Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Сравнительный анализ эффективности применения аллогенных диплоидных фибробластов различной степени зрелости в лечении пограничных ожогов.

Ледовскон Сергей Николаевич

Сравнительный анализ эффективности применения аллогенных диплоидных фибробластов различной степенн зрелости в лечении пограничных ожогов

(клинико-эксперименталыюе исследование)

14.01.17 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Курск-2011

1 О О ЕВ 2011

4853854

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Лазаренко Виктор Анатольевич Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Иванов Сергей Викторович доктор медицинских наук Темирбулатов Владимир Ибрагимович

Ведущая организация: ФГУ «Институт хирургии им. А.В.Вишневского Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».

Защита диссертации состоится »¿р-и^Л2011 г. в/3 '•' часов на заседании диссертационного совета Д 20К039.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (305041, г.Курск, ул.К.Маркса,3).

Автореферат разослан «¿О» ¡р2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Маль Г.С.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Проблема ожоговой травмы остается одной из самых серьезных как в медицинском, так и в экономическом и социальном аспектах. Данному виду поражений подвержены все возрастные категории, часто оно носит профессиональный характер, сопряжено с высокой летальностью и инвалидностью. Традиционный хирургический подход к лечению этой категории больных, по-прежнему являясь основным, тем не менее, практически исчерпал резервы для своего дальнейшего развития (А.А.Алексеев, 2000). В связи с этим, в поисках возможностей совершенствования терапии и повышения ее клинической эффективности, на сегодняшний день на первое место выходят методы консервативного лечения, разработка «идеальных» раневых покрытий и методы биотехнологии, связанные с выращиванием in vitro отдельных культур клеток кожи или созданием живых кожных эквивалентов (Парамонов Б.А. и со-авт., 2000; Бурда Ю.Е. и соавт., 2002; Jones I., Currie L., Martin R., 2002; Dorsett-Martin W. et al., 2008). К последнему направлению относится трансплантация аллогенных диплоидных фибробластов (АлДФ) на ожоговые раны, используемая как самостоятельный метод, так и как способ подготовки ран к аутодермо-пластике (Алексеев A.A., 1996; Будкевич Л.И. и соавт., 1997; Morimoto N. et al., 2005). Наибольшее развитие трансплантация АлДФ нашла в лечении пограничных и глубоких ожогов.

В настоящий момент клиническая эффективность трансплантации АлДФ, благодаря проведенным исследованиям (Глущенко Е.В., 1994; Рахаев A.M., 2000; Atiyeh B.S., Hayek S.N., Gunti SW. 2005), уже не вызывает сомнения. Разработаны различные подходы к тактике применения данного метода в лечении ожоговой травмы (А.А.Алексеев и соавт., 1998, 2007). Однако в различных медицинских учреждениях используют АлДФ различной степени зрелости, полученные как из эмбриональных тканей (Красноухов А.И. и соавт., 1996; Селезнев Ю.П., 2001), так и из кожи взрослых доноров (Саркисов Д.С. и соавт., 1994, Рахаев A.M., 2000, Алексеев A.A., 2007). И в том и другом случае описываемая эффективность их трансплантации сопоставима, но фибробласты различной степени зрелости отличаются по функциональным свойствам, требуют дифференцированных подходов к культивированию, а, следовательно, могут значительно отличаться по экономической эффективности. Поэтому представлялось целесообразным провести сравнительный анализ затрет на получение готовых к трансплантации культур из эмбриональных и взрослых тканей.

Пограничные ожоги, или ожоги Ша степени, несмотря на их возможную способность к самостоятельной эпителизации за счет сохранившихся клеточных элементов дериватов кожи, часто сопровождаются формированием рубцов, в том числе гипертрофических и келоидных, что представляет не только косметическую проблему, но и формирует различные контрактуры, требующие в дальнейшем выполнения многих реконструктивно-восстановительных и пластических операций (А.А.Алексеев и соавт. 1997, 1998; Парамонов Б.А. и соавт, 2000). Однако, несмотря на длительный период использования трансплантации фибробластов в лечении ожогов, работ, посвященных изучению

3

катамнеза данной патологии у этой группы пациентов, в доступной литературе нами встречено не было.

Цель исследования заключалась в сравнительном изучение клинической эффективности и экономических затрат при трансплантации эмбриональных и взрослых человеческих фибробластов в лечении пограничных ожогов.

Задачи исследования

1. Провести сопоставление клинического течения и цитологической картины ожоговых ран Ша степени в процессе их лечения с использованием трансплантации аллогенных диплоидных фибробластов различной степени зрелости.

2. Изучить отдаленные результаты лечения ожогов Ша степени с использованием трансплантации аллогенных эмбриональных и взрослых фибробластов.

3. Провести сравнительный анализ временных и материальных затрат на получение культур человеческих эмбриональных и взрослых фибробластов для трансплантации.

Научная новизна исследования

1. Впервые изучена эффективность клинического применения аллогенных фибробластов различной степени зрелости в сравнительном аспекте у больных с пограничными ожогами.

2. Впервые изучены отдаленные результаты использования фибробластов в комплексном лечении ожоговой травмы.

3. Впервые проведена сравнительная оценка временных и материальных затрат на получение готовой для клинического использования культуры фибробластов различной степени зрелости.

4. Впервые для получения и выращивания эмбриональных фибробластов произведена полная замена эмбриональной телячьей сыворотки на сыворотку крупного рогатого скота.

Практическая значимость

1. Полученные в ходе исследования данные позволили оптимизировать методику лечения больных с ожогами с использованием трансплантации АлДФ, что привело к сокращению длительности стационарного лечения, улучшению косметических и социально-психологических последствий ожоговой травмы.

2. Определена экономическая целесообразность использования каждого из типов аллогенных диплоидных фибробластов.

Положения, выносимые на защиту

1. Аллогенные диплоидные фибробласты различной степени зрелости одинаково эффективны в лечении пограничных ожогов.

2. Трансплантация аллогенных диплоидных фибробластов на ожоговые раны Illa степени способствует профилактике формирования гипертрофических рубцов.

