Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Оценка фармакокинетического взаимодействия афобазола с препаратом-субстратом изофермента цитохрома Р450 CYP1A2

НОВИЦКАЯ ЯНИНА ГЕННАДЬЕВНА

ОЦЕНКА ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АФОБАЗОЛА С ПРЕПАРАТОМ-СУБСТРАТОМ ИЗОФЕРМЕНТА ЦИТОХРОМА Р450 СУР1А2

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

11 СЕН 2014

Москва-2014

005552324

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательском институте фармакологии имени В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Литвин Александр Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАН, директор ФГБУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков

им. Г.Ф. Гаузе» РАМН Фирсов Александр Алексеевич

доктор биологических наук, профессор кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО «Первого МГМУ

им. И.М. Сеченова» Минздрава России Соколов Андрей Владимирович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Минздрава России

Защита диссертации состоится «_»_2014 г. в_ч на

заседании диссертационного совета Д. 001.024.01 на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8 и на сайте www.academpharm.ru

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Астуальность проблемы

Взаимодействие лекарственных средств (ЛС) играет важную роль в эффективности и безопасности фармакотерапии и может приводить, как к повышению, так и понижению эффективности лечения, а иногда, к проявлению серьезных нежелательных реакций. В последнее время все большее внимание уделяется изучению взаимодействия лекарственных веществ (JIB) на уровне изменений их биотрансформации. Известно несколько сотен JIC, влияющих на метаболизм других препаратов. При этом J1C способны, как повышать активность ферментов метаболизма J1B (индукция), так и снижать ее (ингибировапие) (Кукес В.Г. с соавт., 2008; Жердев В.П. с соавт., 2010; Levy R.H. et al., 2002; Testa В., Kramer S.D., 2008).

Влияние новых ЛС на изоформы цитохрома Р450 необходимо оценивать уже на доклиническом этапе в экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo. Несмотря на технологические преимущества в проведении in vitro исследований, интерпретация полученных параметров остается проблематичной из-за невозможности корректной экстраполяции на целостный организм (Tucker G.T. et al., 2001). Последнее определяет высокую вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Поэтому предпочтительным представляются опыты in vivo с использованием в качестве экспериментальной модели беспородных крыс (Kobayashi К. et al., 2002; Lee D.Y. et al., 2006).

В современной терапевтической практике при лечении различных патологий полипрагмазия стала основным подходом, поэтому описание межлекарственных взаимодействий является стандартной процедурой уже на этапе разработки лекарственных средств как за рубежом, так и в Российской Федерации в течение последних 20 лет (Сычев Д.А., 2009; Bailie G.R. et al., 2004; NagaiN., 2010).

В ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН создан оригинальный анксиолитик афобазол - 2-(2-морфолиноэ™лтио)-5-этоксибензилимидазола дигидрохлорид (Середенин С.Б. с соавт., 1998; Seredenin S.B., 2003).

Афобазол находит все более широкое применение в клинической практике при лечении генерализованных тревожных расстройств в составе поликомпонентной фармакотерапии. Существует вероятность, что наряду с афобазолом могут применяться метаболизируемые изоферментом CYP1A2 препарата, например, атипичные нейролептики (клозапин, оланзапин), фторхинолоны, циметидин, рифампицин, фенобарбитал и другие сильнодействующие ЛС. При этом возможны нежелательные межлекарственные взаимодействия и, как результат - выраженные побочные эффекты.

В связи с этим чрезвычайно важной и актуальной задачей является изучение лекарствешгых взаимодействий афобазола при комбинированном приеме с препаратами, являющимися типичными субстратами представителей суперсемейства цитохромов CYP1A2.

Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР Федерального государственного бюджетного учреждения «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»

РАМН «Изучение механизмов эндо- и,экзогенной регуляции функций ЦНС, разработка новых оригинальных нейропсихотропных средств» (№ госрсгистрации 01.2006 06601).

Цель исследования

Изучение фармакокинетического взаимодействия афобазола при комбинированном введении с препаратом-маркером кофеином, являющимся типичным субстратом изоформы цитохрома СУР1А2.

Задачи исследования

Для достижения цели настоящего исследования были поставлены следующие задачи:

1. Воспроизвести/модифицировать аналитический метод количественного определения кофеина и его метаболитов (параксантина, теобромина, теофиллина и 1,3,7-триметилмочевой кислоты) в плазме крови и моче крыс с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2. На крысах оценить фармакокинетическое взаимодействие афобазола при одинаковой длительности введения (субхроническое) в эффективной, анксиолитической дозе (5 мг/кг) и дозе, превышающую эффективную (25 мг/кг), с препаратом-субстратом цитохрома СУР1А2.

3. Изучить влияние длительности введения афобазола (однократно, в течение 2-х и 4-х суток) в дозе 25 мг/кг на изменение активности изоформы СУР1А2 у крыс.

4. Оценить метаболические отношения (МО) маркера СУР1А2 после введения

афобазола в различных дозах по данным мочевой экскреции и провести сравнительный анализ с МО полученными в плазме крови крыс.

5. Показать адекватность и избирательность разработанной методологии на примере определения изменения активности изоформы СУР1А2 после введения стандартных ингибиторов и индукторов данного изофермента в эффективных дозах у крыс.

6. Сделать заключение о возможном комбинированном применении афобазола с препаратами различных фармакологических групп, метаболизируемых СУР1А2.

Научная новизна исследования

Впервые изучена фармакокинетика субстратного маркера СУР1А2 - кофеина и его метаболитов при комбинированном введении с афобазолом.

Установлено, что после введения афобазола в течение 4-х суток (по 3 раза в сутки через каждые 3 ч) в эффективной, анксиолитической дозе 5 мг/кг ни ингибирующий, ни индуцирующий эффекты на изоформу СУР1А2 не выявлены. Пятикратное увеличение дозы афобазола до 25 мг/кг при курсовом введении препарата позволило выявить умеренный индуцирующий эффект через 2 суток, который усиливался через 4 дня.

По данным мочевой экскреции установлено, что афобазол в эффективной, анксиолитической дозе 5 мг/кг и в дозе 10 мг/кг после 4-х дневного введения (3 раза в сутки) не вызывал изменения активности изоформы СУР1А2. В то же время увеличите дозы афобазола до 25 мг/кг после многократного введения препарата позволило выявить

4

умеренный индуцирующий эффект. Дальнейшее ее увеличение до 50 мг/кг практически не изменило степень выраженпости этого эффекта, что может быть объяснено насыщением активных центров изофермента молекулами афобазола.

Сравнение величин МО (метаболит/кофеин), полученных в плазме крови и суточной моче крыс показало, что усиление индуцирующего эффекта происходит только при значительном увеличении дозы афобазола. Различия в значениях МО в плазме крови и моче можно объяспить различными уровнями концентрации теобромина, параксантина и кофеина в рассматриваемых биожидкостях.

