Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Физиологические и биохимические аспекты действия альфа-фетопротеина на гепатоциты и иммунокомпетентные клетки

РГБ

ОД

АНТОНОВ Виктор Георгиевич

На правах рукописи

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ

АСПЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА НА ГЕПАТОЦИТЫ И ИД1МУНОКОМ ПЕТЕНТНЫЕ КЛЕТКИ

14.00.17 — нормальная физиология 03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1097

Работа выполнена в Военно-медицинской академии

Научные консультанты: академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор В. С. Новиков, доктор медицинских наук, профессор А. И. Карпищенко.

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор К. П. Хансон.

доктор биологических наук, профессор А. Т. Марьянович, доктор медицинских наук, профессор Б. И. Клементьев.

Ведущее учреждение: Институт физиологии им. И. П. Павлова.

Защита диссертации состоится 22 сентября 1997 г. в чэсое

на заседании диссертационного совета Д 106.03.01 при Военно-медицинской академии (194044. С.-Петербург, ул. Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии.

Автореферат разослал ___'__' _ 1997 года

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор

В. Н. Александре!

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Альфа-фетопротеин (АФП) - один из основных белков эмбриональной сыворотки млекопитающих, который в крови взрослых присутствует в небольших количествах. Альфа-фетопротеин регулирует интенсивность пролиферации клеток печени в эмбриогенезе, при их физиологической и репаративной регенерации, злокачественном перерождении [Абелев Г.И., 1994; Шевцова А.И., 1995; Sarcione E.J., Hart D.,1985; Nunez E.A., 1994].

Зависимость пролиферирующих клеток печени от альфа-фетопротена доказана результатами опытов in vivo и in vitro. В эксперименте регенерация гепатоцитов после гибели части из них под действием четыреххлористого углерода или резекции печени, подавляется введением антител к альфа-фетопротеину. При гепатоцеллюлярном раке аналогичное воздействие приводит к регрессии опухоли [Deutsch Н. F., 1991; Laderoute М.Р., Pilarski L.M., 1994]. Введение альфа-фетопротеина в культуральную среду индуцирует размножение клеток печени, напротив, его удаление или замена на альбумин ингибирует пролиферативный процесс [Uriel J., 1989, Hoffmann В. et al., 1989, Yamamoto Т. et al., 1992].

В клинической практике отмечено, что официнальные препараты альбумина из ретроплацентарной сыворотки обладают значительно более высокой стимулирующей активностью процесса регенерации клеток печени, чем препараты альбумина полученного из донорской крови [Русанов В.М., Скобелев Л.И., 1983]. Показано, что подобная терапевтическая активность препаратов альбумина из ретроплацентарной сыворотки находится в сильной зависимости от количества в них альфа-фетопротеина [Мирошников В.М. и др., 1987; Коханов A.B. и др., 1984, 1988].

Изученные функции альфа-фетопротеина в период эмбриогенеза и при канцерогенезе, в полной мере не позволяют объяснить механизм его стимулирующего действия на размножение гепатоцитов. Предположение о влиянии альфа-фетопротеина в период эмбриогенеза на пролиферацию гепатоцитов через связывание эстрогенов матери, транспорт ненасыщенных жирных кислот (НЭЖК) и других соединений [Geuskens М. et al., 1989; Uriel J., 1989; Torres J.M. et al., 1991] не согласуется с целым рядом экспериментальных фактов. В частности, низкое

сродство альфа-фетопротеина человека и приматов к эстрогенам [Абелев Г.П., 1994; Christiansen M. et al., 1993] и обнаружение АФП у филогенетически более древних по сравнению с млекопитающими животных, развивающихся без гормонального контакта с матерью [Коханов A.B. и др., 1988], свидетельствует о том, что в регуляции размножения клеток печени связывание эстрогенов альфа-фетопротеином не играет существенной роли. При культивировании гепатоцитов замена альфа-фетопротеина на близкородственный в структурном и, значительной степени, функциональном отношении белок - альбумин не сказывается на внутриклеточном содержании НЭЖК, но ингибирует пролифератив-ный процесс [Deutsch H. F., 1991].

Приведенные факты дают основание предполагать, что роль аль-фа-фетопротеина в пролиферации клеток печени как in vivo, так и in vitro не сводится к транспортной активности белка, а имеет иную природу. Новые подходы к исследованию функциональной активности белков, складывающиеся в молекулярной физиологии, позволяют в ином ключе проанализировать факты относительно зависимости пролифера-тивных реакций от альфа-фетопротеина.

Результаты изучения обмена веществ в пролиферирующих клетках свидетельствуют о наличии значительного количества отличий их метаболизма по сравнению с метаболизмом дифференцированных клеток. Однако широкий спектр особенностей обмена веществ при пролиферации клеток имеет важную закономерность, связанную с определяющей ролью в его формировании уровня интенсивности гликолитиче-ского процесса и внемитохондриальных реакций утилизации кислорода ILUanoT С. В., 1975; Хочачка П., Сомеро Дж., 1988; Вольский H.H. и др., 1988; Вартанян Л.С. и др., 1992; Марри Р. и др., 1993]. Развитие проли-феративного процесса in vivo требует также нейтрализации функций ряда клеток иммунной системы [Бабаева А.Б., 1985; Ширшев C.B., 1993 ].

Регуляторная активность альфа-фетопротеина в отношении гликолиза и внемитохондриальных реакций утилизации кислорода в пролиферирующих клетках частично изучена. В частности обнаружено, что увеличение активности анодных изоферментов лактатдегидрогена-зы при гепатоцелюлярном раке корреллирует с уровнем альфа-фетопротеина [Kalpaxis D.L., Giannoulaki Е.Е., 1989]. Показано, что действие альфа-фетопротеина на тропные клетки приводит к увеличению продукции АТФ в реакциях гликолиза и ингибирует активность цикло-

оксигеназы, одного из ферментов внемитохондриальных реакций утилизации кислорода [Карелин A.A. и др., 1997; Aussei С., Fehlman М., 1987]. Однако практически не исследованы эффекты альфа-фетопротеина относительно более мощных внемитохондриальных систем утилизации кислорода - цитохрома Р-450 и ксантиноксидазы (КСО). Не вполне понятны особенности механизмов регенерации NAD для гликолиза при увеличении в них продукции АТФ под действием альфа-фетопротеина. Пролиферирующие клетки, в их числе и гепатоциты, характеризуются низкой функциональной активностью митохондрий, где при сбалансированном метаболизме идет в основном окисление NADH, но они с высокой скоростью поглощают из внеклеточной среды молочную кислоту и затрачивают NAD для ее превращения в пируват [Островский Ю.М. и др., 1984; Хочачка П., Сомеро Дж., 1988]. В этой связи нельзя исключить, что окисление NADH осуществляется во внемитохондриальных реакциях утилизации кислорода, однако механизм и структура этого процесса не вполне ясны.

С депрессивным действием альфа-фетопртеина на функции Т-хелперов, реагирующих с конканавалином А, связывают формирование благоприятного иммунного фона для пролиферации клеток печени при канцерогенезе [Коханов A.B. и др., 1988; Kucharz Е. L., 1990], но нет ясности относительно комплекса биохимических реакций, реализующих регуляторное действие альфа-фетопротеина на иммунокомпетентные клетки определенного типа .

Исследование регуляторной активности альфа-фетопротеина в отношении гликолитического процесса и внемитохондриальных процессов утилизации кислорода в гепатоцитах, затруднено рядом обстоятельств, среди которых следует отметить гетерогенность его молекулярных форм: тестируется от 7 до 14 изоформ АФП [Абелев Г.И., 1994; Breborowicz J., 1988; Ishiguro Т., Yashida Y., 1991; Seregni E. et al., 1995]; лабильность физиологически активных форм белка при их получении в очищенном виде [Abramski О. et al., 1982]; трудоемкость работы по очистке белка; несовершенство методов определения физиологической активности изоформ АФП. Комплексом этих же причин обусловлена сложность изучения биохимических механизмов иммуномодули-рующей активности альфа-фетопротеина.