3. Применение эмбриональных фибробластов экономически более целесообразно, чем взрослых кожных фибробластов.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы внедрены в практическую деятельность ожоговых отделений Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, Курской областной клинической больницы и в учебный процесс на медицинском факультете Белгородского государственного университета.

Апробация диссертации

Работа апробирована на совместном заседании кафедр хирургических болезней №1, хирургических болезней №2, хирургических болезней ФПО, оперативной хирургии и топографической анатомии им. профессора А.Д.Мясникова ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Росздрава», кафедры хирургических болезней №2 медицинского факультета ГОУ ВПО «Белгородский государственный университет» (сентябрь 2010 г.). Результаты работы доложены на II Съезде комбустиологов России (Москва, 2-5 июня 2008 г.), втором Всероссийском симпозиуме с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты клеточной терапии. Теория и практика клеточных биотехнологий» (Россия, Самара 28-30 июня 2004 г.), международной научно-практической конференция молодых ученых «Новые технологии в неотложной хирургии и восстановительной медицине» (Украина, Ялта, 12-15 октября 2008 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 1 - в рецензируемых изданиях ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 97 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 15 рисунками. Библиографический указатель включает 189 источников, из них 81 отечественных и 108 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы экспериментальных исследований

Характеристика клинических групп. Настоящая работа основана на анализе результатов лечения 90 ожоговых ран Illa степени у 30 больных, находившихся на стационарном лечении в ожоговом отделении Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа по поводу ожогов различной площади и локализации. Возраст больных составил от 20 до 67 лет, в среднем (M±tm) - 39,43±4,94 года. Мужчин было 24 (80%), женщин - 6 (20%). Площадь ожогов составляла от 2% до 18% поверхности тела. Следует отметить, что 19 ран (21,1%) Illa степени располагались в функционально активных и косметически важных зонах: шее, молочных желёз, кистях, локтевых и голеностопных суставов, стоп. Обследование и комплексное лечение пациентов соответствовало стандарту ведения данной категории больных.

Метод получения аллогенных фибробластов и га применения. Доноров биологического материала и, в случае эмбрионального источника, саму ткань тестировали бактериологическим, вирусологическим, серологическим и ПЦР методами на возбудителей трансмиссивных инфекций.

Эмбриональные и взрослые кожные фибробласты получали из фрагментов ткани 5*5 мм путем механической дезинтеграции и последующего выращивания на среде MEM с 10% сыворотки эмбрионов коров (ЭТС). Выращивание клеток осуществляли в центре иммунотерапии и клеточной трансплантации ГМУ «Курская областная клиническая больница» (автор выражает благодарность руководителю центра Ю.Е.Бурде и сотрудникам). Концентрированную суспензию КАФ доставляли в транспортной среде, в гипотермических условиях в ожоговое отделение ГУЗ «БОКБ Святителя Иоасафа». Для непосредственного использования культуру фибробластов отмывали и разводили стерильным физиологическим раствором до концентрации 1х105 клеток/мл с добавлением 2% донорской сыворотки крови АВ (IV) группы и амикацина в концентрации 40 мкг/мл. На контрольные участки ран использовался физиологический раствор, содержащий амикацин и донорскую сыворотку крови АВ (IV) группы в тех же концентрациях.

Препараты наносили на отдельные участки ран у одного и того же пациента в виде пропитанных стерильных марлевых салфеток с ежедневной их сменой. В течение суток до следующей перевязки салфетки через каждые 4 часа орошали соответствующим препаратом для предотвращения их высыхания. Контрольные и исследуемые участки ран были расположены на теле одного и того же пациента, что позволило исключить возможное влияние на результаты исследования внешних и внутренних дополнительных факторов, требующих рандомизации пациентов. Площадь контрольных и исследуемых участков была сопоставима.

Методы исследования и оценки результатов. Для объективной оценки и сравнительной характеристики эффективности применения различных методов лечения пограничных ожогов Ilia степени были проведены клинические, цитологические и морфологические исследования ран.

Цитологическое исследование ран проводили, используя препараты-отпечатки с поверхности ран по методике, предложенной М.П.Покровским в модификации О.С.Сергель (1990). Мазки-отпечатки с поверхности ран получали непосредственно перед трансплантацией КАФ, на следующие сутки, а в последующем - на 3, 5, 7, 9,11 и 14-е сутки с момента первой трансплантации КАФ. Общее заключение по цитограммам выражали в виде определения типа цитограмм по М.Ф.Камаеву (1970) в модификации О.С.Сергель (1990). При этом различали следующие типы цитограммы: некротический, дегенеративно-воспалительный, воспалительный, воспалительно-регенераторный,

регенераторный. Количество присутствующих в мазках - отпечатках клеток выражали в процентах, кроме популяций, склонных к колониальному росту или агрегации, поэтому не поддающихся руганному подсчету (молодые клетки плоского эпителия, эндотелиальные клетки, фибробласты). Для оценки их количества использовалась балльная система (рацпредложение № 1933-10 от б

20.09.2010 г.): 0 баллов - нет клеток, 1 балл - единичные в иоле зрения, 2 балла - множественные в поле зрения, 3 балла - скопления клеток.

Цитологическое исследование раневых отпечатков проведено в цитологическом отделе клинической лаборатории Курской областной клинической больницы и Курском областном патологоанатомическом бюро (автор выражает благодарность врачу-цитологу Поповой Л.П. и врачу морфологу Бондареву В.П.). Исследуемый материал доставляли в виде высушенных при комнатной температуре и фиксированных в течении 1 минуты ацетоном мазков-отпечатков на предметных стеклах. В лаборатории мазки-отпечатки окрашивали по стандартной методике гематоксилином и эозином и производили подсчет клеток в световом микроскопе.

