Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Структурно-функциональная характеристика грибов рода Candida и патогенетические особенности кандидамикоза сельскохозяйственных животных

МУ^Ш04'1СаЛЕД0БАТК][ЬаШй ИНСТИТУТ ЖШИТАШЮЙ BláTEHIlIAHIVl им. Я.Р.КОВЛЛЕЖО

¡ЕСОКШОЙ ордена лшина и. ордена трудового .аз ОГО ЗЯА МЕЛИ ак/ще;#ти сжъскохозяМстбзшшх

• НАУК им. В.И.ЛЖША (ВАСХИИЛ)

Ha правах рукописи СаБРЯЕОЗ ЕВГЙШЙ .ВДШШЧ

с:::и»'1ауию~ш1кщюстлль1ш1 ХАРАКТЕРИСТИКА

ГРИБОВ РОДА CANDI» Л И ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ БЖИОСТИ 1ШЩЦАШ1КША СЕЯЬСКОХОЗЯЙСТВШНиХ

животных

16.ОС.03 - ветеринарная микробиология, виру сологик, о IILI30 О Т OJIO гия,

■МИКОЛОГИЯ И ИММУНОЛОГИЯ

ABTOPI^EPAT диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

МОСКВА - 1391

Работа заполнена в Донском ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственном институте,

Официальные'оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор А.В.Голикор. доктор биологических наук Ю.М.Плотникова доктор зэторинарных наук П.А.Курманоз.

Ведущая организация - Всесоюзный научно-исследовательский • институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

I *

Защита диссертаццч • лосгсптсл ''____"__________ХУЛ г. .,

ъ___час. на ;заседЕ'Нии 'специализированного созета

Л.020.23.01 но заняла диссертаций на соискание степени доктора наук при Всесоюзном ордена Ленина нау чн о-ис сдедователь скок институте экспоримбгжэльнзй вотеринарш им. Я. Р.Когалепко по адресу: 109172, Мосяха,' Кузьминки, ШЭВ.

С диссертацией модно ознакомиться в бнблиотехш института.

Автореферат разослан ''__"__1391 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат ветеринарных наук

Ф.Г.ТЕКМКОВ

/''Г» я.

■ кк . '

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Кандидамикоз (кандидоз) - мшсотиче-ское заболевание человека и животных, вызываемое дрожжеподобны-мя грибами рода СапсИНа, . в результате многочисленных исследований и наблюдений доказано, что, кроме поверхностных поражений кожи и слизистых оболочек ротовой полости и наружных мочеполовых органов, грибы рода ййпШсСь/ вызывают висцеральный канди-. дамйкоэ, который при несвоевременной диагностике и лечении нередко заканчивается гибелью больного (П.Н.Кашкин, 1958; 0.К.Хмельницкий, 1963; А.В.Цинзерлинг, 1964; О.К.Хмельницкий, В.Л.Аравийский, О.Н.Экземпляров, 1984; Л.А.Лнтоньев, Л.А.Буль-вахтер, Л.К.Глазунов, И.И.Ильин, 1985; Р.Н.Реброва, 1989 и др.).

В настоящее время известно, *1то грибы рода СапгИНа- Могут вызывать массовое заболевание молодняка сельскохозяйственных животных и птиц с поражением органов пищеварения и дыхания (Н.А.Спесивцева, 1960; В.В.Курасова, 1964; В.Н.Куликова, 1967; В.И.Баринов, 1967, 1970; А.Х.Саркисов, В.П.Королева, Е.С.Квашина, В.Ф.Грезин, 1971; Л.И.Аверихин,, Т.П.Жерносек, 1977; Р.Л.Ци-он, 1977; В.К.Парашн, Е.В.Себряков, Б.Б.Ермолаев и др., 1978; Е.В.Себряков, В.К.Паракин, В;П.Воронянский, 1984; Мс СлчИ , 1956, 1967; /СбЛ^ е£ цб , 1976;

4аАХ)еч£ши1, С, АНъцгНьлмй ^ ¿.Спывъъш , 1974 и др.).

За последние 15-16 лет мы неоднократно наблюдали в различных хозяйствах массовое заболевание молодняка сельскохозяйственных животных (поросят, телят, цыплят, индюшат) висцеральным кандидамикозом. При висцеральном кандидамикозе поросят-сосунов при отсутствии своевременного проведения лечебно-профилактиче-

*

ских мероприятий заболевание сопровождалось значительной гибелью больных животных (25-50$ о? числа родившихся) в первые 10-15 дней жизни. Для своевременного проведения лечебно-профилактических мероприятий, первостепенное значение имеет разработка надежных и быстрых методов диагностики кандидамикоза различных животных.

Многообразие клинико-анатомических форм висцерального кандидамикоза у разных животных и сложности, возникающие при его клинической диагностике, выдвигают необходимость дальнейшего совершенствования методов лабораторной диагностики'этого заболевания, всестороннего изучения структурно-функциональной характеристики различных видов грибов рода СапШг^а, и разработки ускоренных способов их идентификации, а также определения роли этих грибов как этиологического фактора заболевания у разных видов животных и дифференциации кандидамикоза от кандидано-сительства. Существенный научно-практический интерес представляет также изучение патогенеза этого заболевания и разработка лечебно-профилактических мероприятий при кандидамикозе крупного рогатого скота и свиней.

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы являлось изучение структурно-функциональной характеристики разных видов грибов рода СанМЫп.. , представляющих интерес для медицинской и ветеринарной микологии, определение их этиологического-значения при заболевании различных видов сельскохозяйственных.животных (крупного рогатого скота, свиней, птицы), совершенствование методов идентификации этих грибов и диагностики висцерального кандидамикоза телят, поросят, цыплят, индюшат и маститов коров кандидамикозной этиологии, а также изучение некоторых вопросов патогенеза этого заболевания и разработка научно обоснованной системы лечебно-профилактических мероприятий при кандидамикозе

' желудочно-кишечного тракта телят и поросят.

Для решения данной цели были поставлены следующие задачи:

- определить частоту выделения различных видов грибов рода Сси1с11'е{<1 при висцеральном кандидамикозе молодняка сельскохозяйственных животных (телят, поросят, цыплят, индюшат), а также при мабтитах коров кандидамикозной этиологии;

- изучить патогенность и вирулентность различных видов грибов рода СйлМс/л, при экспериментальном заражении лабораторных животных (белых мышей и кроликов) и при введении культуры гриба в молочную железу подопытных коров;

- изучить структурно-функциональную характеристику грибов

С. 'С. Ььо^са-бсА, СМши^.р^еиАЛ^соаШ, С,

раЛ&кЬиЯ**' и влияние состава питательной среды и аэрации культуры гриба на фенотипические изменения их цитоморфологиче-ских признаков при их культивировании на различных искусственных питательных средах;

изучить структурно-функциональные особенности различных видов грибов рода СсукСЫа при их размножении в нативной сыворотке крови и в организме восприимчивого животного, а также некоторые морфологические и функциональные аспекты их патогенно-сти;

- изучить фагоцитарную' активность лейкоцитов крови .животных по отношению к различным видам грибов ро^а СхпсС1<&Ъ и динамику

их размножения в плазме и крови этих животных;

I

- изучить патогномоничные особенности {сандидамикоза крупного рогатого скота и свиней и разработать ускоренную культуральио-микологическую дифференциацию висцерального кандидамикоза от кандиданосительства; !

- изучить патогенез канди^микозных ма'ртитов коров и разработать их патогенетическую и этиотропнуго терапию;

!

I

- разработать научно обоснованные лечебно-профилактические мероприятия при висцеральном кандидамикозе желудочно-кишечного тракта телят и поросят.

Научная новизна работы. Получены новые сведения о структурно-функциональной характеристике грибов рода СанеНЫ-е* при их размножении в'различных условиях - на искусственных питательных средах разного состава, в сыворотке крови животных, в средах, содержащих нативные белки животного происхоздения (сывороточный альбумин, ^ -глобулины), в культуре клеток переживающих макрофагов и в организме восприимчивого животного. Изучена роль различных видов грибов рода как возбуди-• телей кандидамикоза и определено этиологическое значение этих грибов при различной локализации кандидамикозного процесса, что имеет существенное значение для правильной интерпретации данных микологического исследования.

Получены новые данные о факторах патогенности у разных видов грибов рода 0ац(11-Ы«> - об образовании добавочных слоев клеточной стенки, интенсивности образования ростковых трубочек и псевдомицелия в сыворотке крови и в организме, протеолитиче-ской и фосфолипазной активности грибов и их цитопатогенного

I

действия при размножении в переживающей культуре перитониальных макрофагов. Изучены также некоторые вопросы патогенеза кандидамикоза и факторы, способствующие возникновению висцерального кандидамикоза молодняка сельскохозяйственных животных и каиди-дамикозиых маститов коров.

Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований по изучению структурно-функциональной характеристики, грибов рода йлмМНл. определены основные цитоморфологические критерии их идентификации, разработана ускоренная методика определения бродильной активности этих грибов и методика определе-

ния их вирулентности по датопатогенному действию на переживающую культуру перитониальных макрофагов.

При изучении структурно-функциональных особенностей грибов в сыворотке крови разработан ускоренный способ идентификации грибов С. aitfi'cans а Ö, izojvitaäs. (A.C. J5 II04I53 Способ дифференциации грибов C.<L(4/.C,<inS и С, от других дрожжеподобных грибов).1 Разработан также способ ускоренной культурально-микологической дифференциации висцерального кандидамикоза желудочно-кишечного тракта от кандиданоситель-ства ( A.c. № 1629037. Способ посмертной диагностики висцерального кандидамикоза) и лечебно-профилактические мероприятия при висцеральном кандидамикоза ( A.c. 1629066. Способ профилактики кандидамикоза поросят-сосунов).

Внедрение результатов научных исследований. Полученные данные были использованы при. разработке и написании рекомендаций и методических указаний:

1. Диагностика и меры борьбы при кандидамнкозе поросят-сосунов. (Рекомендации).- Персиановка, 1982.

2. Кандидамикоз крупного рогатого скота, свиней и птицы. Рекомендации по диагностике, мерам борьбы и профилактике. (Рекомендованы к изданию Советом ветеринарного факультета ДонСХИ и НТО Ростовского облисполкома).- Персиановка, 1988.

3. Методические указания к лабораторно-практическим занятиям по диагностике и лечебно-профилактическим мероприятиям при кандидамикозе сельскохозяйственных животных.- Персиановка, 1989.

4. Рекомендации по диагностике и мерам борьбы при кандидамикоза крупного рогатого скота, свиней и птицы, 1989. (Рекомендованы Советом ДонСХИ и ИТС Госагропрома РСФСР).

5. Методические рекомендации по диагностике и мерам борь-

бы с*кандидамикозом сельскохозяйственных животных /Е.В.Себряков . и др., под руководством академика ВАСХНИЛ А.Х.Саркисова.-ВАСХНИЛ.- Москва, 1991.