Знание механизмов регуляторного действия альфа-

фетопротеина на интенсивность пролиферативного процесса гепато-2 3,Si6

цитов может дать ключ для целенаправленной разработки принципиально новых фармакологических препаратов, стимулирующих регенеративный процесс или, напротив, средств для профилактики и лечения раковых заболеваний.

Цепь исследования. Целью настоящей работы явилось изучение регуляторной активности альфа-фетопротеина в отношении гликолити-ческого процесса и внемитохондриальных реакций утилизации кислорода в гепатоцитах, механизмов иммуномодулирующего действия белка на тимоциты.

Задачи исследования:

1. Разработать метод выделения физиологически активных изоформ альфа-фетопротеина из различного биоматериала.

2. Выявить уровни физиологической активности у различных изо-форм альфа-фетопротеина.

3. Исследовать интенсивность гликолитического процесса, особенности распределения изоферментов лактатдегидрогеназы в клетках печени in vivo при действии на них изоформ альфа-фетопротеина, обладающих выраженной физиологической активностью.

4. Изучить характер изменения содержания и активности ведущих внемитохондриальных систем утилизации кислорода - цитохрома Р-450 и ксантиноксидазы в клетках печени in vivo при действии изоформ альфа-фетопротеина, обладающих выраженной физиологической активностью.

5. Определить закономерности окислениния NADH во внемитохондриальных реакциях утилизации кислорода.

6. Выяснить в эксперименте динамику изменения уровня маркеров апоптоза в тимоцитах, тройных к действию с альфа-фетопртеина и выявить возможные биохимические механизмы ее определяющие.

7. Оценить терапевтическое действие альфа-фетопротеина на характер развития восстановительных процессов при аллиловом гепатите.

Научная новизна. Впервые выполнен комплекс экспериментальных исследований, позволивший получить изоформы альфа-фетопротеина, обладающие выраженной физиологической активностью и выявить их регупяторное действие в отношении гликолитического про-

цесса и внемитохондриальных реакции утилизации кислорода в гепато-цитах. Установлено, что изоформы альфа-фетопротеина, обладающие выраженной физиологической активностью имеют изоэлектрические точки в диапазоне рН = 4.1 - 4.4, насыщены неэстерифицированными жирными кислотами, с длиной углеродной цепи от C1S до С22 и отличаются количеством гидрофобных участков. Выявлено, что действие на клетки печени изоформ альфа-фетопротеина, обладающих выраженной физиологической активностью, приводит к увеличению содержания в них изофермента лактатдегидрогеназы - ЛДГз до уровня, характерного для гепатоцитов в эмбриональный период развития. Показано, что действие альфа-фетопротеина на клетки печени увеличивает интенсивность цианидрезистентного дыхания, обусловленного преимущественно активностью кислородзависимой формы ксантиноксидазы (О-форма КСО), катализирущей окисление NADH до NAD. Установлено, что катализируемое ксантиноксидазой и сопутствующая окислению пуринового субстрата регенерация NAD дозазависимо активируется восстановленной формой пиридиннуклеотида в диапазоне концентраций 0.01 - 0.15 ммоль/л, ионами железа (Fe3+) при концентрациях от 0.1 до 10 мкмоль/л. Стимуляция окисления NADH ингибируется супероксиддисмутазой и не зависит от активности каталазы. Предложена схема реакций цепного окисления NADH до NAD с участием пуринового субстрата, проокси-дантной формы ксантиноксидазы, ионов железа и супероксидного анион радикала. Расчитано, что цепная реакция утилизации молекулы кислорода обеспечивает окисление двух молекул NADH. Доказано, что про-оксидантная активность ксантиноксидазы обеспечивает образование NAD из NADH для реакций гликолиза. Обоснована физиологическая значимость механизма прооксидантно индуцируемой регенерации NAD для гликолиза в пролиферирующих и дифференцированных клетках печени. Показано, что действие на тимоциты, реагирующие с конканава-лином А, изоформ альфа-фетопротеина, обладающих выраженной физиологической активностью, приводит к увеличению количества одно- и двунитевых разрывов ДНК, продуктов межнуклеосомной фрагментации хроматина, свидетельствующих о более высокой интенсивности в этой группе клеток реакций развития апоптоза. Выявлено, что при аллиловом гепатите альфа-фетопротеин оказывает стимулирующее действие на клетки печени, сокращая сроки развития реакций цитолиза и нормализации обмена веществ в гепатоцитах . г *

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые получены данные о молекулярных механизмах регуляторной активности альфа-фетопротеина в отношении гликолитического процесса и внеми-тохондриальных реакций утилизации кислорода. Показано, что изофор-мы альфа-фетопротеина, насыщенные неэстерифицированными жирными кислотами с длиной углеродной цепи от C1S до С22 и имеющие изоэлектрические точки в диапазоне рН = 4.1 - 4.4, обладают регуляторной активностью в отношении реакций гликолиза и цианидрезистент-ного дыхания. Установлено, что формируемые в гепатоцитах особенности активностей реакций гликолиза и внемитохондриального дыхания при действии на них альфа-фетопротеина направлены на увеличение синтеза гликолитической АТФ, стабилизацию уровня пирувата и элиминацию лактата. Предложен механизм прооксидантно индуцируемой регенерации NAD для гликолиза, отражающий взаимосвязь внеми-тохондриальных реакций утилизации кислорода и синтеза АТФ. Отмечено, что регуляторная активность альфа-фетопротеина в отношении реагирующих с ним клеток тимуса, может быть связана с ускоренной их элиминацией по механизму апоптоза. Выявлена активность альфа-фетопротеина как биостимулятора при аллиловом гепатите.

Для практического здравоохранения предложен:

1) способ фракционирования белков из биоматериала, загрязненного гемоглобином, гемопигментами, микробными и тканевыми белками;

2) чувствительный метод оценки лимфоцитолитического действия веществ.

Представленные рекомендации следует использовать при получении высокоочищенных белковых препаратов крови, а также в исследованиях, касающихся оценки лимфоцитолитического действия фармакологических средств.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Регуляторной активностью в отношении реакций гликолиза и внемитохондриального дыхания в гепатоцитах обладают изоформы альфа-фетопротеина, насыщенные неэстерифицированными жирнымv кислотами с длиной углеродной цепи от C1S до С22 и имеющие изоэлектрические точки в диапазоне рН = 4.1 - 4.4.

2. Регуляторное влияние альфа-фетопротеина на ключевой биоэнергетический процесс в период пролиферации гепатоцитов - гликолиз, выражается в увеличении активности изофермента лактатдегидроге-назы - ЛДГз, возрастании уровня пирувата и снижении содержания пактата.

3. Регуляторное действие альфа-фетопротеина на ведущие реакции внемитохондриального дыхания в гепатоцитах, связанные с активностями цитохрома Р-4Ь0 и ксантиноксидазы, приводит к перераспределению активности между ними в пользу О-формы КСО и инициацией с ее участием цепного механизма регенерации NAD для гликолиза.

4. Действие альфа-фетопротеина на клетки тимуса, реагирующие с конканавалином А, обусловливает увеличение в них интенсивности реакций образования высокомолекулярных фрагментов хроматина.

Реализация и апробация работы. Результаты исследования реализованы в "Программах лабораторной диагностики" (М., 1990), учебно-методическом пособии "Онкомаркеры, их использование в диагностической практике" (публикация в IV квартале 1997), лекции "Биохимия печени" (публикация в IV квартале 1997), практикуме для факультета подготовки врачей ВМедА (публикация в III квартале 1997), учебно-методическом пособии для врачей лаборантов (принято к публикации в I квартале 1998), учебнике по клинической биохимии для медицинских вузов (публикация в 1998).

Теоретические и практические результаты исследований используются в учебном процессе на кафедрах токсикологии и медицинской защиты, акушерства и гинекологии, клинической биохимии и лабораторной диагностики Военно-медицинской академии.

