Клинико-экспериментальное обоснование применения аллогенных фибробластов для лечения рубцов и атрофий кожи

Щеголев, Виталий Владимирович

Диссертации по медицине → Кожные и венерические болезни

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Клинико-экспериментальное обоснование применения аллогенных фибробластов для лечения рубцов и атрофий кожи

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Щеголев, Виталий Владимирович Санкт-Петербург 2009 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.11

Автореферат диссертации по медицине на тему Клинико-экспериментальное обоснование применения аллогенных фибробластов для лечения рубцов и атрофий кожи

На правах рукописи

ЩЕГОЛЕВ Виталий Владимирович

КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ АЛЛОГЕННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РУБЦОВ И АТРОФИЙ КОЖИ

14.00.11 - кожные и венерические болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саккт- Петербург - 2009

003467523

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» МО РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Озерская Ольга Сергеевна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Данилов Сергей Иванович доктор медицинских наук профессор Королькова Татьяна Николаевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П.Павл ова Росздрава».

Защита диссертации состоится 18 мая 2009 г. )Г_^_часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.01 при ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» МО РФ (194044, Санкт- Петербург, ул. Академика Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» МО РФ

Автореферат разослан «_»

.2009 года

Ученый секретарь совета доктор медицинских наук профессор ПОНОММ (колаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследоиания.

Кожа человека подвержена различным неблагоприятным воздействиям внешней среды и заболеваниям . Это приводит к нарушению трофики кожи, влекущее истончение ее слоев за счет уменьшения или исчезновения составляющих кожи - клеток и волокон, желез ,волосяных фолликулов с замещением их менее дифференцированной фиброзной тканью. Группу заболеваний, возникающих в результате нарушения питания кожи называют атрофиями кожи (Романенко И.М.,2007).

Атрофии кожи являются достаточно разнообразной по клинической картине, этиологии и патогенезу группе дерматозов. Приобретенные атрофии кожи могут быть следствием эндогенных или экзогенных факторов, таких как интоксикации, лучевые воздействия, голодание, тяжелые соматические заболевания, эндокринопатии, механическое давление, травмы, возрастные дегенеративные изменения и др.

Клинически атрофии кожи проявляются ее истончением, той или иной степенью выраженности сухости, выпадением волос, дистрофическими изменениями ногтевых пластинок, нарушением потоотделения и всех видов кожной чувствительности, снижением сосудистых реакций. Пораженная кожа имеет дряблый, морщинистый вид.

Отдельно стоит группа дистрофических состояний кожи, возникших после перенесенного дерматоза с деструктивным процессом в дерме -туберкулез кожи, глубокие микозы, глубокие пиодермии, васкулиты, склеродермия, саркоидоз и др. (Павлов С.Т. и др. 1975; Самцов A.B., Барбинов В.В., 2008). После излечения от вышеперечисленных дерматозов на коже у пациентов остаются рубцовые очаги атрофического, гапотрофического или нормотрофического вида (Озерская О.С., 2007). Подобные же изменения могут возникнуть на коже после перенесенных травм и различных оперативных вмешательств.

Патогистологически в коже при атрофиях обнаруживается уменьшение, а у некоторых пациентов и исчезновение клеточных и волокнистых элементов, межуточного вещества, придатков кожи с замещением их менее дифференцированной соединительной тканью.

Схожесть патогистологической картины многих видов атрофий диктует и сходное патогенетически обоснованное лечение, основанное на улучшении питания и трофики кожи. I! связи с этим, таким пациентам назначаются ангиопротекторы, средства специфической и неспецифической иммунотерапии; витамины С, А, Е, группы В; тепловые процедуры, органопрепараты (Скрипкин Ю.К. 2001). В процессе лечения клиническая картина очагов атрофии несколько улучшается, однако лечение не приносит пациентам желаемого удовлетворения. Лечение же сформировавшихся атрофических изменений вообще малоэффективно (Романенко И.М., 2007). ,

Тканевая терапия уже более 100 лет привлекает внимание ученых и врачей. Интерес к применению клеточных технологий в дерматокосметологии связан с тем, что клетки несут в себе мощный биоэнергетический и информационный потенциал, благодаря которому возможно получение качественно новых результатов лечения. Особый интерес у ученых вызывает основная клетка дермы - фибробласт. Комбустиологи уже не одно десятилетие применяют пересадку аутологичных и аллогенных фибробластов на ожоговые раны. Пересаженные на кожу клетки закрывают раневой дефект и стимулируют дерму, выделяемыми аутокинами (факторами роста, цитокинами, окисью азота и др.) (Туманов В.П. 1996; Хавинсон В.Х., Калинин В.В. 2002). Кроме того, они действует на собственные фибробласты, повышая их синтетическую и пролиферативную активность (Липшиц Р.У., Звягинцева Т.В. 1999; Эрнандес Е., 2001.). Фибробласты вырабатывают коллаген, эластин, ферменты, гликозаминогликаны, факторы роста и другие биологически активные молекулы. Новообразование сосудов, снятие гипоксии, улучшение трофики, утолщение дермы - вот морфологическая основа действия фибробластов на кожу ( Сухих Г.Т, Алиханова З.М. 2001; Камеей Т.Н.й а1. 1998). Биостимуляция и увеличение толщины дермы — желаемый результат лечения атрофии кожи. Таким образом, низкая эффективность существующих методов лечения атрофических заболеваний, приводит к необходимости поиска новых средств и методов, основанных на стимуляции дермы, синтетической и пролиферативной активности собственных фибробластов.

Цель исследования.

На основе экспериментальных цитоморфологических исследований изучить приживаемость имплантированных в дерму аллогенных фибробластов и научно обосновать методы комплексного лечения рубцов и атрофий кожи с помощью культуры аллогенных фибробластов.

Задачи исследования:

1. С помощью гистологических и цитоморфологических методов исследования изучить в эксперименте процесс выживания и сохранения жизнеспособности аллогенных фибробластов в коже крыс после их инокуляции в дерму.

2. Оценить эффективность применения трансплантации аллогенных фибробластов при коррекции рубцов кожи методом дермабразии.

3. Изучить эффективность мезотерапевтического введения культуры аллогенных фибробластов при лечении атрофических заболеваний кожи.

4. Провести сравнительный анализ эффективности использования культуры аллогенных фибробластов в терапии базалиом, стрий, возрастных изменений кожи, атрофических, гипотрофических, нормотрофических, гипертофических рубцов.

Научная новизна. В эксперименте установлено, что 39,9% аллогенных фибробластов, инокулированных в дерму крыс, сохраняет синтетическую и пролиферативную активность и улучшают трофику кожи.

Мезогерапевтическое введение суспензии живой культуры аллогенных фибробластов приводит к улучшению клинической картины очагов атрофии: увеличивает тургора кожи, выравнивает рельеф, уменьшает площадь очагов, снижает сухость кожи.

Выявлено, что введение суспензии аллогенных фибробластов в очага поражения кожи пациентов при гипотрофических, атрофических рубцах и атрофиях кожи усиливают регенерацию изучаемых заболеваний.

Установлено, что эффективность лечения рубцов и атрофии кожи выше при использовании культуры аллогенных фибробластов чем традиционной терапии(дермабразия, мезотерапия).

Практическая значимость работы. Значительная доля сохранившихся инокулированных аллогенных фибробластов в дерме ( 39,9 % ) позволяет рассматривать их как потенциально эффективные клетки для лечения рубцов и атрофий кожи.

Разработанная технология микроинъекционного применения суспензии аллогенных фибробластов человека в концентрации ( 1,5 - 2,0) х 106кл.мл. может быть - успешно использована в дерматокосметологии для лечения пациентов со стрией, возрастной атрофией кожи, гипотрофическим и атрофическим рубцов.

Высокая эффективность применения культур аллогенных фибробластов на стерильном батисте позволяет успешно использовать их для лечения гипертрофических рубцов с помощью лазерной дермабразии.

Личное участие автора в получении результатов.

Автором выполнен весь объем клинических исследований, организованы лабораторные и инструментальные исследования, отбор и курация пациентов, проведены процедуры мезотерапии, лазерной дермабразии, обобщение и анализ полученных данных, разработана формализированная карта, произведена статистическая обработка полученного материала.

Основные положения, выносимые на защиту:

Инокулированные в дерму аллогенные фибробласты сохраняют свою жизнеспособность и пролиферативную активность и могут быть использованы как клеточные технологии для лечения рубцов и агрофий кожи.

Применение аллогенных фибробластов человека на батистовой подложке позволяет повысить на 25 % эффективность лечения гипертрофических рубцов кожи при помощи дермабразии.

Эффективность мезотерапевтического введения аллогенных фибробластов у пациентов с атрофическими и и гипотрофическими рубцами кожи составляет 21 %.

Реализация и внедрение полученных результатов работы.