6. Ростовским межотраслевым территориальным ЩТИ изданы информационные листки й 481-84, № 421-85, J£ 187-89 для внедрения в производство разработанных нами методов диагностики и лечебно-профилактических мероприятий при кандидамикозе.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на научных конференциях Донского сельскохозяйствен-, ного института в 1973, 1974, 1976, 1977, 1978, 1979, 1980, 1981, 1982, 1983, 1984, 1985, 1988, 1990, 1991 гг.; на первой конференции Донецкого общества генетиков и селёкционеров (г. Донецк, Î968),-на научно-технической конференции "Профилактика и ликвидация болезней домашних животных и птиц" (ст. Персиановка, 1971); на зональной межвузовской конференции, посвященной памяти профессора Н.Н.Мари (ст. Персиановка, 1972); на Всесоюзной научно-технической конференции "Профилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней свиней" (г. Новочеркасск, 1978); на Всесоюзной научно-производственной конференции "Профилактика 1 болезней молодняка на животноводческих комплексах (г. Воронеж, 1981); на Всесоюзной конференции "Структурно-функциональная организация клеток микроорганизмов" (г. Дущино, 1987);' на научно-технической конференции "Ветеринарно-санитарные основы повышения качества продукции животноводства" (г. Одесса, 1987); на Ростовской областной конференции "Проблемы медицинской и санитарной микробиологии города" (г. Ростов-на-Дону, 1987); на XI Всесоюзной научно-практической конференции патологической анатомии заболеваний сельскохозяйственных животных (г. Харьков,1990); на Всесоюзной научной конференции, посвященной 140-летию Харьковского зооветеринарного института (1991).

' Диссертация обсуодена и апробирована на заседании Ростовского отделения Всесоюзного микробиологического общества (протокол №от 14.11.1990 г.), на объединенном заседании сотрудников кафедры патологической анатомии, вотсанэкспортизы и патофизиологии и кафедры микробиологии и эпизоотологии Донского сельскохозяйственного института (протокол )Ь.Ц от 27.03.91 г.).

Публикация результатов исследования. Основные положения диссертации изложены в 39 научных статьях, опубликованных в • журналах, сборниках и в трех изобретениях.

Основные положения, подлежащие защите:

1. Цитоморфологические признаки и функциональные свойства грибов рода Üeindidtb ( С,йССи&п&, CMojücaüs, C.uw?,cir С.дуецdo{,lo!t.iCQ&& r C,flA?nUttisel ) зависят как от видовой принадлежности этих грибов, так и от условий их размножения, на искусственных питательных средах и в организме восприимчивого животного. Состав питательной среды, наличие в ней нативных белков животного происхождения, активная реакция (pH) среды, условия аэрации культуры гриба и организм восприимчивого животного оказывают существенное влияние на фенотипическую изменчивость ¡грибов рода Candida, .

2. Заболевание молодняка сельскохозяйственных животных кандидамикозом органов пищеварения (телят и поросят - до 1015 дней жизни и цыплят и индюшат - до 25-30 дней жизни) сопровождается значительной гибелью больных животных. Характерные кандидамикозные поражения в желуДочно-кишечном тракте у телят-молочников обнаруживаются чаще всего в сычуге и преджелудках, у поросят-сосунов - в области фундальной и пилорической частей желудка, у молодняка птицы - в ротовой полости, пищеводе и зобе. Возбудителями висцерального кавдидамикоза молодняка сельскохозяйственных Дшвотных являются грибы C.QtSlcnn-S и C.izolu

, значительно реже - гриб (!;Н%11-И1- .

3. Обоснование новых методов лабораторной диагностики кан-дидамикоза и идентификации грибов рода С&ц-еНЖл,:

- определение ауксанотрофности и бродильной активности грибов индикаторным методом;

- ускоренная идентификация грибов С.йСёиьНгЦ и С.Ьо^са-

по их цитоморфологическим признакам и дегидрогеназной активности;

- определение вирулентности грибов по их цитопатогенному действию на переживающую культуру перитониальных макрофагов;

. - культурально-микологическая дифференциация висцерального

I

кандидамикоза желудочно-кишечного: тракта от кандиданосительства.

4. Обоснование лечебно-профилактических мероприятий при висцеральном кавдидамикозе желудочно-кишечного тракта телят и поросят с применением фунгиостатических и фунгиоцидных средств и витаминных препаратов, а также ^патогенетической и этиотропной терапии кяндидамикозных маститов коров.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 441 странице машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения. Работа иллюстрирована 152 рисунками, объединящиюР^ифо- и микрофотографии, и 70 таблицами. Список литературы включает 425 источников, из шх 235 иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в Донском ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственном институте и в хозяйствах Ростовской и Донецкой областей. Материалы, изложенные в диссертационной работе, представляют результат собственных исследований, выполнен-

ны'х с 1966 по 1989 г. Разработанные методы диагностики канди-дамикоза апробированы и внедрены в ветеринарных лабораториях Ростовской, Харьковской, Днепропетровской областей и Ставропольского края, а также на кафедре микробиологии и вирусологии 'Js I и в производственной лаборатории Ростовского медицинского

института и в Азовочерноморском институте рыбного хозяйства.

'i

При диагностике висцерального кандвдамикоза наряду с кли-1Шко-анатомичвскими методами применяли микологические и патоло-гогиотологические методы исследования патологического материала. Для выделения чистой культура гриба проводили посев исследуемого материала на агар Сабуро пли мясопептошшй агар с 1% глюкозы и антибиотиками (по 200-300 ЕЩ пенициллина и стрептомицина на I мл среды). Выделение одноклеточной культуры гриба проводили по методу Линдера в нашей модификации (Е.В.Себряков, 1976).

При идентификации грибов рода и определении их

видовой принадлежности пользовались диагностическим ключем Н.И.Енинова (Патогенные дрожжеподобные организмы, IC64), огуюде-лителем патогенных, токсических и вредных для человека грибов (П.Н.Кашкин,' М.П.Хохляков, А.Н.Кашкин, 1979) и информационными материалами АН СССР по систематике и идентификации дрожжей рода Candida Беркхоут (В.М.Благодатская, Л .И. Уткин, И. С. У тюша, 1980).

Цигоморфологические особенности грибов изучали на различных этапах их культивирования на следующих искусственных питательных средах:

а) агар Сабуро с 4% глюкозы, рН 6,5-6,6;

б) мясопептошшй агар, рН 7,0-7,2;

в) мясопептонный агар с 1% глюкозы, рН 7,0-7,2;

г) картофельный агар, рН 6,5-6,6;

д) картофельный агар с 1% глюкозы, рН 6,5-6,6;

г е) кукурузный агар, рН 6,5-6,6;

ж) бульон Сабуро с 4% глюкозы, рН 6,5-6,6;

з) мясопептонный бульон, pli 7,0-7,2;

и) мясопептонный бульон с 1% глюкозы, рН 7,0-7,2; к) картофельный бульон, pli 6,5-6,6; -

л) картофельный бульон с 1% глюкозы, рН 6,5-6,6; м) жидкая среда из кукурузной.муки, рН 6,5-6,6; j н) обезжиренное молоко, рН 6,6-6,7. 1

Для изучения влияния условий аэрации на изменение цитомор-фологических признаков грибы, рода Candi dix, культивировали в анаэробных условиях и в специальной камере, позволявшей прово- I дить наблюдение за развивающейся культурой гриба в разных условиях аэрации, а также применяли различные методы посева культуры гриба на плотные питательные среды (на поверхность среды,' в толщу среды и методом вторичной заливки культуры гриба анало- \

I

гичной плотной средой по специально разработанной методике). ;

I

При определении ферментативной активности различных угле- | водов изучали корреляцию между изменением активной реакции (рН) среды, ауксанотрофносгью и газообразованием в культуре гриба. Нротеолитическую активность различных видов и штаммов грибов рода Qandîdti> определяли хроматографическим методом, описанным f. UclU (1869), в нашей модификации, а фосфолипазную (лецити- . назную) активность - по методике Â,C. 'WiCCbnbSon, f У.-,?, Sumta-n^ akb,t Mac ТахСьп*, (1986).

Дегидрогеназную активность грибов определяли по методике Н.П.Елинова (1958). Аминокислотный состав белков биомассы грибов определяли методом распределительной хроматографии на бумаге по общепринятой методике (Ю.Б.Филиппович, 1958; В.Г.Рябчиков, И.Н.Андропова, И.П.Дроздешсо, И.Р.Птак, 1967), а общий азот биомассы и азот гидролизата - полумикрометодом Кьельдаля с при-

i I

, мейвтвм прибора Парнаса-Вагнера по методике, описанной Л.ТЛебедевым и А.Т.Усовичем (1976).

Для изучения цитоморфологических признаков и функциональных свойств грибов в средах, содержащих нативные белки животного происхождения, их культивировали в нативной сыворотке крови крупного рогатого скота, овец, лошадей, свиней, кроликов и кур, а также в средах, содержащих различное количество сыворотки крови и ее белковых фракций - сывороточного альбумина, -, Ji-, ^-глобулинов.

При изучении влияния активной реакции среды на образование ростковых трубочек и псевдомицелия у грибов рода Cat\did<k> их культивировали в сыворотке крови с различными значениями рП: 5,2-5,4; .6,2-6,4; 7,2-7,4; 8,2-8,4. Для создания нужной реакции среды в сыворотку крови добавляли определенное количество стерильного I п. раствора соляной кислоты или едкого натрия. рН сыворотки крови-определяли электрометрическим микрометодом на рН-метре 340. |

Цитоморфологические особеннЬсти грибов на различных этапах их культивирования изучали путем микроскопического исследования неокрашенной (нативной) культуры гриба в светлом поле зрения микроскопа, методом фазовоконтрастной микроскопии, при витальной окраске клеток гриба нейтральным красным по методике > Н.М.Мейселя (1950), в фиксированных препаратах, окрашенных гематоксилином по Гейденгайну в модификации М.Н.Мейселя (1950), при окраска ядерного хроматина клеток гриба по методике М.А.Пешкова (1955), а также при люминесцентном исследовании витальных препаратов, окрашенных акридиновым оранжевым, корифосфином, нейтральным красным, примулином, титановым желтым и другими флюорохромамн. Показатель преломления цитоплазмы клеток гриба определяли методом иммерсионной рефрактометрии, разработанным

f

для'бактериальных культур Б.А.Фихманом (1967).

Ультраструктуру грибов изучали при электронной микроскопии ультратонких срезов клеток гриба, контрастированных уранилацета-том и цитратом свинца по Рейнольдсу, и при окраске их рутепие-

I

bum красным по Лафту (Г.Гайер, 1974; В.В.Делекторский, Г.В.Павлова, Г.Н.Якшова, Г.Л.Дмитриев, 1979).

Для моделирования висцерального кандидамикоза и определения вирулентности грибов рода Ccuictidt^ проводили внутрибрюшин-ное заряжение белых мышей, внутривенное - кроликов и интрацис-тернарное (внутривыменное) - коров. В опытах использовано 1100 белых мышей, 104 кролика и 39 малоценных в хозяйственном отношении коров.

Патогенные свойства грибов на клеточном уровне изучали In iritto при заражении переживающей культуры перитониальных макрофагов. Среднюю летальную дозу №59) при заражении белых мышей и цитопатогеиное действие грибов на макрофаги (IU%q) рассчитывали по Риду и Менчу (Г.Штаркс, И.Фридман, Н.Хлинак, 1970), а среднюю статистическую ошибку - по формуле Миллера и Тинтера (Л.Н.Кудрин, Г.Т.Пономарева, 1967).

Фагоцитарную активность лейкоцитов по отношению к различным видам и штаммам грибов (в интактном и сенсибилизированном организме, а также при воздействии антибиотиков широкого спектра действия) изучали по методика Бермана-Славского (1958).

Витамин Л в крови и печени определяли по методике, описанной П.Т.Лебедевым и Л.Т.Усовичем (1976).

