996. V. 47. P. 125-131.

64. Kloinkant H., Dohren V. Peptide antibiotics. Compragensive biotechnology. 1983 V. 3. Pregamon Press. Jxford.

65. Knaus H.G., Striessnig J., Koza A., Glossmann H. Neurotoxic aminoglycoside antibiotics are potent inhibitors of 125I.-Omega-Conotoxin GVIA binding to guinea-pig cerebral cortex membranes. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1987. V. 336. P. 583-6.

66. Kondo A., Ohnishi A., Nagara H., Tateishi J. Neurotoxicity in primary sensory neurons of adriamycin administered through retrogradeaxoplasmic transport in rats. Neuropathol Appl Neurobiol. 1987. V. 13. P. 177-92.

67. Lauer G.M., Walker B.D. Hepatitis С Virus Infection. N.Engl. J. Med. 2001. V. 345. P. 41-52.

68. Lee S.J., Yun B.S., Cho D.H. and Yoo I.D. Tylopeptins A and B, new antibiotic peptides from Tylopilus neofelleus. J. Antibiot. 1999. V. 52. P. 998-1006.

69. Lieberman J.M. Appropriate antibiotic use and why it is important: the challenges of bacterial resistance. Pediatr Infect Dis J. 2003. V. 22 P.l 1431151.

70. Lietman P.S. Fluoroquinolone toxicities. An update. Drugs. 1995. V. 49. P. 159-63.

71. Maldonado F., Portier H., Kisterman J.P. Bilateral facial palsy in a case of leptospirosis. Scand J Infect Dis. 2004. V. 36 P. 386-8.

72. Mangan S.H., Campenhout A.V., Rush C., Golledge J. Osteoprotegerin upregulates endothelial cell adhesion molecule response to tumor necrosis factor-alpha associated with induction of angiopoietin-2. Cardiovasc Res. 2007. Aug 2; (Epub ahead of print).

73. Mills D.M., Rubel E.W. Variation of distortion product otoacoustic emissions with furosemide injection. Hear Res. 1994. V. 77 P. 183-99.

74. Molle G., Duclohier H., Julien S., Spach G. Synthetic analogues of alamethicin: effect of C-terminal residue substitutions and chain length on the ion channel lifetimes. Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1064. P. 365369.

75. Monaco V., Formaggio F., Crisma M., Toniolo C., Hanson P., Millhauser G.L. Orientation and immersion depth of a helical lipopeptaibolin membranes using TO AC as an ESR probe. Biopolymers. 1999. V. 50. P. 239-253.

76. Moser V. Neurotoxicol Teratol. 2000. V. 19 № 6. P. 407-415.

77. Murakami H., Yayama K., Chao J., Chao L. Atrial natriuretic peptide gene delivery attenuates gentamycin-induced nephrotoxicity in rats. Nephrol Dial Transplant. 1999. V. 14. P. 1376-84.

78. Mueller P., Rudin D.O. Resting and action potentials in experimental bimolecular lipid membranes. Nature. 1968. V. 217. P. 713-719.

79. Nagaoka Y., Iida A., Kambara Т., Tachikawa E., Asami K., Fujita Т. Effect of lipophilicity of trichosporin-Bs on ion-channel formation and catecholamine-releasing activity. Biol. Pharm. Bull. 1995. V. 18. P. 640642.

80. Nagaraj G., Uma M.V., Shivayogi M.S, Balaram H. Antimalarial Activities of Peptide Antibiotics Isolated from Fungi. Antimicrobial agents and Chemotherapy. V. Jan. 2001. P. 145-149

81. Neal M.J. Medical Pharmacology at a Glance. Oxford: Blackwell sci. publ., 1992.92 p.

82. Neal R.A., van Bueren J., Hooper G. The activity of nitrofurazone and furazolidone against Leishmania donovani, L. major and L. enriettii in vitro and in vivo. Ann Trop Med Parasitol. 1988. V. 82. P. 453-6.

83. Novitzky N., Rouskova A. Infectious complications following T-cell depleted hematopoietic stem-cell transplantation. Cytotherapy. 2001. V. 3 P. 165-73.

84. Neuhof Т., Berg A., Besl H., Schwecke Т., Dieckmann R., von Dohren H. Peptaibol production by sepedonium strains parasitizing boletales. Chem Biodivers. 2007. V. 4. P. 1103-15.

85. Neuwelt E.A., Glasberg M., Frenkel E., Barnett P. Neurotoxicity of chemotherapeutic agents after blood-brain barrier modification: neuropathological studies. Ann Neurol. 1983. V. 14. P. 316-24.

86. Nzeako B.C., Al-Qasabi S.S. Evaluation of the neutralising capacity of bactec medium for some antibiotics. Br J Biomed Sci. 2004. V. 61(4). P. 171-4.

87. Okuda M., Iida A., Uesato S., Nagaoka Y., Fujita Т., Takaishi Y., Terada H. Fungal metabolites. X. The effect of peptide antibiotics, trichosporin-Bs, on the respiratory activity of mitochondria. Biol. Pharm. Bull. 1994. V. 17. P. 482-485.