Использованная в работе новая технология мезотерапии аллогенными фибробластами, лазерная дермабразия очагов различных дерматозов с пересадкой аллогенных фибробластов применяется в учебном процессе, а также в комплексе лечебных мероприятий на кафедре кожных й венерических болезней ВМА им. СМ. Кирова и в клинике «Лекарь» (Санкт - Петербург).

Апробация и публикации материалов исследования. Основные положения диссертации доложены на конгрессе: «Новые технологии восстановительной медицины и концепции развития аппаратного обеспечения» (Москва, 2008); на заседании Дерматовенерологического общества (Санкт-Петербург, 2008).

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе одна в журнале по перечню ВАК Минобразования России.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 55 рисунка, 3 таблицы. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 112 источников, из которых 58 отечественных и 54 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Работа основана на данных экспериментальных, цитоморфологических и клинических исследований. В экспериментальном разделе работы использовались белые беспородные крысы, полученные из питомника «Рапполово». Культура крысиных фибробластов получена из Института Цитологии РАМН. Одна часть экспериментальных исследований на животных и гистологические препараты выполнены в виварии и гистологической лаборатории Военно-медицинской академии. Вторая часть экспериментальных исследований, связанных с прижизненной окраской ядер крысиных

фибробластов флюоресцентным красителем Хекст33258, проводка материала и изучение его в люминесцентном микроскопе выполнена в Институте Цитологии РАМН. Для получения культуры аллогенных крысиных фибробластов использовалась кожа новорожденных крысят. Кожу промывали в солевом растворе Хенкса, содержащем 200 U/ml гентамицина, разрезали на мелкие кусочки, площадью 0,2-0,5 см2. Кусочки кожи инкубировали в 0,5% растворе диспазы в сбалансированном солевом фосфатно-буферном растворе при температуре 37°С в течение часа. Затем кусочки переносили в фосфатный солевой буферный раствор Дульбекко и с помощью пинцета отделяли эпидермис от дермы. Дерму инкубировали в 0,125% растворе трипсина в течение 10-15 минут при перемешивании со скоростью 50 об/мин, после чего действие фермента останавливали добавлением 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Полненную суспензию клеток центрифугировали при 1000 об./мин и фильтровали через нейлоновую марлю. Суспензия клеток высевалась непосредственно на дно чашек Петри. Культивирование осуществляли в течение 6 дней на среде FAD, состоящей из смеси среды DMEM и F12 в соотношении 3:1, с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 5 мкг/мл инсулина (Sigma), 0,5мкг/мл гидрокортизона гемисукцината (Sigma), 10 мкг/мл эпидермального фактора роста .

Для осуществления первой части эксперимента, полученные крысиные фибробласты прокрашивали специальным флюоресцентным красителем (Хекст33258), окрашивающим клеточную стенку. Краситель не является цитотоксичным, клетки сохраняют при этом жизнеспособность. Полученную суспензию клеток в течение 2-х часов транспортировали в лабораторию, где осуществлялось ее инокулирование в кожу крыс. Крыс перед опытом взвешивали и из расчета их веса вводили внутрибрюшинно тиопентал натрия 30 мг/кг веса. После введения 1:рыс в наркоз им выбривали шерсть в области позвоночника, размером около 6 см2'. В центр выбритой области вводили внутрикожно суспензию аллогенных фибробластов в объеме 0,4 мл. на одну папулу. Контрольным крысам в таком же объеме вводили изотонический раствор натрия хлорида. Полученную внутрикожную папулу обводили желтым кадмием или крепким раствором КМп04. Через 3,5,8,14 дней из этих участков брали биопсию кожи. Биоптаты: подвергали заморозке в криостате, после чего на ультратоме делали срезы, толщиной 7-10 мк. Срезы с прижизненно окрашенными флюоресцентной краской «Хекст33258» фибробластами изучали в люминесцентном микроскопе.

Второй вариант работы с крысиными фибробластами заключался в гистологическом исследовании биоптагов, традиционно окрашенных гематоксилин- эозином и на пролиферативные белки с помощью красителя PCNA. Целью данного исследования было дополнительное изучение введенных в дерму аллогенных фибробласюв и их способность к пролиферации.Через 3, 5, 8 и 14 дней после пересадки крысиных аллогенных фибробластов под эфирным наркозом усыпляли по 4 крысы и из обведенных красителем очагов вырезали

кусочки кожи, размером 0,8 см2. В качестве контроля брали образцы нормальной крысиной кожи без трансплантации клеток после введения им изотонического раствора хлорида натрия. На гистологических препаратах, взятых от опытной группы крыс, были видны локусы с введенными аллогенными фибробластами. По мере удлинения сроков после инокуляции клетки «расползались» из очагов введения, большинство из них сохраняло структуру нормальных фибробластов. В препаратах, окрашенных на пролиферативные белки видно, что большое количество введенных клеток (39,9%) содержит белок пролиферации, пояапение которого предшествует делению клетки.

Материалы и методы клинических исследований.

Получение культуры аллогенных человеческих фибробластов. На этапе клинических исследований культуру аллогенных человеческих фибробластов получали из кожи здоровых доноров, взятой во время пластических операций. Получение и культивирование фибробластов из биоптатов кожи проводили по стандартной методике. Фибробласты тестировались на отсутствие контаминации ВИЧ, гепатитов А, В и С, ЦМВ, микоплазмы и других инфекционных заболеваний. Тестирование проводили при помощи ПЦР и иммуноферментными методами. Далее монослойные культуры клеток суспензировали в стерильном физиологическом растворе для инъекций и сохраняли при +4 °С. Жизнеспособность клеток в суспензии определяли с помощью высевания суспензионной культуры через различные сроки инкубации и подсчета количества прикрепившихся клеток по их способности к образованию колоний. Препараты клеток использовали в течение 2-3 часов после получения. Для длительного сохранения клеток их замораживали в жидком азоте при температуре ниже 120° Цельсия. При необходимости, клетки размораживались и использовались в виде суспензии или наращивались на раневых покрытиях. Для этой цели использовали стерильный 2-х слойный батист, пленки «Тагадерм», пленки «Мефилм», коллагеновые пластины «Колост».Под нашим наблюдением находилось 107 пациентов, из них 71 пациент - группы контроля и 36 пациентов в исследуемой группе. Пациенты, отобранные для клинического изучения эффективности применения аллогенных фибробластов, были волонтерами и заполняли информационное согласие. Для клинического подтверждения эффективности терапии аллогенными фибробластами было проведено лечение 36 пациентов, из них 19,5% мужчин и 80,5% женщин. Пациенты были со следующими нозологическими формами: стрии (4 пациентки), возрастная атрофия кожи (7 пациенток), атрофические и гипотрофические рубцы (12 пациентов), базалиомы (3 пациента), нормо- и гипертрофические рубцы (9 пациентов), гемиатрофия Ромберга (1 пациентка). Возраст пациентов в группе с рубцами и стриями был от 18 до 36 лет. Возраст пациентов в группе с базалиомами и атрофиями кожи составлял от 55 до 67 лет. Пациентам проводили лечение с использованием двух композиций из фибробластов: фибробласты на раневом покрытии, фибробласты в суспензии.

В группе контроля был 71 пациент, из них 13% мужчин и 87% женщин в возрасте от 21 до 65 лет. 37 пациентам производилась лазерная шлифовка по поводу рубцовой и возрастной патологии с ведением раневых поверхностей традиционным способом (гелем Куриозин), 34 пациентам с гипо- и атрофическими изменениями кожи и рубцами проводилось микроинъекционное лечение (мезотерапия) вазоактивными, антиоксидантными и анаболическими препаратами, без инъекций фибробластов. Все, отобранные пациенты были здоровы относительно своей возрастной группы. Пациенты были сравнимы по возрасту и состоянию здоровья с пациентами исследуемой группы.

Для объективизации оценки эффективности лечения были разработаны критерии состояния очагов рубцов и атрофий кожи на основании четырех, наиболее характерных клинических признаков: площадь, тургор кожи, рельеф, цвет (таблица №1). Эффективность лечения оценивалась как врачом, так и пациентами. Изменение выраженности клинических проявлений каждого признака от первоначального в сторону уменьшения оценивалось в баллах.

Таблица №1

Клиническая оценка эффективности лечения пациентов с рубцами и атрофиями кожи

Признаки Первоначальная клиническая характеристика очагов (0 баллов) Изменение клинической картины каждого признака в процессе лечения от 1 до 3 баллов Определение общего балла для всех признаков в конце лечения

Площадь Площадь очагов (в см2) Значительное уменьшение площади -3 балла, умеренное -2 балла, незначительное -1 балл. Изменение на 4-5 баллов-к оценке удовлетворительно Изменение на 6-7 баллов - к оценке хорошо. Изменение на 8-9 -к оценке отлично.

Тургор Сухость, симптом «папиросной бумаги, толщина кожной складки» Устранение сухости, значительное увеличение толщины кожной складки -3 балла, умеренные изменения - 2 балла, незначительные -1 балл.