Апробирована методология изучения влияния JIC на изоформу CYP1A2 цитохрома Р450 in vivo с использованием стандартных модификаторов и субстрата-маркера.

Установлено, что активность изоформы CYP1A2 у крыс можно оценивать по одному из метаболитов препарата-маркера (параксантину или теобромину).

Практическая значимость исследования

Афобазол в эффективной, анкснолитической дозе (5 мг/кг) у крыс, соответствующей терапевтической у человека, не вызывает ни ингибирующего, ни индуцирующего эффектов на изоформу CYP1A2. Таким образом, терапевтическая доза афобазола у человека (10 мг) также пе будет вызывать изменений активности данной изоформы.

Полученные данные могут составить основу рекомендаций по комбинированному применению афобазола с рядом J1C с целью повышения эффективности и безопасности проводимой фармакотерапии.

Апробированную методологию оценки изменения активности CYP1A2 с применением стандартных индуктора и ингибитора можно использовать при разработке новых JIC.

Личный вклад автора

Автором самостоятельно воспроизведена и модифицирована методика количественного определения кофеина и его метаболитов в биоматериале, проведены исследования по изучению влияния афобазола на фармакокинетику кофеина и его метаболитов, обработаны результаты, сформулированы выводы. При непосредственном участии автора подготовлены публикации по результатам работы.

Положения, выносимые на защиту

1. Афобазол в эффективной дозе 5 мг/кг после субхронического введения не вызывает изменения активности изоформы CYP1А2.

2. Однократное введение афобазола в дозе 25 мг/кг не изменяет активность изоформы CYP1A2. Субхроническое введение афобазола в этой дозе в течение 2-х суток вызывает умеренный индуцирующий эффект. При увеличении длительности введения афобазола до 4 суток его индуцирующий эффект усиливается.

3. Афобазол в дозе 5 мг/кг и 10 мг/кг после 4-х дневного введения не вызывает измепения активности изоформы CYP1A2. Увеличение дозы афобазола до 25 мг/кг

5

вызвало индуцирующий эффект. Дальнейшее увеличение дозы препарата до 50 мг/кг практически не изменило степень выраженности этого эффекта.

4. Сравнительный анализ величин МО метаболитов кофеина (теобромина и параксантина) в плазме крови и суточной моче крыс показал, что с увеличением дозы афобазола индуцирующий эффект усиливается. Оценку активности изоформы CYP1A2 можно проводить по данным полученным в плазме крови или суточпой моче крыс.

5. Апробирована методология изучения влияния лекарственного средства афобазола на изоформу цитохрома Р450 CYPIА2 в эксперименте.

6. Афобазол в терапевтической дозе 10 мг (3 раза в день) не вызывает изменения активности изоформы CYPI А2, поэтому его можно применять в сочетании с препаратами, метаболизируемыми данным изоферментом.

Апробация работы

Основные результаты работы представлены на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012 г.); IV съезде фармакологов России «Инновация в современной фармакологии» (Казань, 2012 г.); Евразийском конгрессе «Медицина, фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2013 г.); IX Международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: Вопросы медицины» (Москва, 2013 г.); Первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблема разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013 г.); конференции лаборатории фармакокинетики ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН (Москва, 2013 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи (в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ), 1 статья и 4 тезиса докладов в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Содержит 15 таблиц и 12 рисунков. Список литературы включает 173 источника, из них 28 отечественных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования

В работе использовались:

Субстанция афобазола, «Erregierre SpA.» (Италия). Субстанция кофеина «Fluka» (ФРГ), субстанция теобромина «Sigma» (ФРГ), субстанция теофнллина «Sigma» (ФРГ), субстанция параксантина «Fluka» (Канада), субстанция 1,3,7 -триметилмочевой кислоты «Sigma» (ФРГ).

Фепитоин (дифенин) - таблетки 100 мг, «Луганский химфармзавод» (Украина).

Ципрофлоксацин - субстанция, «Aarti Dmgs Limited» (Индия).

Содержание основного компонента во всех используемых в работе стандартных веществах было не ниже 99,0%.

Экспериментальные животные

Влияние афобазола на активность изоформы CYP1A2 после введения внутрь проводили на ненаркотизированных белых беспородных крысах-самцах с массой тела 200±20 г, полученных из питомника «Столбовая» РАМН.

Животных содержали в стандартных условиях вивария ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН при 12-ти часовом световом режиме. Исследования выполняли согласно «Правилам лабораторной практики» (Приказ Мипздравсоцразвития РФ №708н от 23 августа 2010 г.).

Введение препарата

Водный раствор кофеина, а также раствор афобазола дигидрохлорида готовили ех tempore и вводили крысам натощак (За 12 ч до эксперимента животных лишали корма). Введение осуществляли перорально с помощью металлического зонда. После введения препарата крыс помещали в индивидуальные клетки.

Способ отбора крови в мочи

Образцы крови получали декапитацией животных: кровь сливали в пластиковые пробирки, обработанные гепарином. Пробы отбирали в течение 24 ч в дискретные интервалы времени: до введения (контроль) и через 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4; 6; 8; 24 ч после введения JIC. Плазму крови получали центрифугированием образцов крови при 3000 об/мин в течение 10 мин и хранили при температуре -18 °С.

С целью сбора суточной мочи животных помещали в индивидуальные клетки на 24 ч со свободным доступом к воде. Суточную мочу собирали в стеклянные предварительно пронумерованные пробирки. Далее измеряли и записывали в лабораторный журнал для последующих расчетов объем собранной мочи. Образцы мочи хранили при -18 "С без добавления консервантов.

При изучении влияния афобазола, индуктора или ингибитора на изменение активности CYP1A2 (по данным мочевой экскреции) крысам каждой группы сначала вводили кофеин без афобазола, индуктора или ингибитора (контроль), затем по истечении 3-х суток этим же животным вводили афобазол (индуктор или ингибитор) в течение 4-х суток (субхроническое введение). Последнее введение афобазола (индуктора или ингибитора) производили вместе с кофеином. Для этого первоначально получали раствор кофеина в воде (навеску растворяли в горячей воде 85°С), в котором после охлаждения, растворяли навеску афобазола дигидрохлорида. При этом каких-либо видимых изменении полученного раствора не наблюдали.

При изучении влияния афобазола, индуктора или ингибитора на изменение активности CYP1A2 сбор мочи крыс проводили по следующей схеме: Контроль. После введения кофеина без афобазола (индуктора или ингибитора) крыс помещали в индивидуальные клетки со свободным доступом к воде. У каждой крысы собирали суточную мочу. Отсчет времени начинался после введения препарата-маркера. Субхроническое введение. После последнего введения афобазола (индуктора или ингибитора) совместно с кофеином крыс помещали в индивидуальные клетки со свободным доступом к воде. У каждой крысы собирали суточную мочу. Отсчет времени начинался после введения афобазола (индуктора или ингибитора) с препаратом-маркером.

