Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Сравнительное исследование химического состава цветков, листьев и корневищ с корнями первоцвета лекарственного с целью контроля качества и стандартизации сырья

На правах рукописи

Ь /сМ'

005052234

Борисова Дарья Алексеевна

Сравнительное исследование химического состава цветков, листьев и корневищ с корнями первоцвета лекарственного с целью контроля качества

и стандартизации сырья

14.04.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

18 ЛПР ¿013

Москва - 2013

005052234

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор, профессор кафедры фармакогнозии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России

кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник, научный консультант ОАО «Красногорсклексредства»

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Ярославская государственная медицинская академия Минздрава России

Защита диссертации состоится 2013 г. в 14-00 часов на

заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (ЦНМБ) по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан « 5" г>Ф? 2013 г.

Попов Дмитрий Матвеевич

Сорокина Алла Анатольевна

Горчакова Наталья Кирилловна

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09 доктор фармацевтических наук, /' /

профессор ' Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на достигнутые успехи в области синтеза лекарственных веществ, растения остаются важным источником для получения медицинских препаратов. Более 1/3, применяемых в современной медицине лекарственных препаратов, вырабатывается из растительного сырья. В последние годы значительно возросла популярность фитотерапии в связи с такими преимуществами как низкая частота побочных эффектов, малая токсичность, высокая эффективность, доступность и др. В связи с этим возникает вопрос о расширении растительной лекарственной сырьевой базы для производства фитопрепапратов и введения в медицинскую практику тех источников биологически активных веществ, которые относятся к определенным частям растений, на сегодня неизученных и неиспользуемых в медицинской практике.

Первоцвет лекарственный с давних пор находит широкое применение в народной и практической медицине в виде отваров и настоев. Первоцвет входит в состав комбинированных препаратов: примотуссин, экспектизат, мелрозум, синупрет, герби-он, пекторал и др. Однако, химический состав первоцвета изучен недостаточно и не решен вопрос относительно более эффективного сырья - листья, или корневища с корнями. По мнению одних авторов корневище с корнями первоцвета содержат сапонины, гликозиды, примверин и примулаверин, витамины С, каротин. В цветках - сапонины, флавоноиды. По мнению других авторов в первоцвете содержится аскорбиновая кислота, каротин, сапонины; в подземных органах - сапонины, флавоноиды, ка-ротиноиды, эфирное масло.

Недостаточная изученность химического состава не позволяет окончательно решить вопрос, что более рационально использовать в качестве сырья - листья или корневища с корнями. Одни страны используют в качестве сырья листья, другие -корневища с корнями.

Центр стандартизации лекарственных средств ФГУ НЦЭ СМП обратился к нам с просьбой разработать нормативный документ на листья первоцвета. Для решения этого вопроса необходимо провести исследование химического состава цветков, листьев и корневищ с корнями первоцвета.

Все изложенное выше позволяет заключить, что сравнительное исследование химического состава цветков, листьев и корневищ с корнями первоцвета является актуальной проблемой.

Целью настоящего исследования является сравнительное изучение химического состава цветков, листьев и корневищ с корнями первоцвета, разработка методов контроля качества и стандартизации основных действующих веществ с использованием физических, химических и физико-химических методов анализа.

Постановка задач и выбор средств для их решения

Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить литературу по фармакогностическим признакам, фармакологии, химическому составу, методам анализа основных действующих веществ листьев, цветков и корневищ с корнями первоцвета.

2. Исследовать качественный и количественный состав углеводов в листьях, цветках и корневищах с корнями первоцвета.

3. Исследовать качественный и количественный аминокислотный состав первоцвета.

4. Разработать методики идентификации и количественного определения дубильных веществ в изучаемом сырье

5. Подобрать условия и разработать методики идентификации и количественного определения флавоноидов и изучить содержание их в сырье первоцвета.

6. Разработать методики качественного и количественного определения сапонинов и изучить сравнительное их содержание в листьях, цветках и корневищах с корнями первоцвета.

7. Определить количество аскорбиновой кислоты в сырье первоцвета.

8. Исследовать анатомо-диагносгаческие признаки цветков, листьев и корневищ с корнями первоцвета.

9. Разработать показатели качества корневищ с корнями и травы первоцвета с целью создания нормативной документации

Решение задач осуществлялось путем обобщения данных литературы и проведением экспериментальных исследований.