Рельеф Уровень очагов относительно окружающей кожи (- или + ткань) Выравнивание рельефа до уровня окружающей кожи - 3 балла, умеренное выравнивание рельефа -2 балла, незначительное выравнивание рельефа - 1 балл.

Цвет Белый, бледный, синюшный, розовый. Приближени е цвета очагов к цвету нормальной кожи - 3 балла, умеренное улучшение цвета-2балла, незначительное улучшение цвета -1 балл.

Данные оценки изменения вида рубцов и атрофий кожи обрабатывали статистически с использованием параметрических и непараметрических критериев в независимых выборках. При построении графиков и таблиц использовались прикладные пакеты MS Excel и MS Word.

Результаты исследований и их обсуждение

В процессе экспериментальных исследований были получены данные о том, что аллогенные фибробласты, введенные в дерму крыс находятся там в виде скоплений округлых и полигональных клеток, вокруг которых не отмечено воспалительной реакции. По мере \'длинения. сроков, прошедших после инокуляции, отмечается тенденция к «расползанию» клеток из очагов введения. Меняется форма, размеры и степень окрашивания фибробластов гематоксилином и эозином. Наряду с клетками обычной формы и размера, появляются гигантские клетки с длинными отростками. Во многих клетках отчетливо видны ядра, ядрышки. Однако интенсивность окрашивания ядер разная, что говорит о различиях в состоянии клеток. При удлинении сроков нахс "<дения аллогенных фибробластов в дерме нарастает тенденция к уменьшению плотности клеток в зонах введения, которые уже не всегда можно выявить отчетливо. При этом отмечено, что в местах скопления клеточных элементов через 14 сут. после инокуляции фибробластов происходило активное новообразование сосудов. Это косвенно говорит о биостимуляции ткани. Клинически стимуляция дермы проявлялась появлением роста шерсти в очагах инокуляции фибробластов у 100% животных на пятый день после введения клеток, тогда как в контрольной группе животных роста шерсти не наблюдалось.

Фибробласты, окрашенные иммунофлюоресцентным красителем Хекст 33258 дали нам лишь ориентировочные сведения о выживаемости в дерме аллогенных фибробластов. При традиционном гистологическом исследовании и окраске гематоксилин-эозином были получены данные о жизнеспособности и поведении аллогенных клеток, введенных в дерму. Однако возможность количественного определения живых клеток дает только окрашивание клеток на пролиферативные белки. В результате изучения 30 срезов ,их окраски на белки PCNA, подсчета пролиферирующих клеток и статистической обработки значений, были получены данные о том, что в зонах инокуляции выживают в среднем 39,94% аллогенных фибробластов. Полученные результаты доказали, что аллогенные фибробласты не только выживают в коже после инокуляции, восполняя дефицит собственных фибробластов, но и пролиферируют.

Оперативная дермабразия применяется при старческой атрофии кожи; атрофических, нормотрофических, гипотрофических и гипертрофических рубцах; стриях; для лазерной экцизии доброкачественных опухолей. Из литературы известно, что фибробласты, выращенные на подложке и используемые в качестве раневого покрытия, ускоряют эпителизацию,

уменьшают воспалительную реакцию и способствуют улучшению состояния соединительной ткани и дермы ( Туманов В.П. 1996, 1998, 1999; Сухих Г.Т, Алиханова З.М. 2001; Kangesu T.H.et al. 1998). В последнее время появилось много различных вариантов раневых покрытий для ведения раневых эрозивных поверхностей после оперативной дермабразии (Озерская О.С., 2007). Провели исследование по выращиванию аллогенных фибробластов на пленках «Мефилм», «Тегадерм», коллагеновых пластинах «Колост» и многослойном батисте. В результате исследования установлено, что использования в качестве подложки для фибробластов коллагеновой пластины «Колост» и пленок «Тегадерм» и «Мефилм», несмотря на их биосовместимость с клетками не оправдано. Связано это с тем, что «Колост» не прозрачен, поэтому на нем трудно контролировать состояние клеток и, набухая в ростковой среде становится очень толстым, что неудобно для пациентов. Пленки «Тегадерм» и «Мефилм» - тонкие, прозрачные, но одна сторона у них липкая, что затрудняет их снятие с чашки Петри и перенос на раневую поверхность. В связи с этим чаще всего для работы с фибробластами использовался многослойный батист, который фиксировали на коже пленками «Тегадерм» и «Мефилм» или пластырем «Омнификс». Таким образом, в качестве раневого покрытия после лазерной дермабразии применяли аллогенные фибробласты, выращенные на двухслойном батисте.

На следующем этапе работы оценивали эффект использования культуры аллогенных фибробластов в терапии рубцов после применения дермабразии. Лазерная дермабразия рубцов осуществлялась с помощью эрбиевого лазера «Мультилайн» с длиной волны 2,94 мкм. Результаты оценки эффективности применения культуры аллогенных фибробластов после дермабразии представлены на рисунке 1

«esa- :: ....J,

«к ш « ——„

----

;0 ^ -g .! руяЬм t lüj»< мзз'

Рис. 1 Клиническая эффективность лазерной дермабразии у пациентов с использованием аллогенных фибробластов на подложке и традиционным методом.

По оси абсцисс группы пациентов: 1а -наблюдения (п =19) , 1б-сравнения (п =37) .По оси ординат баллы * - р<0,05 .Таким образом эффективность лечения в группе пациентов с применением культуры аллогенных фибробластов на 25 % выше, чем при использовании традиционной дермабразии, что обусловлено выработкой фибробластами факторов роста, коллагеновых ,эластических и ретикулиновых волокон.

Третий этап работы включал оценку эффективности коррекции атрофий кожи при помощи мезотерапевтического введения культуры аллогенных фибробластов. Известно, что мезотерапия вазоактивными микроэлеменными и витаминными препаратами широко применяется для эпитализации особенно в тех анатомических областях где дермабразия неприемлема, истончение или отсутствие подкожно-жировой клетчатки (Озерская О.С., 2007). Другим вариантом лечения аллогенными фибробластами является технология с использованием суспензией аллогенных фибробластов, которая использовалась при коррекции гипотрофических и атрофических рубцов, атрофических полос кожи (стрий), старческой атрофии кожи. Суспензия вводится внутрикожно, ретроградно или инфильтративным способом. Результаты оценки эффективности применения культуры аллогенных фибробластов с помощью мезогерапии представлены на рисунке 2

Рис.2 Клиническая эффективность мезотерапевтического введения с использованием аллогенных фибробластов и традиционным методом.

По оси абсцисс группы пациентов: 2а -наблюдения (п =17), 26-сравнения (п =34) .По оси ординат баллы * - р<0,05 .Таким образом эффективность лечения в группе пациентов с применением культуры аллогенных фибробластов на 2.1 % выше, чем при использовании традиционной мезотерапии, что также повышает синтетическую активность фибробластов как и в предыдущем случае.

На рис. 3 представлена сравнительная эффективность использования культуры аллогенных фибробластов по ряду нозологических форм в сравнении с группами пациентов получавших базисное лечение, эффективность которой оценивали в 100%.

1ФО . -.——----.-

^ и

Z —j-R— ;-гН— т . rírf-

• _.-■*_ _.. i_ i

__ j — -, - . г_

— , .—. р— ---^ -

~— --- --* * I—

350 • ——— , .,..,.,.. 11 11 —■"—"■'■■■— ■—......— *"1.............'" |——-

о ——-Í. • 1--1—,——!-—!—

..^KL.JÍiJ'lt...^ II..Г MUÍ

Т 2 3 * S

Рис 3.Сравнительная эффективность применения культуры аллогенных фибробластов и традиционной базисной терапии по нозологическим формам.

1 - пациенты с базалиомами (п =8); 2 - пациенты со стриями (п =10); 3 -пациенты с гипотрофическими и атрофическими рубцами (п =46); 4 - пациенты с возрастными изменениями кожи (п =24); .5 - пациенты с нормо - и гипертрофическими рубцами (п =19). Знаком * отмечено различия значений эффективности применения клеточных технологий по сравнению со значениями эффективности традиционного лечения - р<0,05.

Оценка эффективности применением аллогенных фибробластов при различных нозологических формах показало, что эффективность лечения в группе сравнения выше, чем в группе контроля. Применение клеточных технологий с использованием аллогенных фибробластов максимально эффективнее у пациентов со стриями на 50%(р<0,05): у всех пациентов повышалась упругость кожи, уменьшалась ширина и длина стрий, нормализовался цвет, стрии становятся незаметными. Хорошая эффективность применения клеточных технологий наблюдалась у пациентов с нормо--гипертрофическими рубцами. В данной группе эффективность применения составила 31%(р<0,05).Умеренная эффективность применения аплогенных фибробластов наблюдалась у пациентов с базалиомами, гипо-атрофическими рубцами и составила 29%(р<0,05).Низкая эффективность применения культуры аллогеных фибробластов определялась у пациентов с возрастными изменениями кожи 10%,что обусловлено снижением трофики кожи, ее метаболизма и тем самым снижением выработки фибробластов.