Условия количественного определения кофеина и его метаболитов в плазме крови и моче животных

Изучение влияния афобазола на CYP1A2 с помощью препарата-маркера кофеина в моче и плазме крови крыс проводили методом ВЭЖХ.

Для анализа кофеина и его метаболитов в биожидкостях широко используются хроматографические методы, в частности ВЭЖХ (Филимонова A.A., 2009; Haughey D.B., 1982; Rasmussen В.В., Brosen К., 1996; Schräder Е. et al., 1999; Oh K.S. et al., 2012).

На основании, описанных в литературе методик нами была воспроизведена с некоторыми модификациями методика количественного определения кофеина и его четырех метаболитов в плазме крови и моче крыс.

Хроматографический анализ проводили на жидкостном хроматографе «Beckman Coulter» (США), состоящем из изократической помпы «System Gold 127», ультрафиолетового детектора «System Gold 166» и компьютера с соответствующим пакетом программ для обработки хроматографических данных («Мультихром», «Амперсенд», Россия).

Условия хроматографирования: Колонка - «Luna Cíe (2)» («Phenomenex», США; 250*4,6 мм; 5 мкм);

Подвижная фаза (ПФ) - вода (значение pH доведено до 4,0 с помощью 1,0% раствора кислоты муравьиной), ацетонитрил и метанол (80:8:14, по объему). Скорость подвижной фазы - 1,5 мл/мин.

Хроматографический анализ проводили при комнатной температуре (18-20°С). Перед хроматографированием ПФ дегазировали на ультразвуковой бане в течение 5 мин. Объем пробы составил 100 мкл.

Детектирование целевых соединений проводили при длине волны 273 нм.

В этих условиях время удерживания кофеина в среднем составило б,7±0,3 мин, теобромина - 3,1±0,2 мин, параксантина - 4,5±0,2 мин, теофиллина - 4,7±0Д мин, 1,3,7-триметилмочевой кислоты - 5,1±0,3 мин Коэкстрактивные вещества не мешали определению.

Валидацию методики проводили в соответствии с «Руководством по валидации аналитических методик для производителей лекарств» (Береговых В.В., 2008). Количественное определение кофеина и его метаболитов проводили методом абсолютной калибровки. Линейность методик оценивалась по 8 калибровочным стандартам (25-5000

8

нг/мл). Стандарты готовили последовательным разведением ПФ матричных растворов кофеина, теобромина, теофиллина, параксантина, 1,3,7-триметилмочевой кислоты (100 мкг/мл в воде).

В изучаемом диапазоне концентраций (С) отмечена линейная зависимость между концентрациями анализируемых соединений и соответствующими площадями хроматографических пиков, усредненное значение которых описывается следующими уравнениями (и=7): для кофеина - 5 = -0,24 + 0,21 хС (г =0,9995); для теобромина - 5 = -6,25 + 0,19*С (г =0,9991); для теофиллина - 5 =-5,13 + 0,22хС (г = 0,9993); для параксантина - 5 = -4,11+0,17x0 (/=0,9998); для 1,3.7-триметилмочевой кислоты - £ =-3,29+0,11хС (/=0,9993), где Я - площадь хроматографического пика вещества (в единицах интегрирования хроматографа), С- концентрация, нг/мл.

Предел количественного обнаружения кофеина, теобромина, теофиллина, параксантина (1Х><3) составил 25 нг/мл при соотношении сигнал/шум = 3:1, а предел детектирования (1ХЮ) - 10 нг/мл. Для 1,3,7-триметилмочевой кислоты 1_0<3 - 50 нг/мл при соотношении сигнал/шум = 3:1 и ЬОР - 25 нг/мл.

Относительная ошибка определения кофеина для концентрации 25 нг/мл

составила не более 8,9%, параксантина - не более 8,0%, теобромина - не более 6,2%, и 1,3,7-триметилмочевой кислоты (для концентрации 50 нг/мл) - не более 9,3%.

Обработка биологических проб, экстракция кофенпа и его метаболитов из биологических образцов

Подготовка плазмы крови крыс к хроматографическому анализу

Исследуемые вещества извлекали из плазмы крови, для чего осаждали белки с помощью 0,5 мл ацетонитрила, прибавляя его в центрифужную пробпрку к 0,5 мл плазмы крови. Содержимое пробирки перемешивали на вихревом миксере в течение 30 с. Полученный раствор центрифугировали в течение 15 мин при 8000 об/мин. Супернатант переносили в выпарительную колбу и выпаривали досуха на роторном испарителе. Сухой остаток растворяли в 1,0 - 10,0 мл ПФ (в зависимости от величин концентраций в различные интервалы времени), перемешивали на вихревой мешалке, и 100 мкл полученного раствора вводили в петлю инжектора хроматографа.

Результаты исследования показали, что процент извлечения кофеина из плазмы крови составил 89,4±2,5% (*±80), теофиллина - 87,8±2,9%, параксантина - 85,9±4,4%, теобромина - 88,2±2,0% и 1,3,7-триметилмочевой кислоты - 80,1 ±2,6%.

Подготовка мочи крыс к хроматографическому анализу

До проведения экстракции образцы хранили в замороженном виде. В экстракционную пробирку к 0,05 мл мочи добавляли 0,5 мл ацетатного буфера (0.01М, рН 4,0). Затем добавляли 5,0 мл смеси этилацет/2-пропанол (93:7). Смесь встряхивали на механическом, горизонтальном шейкере в течение 15 мин, и после центрифугировали 10 мин при 1000 об/мип. Пробирку помещали в морозильную камеру и хранили при -30ЭС до тех пор, пока водная фаза не была заморожена. Органическую фазу перемещали в

коническую колбу и выпаривали досуха при 55°С в токе азота. Остаток растворяли в 0,3 мл подвижной фазы, перемешивали на вихревой мешалке, и 100 мкл полученного раствора вводили в петлю инжектора хроматографа (Rasmussen В.В., Brosen К., 1996).

Результаты исследования показали, что процент экстракции кофеина из мочи составил 89,1±8,3% (*±SD), теофиллина - 82,5±9,4%, параксантина - 83,8±6,0%, теобромина - 81,6±5,9% и 1,3,7-триметилмочевой кислоты - 73,0*9,7%.

Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации экспериментальных данных

Основные фармакокинетические параметры рассчитаны моделыго-независимым методом (Агафонов A.A., Пиотровский В.К., 1991):

AUCo-t (мкг/млхч) - площадь под фармакокинетической кривой (площадь под кривой концентрация лекарственного вещества - время) после перорального введения вещества крысам. AUCo-t рассчитывается от момента введения до последнего отбора пробы; Tmlx (ч) - время достижения максимальной концентрации препарата в плазме крови после перорального введения;

Ста, (мкг/мл) - максимальная концентрация лекарственного вещества/метаболита в плазме крови после перорального введения;

CWAUCt» (ч1) - параметр, характеризующий скорость всасывания препарата в системный кровоток;

MRT (ч) - среднее время пребывания лекарственного вещества в организме; Kji (ч"') - константа элиминации, параметр, характеризующий скорость выведения препарата из организма;

tiaei (ч) - период, за который выводится половина введенной и всосавшейся дозы лекарственного вещества;

С1 (л/ч/кг) - общий плазменный клиренс, параметр, характеризующий скорость «очищения» организма от JIB;

Vd (л/кг) - кажущийся объем распределения JIB, параметр, характеризующий степень захвата ЛВ тканями из плазмы крови. МО - метаболическое отношение

Оценка индуцирующего или нигнбирующего эффекта

Индуцирующий или ингибирующий эффект оценивали по абсолютным величинам метаболических отношений. Метаболическое отношение (по плазме крови) - это отношение AUC метаболита к AUC неизмененного вещества. Метаболическое отношение (по моче) - это отношение концентрации метаболита к концентрации неизмененного вещества в суточной моче.

Статистическая обработка полученных результатов

Полученные экспериментальные данные были статистически обработаны с помощью программы "Excel v. 11.0". В таблицах представлены следующие статистические характе-

ристики: х - среднее арифметическое результатов измерений, SD - стандартное отклонение, S.r - стандартное отклонение от среднего арифметического, Лл - абсолютная погрешность измерений, е% - относительная погрешность измерений.

Достоверность различий для сравниваемых концентраций исследуемых соединений оценивали с помощью парного критерия Стьюдента (Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2001).

Поскольку на каждую временную точку использовали по 8 животных, результирующие фармакокинетические кривые построены по усредненным концентрациям, поэтому при расчетах фармакокинетических параметров отсутствует статистическая обработка результатов. Достоверность различий между величинами фармакокинетических параметров кофеина и его метаболитов после различных режимов введения афобазола оценивали по концентрациям соответствующих веществ в дискретные временные точки фармакокинетической кривой.

Рисунки были выполнены с использованием графического редактора "Origin v.7.0".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка фармакокннетического взаимодействия афобазола с препаратом-субстратом цитохрома CYP1A2 в эксперименте

Цель данного этапа - изучение фармакокннетического взаимодействия афобазола с препаратом - субстратом изоформы CYP1A2 у крыс.

В данной главе представлены данные по влиянию афобазола на изофермент CYP1A2 с использованием маркера - кофеина.

Предполагается, что изменение величины AUC„ t кофеина в сторону уменьшения в зависимости от продолжительности введения афобазола можно объяснить повышением интенсивности биотрансформации исходного соединения и как следствие индукцией изоформы CYP1A2. И наоборот, увеличение AUCo.t кофеина при прочих равных условиях можно объяснить снижением интенсивности биотрансформации препарата-маркера и как следствие ингибированием CYP1A2.

В случае метаболитов кофеина (теобромин, параксантин) увеличение соответствующих значений AUCo-t в зависимости от длительности введения афобазола приведет к индукции изучаемой изоформы (повышение интенсивности биотрансформации исходного соединения), а уменьшение AUC0-t - к ингибированию фермента.

В данном разделе представлены результаты влияния афобазола на фармакокинетику субстратного маркера CYP1A2 - кофеина и его метаболитов после различных режимов введения анксиолитика.

Для изучения влияния величины вводимой дозы на изучаемые процессы использовали эффективную, анксиолитическую дозу афобазола - 5 мг/кг (Seredenin, S.B., 2003) и дозу в 5 раз превышающую таковую.

Второй фактор, оцениваемый в настоящем исследовании, - влияние длительности введения крысам афобазола в дозе 25 мг/кг на возможный индуцирующий или ингибирующий эффекты.

Препарат-маркер кофеин вводили животным в дозе 50 мг/кг. Выбор доз афобазола и кофеина продиктован низкой токсичностью препаратов. Так LD50 афобазола для крыс составляет 1100 мг/кг (Соловьева И.К., 2006).

Исследования проводили на пяти группах крыс. Первая группа - крысы, которым вводили кофеин без афобазола (группа I; контроль); вторая группа - крысы, которым вводили кофеин на фоне 4-х дневного введения афобазола в дозе 5 мг/кг в (группа II); третья группа - животные, которым вводили однократно афобазол в дозе 25 мг/кг и кофеин (группа III); четвертая группа - крысы, которым вводили кофеин на фоне 2-х (группа IV) и 4-х дневного (группа V) введения афобазола в дозе 25 мг/кг. Животным II, IV и V групп препарат вводили 3 раза в день через каждые 3 ч. Режим дозирования афобазола основывался на величине периода полувыведения исследуемого ЛВ (Середенин С.Б. с соавт., 2007).

В пилотных исследованиях установлено, что в отличие от литературных данных, описывающих метаболизм кофеина у людей, в плазме крови крыс, которым вводили кофеин, либо афобазол и кофеин, детектировали помимо неизменного препарата в значительных количествах только два его метаболита (теобромин и параксантин). Теофиллин определялся в количествах не позволяющих провести достоверную оценку активности изофермента CYP1A2. 1,3,7 тримочевая кислота в плазме крови не регистрировалась даже в следовых количествах.

После введения животным кофеин подвергается интенсивной биотрансформации и уже через 0,25 ч в плазме крови регистрируются значительные концентрации его метаболитов теобромина и параксантина. Исследуемые соединения после различных режимов введения афобазола определяются на протяжении 8 ч, а концентрации теобромина и параксантина в плазме крови крыс, которым вводили кофеин на фоне 2 (группа IV) и 4 дневного (группа V) введения афобазола регистрируются в течение 24 ч. Снижение концентраций препарата и его метаболитов носят ярко выраженный однофазный характер. Фармакокинетика метаболитов кофеина (теобромина и параксантина) существенно отличается от кинетики исходного соединения, прежде всего, более низкими концентрациями и абсолютными величинами площадей под фармакокинетическими кривыми.

Сравнительный анализ основных фармакокинетических параметров кофеина в плазме крови крыс после различных режимов введения афобазола (табл. 1) показал, что изучаемое соединение всасывается из желудочно-кишечного тракта примерно с одинаковой скоростью (величины Cmax/AUC0-t, составили 0,225-0,256 ч"').

Таблица 1. Фармакокинетические параметры кофеина в плазме крови крыс после различных режимов дозирования афобазола

№/№ групп Фармакокинетические параметры

AUCo-t. Сщах, Cmax/AUCt. Ттах, С1, Kel, tl/2el. MRT, vd,

мкг/млхч мкг/мл ч-' ч л/ч/кг ч-' Ч ч л/кг

I контроль 185,32 43,96 0,237 1,0 0,258 0,418 1,66 . 3,36 0,618

II 179,67 44,91 0,250 1,0 0,268 0,437 1,59 3,36 0,612

III 176,19 39,65 0,225 1,0 0,271 0,407 1,70 3,44 0,665

IV 145,36 36,11 0,248 1,0 0.336 0,503 1,38 2,88 0,668

V 131,40 33,68 0,256 1,0 0,373 0,523 1,33 2,86 0,714

Как видно из табл. 1 время достижения максимальной концентрации (Ттах) кофеина в плазме крови во всех пяти группах крыс составило 1,0 ч, а ее величина в контрольной группе - 43,96 мкг/мл. Максимальные концентрации (Стах) кофеина в группах II и III были близки по абсолютным величинам к аналогичному параметру контрольной группы. Сщах маркерного препарата в группе IV на 18%, а в группе V на 20% меньше по сравнению с контролем.