Гистологическое и морфометрическое исследование. Через 12 мес. после получения ожоговой травмы под местной инфильтрационной анестезией 0,5% раствором новокаина на контрольном и исследуемых участках скальпелем иссекали три полнослойных фрагмента рубца до подкожной клетчатки размером 3><5 мм. Иссеченные фрагменты ткани помещали в 10% раствор формалина в отдельный флакон каждый, маркировали и передавали в патологоанатомическое отделение, где готовили парафиновые блоки и срезы по стандартной методике (Семченко В.В., 2003). Морфометрию окрашенных по методу Ван-Гизона (Семченко В.В., 2003) срезов осуществляли в световом микроскопе с использованием морфометрической сетки при общем увеличении *40 (Автандилов Г.Г., 1990) (автор выражает благодарность врачам-патологоанатомам Бондареву В.П. и Нагорному В.А.).

Клиническая оценка результатов лечения. Клиническую оценку результатов лечения пограничных ожогов Illa степени проводили по срокам их заживления с начала специализированного лечения, как при трансплантации КАФ, так и при традиционном методе. С этой целью была введена бальная система оценки по клиническим симптомам, отраженным в карте индивидуального наблюдения (рационализаторское предложение № 193-09 от 05.12.09):

1. Выраженность экссудации: обильно пропитывает повязки и постель - 3 балла, умеренно пропитывает повязки - 2 балла, слабо пропитывает - 1 балл, нет - 0.

2. Характер экссудации: серозно-гнойная - 2 балла, серозная - 1 балл, нет

-0.

3. Выраженность островковой эпителизации: нет - 0, единичные - 1 балл, множественные, сливные - 2 балла.

Также производилась оценка размера раны с помощью палетки с размером ячейки 1 х 1см и срока окончательной эпителизации.

Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с использованием параметрического и непараметрического вариантов дисперсионного анализа повторных измерений и методов множественных сравнений. За уровень значимости различий принят р<0,05.

Сравнительная оценка экономических затрат. Поскольку при получении фибробластов из эмбриональных и взрослых тканей различия заключались лишь в используемых культуральных средах и сыворотках, для сравнительной оценки экономической эффективности применения каждого из источников АлДФ из стандартной формулы (Кадыров Ф.Н., 2001) были исключены все пункты, кроме себестоимости расходного материала.

Результаты собственных исследований

Результаты цитологических исследований.

С целью получения объективной информации для оценки типов цитограмм проведено динамическое наблюдение за течением раневого процесса на контрольных и исследуемых участках на основании картины в мазках-отпечатках.

Из представленных на рисунке 1 данных видно, что, начиная с 5-х суток, имело место статистически значимое уменьшение нейтрофильной реакции на исследуемых участках ран, которое сохранялось вплоть до окончания сроков наблюдения. Как известно (В.В.Серов, В.С.Пауков, 1995), именно данный тип клеток отражает острую воспалительную реакцию, причем не только обусловленную микробным фактором, но и наличием асептического некроза, в частности, при ожоговой травме в раннем периоде. Указанное провоспалительное влияние некротических тканей реализуется через способность индуцировать продукцию нейтрофил-специфического хемотаксического фактора КС и М1Р-2 фибробластами и макрофагами через То11-2-рецептор/ЫРкВ путь (М. П е1 а!., 2001). По-видимому, аллогенные фибробласты наряду с их способностью подавлять продукцию ТОТ-а и 1 р (Ю.Е.Бурда, 2003) оказывают регулирующие влияние и на указанный механизм.

Примечание. Здесь и далее: * - р<0,05 по сравнению с контролем, в - воспалительный тип цитограммы, в-р - воспалительно-регенераторный тип цитограммы, р - регенераторный тип цитограммы.

Рис. 1. Динамика числа нейтрофилов в мазках-отпечатках с поверхности ран.

Дни наблюдения

Рис. 2. Динамика числа лимфоцитов в мазках-отпечатках с поверхности ран.

Количество лимфоцитов на контрольных и исследуемых участках ран (рис. 2) вплоть до 11-х суток не различалось и лишь в конце срока наблюдения достигло статистической значимости за счет того, что к этому сроку практически все не зажившие исследуемые участки характеризовались регенераторным типом цитологической картины.

Дни наблюдения

Рис. 3. Динамика числа макрофагов в мазках-отпечатках с поверхности ран.

Динамика количества макрофагов и полибластов (многоядерных макрофагов, похожих на гигантские клетки инородных тел) в ранах (рис. 3 и 4) по срокам имеет четко выраженную обратную корреляцию с динамикой числа нейтрофилов и отражает процесс очищения ран от некротических тканей, который достоверно превалировал на исследуемых участках по сравнению с контролем на 5-9 сутки наблюдения. Указанный феномен можно объяснить известной способностью фибробластов продуцировать значительные количества М-КСФ и ГМ-КСФ, стимулирующих созревание и накопление макрофагов в зоне действия этих факторов (Xing Z. et al., 1992). Кроме того, хемотаксические свойства в отношении моноцитов, являющихся предшественниками макрофагов, проявляют продуцируемые фибробластами ростовые факторы PDGF, FGF и TGF-p (Kelley's Textbook of Rheumatology, 2001).

Рис. 4. Динамика числа полибластов в мазках-огпечатках с поверхности ран.

Обобщая представленные на рис. 1-4 данные, можно заметить, что вначале исследования большинство ран характеризуется воспалительным типом цитограмм. Статистически значимое различие в цитологической картине между контролем и исследуемыми зонами отмечается уже с 5-х суток, когда на исследуемых участках происходит ее переход в воспалительно-регенераторный тип, в то время как на контрольных участках сохраняется воспалительный тип до 7-х суток. Регенераторный тип цитограммы на исследуемых участках наблюдается с 9-11-х суток, а в контроле - с 11-14-х.

Дии наблюдения

Рис. 5. Динамика числа фибробластов в мазках-отпечатках с поверхности ран.

Из рисунка 5 видно, что количество фибробластов в исследуемых ранах уже с 5-го дня значимо превосходит контрольные участки, что можно было бы объяснить наличием в отпечатках аллогенных клеток. Однако реципрокные изменения цитологической картины к 11 суткам позволяют предположить преимущественно аутологичное происхождение фибробластов, по-видимому, связанное с продукцией трансплантированными клетками хемоатграктантов и ростовых факторов, действующих паракринно (Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., 2008; Price R.D. et al., 2004; W.Lu, Y.J.Zhang, Y.Jin, 2009).