Известно, что эффективной технологией для лечения нормотрофических и гипертрофических рубцов является оперативная дермабразия (Озерская О.С.,

Т^Т 7Г- *

г гЬ «г rtf- \L • • г -F

Ч Т. | i- * 'i

. i' - KÉI: ■ ч •

t 2 3 4 «5

2004; 2005; 2006). Важным этапом терапии гипертрофических рубцов является ведение послеоперационной поверхности и чем быстрее наступит эпителизация и купируется воспалительная реакция, тем лучше будут результаты лечения (Озерская О.С., 2007). Пересаженные аллогенные фибробласты способствуют актшшзации кератиноцитов, увеличению их популяции в ране, что приводит к сокращению сроков эпителизации (Тафришьян Н.Р., 2007). Кроме того, факторы роста, выделяемые аллогенными фибробластами, стимулируют дермоподобную трансформацию рубцовой ткани (Озерская О.С., 2004; 2005; 2006). Приживаясь в ране, аллогенные фибробласты также ускоряют эпителизацию, купируют воспаление, стимулируют пролиферативную и синтетическую активность собственных кератиноцитов и фибробластов, выделение биологически активных молекул, что в комплексе дает потенциал для улучшения эстетического вида нормо-и гипертрофических рубцов.

Пациентам с молодыми стриями (розово-синюшного цвета), оптимально показана мезотерапия суспензией фибробластов, так как в этой стадии дерма повреждена, архитектоника ее нарушена и благодаря синтетической и пролиферативной активности аллогенных фибробластов она может быть значительно восстановлена. Пациентам со старыми стриями (белого цвета), показана легкая оперативная дермабразия с пересадкой культуры фибробластов на раневом покрытии, как при коррекции нормо-гипертрофических рубцов. Связано это с тем, что старые стрии являются практически вариантом нормо- и гипотрофических рубцов. В случае оставшегося «западения» тканей в области старых стрий, показан комбинированный метод - оперативная дермабразия с фибробластами на раневом покрытии и введение в ткани стрии суспензии фибробластов, как в случае с гипотрофическими рубцами.

Пациенты со старческой атрофией кожи нуждаются в уменьшении кожных складок, морщин, участков гипотрофии, в улучшении тургора кожи. Таким пациентам одинаково показана мезотерапия суспензией фибробластами, и оперативная дермабразия с пересадкой аллогенных фибробластов на раневом покрытии. Введение суспензии фибробластов микропапульной или ретроградной техникой вызывает восполнение компонентов дермы (коллагена, эластина, гликозаминогликанов, натурального увлажняющего фактора и воды). Кроме того, за счет выделения факторов роста происходит биостимуляция кожи, так называемый «мезолифтинг». В том случае, если кожа толстая, морщинистая, кроме микроинъекций суспензией фибробластов, показана также оперативная дермабразия с применением фибробластов, выращенных на раневых покрытиях.

Наиболее часто необходимость применения клеточных биотехнологий есть у пациентов с гипотрофическими рубцами небольшой площади, до 5-10 см2. Для этой категории пациентов применимы и используются все варианты клеточных композиций с фибробластами. Гипотрофические эстетические дефекты являются наиболее заметными для окружающих, что и является причиной для обращения пациентов к врачам дерматовенерологам. Учитывая

наличие атрофии ткани в области рубца имеется морфологический субстрат для применения на первом этапе лечения мезотерапии суспензией фибробластов. В том случае, если пациенты не удовлетворены видом рубца после первого этапа лечения (рубец недостаточно выровнялся относительно окружающей кожи), показан второй этап лечения. Он состоит из оперативной дермабразии с пересадкой фибробластов на раневом покрытии.

Результаты сравнительного анализа эффективности лечения рубцов и атрофий кожи с помощью предлагаемых в нашей работе клеточных технологий (аллогенные фибробласты в виде суспензии и на раневых покрытиях) позволили получить предположения об отсутствии фармацевтической (за счет неклеточных компонентов препарата), фармакодинамической (прямое действие клеток), токсической и аллергической реакции. У всех 36 пациентов (100%) на всех сроках наблюдения, не было отмечено появления побочного действия от введения клеточной культуры как местного, так и системного характера. Нежелательных субъективных ощущений пациенты не отмечали. Не отмечено появление, каких — либо высыпаний и температурных реакций в течение суток после трансплантации. Данные наблюдения подтверждают безопасность применения используемых клеточных препаратов. Наши данные свидетельствуют, что аллогенные фибробласты улучшают трофику рубцовой ткани и очагов атрофии. Таким образом, предлагаемые нами технологии лечения рубцов и атрофий кожи с помощью пересадки культуры аллогенных фибробластов являются не только эффективными, но простыми и безопасными для пациентов.

ВЫВОДЫ

1. В эксперименте на животных с помощью гистологических и цитоморфологических методов исследования доказано, что аллогенные фибробласты, инокулированные в дерму крыс в 39,9% сохраняют жизнеспособность, синтетическую и пролиферативную активность и улучшают трофику кожи.

2. Клиническая эффективность применения дермабразии с последующей трансплантацией культуры аллогенных фибробластов на тканевой подложке при коррекции рубцов кожи на 25 % эффективнее , чем при использовании традиционной дермабразии (р<0,05).

3. Мезатерапевтическое введения культуры аллогенных фибробластов при коррекции атрофий кожи на 21% эффективнее мезотерапевтического введения с использованием витаминов, микроэлементов, сосудистых препаратов (р<0,05).

4. Введение аллогенных фибробластов оказалась эффективнее у

пациентов со стриями (50%), нормо-и гипертрофическими рубцами ( 31%), базалиомами и гипо-атрофическими рубцами ( 29% ) и малоэффективно у пациентов с возрастными изменениями кожи( 10%).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При лечении рубцов кожи с помощью лазерной дермабразйи целесообразно использовать аллогенные фибробласты на стерильном многослойном батисте в концентрации ( 1,5 - 2,0) х 106кл. на 1 см2 поверхности подложке.

2. В лечении атрофий кожи целесообразно применять мезотерапевтическое введение суспензии аллогенных фибробластов в концентрации ( 1,5 - 2,0) х 106кл. в I мл. • ■

3. Мезотерапевтические коктейли №1,2,3 могут применяться в качестве подготовительного курса перед лечением аллогенными фибробластами при рубцах и атрофиях кожи. Коктейль№1 : витамин С 5%-2мл, никотиновая кислота -1 мл, новокаин 2%-1 мл. Коктейль № 2: витамин В 12 0,01 % -0,5 мл , пентоксифиллина-3 мл , новокаин 2%- 2 мл . Коктейль № 3: рибоксин-1 мл, витамин С- 3 мл, новокаин-2 %-2 мл. Коктейль используется 1 раз в 3-4 дня, чередуя инъекции, курс - 8-10 инъекций.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Озерская О.С. Экспериментальные подходы к обоснованию применения клеточных композиций на основе фибробластов в дерматокосметологии / О.С.Озерская, В.В.Щеголев// Научно-информационный аналитический журнал «Клеточная трансплантология и тканевая инженерия». СПб, 2008. - С.66-67.

2. Озерская О.С. Возможности коррекции дистрофических состояний заболеваний кожи с помощью аппаратных технологий / О.С.Озерская, В.В.Щеголев// Новые технологии восстановительной медицины в концепции развития аппаратного обеспечения. - М., 2007. -С.96.

3; Щеголев В.В. Реабилитация пациентов с гипотрофическими рубцами. / В.В.Щеголев, О.С.Озерская // Межакадемический информационный бюллетень. - СПб, 2007. - С.11-12.

4. Щеголев В.В. Патогенетические обоснования лечебно-реабилитационных мероприятий у пациентов геронто-косметологического профиля. /В.В.Щеголев, О.С.Озерская // Межакадемический информационный бюллетень. - СПб, 2007. - С.12-13.

5. Щеголев В.В. Ревитализации кожи суспензией фибробластов. / В.В.Щеголев, О.С.Озерская // Межакадемический информационный бюллетень. - СПб, 2007. - С. 14.

6. Щеголев В.В. Экспериментальное изучение влияния аллогенных фибробластов на кожу. / В.В.Щеголев, О.С.Озерская// Межакадемический информационный бюллетень. - СПб, 2007. - С.20.

7. Щсголев B.B. Клшшко-морфологический анализ успешности применения аллогенных фибробластов в терапии атрофических поражений кожи. / Щеголев В.В. О.С.Озерская // Межакадемический информационный бюллетень. - СПб, 2007.-С.21.