Анализ параметров кинетики позволяет заключить, что кофеин быстрее выводится из организма крыс IV и V групп в сравнении с контролем, на что указывают значения констант скорости элиминации из плазмы крови (K^i). Данные параметры для крыс групп IV и V по абсолютным величинам выше чем для крыс групп I, II и III. Как показали результаты, проведенного исследования абсолютные величины общего плазменного клиренса (С1) кофеина в группах II и III были близки по абсолютным величинам к аналогичному параметру контрольной группы. В то же время в группах IV и V значения клиренса значительно увеличиваются по сравнению с контролем. Так, этот параметр в группе IV вырос на 23% и в группе V - на 31%. Величины кажущихся объемов распределения (V<j) у животных IV и V групп, также выше аналогичного параметра контрольной группы.

Для метаболитов кофеина теобромина и параксантина наблюдается противоположный эффект. Они более продолжительное время выводятся из организма крыс групп IV и V по сравнению с контрольной группой животных, на что указывают значения констант скорости элиминации из плазмы крови и периодов полувыведения препарата из организма (ti/2ei) (табл. 2,3).

Таблица 2. Фармакокинетические параметры теобромина в плазме крови крыс после различных режимов дозирования афобазола

№/№ групп Фармакокинетические параметры

AUCo-t, Сщах, Тщах, Ке|, tl/2el, MRT,

мкг/млхч мкг/мл ч ч-1 ч ч

I контроль 18,35 4,56 3,0 0,171 4,06 7,84

II 22,14 4,63 3,0 0,213 3,26 6,51

III 19,06 4,71 3,0 0,230 3,02 6,26

IV 35,55 3,45 3,0 0,152 4,55 7,09

V 54,08 5,03 2,0 0,112 6,17 8,69

Таблица 3. Фармакокинетические параметры параксантина в плазме крови крыс после различных режимов дозирования афобазола

№/№ групп Фармакокинетические параметры

AUCo-T, Сщах, Тщах, Ке|, tl/2el, MRT,

мкг/млхч мкг/мл ч ч-' Ч ч

I контроль 12,10 2,54 3,0 0,356 1,95 4,70

II 15,19 2,96 3,0 0,310 2,23 4,67

III 11,84 2,61 3,0 0,361 1,92 4,60

IV 31,56 3,91 2,0 0,162 4,27 6,59

V 51,88 5,97 2,0 0,172 4,04 6,39

Быстрое исчезновение кофеина из организма характеризуется также величинами фармакокинетического параметра: среднее время удерживания препарата в организме (MRT) для крыс IV группы - 2,88 ч и для V - 2,86 ч, соответственно. В то время как величина MRT в контрольной группе составила 3,36 ч. Для метаболитов, наоборот, величины MRT у крыс IV и V группы превышают аналогичный параметр контрольной группы.

В то же время быстрое снижение концентраций неизмененного кофеина в плазме крови крыс IV и V групп обуславливает небольшие величины площадей под фармакокинетическими кривыми (AUCo-T = 145,36 и 131,40 мкг/млхч, соответственно) по сравнению с контролем. Величина AUCo-T в контрольной группе составила 185,32 мкг/млхч (табл. 1).

Необходимо отметить, что AUCo-t кофеина на фоне 2-х (группа IV) и 4-х дневного введения (группа V) афобазола в дозе 25 мг/кг достоверно отличаются от контроля. При этом AUC0.( кофеина на фоне 4-х дневного введения афобазола меньше, чем на фоне 2-х дневного введения (табл. 1). Уменьшение величин AUC кофеина и увеличение значений его CI и Vd на фоне 2-х и 4-х дневного введения афобазола в дозе 25 мг/кг в сравнении с

контрольной, II и III группами объясняется возрастанием интенсивности биотрансформации исходного соединения.

В то же время выявлено увеличение параметра AUC0-t теобромина и параксантина от продолжительности введения афобазола. Наибольшие величины AUC„, метаболитов получены после 4-х дневного введения афобазола в дозе 25 мг/кг. AUC0.t теобромина и параксантина на фоне 2-х и 4-х дневного введения афобазола в дозе 25 мг/кг достоверно отличаются от контроля. Необходимо отметить, что абсолютные величины AUCo-T метаболитов после введения афобазола в течении 4-х суток превышают аналогичные параметры после введения афобазола в течении 2-х суток (табл. 2, 3).

В результате, проведенного исследования нами установлено, что с увеличением продолжительности введения афобазола (с 2-х до 4-х суток) интенсивность образования теобромина и параксантина возрастает. Таким образом введение афобазола в дозе 25 мг/кг в течение 2-х и 4-х суток вызывает умеренный индуцирующий эффект на активность изоформы CYP1A2.

В заключительной части данного раздела исследования следует подчеркнуть, что все фармакокинетические параметры субстратного препарата кофеина и его двух основных метаболитов на фоне 4-х дневного введения афобазола крысам в эффективной, анксиолитической дозе 5 мг/кг достоверно не отличались от аналогичных параметров, рассчитанных для контрольной группы животных. Таким образом, афобазол в эффективной дозе не вызывает индукцию изофермента CYP1A2.

Оценка метаболических отношений кофеина и его метаболитов после различных режимов дозирования афобазола

Цель данного этапа - оценить степень индукции, вызванную различными режимами дозирования афобазола (доза и длительность введения) у крыс.

Индуцирующий эффект афобазола оценивали по абсолютным значениям метаболических отношений. В настоящей работе под «метаболическим отношением» принимали отношение площади под фармакокинетической кривой (AUC„_i) метаболитов кофеина в плазме крови к аналогичному параметру неизмененного вещества.

Оценивали МО (метаболит/кофеин) после введения кофеина (контроль) в сравнении с однократным комбинированным введением афобазола и кофеина, а так же после введения кофеина на фоне 2-х и 4-х дневного введения афобазола.

Результаты исследования по изучению влияния эффективной, анксиолитической дозы (5 мг/кг) афобазола на активность изоформы CYP 1А2 представлены на рис.1. Статистический анализ не выявил достоверно значимых различий между величинами МО обоих метаболитов кофеина в плазме крови животных групп I и II.

о

о

I

о

i

i

теобромин

параксантин

теобромин

CZ] группа I (контроль) !._.. í группа II

параксантин

I-- - Группа I (контроль)

I I Группа III 1 ' Группа IV Ii Группа V

Рис.1. Метаболические отношения Рис. 2. Метаболические отношения

метаболитов кофеина после 4-х дневного метаболитов кофеина после различных введения эффективной анксиолитической режимов введения афобазола (доза 25

Значком «*» отмечены статистически значимые различия при Р<0,05 в сравнении с контролем.