Научная новизна результатов исследования. Впервые с помощью метода ВЭЖХ из цветков и листьев первоцвета выделено 9 флавоноидных соединений, с помощью масс спектрометрии установлено их химическое строение:

4 флавоноида производных кверцетина:

1). - Кверцетин- З-О-р-Б - глюкопнранозид З-О-р-О- глюкопира-нозид кверцетина; 2). - Кверцетин -З-О-а-Ь- маннопиранозил - (1 —> 6) - р

- Э - глюкопнранозид; 3). - Кверцетин -З-О-а-Ь- маннопиранозил - (1 —* 6)

- маннопиранозил - (1-6) - р - О - глюкопнранозид; 4). - Кверцетин - 3 - О - {б -О - [3 - (2,4 - диметоксифенил) - 2 - бутенонл] - а - Ь - маннопиранозил - (1 —► 6) - Р - Б - глюкопнранозид}

5 флавоноидных слединений производных кемпферола:

1).- Кемпферол - З- О- Р- О- глюкопнранозид, 3 О - р - Б - глюкопнранозид кемпферола; 2). - Кемпферол - З- О- а- Ь- маннопиранозил - (1—»6) -Р~ И- глюкопнранозид; 3).- Кемпферол - З- О- а- Ь- рамнопиранозил- (1—»6) -Р- Б- глюкопнранозид; 4).- Кемпферол- 3- О- а- Ь- маннопиранозил- (1—> 6) -а - Ь - маннопиранозил -(1-+6)-р-0- глюкопнранозид; 5). - Кемпферол - 3

- О - {6 - О - [3 - (4 - (2 - гидроксиэтокси) - 3 - метоксифенил) - 2 - пропеноил]

- а - Ь - рамнопиранозил -(1—»6) — р-Э — глюкопнранозид}

В листьях содержатся все 9 флавоноидных соединений, в цветках 5 флавоноидных соединений. В корневищах с корнями первоцвета флавоноидные соединения отсутствуют.

Методом ВЭЖХ установлено, что свободные сахара содержатся только в цветках и представлены фруктозой, глюкозой и сахарозой. Общая сумма их составляет 9,24 % в расчете на абсолютно сухое сырье. Связанные сахара представлены арабинозой, ксилозой, глюкозой и галактозой. В корневищах с корнями связанных Сахаров - 8,5 %, в цветках - 6,5 %, в листьях - 4,0 % в расчете на абсолютно сухое сырье.

С помощью аминокислотного анализатора в листьях и корневищах с корнями первоцвета установлено содержание 19 аминокислот одинакового состава. В цветках содержится 18 аминокислот того же состава, что и в листьях, но при этом отсутствует цистеин.

Методом спектрофотометрии по реакции с алюминия хлоридом определено количественное содержание флавоноидов в сырье первоцвета. Установлено суммарное содержание флавоноидов в цветках- 4,15- 4,67 %, в листьях- 1,02 - 1,57 %, в корневищах с корнями флавоноиды отсутствуют.

С использованием спектрофотометрического и хроматографического методов анализа определены факторы оптимизации процесса экстракции сапонинов из сырья первоцвета, обоснованы способов очистки извлечений, особенности протекания реакции эсцина и сапонинов с кислотой серной концентрированной, разработана методика количественного определения сапонинов в цветках, листьях и корневищах с корнями. С помощью разработанной методики определено содержание сапонинов в цветках 1,14- 1,74 %, в листьях 2,39- 3,68 %, в корневищах с корнями 8,96 - 16,52 %.

Исходя из особенностей поведения аскорбиновой кислоты количественное определение её проводили методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе высокого давления, укомплектованного системой градиентной подачи элюента с компьютерной системой сбора и обработки данных при условиях:

• - колонка 250*4,6 мм, сорбент КготозН 100 -5С18 с размером частиц 5 мкм; • - температура термостата 38 °С; • - длина волны 280 нм; • - подвижная фаза: ацетонитрил (А)/ 0,01 % раствор фосфорной кислоты (В); • - режим элюирования: скорость элюирования 1 мкл/мин; время регистрации 5 мин.

Установлено содержание аскорбиновой кислоты в цветках 26,4-60,5 мг/%, в листьях 21,9-40,1 мг/%. В корневищах с корнями аскорбиновая кислота практически отсутствует.

Установлены морфолого - анатомические признаки цветков, листьев и корневищ с корнями первоцвета. Проведено исследование анатомического строения

цветков, листьев и корневищ с корнями, выделены анатом о - диагностические признаки всех видов сырья первоцвета.

Научно-практическая значимость результатов исследования полученных результатов состоит в установлении диагностических признаков анатомического строения сырья первоцвета лекарственного цельного и измельченного. Выявлены диагностически значимые признаки при идентификации цветков, листьев и корневищ с корнями. На основании данных проведенных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения сапонинов в цветках, листьях и корневищах с корнями. Исследования по стандартизации лекарственного растительного сырья были использованы при разработки ФС на корневища и корни первоцвета для Государственной фармакопеи XII издания. Показано, что наиболее перспективным сырьем являются не листья, а трава первоцвета.