Основные положения работы обобщены и доложены на III Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1989), десятом объединенном симпозиуме биохимических обществ (Ташкент, 1939), I Российском биохимическом съезде (Ленинград, 1992 г.), V и VII конференциях по актуальным вопросам клиники, диагностики и лечения (Санкт-Петербург, 1995, 1997), III Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996), объединенном симпозиуме лабораторных обществ (Санкт-Петербург, 1996), II Российском биохимическом съезде (Москва, 1997 г.), XXXIII международном конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997). 3i. S -i6

Структура и ооьсм дисссргации. Диссертация изложена па2i0 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методик исследования, пяти глав с описанием полученных результатов и их обсуждением, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 95 отечественных источников и 172 зарубежных. Работа иллюстрирована 7 таблицами н 33 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования.

Выделение альфа-фетопротеина проводили из амниотической жидкости (материал получали из клиники "Акушерства и гинекологии" ВМе-дА). Исходный биоматериал содержал продукты гемолиза эритроцитов, сгустки фибрина, флоттирующие частицы, примесь форменных элементов крови. Жидкую компоненту биоматериала, содержащую АФП, отделяли от плотных частиц центрифугированием при 12х103 д. Осадок в последующем не использовался.

Определение содержания альфа-фетопротеина осуществляли твердофазным иммуноферментным методом, основанном на принципе "сендвича" { Schiller H.S. et al., 1978; Sell S., 1990) с использованием набора реактивов фирмы "Диаплюс" "Россия".

Определение чистоты и молекулярной массы полученного белка проводили методом электрофореза в присутствии ДСН с использованием буферной системы . Laemmli (1970) и гель-фильтрации на колонке "SUPEROSE 6 HR 10/30" фирмы "Pharmacia LKB, Biotechnology Inc' (Швеция). Хроматографический процесс при умеренном давление осуществляли на хроматографе "FPLS" той же фирмы.. Изоэлектри ческую точку альфа-фетопротеина определяли методами хроматофоку сирования и изоэлектрофокусирования. Изоэлектрофокусирование t хроматофокусирование выполнено на соответствующем оборудованш фирмы "Pharmacia LKB, Biotechnology Inc" (Швеция) в соответствии с ре комендациями изготовителя.

Экстрагирование жирных кислот, ассоциированных с альфа фетопротеином, осуществляли по методу Фольча (1957). Газохромато графический анализ выполняли на сорбенте Gas Chrom Q с использова

нием газового хроматографа "Цвет-570" с пламенно-ионизационным детектором в режиме программирования температуры.

Работа по изучению регуляторной активности альфа-фетопротеина выполнена на 350 белых беспородных крысах-самцах массой 180-200 г. Апьфа-фетопротеин вводили ежедневно, внутрибрюшинно на изотоническом растворе, из расчета 0.25 мг/кг массы животного. Контрольных групп животных было две. Первой группе контрольных животных (контроль 1) вводили ежедневно внутрибрюшинно альбумин на изотоническом растворе из расчета 0.25 мг/кг массы животного, в объеме, равном объему вводимого апьфа-фетопротеина. Альбумин получали из того же биоматериала, что и альфа-фетопротеин. Белки разделялись на заключительной стадии очистки альфа-фетопротеина, который в отличие от альбумина не связывался с голубой сефарозой. Связавшийся с голубой сефарозой альбумин элюировали 0.5 М раствором МаС1). Второй группе контрольных животных (контроль 2) вводили ежедневно, внутрибрюшинно изотонический раствор в объеме, равном объему вводимого альфа-фетопротеина (альбумина).

При отсутствии различий тестируемых показателей в контрольных группах между собой в тексте приводится лишь значение контроля 1.

Животных использовали в опытах на 1, 2, 3, 5 и 7 сутки после экспериментального воздействия. Под эфирным наркозом вскрывали левую подключичную артерию и собирали кровь в центрифужную пробирку. Печень извлекали после ее перфузии через верхнюю полую вену охлажденным 0,15 М раствором КСЦрН 7,8) до полного удаления крови. Приготовление срезов ткани печени, толщиной 1 мм и массой 90 - 100, мг для измерения интенсивности поглощения кислорода в аппарате Вар-бурга проводилось по методике, изложенной В.В.Умбрейт и соавт. (1951). Экспериментальный гепатит вызывали внутрижелудочным введением через зонд 1% аллилового спирта в 0.9% растворе ЫаС1 в дозе 1.5 мл/кг веса. Альфа-фетопротеин животным с аллилсвым гепатитом вводили как сказано выше. Животных использовали в опытах на 1, 5, 10, 15 и 20 сутки после экспериментального воздействия.

Тимус извлекали нижнегрудным доступом, очищали от соединительной ткани, жира и близлежащих лимфоузлов, промывали свежеприготовленным 0.25 М раствором сахарозы комнатной температуры, высушивали фильтровальной бумагой и взвешивали.

3 *Г

Для исследования содержания пирувата, лактата, гипоксантина, ксантина и мочевой кислоты печень животных после перфузии замораживали in situ, охлажденными в жидком азоте щипцами Волленбергера, извлекали из брюшной полости и хранили в жидком азоте до исследования. Тимоциты выдавливали в стеклянном гомогенизаторе поступательными движениями стеклянного пестика (зазор между пестиком и корпусом гомогенизатора 0.3 мм) в раствор среды 199 комнатной температуры. Объем среды 199 на этом этапе брали, исходя из соотношения 10 мл среды на 100 мг массы ткани тимуса. Полученную клеточную суспензию фильтровали через три слоя капронового фильтра и центрифугировали при 1.5х103д в течение 15 мин. Цитозольную и микросомальную фракции из клеток печени выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования [Биологические мембраны. Методы, 1990]. Гомогенат подвергали центрифугированию при 12х103д, температуре 4° С в течение 25 мин. Постмитохондриальный супернатант центрифугировали npf 105x103 д, температуре 4° С в течение 60 мин на ультрацентрифуге фирмы "Beckman" (США). Цитозольную фракцию использовали дл; определения активности лактатдегидрогеназы, ксантиноксидазы, катала зы и супероксиддисмутазы.

Полученный осадок микросом ресуспендировали в среде выделе ния и подвергали повторному осаждению в тех же условиях. Осадок мик росом в последующем использовался для измерения содержания цито хрома Р-450 по методу T.Omura, R.Sato (1964) на спектрофотометре "DU 50" фирмы "Beckman" (США).

Количество погибших клеток определяли по поглощению клеткам трипанового синего [Конки Д. и др., 1989]. Выделение ядер тимоцито проводили по методу, изложенному Д.Б.Финдлея и У.Г. Эванзом (1990 Продукты межнуклеосомной фрагментации хроматина (ПДН) экстрэгирс вали из ядер тимоцитов, ресуспендируя их осадок в растворе 7*10"4 I ЭДТА (рН = 7.2). Количество разрывов ДНК определяли по методу Н С Biriboim, J.Jevcok (1981).

Поглощение кислорода срезами ткани печени определяли Maui метрическим методом на аппарате Варбурга [Умбрейт В.В. и др., 1951]. качестве среды инкубации использовали раствор Кребса-Рингера (КР<1 Раствор готовили непосредственно перед экспериментом, в него допо нительно вносили глюкозу и инсулин из расчета 10 ммоль/л и 5 мкг/и соответственно.

Активность ксантиноксидазы определяли по скорости прироста мочевой кислоты, образующейся при окислении ксантина в присутствии и отсутствии NAD в составе среды инкубации (метод Stirpe, D.Corte в модификации Z.W.Kaminsky, M.M.Jezewska (1979)). Кинетические параметры D- и О-форм КСО - константу Михаэлиса (Км), максимальную скорость (Vmax) и отношение КмЛ/мах, определяли по методу Хейнса [Келети Т., 1990].

Активность каталаэы определяли по скорости разложе-ния перекиси водорода, поглощающей при длине волны 240 нм [Tayarami J. et al., 1987].

Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли методом, основанном на ингибирующем действии СОД восстановления HCT супероксидным анион радикалом, генерируемым в системе: ксантин - ксанти-ноксидаза [Beyer W.V., Fridovich I., 1987].

При выборе условий для определения активности лактатдегидроге-назы (ЛДГ) в цитозольной фракции гепатоцитов руководствовались литературными данными об оптимальных условиях для определения ЛДГ в ткани печени [Цапко Л.И., Усатенко М.С., 1973; Bergmeyer H.U., 1985 J.

Для определения изоферментов ЛДГ в цитозольной фракции клеток печени использовали энзимэлектрофорез [Корочкин Г.К. 1977]. Кинетические параметры лактатдегидрогеназы - константу Михаэлиса (Км), максимальную скорость (Vmax) и отношение Км/Vmax, определяли для реакций восстановления пирувата и окисления лактата по методу Эйзенталя -Корниш-Боуден [Келети Т. 1990]. Содержание цитохрома Р-450 определяли по методу T.Omura и R.Sato (1964).

Содержание молонового диальдегида (МДА) в том о re нате печени крыс определяли по методу, предложенному М. Uchiyama и М. Michara (1978).

Количество пировиноградной и молочной кислот определяли энзи-матическими методами с использованием ЛДГ [Bergmeyer H.U., 1970].

Содержание гипоксантина и ксантина рассчитывали по количеству окисленного нитросинего теразошя супероксидным анион-радикалом [Bergmeyer H.U., 1970].

Содержание белка в гомогенатах тканей определяли по методу Y.R.Schachterle и R.L.Pollack (1973).

Значения биохимических показателей: общего билирубина, общего белка, альбумина, глобулина, мочевой кислоты, мочевины, аланинами-

Ч 3. & {£

нотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрасферазы (ACT), гаммаглюта-мнлтранс-пептидазы (ГГПТ), железа в сыворотке крови крыс определяли на биохимическом анализаторе "SPECTRUM Т 0-11" фирмы "ABBOT" (США) в центральной клинико-диагностической лаборатории ВМедА, используя соответствующие фирменные наборы реактивов.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ для ПЭВМ - "Statgraphics". Она включала расчеты средней арифметической (М), ее стандартной ошибки (т). Достоверность различий между полученными показателями в сравниваемых группах оценивали с помощью t критерия Стьюдента [Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., 1975; Малета Ю.С., Тарасов В.В., 1982].

Результаты исследования и их обсуждение.

Получение изоформ альфа-фетопротеина. Альфа-фетопротеин получали из амниотической жидкости, содержащей пуповинную кровь, гемоглобин и гемопигменты.

Удаление НЬ и ряда сопутствующих белков из биоматериала достигали нагреванием его до 68°С с этанолом (10%) и каприлатом Na (0.004 М). Значение рН 6.5 стабилизировали 0.05 М К-фосфатным буфером (буфер А). При достижении 68°С смесь быстро охлаждали до 10-12°С и центрифугировали при 20*103д 15 мин. Для перевода гемопиг-ментов в растворимую форму супернатант инкубировали 5 часов в холодильнике, добавив Н2О2 до 6%. Затем его центрифугировали при 20*103д 10 минут. К надосадочной жидкости добавляли раствор сульфата аммония (СА) с рН 6.5 до 50% насыщения, инкубировали при 4°С 20 мин и центрифугировали при 20*103д 10 мин. Супернатант наносили на колонку с фенилсефарозой (5.0x50 см), уравновешенную буфером А с 2М СА. Промывали носитель К-фосфатным буфером рН 5.0 с 2№ СА (3 объема колонки) и потом без него, до смещения пера самописца к базовой линии при >.=280 нм (развертка шкалы монитора - 0.5 ед. абсорбции). Скорость подачи растворов составляла 1.5 мл/мин. Связавшиеся белки элюировали буфером А.. Элюат содержал помимо АФП - альбумин, который удалили на колонке с голубой сефарозой (2.6x10.0см). Для чего носитель уравновешивали буфером А, наносили материал (0.3 мл/мин) и собирали не связавшийся белок. Выход АФП составил 77%, при очистке в 1500 раз. Полученный белок имел молекулярную массу 64 000 дальтон

(рис.1), был представлен 14 изоформами, которые тестировались при разделении белка методами изоэлектрофокусирования и хроматофоку-сирования. Множество изоформ АФП, они группировались в двух областях рН = 4.1 -4.4 и 4.8 - 5.2 (рис.2).

Спектр жирных кислот, ассоциированных с изоформами альфа-фетопротеина, имеющими pi 4.8 - 5.2 и pi 4.1 - 4.4, представлен на рис.За и ЗЬ соответственно. Количество белка для экстракции жирных кислот было одинаковым в обоих случаях. Очевидно, что белок с pi 4.1 -4.4 имеет более высокое содержание ассоциированных ненасыщенных жирных кислот (НЭЖК) 20 : 1 и 20 ; 4 ( на рис.За и ЗЬ заштрихованы). Полученные результаты соответствуют данным, представленным в литературе [Deutsch Н. F., 1991]. Микропрепаративное выделение изоформ, очищенного альфа-фетопротеина с р! 4.8 - 5.2 и pi 4.1 - 4.4, проведено на анионообменной колонке "MONO Q HR 5/5" фирмы "Pharmacia LKB, Biotechnology Inc." Колонку уравновешивали 0.05 М К-фосфатным буфером с рН 6.5 (буфер А). Раствор очищенного белка наносили на колонку (количество нанесенного в растворе альфа-фетопротеина составляло 25 мг). После чего носитель промывали тремя объемами буфера А. Эпюцию сорбированного белка вели линейным градиентом 0 - 0.3 М раствора NaCI на буфере А, в течение 20 мин. Скорость подачи растворов составляла 1.0 мл/мин. Детектирование на выходе колонки осуществляли на длине волны 280 нм при развертке шкалы 1.0 в режиме поглощения. Профиль элюции изоформ альфа-фетопротеина представлен на рис.4. Работу по получению микропрепаративных количеств изоформ альфа-фетопротеина вели на хроматографической системе "FPLS" фирмы "Pharmacia LKB, Biotechnology Inc.".

Полученные изоформы альфа-фетопротеина использовались в дальнейшем для изучения их регуляторной активности в отношении гли-колитического процесса и внемитохондриальных реакций утилизации кислорода.

Исследование регуляторного действия изоформ альфа-фетопротеина в отношении гпиколитического процесса и внемитохондриальных реакций утилизации кислорода. При парентеральном введении обоих групп изоформ альфа-фетопротеина крысам из расчета 0.25 мг/кг массы тела и альбумина и физраствора двум группам контроля, увеличение уровня мочевой кислоты на 20-30%, концентрации железа, пере-

Рис.1. Разделение на ДСИ ПАЛГе очищенного альфа-фегоиро-теина (А) и смеси белков (В) известной молекулярной массы (М\У).

Рис.2. Разделение изоформ альфа-фетопротешга методом хроматофокусирования на носителе "MONO Р".

5 3 .216

Рис.3. Спектр жирных кислот, ассоциированных сизоформами ал ьфа-фето протеин а, имеющими р! 4.8 - 5.2 (А) и 4.1 - 4.4 (В).

го Oas

Объем (мл)

Рис.4. Разделение на носителе "MONO Q" изоформ альфа-фстопротенна, имеющих pi 4.8 - 5.2 (А) и 4.1 - 4.4 (В).

s*-

распределения активности ЛДГ в пользу ЛДГз, ЛДГ4 и ЛДГ5 и двукратное снижение активности АЛТ на 3, 5, 7 сутки обнаружено лишь в группе животных, которым вводили изоформы АФП с pi 4.1 - 4.4.