Однократное введение крысам дозы афобазола 5-кратно превышающую эффективную (25 мг/кг) также не приводит к статистически значимому изменению МО метаболитов кофеина к исходному соединению у животных группы III по сравнению с группой I (рис. 2).

В то же время при увеличении продолжительности введения афобазола, его индуцирующий эффект усиливается. Так величина МО после 2-х дневного введения афобазола в дозе 25 мг/кг превышает аналогичную величину в контроле в 2,5 раза для теобромина и в 3,3 раза для параксантина. Значение МО на фоне 4 дневного введения афобазола в дозе 25 мг/кг превышает аналогичную величину в контроле в 4,2 раза для теобромина и в 6,1 раз для параксантина (рис. 2).

Таким образом, при увеличении длительности многократного введения афобазола в дозе превышающей эффективную анксиолитическую дозу в 5 раз, его индуцирующий эффект на CYP1A2 усиливается.

Афобазол в эффективной дозе (5 мг/кг) не оказывает ни ингибирующего, ни индуцирующего действия на активность изоформы CYP1A2. При 5-кратном увеличении дозы анксиолитика выявлен индуцирующий эффект.

Учитывая высокую степень гомологичности изоформы CYP1A2 у крыс и человека (Lee D.Y. et al., 2006), можно предположить, что терапевтическая доза афобазола у человека (10 мг) также не будет вызывать изменений активности данной изоформы.

Таким образом, полученные данные позволяют предположить отсутствие межлекарственного взаимодействия афобазола в эффективной дозе с другими лекарственными средствами, метаболизируемыми изоформой CYP1A2.

дозы афобазола 5 мг/кг.

мг/кг).

Оценка влияния афобазола на изменение активности изоформы CYP1A2 после его введения в различных дозах по данным мочевой экскреции

Цель данного этапа - оценить степень индукции, вызванную различными дозами афобазола, при одинаковой длительности введения у крыс.

В настоящем исследовании изучали влияние различных доз афобазола (от анксиолитической - 5 мг/кг до 50 мг/кг) при одинаковой длительности введения препарата (4 дня). Выбор доз основывался на результатах ранее проведенных исследований анксиолитической активности и экспериментальных данных фармакокинетики афобазола у крыс (Seredenin S.B., 2003, Виглинская А.О. с соавт., 2007). Исследования проводили на 4 группах крыс. В каждую группу входило по 8 животных. Введение афобазола производили трехкратно через каждые 3 ч в дозе 5 мг/кг - группа I,

10 мг/кг - группа II, 25 мг/кг - группа III, и 50 мг/кг - группа IV. Препарат-маркер кофеин вводили животным в дозе 50 мг/кг. У каждой крысы собирали суточную мочу. Индуцирующий эффект афобазола оценивали по абсолютным значениям МО (отношение концентрации метаболита к концентрации неизмененного вещества в суточной моче).

На рис. 3 представлены величины МО метаболита кофеина - теобромина к неизмененному веществу после введения различных доз афобазола. Статистический анализ не выявил достоверно значимых различий между величинами МО теобромина к кофеину в моче животных группы I и И. МО после 4-х дневного введения крысам афобазола в эффективной анксиолитической дозе 5 мг/кг по абсолютной величине практически не отличалось от аналогичного параметра в контроле. Величина МО в группе

11 после субхронического введения афобазола достоверно не отличалась от аналогичного параметра в контрольной группе. То есть, увеличение дозы афобазола с 5 до 10 мг/кг не вызвало изменения активности изофермента CYP1A2. Средние значения МО в группах III и IV значительно увеличиваются по сравнению с контролем. Так, этот параметр в группе III вырос на 39% и в группе IV - на 38%. Таким образом, пятикратное увеличение эффективной анксиолитической дозы афобазола привело к развитию индуцирующего эффекта на изоформу CYP1A2. Дальнейшее ее увеличение до 50 мг/кг практически не изменило степень выраженности этого эффекта, что может быть объяснено насыщением активных центров изофермента молекулами афобазола. Подобная зависимость обнаружена Грибакиной О.Г. и соавт. при изучении влияния различных доз афобазола на изменение активности изоформы CYP2C9 (Грибакина О.Г. с соавт., 2013).

I I контроль

I I субхроническое введение афобазопа * *

I I контроль

I субхроническое введение афобазопа

Рис. 3. Метаболические отношения Рис. 4. Метаболические отношения теобромина к кофеину после введения параксантина к кофеину после введения афобазола в различных дозах. афобазола в различных дозах.

п=8;x±SD. Обозначения на рисунках: I - 5 мг/кг; II - 10 мг/кг; III - 25 мг/кг и IV - 50 мг/кг. Значком «*» отмечены статистически значимые различия при Р< 0,05 в сравнении с контролем)

Аналогичную картину наблюдали при расчете МО параксантина к кофеину (рис. 4).

Интересным представляется сравнение МО теобромина и параксантина, полученных в плазме крови и суточной моче крыс (рис. 5). Такого рода сравнения позволяют оценить степень выраженности индукции изучаемой изоформы. Причем сравнение не следует проводить по абсолютным значениям МО метаболитов, полученным в различных биосредах. Необходимо сравнить количественные изменения этого параметра с увеличением дозы афобазола в одной из исследуемых биожидкостей.

Так, например, величина МО теобромина для дозы 5 мг/кг, полученная по плазме крови составила 0,12 и для дозы 25 мг/кг - 0,41. Этот же параметр, рассчитанный по суточной моче, для дозы 5 мг/кг составил 1,30 и для дозы 25 мг/кг - 2,60. В обоих случаях с ростом дозы афобазола происходит увеличение МО метаболита, говорящее о появлении индукции афобазолом СУР1А2. Различия в абсолютных величинах МО теобромина в плазме крови и суточной моче можно объяснить различными уровнями концентрации теобромина в рассматриваемых биожидкостях.

э-г-

ШЯШ 5 мг/кг 1 125 мг/кг

»

_ 1

плазма крови моча

Рис. 5. Метаболические отношения теобромина к кофеину после 4-х дневного введения афобазола в дозах 5 мг/кг и 25 мг/кг в плазме крови и моче крыс.

Так, в плазме крови концентрации кофеина примерно в 10 раз выше концентраций теобромина. И, наоборот, в моче содержание неизмененного субстратного маркера значительно ниже его многочисленных метаболитов различной химической структуры (Schräder. Е. et al.,1999). Такие же рассуждения справедливы относительно другого изучаемого метаболита кофеина - параксантина.