Положения, выносимые на защиту:

• Результаты исследований качественного состава и количественного определения углеводов в сырье первоцвета;

• Данные по аминокислотному составу листьев, цветков и корневищ с корнями первоцвета;

• Методики идентификации и количественного определения дубильных веществ в изучаемом сырье

• Результаты выделения методом ВЭЖХ и установления химического состава флавоноидных соединения цветков и листьев первоцвета;

• Методики идентификации и количественного определения флавоноидов в цветках и листьях первоцвета;

• Методики идентификации и количественного определения сапонинов в цветках, листьях и корневищах с корнями первоцвета и результаты по количественному определению аскорбиновой кислоты в цветках и листьях.

• Результаты по изучению диагностических признаков анатомического строения цветков. Листьев и корневищ с корнями и выявлению диагностически значимых признаков для идентификации сырья первоцвета.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на Научно-практической конференции «Стандартизация готовых лекарственных средств», Москва, 27.05.2011 г; XIX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» Москва, 23-27 апреля 2012 года

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в постановке целей и задач настоящего исследования, их реализации, анализе и обобщение данных, изложении полученных результатов в виде научных публикаций. Автором лично произведен обзор литературы по данной теме, сделан научно-обоснованный выбор применяемых в работе методик идентификации и количественного определения присутствующих в сырье веществ. Разработана нормативно-техническая документация: проект ФСП на «Первоцвета лекарственного корневища с корнями» и «Первоцвета лекарственного трава».

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 3,5 и 6.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в НИИ Фармации ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России в соответствии с тематикой и планом «Разработка научных основ технологии, стандартизации, организации производства и фармакоэкономики лекарственных средств». Номер регистрации: 01.2.009.07145.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 4 научных статьи в ведущих изданиях, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 182 странице машинописного текста, содержит 29 таблиц и 66 рисунков.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех экспериментальных глав, библиографии из 165 наименований, из которых 44 иностранных источника.

Содержание работы

Объектами исследования служили собранные во время цветения цветки, листья и в период увядания корневища с корнями первоцвета лекарственного, заготовленные фирмой «Зеленая Аптека» в предгорьях Кавказа. Сырье сушили в тени в хорошо проветриваемых помещениях и в сушилке при температуре 50 °С.

Из всех видов сырья готовили извлечения с применением 40 % этанола путем нагревания на кипящей водяной бане. Этанол удаляли под вакуумом. Для удаления полифенольных соединений водное извлечение пропускали через колонку с оксидом алюминия. В элюате определяли углеводы и аминокислоты.

Свободные сахара определяют реакцией Бертрана с реактивом Фелинга. Положительную реакцию дает только извлечение из цветков.

Связанные сахара определяют реакцией с реактивом Фелинга после кислотного гидролиза хлористоводородной кислотой. Положительную реакцию дали извлечения из цветков, листьев и корневищ с корнями. Связанные сахара присутствовали во всех видах сырья.

Полученные данные подтверждены методом хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках «Сорбфил ПТСХ - АФ-А-УФ», в системе растворителей изопропанол - вода (4:1). Свободные сахара выявляли дифениламиновым реактивом. Метод ТСХ показал аналогичные результаты- свободные сахара содержатся только в цветках.

Для подтверждения наличия связанных Сахаров нами был также применен метод ТСХ по методике для идентификации свободных Сахаров. Связанные сахара выявляли с помощью антронового реактива. Метод ТСХ подтвердил, что связанные сахара содержатся во всех видах сырья.

Для более детального изучения содержания углеводов дальнейшее исследование проводили методом ВЭЖХ. Полученные результаты представлены на рис. 1, 2. На рис.1 представлена хроматограмма стандартов углеводов. На хрома-тограмме извлечения из цветков присутствуют пики, соответствующие фруктозе, глюкозе и сахарозе (рис.2). На хроматограммах извлечений из листьев и корневищ с корнями пики соответствующие сахарам отсутствуют.

Количественное содержание свободных Сахаров представлено в табл. 1.

Таблица 1

Содержание свободных Сахаров в цветках, листьях и корневищах с корнями

Наименование объектов Содержание углеводов, %

Фруктоза Глюкоза Сахароза Сумма

Цветки 3,88 3,27 2,09 9,24

Листья 0 0 0 0

Корневище с корнями 0 0 0 0

Из табл. 1 видно, что свободные сахара содержатся только в цветках первоцвета лекарственного и представлены фруктозой, глюкозой и сахарозой. Содержание глюкозы составляет 3,27 %, фруктозы- 3,88 % и сахарозы- 2,09 %. Сумма свободных Сахаров- 9,24 %.