Морфологические особенности грибов в организме и гистологические изменения в пораженных тканях при висцеральном кандидами-козе телят, поросят, цыплят, индюшат изучали при исследовании гистопрепаратов, окрашенных зозингематоксилином, по Гочкис-Мак-Манусу в модификации В.В.Курасовой и Грам-Вейгерту в модифика-

' ции Боголепова.

Разработанные нами лечебно-профилактические мероприятия были апробированы в производственных условиях на поголовье 540 телят и 21400 поросят. .

При статистической обработка цифровых данных использовали руководства и сообщения по математической статистике А.11.Кудрина и Г.Т.Пономаревой (1367), П.Ф.Раковского (1067), Н.А.Плохин-ского (1969), Н.В.Садовского (1975), Г.Л.Лакина (1980).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССВДОВАНИЙ

3.1. Выделение грибов рода Свлл^^ь и их структурно-функциональная характеристика при культивировании на искусственных питательных средах

Из различного патологического материала и внешней среды било выделено и идентифицировано 507 штаммов различных валов грибов рода Сыи^ссСх- : 153 штамма гриба С.п&(сап,Я , 182 штамма гриба , 82 штамма гриба , 35

штаммов гриба С, з, 17 штаммов гриба С.рлга -

ЮшъеЬ, 9 штаммов гриба Й-. ^ш'^&еичогиШ , 6 штаммов гриба О-Ахлил^^ , 4 штамма гриба , 6 штаммов гриба

С^тлЫбсИ , 5 штаммов гриба С. , 5 штамглов гриба

С, МоШЬ

, 3 штамма гриба С. .

Для детального изучения структурно-функциональной характеристики грибов рода С<игЖс£<1, в опытах было использовано 243 штамма грибов, представляющих интерес для медицинской и ветеринарной микологии: 83 штамма гриба С.Л^&ед/ьЯ , 71 - С. 1гоцс-, 45 - С,}(лаи1 , 24 ~ 0,.^Шс1оЬг4>11ШеЦ , 12 -

При внутрибрюшинном заражении белых мышей было установлено, что по патогенности различные виды грибов располагались в

it)

г

: следующем порядке: <\CiiCAnSf f С. fctasec(

C,pmdoizop.ica&£ и С.JULioMuieC . Однако в пределах каждого вида обнаруживаются штаммы с различной вирулентностью, что необходимо учитывать при.определении их патогенетической роли в возникновении и развитии кандидамикозного процесса. Так, средняя летальная доза (ЛД50) ПРИ заражении белых мышей, для различных штаммов гриба С. составляла от 77,0 до 405,0 млн. клеток гриба, для штаммов гриба (Kitojuca/H соответственно --от 179,0 до 675,4 млн., а для штаммов гриба й.КШ%ес - от 317,0 'до 642,9 млн., для штаммов гриба C-^lcdottofucай'з - от 610,5 до 800 млн., для штаммов гриба С, jWtA'hutMi - от 640,7 до

800 млн. Штаммы других видов грибов ( ^^uiCCietinoiiUil^

С. tmmjdi^ в, lelfahoUts % С, С,5ЫШ.} С, U(,tjps<\, )

являлись авирулентннми и не вызывали гибели мышей даже при введении в брюшную полость 800-1600 млн. клеток гриба. Минимальная летальная доза при внутривенном заражении кроликов для штаммов . гриба C,([C£ic(UvS составляла 0,5-1,0 млн., для штаммов гриба C.btojutuCLg - 40 млн. клеток гриба на кг массы животных. Минимальная доза, вызывавшая клинически выраженные маститы у коров, для гриба G.Ь&1е.<иьй составляла 1,0 млн., а для гриба С. ttajiica.Ci&. г 0.1 млн. клеток гриба.

Проведенные исследования таю^а показали, что вирулентность культуры гриба зависела от реактивности макроорганизма - многократное введение хлортетрациклина гидрохлорида подопытным кроликам оказывало существенное влияние на повышение патогенных свойств грибов и С.-blvjiiCA¿¿S . Аналогичные ре-

зультаты получены при введении гриба С. bitijvicatib и гриба C',Kiu,Sti в молочную железу подопытным коровам - применение антибактериальных антибиотиков широкого спектра действия (окситет-рациклина и стрептомицина) существенно изменяло течение кавдида

1(5

' микоэного процесса и повышало вирулентность этих грибов.

При электронной микроскопии ультратонких срезов установлено, что клеточная стенка различных видов грибов, выращенных на агаре Сабуро, состояла из нескольких слоев: наружного фибриллярного слоя высокой электронной-плотности, среднего гомогенного электронно-позитивного слоя и внутреннего электронно-плотного слоя. В препаратах, контрастировашшх рутениевым красным, средний гомогенный слой был разделен,добавочным гранулярным слоем

повышенной электронной плотности| Толщина клеточной стенки составляла 160-280 нм. Непосредственно к внутреннему слою меточной стенки прилегала трехслойная клеточная мембрана толщиной 30-50 нм,- которая местами образовывала инвагинации в цитоплазму с электронно-плотным содержимым. В мелкогранулярном основном веществе цитоплазмы обнаруживалось клеточное ядро, отделенное от основной части цитоплазмы двухслойной ядерной мембраной, центральная вакуоль, розетки гликогена, овальные митохондрии (300400 х 250-300 нм), небольшие скопления рибосом (20-30 нм), эндоплазма тический ретикул и электронно-плотные гранулы, которые, по-видимому, являлись метахроматином. Однако у различных видов грибов наблюдались определенные видоспецифические особенности. В цитоплазме клеток грибов С. Л^слцй и С. обнару-

живалось крупное ядро (800-1300 х 500-1000 нм) и относительно крупные (400-850 х 300-600 нм) эллипсоидные гранулы высокой электронной плотности, отделенные от остальной части цитоплазмы тонкой (10-12 нм) электронно-позитивной мембраной, а у грибов

ких (диаметром 50-250 нм) электронно-плотных гранул, расположенных в цитоплазме, и вакуоли клеток гриба.

Сравнительное изучение различных цитоморфологических методов исследования показало, что для практических целей иделтифи-

множество относительно мел-

: нации грибов целесообразно проводить прижизненную микроскопию выделенной культуры, которая дает возможность определять истинные размеры клетки гриба и ее органоидов, не искаженных действием фиксирующих препаратов. Хорошие результаты в этом отношении получены при микроскопии яативной (неокрашенной) культуры грибов в проходящем свете, при витальной окраске клеток водным раствором нейтрального красного и при фазовоконтрастной микроскопии, а также при люминёсцентном исследовании препаратов, флюорохро-мйрованных супровитально корифосфином в комбинации с нейтральным красным или акридиновым оранжевым.

При'культивировании грибов С. 41&СД/&;, С. С. Ц.Ц'НчсСо^о^и^й^ ^ С^1аглкиш1 на различных ис-

кусственных питательных средах они размножались сначала в дрож-жевидной форме, культура гриба состояла из овальных или овально-удлиненных дрожжевидных клеток, затем образовывали сильно удлиненные клетки псевдомицелия, которые при дальнейшем развитии культуры гриба вновь продуцировали овальные или овально-удлиненные почкующиеся дрожжевидные клетки (бластоспорн). Вместе с тем различным видам этих грибов были свойственны определенные структурные особенности, которые зависели как от вида гриба, так и от состава питательной среды, ее консистенции и времени культивирования гриба. Так, культура гриба на ага-

ре и бульоне Сабуро развивалась преимущественно в дрожжевидной форме, псевдомицелий обнаруживался непостоянно и только на 610 сут инкубации гриба, в то>время как на мясопептонном агаре и бульоне образование псевдомицелия наблюдалось уже на 2-4 сут культивирования. У большинства штаммов грибов С.г СЛи1*,е1) и ПРИ культиви-

ровании на агаре и бульоне Сабуро образование псевдомицелия в культуре этих грибов происходило на 3-4 сут инкубации. Наличие

в состава мясопептонного агара и бульона глюкозы (1$) стимули-

С.НшЫо < но задерживало его появлв1ше у большинства штаммов гриба (лА££Сслн,& . Существенное влияние на дннамшсу образования псевдомицелия у- различных видов грибов оказывала и консистенция питательной среды: в жидких питательных средах образование псевдомицелия у различных видов грибов происходило и более ранние сроки, чем на аналогичных плотных средах.

Проведенные исследования по совершенствованию методики культивирования грибов на кукурузном и картофельном агарах показали, что на образование псевдомицелия влияет также способ посева гриба на эти среды. Наиболее быстро процесс перехода дрожже-видной формы в псевдомицелиальную форму развития наблюдался при посеве этих грибов методом вторичной заливки культуры гриба аналогичной плотной средой. При этом способе посева образование развитого псевдомицелия у большинства штаммов грибов происходило уже на 2-3 сут инкубации. Аналогичные результаты били получены при посеве грибов в жидкие питательные-среды из растительного сырья (в жидкой среде из кукурузной муки и в картофельном бульоне), а также в обезжиренном молоке, в котором псевдомицелий у большинства штаммов грибов рода С&мСиЬь- обнаруживался уже через 24-48 ч инкубации.

На основании сравнительного изучения цитоморфологических признаков различных видов грибов рода были разработа-

ли дифференциальные таблицы, в которых отражены размеры и форма клеток, величина и форма ядра и ^акуолей, а также время образования псевдомицелия и его особенности у различных видов этих грибов при их культивировании на разных питательных средах. Использование этих данных дает возможность уже в первичном посеве патологического материала провести предварительную идентификацию

ровало образование псевдомицелия у грибов

и

; выделенной культуры гриба по характерным цитоморфологическим признакам.

3.1.1. Дитоморфологические изменения грибов родаСа/гсИсСсь при их культивировании в различных условиях аэрации

В результате этих исследований было установлено, что условия аэрации культуры гриба оказывают существенное влияние на изменение цитоморфологических признаков у грибов рода СапсИНа.. . Однако у различных видов грибов эти изменения были неодинаковые и зависели как от условий аэрации- культуры гриба, так и от состава питательной среды. Так, на кукурузном агаре большинство штаммов гриба С.ьСбмсш-З в аэробных условиях развивались лре-

I

имущественно в дрожжевидной форме! а в анаэробных условиях - в пссвдомицелиальной форме. При культивировании этого же гриба на агаре Сабуро и в мясопептонном агаре как в аэробных, так и в анаэробных условиях преобладала дрожжевидная форма развития культуры гриба. Колонии грибов С, {,Х0р.1с4€1а, (¡д^ыс/а -

1иу*1СА&& и С,цачМШИег- , выращенные в анаэробных условиях, состояли из овальных дрожжевидных клеток, элементы псевдомицелия отсутствовали.

При культивировании грибов рода С(тг(Сс£л, в анаэробных условиях обнаруживались также изменения в строении ядра и митохондрий. В препаратах, окрашенных гематоксилином по Гейденгай-ну. У псех изученных видов грибов в анаэробных условиях наблюдалась гипертрофия клеточного ядра и изменение его формы. Величина ядра по сравнению с аэробными условиями культивирования у гриба С.А&{сац& была.больше на 30,4-50,0$, у гриба СМо^.1-_ на 33,3-35,0%, у гриба - на 25,0-30,0$, у

гриба С^р-Ш^оЫе^сШл - на 18,8-30,0$. Гипертрофия ядра клеток грибов сопровождалась изменением его внешнего вида: оно

приобретало неправильную геометрическую форму с лопастными выступами, напоминающими амебовидные ложноножки. В анаэробных .условиях наблюдалась также гипертрофия митохондрий и изменение их тинкториальных свойств при окраске гематоксилином. Аналогичные цитологические особенности обнаруживались в клеточной популяции из осадка при культивировании грибов в жидкой питательной среде (в бульоне Сабуро и в мясопептонном бульоне), где возникали условия их ограниченной аэрации.