8. Озерская О.С. Опыт комплексного подхода к изучению коррекции гипо-и атрофических рубцов с помощью культуры фибробластов. / О.С.Озерская, В.В .Щегол ев// Межакадемический информационный бюллетень. - СПб, 2007. - С.22-24.

9. Озерская О.С. Мезотерапия аллогенными фибробластами. / Озерская О.С., Щеголев В.В. // Вестник эстетической медицины. - 2008. - №2 . - С. 2024.

10. Озерская О.С. Аллогенные фибробласты в эксперименте и клинике./ Озерская О.С., Щеголев B.B// II Российская научная конференция. Дерматологические чтения / Тез. .докл. - СПб. 2008. - С. 49-50.

Формат 60x84/16 Заказ № 323

Подписано в печать 06.04.09

Объем 1 п.л. Тираж то экз.

Типография BMA им. С.М. Кирова 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6

Оглавление диссертации Щеголев, Виталий Владимирович :: 2009 :: Санкт-Петербург

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. АТРОФИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ, СОСТОЯНИЯ И РУБЦЫ КОЖИ. ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ИХ ЛЕЧЕНИЮ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Современная классификация атрофий и рубцов кожи.

1.2. Традиционные терапевтические подходы к коррекции атрофий и рубцов кожи

1.3. Применение клеточных биотехнологий для коррекции атрофий и рубцов кожи 1.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Экспериментальные исследования.33д „

2.1.1. Группы и этапы исследований.

2.1.2. Получение культуры аллогенных крысиных фибробластов.

2.1.3. Изучение выживаемости аллогенных фибробластов после внутрикожной инокуляции методом прижизненной окраски

2.1.4. Изучение морфологии и пролиферативной активности аллогенных фибробластов после внутрикожной инокуляцию.

2.2. Материалы и методы клинических исследований.

2.2.1. Получение культуры аллогенных человеческих фибробластов.

2.2.2. Выращивание культуры фибробластов на различных подложках.

2.2.3. Мезотерапия

2.2.4. Дермабразия

2.2.5. Группа клинического наблюдения.

2.3. Статистическая обработка данных.

Глава.З. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ВЫЖИВАНИЯ ТРАНСПЛАНТИРОВАННЫХ АЛЛОГЕННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ В КОЖЕ И ИХ ВЛИЯНИЯ НА ДЕРМУ.

3.1. Исследование выживаемости культуры аллогенных фибробластов в тканях реципиента.

3.2. Изменение клинико-морфологических характеристик кожи крыс под влиянием интродермально инокулированной суспензии аллогенных фибробластов.

Глава 4. ЛЕЧЕНИЕ АТРОФИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И

РУБЦОВ КОЖИ С ПОМОЩЬЮ АЛЛОГЕННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ.

4.1. Возрастная атрофия кожи. Варианты применения культуры аллогенных фибробластов.

4.2. Применение культуры аллогенных фибробластов в коррекции стрий.

4.3. Гемиатрофия Ромберга. Комплексный подход к терапии. Применение клеточных технологий с фибробластами.

4.4. Гипо- и атрофические рубцы. Комплексный подход к лечению. Возможность коррекции с помощью культуры фибробластов.

4.5. Применение аллогенных фибробластов для улучшения результатов лечения доброкачественных новообразований кожи и очагов возрастной гиперпигментации.

4.6. Применение аллогенных фибробластов для коррекции нормо- и гипертрофических рубцов кожи

4.7. Интегральная оценка клинической эффективности и безопасности применения клеточных технологий в лечении атрофий и рубцов кожи

Введение диссертации по теме "Кожные и венерические болезни", Щеголев, Виталий Владимирович, автореферат

Кожа человека подвержена различным неблагоприятным воздействиям внешней среды и заболеваниям. Это приводит к нарушению трофики кожи, влекущее истончение ее слоев за счет уменьшения или исчезновения составляющих колеи - клеток и волокон, желез, волосяных фолликулов с замещением их менее дифференцированной фиброзной тканью. Группу заболеваний, возникающих в результате нарушения питания кожи, называют атрофиями кожи (Романенко И.М., 2007).

Отдельно стоит группа дистрофических состояний кожи, возникших после перенесенного дерматоза с деструктивным процессом в дерме — туберкулез кожи, глубокие микозы, глубокие пиодермии, васкулиты, склеродермия, саркоидоз и др. (Павлов С.Т. и др. 1975; Самцов A.B., Барбинов В.В., 2008). После излечения от вышеперечисленных дерматозов на коже у пациентов остаются рубцовые очаги атрофического, гипотрофического или нормотрофического вида (Озерская О.С., 2007). Подобные же изменения могут возникнуть на коже после перенесенных травм и различных оперативных вмешательств.

Схожесть патогистологической картины многих видов атрофий диктует и сходное патогенетически обоснованное лечение, основанное на улучшении питания и трофики кожи. В связи с этим, таким пациентам назначаются ангиопротекторы, средства специфической и неспецифической иммунотерапии; витамины С, А, Е, группы В; тепловые процедуры, органопрепараты (Скрипкин Ю.К. 2001). В процессе лечения клиническая картина очагов атрофии несколько улучшается, однако лечение не приносит пациентам желаемого удовлетворения. Лечение же сформировавшихся атрофических изменений вообще малоэффективно (Романенко И.М., 2007).

Тканевая терапия уже более 100 лет привлекает внимание ученых и врачей. Интерес к применению клеточных технологий в дерматокосметологии связан с тем, что клетки несут в себе мощный биоэнергетический и информационный потенциал, благодаря которому возможно получение качественно новых результатов лечения. Особый интерес у ученых вызывает основная клетка дермы — фибробласт. Комбустиологи уже не одно десятилетие применяют пересадку аутологичных и аллогенных фибробластов на ожоговые раны. Пересаженные на кожу клетки закрывают раневой дефект и стимулируют дерму, выделяемыми аутокинами (факторами роста, цитокинами, окисью азота и др.) (Туманов В.П. 1996; Хавинсон В.Х., Калинин В.В. 2002). Кроме того, они действует на собственные фибробласты, повышая их синтетическую и пролиферативную активность (Липшиц Р.У., Звягинцева Т.В. 1999; Эрнандес Е., 2001.). Фибробласты вырабатывают коллаген, эластин, ферменты, гликозаминогликаны, факторы роста и другие биологически активные молекулы. Новообразование сосудов, снятие гипоксии, улучшение трофики, утолщение дермы - вот морфологическая основа действия фибробластов на кожу (Сухих Г.Т, Алиханова З.М. 2001; Каг^еБи Т.Н.е! а1., 1998). Биостимуляция и увеличение толщины дермы — желаемый результат лечения атрофий кожи. Таким образом, низкая эффективность существующих методов лечения атрофических заболеваний, приводит к необходимости поиска новых средств и методов, основанных на стимуляции дермы, синтетической и пролиферативной активности собственных фибробластов.

Цель исследования.

Задачи исследования:

Мезотерапевтическое введение суспензии живой культуры аллогенных фибробластов приводит к улучшению клинической картины очагов атрофии: увеличивает тургора кожи, выравнивает рельеф, уменьшает площадь очагов, снижает сухость кожи.

Выявлено, что введение суспензии аллогенных фибробластов в очаги поражения кожи пациентов при гипотрофических, атрофических рубцах и атрофиях кожи усиливают регенерацию изучаемых заболеваний.

Установлено, что эффективность лечения рубцов и атрофий кожи выше при использовании культуры аллогенных фибробластов, чем традиционной терапии (дермабразия, мезотерапия).

Практическая значимость работы. Значительная доля сохранившихся инокулированных аллогенных фибробластов в дерме (39,9 %) позволяет рассматривать их как потенциально эффективные клетки для лечения рубцов и атрофий кожи.

Разработанная технология микроинъекционного применения суспензии аллогенных фибробластов человека в концентрации (1,5 - 2,0) х 10бкл/мл может быть успешно использована в дерматокосметологии для лечения пациентов со стрией, возрастной атрофией кожи, гипотрофическим и атрофическим рубцов.

Личное участие автора в получении результатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

Применение аллогенных фибробластов человека на батистовой подложке позволяет повысить на 25% эффективность лечения гипертрофических рубцов кожи при помощи дермабразии.

Реализация и внедрение полученных результатов работы.

Использованная в работе новая технология мезотерапии аллогенными фибробластами, лазерная дермабразия очагов различных дерматозов с пересадкой аллогенных фибробластов применяется в учебном процессе, а также в комплексе лечебных мероприятий на кафедре кожных и венерических болезней BMA им. СМ. Кирова и в клинике «Лекарь» (Санкт - Петербург).

Заключение диссертационного исследования на тему "Клинико-экспериментальное обоснование применения аллогенных фибробластов для лечения рубцов и атрофий кожи"

104 ВЫВОДЫ

2. Клиническая эффективность применения дермабразии с последующей трансплантацией культуры аллогенных фибробластов на тканевой подложке при коррекции рубцов кожи на 25 % эффективнее, чем при использовании традиционной дермабразии (р<0,05).