In vivo оценка метаболического отношения маркера CYP1A2 после введения афобазола в сравнении со стандартными индукторами и ингибиторами цитохромов

Цель данного этапа - доказать адекватность и избирательность разработанной методологии на примере определения изменения активности изоформы CYP1A2 после введения стандартных ингибиторов и индукторов данного изофермента в эффективных дозах у крыс.

Изменение активности CYP1A2 под влиянием афобазола, индуктора или ингибитора проводили на 3-х группах крыс. В каждую группу входило по 8 животных. Крысам группы I вводили афобазол в дозе 5 мг/кг, крысам группы II вводили фенитоин в дозе 10,4 мг/кг, крысам группы III вводили ципрофлоксацин в дозе 44,0 мг/кг.

Препарат-маркер кофеин вводили животным в дозе 50 мг/кг без и на фоне субхронического введения афобазола, фенитоина и ципрофлоксацина. У каждой крысы собирали суточную мочу.

В качестве индуктора изоформы CYP1A2 использовали фенитоин. Этот препарат относятся к группе умеренных индукторов. В качестве ингибитора изоформы CYP1A2 использовали ципрофлоксацин. Препарат относится к сильным ингибиторам. Выбранные индуктор и ингибитор рекомендованы для оценки активности соответствующих изоформ у человека (Le J., 2012).

Эффективные дозы фенитоина и ципрофлоксацина рассчитывали, исходя из терапевтических доз для человека по соответствующей формуле (Reagan-Shaw S. et al., 2008).

Режим дозирования афобазола, индуктора и ингибитора основывался на величинах периодов полувыведения исследуемых ЛВ (Середенин С.Б. с соавт., 2007; ЬоНп УЛ. й а!., 1994; гЬиМ. е1аЦ 1999).

В исследовании использовали эффективную, анксиолитическую дозу афобазола - 5 мг/кг (пероралъно 3 раза в день через каждые 3 ч в течение 4 суток).

Помимо кофеина измеряли концентрации двух его метаболитов (теобромина и параксантина).

На рис. 6 и 7 представлены результаты исследования влияния афобазола, а так же индуктора - фенитоина и ингибитора - ципрофлоксацина (в эффективных дозах) на изменение активности изоформы СУР1А2, оцениваемое по МО метаболитов (теобромина и параксантина) субстратного маркера - кофеина к неизмененному ЛВ.

афобазол индуктор ингибитор

V//4- введение кофеина без афобазола, игибитора или индуктора ВЯЗ - введение кофеина на фоне субхронического введения афобазола, ингибитора или индуктора

Рис. 6 Метаболические отношения теобромина к кофеину после введения афобазола, индуктора и ингибитора изоформы СУР1А2 (п=8; х ±80). Значком «*» отмечены статистически значимые различия при Р<0,05 в сравнении с введением кофеина без афобазола).

Из рис 6 видно, что после перорапьного субхронического введения крысам афобазола в дозе 5мг/кг индуцирующий/ингибирующий эффект на СУР1А2 не выявлен.

Так, после введения кофеина без афобазола МО, определяемое по отношению концентраций теобромина к кофеину, равнялось 1,42±0,40, а после введения кофеина на фоне субхронического введения афобазола - 1,41±0,33.

В то же время после перорапьного субхронического введения индуктора фенитоина в эффективной дозе выявлен статистически значимый индуцирующий эффект (Р<0,05). МО после однократного введения кофеина без фенитоина составило 1,13±0,23, а после сухронического введения индуктора - 2,18±0,39. Таким образом, индукция изоформы СУР1А2, вызванная фенитоином, привела к повышению интенсивности биотрансформации препарата-маркера и увеличению МО.

В случае введения животным ингибитора - ципрофлоксацина наблюдался противоположный эффект. Ингибирование изоформы СУР1А2, вызванное

ципрофлоксацином, привело к снижению интенсивности биотрансформации маркерного препарата и уменьшению значения МО.

Так, МО теобромин/кофеин после субхронического введения ингибитора равнялось 0,53±0,10 и после однократного введения препарата-маркера без ципрофлоксацина составило 1,33±0,22.

Хотя фенитоин относится к группе умеренных индукторов, а ципрофлоксацина - к сильным ингибиторам. Выраженность индукции и ингибирования, определяемая по МО теобромин/кофеин отличалась на 23% (1,93 и 2,51, соответственно).

При анализе данных относящихся к параксантину отмечаются такие же зависимости, как и для теобромина (рис. 7). Выраженность индукции и ингибирования у крыс, определяемая по МО параксантин/кофеин, так же как для МО теобромин/кофеин отличалась на 23% (1,57 и 2,05, соответственно).

Рис. 7 Метаболические отношения параксантина к кофеину после введения афобазола, индуктора и ингибитора изоформы CYP1A2 (n=8; x±SD). Значком «*» отмечены статистически значимые различия при Р<0,05 в сравнении с введением кофеина без афобазола)

Абсолютные значения МО, полученные для различных метаболитов кофеина, после введения индуктора и ингибитора отличаются друг от друга, но их отношение дает одинаковую величину, следовательно, активность изоформы CYP1A2 у крыс можно оценивать по одному из метаболитов препарата-маркера.

Таким образом, проведенное исследование с одной стороны, подтвердило отсутствие у афобазола в дозе, соответствующей терапевтической, способности вызывать сдвиги в активности цитохромов, участвующих в метаболизме ряда лекарств, что позволяет исключить зависимое от CYP1A2 фармакокинетическое взаимодействие. С другой стороны, выполненная работа демонстрирует адекватность применения in vivo методологии для изучения влияния новых фармакологических средств на активность изоформ Р450 с использованием стандартных модификаторов и субстратов-маркеров.

'г

- введение кофеина без афобазола, индуктора или ингибитора ■■ - введение кофеина после субхронического введения афобазола, индуктора или ингибитора

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На крысах изучено влияние афобазола на изоформу цитохрома Р450 СУР1А2. Возможные эффекты (индуцирующий или ингибирующий) афобазола оценивали по абсолютным значениям метаболических отношений метаболитов кофеина (теобромина и параксантина) к неизмененному веществу в плазме крови и моче.

Показано, что афобазол в эффективной, анксиолитической дозе 5 мг/кг после 4-х дневного введения (3 раза в день) не вызывает изменения активности изоформы СУР1А2. Известно, что доза афобазола 5 мг/кг у крыс соответствует терапевтической дозе для человека - 10 мг.

Учитывая высокую степень гомологячности изоформы СУР1А2 у крыс и человека, можно сделать вывод, что терапевтическая доза афобазола для человека также не вызывает изменений активности данной изоформы.

Таким образом, прием афобазола в дозе 10 мг (3 раза в день) не приведет к изменению активности изоформы СУР1А2, поэтому его можно применять в сочетании с препаратами, мегтаболизируемыми данным изоферментом.