При культивировании грибов в специальной камере в условиях свободного доступа кислорода воздуха у гриба С.(\Шеап$ па кукурузном агаре преобладали почкующиеся дрожкевидние клетки; хламидоспоры обнаруживались при частичном ограничении притока кислорода воздуха, но не при полном отсутствии аэрации. При культивировании этого гриба на мясопептонном агаре псевдомицелий обнаруживался только в условиях ограниченной аэрации культуры. У грибов 1 С„Лт£е11 С.^е а (¿о ¿г ор ¿а о ¿¿й и С.ра,ханисйе1 образование псевдомицелия при их культивировании на агаре Сабуро и1кукурузном агаре происходило при частичном ограничении аэрации, а при свободном доступе кислорода воздуха и в анаэробных условиях эти грибы развивались преимущественно в дрожжевидной форме.

3.1.2. Ферментативная активность грибов . рода СапсИЫ<\, и их аминокислотный состав

В результате сравнительного изучения ауксанотрофности; • бродильной активности и изменения активной реакции среды (рП) при культивировании различных видов грибов рода Сап^Мл. в средах, содержащих разные углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу), было обнаружено, что при ассимиляции этих углеводов происходило снижение активной реакции среди от нейтральной или

Г

■ слабощелочной (¡511 7,0-7,2) до "слабокислой (рН 6,0-6,5), а при расщеплении их ферментами гриба до конечных продуктов брожения активная кислотность (рН) культуральной жидкости была менее. 5,0. На основании этих .исследований была разработана индикаторная методика ускоренного определения ауксанотрофности и бродильной активности грибов на плотной питательной среде со специально подобранными шщикаторами (бромтимолблау, лакмусовой настойкой и бромкрезоловым зеленым), которая позволяла в течение 24-48 ч инкубации определять видовую принадлежность у грибов С,; СЛго1и'сй&б, С.кш$еС> С.ьшиСоСгшШ&ъ,

При определении протеолитической и фосфолипазной активности было установлено, что протеолитическая активность как качественный признак наиболее часто обнаруживалась у штаммов гриба (86,96$), затем у штаммов гриба йМ^чьШ (68,18$) и значительно реже у других видов грибов рода , а фосфолипазная активность - только у гриба . Высокая протеолитическая активность наблюдалась у свежевыделенных . из патологического материала штаммов грибов

СлШ

СЛю^'с^д-Ч при заболевании животных кандидамикозом. Проведенные исследования показали, что протеолитическая и фосфолипазная активность грибов рода СапсИск, является одним из функциональных факторов их вирулентности и оказывает определенное влияние на течение и исход каццидамикозного процесса. Последнее подтверждалось наличием статистически достоверной положительной корреляции между вирулентностью этих грибов при внутрибрюшинном заражении белых мышей и активностью внеклеточной протеазы

( Ы5Ъ = 0,64 + 0,09) и фосфолипазы = 0,41 + 0,22).

(

При изучении аминокислотного состава гидролизата белков грибов рода «йпс{1с{.<\. в большинстве случаев не наблюдалось су-

I щественной разницы в содержании различных аминокислот у разных видов этих грибов. Однако'у грибов С.цМгслня и СЛгсуи'ги&ь обнаружена не идентифицированная аминокислота, которая отсутствовала у других видов грибов рода Сл/^Мъ .

3.2. Структурно-функциональные особенности грибов рода Сйпси^л- при их размножении в сыворотке крови и в организме восприимчивого животного

При культивировании грибов рода СйлМеЬъ в сыворотке крови разных животных (крупного рогатого скота, свиней, лошадей, кроликов и кур) уже в первые часы инкубации наблюдались существенные цитоморфологические изменения у гриба : на поверхности дрожжевидных клеток через 1-2 ч инкубации появлялось одно или два выпячивания, которые, постепенно увеличиваясь в размерах, превращались в ростковые трубочки. Через 4-6 ч культивирования в сыворотке крови в ростковых трубочках обнаруживались перегородки. Образование ростковых трубочек у этого гриба

I

в сыворотке крови происходило только при температуре от 33 до а наиболее быстро они появлялись при 37-39°С. При этом наиболее быстро они образовывались при культивировании этого гриба в сыворотке крови кролика и птицы. На образование ростковых трубочек в сыворотке крови определенное влияние оказывали ; условия культивирования гриба: густота посева клеток гриба в сыворотку крови, наличие в ней электролитов и-других низкомолекулярных соединений, концентрация белков в сыворотке крови и соотношение в ней различных белковых фракций (альбуминов, «0-, р у-глобулинов). Другие виды грибов рода Сьпс1.1с1<х.,

( С.^го^иса^г .С, Кгши, О.^тЫо^ло^сс,^ ^ Срш/пияеС,

), а также грибы рода Зчсс.Ал74туМ5, Тот-¿ушЧи Цос1а1х>111$\. ростковых трубочек не образовывали, а раз-

I множались поякованием. При сравнительном изучении интенсивности образования ростковых трубочек в сывороткё крови у штаммов гриба , развивавшихся на искусственных питательных средах в £-форме, с их вирулентностью при экспериментальном заражении белых мышей была обнаружена^ хотя и не высокая ( Ъ = = 0,35-0,59), но статистически достоверная/положительная корреляция между этими показателями. Однако у штаммов этого гриба, развивавшихся на искусственных питательных средах в ' /¿-форме, корреляция между их вирулентностью и интенсивностью образования ростковых трубочек отсутствовала.

Ростковые трубочки являлись начальной стадией образования мицелия: ^начале - септированного истинного мицелия, а в последующем - типичного псевдомицелия. О наличии типичного септированного мицелия на определенных стадиях культивирования гриба С.л^йсаи-Я в сыворотке крови свидетельствовали результаты наших исследований по изучению динамики размножения этого гриба в специальной камере на агаризированной сыворотке крови и данные, полученные при электронной микроскопии ультратонких срезов клеток мицелия. Развитый псевдомицелий у этого гриба обнаруживался при его культивировании в сыворотке крови, имевшей как щелочную (рН 8,2-8,4), так и кислую реакцию (рН 5,2-6,4). Другие виды грибов рода СлпМЫц на различных этапах их культивирования в сыворотке крови с рН 7,0-7,2 и 8,2-8,4 развивались преимущественно в дрожжевидной форме. Вместе с тем проведенные нами исследования показали, что образование псевдомицелия возможно и у других видов грибов рода Ссцгс1и1ск, при их культивировании в сыворотке крови, имевшей кислую реакцию (рН 5,2-6,4), Оптимальной средой для образования псевдомицелия у гриба С.'Ьгои,1сц6(-& являлась сыворотка крови с рН 6,2-6,4, а для грибов С кшче'с^

С. р зеи(/.о1 гоц1 с«¿¿2, С. 11АЫ1Ш1$е1} С. ^.{бСиг^опсИ

I -

I сыворотка крови с рК 5,2-5,4. Однако процесс.образования псев-' домицвлия у этих грибов начинался с появления сильно удлиненных бластоспор, отделенных от исходных дрожжевидных (материнских) клеток перетяжками.

В результате проведенных исследований было установлено, что образование псевдомицелия в сыворотке крови у грибов рода ОлпсЦсЬк- зависело от вида гриба, условий аэрации культуры я активной реакции (рН) среды. Аналогичные морфологические особенности обнаруживали у различных видов этих грибов при их размножении в организме восприимчивого животного. Дрожжевидные клетки гриба в организме прорастали с образованием ростко-

вых трубочек, которые являлись начальной стадией образования мицелия и псевдомицелия. При размножении гриба С> ¿г^гг'мй'х в организме восприимчивого животного морфологические особенности этого триба зависели от локализации патологического процес-

I

са: в почках при экспериментальном кандидамикозе кроликов, на поверхности слизистых оболочек ротовой полости, зоба, пищевода и кишечника клетки этого гриба размножались почкованием, а при поражении желудка и сычуга у поросят и телят и при кандидами-козных маститах наряду с почкующимися дрожжевидными клетками обнаруживались нити псевдомицелия. При введении гриба СЛп? или гриба С.~6то^ггсс\/¿'5 в молочную железу оба гриба в вымени развивались в псевдомицелиалыюй форме, при этом течение кандидамякозного процесса, вызванного грибом С Ыо^са^^ ; было более тяжелое, чем при маститах, вызванных грибом С. СЩ»5 , что можно объяснить более энергичным размножением гриба С.т&^н'сай'З в молочной железе. Сопоставляя морфологические изменения этих грибов с их вирулентностью,.можно заключить, что образование мицеЛиальных и псевдомицелиальных форм у грибов С. а^ССаця и С.тбмМеи&Я в организме восприимчивого живот-

ного является одним из факторов их патогенности. При культивировании грибов в нативной сыворотке крови в препаратах, контра-стированных рутениевым красным, при электронной микроскопии ультратонких срезов по периферии клеточной стенки гриба С&п£ постоянно обнаруживалась микрокапсула, которая по толщине была равна или превышала все пять слоев клеточной стенки и состояла из двух хорошо различимых слоев различной электронной плотности: внутреннего фибриллярного - пониженной электронной плотности и наружного рыхлого - повышенной электронной плотности. Микрокапсула гриба С.Ью^иц^ также состояла из двух хорошо различимых слоев, которые по толщине составляли 70-80% ширины клеточной стенки. У подавляющего большинства клеток грибов и С,рИисСсЬю^сь, 1а микрокапсула отсутствовала. Образование добавочных слоев клеточной оболочки (микрокапсулы) . у грибов и С.ЬюриЮг&ц можно рассматривать как один из морфологических факторов патогенности этих микроорганизмов при их переходе к паразитической форме существования.

Существенные различия были обнаружены в динамике размножения различных видов грибов рода СалсЫЖа, в нативной сыворотке крови животных и их дегидрогеназной активности. По интенсивности размножения различные виды грибов располагались в следующем порядке: <3, (¡¿¿¿сапл ( С.1гор1С<\&$) С-Ргизеб,

С. ^Шис^лЫа^сь&ь . Интенсивное накопление биомассы у грибов и О-Лю^ю.пбь^ в нативной сыворотке крови указывало на свойство этих видов грибов использовать для синтеза клеточных белков азотистые вещества сыворотки крови и -противостоять неспецифическим факторам гуморальной защиты макроорганизма.

При размножении этих грибов в сыворотке крови и в питательной среде, содержавшей ее белковые фракции, было обнаружено,

что различные белковые фракции сыворотки крови (сывороточный альбумин, (С-, у?-, ¡¡р-глобулины) оказывали не одинаковое влияние на интенсивность их размножения: сывороточный альбумин стимулировал их размножение, а глобулиновые фракции сыворотки, особенно •• ^-глобулиновая фракция, оказывали ингиби-рующее действие. Однако даже повышенное содержание ^-'-глобулина в сыворотке крови не прекращало размножения в ней не только клеток грибов СъШс&ий , и 0..-Огормс«,€с?. , но и других видов грибов рода 0Апе11с(л, , что. свидетельствовало о второсте-пенности гуморального фактора неспецифической защиты организма . от кандидамикозной инфекции.