Рис. 6. Динамика числа клеток эндотелия в мазках-отпечатках с поверхности ран.

Представленные на рис. 6 данные характеризуют стимулирующее влияние трансплантированных АлДФ на формирование грануляционной ткани, что является обязательным этапом в процессе заживления раны, затрагивающей сетчатый слой эпидермиса (Ы.Ь.Рате^еаи е1 а1., 2007). При пограничных же ожогах поражение дермы ограничено преимущественно сосочковым слоем, поэтому данный феномен не оказывает стимулирующего влияния на степень выраженности рубцовых изменений в ожоговой ране, что в дальнейшем нашло подтверждение при изучении отдаленных результатов лечения.

Приведенные на рис. 7 данные свидетельствуют о стимулирующем воздействии аллофибробластов на эпителизацию ран, причем уже с 7-х суток отмечается достоверная разница в этом процессе между контрольным и исследуемыми участками ожоговых ран, что полностью согласуется с клиническим течением раневого процесса.

Таким образом, как эмбриональные, так и взрослые фибробласты оказывают позитивное влияние на цитологическую картину ожоговой раны, что отражается в более быстрой смене воспалительного типа цитограммы на регенераторный. При этом достоверного отличия между эффективностью аллогенных фибробластов различной степени зрелости не отмечено.

Дни наблюдения

Рис. 7. Динамика числа молодых клеток эпителия в мазках-отпечатках с поверхности ран.

Результаты клинических исследований.

На рис. 8 представлены данные по динамике изменения размеров ран в процессе лечения. Как видно из графика, при общей сопоставимости размеров ожоговой раны на контрольном и исследуемых участках вначале, уже начиная с 7 суток на участках применения аллофибробластов отмечается уменьшение площади остаточной раны по сравнению с контролем, достигая статистически значимых различий к 9 суткам. Различия в воздействии на данный показатель эмбриональных и взрослых фибробластов не отмечено.

Рис. 8. Динамика сокращения площади ожоговых ран.

На рис. № 9-10 отражена динамика выраженности и характера экссудации.

3

2,5 2

3

§ 1,5

я ю

1

0,5 0

Ш

№

Л-

ш

3 5 7 9 Дни наблюдения

О Контроль и эф ивф

Примечание. Здесь и далее; * -р<0,05 между контрольным и исследуемым участком, -р<0,05 между ЭФ и ВФ

Рис. 9. Динамика выраженности экссудации.

Достоверное уменьшение экссудативного компонента на исследуемых участках, начиная с 5-х суток наблюдения, четко перекликается с изменением цитологической картины ран, в частности, уменьшением числа нейтрофилов (рис. 1) и увеличением количества макрофагов и полибластов (рис. 3 и 4).

Дни наблюдения

Рис. 10. Динамика характера экссудации.

Хотя различия в выраженности экссудации со стороны исследуемых участков по сравнению с контролем достигали статистической значимости уже к 5-м суткам (рис. 9), изменение характера экссудативного компонента на 5-7 дни наблюдения выражалось лишь в виде тенденции к купированию гнойного компонента воспаления - снижение оценки до 1 балла и ниже (рис. 10). Достоверная разница в характере экссудации отмечена на 9 сутки и сохранялась в дальнейшем. Указанное отсроченное влияние на данный исследуемый показатель можно объяснить тем обстоятельством, что пациентов с наиболее тяжелым, гнойным, воспалением в исследование не включали, а изменение серозно-гнойного экссудата на серозный растянуто во времени в условиях очищающихся от некротических тканей ран.

Дни наблнцения

Рис. 11. Выраженность островковой эпителизации ожоговых ран.

Появление островковой эпителизации в ранах на участках применения аллофибробластов отмечено уже с 3-го дня наблюдений, в то время как на контрольных участках - лишь на 5-й. При этом достоверная разница в

выраженности данного процесса между исследуемыми и контрольными участками сохранялась вплоть до 14-го дня.

Рис. 12. Сроки полной эпителизации ран.

Выявлено статистически значимое различие и в сроке полной эпителизации исследуемых и контрольных участков ран. В случае использования ЭФ он составил в среднем 12,27±0,97 суток, ВФ - 12,63±1,04, а в контроле - 18,43±1,31 суток. Ни по одному из вышеуказанных клинических критериев не отмечалось статистически значимого различия в действии ЭФ и ВФ, т.е. как эмбриональные, так и взрослые аллофибробласты одинаково эффективно улучшали клинические показатели течения раневого процесса при пограничных ожогах, достоверно сокращая сроки заживления ран по сравнению со стандартным лечением.

Наиболее значимыми показателями для оценки отдаленных результатов лечения с использованием ЭФ и ВФ представляются выраженность Рубцовых изменений. Из 30 пролеченных пациентов у 2 человек через 6 мес. отмечено формирование гипертрофического рубца на контрольных участках, в то время, как на исследуемых участках рубцовые изменения носили нормотрофический характер. У 5 участников исследования с нормотрофическими рубцами, давших добровольное согласие, через 1 год после эпителизации ран была произведена эксцизионная биопсия участков в контрольной и исследуемых зонах (15 ран) с последующим морфометрическим анализом (табл. 1).

Таблица 1

Пациенты Контроль ЭФ ВФ

1 3,8 2 2,1

2 3,2 1,9 1,8

3 3,6 2,5 2,4

4 3,0 1,7 1,9

5 3,7 2,2 2,0

М=Ит 3,46±0,30 2,06±0,27* 2,04±0,20*

Представленные показатели демонстрируют статистически значимое

различие в толщине сформировавшегося рубца на контрольных и исследуемых участках. При этом различий в зонах применения ЭФ и ВФ вновь не выявлено.

Таким образом, использование как эмбриональных, так и взрослых аллогенных фибробластов улучшает отдаленные результаты лечения пограничных ожогов, предотвращая формирование гипертрофических рубцов и, в целом, способствуя менее выраженным Рубцовым изменениям.

Анализ временных и материальных затрат на получение культур человеческих эмбриональных и взрослых фибробластов для трансплантации.