Исследование общей активности ЛДГ в цитозольной фракции клеток печени крыс опытной и контрольной групп, не позволило выявить достоверных отличий. Так общая активность ЛДГ в цитозольной фракции гепатоцитов контрольной и опытной серий на седьмые сутки эксперимента составила 0.81 + 0.09 mU/мг белка и 0.77 + 0.07 mU/мг белка (р<0.05) соответсвенно. Несмотря на близкие значения цифр общей активности лактатдегидрогеназы, кинетические константы фермента из цитозольной фракции клеток печени крыс опытной серии, отличались от таковых из цитозольной фракции гепатоцитов контрольной серии животных в реакциях восстановления пирувата и окисления лактата. При введении аль-фа-фетопротеина имеет место увеличение сродства фермента к лактату более, чем в два раза. Константа Михаэлиса (Км) ЛДГ из цитозольной фракции гепатоцитов животных экспериментальной группы равнялась 2.3

* 10"3 М , тогда как ЛДГ из цитозольной фракции клеток печени контрольной группы имело значение Км = 4.9 * 10'3 М. Сродство лактатдегидрогеназы к пирувату в клетках печени опытной и контрольной групп также изменялось. Величина Км в них соответстенно равнялась 3.1 * 10"4 М и 5.0

* Ю"4 М. Разделение изоферментов ЛДГ из цитозольной фракции клеток печени животных контрольной и опытной групп представлено на рис. 5.

Очевидно, что особенностью изоферментного спектра лактатдегидрогеназы из цитозольной фракции гепатоцитов животных, которым вводили изоформы альфа-фетопротеина с р! 4.1 -4.4, является прирост ЛДГз. Подобное распределение изоферментов ЛДГ установлено на ранних стадиях эмбриогенеза, когда наибольшая активность лактатдегидрогеназы в клетках печени также связана с ЛДГз ■

Физиологическую целесообразность преобладания ЛДГ3 объясняют особенностями ее кинетических констант. В частности степень сродства ЛДГз к пирувату обеспечивает сбалансированное его использование в пролиферирующих клетках между реакциями биосинтеза пуриновых, пи-римидиновых оснований, аминокислот, других важных метаболитов и процессом регенерации NAD из NADH для гликолиза, связанным с восстановлением пирувата в лактат при участии лактатдегидрогеназы [Нъюсхолм Э., Старт К., 1977]. В сравнении с изоформой ЛДГз, низкое сродство к пирувату изоэнзимов ЛДП и ЛДГг не позволяет эффективно

лдг5 лдг4 лдг, лдг, яд г,

Рис.5. Спектр изоферментов лактатдегндрогеназы «з клеток печени контрольной (а) и опытной (Ь) групп.

восстанавливать его и окислять NADH, напротив, значительно более высокое сродство изоформ ЛДГ4 и ЛДГ5 обеспечивает отток пирувата из биосинтетических процессов на регенерацию NAD. Зависимость процессов синтеза ДНК и РНК от АТФ и пирувата, образующихся в реакциях гликолиза, требует относительно высокой и стабильной их концентрации [Марри Р. и др., 1993; Островский Ю.М. и др., 1984; Хочачка П., Сомеро Дж., 1988; Wang T. et al., 1976]. Инициируемое введением альфа-фетопротеина перераспределение активности лактатдегидрогеназы в пользу ЛДГз позволяет предполагать наличие особенностей обмена конечных метаболитов гликолиза, подобное их обмену в эмбриональный период развития. В частности, стационарный уровень пирувата в эмбриональных клетках поддерживается, среди прочих источников, за счет окисления молочной кислоты в пировиноградную [Хочачка П., Сомеро Дж., 1988].

Элиминация лактата из крови и последующее его окисление в пи-руват в эмбриональный период развития значимо и потому, что молочная кислота, начиная с определенных концентраций, способна ингибиро-вать пролиферативный процесс [Мусил Я., 1985]. В этой связи можно предположить, что сродство ЛДГ3 к лактату, усредненное между ЛДГ-,, ЛДГ2с одной стороны и ЛДГ4, ЛДГ5 с другой стороны [Островский Ю.М. и др., 1984], позволяет стабилизировать уровень молочной кисло ты в этих условиях более эффективно, чем другие изоферменты лактатдегидрогеназы.

Связанное с введением альфа-фетопротеина перераспределение активности ЛДГ между различными изоформами отразилось на содержании пировиноградной и молочной кислот в ткани печени. Так удельное содержание пирувата и лактата в ткани печени экспериментальной группы животных на седьмые сутки составило 0.370 + 0.043 мкмоль/г ткани и 4.40 + 0.47 мкмоль/г ткани (р<0.05) соответсвенно. Удельная концентрация пирувата и лактата в ткани печени контрольной группы животных соответственно ровнялось 0.28 ± 0.031 мкмоль/г ткани и 4.84 + 0.51 мкмоль/г ткани (р<0.05). Уровень пирувата в ткани печени экспериментальной группы практически на 40 % превышал таковой в контроле. Относительно концентрации лактата можно говорить лишь о некоторой тенденции снижения его количества в ткани печени при введении альфа-фетопротеина.

Уровень пирувата и лактата в ткани позволяет расчитать соотношение NAD/NADH в цитозоле [Williamson D.H. et al., 1967]. Расчитанная по методике Williamson D.H. и соавт. (1967) величина соотношения NAD/NADH в цитозоле клеток печени при введении альфа-фетопротеина составила 757 + 92 единицы (р<0.05). Аналогичный показатель в клетках печени контрольной группы составил 521 ± 57 единиц (р<0.05).

Регенерация NAD для гиколиза в условиях эксперимента может быть связана с митохондриальными реакциями утилизации кислорода [Марри Р. и др., 1993]. Однако эмбриональные клетки имеют слаборазвитые митохондрии и низкое напряжение кислорода [Хочачка П., Сомеро Дж., 1988]. Низкий окислительный потенциал митохондрий в этих условиях компенсируется высокой интенсивностью реакций свободнорадикального окисления в цитозоле [Вартанян Л.С. и др., 1992]. В этой связи возникает вопрос о конкретных биохимических реакциях, формирующих внемито-хондриаль-ный окислительный потенциал цитозоля эмбриональных клеток. Одна из таких ферментативных реакций цитозоля может быть связана с окислением луринового субстрата до мочевой кислоты при участии ксантиноксидазы. В ее пользу свидетельствует факт увеличения уровня мочевой кислоты в сыворотке крови при введении альфа-фетопротеина, указывающий на возможную мобилизацию прооксидантной активности ксантиноксидазы в клетках печени. Однако нельзя исключить вклад и других внемитохондриальных кислородзависимых процессов, связанных, например, с активностью цитохрома Р-450. Образующиеся в них активные формы кислорода способны окислять NADH до NAD [Bemofsky С., Wanda S.Y. 1982; Liochev S. et al., 1989], что дает основание экспериментально проверить возможный вклад внемитохондриальных кислородзависимых процессов в формировании, наряду с ЛДГ, стационарного уровня окисленной формы пиридиннуклеотида для реакций гликолиза.

Исследование активности ксантиноксидазы и ее кислород (О-форма) и NAD (D-форма) зависимых единиц в цитозольной фракции клеток печени крысы позволило установить некоторые особенности функциональной активности фермента. Увеличение активности ксантиноксидазы в опытной группе начиналось на третьи сутки и стабилизировалось на более высоком уровне с четвертого дня эксперимента. Значения активности D-и О- форм ксантиноксидазы в ней составили 116.2 + 12.1 mU/r белка и 45.8 + 3.9 mU/r белка (р<0.05) соответственно. Величина аналогичных по-

казателей контрольной группы была гораздо ниже и равнялась 86.0 + 10.3 mll/r белка (р<0.05) для D-формы КСО и 31.2 + 2.8 mU/r белка (р<0.05) у О-формы фермента.

Возрастание активности ферментов КСО в гепатоцитах происходило в условиях снижения активности СОД в пределах 30 - 40 % содержания (в пределах 15%) цитохрома Р-450 и увеличения активности каталазы в 1.3 раза. Если сопоставить эти результаты с данными о снижении активности АЛТ в сыворотке крови практически в два раза, а он является одним из маркеров реакций цитолиза гепатоцитов, можно утверждать, что мобилизация прооксидантной активности ксантиноксидаэы не связана с гибелью клеток печени, а играет иную физиологическую роль.