3.2.1. Ускоренная идентификация грибов и

СЛюрсм&з.

В результате изучения структурно-функциональных особенностей грибов рода ОапсАкк, в сыворотке крови был разработан ускоренный способ идентификации грибов С, и С:Ыоц1-

0а&$ , которые являются основными возбудителями кандидамикоза человека и животных. Способ основан на определении культураль-но-морфологических признаков и деГидрогеназной активности этих грибов и дает возможность определять их видовую принадлежность в течение 24-28 ч, в то время как при использовании общепринятой методики требуется от 4 до 10 сут.

Выделенную из патологического материала культуру- гриба пересевали одновременно в сыворотку крови с рН 8,2-8,4 (среда И) и в сыворотку крови, содержавшую 2>% лактозы, с рН 6,2-6,4 (среда И 2). Предварительное определение видовой принадлежности грибов проводили уже через 2-6 ч инкубации культуры при ее микроскопическом исследовании. В средах № I и № 2 часть исходных дрожжевидных клеток гриба через 2-3 ч культивирова-

ния прорастала с образованием ростковых трубочек (ростков), а через 4-6 ч в них появлялись перегородки. Культура гриба СЛю^С^^ в среде № I состояла из овальных почкующихся клеток, а в среде № 2 у части исходных дрожжевидных клеток через 5-6 ч инкубации наблюдалось образование сильно удлиненных бластоспор. Через 20-24 ч инкубации в культуре гриба С, <1$ссапя в обеих средах на дне пробирки обнаруживали хлопьевидный осадок, состоявший из длинных, извитых нитей псевдомицелия. В местах сочленения его клеток преобладали овальные или округлые бластоспоры. Культура гриба сч€1й в-среде состояла из овальных

дрожжевидных ¡слеток, а в среде № 2 обнаруживались длинные ветвистые нити псевдомицелия с удлиненными бластоспорами. Другие виды грибов рода Сйлд^'я^и в этих средах размножались преимущественно в дрожжевидной форме. Окончательную идентификацию грибов СА^<нсал£ и С.Сгс^С-а.осуществляли при определении дегидрогеназной активности этих Грибов с использованием окислительно-восстановительных индикаторов (резазурина и 2,3,5-трифе-нилтетразолиум хлорида).

I

3.2.2. Изменение биологических свойств, гриба СаСИсаМ в организме восприимчивого животного

При па с сиро ваш; и штаммов гриба С.иС^сапЗ (одноклеточные культуры штамма № 4 и штамма № 18) в организме экспериментально зараженных кроликов обнаружено, что на изменение вирулентности исходных штаммов существенное влияниё оказывало течение кандидамлкозного процесса.'Так, у восьми культур этого гриба, 1 выделенных при остром течении заболевания (по сравнению с исходными штаммами), наблюдалась тенденция к увеличению вирулентности, а у шести культур, выделенных при хроническом и субклиническом течении заболевания, было обнаружено существенное сни-

женив вирулентности. ЛД^ при внутрибрюшинном заражении белых мышей у исходных штаммов составляла 100,5 млн. и 79,3 млн. клеток гриба, у культур, выделенных при остром течении заболевания, соответственно -.81,7 млн. и 80,5 млн., при хроническом и субклиническом течении - 295,3 млн. и 282,8 млн. Снижение вирулентности у культур, выделенных при хроническом и субклиническом течении заболевания, сопровождалось изменением некоторых других функциональных свойств: ослаблением бродильной активности, снижением протеолитической активности и понижением интенсивности образования ростковых трубочек в сыворотке крови. Однако по цитоморфологическим признакам культуры, выделенные при хроническом и субклиническом течении заболевания, не отличались от исходных штаммов. Проведенные исследования показали, что не только структурно-функциональные свойства гриба оказывают влияние на возникновение, развитие и исход кандидамикозно-го процесса, но и течение заболевания оказывает существенное воздействие на изменение функциональных свойств возбудителя кандидамикоза.

3.3. Фагоцитируемость грибов рода С&псИсб^ лейкоцитами крови и их цитопатогенное действие при размножении в культуре макрофагов

При изучении фагоцитарной активности лейкоцитов крови по отношению к различным видам грибов рода Ссш<&с£<я, было установлено, что фагоцитарное число и завершенность фагоцитоза зависели от их функционального состояния, вида и штамма гриба. Фагоцитарное число лейкоцитов интактного организма (кролика) для большинства видов грибов рода0ан«1£-Ы(1> ( С. ¡гти5?1, С^еис/о -Ь-о^Сй&Ъ г С.цохлкгизеЬ, С,^иСб£<1г»)опсйС ) находилось в пределах от 2,12 + 0,14 до 3,26 + 0,19, а завершенность фагоци-

тоза - от 13,21 + 6,48 до 66,56 + 2,34. Исключение составляли только штаммы грибов C.a^lCanS. и , фагоцитоз

которых не сопровождался гибелью их клеток в цитоплазме лейкоцитов. Однако при сравнительном изучении динамики размножения грибов Ca^UojxI и C./ttj/iiCQ&S в гепаринизированной крови, содержащей жизнеспособные лейкоциты, и в плазме, лишенной форменных элементов крови, наблюдался статистически достоверный ингибирующий эффект цельной крови, что, по-видимому, было обусловлено наличием в ней как жизнеспособных лейкоцитов, так и продуктов их распада, подавлявших размножение этих грибов.

Антибактериальные антибиотики, особенно широкого спектра действия (хлортетрациклин гидрохлорид, окситетрациклин, стрептомицин сульфат), оказывали существенное, влияние на снижение фагоцитарной активности лейкоцитов крови по отношению к различным видам грибов рода Cat\dLdc\.> .

При иммунологической перестройке организма происходило значительное увеличение фагоцитарной активности лейкоцитов, что сопровождалось существенным снижением интенсивности размножения клеток гриба в крови сенсибилизированных животных. Полученные данные свидетельствуют о том, что фагоцитоз является одним из основных факторов защиты макроорганизма от кандидамикозной инфекции на всех этапах развития патологического процесса.

При изучении цитопатогенного действия грибов рода Candida на переживающую культуру перптониальяых макрофагов была разработана специальная методика, позволявшая проводить количественный учет гибели клеток-мишеней и определение ЦЦ^ (дозы, вызывавшей гибель 50$ макрофагов) в зависимости от количества клеток гриба, использованных для заражения. В результате проведенных исследований было установлено, что различные виды грибов рода Candida.- значительно отличались по цитопатогенному дейст-

вию' йа переживающую культуру макрофагов. Наиболее выраженный цитопатический эффект наблюдался!при заражении культуры макрофагов грибами и С.{^^¿сцб'Л , клетки которых интенсивно размножались в..их цитоплазме. Однако в пределах каждого вида различные штаммы грибов значительно отличались по цпто-патогенному действию. Штаммы гриба вызывали гибель 50% клеток-мишеней (ЦД50) в количестве от 0,10 до 0,68, штаммы гриба С> Ьхо^-СсиШ - от 0,36 до 1,52 клеток гриба в расчете на один макрофаг. Вирулентные штаммы вызывали гибель 51$ макрофагов при заражении в дозе от 0,10 до 0,50 клеток гриба на один макрофаг.

При математической обработке экспериментальных данных установлена высокая положительная корреляция ( £= 0,87) между ци-топатогенным действием и вирулентностью грибов рода С&псИЖа.- . Таким образом, при определении вдтопатогенного действия можно в течение 24-28 ч типировать по вирулентности выделенную культуру гриба, что ускоряет проведение исследования в 10-20 раз по сравнению с применением общепринятого метода - определения вирулентности грибов при экспериментальном заражении лабораторных жи- 1 вотных.

3.4. Клиническая, патологоанатомическая и микологическая- диагностика кандидамикоза сельскохозяйственных животных

Клинические признаки висцерального кандидамикоза у телят и поросят' в большинстве случаев обнаруживались на 3-10 сут после рождения. Симптомы кандидамикозного гастроэнтерита у этих животных были сходны с желудочно-кишечными заболеваниями другой этиологии (угнетенное состояние, диарея, усиленная перистальтика кишечника). Температура тела в пределах нормы. Висцеральный

I кандидамикоз органов дыхания обнаруживали у 2-3-месячных телят и поросят. У больных животных наблюдался кашель, слизисто-гной-ные истечения из носовой полости и незначительное повышение температуры тела. У молодняка домашней птицы заболевание обнаруживали в возрасте от 5-10 дней до двух-трех месяцев. У больной птицы наблюдались диарея, болезненность зоба при пальпации, затрудненное глотание, иногда судороги. В ротовой полости нередко обнаруживали творожистые наложения и пленки белого или серо-желтого цвета.

Характерным признаком, который необходимо учитывать при клинической диагностике кандидамикоза, является отсутствие терапевтического эффекта при применении антибактериальных антибиотиков широкого спектра действия.

При патологоанатомическом вскрытии 62 больных кандидамико-зом телят поражение органов пищеварения было обнаружено у 52 (85,48$), у которых характерные'для висцерального кандидамикоза изменения в виде творожистых наложений и пленок или нежного серо-белого налета на слизистой оболочке наблюдались в пищеводе (11,53$), преджелудках (48,07$), сычуге (75,00$), кишечнике (9,61$). После их удаления обнажалась гиперемированная слизистая оболочка, эрозии, а иногда и относительно крупные язвы диаметром до 10-30 мм. Локализация патологического процесса зависела от возраста животного. У телят-молочников, павших на 515-й день жизни, характерные для кандидамикоза поражения наиболее часто обнаруживались в сычуге и значительно реже в преджелудках. Кандидамикозные поражения преджелудков наблюдались чаще у телят в возрасте от 10-15 до 30 дней жизни, поражение ротовой полости и пищевода встречалось у телят преимущественно в возрасте от одного до трех месяцев в виде спорадических случаев и при генерализации кандидамикозного процесса. Кандидамикозное

(

поражение легких наблюдалось у 2-3-месячных телят в виде катаральной или катарально-гнойной пневмонии. Часто в пораженных участках легочной ткани обнаруживали инкапсулированные плотные очаги желтого цвета диаметром от 2-^ до 10-12 мм. У некоторых животных при генерализации кандидамикоэного процесса наряду с кандидамикозной'пневмонией и бронхопневмонией обнаруживали по-радение органов пищеварения.

При патологоанатомическом вскрытии 225 больных кандидами-козом поросят поражение органов пищеварения было обнаружено у 216 (96,00$), у которых характерные для кандвдамикоза изменения наблюдались в ротовой полости у 10 (4,63$), в пищеводе - у 9 (4,14$), в фундальной и пилорической частях желудка - у 191 (88,26$), в кишечнике - у 15 (6,94$), в почках - у 12 (5,55$). Гибель больных животных наблюдалась преимущественно в первые 515 дней после рождения. Слизистая желудка была отечная, складчатая, гиперемированная с точечными и пятнистыми кровоизлияниями. При удалении пленок и наложений на слизистой желудка обнаруживали мелкие эрозии, а иногда и язвы (диаметром до 10-30 мм) . с неровными краями, дном темно-красного цвета и небольшими узелками серого цвета,. Слизистая^оболочка тонкого кишечника и особенно двенадцатиперстной кишки набухшая, гиперемированная. У павших поросят нередко обнаруживали зернистое и жировое перерождение печени и мелкие кровоизлияния в почках. При гибели в более поздние сроки (на 15-30-е сут) в полости почечной лоханки иногда обнаруживали серовато-желтые или желтовато-зеленые слизистые массы, при микроскопическом исследовании которых выявлялись овальные дрожжевидные клетки.