3. Мезотерапевтическое введения культуры аллогенных фибробластов при коррекции атрофий кожи на 21% эффективнее мезотерапевтического введения с использованием витаминов, микроэлементов, сосудистых препаратов (р<0,05).

4. Введение аллогенных фибробластов оказалась эффективнее у пациентов со стриями (50%), нормо- и гипертрофическими рубцами (31%), базалиомами и гипо-атрофическими рубцами (29%) и малоэффективно у пациентов с возрастными изменениями кожи (10%).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При лечении рубцов кожи с помощью лазерной дермабразии целесообразно использовать аллогенные фибробласты на стерильном многослойном батисте в концентрации (1,5 - 2,0) х 10 кл. на 1 см поверхности подложке.

2. В лечении атрофий кожи целесообразно применять мезотерапевтическое введение суспензии аллогенных фибробластов в концентрации (1,5 — 2,0) х 106кл. в 1 мл.

3. Мезотерапевтические коктейли №1,2,3 могут применяться в качестве подготовительного курса перед лечением аллогенными фибробластами при рубцах и атрофиях кожи. Коктейль№1 : витамин С 5%-2мл, никотиновая кислота -1 мл, новокаин 2%-1 мл. Коктейль № 2: витамин В 12 0,01 % -0,5 мл, пентоксифиллина-3 мл, новокаин 2%- 2 мл. Коктейль № 3: рибоксин-1 мл, витамин С- 3 мл, новокаин-2 %-2 мл. Коктейли используются 1 раз в 3-4 дня, чередуя инъекции, курс - 8-10 инъекций.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Щеголев, Виталий Владимирович

1. Алейник Д.Я. и др. Использование культур аллофибробластов для лечения ожоговых ран у детей / Д.Я.Алейник, В.А. Куприянов, В.М. Левин и др. // Новые методы лечения ожогов с использованием культивируемых клеток кожи / Междунар. симп. — Тула, 1996. — С. 1.

2. Алексеев A.A., Попов C.B. Современные методы трансплантации культивированных клеток кожи и ее эквивалентов при лечении ожогов // Комбустиология- 1999.- №1 — С.1-12.

3. Андреев С.М. Коллаген: структура и функции (Часть 2) // Косметика и медицина. -2001.- Т.4, № 23.- С.14-23.

4. Андреев С.М. Коллаген: структура и функции // Косметика и медицина— 2001 -Т.З, № 22 — С. 41-46.

5. Арсений И.А. и др. Сравнительная характеристика методов выделения эпидермоцитов из кожи человека / И.А. Арсений, Е.В. Маркелов, Т. А. Назаренко и др. // Актуальные вопросы теоретической и практической медицины. Харьков, 1976. — С. 7.

6. Баутин Е.А. Эволюция кожного покрова, восстановленного дермальными аутотрансплантантами: Автореф. дис. . канд. мед. наук.— Л., 1978.- 18 с.

7. Вялов С.Л. и др. Современные представления о регуляции процесса заживления ран (обзор литературы) / С.Л. Вялов, К.П. Пшениснов, П. Куиндоз и др. // Анналы пласт., реконстр., эстет, хирург 1999 - № 1-С.49-56.

8. Г.Степанова, С.Б.Алексеев, A.A. Згурский, Г.А.Ломанова, Н.В.Шалу нова. Получение и характеристика нового штамма диплоидных клеток из фетальной ткани легкого человека // Цитология. 1986. - Т.28, №12.-С.1373-1376.

9. Г.Т. Сухих, З.М. Алиханова. Коррекция синдрома постовариоэктомии фетальными тканями / В кн.: Руководство по климактерию. Под редакцией В.И.Кулакова и В.П.Сметник. Москва, 2001. - С.641-662.

10. П.Глущенко Е.В., Заец Т.Д., Серов Г.Г. Выбор оптимальных сроков трансплантации культивированных фибробластов на ожоговую рану // Пластическая хирургия при ожогах и ранах / Междунар. симп. — М., 1994.-С. 21-22.

11. Домасева Т.В., Бабкин A.B. Подходы к диагностике и лечению различных атрофий кожи при Лайм-бррелиозе. // Актуальные вопросы косметологии/ Материалы научно-практической конференции. СПб.,2000.-С.17-18.

12. Жигульцова Т.И., Пархаева Л.В. Дермабразия в коррекции косметических недостатков // Рос. Журн. кожн. вен. болезней. 2000. -№ 1. - С. 63-69.

13. Жилина Н. М., Иванов В. Б., Корень Н. Н. Сравнительный анализ кожной аутопластики традиционными методами и с использованием клеточной культуры фибробластов // Вестник новых медицинских технологий. 1997. -Т. IV, №1.- С. 88.

14. Заец Т.Л., Лавров В.А. Фибронектин в культурах фибробластов и в биологических средах организма // Новые методы лечения ожогов с использованием культивируемых клеток кожи // Междунар.симп. — Тула, 1996.-С. 5.

15. Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы общей патологии. Часть 1. Основы общей патофизиологии. СПб.: ЭЛБИ, 1999.- 624с.

16. Иващев-Мусатов О.С. Тебория вероятности и математическая статистика.- 2000.-№5-6.- С.9-93.

17. Kumagai N., Fukushi S., Matsuzaki К. et al. Treatment of nevus Ota with autologous-cultured epithelium grafting combined with dermabrasion // Ann. Plast. Surg. 1995.-Vol. 34, N2.-P. 180-197.

18. Калайджан К. Эрбиевые лазеры в эстетической дерматологии // Nouv. Esthet. 1999. - N 1. - P. 26-28.

19. Келлер Г., Себастиан Дж., Лакомбе Ю., Тофт К., Ласк Г., Ревазова Е. Сохранность инъецируемых аутологичных человеческих фибробластов // Бюл. эксп. биол. мед. 2000. - Т. 130, №'8. - С. 203-206.

20. Лапутин Е. Современное представление.о дермабразии //Nouv. Esthet. -1999.-N 1. P. 18-20.

21. Малахов С.Ф. и др. Перспективы биотехнологических методов восстановления кожных покровов / С.Ф. Малахов, A.B. Васильев,

22. B.В.Терских и др. // Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи / Междунар. симп. — Тула, 1996 — С .6-7.

23. Малахов С.Ф., Парамонов Б.А., Емельянов A.B. Новые подходы к лечению тяжелых ожогов: трансплантация выращенных в культуре кератиноцитов // Военно-медицинский журнал. 1997. - Т 318., N 9.1. C.16-19.

24. Мельцова А.Ж., Гриценко В.В., Орловский П.И. и соавт. Применение дермальных фибробластов в комплексном лечении больных с трофическими язвами венозной этиологии // Вестн. Хир. им. И.И. Грекова. 2007. - Т. 166, №1. - С.72-77.

25. ЗЗ.Озерская О.С. Рубцы кожи и их дерматокосметологическая коррекция. СПб.: Из-во «Искусство России». 2007. - С.223.34.0зерская О.С. Способ дермато-хирургического лечения гипотрофических рубцов. Патент на изобретение №.2184492, -Москва,2002.

26. Павлов С. Т., Шапошников О. К., Самцов В. И., Ильин И. И. Кожные и венерические болезни. -М., 1975. С.352

27. Пальцев М.А., Иванов A.A. Межклеточные взаимодействия- М.: Медицина, 1995.-224 с.

28. Парамонов Б.А., Современные возможности и переспективы развития методов восстановления кожного покрова у тяжелообожженных. Дисс. д-ра мед.наук. СПб, - 1996.

29. Романенко И.М., Кулага В.В., Афонин C.JL. Лечение кожных и венерических болезней. Руководство для врачей, Том 2, Медицинское информационное агенство Москва, 2006.- С.885.

30. Салистый П.В., Панова О.В. Аллофибробласты в лечении глубоких ожогов у детей. / В сб. "Комбустиология на рубеже веков" Мат. Конгресса. - М, 2000. - С. 120.

31. Самцов A.B., Барбинов В.В. Дерматовенерология. СПб.,2008. - С. 320.

32. Саркисов Д.С., Алексеев A.A. Теоретические и практические аспекты использования культивированных фибробластов при восстановлении целостности кожного покрова // Вестн. РАМН — 1994 — № 7.- С. 6-11.

33. Серов В.В, Шехтер А.Б. Соединительная ткань. М.: Медицина, 1981. -312с.

34. Сешо Ж.Л. Выравнивание рельефа кожи при помощи лазера // Nouv. Esthet. 1997. - Present. N. - P. 36-39.

35. Скрипкин Ю. К. Кожные и венерические болезни. — М., 2001. С.642.

36. Смирнов C.B. и др. Банк клеток и тканей как основа для систематизации работ в области клеточной терапии / C.B. Смирнов, И.В. Киселев, A.B. Емельянов и др. // Онтогенез. 1998.- Т. 29, № 6. - С. 476.