Широкое внедрение трансплантации АлДФ в практику лечения ожоговой травмы сопряжено с необходимостью обеспечения экономической эффективности метода, которая включает как себестоимость расходного материала для получения клеточных культур, так и сроков, необходимых для наращивания достаточной клеточной массы. С этой целью было проведено исследование сроков получения монослойной культуры фибробластов различной степени зрелости из одинакового объема донорской ткани на стандартном протоколе. ЭФ в среднем формировали монослой через 5,00±0,41 суток, а ВФ - через 28,70±1,89 суток, т.е. начальные ростовые свойства культуры эмбриональных фибробластов примерно в 5,74 раза превосходят взрослые кожные фибробласты (р<0,05).

Была предпринята попытка оптимизировать протокол получения ЭФ за счет сокращения объема наиболее дорогостоящего компонента - ЭТС и замены ее на сыворотку крупного рогатого скота (СКРС). Сроки формирования монослойной культуры ЭФ на различных объемах сыворотки представлены в табл. 2. Как видно из таблицы, уменьшение концентрации сыворотки в культуральной среде является критичным для деления фибробластов, но ее источник не имеет принципиального значения, что позволило заменить дорогостоящую сыворотку эмбрионов коров на значительно более дешевую сыворотку взрослых особей рогатого скота.

Таблица 2

Сроки формирования монослойной культуры эмбриональных фибробластов при условии модификации стандартного протокола (в сутках) _

Л» линии ЭФ Стандар Т11ЫН 7% ЭТС 5% ЭТС 2% ЭТС 10% ЭТС: 10% СКРС 10% СКРС 5% СКРС

1 5 12 24 нет 5 5 нет

2 4 15 нет нет 4 4 нет

3 5 19 32 нет 5 5 нет

4 5 19 нет нет 5 5 нет

5 5 17 21 нет 5 6 нет

6 6 нет нет нет 5 6 нет

7 5 19 25 нет 5 5 нет

8 5 14 23 нет 4 5 нет

9 6 21 нет нет 6 7 нет

10 4 21 нет нет 4 5 нет

М =ат 5,00 17,44 25,00 4,80 5,30

±0,41 ±2,07* ±3,67* ±0,39 ±0,51

Примечание. ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка, % в культуральной среде, СКРС - сыворотка крупного рогатого скота, % а культуральной среде.

С другой стороны, была предпринята попытка модификации протокола получения взрослых кожных фибробластов с целью: 1) ускорить срок формирования монослойной культуры; 2) сократить себестоимость получения культуры клеток. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Сроки формирования монослойной культуры взрослых фибробластов при условии модификации стандартного протокола

№ линии ВФ Стандар тный 7% ЭТС 15% ЭТС 20%ЭТС 30% ЭТС 10% ЭТС: 10% СКРС 10% СКРС

1 26 нет 23 21 29 24 нет

2 23 нет 19 1S 22 24 нет

3 28 нет 26 23 нет 28 нет

4 29 нет 24 22 29 29 нет

5 30 нет 30 24 41 29 нет

6 32 нет 32 24 27 27 нет

7 34 нет 27 27 33 33 нет

8 29 нет 29 25 24 31 нет

9 27 нет 24 23 23 28 нет

10 29 нет 29 23 36 29 нет

M±tm 28,70 ±1,89 - 26,30 ±2,41 23,00 ±1,49* 29,33 ±4,14 28,22 ±1,93 -

Как видно из представленных данных, увеличение содержания ЭТС в культуральной среде способствует сокращению сроков формирования монослойной культуры, но лишь до определенных пределов (20%). В то же время, в отличие от ЭФ, попытка заменить ЭТС частично или полностью на СКРС ведет к прекращению деления ВФ.

На заключительном этапе данного исследования представлялось необходимым провести сравнительный анализ длительности сохранения культурами способности к пролиферации в условиях пассирования in vitro на различных вариантах культуральной среды. Для пассирования использовали стандартную концентрацию 10s клеток/мл среды, 15 мл которой вносили в культуральный флакон с площадью дна 25 см2. Дальнейшее культивирование проводили в условиях влажной атмосферы с 5% С02 при 37"С. Результаты представлены в табл. 4 и 5.

Таблица 4

Срок формирования моиослойиой культуры в процессе пассирования и

длительность пролиферации in vitro эмбриональных фибробластов

№ линии ЭФ 10% СКРС 5% СКРС

Срок формирования монослоя Кол-во пассажей Срок формирования монослоя Кол-во пассажей

1 2 50 7 2

2 2 51 10 2

3 2 51 12 1

4 3 48 12 1

5 2 64 12 2

6 2 59 нет нет

7 3 49 13 1

8 3 46 9 3

9 2 49 нет нет

10 2 53 нет нет

M ± tm 230±0,30 52,00±3,39 10,71±1,58* 1,71±0,56*

Таблица 5

Срок формирования моиослойиой культуры в процессе пассирования и длительность пролиферации in vitro взрослых фибробластов

я s е ч ш « Стандартный 20%ЭТС 10%ЭТС: 10%СКРС 10% СКРС

День формир. монослоя Кол-во пассажей День формир. монослоя Кол-во пассажей День формир. монослоя Кол-во пассажей День формир. монослоя Кол-во пассажей

1 3 45 2 43 3 12 3 3

2 3 49 2 48 3 18 4 7

3 2 52 2 49 2 16 4 10

4 3 53 2 51 3 16 5 5

5 3 49 2 51 3 13 3 3

6 2 49 2 50 3 9 3 3

7 4 50 2 51 4 14 3 6

8 3 52 3 52 3 20 6 9

9 2 51 2 45 2 17 3 11

10 2 52 2 50 2 17 3 6

М± tm 2,70 ±0,42 50,20 ±1,46 2,10 ±0,20 49,00 ±1,80 2,80 ±0,39 15,20 ±2,00* 3,70 ±0,66 6,30 ±1,83*

Как видно из таблиц, уменьшение концентрации сыворотки ниже 10% способствует прекращению размножения клеток в культуре. При этом для взрослых фибробластов остается критичным эмбриональное происхождение сыворотки. Следовательно, оптимальной для поддержания жизнеспособности при длительном пассировании ЭФ следует признать среду с содержанием 10%

СКРС, а для ВФ - 10% ЭТС.