У молодняка всех видов птицы характерные для кандидамшсоза изменения наблюдались преимущественно на слизистых оболочках ротовой полости, пищевода и зоба. В большинстве случаев наибо-

I лее выраженные изменения наблюдались при осмотре зоба. У" части пашей птицы обнаруживали также катаральное воспаление кишечника, а при генерализации кандидамикозного процесса - некротические очаги в почках, .печени, селезенке, кишечнике и на брюшине.

При сопоставлении результатов патологоанатомического вскрытия с данными, полученными при гистологическом исследовании, было установлено, что при гистологических изменениях в пораженных тканях и наличии в них грибов рода СлпаИс1(1 характерные макроскопические изменения наблюдались только у 68,4$ поросят-сосунов и у 67,6$ молодняка птицы. Поэтому при диагностике висцерального кандвдамикоза необходимо проводить комплексное лабораторное исследование патологического материала.

При сопоставлении результатов микологического исследования патологического материала с клинико-эпизоотическими, пато-логоаиатомическими и гистологическими данными, а также при определении интенсивности колонизации пораженных органов и тканей различными видами грибов рода установлено, что основными возбудителями кандидамикоза сельскохозяйственных животных являлись грибы О&ШшхЬ м О-Аы^саДь . Однако в зависимости от вида, возраста животных и места локализации патологического процесса роль этих видов грибов в возникновении, развитии и исходе кандидамикозного процесса неодинаковая. Так, при каццидамииозе молодняка птицы из патологического материала, как правило, выделяли гриб аЩ , при заболевании телят и поросят из сычуга и желудка в 92,8-93,4$ случаев выделяли гриб С. Ьо^Оо.&Ц . Этот же гриб ввделяли из содержимого кишечника, а при генерализации кандидамикозного процесса у этих животных - из почек, селезенки, печени и крови. В некоторых случаях гриб Сл^о/гд'ся^З ввделяли совместно с грибом С.кХ^и ,

который, по-видимому, также играл определенную роль в развитии патологического процесса в ассоциации с патогенными штаммами /гегСс(т.Сй,-Со¿¡I . При поражении ротовой полости, пищевода и преджелудков у телят и .поросят обнаруживали преимущественно гриб СлШслц£ . Из содержимого трахеи, бронхов, легочной ткани, а также из носового истечения при кандидамикозной пневмонии обычно выделяли гриб , реже - гриб С,{га^сСд_

или их ассоциации с другими грибами (чаще с грибами С.кш-3е1 и С /г5([1г1осъо1г1СЛ). При кандидамикозных маститах коров из пораженной четверти вымени в 60,68$ случаев выделяли гриб СЛго^сь^ , реже - грибы <?-, анализ, С,£гичп>

Значительную сложность при лабораторной диагностике висцерального кандидамикоза желудочно-кишечного тракта представляла дифференциация этого заболевания от кандиданосительства, которое проявлялось выделением грибов рода СаяЫлс/а, из различных отделов пищеварительного тракта. Надежным критерием дифференциации кандидамикоза от кандиданосительства являлось патоло-гогиотологическое исследование с применением специальных методов окраски гистосрезов (по Гочкис-Мак-Манусу в модификации В.В.Курасовой, по Грам-Вейгерту в модификации Боголепова). Однако при патологогистологической диагностике необходимо прибегать к относительно сложным и длительным методам исследования. В связи с этим нами был разработан ускоренный культурально-ми-кологяческий способ, с помощью которого в течение 24-48 ч дифференцировали кандвдамикоз от кандиданосительства. Дифференциальную диагностику висцерального кандидамикоза осуществляли при посеве патологического материала на агар Сабуро с последующим определением количества клеток гриба в пораженных тканях при подсчете выросших колоний гриба. При этом определяли коли-

' чество клеток гриба как на поверхности слизистой оболочки, так и в глубине пораженной ткани исследуемого органа (пищевода, зоба, желудка или кишечника). На основании полученных данных вычисляли индекс инвазивности и комплексный показатель - дифференциальное число, характеризовавшее интенсивность обсеменения тканей клетками гриба и их проникновение с поверхности слизистой оболочки в глубину пораженного органа.При сравнительном изучении результатов патологогистологического и культураль-но-микологического исследования были определены статистически достоверные критерии дифференциации висцерального кандидамико-за от кандиданосительсгва. В результате этих исследований установлено, что при дифференциальном числе менее 0,61- 10 результаты исследования на кандидамикоз надо оценивать как отрица-

с с

тельные, при дифференциальном числе от 0,61- 10 до 1,41 • 10 -диагноз сомнительный, а при дифференциальном числе 1,42 • 10 и более - положительный. Возможная ошибка (по сравнению с патоло-гогистологическим исследованием) менее Ъ% (Р< 0,05).

В результате определения обСемененности различных участков желудочно-кишечного тракта грибами рода Схщгис1<ь было обнаружено, что гриб С. интенсивно колонизировал ткани пищевода, зоба и преджелудков, а гриб С.Ыа^СА^Ь - желудка и сычуга. Другие виды грибов рода в различных отделах желудочно-кишечного тракта размножались в его содержимом или на поверхности слизистой и в большинстве случаев не проникали в глубину этих тканей.

I

3.5. Лечебно-профилактические мероприятия при висцеральном кандидамякозе телят и поросят

В неблагополучных по кандидамикозу хозяйствах основным источником заражения молодняка являлись взрослые животные, кото-

• ры'е выделяли во внешнюю среду грибы рода СалаИЛа- , что было одной из причин интенсивного инфицирования молодняка в первые часы жизни. В таких хозяйствах грибы , С {-гар.1СА-

■/¿5 или их ассоциации с другими грибами выделяли из содержимого кишечника, каловых масс, с поверхности кожных покровов и сосков, а иногда - из влагалища и молока, в особенности при заболевании дойных коров кандидамшсознши маститами, которые по клиническим признакам не отличались от маститов другой этиологии. В связи с этим была разработана методика патогенетической терапии маститов окситоцином. При внутривенном введении оксито-цина (по 40 ДЦ два-четыре раза) наблюдался высокий терапевтический эффект при лечении как спонтанных, так и экспериментальных кандидамикозных маститов коров.|Однако без последующего применения этиотропной терапии у части коров после клинического выздоровления наблюдалась персистёнция гриба в молочной железе и его вцделение с молоком, поэтому при санации молочной железы применяли этиотропную терапию. Хорошие результаты получепи при введении через сосковый канал раствора натриевой соли леворина по 100-150 тыс. ИЕ в течение трех-четырех дней. Затраты на медикаменты при лечении кандидамикозных маститов окситоцином и натриевой солью леворина в расчете на одну корову составляли всего 0,5-0,6 руб.

Проведенные исследования также показали, что неблагоприятные факторы внешней среды оказывали существенное и статистически достоверное влияние на течение висцерального кандвдамикоза. Среди различных экзогенных факторов, предрасполагавших к этому заболеванию, необходимо отметить прежде всего наличие гипо- и авитаминоза А, массовое применение антибиотиков широкого спектра действия, поражение кормов плесневыми грибами из рода й^чъ." (\Ши$. и РмШбйи-нь .

37 ;

i

На основании проведенных исследований был разработан комплекс лечебно-профилактических мероприятий, направленных на повышение естественной резистентности животных и ликвидацию заболевания.

В хозяйствах, неблагополучных по кандидамикозу молодняка, необходимы следующие мероприятия:

• - отмена массового использования антибиотиков широкого спектра действия;

- введение в рационы маточного поголовья и молодняка кормов, богатых витаминами, минеральными веществами и микроэлементами;

- двух-трехкратная внутримышечная обработка стельных коров и супоросных свиноматок во второй половине беременности смесью витаминных концентратов витамина А, Д3 и Е (коровам - по 500600 ИЕ витамина Л, 100-120 ИЕ витамина Д„ и 60-70 мг витамина Е;

О

свиноматкам - соответственно 200-300; 60 и 30);

- очистка и дезинфекция помещений и инвентаря с применением фунгиоцидных средств;

- систематическая лечебно-профилактическая обработка молодняка и санация маточного поголовья препаратами, обладающими фунгиостатическим и фунгиоцидным действием.

При кандидамикозе телят с лечебно-профилактической целью применяли внутрь (jutoi ) леворин или нистатин. Для лечения больных животных эти антибиотики применяли два раза в день по 15-20 тыс.ЕД, а с профилактической целью - по 5-10 ДД/кг в течение 5-6 сут. При заболевании телят в первые дни жизни указанные антибиотики использовали также для санации маточного поголовья. С этой целью леворин или нистатин задавали коровам ( цгг os ) за 10-15 дней до отела по 5-6 тыс. ЕЩ/кг два раза в день в течение пяти суток. Затраты на лечение одного теленка составляли 0,23-0,31 руб., на профилактическую обработку -

| 0,0й-0,16; санацию маточного поголовья в расчете на одну стельную корову - 1,0 руб.

При кавдидамикозе поросят леворин назначали с лечебно-профилактической целью с первого-второго дня жизни. Препарат применяли внутрь один-два раза в день в дозе 25-50 тыс.ЕД в течение пяти суток. При появлении признаков заболевания в более поздние сроки (на 10-15-е сут) курс лечения повторяли. Хороший лечебно-профилактический эффект при висцеральном кандидамикозе желудочно-кишечного тракта поросят-сосунов получали также при применении раствора чеснока на крахмальном геле. Сок чеснока, разбавленный в соотношении 1:10 крахмальным гелем, применяли поросятам с первого-второго дня жизни по 3-4 мл (¡г1-г ) один-два раза в день в течение пяти суток. При появлении заболевания в более поздние сроки обработку повторяли, вводя раствор чеснока внутрь по 4-5 мл. Одновременно проводили санацию свиноматок. С этой целью оставшуюся после отжима сока массу измельченного чеснока (жом) в количестве 20-30 г скармливали свиноматкам ежедневно в течение пяти суток.

Экономическая эффективность проведения комплекса лечебно-профилактических мероприятий при висцеральном кавдидамикозе у телят-молочников 5,7 руб., у поросят-сосунов - 7,4 руб. на один затраченный рубль; на одну наличную голову - соответственно 17,1 и 3,9 руб."

4. ВЫВОДЫ

I. Из патологического материала и объектов инешней среды выделено 507 штаммов грибов рода СапсИНъ : 153 штамма гриба С. й№.сап5 , 182 - а.-Ъю^ЬСА&З. , 82 - й.ки^ , 35 -С. ^тс/Мо^й&йь , I? - а.цачмтиь , з - а^тейб?.-Ь\оп((лЬ и 29 штаммов других видов грибов СмсИНь ( С-. ,

С, щМноос(м, t.ivtWtit.&Jofttt,С. SMottii , С, tugo-

51/ ). При экспериментальном заражении 1100 белых мышей, 110 кроликов и 39 коров изучена патогенность и вирулентность различных видов этих грибов.