Многократное увеличение дозы афобазола до 25 мг/кг и выше при введении его крысам в течение 2-4 суток (3 раза в день) вызывает умеренный индуцирующий эффект на активность изоформы СУР1А2. Таким образом, увеличение дозы афобазола может привести к снижению эффективности терапии препаратами-субстратами изоформы СУР1А2. При одновременном применении афобазол (в завышенных дозах) может снижать действие следующих ЛС: атипичных нейролептиков (клозапин, оланзапин), производных хинолона (пипемидовая кислота, налиднксовая кислота), производных фторхинолона (ципрофлоксацин, норфлоксацин, ломефлоксацин), циметидина, рифампицина, фенобарбитала, фенитоина и других сильнодействующих препаратов. Поэтому афобазол с перечисленными ЛС следует применять только в терапевтической дозе 10 мг (3 раза в день).

ВЫВОДЫ

1. На основе высокоэффективной жидкостной хроматографии модифицирована и метрологически охарактеризована чувствительная и селективная методика количественного определения кофеина и его метаболитов в биологическом материале.

2. Показано, что афобазол в эффективной, анксиолитической дозе 5 мг/кг, соответствующей терапевтической, 3 раза в дспь в течение 4-х суток не вызывает изменения активности изоформы СУР1А2. Введение афобазола в дозе 25 мг/кг в течение 4-х суток оказывает умеренный индуцирующий эффект на активность данного изофермента.

3. Установлено, что однократное введение афобазола в дозе 25 мг/кг не влияет на активность изоформы СУР1А2. Введение афобазола в дозе 25 мг/кг 3 раза в день в течение 2-х суток вызывает умеренный индуцирующий эффект на активность данного

изофермента. При увеличении длительности введения афобазола до 4-х суток его индуцирующий эффект усиливается.

4. Показано, что афобазол в дозе 5 и 10 мг/кг (3 раза в день в течение 4 суток) не влияет на изменение активности изоформы CYP1A2. Увеличение дозы афобазола до 25 мг/кг вызывает умерепный индуцирующий эффект. Повышение дозы до 50 мг/кг достоверно не изменяет степень выраженности этого эффекта.

5. Сравнительный анализ величин метаболических отношений теобромина и параксантина, полученных в плазме крови и суточной моче крыс показал, что в обоих случаях с увеличением дозы афобазола происходит усиление индуцирующего эффекта. Различия в величинах метаболических отношений метаболитов кофеина в изучаемых биожидкостях можно объяснить различными уровнями концентраций теобромина, параксантина и кофеина в плазме крови и суточной моче.

6. На примере афобазола с использованием стандартных модификаторов и субстрата-маркера апробирована методология изучения in vivo влияния лекарственного средства на изоформу цитохрома Р450 CYP1A2. Установлено, что активность данной изоформы у крыс можно оценивать по одпому из метаболитов препарата-маркера кофеина (теобромину или параксантину).

7. Афобазол в терапевтической дозе 10 мг (3 раза в день) не вызывает изменения активности изоформы CYP1А2, поэтому его можно применять в сочетании с препаратами, метаболизируемыми данным изоферментом. Многократное увеличение дозы афобазола может привести к снижению эффективности терапии препаратами-субстратами изоформы CYPIА2 (например, атипичные нейролептики, фторхинолоны и др.).

Практические рекомендации

1. Афобазол в терапевтической дозе (10 мг 3 раза вдень) можно применять в комбинированной терапии с препаратами, метаболизируемыми изоформой CYPI А2.

2. Апробированную методологию изучения влияния лекарственных веществ на изоформу CYPI А2 in vivo с использованием стандартных модификаторов и субстрата-маркера у крыс целесообразно использовать в доклинических исследованиях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Новицкая, Я.Г. Количественный анализ кофеина и его метаболитов в плазме крови крыс с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии как метод для определения метаболических отношений. [Текст] / Я.Г. Новицкая, A.A. Литвин, В.П. Жердев, Е.В. Блынская, С.Э. Кондаков// Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. - 2013. - Т.54, №1. - С. 56-60.

2. Новицкая, Я.Г. Оценка фармакокинетического взаимодействия афобазола с препаратом-субстратом изоформы CYP1A2 в эксперименте. [Текст] / Я.Г. Новицкая, A.A. Литвин, А.О. Виглинская, В.П. Жердев // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2013. - № 6. - С. 30-33.

3. Новицкая, Я.Г. In vivo оценка метаболического отношения маркеров CYP2C9 и CYP1A2 после введения афобазола в сравнении со стандартными индукторами и ингибиторами цитохромов. [Текст]/Я.Г. Новицкая, О.Г. Грибакина, A.A. Литвин, Г.Б. Колыванов, В.П. Жердев, В.В. Смирнов, С.Б. Середенин // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2013.- № 11. - С. 36-39.

Статья в сборнике

1. Грибакина, О.Г. Взаимодействие афобазола с препаратами-субстратами изоферментов цитохрома Р450. [Текст] / О.Г. Грибакина, Я.Г. Новицкая, М.И. Емельянов, Г.Б. Колыванов, A.A. Литвин, В.П. Жердев // Сб. научных трудов по материалам К международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы медицины». - М., 2013. - С. 112-119.

Тезисы:

1. Пронина, О.Г. Изучение влияния нового селективного анксиолитика афобазола на изоферменты цитохрома Р450 у крыс. [Текст] / О.Г. Пронина, Я.Г. Новицкая, М.И. Емельянов, А.О. Виглинская, В.В. Смирнов, Д.В. Бастрыгин, Е.А. Литвин, Р.В. Шевченко, В.П. Жердев // Материалы XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство» 23-27 апреля 2012, Москва. - М., 2012. - С. 417.

2. Пронина, О.Г. Оценка фармакокинетического взаимодействия афобазола с препаратами-субстратами изоформ цитохрома Р450. [Текст] / О.Г. Пронина, М.И. Емельянов, Я.Г. Новицкая, В.В. Смирнов, А.О. Виглинская, Р.В. Шевченко, A.A. Литвин, В.П. Жердев // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» 18-21 сентября 2012 г, Республика Татарстан, г. Казань. - М.: изд-во Фолиум, 2012. - С. 155.

3. Грибакина, О.Г. Фармакокинетическое взаимодействие афобазола с препаратами-субстратами изоформ 2С9, 1А2 и ЗА4 в эксперименте. [Текст] / О.Г. Грибакина, Я.Г. Новицкая, М.И. Емельянов// Материалы Евразийского Конгресса с международным участием «Медицина, фармация и общественное здоровье» 2123 мая 2013, г. Екатеринбург. - Екатеринбург, 2013. - С. 80

4. Новицкая, Я.Г. Влияние афобазола на некоторые изоформы цитохрома Р450 in vivo. [Текст] /Я.Г. Новицкая, О.Г. Грибакина, М.И. Емельянов // Материалы Первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» 3-5 июня 2013, г. Москва. -М., 2013.-С. 84.

Подписано в печать 10.07.2014 г. Тираж 100 экз. Заказ № 520 Объем: 1.0усл.п.л. Отпечатано в типографии ООО «Медлайн-С» 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 www.bravoprint.ru