Связанные сахара определяли после гидролиза извлечений из листьев, цветков и корневищ с корнями первоцвета лекарственного по той же методике, что и свободные сахара.

Тестовую смесь анализировали методом обращено-фазовой ВЭЖХ в градиентном режиме на колонке Luna С18(2) 4,6*250mm (5um) с подвижной фазой А-вода, В- ацетонитрил и D- 100 мМ раствор гидрофосфата калия в воде (рН 9,12)

при скорости потока 1 мл/мин, при температуре 25 °С и с УФ детекцией при 260 им. Был использован градиентный хроматограф Agilent 1100, включающий четырех канальный насос, автосамплер, колоночный термостат и ПДА- детектор. Сбор и обработка хроматограм осуществлялась с помощью программ ChemStation и AutoChrom 1200/ACDlabs.

Состав подвижной фазы: 50 % 100 мМ раствор гидрофосфата калия в воде (рН 9.12), градиент ацетонитрила 10 - 20 % (5мин): 20 - 20 % (8 мин): 20 - 30 % (4 мин).

Отношение пиков и расчет концентрации углеводов проводили по внутреннему (глюкозамин) и внешнему стандарту смесь пяти анализируемых углеводов в концентрации 1 г/л.

Результаты определения связанных Сахаров в цветках, листьях и корневищах с корнями первоцвета лекарственного представлены на рисунках 3-6

[iutu- 160 -140 -s 120 -| 100 - *з -J0 - 8 |

: i ' 1 1 I . 'И ' J . N 1 I 1 ! 1 1 | t|j| i ЦдГ

'о'.........s.........nj ' is ' го Йвепооя Типе (ГГМП)

Хроматограмма стандартных растворов углеводов. Рис.3. Хроматограмма извлечения из цветков первоцвета. Рис. 4.

гон 22-12:00

Хроматограмма извлечения из листьев первоцвета. Рис. 5.

<1«Э1 АСИ 201 1 22 45 Об

N 3 8 3

400 - 2 | 320 - /

240 - —

150 -80 - і -¿-Л. ІІ1 11; ід/

Хроматограмма извлечения из корневищ с корнями первоцвета. Рис. 6

На рис. 3 представлена хроматограмма стандартных углеводов. На хромато-грамме извлечений из цветков, листьев и корневищ с корнями (рис. 4, 5, 6) получены пики соответствующие арабинозе, ксилозе, глюкозе и галактозе, присутствующие во всех частях растения. Сравнительное содержание связанных Сахаров в сырье первоцвета лекарственного представлены в табл. 2.

Таблица 2

Сравнительное количественное содержание связанных Сахаров в цветках, листьях и корневищах с корнями первоцвета лекарственного

Наименование сырья Содержание связанных Сахаров

Пентозы Гексозы Общая-сумма

Арабипоза Ксилоза Сумма Глюкоза Галактоза Сумма

Цветки 0,5 1,1 1,6 4,2 0,7 4,9 6,5

Листья 0.6 1,1 1,7 1,4 0,9 2,3 4

Корневище с корнями 0,9 1,2 2,1 5,3 1,1 6,4 8,5

Из табл. 2 следует, что наибольшее содержание связанных Сахаров в корневищах с корнями - 8,5 %; в цветках связанных Сахаров 6,5 %, наименьшее содержание связанных Сахаров в листьях 4,0 %.

12

Для установления присутствия аминокислот использовали извлечение приготовленное для определении углеводов. Наличие аминокислот определяли с помощью реакции со спиртовым раствором нингидрина. Положительная реакция наблюдалась в извлечениях из листьев, цветков и корневищ с корнями первоцвета.

Далее исследование проводили методом ТСХ на пластинках «Сорбфил ПТСХ - АФ-А - УФ». Наилучшее разделение аминокислот наблюдалось при использовании в качестве подвижной фазы системы растворителей: н - бутанол-кислота - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:2). Проявитель 0,25% спиртовой раствор нингидрина. В исследуемых объектах методом ТСХ были обнаружены: аланин, метионин, глицин, кислота глютаминовая и ряд других неидентифици-руемых аминокислот. Для более глубокого изучения содержания аминокислот проводили с использованием аминокислотного анализатора. Как следует из эксперимента, в листьях и корневищах с корнями первоцвета лекарственного содержится по 19 аминокислот одинакового состава. В цветках содержится 18 аминокислот того же состава за исключением цистеина (рис. 7, 8, 9).

Хроматограмма извлечения из листьев первоцвета

Рис. 8.

Хроматограмма извлечения из корней первоцвета

Рис. 9.