37. Сологуб В.К., Донецкий Д. А., Борисов В .Я., Яковлев Г.Б., Лагвилава М.Г. Клиническое применение консервированных биопокрытий для ран и ожогов. Москва, 1990. - С. 8.

38. Тафришьян Н.Р. Применение культивированных кератиноцитов и фибробластов для восстановления кожного покрова после лазерной дермабразии. — автореферат дисс. канд. мед. наук. — СПб, 2007. 16 с.

39. Терехов С.М. Усовершенствованный метод клонирования диплоидных фибробластов человека // Цитология. 1981. - Т.23,№ 6. - С.717-718.

40. Ткаченко Б.И. Основы физиологии человека. Т.2. СПб, 1994. - С.218-262.

41. Туманов В.П. Способ получения трансплантанта из культивированных фибробластов человека для лечения обожженных / Новые методы лечения ожогов с использованием культивируемых клеток кожи. Междунар. симп. Тула, 1996. — С. 11.

42. Туманов В.П. Десятилетний опыт использования культуры клеток человеческой кожи для лечения термических ожогов // Арх. патол. — 1999.-№4.-С. 5-9.

43. Туманов В.П., Глущенко Е.В., Морозов С.С., Саркисов Д.С. Использование культивированных фибробластов при лечении ожоговых ран. Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990. - №4. - С. 400-402.

44. Федоров В.Д. , Саркисов Д. С., Алексеев А. А., Туманов В. П., Серов Г. Г. Пластическое восстановление кожных покровов с использованием культивированных фибробластов // Анналы Хирургии. 1996. - №4. - С. 16-19.

45. Цветкова Г. М., Гетлинг 3. М. Ультраструктура основных компонентов дермы / В кн.: Морфология кожи человека. Под ред. И. Карасей, Г. М. Цветковой. Брно, 1980, - С. 69 - 109.

46. Цветкова Г. М., Мордовцев В. Н. Патоморфологическая диагностика заболеваний кожи. М., 1986. - С.245.

47. Чернух А. М., Фролов Е. П. Кожа (строение, функция, общая патология и терапия). — М., 1982.- С.335.

48. Ярыгин Н. Е., Серов В. В. Атлас патологической гистологии. М., 1977.

49. Acland К.М., Barlow R.J. Lasers for dermatologist // Br. J. Dermatol 2000. - Vol.143, № 2. - P.244 - 255.

50. Adzick N.S., Longaker M.N. Scarless fetal healing. Therapeutic implications // Ann. Surg.- 1992.- Vol. 21, № 1.- P.3 7.

51. Aggarwal S., Pittenger M.F. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responces // Blood. 2005. - Vol.105, N4. - P.1815-1822.

52. Alvarez O.M., Merz P.M., Eaglstein W.H. The effect of occlusive dressings on collagen synthesis and re-epithelialization in superficial wounds // J. Surg. Res. 1983. - Vol. 35, N 2. - P.142 - 148.

53. Auger F.A. Tissue-engineered human skin substitutes developed from collagen-populated gels: clinical and fundamental applications / M. Rouabhia, F. Goulet, F. Berthod et al. // Med. Biol. Eng. Comput. 1998. - Vol.36, N 6.-P.801-812.

54. Aust L., Devlin B., Foster S.J. et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates // Cytotherapy. — 2004. Vol.6, N.l. -P.7-14.

55. Ballaun C. Weniger W., Uthman A. et al. Human kerotinocytes express the three major splice forms of vascular endothelial growth factor // J. Invest. Deramtol.- 1995.-Vol.104, N.l P. 7- 10.

56. Bartholomew A., Sturgeon C., Siatskas M. et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo // Exp. Hematol. 2002. - Vol.30. - P.42-48.

57. Bâtisse D., Bazin R. Et al. Influence of age on the wrinkling capacilities of skin // Skin Res. Technol. 2002. - Vol.8, N3. - P. 148.

58. Baumann L. Cosmetic dermatology. New York: McGraw-Hill., 2002.

59. Bayram Y., Deveci M., Imirzalioglu N. et al. The cell based dressing with living allogenic lceratinocytes in the treatment of foot ulcers: a case study // Br. J. Plast. Surg. 2005. - Vol.58, N.7. - P.988-996.

60. Bell E., Sher S., Hull B. et al. The reconstitution of living skin // J. Invest. Dermatol. 1983.-Vol.81, N 1 Suppl. - P. 2 - 10.

61. Bergoglio V., Warrick E., Chevallier-Lagente O., Magnaldo T. Cutaneous gene therapy: the graft takes // Med. Sei. (Paris). 2008. - Vol.24, N.6-7. -P.607-614.

62. Beyth S., Borovsky Z., Mevorach D. et al. Human mesenchymal stem cells alter antigen-presenting cell maturation and induce T-cell unresponsiveness // Blood. 2005.-Vol. 105, N.5. —P.2214-2219.

63. Boese G., Trimpert C., Albrecht W. et al. Membranes from acrylonitrile-based polymers for selective cultivation of human lceratinocytes // Tissue Eng. -2007. Vol.13, N.12. - P.2995-3002.

64. Boisnic S., Branchet-Gumila M.C., Le Charpentier Y. et al. Repair of UVA-induce elastic fiber and collagen damage by 0,05% retinaldehyde cream in an ex vivo human skin model // Dermatology. 1999. - Vol.199, N1. P.43—48.

65. Bukvic Mokos Z., Lipozencic J. Corrective dermatology: yesterday today — tomorrow // Acta Dermatovenerol. Croat. - 2009. - Vol.17, N.l. - P.84.

66. Caissie R., Gingras M., Champigny M.F., Berthod F. In vivo enhancement of sensory perception recovery in a tissue-engineered skin enriched with laminin //Biomaterials. 2006. - Vol.27, N.l5. - P.2988-2993.

67. Carter D.M., Lin A., Varghese M.C. et al. Treatment of iunctional epidermolisis bullosa with epidermal autografts // J. Am. Acad. Dermatol. — 1987. Vol.17, N 2. - P. 248 - 250.

68. Chadially R., Brown B.E, Sequeira-Martin S.M. et al. The aged epidermal permeability barrier: Structurel, functional and lipid biochemical abnormalities in humans and a sensescent murine model // J. Clin. Invest. -1995. Vol. 95. - P. 2281-2286.

69. Chen X., Soejima K., Nozaki M. Accelerated angiogenesis in artificial dermis with allogenic cultured dermal fibroblasts transplantation // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 2004. - Vol. 18, N.3. - P.205-208.

70. Cristofalo V.J., Allen R.G., Pignolo R.J. et al. Relationship between donor age and the replicative lifespan of human cells in culture: a réévaluation. Proc Natl Acad Sci USA.- 1998. Vol.95, N18. - P.10614-10619.

71. Di Nicola M., Carlo-Stella C., Magni M. et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli // Blood. 2002. - Vol.99. - P. 3838-3843.

72. Diridollou S., Vienne M.-P., Ailbert M. et al. Efficacy of topical 0,05% retinaldehyde in skin aging by ultrasound and theological techniques // Dermatology. 1999. - Vol.199, N1. P.37—41.

73. Duncan D., Rubin J.P., Golitz L. et al. Refinement of technique in injection lipolysis based on scientific studies and clinical evaluation // Clin. Plast. Surg. -2009. Vol.36, N.2. - P.195-209.

74. Edvard M. Proteoglycans and glycosaminoglycans. Chichester, England, 1993. - P. 89-110.

75. Falanga V. Apligraf treatment of venous ulcers and other chronic wounds // J. Dermatol. 1998.-Vol. 25, N 12.-P. 812-817.

76. Falanga V., Margolis D., Alvarez O. Rapid healing of venous ulcers and lack of clinical rejection with an allogeneic cultured human skin eguivalent // Arch. Dermatol. 1998.-Vol.134, N3.-P. 293 -300.

77. Fitzpatrick R.E. Dermatology in general medicine: Int.ed.v.1,2.- 1999.

78. Fohn M., Bannasch H. Artificial skin // Methods Mol. Med. 2007. - P. 140. - P.167-182.

79. Freedman B.M. Hydradermabrasion: an innovative modality for nonablative facial rejuvenation // J. Cosmet. Dermatol. 2008. - Vol.7, N.4. - P.275-280.

80. Friedenstein A.J., Petrakova K.V., Kurolesova A.I., Frolova G.P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for octeogenic and hematopoeietic tissue // Transplantation. 1968. - Vol. 6. - P.230-247.

81. Gilchrest B.A. A rewiew of skin aging // J. Investig Dermatol Symp Proc. -1998. Vol.135, N.6. - P. 867 - 875.

82. Gniadecka M. Effects of aging on dermal echogenicity // Skin Res. Technol. -2001.-Vol.7, N.3.- P. 204-207.

83. Gotkin R.H., Samoff D.S., Cannarozzo G. et al. Ablative skin resurfacing with a novel microablative CO2 laser // J. Drugs Dermatol. — 2009. — Vol.8, N.2.-P.138-144.