2. ДЦзд при внутрибрюшинном заражении белых мышей для разных штаммов гриба С.<х£$£&з.п£ находится в пределах от 70,0 до 405,0 млн. клеток гриба, для штаммов гриба CiitopitaiU соответственно - от 179,0 до 675,4 млн., для штаммов гриба

- от 317,0 до 641,9 млн., для штаммов гриба 0.. pliiccio^capt tCitiS - от 610,5 до >- 800 млН4, для штаммов гриба KnMSlt- от 648,7 до Р>- 800 млн. Минимальная летальная доза при внутривенном заражении кроликов для штаммов гриба С- CiiS-C -tOM/> составляет 0,5-1,0 млн., для штаммов -

40,0 млн. клеток гриба на I кг массы животных; минимальная доза, вызывающая клинически выраженные маститы коров, соответственно - 1,0 и 0,1 млн. клеток гриба при интрацистернальном заражении. I

I

3. Цитоморфологические признаки грибов рода Са./ь(Ссс(й зависят от вида гриба и состава питательной среды. На агаре и бульоне Сабуро культура гриба С. ctE^iccw-S состоит преимущественно из овальных дрожжевидных клеток, псевдомицелий обнаруживается непостоянно и только на 6-10-е сут инкубации, а на мясо-пептонном агаре и бульоне - на 2-3-и суг культивирования. У грибов Сitop'itoJts,С.K'titsti, С-p,^ucioi>copUa.iii г С.р&ча-fctusti при их культивировании на агаре и бульоне Сабуро, мясо-пептонном агаре и бульоне образование псевдомицелия наблюдается на 3-4-е сут инкубации. В жидких питательных средах из растительного сырья (кукурузная и картофельная среда), в бульоне Сабуро и мясопептонном бульоне образование псевдомицелия у грибов рода tctultiici происходит более постоянно, чем на аналогичных

1 плотных питательных средах.

4. На изменение цитоморфологических признаков при культивировании грибов рода С<шс1*с1ау на искусственных питательных средах существенное влияние оказывают условия аэрации культуры гриба: гриб & Ч&Сеанй на кукурузном агаре в аэробных условиях развивается преимущественно в|дрожжевидной форме, в анаэробных условиях - в псевдомицелиальной форме, а образование хлами-доспор происходит только в условиях частичного ограничения аэрации. У грибов О. ¿го^ол&ь 1 О.кгизео у СуШи^&л/н'ез&з

и й.^аЦги^еь на агаре Сабуро, на кукурузном и мясопептонном агарах интенсивное образование псевдомицелия происходит только при частичном ограничении аэрации, а в анаэробных условиях преобладают овальные дрожжевидные клетки.

5. Ассимиляция углеводов (глюкозы, сахарозы, мальтозы и лактозы) грибами рода (1а1ьсИЫ<ъ сопровоздается изменением активной реакции среды от нейтральной или слабощелочной (рН 7,07,2) до слабокислой (рН 6,0-6,5). При расщеплении этих углеводов до конечных продуктов брожения рН среды приобретает кислую реакцию (рН< 5,0). На основании этих данных разработана ускоренная методика определения ауксанотрофности и бродильной активности этих грибов.

6. Протеолитическая активность как качественный признак обнаружена у 86,96$ штаммов гриба С.4(%'С<ьп2 , у 68,18% штаммов гриба О.Ыо^и^И , у 20,0$ штаммов гриба С.^шиищео , у 16,66% штаммов гриба С.^¿и^обго^гс'йа^ и 10,0% штаммов гриба сгаягЬ , фосфолипазная Активность - только у гриба

С,«¿ЙбйлЯ (у 95,65$ исследованных штаммов). .Коэффициент корреляции мевду протеолитмческой активностью и вирулентностью грибов при заражении белых мышей равен 0,64, а между фосфоли-пазной активностью и вирулентностью - 0,45.

1 .. ' Г - '

7. В натйвной сыворотке крови крупного рогатого скота, лошадей, свиней, овец, кроликов и птицы дрожжевидные клетки гриба G,<\C6iC(ini через 1-2 ч культивирования при температуре от 33° до 41°С образуют ростковые трубочки, которые являются начальной стадией развития мицелия и псевдомицелия. Другие виды грибов рода QatulicU, в сыворотке крови размножаются почкованием. Оптимальные условия для образования ростковых трубочек у гриба С. WtS : температура инкубации 37-39°С, содержание яативного белка в сыворотке крови 6-8$, рН сыворотки 6,26,7. Растворы «С- или ^"-глобулинов, добавленные к сыворотке крови, ингибируют интенсивность образования ростковых трубочек.

8. При культивировании в сыворотке крови грибов 0.

Олц% и C.tzojùcciùb в ультратонких срезах их клеток, окрашенных рутениевым красным, обнаружены добавочные слои клеточной оболочки - микрокапсула, которая отсутствует у других видов грибов рода Candi du- .

9. Образование развитого псевдомицелия у гриба C-ACéicanS происходит при его культивировании в сыворотке крови с рН от 5,2 до 8,4; у гриба C,.-iïojtic<(CLi ,- в сыворотке с рН от 5,2 до 6,4; у грибов С, /СгийеС( С. jtiitWÔoit-a^tlCdÛ!!,t G.JimiituSel

и С, (jU-iMieifionsdU - в сыворотке с рН от 5,2 до 5,4. Па основании этих данных и результатов изучения дегидрогеназной активности грибов разработан способ ускоренной идентификации грибов

10. В организме восприимчивого животного гриб C.a&iCatbS развивается преимущественно в мицелиальной и псевдомицелиальной формах. Морфологические особенности гриба Q.iloJiicbÛs зависят от локализации патологического процесса: в почках, на слизистой оболочке ротовой полости, пищевода, зоба, кишечника он

; 42

I

развйвается в дрожжевидной форме; при кандидамикозном поражении желудка у поросят, сычуга у телят и в молочной железе - в дрожжевидной и псевдомицелиалыюй формах.

II. На изменение биологических свойств гриба при его пассировании в организме восприимчивого животного существенное влияние оказывает течение кандидамикоэного процесса. У восьми культур, выделенных при остром течении кавдпдамикозно-го процесса, по сравнению с исходными штаммами наблюдалась тенденция к увеличению вирулентности. У шести культур, выделенных при хроническом и субклиническом течении кандидамикоэного процесса, произошло•снижение протеолитической активности, интенсивности образования ростковых трубочек и вирулентности. ЛДзд при внутрибрюшинном заражении белых мышей у исходных штаммов составляла 100,5 млн. и 79,3 млн. клеток гриба, у культур, выделенных при остром течении,__соответственно - 81,7 млн. и 00,5 млн., при хроническом и субклиническом течении -295,3 млн. и 282,8 млн.

12. Фагоцитарная активность лейкоцитов крови зависит от их функционального состояния и вида фагоцитируемого гриба. Завершенность фагоцитоза грибов С./Сш$еС, С.р&ис^абг^и г С^Шй/миХеи, 0. уилМСе-Ъ/птЫН. составляет 13,21-66,56$,

а у гриба С, она наблюдается только после специфиче-

ской сенсибилизации организма и составляет 42,60$. Антибиотики широкого спектра действия ингибируют фагоцитарную активность лейкоцитов и завершенность фагоцитарного процесса.

13. Размножение грибов рода Слпг&'еСц, в культуре перито-ниальных макрофагов ( иь иИго ) сопровоздается гибелью клеток-мишеней. Гибель 50$ макрофагов (Ш^д) наблюдается при их заражении штаммами гриба С аё& сапв в количестве 0,10-0,69, штаммами гриба С, Ьионьса-Ссь - 0,36-1,52, штаммами гриба

1 С, Кис^сС - 0,91-3,05 клеток гриба в расчете на один макрофаг. Коэффициент корреляции между ЦЦ^ и ЛД5д при заражении белых мышей 0,87.

14. Локализация патологического процесса при висцеральном кандидамикозе зависит от вида и возраста животных. При патоло-гоанатомическом вскрытии (62 телят, 225 поросят и 280 цыплят и индюшат) установлено, что характерные каццидамикозные поражения у телят-молочников чаще всего обнаруживаются в сычуге

I

(75,00$) и в преджелудках (48,07$), у поросят-сосунов - в области фундальной и пилорической частей желудка (88,26$), а у молодняка птицы - на слизистых оболочках ротовой полости, зоба и пищевода. Поражение слизистых'оболочек ротовой полости, пищевода, кишечника и органов дыхания у телят и поросят встречаются в виде спорадических случаев преимущественно в возрасте от 20-30 дней до трех месяцев.

15. В результате микологического и патологоморфологическо-го исследования 227 проб патологического материала от телят, поросят, молодняка птицы и 484 проб молока при маститах было установлено, что возбудителем висцерального каадидамикоза, кроме гриба СлС41счи& , является гриб С,~6'гуг1С1\С('& , который выделяли при кандидамикозном поражении сычуга телят (92,8$), при кандидамикозе желудка поросят (93,4$), при кандидамикозных маститах коров (60,6$).

16. Разработан и внедрен в лабораторную практику способ культурально-микологической дифференциации висцерального канди-дамикоза желудочно-кишечного тракта от кандиданосительства, . основанный на определении дифференциального числа - комплексного числового показателя инвазивности и обсемененности тканей

с

клетками гриба. При дифференциальном числе 1,42 • 10 и более диагноз на кандидамикоз положительный. Возможная ошибка при

проведении культурально-микологической диагностики (по сравнению с патологогистологическим исследованием) менее Ъ% (Р < 0,05).

17. Изучена динамика размножения грибов рода Слл<й(С<о в молочной железе и влияние антибиотиков широкого спектра действия и дефицита витамина А на течение кандидамчкозных маститов коров и обоснована терапевтическая эффективность применения окситоцина и натриевой соли леворина для их лечения.

18. Разработан и внедрен в ветеринарную практику при висцеральном кандидамикозе желудочно-кишечного тракта телят и поросят комплекс лечебно-профилактических мероприятий с применением в качестве фунгиостатических и фунгиоцидннх средств леворина, нистатина и сока чеснока на крахмальном геле.

Мероприятия апробированы в производственных условиях на поголовье 540 телят и 214(^0 поросят. Экономическая эффективность лечебно-профилактических мероприятий при кандидамикозе телят - 5,7 руб., при кандидамикозе поросят - 7,4 руб. на один затраченный рубль.

.5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

На основании наших исследований рекомендуются для практики:

1. Способ дифференциации грибов СйС&с<ш$ и С.

от других дрожжеподобных грибов (Авторское свидетельство № 1104153 от 22.03.84 г. по заявке № 3536876 от 07.01.83 г.).

2. Способ посмертной диагностики висцерального кандидами-коза животных (Авторское свидетельство № 1629037 по заявке

Д. 40638136 от 30.04.86 г.). 1

3. Способ профилактики кандидамикоза поросят-сосунов (Авторское свидетельство .№ 1623066 по заявке )й 4123418 от

Г.07.86 г.).

4. Комплекс диагностических и лечебно-профилактических ероприятий'при кандидамикозе молодняка сельскохозяйственных ивотных:

- Рекомендации по диагностике и мерам борьбы при кандидами-,озе крупного рогатого скота, свиней и птицы (рекомендованы ;тс Госагропрома РСФСР).- Ст. Персиановка, 1989.

- Методические рекомендации по диагностике и мерам борьбы

; кандидамикозом сельскохозяйственных животных. ВАСХНИЛ.- М., [991.

6. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ, .В КОТОРЫХ ОТРАЖЕНЫ ОСНОВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ

1. Себряков Е.В. К вопросу о патогенезе кандидамикоза и морфологических изменениях грибов рода й&псйс^А в сыворотке крови //Вестник дерматологии и венерологии.- 1966.- № 10.-С. 54-57.

2. Себряков Е.В. Динамика цитоморфолог1чних та функц1о-нальних зм1н гриб1в роду при 1х размноженн1 на р1з-них штучних поживних середовищах //В1сник с1льскогосп.науки.-1966.- № 2.- С. 107-110.