По данным проведенного исследования, преобладающими аминокислотами в листьях являются аспарагиновая кислота - 12,2 %, глютаминовая кислота - 15,9 %, пролин -7,8 %, глицин- 5,9 %, аланин- 6,4 %, валин - 6,2 %, лейцин - 9,5 %, фенилаланин - 5,5 %, лизин - 7,0 % от суммы свободных аминокислот, в цветках более 5,0 %, являются аспарагиновая кислота - 16,6 %, глютаминовая кислота -24,2 %, аланин - 5,6 %, валин - 5,4 %, лейцин - 6,9 %, лизин - 6,0 % от суммы свободных аминокислот, в корневищах с корнями первоцвета являются - аспарагиновая кислота - 26,6 %, глютаминовая кислота - 14,3 %, лейцин - 5,2 %, лизин - 5,6 %, аргинин - 9,0 % от суммы свободных аминокислот.

Для определения дубильных веществ в настоящее время наиболее точным и

эффективным, не требующим больших затрат времени, является спектрофотомет-

рический метод определения, основанный на измерении оптической плотности ок-

14

рашенных продуктов взаимодействия катехииов с железо - тартратиым реактивом в присутствии буферного раствора с рН 8,2 при длине волны 460 им.

В качестве стандартного раствора нами выбрана галловая кислота, так как она является основным веществом дубильных соединений сырья первоцвета.

Образцы различных видов сырья первоцвета были проанализированы с помощью данной методики и полученные результаты соотнесены между собой. Сравнительные данные представлены в табл. 3

Таблица 3.

Сравнительные результаты количественного определения дубильных ве-

ществ в различных видах сырья первоцвета лекарственного.

Номер образца Содержание дубильных веществ

Цветки Корневище с корнями Листья Трава

1 2,45 0,88 0,43 0,57

2 1,87 0,97 0,47 0,61

3 1,99 1,09 0,51 0,73

Анализ табл. 3 показывает, что наибольшее содержание дубильных веществ представлено в цветках, а наименьшее в листьях.

Сравнительное исследование качественного состава флавоноидов в листьях, цветках и корневищах с корнями первоцвета проводили ВЭЖХ/ Массспектро-метрическим методом.

При анализе растворов методом ВЭЖХ был использован градиентный хроматограф Agilent 1100 (США), включающий четырехканальный насос, автосам-плер, колоночный термостат и ПДА- детектор. Сбор и обработка хроматограм осуществлялось с помощью программы Chemstation и Autochrom 1200 ACDlabs. Растворы анализировали методом обращено-фазной ВЭЖХ в градиентном режиме на колонке Germini С18 (5 мкм) в 4,6* 150 мм с подвижной фазой А- вода, В-ацетонитрил и С- 1 % раствор ТФУ(трифторукусная кислота) в воде (рН 2) и градиентной программой: 5-5 % В (за 4 мин), 5-70 % В (за 8 мин), 5 % С - постоянно при скорости потока 1.5 мл/мин, температуре 25 С и УФ- детекцией при 272- 360 им. Химическое строение флавоноидов устанавливали массспектрометрическим методом.

На основании проведенных исследований с помощью метода ВЭЖХ из цветков выделено 5 флавоноидов, из листьев первоцвета 9 флавоноидов. С помощью масс спектроскопии установлено их строение.

4д/100ш1 ОВА127 02-»1от-2011 14:41:40

ятр1-021111-5 1: Бсап Е8+ 4д/100т1 ОВА127 02^оу-2011 14:41:40

Рис.10 Рис.11

1. Кверцетин-3-0-(^-1>-глюкопиранозид, З-О-р-Б-глюкопиранозид кверцетина

2. Кверцетин-3-0-а-Ь-маннопиранозил-{1 —» 6)-р-1>-глюкопиранозид

3. Кверцетин-3-0-а-Ь-маннопиранозил-<1 —6)-маннопиранозил-(1-6) - р - Б -глюкопиранозид

4. Кверцетин-3-0-{6-0-[3-(2, 4-диметоксифенил)-2-бутеноил]- а -Ь - маннопи-ранозил-(1 —»6)-[МЗ-глкжопиранозид}

4з/100т1

' 1! 100-|

ЗЗА127 сг-ыоу-гои 14:41:40

1

1.73 191 ,„ .15! I I I ... 5.00С-5

122 Г I |,к ¡"1 !39

I»«. X..! >'...МЦ.

1.00 1.25 1Ю 1.75 2.00 2 25 2 50

098 137 I >1 70 1 821 М 212 2«

100 1.25 1.50 1.75 2 СО 225 250

ззгпр1-С21111-5 1

160 611

1.81 7 Е5£5

100-,

13.

:085

"Л". А I 212 234 247

м II

1® I '' I 2 М 2.27

11 Б9 ]

100 1.25 1 50 1 75 2. СО 225 250

I

я!