При оценке интенсивности цианидрезистентных реакций, а проо-оксидантная активность КСО является их составляющей, по поглощению кислорода срезами ткани печени в аппарате Варбурга, активности реакции гликолиза по уровню прироста лирувата и лактата, расчета соотношения по их значениям NAD/NADH, установлено, что пуриновый субстрат стимулировал поглощение кислорода и интенсивность реакций гликолиза, увеличивал соотношение НАД/НАДН. Причем в срезах ткани печени животных получавших изоформы АФП с pf 4.1 - 4.4 количественные значения тестируемых показателей были на 35 - 50 % выше, чем в других экспериментальных группах. Эффект пуринового субстрата на стимуляцию цианид резистентного дыхания отменялся действием селективного ингибитора КСО - аллопуринола и низкомолекулярного аналога активности СОД - Си-лизина.

На основании полученных данных было сделано предположение, что в условиях ингибирования митохондриального пути связывания кислорода и потребления митохондриями восстановительного эквивалента NADH с образованием NAD, система гипоксантин - О-форма КСО выступает как кислородзависимый внемитохондриальный путь окисления NADH. Прооксидантный характер активности ксантиноксидазы, динамика реакций гликолиза в этих условиях, позволяют в целом охарактеризовать процесс дегидрирования NADH как прооксидантно индуцируемую регенерацию NAD для гликолиза.

Однако срезы ткани печени не позволяют изучить количественные параметры процесса прооксидантно индуцируемого окисления NADH установить последовательность реакций, что, однако, может быть выпол

нено in vitro с использованием очищенной формы КСО и исходных субстратов.

Ксантиноксиадзу для экспериментов очищали из ткани печени по методу [Suleiman S.A., StevensJ.B., 1987]., полученный фермент был очищен в две тысячи раз, соотношение Д- и О-форм составляло 5:1.

При исследовании количественных параметров прооксидантно индуцируемого окисления NADH установлено, что катализируемое ксанти-ноксидазой и сопутствующая окислению пуринового субстрата регенерация NAD из NADH дозазависимо активируется восстановленной формой пиридиннуклеотида в диапазоне концентраций 0.01 - 0.15 ммоль/л, ионами железа (Fe3t) при концентрациях от 0.1 до 10 мкмоль/л. Стимуляция окисления NADH ингибируется супероксиддисмутазой и не зависит от активности каталазы. С учетом результатов экспериментов на срезах ткани печени и изучению закономерностей окисления NADH с участием О-формы КСО, пуринового субстрата, ионов железа и супероксидного анион радикала на рис.6 предлагается упорядоченная последовательность реакций прооксидантноиндуцируемой регенерации NAD для гликолиза.

Предложенная цепная реакция окисления NADH, с участием супероксидного анион радикала, генерируемого в системе пуриновый субстрат - ксантиноксидаза, показывает, что многоступенчатая утилизация молекулы кислорода до воды обеспечивает окисление двух молекул NADH. Образование из Ог супероксидного анион радикала и последующее многоступенчатое восстановление до воды, является энергетически более выгодным, чем одноступенчатое четырехэлектронное восстановление кислорода [Метелица Д.И., 1984]. Прооксидантная активность ксантиноксидазы способна обеспечить необходимый уровень продукции супероксидного анион радикала в условиях достаточного количества пуринового субстрата. Способность окислять NADH до NAD и использование последнего в реакциях гликолиза обеспечивают синтез гликоли-тической АТФ, стабилизацию уровня пирувата и концентрацию ионов водорода. Если бы регенерацию NAD для гликолиза обеспечивало только превращение пирувата в лактат, то это приводило бы к удалению пиро-виноградной кислоты из реакций синтеза биополимеров и возникновению внутриклеточного метаболического ацидоза. Так снижение нормального значения рН в пределах 0.5 единицы уменьшает интенсивность проли-феративного процесса, а более выраженное падение рН его полностью

Глюкоза

г 1

I пюкоэо--6-фосфат

. 1

ФРУ1ГТОЗО-

Рис. 6. Взаимодействие реакций гликолиза и цепного окисления НА ОН О-формонксантиноксидазы.

ингибирует и является не совместимым с жизнедеятельностью клетки [Островский Ю.М. и др., 1984; Биленко М.В., 1989; Ашмарин И.П., 1992].

Таким образом регуляторная активность альфа-фетопротеина в отношении гликолитического процесса и внемитохондриальных реакций утилизации кислорода замыкается в итоге на параметры, определяющие нормальное функционирование обменных реакций пролиферирую-щих клеток, а соответственно, их жизнеспособность

Динамика тестируемых показателей в клетках тимуса, реагирующих с конканавалином А, при действии на них альфа-фетопротеина. Значения тестируемых показателей в клетках тимуса в условиях проведенных экспериментов представлены в таблицах 1 и 2. Действие изоформ альфа-фетопротеина на клетки тимуса, реагирующие с конкавалином А, следует рассматривать с учетом функционального назначения и биохимических особенностей метаболизма тимоцитов. Тимоциты являются активно про-лиферирующими клетками [Харлова Г.В., 1975; Сальник Б.Ю. и др., 1987], последующая дифференцировка или деградация которых определяется метаболическим и гуморальным статусом организма [Уманский С. Р., 1982; Животовский Б.Д., Хансон К.П., 1985; Берзофени Д.А. и др., 1989; Ашмарин И.П., 1992]. В числе гуморальных факторов, приводящих к деградации клеток тимуса находятся и эстрогены [Сальник Б.Ю. и др., 1987; Comsa J., 1973], к которым альфа-фетопротеин имеет определенную степень сродства [Nikolic J.А., 1992; Bemuau D. et al., 1993; Liu Y. et al., 1994; Nunez E.A. et al., 1974, 1989, 1994]. Избирательное взаимодействие альфа-фетопротеина с Кон А реагирующими клетками тимуса, его последующая интернализация и способность накапливаться в клетках, играть роль внутриклеточного эстрогенсвязывающего рецептора, способствуют формированию в цитозоле уровня эстрогенов, достаточного для инициации реакций деградации в этой фракции тимоцитов. Прирост проокси-дантной активности ксантиноксидазы в тимоцитах, вследстии генетически детерминированной слабости антиоксидантной системы клеток тимуса [Kroemer G. et al., 1995], инициирует их гибель по механизму апоптоза.

Гибель тимоцитов в этих условиях носит выборочный и упорядоченный характер. В качестве первичных процессов, ответственных за распад хроматина, могут выступать одиночные и двойные разрывы в цепях ДНК. Мобилизация прооксидантной активности ксантиноксидазы, вероятно, является связующим звеном в реализации тимоцитолитической

Таблица 1.

Влияние изоформ альфа-фетопротеина на количество лактата, пирувата, распределение активноти лактатдегидрогеназы между ее изоформами в клетках тимуса связывающихся с конканавалином А (КонА+) и нереагирующих с ним (КонА-) (П= 20 в каждой группе, р<0.05)1.

Экспериментальная группа Лактат мкмоль/г ткани Пируват мкмоль/г ткани ЛДП I ЛДГ, I ЛДГ, I ЛДГд I ЛДГ*

в % от общей активности лактатдегид I I ! эогеназы

Контроль 12 Кон А + Кон А- 1.54 + 0.22 1.67 + 0.20 0.132 + 0.017 0.149 + 0.019 0-6 0-4 0-8 0-11 25 + 5 29 + 9 30 + 8 32 + 4 35 + 5 32 + 6

Контроль 2 Кон А + Кон А- 1.39 + 0.15 1.47 + 0.17 0.129 + 0.013 0.122 + 0.020 0-7 0- 10 0 - 9 0-8 27 + 4 23 + 6 31+8 33 + 8 33 + 7 36 + 4

Опыт 13 Кон А + Кон А- 1.51 + 0.21 1.53 + 0.18 0.141+0.021 0.152 + 0.019 0-5 0-7 0-6 0-5 27 + 7 28 + 10 30 + 5 32 + 6 38 + 7 34 + 6

Опыт 2 Кон А + Кон А- 1.48 + 0.16 1.57 + 0.20 0.144 + 0.015 0,130 + 0.017 0-8 0-5 0-8 0-7 23 + 9 25 + 5 36 + 10 37 + 7 33 + 9 32 + 7

Значения тестируемых показателей приведены на момент окончания эксперимента (7 сутки).