3. Себряков Е.В. Про морфолог1чн1 особливост1 гриб1в роду СшсИсСл, при размнокенн1 1х у сироватц1 нров1 на р1зних штучкових пожевних середовищах //М1кроб1ол. для народного господ. медицини: Сб.ст. /АН УССР,- Ки1в, 1966,- С. 214-217.

I

4. Себряков Е.В. Вирулентность грибов рода Са,псй(1ь и их цитоморфологические особенности при размножении на различных искусственных питательных средах //Ветеринария /Респ.межвед. темат. научный сб.- Киев, 1967.- Вып. 12.- С. 107-109.

I

5. Себряков Е.В., Велиток И.Г. Боротьба з маститами при

машинному до1нн1 кор1в.- Ки1в: Урожай, 1969,- 126 с.

6. Себряков Е.В. Про морфолог1чн1 зм1ни гриб1в роду

пр1 1х размноженн1 в орган1зм1 сприйнятливо1 тваршш // М1кроб1олог1чний журнал.- 1969.- Т. 31, вып. 4.- С. 302-305.

7. Себряков Е.В. Культ,урально-морфолог1чн1 I функц1ональн1 зм1ни гриб1в роду СапсАсбь при 1х пасажуванн1 в сиворотц1 кро-в1 в орган1зм1 сприйнятливо1 твариш //Ветер1нар1я /Респуб. м1жв1д.темаг.наук.зб.- Ки1в, 1970.- Вып. 25.- С, 112-116.

8. Себряков Е.В. Влияние витамина А на течение кандидами-козного процесса в молочной железе //Сб.научн.тр. /Донской с.-х. ин-т.- 1972.- Т. 7, вып. 3.- С. 44-50.

9. Себряков Е.В. Гриби роду СсмсИс1л, - збудники мастит1в кор1в //ГЯкроб1олог1чний журнал.- 1973,- Т. 35, вып. 6.

10. Себряков Е.В. Маститы кандидамикозной этиологии и их патогенез //Сб.научн.тр. /Донской с.-х. ин-т.- 1973.- Т. 8, вып. I.- С. 35-38.

11. Себряков Е.В. Цито-морфологические особенности грибов рода при их культивировании в мясопептонном бульоне и агаре //Сб.научн.тр. /Донской с.-х. ин-т,- 1974,- Т. 9, вып. I.- С. 68-72.

12. Себряков Е.В. Цито-морфологические признаки различных видов грибов рода С&мИсСл, //Сб.научн.тр. /Донской с.-хлш-т.-1974.- Т. 9, вып. I.- С. 64-68.

13. Себряков Е.В. Изучение вторичной люминесценции грибов . рода С'а<-ц.'Д>/л/ //Сб.научн.тр. /Донской с.-х.ин-т.- 1974.- Т. 9, вып. I.- С. 73-76.

14.. Себряков Е.В., Велиток И.Г. Течение экспериментальных кандидамикозных маститов и их лечение окситоцином //Сб.научн. тр. /Донской с.-х. ин-т.- 1974.- Т. 9, вып. I.- С. 77-82.

15. Себряков Е.В. К методике выделения одноклеточной

г

культуры дрожжей и дрожжеподобных грибов //Профилактика и ликвидация болезней с.-х. животных: Сб.ст. /Донской с.-х. ин-т.-Персиановка, 1976.- Т. II, вып. 2.- С. 41-43.

16. Веремеев А.Н,., Себряков Е.В. Висцеральные микозы как осложнение диспепсии телят //Профилактика и ликвидация болезней с.-х. животных: Сб.ст. /Донской с.-х. ин-т.- Нерсиановка, 1976.- Т. II, вып. 2.- С. 43-45.

17. Себряков Е.В. Образование псевдомицелия у грибов рода Candida ■ при их культивировании на искусственных питательных средах //Профилактика и лечение инфекционных и инвазионных заболеваний с.-х. животных: Сб.ст./Донской с.-х. ин-т.- Перепаковка, 1977.- Т. 13.- С. 62-70.

18. Себряков Е.В. Цито-морфологические изменения грибов рода Ctmdtda, при их культивировании в различных условиях аэрации //Профилактика и лечение инфекционных и инвазионных заболеваний с.-х. животных: Сб.ст./Донской с.-х. ин-т,- Нерсиановка, 1977.- Т. 13,- С. 57-62.

19. Себряков Е.В., Рзаев П.Г. Дифференциальная диагностика гриба С. <\¿éic.cubí. при культивировании в сыворотке крови // Профилактика и лечение инфекционных и инвазионных заболеваний с.-х. животных: Сб.ст./Донской с.-х. ин-т.- Нерсиановка,1977.-Т. 13.- С. 70-73.

20. Меры борьбы с каидидамикозом поросят /Иаракин В.К., Себряков Е.В., Ермолаев Б.Б. и др. //Ветеринария.- 1978.-

Jí; 3.- С. 60-63.

21. Себряков Е.В. К вопросу иммерсионной рефрактометрии грибов рода Cajic/,id<u //Профилактика и лечение заболеваний с.-х. животных: Сб.ст./Донской с.-х. ин-т.- Нерсиановка, 1978.Т. 13, вып. 3.- С. 27-30.

22. Себряков Е.В. Образование псевдомицелия у грибов рода

СлпНСНп/ при их культивировании в сыворотке крови //Профилактика и лечение заболеваний с.-х. животных.- Сб.ст./Донской с.-х. ин-т.- Персиановка, 1978,- Т. 13, вып. 3,- С. 30-36.

23. Себряков Е.В.,. Паракин В.К., Воронянскнй В.II. Канди-дамикоз поросят и лечебно-профилактические мероприятия при этом заболевании //Профилактика желудочно-кишечных и респираторных болезней свиней: Тезисы докл. Всесоюзной научно-технической конференции. Новочеркасск.- М., 1979.- С. 58-59.

24. Себряков Е.В., Вороняяский В.II., Маныцков Л.Я. Кандн-дамикоз поросят //Свиноводство,- 1979.- Ц 3,- С. 32-33.

25. Себряков Е.В. Влияние различных белковых фракций сиво-ротки крови на образование ростковых трубочек у гриба С.аШ-ftitS //Профилактика и лечение заболеваний с.-х. животных: Сб. ст./Донской с.-х. ин-т.- Персиановка, 1979.- Т. 14, вып. 3.-

С. 124-126.

26. Себряков Е.В. Ферментативная активность грибов рода (latulLciev //Профилактика и лечение заболеваний с.-х. животных: Сб.ст./Донской-с.-х. ин-т,-Персиановка, 1980.-Т. 15, вып. 2.- С. 73-78.

27. Себряков Е.В. Этиология и. патогенез висцерального кан-дидамикоза поросят-сосунов //Профилактика и лечение заболеваний с.-х. животных: Сб. ст./Донской с.-х. ин-т.- Персиановка,' 1980,- Т. 15, вып. 2.- С. 78-83.

28. Себряков Е.В. Содержание азотистых веществ в биомассе грибов рода Слдdl da, при их культивировании в различных условиях //Профилактика и лечение заболеваний с.-х. животных в условиях концентрации производства: Сб.ст./Донской с.-х. ин-т,-Персиановка, 1981,- Т. 16, вып. 2.- С. 90-94.

29. Себряков Е.В., Федгок В.И. Кандидамикоз телят как осложнение антибиотикотерапии //Совершенствование системы вет.

* ~ '

мероприятий в промышленном скотоводстве: Сб.ст./Донской с.-х. ин-т.- Лерсиановка, 1902.- С. 77-79.

30. Себряков Е.В., Воронянский В.П. Диагностика висцерального кандидамикоза- телят //Новое в борьбе с незаразными заболеваниями, бесплодием и маститами крупного рогатого скота: Сб.ст./Донской с.-х. ин-т,- Лерсиановка, 1983.- С. 14-17.

31. Себряков Е.В. Влияние антибиотиков широкого спектра действия на течение кандидамикозных маститов //Новое в борьбе с незаразными заболеваниями, бесплодием и маститами коров: Сб. ст./Донской с.-х. ин-т.- Нерсиановка, 1983.- С. 73-79.

32. Себряков Е.В., Паракин В.К., Воронянский В.II. Канди-дамикоз крупного рогатого скота и свиней //Ветеринария.- 1984,-№ 3.- С. 43-46.

33. A.c. }& II04I53 (СССР). Способ дифференциации грибов C.flC&'cattS и C.ttojvicixCis. от других дрожжеподобных грибов

/Донской с.-х. ин-т, автор изобретения Е.В.Себряков. Заяв. 07.01.83 г. И 3536876.

34. Себряков Е.В. Терапевтическая эффективность нистатина и фитонцидов чеснока при кандидамикозе индюшат //Интенсификация птицеводческой отрасли в хозяйствах Ростовской области: Сб. научн.тр./Донской с.-х. ин-т.- Нерсиановка, 1985.- С. 42-44.

35. Себряков Е.В. Фунгиостатические свойства чеснока и лука и их применение для профилактики кандидамикоза индюшат //Интенсификация птицеводческой отрасли в хозяйствах Ростовской области: Сб.научн.тр./Донской с.-х. ин-т.- Нерсиановка, 1985.-С. 45-47.

36. Себряков Е.В., Вылегжанин А.Ф. Ветеринарно-санитарная оценка молока и молочных продуктов, обсемененных грибами рода Candida //Ветеринарно-профилактические мероприятия при незаразных болезнях в условиях интенсивного ведения молочного ско-

тово'дства: Cd.научн.тр./Донской с.-х. ин-т.- Персиановка, 1985.- С. 69-73.

37. Себряков Е.В., Косаревская И.Л. Candida aifacatt-S и С ilojbtC<((is, _ основные возбудители кандидамикоза человека и животных и ускоренная идентификация этих грибов //Проблемы медицинской и санитарной микробиологии: Тезисы докл. Ростовского отдёления ВМО при АН СССР.- Ростов-на-Дону, 1987,- С. 76-78.

38. Себряков Е.В. Эгиопатогенез и патоморфологическая диагностика кандидамикоза молодняка птицы //Повышение эффективности птицеводства в хозяйствах Ростовской области: Сб.научн. тр./Донской с.-х. ин-т.- Персиановка, 1987.- С. 32-39.

39. Себряков Е.В. Диагностика висцерального кандидамикоза у телят.и поросят //Меры борьбы с незаразными болезнями крупного рогатого скота: Сб.научн.тр./Донской с.-х. ин-т.- Персиановка, 1987.- С. 72-76.

40. Себряков Е.В., Пиголкина В.В. Ультраструктура грибов рода С&нЫсЫа, при их культивировании в различных условиях // Вестник Всесоюзного микробиологического общества.- 1989,-Вып. I.- С. 39-41.

41. A.c. JS 1629037 (СССР). Способ посмертной диагностики висцерального кавдидамикоза животных /Донской с.-х. ин-т, автор изобретения Е.В.Себряков. Заяв. 30.04.86 г. № 4063826/15.

42. A.c. № 1629066 (СССР). Способ профилактики кандидамикоза поросят-сосунов /Донской с.-х. ин-т, автор способа

Е.В.Себряков. Заяв. 01.07.86 г. № 4123418/15.

Подписано в печать 18.07.91 г. Формат бумаги 60x84 1/16

Печатных листов 2.5. Тираж 12ц._

г. Новочеркасск. Типография НПИ.