'■Я /] ДЛ

0 94105 1.17 ] 1-\ 2.17 2 40

12 —. ...........Т1те

1.00 1.25 150 1.75 2.00 225 250

Рис. 12

4д/100т1 ОЗА127 02-Моу-2011 14:41:40

ятр1-021111-5 212 (1 529) Ст (210:215-218 223) ЕЭ»

2873 8.13е6

СагтрЬэй

5апр1-С21111-5203(1 Е47)Ст (193 207-18313' 100] 7>и ^ '

1.00 125 150 1.75 2СО 2.25 250 .

5аггр1-021111-5 2 С>з1еАгзу

182 Рап^з 1 0--: - -2

158 *

1 0е+2 < 5.0е+1

1.00 1.25 1 50 1.75 2 00 225 2.50

5атр1-021111-5 1: Бсап Ег»

161 163 449

"х,1 * г, 3 89е7

Н Л ]\,м

0] 0В5 139 [ Ц^.у у-( 10Т ИЗ 7<5

1.00 1.25 1.50 1.75 2 СО 2.25 250

^тр1-С21П1-5 1 О - Е'1-

чАА СН О к ^ А/х

159 2 Утл ! 1 "!■■ 1 Н7 ; %ОН си

200 400 6М 803 ЮОО^ 1200 1400

Рис.13

5. Кемпферол-3-0-р-Е>-глкжопиранозид, 3-0-[}-Е)-глюкопиранозид кемпферола

6. Кемпферол-3-0-а-Ь-маннопиранозил-(1 —* 6)-|3-0-глюкопиранозид

7. Кемпферол-3-0-а-Ь-рамнопиранозил-(1 —♦ 6)-(3-0-глюкопиранозид

8. Кемпферол-3-0-а-Ь-маннопиранозил-(1 —» 6)-а-Ь-маннопиранозил-(1 —> 6)--р-Е)-глюкопираиозид

9. Кемпферол-3-0-{6-0-[3-(4-(2-гидроксиэтокси}-3-метоксифенил)-2- пропе-ноил]-а-Ь-рамнопиранозил-(1 —* 6)-р-0-глюкопиранозид}

Для количественного определения применяли дифференциальную спектро-фотометрию после проведения реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом, используя в качестве стандарта рутин. Результаты определения флавоноидов представлены в табл. 4.

Таблица 4.

Сравнительные результаты содержания флавоноидов в цветках, листьях и корневищах с корнями первоцвета лекарственного.

Номер образца Содержание флавоноидов, %

В цветках В листьях Корневище с корнями

1 4,67 1,57 0,127

2 4,15 1,02 0,012

3 4,33 1,08 0,008

4 3,98 1,11 0,011

5 3,95 1,27 0,009

Из табл. 4 следует, что наибольшее содержание флавоноидов в цветках от 4,15 до 4,67 %, в листьях от 1,01 до 1,57 %. В корневищах с корнями флавоноидов практически не содержится.

Для идентификации сапонинов ними предложена хроматография в тонком слое сорбента. Хроматографию производили восходящим способом на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ», в системе растворителей н - бутанол- кислота уксусная ледяная - вода (50:10:40) качестве детектирующего реагента 10 % раствор кислоты серной в 40 % этаноле. В качестве стандарта был использован эс-цин.

На хроматограмме испытуемого раствора должны обнаруживаться не менее 4 зон адсорбции с 115=2,0; 115=1,35; 1*3=1,0 и 113=0,42 относительно зоны адсорбции эсцина.

Для количественного определения сапонинов нами выбран метод спектрометрии, в основе которого лежит способность сапонинов давать окрашивание с кислотой серной концентрированной. Спектр поглощения продуктов реакции взаимодействия эсцина с кислотой серной концентрированной имеет максимум при длине волны 325 нм (рис. 14). Максимум окраски достигается через 30 минут и остается неизменным в течение 12 минут.

Спектр поглощения продуктов реакции сапонинов с кислотой серной

концентрированной

2 — извлечение из корневищ с корнями первоцвета, после очистки от сопутствующих и экстрактивных веществ

1 — 0,015 % раствор эсцина в 70 % этаноле

Рис 14.

Был построен калибровочный график, который показал, что калибровочная кривая зависимости между оптической плотностью, измеренной при длине волны 325 нм, и концентрацией раствора эсцина носит линейный характер в интервале концентраций от 0,00025 % до 0,004 %. Наименьшее определяемое количество эсцина 0.00025 мг/мл. Был рассчитан удельный показатель поглощения эсцина по реакции с кислотой серной концентрированной равный 222,45 (средняя 15 определений).

Для определения сапонинов методом спектрометрии необходимо провести очистку полученного извлечения от сопутствующих и балластных веществ, поглощающих в области близкой к аналитической волне 325 нм.