Исходя из полученных данных, представлялось интересным определить себестоимость получения равного количества эмбриональных и взрослых фибробластов и последующего поддержания жизнеспособности линии в культуре. Для определения стоимости культурапьных сред была рассчитана средняя стоимость каждого из компонентов на основании прайс-листов 2007 г. двух российских дистрибьюторов реактивов и расходного материала для культур клеток, предлагающих полный спектр продукции: ПанЭко (Москва), БиолоТ (Санкт-Петербург). Данные представлены в табл. 6,

Таблица 6

Стоимость основных компонентов для выращивания человеческих

фибробластов.

Наименование компонента ПанЭко БиолоТ Средняя цена

Питательная среда Игла MEM жвдкая, с L-глутамином, стерильная, (HyClone), 450 мл 126,5 130 128,25

Сыворотка крови эмбриональная телячья 500 мл (HyClone) 3068 4200 3634

Сыворотка крови крупного рогатого скота, 400 мл 389,4 399 394,2

Раствор трипсина-версена, 0,05%, 200 мл 64,9 105 84,95

В соответствии с представленными показателями стоимость 1 л оптимальной среды для получения ЭФ составила: 128,25x2+394,2/4 = 355,05 руб., а для ВФ: 128,25x2+3634x0,4 = 1710,1, для поддержания ВФ: 128,25x2+3634/5 = 983,3 руб.

С целью получения монослойной культуры из первичного материала необходимо дважды в неделю производить замену половины культуральной среды во флаконе с культурой на свежую с целью поддержания оптимальной концентрации необходимых для жизнедеятельности и размножения клеток веществ (РгевЬпеу Я., 2000). Общий объем среды во флаконе с площадью дна 25 см2 составляет 15 мл. Учитывая срок формирования монослоя первичной культурой, для ЭФ необходимо было 15+(15/2х1) = 22,5 мл среды, а для ВФ -15+(15/2х6) = 60 мл среды, что составило, соответственно, 355,05 руб./1000х22,5=7,99 руб. и 1710,1/1000x60=102,61 руб.

Таким образом, получение первичной монослойной культуры ВФ в 12,8 раза дороже по себестоимости культуральной среды, чем ЭФ. Поскольку сроки формирования монослоя при последующем пассировании ЭФ и ВФ на оптимальных средах достоверно не отличаются, то себестоимость культуральной среды для поддержания жизнеспособности и размножения ЭФ

и ВФ для клинического использования отличается в 983,3/355,05=2,8 раза.

Исходя из представленных выше данных, при сопоставимой клинической эффективности, использование эмбриональных фибробластов оказывается значительно более целесообразным по экономическим показателям.

ВЫВОДЫ

1. Трансплантация культивированных аллогенных фибробластов различной степени зрелости на пограничные ожоги Illa степени, улучшает клинические показатели течения раневого процесса, достоверно сокращая сроки заживления ран по сравнению с традиционными методами лечения в среднем на 6 дней (р<0,05).

2. Трансплантированные аллогенные фибробласты оказывают позитивное влияние на цитологическую картину ожоговой раны, что выражается в смене воспалительного типа цитограммы на воспалительно-регенераторный на 2-3 суток быстрее, чем в контроле (р<0,05).

3. Применение взрослых аллогенных фибробластов обладает одинаковой клинической эффективностью и влиянием на цитологическую картину ожоговых ран Ша ст. по сравнению с эмбриональными фибробластами (р>0,05).

4. Местное применение аллогенных диплоидных фибробластов способствует формированию более тонкого рубца — в среднем 2,06 мм для эмбриональных фибробластов и 2,04 мм для взрослых фибробластов по сравнению с 3,46 мм в контроле (р<0,05).

5. Применение эмбриональных фибробластов целесообразнее экономически вследствие возможности использования более дешевой среды для получения их первичной культуры (в 12,8 раза, р<0,05) и дальнейшего выращивания (в 2,8 раза, р<0,05) по сравнению с взрослыми фибробластами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для уменьшения выраженности рубцовых изменений и предотвращения формирования гипертрофических рубцов целесообразно использовать в лечении пограничных ожогов Ша ст. трансплантацию аллогенных фибробластов.

2. При отсутствии собственной производственной базы для выращивания фибробластов, эффективно клиническое применение аллогенных фибробластов, транспортированных в гипотермических условиях (О - +4°С), в питательной среде с 20% сыворотки крупного рогатого скота.

3. Методика применения аллогенных фибробластов на ожоговые раны заключается в следующем: пропитанные суспензией клеток стерильные марлевые салфетки накладывают на раневые поверхности сразу после первичной хирургической обработки и в дальнейшем во время плановых перевязок ожоговых ран. Для предотвращения высыхания салфеток производят их орошение суспензией фибробластов каждые 4 часа.

4. С целью удешевления себестоимости получения и дальнейшего выращивания человеческих эмбриональных фибробластов возможна замена сыворотки эмбрионов коров на сыворотку крупного рогатого скота.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оригинальный способ профилактики лизиса кожного трансплантата у ожоговых больных // Матер. 2 Всероссийского симпозиума с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии. Теория и практика клеточных биотехнологий» (Россия, Самара, 28-30 июня 2004 г.). - Самара. - 2004. - С. 164-165 (соавт. С. М. Шевченко, Ю. Е. Бурда, С. Н. Нестеренко, И. Ю. Леонова, В. А. Лазаренко, С. В. Сокольникова, Д. В. Ершов).

2. Новый подход к изучению функциональных свойств фибробластов Матер.2 Всероссийского симпозиума с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии. Теория и практика клеточных биотехнологий» (Россия, Самара, 28-30 июня 2004 г.). -Самара. - 2004. - С. 166-167 (соавт. С. М. Шевченко, Ю. Е. Бурда, С. Н. Нестеренко, И. Ю. Леонова, Д. В. Ершов, В. А. Лазаренко, С. В. Сокольникова, А. И. Конопля).