88. Ovchinnikova T.V., Levitskaya N.G., Voskresenskaya O.G., Yakimenko Z.A., Tagaev A.A., Ovchinnikova A.Yu., Murashev A.N., Raap J., and Kamenskii A.A. Chem. Biodivers. 2007. V. 4. No. 6. P. 1374-1387.

89. O'Grady F. et al. (Eds.). Anti-Infective Agents and their Use in Therapy. Antibiotic and Chemotherapy. 1997. 7th ed. New York etc.: Churchill Livingstone

90. Panday R.C., Cook J.C., Konneth L., Reinhart Jr. High resolution and field desorption mass spectrometry studies and revised structures of alameticins I and II. Biochemical et Biophysical Acfa. 1991. V. 1153. P. 8469-8483

91. Peter G., Pappas J.H., Jack D. S., Scott G. F., William E. D., Thomas J. W., John E. E. Практическое руководство по лечению кандидоза. Clinical Infection Diseases. 2004. V. 38. P. 161-189.

92. Porsolt R.D. Historical perspective on CMS model. Psychopharmacology 1997. V. 134. P. 363-4.

93. Posner J.D. Particular problems of antibiotic use in the elderly. Geriatrics. 1982. V. 37. P. 49-54.

94. Powell B.L., Capizzi R.L., Lyerly E.S., CooperM.R. Peripheral neuropathy after high-dose cytosine arabinoside, daunorubicin, and asparaginase consolidation for acute nonlymphocytic leukemia. J Clin Oncol. 1986. V. 4. P. 95-7.

95. Quintiliani R., Owens R. Jr., Grant E. Clinical role of fluoroquinolones in patients with respiratory tract infections. Infect Dis Clin Pract. 1999. V. 8. P. 28-41.

96. Rebuffat S., Conraux L., Massias M., Auvin-Guette C., Bodo В. Sequence and solution conformation of the 20-residue peptaibols, saturnisporins SA II and SA IV. Int. J. Pept. Protein Res. 1993. V. 41. P. 7484.

97. Roychowdhury S., Vyas P.M., Svensson C.K. Formation and uptake of arylhydroxylamine-haptenated proteins in human dendritic cells. Drug Metab Dispos. 2007. V. 4. P. 676-81.

98. Samsom M.S., Balaram P., Karle I.L. Ion channel formation by zervamicin IIB. European Biophysics Journal. 1993. V 18. P. 345- 351

99. Schliamser S.E., Broholm K.A., Liljedahl A.L., Norrby S.R. Comparative neurotoxicity of benzylpenicillin, imipenem/cilastatin and FCE 22101, a new injectible penem. J Antimicrob Chemother. 1988. V. 22 P. 687-95.

100. Schwartz G.J., Haycock G.B., Edalmann C.M., Spitzer A. A simple estimate of glomerular filtration rate in children derived from body length and plasma creatinine. Pediatrics. 1976. V. 58. P. 259—63.

101. Snook C.F., Woolley G.A., Pattabhi V., Wood S.P., Blundell T.L., Wallace B.A. The structure and function of antiamoebin I, a proline-rich membrane-active polypeptide. Structure. 1998. V. 6. P. 783-792.

102. Steinman M.A., Steinman T.I. Clarithromycin-associated visual hallucinations in a patient with chronic renal failure on continuous ambulatory peritoneal dialysis. Am J Kidney Dis. 1996. V. 27. P. 143-6.

103. Thompson J.D., Higgins D.G. Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994. V. 22 P. 4673^1680.

104. Tsantrizos Y.S., Pischos S., Sauriol F. Isolation and semi-synthesis of a bioactive taxane from Taxus canadensis. J. Org. Chem. 1996. V. 61. P. 2118-2121.

105. Toniolo С., Peggion E., Crisma M., Formaggio F., Shui X.Q., Eggleston, D.S. Structure determination of racemic trichogin A IV using centrosymmetric crystals. Nat. Struct. Biol. 1994. V. 1. P. 908-914.

106. Turton J.A., Andrews C.M., Havard A.C., Robinson S., York M., Williams T.C., Gibson F.M. Haemotoxicity of thiamphenicol in the BALB/c mouse and Wistar Hanover rat. Food Chem Toxicol. 2002. V. 40. P. 1849-61.

107. Ungvary G., Szakmary E., Tatrai E., Hudak A., Naray M., Morvai V. Embryotoxic and teratogenic effects of indium chloride in rats and rabbits. J Toxicol Environ Health A. 2000. V. 59 P. 27-42.

108. Yun B.S., Yoo I.D., Kim Y.H., Kim Y.S., Lee S.J., Kim, K.S., Yeo W.H. Lipid peroxidation inhibitory activity of some constituents isolated from the stem bark of Eucalyptus globulus. Tetrahedron Lett. 2000. V. 41. P. 1429-1431.

109. Zepp F., Knuf M., Habermehl P., et.al. Pertussis-specific cell-mediated immunity in infants after vaccination with a tricomponent acellular pertussis vaccine. Infect Immun. 1996. V. 10. P. 4078-4084.

110. Zimmerman R.K., Ruben F.L., Ahwesh E.R. Influenza, influenza vaccine, and amantadine/rimantadine. J Fam Pract. 1997. V. 45. P. 107122.