Для очистки извлечения применялись следующие методы: а). Способ смены растворителей; б). Колоночная хроматография с алюминия оксидом; с). Способ смены растворителей.

При подборе оптимальных условий экстракции установлено: экстрагент 70 % этанол, соотношение сырья и экстрагента для листьев, цветков и травы 1:50, для корневищ с корнями 1:100, измельченность сырья 2 мм; температура экстракции 100 °С; время экстракции 60 мин; двухкратная экстракция 45 и 15 мин. Полученные результаты использовались при составлении методики.

Метрологическая характеристика методик представлена в табл. 5

Таблица 5.

Метрологическая характеристика методик количественного определения суммы

р X, г/100 мл Бх Р,% Т(рД) дХ А±%

Корневище с корнями первоцвета

9 12,74 0,24 95 2,26 0,57 4,5

Листья первоцвета

9 2,39 0.05 95 2.26 0.11 4.7

Из табл. 5 видно, что с помощью разработанной методики возможно определять сапонины в первоцвете с достаточной точностью. Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95 не превышает ± 5 %.

Для определения систематической ошибки разработанной методики был использован метод добавок стандарта эсцина. Полученные результаты представлены в табл.6 .

Таблица 6.

Определение суммы сапонинов в корневищах с корнями первоцвета с ис-_пользованием метода добавок._

Найдена сумма сапонинов, г на 100гсырья Введено эсцина на 100 г сырья Должна быть найдена сумма сапонинов и эсцина на 100 г сырья Найдена сумма сапонинов и эсцина на 100 г сырья Относительная ошибка, %

16,52 4,13 20,65 20,25 - 1,94

13,97 3,49 17,46 17,96 + 2,86

12,36 6,18 18,54 19.05 + 2,75

12,74 9,56 22,30 22,00 - 1,35

8,96 8,96 17,92 17,42 -2,79

Из табл. 6 следует, что систематическая ошибка отсутствует, так как ошибка единичного определения больше относительной систематической ошибки.

Сравнительные результаты определения сапонинов представлены в табл. 7 .

Таблица 7.

Сравнительные результаты количественного определения сапонинов в ли-

Номер образца Содержание сапонинов, %

Листья Цветки Трава Корневище с корнями

1 2,97 1,26 1,66 16,52

2 2,39 1,14 1,72 13,97

3 3,63 1,57 1,57 12,36

4 3,68 1,74 1,93 12,74

5 3,14 1,15 1,89 8,96

Из результатов эксперимента следует, что наибольшее содержание сапонинов в корневищах с корнями (от 8,96 до 16,52 %), наименьшее - в цветках (от 1,14 до 1,74 %), в листьях от 2,39 до 3,68 %, трава содержит от 1,57 до 1,93 %.

Для идетификации аскорбиновой кислоты использовали пластинки «Сорб-фил» ПТСХ-АФ-А-УФ и систему растворителей вода дистиллированная. Зоны адсорбции выявляли с помощью 5 % спиртового раствора кислоты фосфорномо-либденовой. На хроматограмме должно быть синее пятно на уровне пятна аскорбиновой кислоты с ЯГ 0,89.

Количественное определение аскорбиновой кислоты проводили на жидкостном хроматографе высокого давления, укомплектованного системой градиентной подачи элюента, УФ-диодиометричным детектором или с детектором с перестраиваемой длиной волны, а так же компьютерной системой сборки и обработки данных при следующих условиях: • - колонка 250*4,6 мм, сорбент КготозП 100 -5С]8 с размером частиц 5 мкм; • - температура термостата 38 °С; в - длина волны 280 нм; • - подвижная фаза: ацетонитрил (А)/ 0,01 % раствор фосфорной кислоты (В); в - режим элюирования: скорость элюирования 1 мл/мин.

Методом ВЭЖХ были проанализированы 5 образцов листьев, цветков и корневищ с корнями первоцвета. Сравнительные результаты представлены в табл. 8.

Таблица 8

Сравнительные результаты количественного определения аскорбиновой кислоты в листьях, цветках и корневищах с корнями первоцвета_

Номер образца Соде ржание аскорбиновой кислоты мг/%

Листья Цветки Корневище с корнями

1 40,1 60,5 2.6

2 30,3 47,1 2,8

3 23,9 29,5 2,3

4 22,0 26,4 2,2

5 21,9 27,9 2,0

Из табл. 8 следует, что наибольшее содержание аскорбиновой кислоты от 26,4 до 60,5 мг/% в цветках; в листьях от 21,9 до 40,1 мг/%; в корневищах с корнями содержание аскорбиновой кислоты минимальное 2,0 мг/%.