3. Влияние супернатантов аллогенных диплоидных фибробластов различной степени зрелости на пролиферативную активность мононуклеарных иммуноцитов т уйго.//Универсальная наука: взгляд в будущее. Сб. трудов юбил. научн. конф. КГМУ. - 2005. - Т.1. - С. 115-116

(соавт. В. А. Лазаренко, Ю. Е. Бурда, А. И. Красноухов, С. М. Шевченко, Д. В. Ершов, С. В. Сокольникова, С. Н. Нестеренко, И. Ю. Леонова).

4. Сравнительная характеристика экономической эффективности применения эмбриональных и зрелых фибробластов. // 2 съезд комбустиологов России: сборник научных трудов (Россия, Москва, 2-5 июня 2008г.) - Москва. - 2008. - С. 218-219 (соавт. Ю. Е. Бурда, И. Ю. Леонова, В. В. Коробов, С. Н. Нестеренко).

5. Сравнительный анализ клинической эффективности применения аллогенных диплоидных фибробластов различной степени зрелости в лечении пограничных ожогов. // 2 съезд комбустиологов России: сборник научных трудов (Россия, Москва, 2-5 июня 2008г.) - Москва. - 2008. - С. 232233 (соавт. Ю. Е. Бурда, В. А. Лазаренко).

6. Динамика изменения клеточного состава ожоговых ран в процессе их лечения аллогенными фибробластами различной степени зрелости и традиционными методами. // 2 съезд комбустиологов России: сборник научных трудов (Россия, Москва, 2-5 июня 2008г.) - Москва. - 2008. - С. 233234 (соавт. Л. П. Попова, Ю. Е. Бурда, В. П. Бондарев).

7. Анализ экономической эффективности получения аллогенных диплоидных фибробластов различной степени зрелости. // Вестник неотложной и восстановительной медицины. - Т.9, №3, 2008. - С.426-427 (соавт. Ю. Е. Бурда, И. Ю. Леонова, В. В. Коробов, С. Н. Нестеренко).

8. Влияние трансплантации аллогенных диплоидных фибробластов различной степени зрелости и традиционных методов лечения на динамику изменения клеточного состава ожоговых ран. // Вестник неотложной и восстановительной медицины. - Т. 9, №3, 2008. - С.442-443 (соавт. Попова Л.П., Бурда Ю.Е., Красноухов А.И., Бондарев В.П..).

9. Динамика изменения клеточного состава ожоговых ран в процессе их лечения аллогенными диплоидными фибробластами различной степени зрелости и традиционными методами.// ISSN 1811-3559, Медицинские науки №5(29) -2008. С.33-37 (соавт. Попова Л.П, Бурда Ю.Е, Бондарев В.П..)

10. Анализ клинической эффективности применения эмбриональных и зрелых аллогенных диплоидных фибробластов в лечении пограничных ожогов. // Успехи современного естествознания. - 2008, №9. - С.92-94 (соавт. Бурда Ю.Е., Лазаренко В.А.).

11. Сравнительный экономический анализ получения первичной культуры фибробластов различной степени зрелости для лечения ожогов

// Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». -Курск, 2010. - №1. - С.111-116 (соавт. Лазаренко В.А., Бурда Ю.Е.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

АлДФ - аллогенные диплоидные фибробласты

ОБ - ожоговая болезнь

ВФ - взрослые фибробласты

КАФ - культивированные аллогенные фибробласты

СКРС - сыворотка крупного рогатого скота

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

ЭФ - эмбриональные фибробласты

Издательская лицензия J1P № 070251 от 14.04.99.

Сдано в набор 18.01.2011. Подписано в печать 19.01.2011.

Формат 30 х 42 1/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Ризография. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 3574.

ООО «Везелица» г. Белгород, ул. Садовая, 92

Актуальность темы.

Проблема ожоговой травмы остается одной из самых серьезных как в медицинском, так и в экономическом и социальном аспектах. Данному виду поражений подвержены все возрастные категории, часто оно носит профессиональный характер, сопряжено с высокой летальностью и инвалидностью.

По данным отечественных авторов, общая летальность от ожогов в целом по России колеблется от 2,3% до 3,6% [2, 3], сразу после выписки из стационара инвалидами было признано 6,9% больных по отношению ко всем лечившимся [63]. Среди инвалидов. 82% составляли лица трудоспособного возраста.

Традиционный хирургический подход к лечению этой категории больных, по-прежнему являясь основным,-тем не менее, практически исчерпал резервы для своего дальнейшего развития [62]. В связи с этим, в поисках возможностей совершенствования терапии» и повышения ее клинической эффективности, на сегодняшний день на первое место выходят методы консервативного лечения, разработка «идеальных» раневых покрытий и методы биотехнологии, связанные с выращиванием in vitro отдельных культур клеток кожи или созданием живых кожных эквивалентов [48, 51, 145, 160]. К последнему направлению относится трансплантация аллогенных диплоидых фибробластов (АлДФ) на ожоговые раны, используемая как самостоятельный метод, так и как способ; подготовки ран к аутодермопластике [5, 11, 182]. Наибольшее развитие трансплантация АлДФ нашла в лечении пограничных и глубоких ожогов.

В настоящий момент клиническая эффективность трансплантации АлДФ, благодаря проведенным исследованиям [21, 62, 91], уже не вызывает сомнения. Разработаны различные подходы к тактике применения данного метода в лечении ожоговой травмы [6, 18]. Однако в различных медицинских учреждениях используют АлДФ различной степени зрелости, полученные как из эмбриональных тканей [32, 64], так и из кожи взрослых доноров [62, 5

68, 72]. И в том и другом случае описываемая эффективность их трансплантации сопоставима, но фибробласты различной степени зрелости отличаются по функциональным свойствам, требуют дифференцированных подходов к культивированию, а, следовательно, могут значительно отличаться по экономической эффективности. Поэтому представлялось целесообразным провести сравнительный анализ затрат на получение готовых к трансплантации культур из эмбриональных и взрослых тканей.