84. Griffiths M. et al. Survival of Apligraf in acute human wounds // Tissue Eng. 2004.- Vol.10, N.7-8. - P. 1180-1195.

85. Griffits C.E. Drug treatment of photoaged skin // Druggs Aging. 1999. -Vol.14, N4. - P. 289—301.

86. Gueugniaud P.Y., Fabreguette A., Oddou I. et al. Use of biological film as a cultured epidermal autografts support in the treatment of burns: preliminary report of a new technigue // Ann. Burns Fire Disasters. 1997. - Vol.10, N 1. -P.33 -39.

87. Hansbrough J.F. Boyce S.T. et al. Burn wound closure with CAE & fibroblasts attached on to a collagen-glycosaminoglycan substrate // JAMA. -1989. Vol.262, N.15. - P.2125-2130.

88. Hansbrough J.F. Dermagraft-TC for partial-thickness burns: A clinical evaluation //J. Burn Care Rehabil. 1997. - Vol.18.- P.S25-S28.

89. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains //Exp cell res. 1961. - Vol.25. -P.585-621.

90. Hotta T., Yokoo S., Terashi H., Komori T. Clinical and histopathological analysis of healing process of intraoral reconstruction with ex vivo produced oral mucosa equivalent // Kobe J. Med. Sci. 2007. - Vol.53, N1-2. - P. 1-14.

91. Iorizzo M., De Padova M.P., Tosti A. Biorejuvenation: theory and practice. Clin Dermatol. 2008. - Vol.26. - N.2. - PJ77-181.

92. Kachhawa D., Kalla G. Keratinocyte-melanocyte graft technique followed by PUVA therapy for stable vitiligo // Indian J. Dermatol. Venereol. Leprol. — 2008. Vol.74, N.6. - P.622-624.

93. Kallrot M., Edlund U., Albertsson A.C. Surface functionalization of degradable polymers by covalent grafting // Biomaterials. 2006. - Vol.;27, N.9. -P.1788-1796.

94. Karabudak O., Dogan B., Baloglu H. Histologic evidence of new collagen formation using a Q-switched Nd:YAG laser in periorbital rhytids // J. Dermatolog. Treat. 2008. - Vol.19, N.5. -P.3 00-304.

95. Karasek M. In vitro culture of human skin epithelial cell // Invest. Dermatol. 1966. - Vol. 47, N 6. - P. 533-540.

96. Karasek M., Charlton M. Growth of postembrionic skin epithelial cells on collagen gels // J. Invest. Dermatol. 1971. - Vol. 56, N 2. - P. 205-210.

97. Kempiak S.J., Uebelhoer N. Superficial chemical peels and microdermabrasion for acne vulgaris // Semin. Cutan Med. Surg. 2008. — Vol.27, N.3. -P.212-220.

98. Lam P.K., Chan E.S., To E.W. et al. Development and evaluation of a new composite Laserskin graft // J. Trauma. 19.99. - Vol.47, N.5. - P.918-922.

99. Lang E., Schaefer B.M., Eikhoff U. Rapid normalization of epidermal integrin expression after allografting of human keratinocytes // J. Invest. Dermatol. 1996. - Vol.107, N 3.-P. 423-427.

100. Langdon R., Guono C., Birchall N. et al. Reconstitution of structure and cell function in human skin grafts derived from cryopreserved allogeneic dermis and autologous cultured kerotinocytes // J. Invest. Dermatol. 1988. -Vol. 91, N 5. - P.478-485.

101. Lavker R.M. Cutaneous aging: Chronologic versus photoaging. / In: Gilchrest B.A., ed. Photodamage. Cambridge: Blackwell Science, 1995.

102. Madden M.R., Finkelstein J.L, Stuino-Coico L. et al. Grafting of cultured allogenic epidermis on second-third-degree burn wounds on 25 patients // J. Trauma. 1986.-Vol. 26, N 11.-P. 955-962.

103. Majumdar M.K., Banks V., Peluso D.P., Morris E.A. Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells//J. Cell Physiol. 2000.- Vol.185, N.l. - P. 98106.

104. Matarasso A., Pfeifer T.M. Mesotherapy and injection lipolysis // Clin. Plast. Surg. 2009. - Vol.36, N.2. - P. 181-192.

105. Miller I.J., Gay S. Collagen structure and function / In: Wound Healing: biochemical and physical aspects. Philadelphia, Pa: W.B. Sanders. - 1992. -P. 130—151.

106. Moody B.R., McCarthy L.E., Hruza G.J. Collagen remodeling after 585-nm pulsed dye laser irradiation: an ultrasonographic analysis // Dermatol surgery. 2003. - Vol.29, N.10. - P.997.

107. Obagi Z.E. Obagi Skin Health. Restoration and rejuvenation. 1999. - P. 11—13.

108. O'Connor N. E., Mulliken J. B., Banks-Schlegel S., Kehinde 0., Green H. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologousepidermal cells // Lancet. 1981. - N.l. - P. 75-78.

109. Oh Chang-Keun, Cha Jung-Hoon, Lim Jae—Young et al. Treatment of vitiligo with suction epidermal grafting by the use of an ultrapuls C02 laser with a computerized pattern generator // J. Dermatol. Surg. 2001. - Vol. 27, N6.-P. 565-568.

110. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., et. al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells // Science. 1999. - Vol.284. - P. 143147.

111. Price R.D., Das-Gupta V., Harris P.A. et al. The role of allogenic fibroblasts in an acute wound healing model // Plast. Reconstr. Surg. 2004. -Vol.113, N.6.-P.1719-1729.

112. Puizina-Ivic N. Skin aging // Acta Dermatovenerol. Alp. Panonica Adriat. -2008. Vol.17, N.2. - P.47-54.

113. Qiao J., Philips E., Teumer J. A graft model for hair development // Exp. Dermatol. 2008. - Vol. 17, N.6. - P.512-518.

114. Querleux B., Leveque J-L., de Rigal J. In vivo image of the skin by ultrasonic technique / American Academy of dermatology: 46th meeting. — San Antonio. — December, 1987.

115. Rasulov M.F., Vasilchenkov A.V., Onishchenko N.A. et al. First experience of the use bone marrow mesenchymal stem cells for the treatment of a patient with deep skin burns // Bull. Exp. Biol. Med. 2005. - Vol.139, N.l. - P. 141144.

116. Riva F., Casasco A., Nespoli E. et al. Generation of human epidermal constructs on a collagen layer alone // Tissue Eng. — 2007/ Vol. 13, N. 11. -P.2769-2779.

117. Salvatori G, Lattanzi L, Coletta M et al. Myogenic conversion of mammalian fibroblasts induced by differentiating muscle cells // J. Cell Sci. — 1995.-Vol.108.-P.2733-2739.

118. Sandby-Moler J., Wult H.Ch. Ultrasonographic subepidermal low — ecnogenic band, dependence of age and body site // Skin Res. Technol. -2004.-Vol.10, N.l. P.57.

119. Sandulache V.C., Zhou Z., Sherman A. et al. Impact of transplanted fibroblasts on rabbit skin wounds // Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. -2003. Vol.129, N.3. - P.345-350.

120. Seidenari S., Pagnonini A., Di Nardo A., Gianetti A. Echographic evaluation with image analysis of normal skin: variation according age and sex // Skin Pharmacol. 1994. - Vol.7, N.3. - P. 201-209.

121. Serup J. Ten years experience with high-frequency ultrasound exanination of scin: development and refinement of techique and equipment. / In: Ultrasound in dermatology. Berlin - Heidelberg: Springer-Verlag, 1992.

122. Seshi B., Kumar S. Sellers D. Human bone marrow stromal cell: coexpression of markers specific for multiple mesenchymal cell lineages // Blood Cells, Molecules and Diseases. 2000. - Vol.26, N.3. - P. 234-246.

123. Smith D.J. Jr. Use of Biobrane in wound management // J. Burn Care Rehabil. 1995. - Vol.16, N3Pt 1.-P317-320.

124. Van Scott E.J., Yu R.J. Alpha hydroxy acids: therapeutic potentials // J. Dermatol. 1989. - Vol.1, N.5. - P. 108-112.

125. Vedamurthy M. Mesotherapy // Indian J. Dermatol. Venereol. Leprol. -2007. Vol.73, N. 1. - P.60-62.

126. Xiao S., Zhu S., Ma B. et al. A new system for cultivation of human keratinocytes on acellular dermal matrix substitute with the use of human fibroblast feeder layer // Cells Tissues Organs. 2008. - Vol.187, N.2. -P.123-130.

127. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies // Tissue Eng. 2001. - Vol.7. N.2.-P.211-228.