2 В контроле 1 и контроле 2 животным парентерально вводили альбумин и физраствор соотвественно.

3 В опыте 1 и опыте 2 животным парентерально вводили изоформы АФП с р) 4.1 - 4.4 и 4.7 - 5.2 соответственно.

Таблица 2.

Количество разрывов ДНК и ДНК ПДН в тимоцитах реагирующих и несвязывающихся с КонА, полученных из тимуса экспериментальных и контрольных животных (п= 20 в каждой группе, р<0.05).

Объект День Разрывы ДНК в % ДНК ПДН в % от

исследования эксперимента от спонтанного общего

уровня количества ДНК

Связывающиеся 1 37.0 + 7.2 5.1 +0.9

с Кон А 2 36.1 + 4.8 5.4 + 0.8

тимоциты 3 35.1 + 5.5 6.0+1.0

от контрольных 5 36.3 + 6.1 5.1 +0.8

животных 7 37.1+5.7 6.1 +0.7

Несвязывающиеся 1 34.1 + 4.8 6.0 + 0.9

с Кон А 2 37.2 + 5.1 5.5 + 0.8

тимоциты 3 34.8 + 5.6 5.7 + 1.0

от контрольных 5 34.5 + 4.9 5.4 + 0.6

животных 7 35.9 + 6.1 5.4 + 0.8

Связывающиеся с 1 35.4 + 5.8 5.6 + 0.8

Кон А 2 36.2 + 6.0 6.0 + 0.8

тимоциты от 3 43.2 + 7.2 6.4 + 0.7

экспериментальных 5 43.4 + 7.3 7.1 +0.9

животных 7 46.8 + 7.2 7.1 + 1.1

Несвязывающиеся 1 36.0 + 6.1 6.4 + 0.7

с Кон А 2 34.8 + 5.5 6.1 +0.7

тимоциты от 3 38.3 + 5.7 6.0 + 0.7

экспериментальных 5 37.9 + 6.3 6.6 + 0.8

животных 7 39.1 + 6.3 6.2 + 0.7

активности эстрогенов, обеспечивая необходимый уровень активных форм кислорода для перекисной модификации хроматина. Не исключено также, что имеет место и прооксидантно индуцируемая регенерация ЫАй в тимоцитах, которая может способствовать снижению ингибирующего действия закисления Среды за счет лактата на реакции апоптоза. Итогом подобного действия альфа-фетопротеина на определенную фракцию клеток тимуса будет возможность развития антигена в организме хозяина.

Действие альфа-фетопротеина на клетки печени при аллиловом гепатите. Действие АФП на клетки печени при аллиловом гепатите оценивали по характеру изменения в крови содержания АЛТ, изменению в клетках печени активности ферментов КСО, каталазы, СОД, лактата, пи-рувата. Динамика изменения содержания АЛТ в сыворотке крови животных, получавших АФП, при аллиловом гепатите характеризовалась быстрым увеличением активности этого фермента до более высоких значений. Так к третьему дню с начала эксперимента прирост содержания АЛТ опережал таковой в клетках контрольной группы на 30 %. В последующем уровень активности АЛТ стабилизировался на более высоких значениях, превышая уровень фермента в сыворотке крови животных не получавших АФП на 30 - 35 %. Начиная с 7 - 10 дня эксперимента, уровень АЛТ в сыворотке крови животных, получавших а-фетопротеин, начал понижаться, стабилизируясь с 15 дня от начала эксперимента. В группе животных не получавших АФП аналогичные изменения содержания АЛТ в сыворотке крови запаздывали на 3 - 5 дней. Активность О-формы КСО повышалась в клетках обоих групп животных на фоне падения активности О-формы фермента. Однако если через сутки после введения аллилового спирта значения активности О-формы КСО были практически одинаковы в обоих группах и составляли 232 + 35 ти/г белка (р<0.05), то через трое суток активность О-формы КСО была выше в ткани печени группы животных, получавших АФП на 30 - 35 %. Следует отметить, что изменения прооксидантной активности КСО происходили на фоне некоторого снижения активности антиоксидантных ферментов каталазы и СОД. Так значение активности каталазы через сутки составляло 0.220 + 0.028 ти/мг белка (р<0.05), а через трое суток оно равнялось 0.194 + 0.026 ти/мг белка (р<0.05). Активность СОД ровнялась 0.53 + 0.06 ти/мг белка и 0.40 + 0.05 ти/мг белка (р<0.05) через сутки и трое с

начала эксперимента. Следует отметить, что в группе получавшей альфа-фетопротеин подобные значения сохранялись до 15 дня эксперимента, в последующем активность каталазы превышала норму (животные контрольной группы предыдущей серии экспериментов 0.25 + 0.031 т11/мг белка (р<0.05)) на 15-20 %. Активность СОД, напротив, осталась на тех же значениях, что и на третий день, или была несколько ниже. В группе животных не получавших альфа-фетопротеин, подобные изменения наступали позже на 3 - 5 дней. Соотношение ЫАОЛЧАОН в цитозоле клеток печени животных, получавших АФП, варьировало около значения 280 -300 единиц до 10 дня эксперимента в последующем оно возрастало до 440 - 460 единиц. В группе животных, не получавших АФП до 15 дня эксперимента соотношение ^О/ЫАОН в цитозоле клеток печени составляло 230 - 260 единиц, после этого оно увеличивалось до 380 - 400 единиц. Таким образом совокупность полученных данных свидетельствует как о более ранних и интенсивных изменениях тестируемых показателей, так и об их более быстрой нормализации в группе животных, получавших альфа-фетопротеин. Подобная динамика изменений тестируемых показателей позволяет предположить, что введение альфа-фетопротеина, вероятно, инициирует как процессы гибели в нежизнеспособных клетках, так и реакции адаптации к действию экстремального фактора в клетках, которые способны выжить. Не исключено, что подобное действие альфа-фетопротеина реализуется в обоих случаях с участием прооксидантной системы пурины - О-форма КСО, однако результирующая активность последней определяется общим состоянием метаболического статуса клетки.

Совокупность результатов изучения регуляторной активности различных изоформ альфа-фетопротеина в отношении гликопитического процесса и внемитохондриальных реакций утилизации кислорода в гепа-тоцитах, их иммуномодулирующего действия, данные литературы по физиологической значимости этого белка, позволяют охарактеризовать альфа-фетопротеин, как полифункциональный регулятор гомеостаза, действующий через систему клеточных рецепторов, транспортируемых лигандов и модуляцию активности метаболических процессов. Динамика биохимических показателей реакций цитолиза гепатоцитов при действии альфа-фетопротеина на них при аллиловом гепатите, указывает на пер-

спективность его использования с лечебной целью, как биостимулятора процессов репаративной регенерации клеток печени

ВЫВОДЫ

1. Регуляторной активностью в отношении гликолитического процесса и внемитохондриальных реакций утилизации кислорода в гепато-цитах обладают изоформы альфа-фетолротеина, имеющие pi 4.1 - 4.4 и насыщенные неэстерифицированными жирными кислотами с длиной углеродной цепи от C1S до С22.

2. Регуляторная активность альфа-фетопротеина в отношении гликолитического процесса в клетках печени связана с перераспределением активности между изоферментами лактатдегидрогеназы в пользу ЛДГз, увеличением и стабилизацией уровня пирувата и снижением содержания лактата.