Пограничные ожоги, или ожоги Illa степени, несмотря на способность к самостоятельной эпителизации за счет сохранившихся клеточных элементов дериватов кожи, часто сопровождаются формированием грубых рубцов, в том числе гипертрофических и келоидных, что представляет не только косметическую проблему, но и формирует различные контрактуры, требующие в дальнейшем выполнения многих реконструктивно-восстановительных и пластических операций. [4, 48, 71]. Однако, несмотря на длительный период использования трансплантации фибробластов в лечении ожогов, работ, посвященных изучению катамнеза данной патологии у этой группы пациентов, в доступной литературе нами встречено не было. Цель исследования

В связи с вышесказанным, целью работы- является сравнительное изучение клинической эффективности и экономических затрат при трансплантации эмбриональных и взрослых человеческих фибробластов в лечении пограничных ожогов. Задачи исследования

1. Провести сопоставление клинического течения и цитологической картины ожоговых ран Illa степени в процессе их лечения с использованием трансплантации аллогенных диплоидных фибробластов различной степени зрелости.

2. Изучить отдаленные результаты лечения ожогов Illa степени с использованием трансплантации аллогенных эмбриональных и взрослых фибробластов.

3. Провести сравнительный анализ временных и материальных затрат на получение культур человеческих эмбриональных и взрослых фибробластов для трансплантации. Научная новизна исследования.

Впервые изучена эффективность клинического применения аллогенных фибробластов различной степени зрелости в сравнительном аспекте у больных с пограничными ожогами.

Впервые изучены отдаленные результаты использования фибробластов в комплексном лечении ожоговой травмы.

Впервые проведена сравнительная оценка временных и материальных затрат на получение готовой для клинического использования культуры фибробластов различной степени зрелости.

Впервые для получения и выращивания эмбриональных фибробластов произведена полная замена эмбриональной телячьей сыворотки на сыворотку крупного рогатого скота.

Практическая значимость

Полученные в ходе исследования данные позволили; оптимизировать методику лечения больных с ожогами с использованием трансплантации АлДФ, что привело : к сокращению длительности: стационарного лечения, улучшению косметических т социально-психологических последствий ожоговой, травмы. Определена экономическая целесообразность использования каждого из типов АлДФ. Положения выносимые на защиту

1. Аллогенные диплоидные фибробласты различной степени зрелости одинаково эффективны в лечении пограничных ожогов.

2. Трансплантация аллогенных диплоидных фибробластов на ожоговые раны Illa степени способствует профилактике формирования гипертрофических рубцов.

3. Применение эмбриональных фибробластов экономически более целесообразно, чем взрослых кожных фибробластов.

Внедрение.

Результаты работы внедрены в практическую деятельность ожоговых отделений Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа, Курской областной клинической больницы и в учебный процесс на медицинском факультете Белгородского государственного университета.

Апробация работы.

Результаты работы доложены на совместном заседании кафедр хирургических болезней №1, хирургических болезней №2, хирургических болезней ФПО, оперативной хирургии и топографической- анатомии им. профессора А.Д. Мясникова ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Росздрава», кафедры хирургических болезней №2' медицинского факультета ГОУ ВПО «Белгородский государственный университет», 2 Съезде комбустиологов России (Москва, 2-5 июня 20081 г.), втором, Всероссийском" симпозиуме с международным участием «Клинические и фундаментальные аспекты клеточной терапии. Теория, и практика клеточных биотехнологий» (Россия, Самара 28-30 июня 2004г.), международной научно-практической конференция молодых ученых «Новые технологии! в неотложной хирургии, и восстановительной медицине» (Украина, Ялта, 12-15 октября 2008 г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе в одном издании, определенном ВАК для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации.

Диссертация, изложена на 97 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов,. выводов, практических

выводы.

1. Трансплантация культивированных аллогенных фибробластов различной степени зрелости на пограничные ожоги Illa степени, улучшает клинические показатели течения раневого процесса, достоверно сокращая сроки заживления ран по сравнению с традиционными методами лечения в среднем на 6 дней (р<0,05).

2. Трансплантированные аллогенные фибробласты оказывают позитивное влияние на цитологическую картину ожоговой раны, что выражается в смене, воспалительного типа цитограммы на воспалительно-регенераторный на 2-3'суток быстрее, чем в контроле (р<0,05).

3.Применение взрослых аллогенных фибробластов обладает одинаковой клинической эффективностью и влиянием на цитологическую картину ожоговых ран Illa ст. по сравнению с эмбриональными фибробластами (р>0,05)1

4. Местное применение1 аллогенных диплоидных фибробластов способствует формированию более тонкого рубца - в среднем 2,06.мм для эмбриональных фибробластов., и 2,04 мм для взрослых фибробластов по сравнению^ 3,46 мм в контроле (р<0,05).

5. Применение эмбриональных фибробластов целесообразнее экономически вследствие возможности использования более дешевой среды для получения их первичной-культуры (в 12,8 раза, р<0,05) и дальнейшего выращивания (в 2,8 раза, р<0,05) по сравнению с взрослыми фибробластами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1.Для уменьшения выраженности Рубцовых изменений и предотвращения формирования гипертрофических рубцов целесообразно использовать в лечении пограничных ожогов Illa ст. трансплантацию аллогенных фибробластов.

2. При отсутствии собственной производственной базы, эффективно клиническое применение аллогенных фибробластов, транспортированных в гипотермических условиях (0 - +4°С), в питательной среде с 20% сыворотки крупного рогатого скота.

3.Методика применения аллогенных фибробластов на ожоговые раны заключается в следующем: пропитанные суспензией клеток стерильные марлевые салфетки накладывают на раневые поверхности сразу после первичной хирургической обработки и в дальнейшем во время плановых перевязок ожоговых ран. Для предотвращения высыхания салфеток производят их орошение суспензией фибробластов каждые 4 часа.

4. С целью удешевления себестоимости получения и дальнейшего выращивания человеческих эмбриональных фибробластов возможна замена сыворотки эмбрионов коров на сыворотку крупного рогатого скота.