выводы

1. Анализ литературных источников показал, что сырье первоцвета лекарственного является перспективным, широко используемым в официнальной и народной медицине средством, что является основанием для изучения химического состава и разработки методик анализа основных действующих веществ с использованием современных методов и последующим внедрением их в нормативную документацию, что является актуальной проблемой.

2. Методом ВЭЖХ установлено, что в сырье первоцвета содержатся свободные и связанные сахара. Общая сумма свободных Сахаров в цветках 9,24 % в расчете на абсолютно сухое сырье и представлена глюкозой, фруктозой и сахарозой. Связанные сахара представлены арабинозой, ксилозой, глюкозой и галактозой. Содержание связанных Сахаров в корневищах с корнями — 8,5 %, в цветках - 6,5 %, в листьях - 4,0 % в расчете на абсолютно сухое сырье.

3. С помощью аминокислотного анализатора определено в корневищах с корнями и в листьях первоцвета содержится по 19, в цветках - 18 аминокислот одного и того же состава, при этом в цветках отсутствует цистин.

4. Разработана методика количественного определения дубильных веществ в сырье первоцвета лекарственного, основанного на взаимодействии дубильных веществ с железо - тартратным реактивом присутствии буферного раствора с рН 8,2. Содержание дубильных веществ в цветках колеблется от 1,87 до 2,45%, в корневищах с корнями от 0,88 до 1,09 %, в листьях- от 0,43 до 0,51 %, в траве - от 0,57 до 0,73 %.

5. Методом ВЭЖХ из цветков и листьев первоцвета выделено 9 флавоноид-ных соединений, с помощью масс спектрометрии установлено их химическое строение. В цветках первоцвета содержится 4 флавоноидных соединений производных кверцетина и одно флавоноидное соединение - производное кемпферола. В листьях первоцвета найдены те же производные кверцетина и кемпферола и определено еще дополнительно 4 соединения производные кемпферола. В корневищах с корнями первоцвета флавоноидные соединения отсутствуют. Разработана методика количественного определе-

ния суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии, по реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом при длине 407 нм. В цветках сумма флавоноидов колеблется от 4,15% до 4,67 %, в листьях — от 1,02 до 1,57%, поэтому в качестве источника флавоноидов целесообразно использовать не листья, а траву первоцвета.

6. Разработана методика идентификации сапонинов в сырье первоцвета методом ТСХ. Подобранны условия и разработана методика количественного определения сапонинов, в основу которой положен спектрофотометриче-ский метод после проведения реакции с серной кислотой концентрированной. В качестве стандарта используют эсцин. Сравнительными исследованиями установлено количественное содержание сапонинов в сырье первоцвета: в корневищах с корнями от 8,96 до 16,52 %; в листьях - от 2,39 - 3,68 %; в цветках-от 1,14 до 1,57 %; в траве-от 1,57 до 1,93 %.

7. Количественное определение кислоты аскорбиновой в листьях, цветках и корневищах с корнями первоцвета проводили методом ВЭЖХ. Наибольшее содержание аскорбиновой кислоты от 26,4 до 60,5 мг/% содержится в цветках; в листьях от 21,9 до 40,1 мг/%; в корневищах с корнями содержание аскорбиновой кислоты минимальное-20 мг/%, в отдельных образцах аскорбиновая кислота в корневищах с корнями отсутствует.

8. Установлены анатомо - диагностические признаки листьев, цветков и корневищ с корнями цельного и измельченного сырья первоцвета. Выделены анатомо-диагностические признаки листьев, цветков и корневищ с корнями. Приведены их количественные характеристики. Все признаки зафиксированы на микрофотографиях.

9. Оформлены проекты Фармакопейных статей на корневища с корнями первоцвета и на траву первоцвета, которые направлены рассмотрению Департаментом Государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники для включения в ГФ XII издания.

Список опубликованных работ:

1. Борисова Д. А. Аминокислоты сырья первоцвета лекарственного //Фармация.-2011.-N8.-С. 11-13

2. Борисова Д.А. Содержание углеводов в сырье первоцвета лекарственного» // Фармация. - 2012. - № 2. - С. 25-26

3. Борисова Д.А., Попов Д.М. Сравнительное исследование качественного состава и количественного содержания флавоноидов в различных органах первоцвета лекарственного // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2012. - №8,- С. 8-13

4. Борисова Д.А., Потанина О.Г. Попов Д.М. Микроскопическое исследование сырья Первоцвета лекарственного // Фармация.- 2012. - №6.- С. 17-19

Бумага Метеору». Формат 60x90 1/16. Тираж 100 экз. Подписано в печать 04.02.2013 г. Отпечатано в типографии ООО КМП «Фирма ЭРА» 105484, г. Москва, Сиреневый б-р, д.72 Тел.: 8(499)464-1774,8(903)194-3190