3. Увеличение и стабилизация уровня пировиноградной кислоты, снижение концентрации лактата в гепатоцитах при действии на них альфа-фетопротеина достигается за счет увеличения активности изофер-мента лактатдегидрогеназы - ЛДГз с высокой интенсивностью превращающего молочную кислоту в пируват и инициации процесса проокси-дантно индуцируемой регенерации NAD для гликолиза в системе пурино-вый субстрат - ксантиноксидаза, уменьшающего отток пирувата в реакцию окисления NADH.

4. Инициируемый действием альфа-фетопротеина на клетки печени процесс прооксидантно индуцируемой регенерации NAD для гликолиза в системе пуриновый субстрат - ксантиноксидаза приводит к увеличению возможности гепатоцитов адаптироваться к условиям нестабильного снабжения кислородом. Процесс дозазависимо активируется восстановленной формой пиридиннуклеотида в диапазоне концентраций 0.01 -0.15 ммоль/л, ионами железа (Fe3+) при концентрациях от 0.1 до 10 мкмоль/л, ингибируется супероксиддисмутазой и не зависит от активности каталазы.

5. Регенерация NAD для гликолиза с участием взаимопре-вращающихся форм фермента терминальной стадии распада пуринов (D- и О-формы ксантиноксидазы) является ситуационно об-

условленным адаптационным механизмом к условиям развития и существования клетки.

6. Действие альфа-фетопротеина на клетки тимуса, реагирующие с конканавалином А, приводит к увеличению количества одно- и двуните-вых разрывов ДНК, продуктов межнуклеосомной фрагментации хроматина, что обусловлено инициацией прооксидантных реакций, приводящих к снижению стабильности генетического материала, вследствии генетически детерминированной слабости антиоксидантной системы тимоцитов.

7. Альфа-фетопротеин при аплиповом гепатите оказывает на клетки печени стимулирующее действие, выражающееся в сокращении сроков развития реакций цитолиза и нормализации метаболизма гепатоци-тов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанный способ выделения альфа-фетопротеина рекомендуется для получения микропрепаративных и препаративных количеств биологически активных форм белка из амниотической жидкости, ретроплацентарной и абортной крови.

2. Прооксидантно индуцируемое окисление NADH до NAD и участие последнего в реакциях гликолиза следует учитывать при изучении биохимических механизмов антигипоксического действия веществ, обладающих прооксидантной активностью.

3. С целью рационального использования антиоксидантов при лечении или профилактике конкретной патологии необходимо внедрить в лабораторно-диагностическую практику определение значений показателей, отражающих уровень баланса про- и антиоксидантных реакций окисления.

4. Направленый поиск новых типов антигипоксантов, может быть проведен в классе веществ, способных контролируемо мобилизовывать окислительный потенциал прооксидантных реакций.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Механизмы регуляции про- антиоксидантной активности в ти-моцитах // Биоантиоксидант. - М., 1989. Т.2. - С. 49 - 50 (Совместно с Л.А.Кожемякиным, Е.П.Шелепиной.С.А.Краевым).

2. Особенности регуляции ферментов пуринового обмена в механизмах лимфоцитолитических реакций II 10-й Обьединенный симпозиум биохимических обществ. - Ташкент, 1989. - С.87 (Совместно сЛ.А.Кожемякиным, Е.П.Шелепиной).

3. Некоторые биохимические показатели в динамике травматического повреждения // Проблемы клинической энзимологии. - Ужгород, 1989,- С.72 (Совместно с Л.А.Кожемякиным, Е.П.Шелепиной).

4. Программы лабораторной диагностики для военных госпиталей 1990. - 131 с. (Методическое пособие под редакцией

П.О.Вязицкого)

5. Ксантиноксидазная активность тимоцитов при лимфоцитолити-ческом действии гипоксантина//Вопросы медицинской химиии. - 1990,-Т.36, N1.- С. 87-90 (Совместно с Л.А.Кожемякиным, Е.П.Шелепиной).

6. Молекулярный механизм трансформации активностей ксанти-ноксидазы под действием субстрата // Биохимия,- Т.55, N9 - С.1707 -1712 (Совместно с Л.А.Кожемякиным, Е.П.Шелепиной).

7. Количественное определение продуктов деградации нуклеотидов в лимфоцитах человека спектрофотометрическим методом //Сборник изобретений и рационализаторских предложений -1991. - Вып.22 - С.44. (Совместно с С.А.Каликановым, В.Л.Пастушенковым).

8. Модификация метода определения разрывов ДНК в лимфоцитах человека //Сборник изобретений и рационализаторских предложений -1991. - Вып.22 - С.44. (Совместно с С.А.Каликановым, В.Л.Пастушенковым).

9.The Molecular mechanismof substrate-induced transformation of xanthine oxidase activities//Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1991. - Vol. 177, № 1. - P. 1281 - 1284 (wich E.P. Shelepina, L.A. Kozhemyakyn).

10. Обнаружение ксантиноксидазной активности в мононуклеарных клетках крови человека // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 1992. -TCXIII, N 2 - С.138-139 (Совместно с Л.А.Кожемякиным, С.А.Каликановым, В.Л.Пастушенковым, И.Г.Бондаренко).

11.Clinical significance of xanthine-oxigen oxidoreductase enzyme activity determination i bodi fluids and tissues//Proceeding of the laboratory medicine 95' II th IFCC European Contress of Clinical Chemistry. - Tambere, Finland, 1995. - P.78 (wich A. Karpishchenko, V. Pastushenkov, O. Moltchanov, V.Smirnov).

12. Прооксидантная активность ксантиноксидазы в реализации ге-патотропных эффектов//Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения. - Санкт-Петербург, 1995. - С.215 -216 (Совместно с О. Л. Молчановым).

13. Уровень некоторых факторов острофазового ответа при индукции активности ксантиноксидазы в гепатоцитах// Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения. - Санкт-Петербург, 1995. - С.216 -217 (Совместно с О.Л.Молчановым).

14.Лабораторно-диагностическое использование опухолевого маркера а-фетопротеина//Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения. - Санкт-Петербург, 1995. - С.229 -230 (Совместно с А.И. Карпищенко, А.А.Бутенко, П.В.Начаровым).

15. Влияние альфа-фетопротеина на прооксидантную активность ксантиноксидазы лимфоидных кпеток//1 II Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - М., 1996. - С. 7.

16. Некоторые особенности метаболизма регенерирующих клеток печени при введении альфа-фетопротеина//Ш Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - М., 1996. - С. 7..

17. Возможности улучшения тканевого дыхания медикаментозными средствами при тяжелой сочетанной травме// Клиническая медицина и патофизиология. - 1996. - № 1. - С.56-60 (Совместно с В.Ю.Шаниным,

A.И.Карпищенко, А.А.Будко, С.В.Гаврилиным, С.П.Кропотовым).

18. Биохимические аспекты действия альфа-фетопротеина на клетки печени//Клиническая медицина и патофизиология. 1996. - № 3. - С.76-79 (Совместно с В.С.Новиковым, А.И.Карпищенко).

19. Изменение активности каталазы и супероксиддисмутазы в клетках печени крыс при введении а-фетопротеина// Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения. - Санкт-Петербург, 1997. - С.532 -533.

20. Изменение изоферментного спектра лактатдегидрогеназы в клетках печени крыс при введении а-фетопротеина// Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения. - Санкт-Петербург, 1997. - С.533 - 534.

21. Прооксидантная активность ксантиноксидазы в клетках печени плода и ее возможная роль в адаптации к этому состоянию

II Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения. -Санкт-Петербург, 1997. - С.534 - 535 (Совместно с Ю.С.Лебедзевичем и

B.В.Шиловым).

22. Выделение u-фетопротеина из биоматериала, содержащего гемоглобин и гемопигменты//Второй съезд биохимического общества российской академии наук. - М., 1997. - Ч.И. - С. 504 - 505 (Совместно с А.И. Карлищенко).

23. NAD regeneration for glycolysis reaction induced by xanthine - O-form xanthine oxidase system//XXXIII International congress of physiological sciences. - St.Petersburg, june 30 - july 5 1997. - P.032.05. (wich A. Karpishchenko).