Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Сравнительное исследование гемато- и миелопротекторной эффективности дикарбамина и лейкостима при лучевой супрессии гемопоэза (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

НИКИШИН Сергей Александрович

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕМАТО - И МИЕЛОПРОТЕКТОРНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДИКАРБАМИНА И ЛЕЙКОСТИМА ПРИ ЛУЧЕВОЙ СУПРЕССИИ ГЕМОПОЭЗА

(Экспериментальное исследование)

14.03.06 — Фармакология, клиническая фармакология (медицинские науки)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

16 МАЙ 2013

Саранск 2013 005059300

005059300

Работа выполнена на кафедре «Общая и клиническая фармакология» Медицинского института ФГБОУ ВПО «Пензенский государственный университет».

Научный руководитель - доктор медицинских наук, профессор

Моисеева Инесса Яковлевна.

Официальные оппоненты: Зорькина Ангелина Владимировна,

доктор медицинских наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева»,

заведующая кафедрой поликлинической терапии и функциональной диагностики;

Кузин Владимир Борисович,

доктор медицинских наук, профессор,

ГБОУ ВПО «Нижегородская

государственная

медицинская академия

Минздрава России»,

заведующий кафедрой

общей и клинической фармакологии.

Ведущая организация — ОАО «Всероссийский научный центр

по безопасности биологически активных веществ»

Защита диссертации состоится «^У » 2013 г., в/^-^часов,

на заседании диссертационного совета Д 212.117.08 при ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева» (430032, г. Саранск, ул. Ульянова, 26 а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева» (430005, г. Саранск, ул. Большевистская, 68).

Автореферат размещен на официальном сайте ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева» www.mrsu.ru и сайте ВАК Минобрнауки России.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Защита биологических систем от повреждающего воздействия ионизирующего излучения (ИИ) является одной из самых актуальных проблем радиационной биологии и медицины в связи с расширением использования лучевой энергии в различных областях жизнедеятельности человека [Гуськова А. К., 2004; Ярмоненко С. П., 2006; Власенко Т. Н. с соавт., 2010]. При облучении в сублетальных дозах основное значение приобретает повреждение кроветворной системы. Лечебный эффект высокодозной химио- и радиотерапии у онкологических больных ограничивается развитием серьезных побочных эффектов, среди которых также особое место занимает депрессия кроветворения [Птушкин В. В., 2002; Миненко С. В., 2006; Крылов В. В. с соавт., 2007; Васин М. В. с соавт., 2008; Сакаева Д. Д., Лазарева Д. Н„ 2008; Сипров А. В. с соавт., 2012]. Повреждение костного мозга сопровождается снижением содержания числа лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов периферической крови, при этом наиболее опасным проявлением миелодепрессии является нейтропения, вынуждающая врача порой прекратить противоопухолевое лечение до наступления ремиссии, что может ухудшить прогноз и сократить продолжительность жизни пациента [Птушкин В. В., 2002].

Весьма перспективными для клинической медицины можно считать гемато- и миелопротекторы, созданные на основе эндогенных регуляторов гемопоэза (колониестимулирующие факторы, интерлейкины, эритропо-этин) [Кетлинский С. А. с соавт., 1992; Небольсин В. Е. с соавт., 2010; Dainiak Nicholas et al., 2003], однако невозможность их профилактического применения, серьезные побочные эффекты и высокая стоимость ограничивают широкое экспериментальное изучение и клиническое применение препаратов группы [Гершанович М. Л., Филатов Л. В., 2007; Lord В. L. et al., 1992; Mittelman М. et al„ 1994]. В связи с этим актуальна разработка новых гематомиелопротекторов, обладающих низкой токсичностью, возможностью длительного применения, способных уменьшать повреждение клеток крови, стволовых мультипотентных клеток костного мозга и ускорять восстановление гемопоэза [Квачева Ю. Е., 2003; Ярмоненко С. П., 2006; Небольсин В. Е. с соавт., 2010], что существенным образом расширило бы возможности химио- и радиотерапии и в ряде случаев позволило достичь полной ремиссии и, как следствие, увеличения продолжительности жизни пациентов [Иванова А. А, 2009].

Рациональным путем борьбы с миелосупрессиями является не стимуляция подавленного кроветворения, а защита кроветворной ткани от действия миелоингибирующих факторов [Небольсин В. Е. с соавт., 2010]. С этой точки зрения для нас представляет научный интерес препарат дикарбамин: МНН-имидазолилэтанамид пентандиовой кислоты, фармгруппа: лейкопоэза стимулятор, код ATX: V03AF, который ускоряет дифференцировку и функциональное созревание нейтрофилов. Ранее было показано, что препарат оказывает защитное влияние на ряд показателей системы крови при действии

миелоингибирующих факторов в эксперименте и в клинике [Райхлин Н. Т. с соавт., 2003; Бычков М. Б. с соавт., 2009; Трещалин И. Д. с соавт., 2009; Моисеева И. Я. с соавт., 2010; Небольсин В. Е. с соавт., 2010]. В настоящее время дикарбамин применяется в качестве средства сопровождения химиотерапии для снижения ее миелосупрессивных эффектов [Бычков М. Б. с соавт., 2009; Трещалин И. Д. с соавт., 2009; ВусЬкоу М. В. е1 а1., 2009].

Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу НИР ФГОУ ВПО «Пензенский государственный университет» «Адаптационно-компенсаторные реакции систем гемостаза, крови и кровообращения в норме и патологии» на 2001-2020 гг. Номер государственной регистрации темы 01200851900.

Цель исследования: изучить гемато- и миелопротекторную эффективность дикарбамина в различных дозах и режимах введения в сравнении с лейкостимом при экспериментальной лучевой супрессии гемопоэза.

Задачи исследования.

1. Оценить влияние дикарбамина в различных дозах и режимах введения на показатели периферической крови кроликов при радиационном повреждении системы крови у кроликов.

2. Исследовать миелопротекторную эффективность дикарбамина в различных дозах и режимах введения в условиях лучевой супрессии гемопоэза у кроликов.

3. Сравнить гемато- и миелопротекторную эффективность дикарбамина и лейкостима в условиях лучевой миелосупрессии у кроликов.

Научная новизна работы.

1. Показаны гемато- и миелопротекторные эффекты дикарбамина в лечебно-профилактическом и лечебном режимах введения в дозе 4 мг/кг в условиях экспериментальной пострадиационной миелосупрессии.

2. Отмечено, что в изученных дозах дикарбамин при лечебно-профилактическом и лечебном введении в условиях радиационного повреждения системы крови более эффективно, чем лейкостим, предупреждал по-слелучевой дефицит циркулирующих тромбоцитов и эритроцитов; лейкостим поддерживал лейкоцитарный состав периферической крови на более высоком уровне, чем дикарбамин.

3. Дикарбамин в изученных режимах введения и дозах обеспечивал высокий уровень защиты кроветворной ткани в ранние сроки после лучевого воздействия, что выражалось в статистически значимом уменьшении глубины пострадиационного дефицита исследованных субпопуляций миелокариоци-тов. Лейкостим в изученной дозе защищал и стимулировал преимущественно нейтрофильный, моноцитарный, лимфоцитарный ростки кроветворения, про-тективные свойства препарата в отношении эритрокариоцитарного и мегака-риоцитарного рядов были выражены в меньшей степени, чем у дикарбамина.

4. Дикарбамин по сравнению с препаратом сравнения лейкостимом в изученных дозах и режимах введения в целом обеспечивал поддержание

более оптимального клеточного состава периферической крови и костного мозга в условиях радиационного повреждения системы крови у кроликов.

Практическая значимость исследования. Полученные данные расширяют представление о спектре фармакологического действия дикарбамина, являются экспериментальным обоснованием для дальнейшего изучения мие-ло- и гематопротекторной эффективности дикарбамина и лейкостима в условиях лучевого повреждения биологических систем и могут служить основой для расширения спектра их применения в медицинской практике.

Внедрение в практику. Разработанные положения включены в программу обучения студентов на кафедрах «Клиническая морфология с курсом онкологии», «Общая и клиническая фармакология» ФГБОУ ВПО «Пензенский государственный университет».

Осповные положения, выносимые на защиту:

1. Дикарбамин при лечебно-профилактическом и лечебном режимах введения в условиях пострадиационного экспериментального костномозгового синдрома в значительной степени предотвращал снижение в периферической крови кроликов числа лейкоцитов за счет сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов и ускорял процесс восстановления количества лейкоцитарных клеток до исходных значений; обеспечивал сохранность на достаточно высоком уровне количества циркулирующих эритроцитов, предупреждал развитие тяжелой послелучевой тромбоцитопении.

2. Дикарбамин в различных режимах введения и дозах обеспечивал высокий уровень защиты пролиферирующих кроветворных предшественников в ранние сроки после лучевого воздействия, что выражалось в статистически значимом уменьшении глубины и длительности пострадиационного дефицита клеток, составляющих нейтрофильный, лимфоцитарный, моноцитарный, эритрокариоцитарный и мегакариоцитарный ряды.

3. Дикарбамин в изученных режимах введения и. дозах в большей степени, чем лейкостим, предупреждал развитие в периферической крови и костном мозге экспериментальных животных дефицит клеток эритрокариоцитар-ного и мегакариоцитарного рядов, оказывая менее выраженное влияние на клетки нейтрофильного, моноцитарного, лимфоцитарного рядов.

Личный вклад соискателя. Автор принимал участие в выборе научного направления, формулировании цели и задач исследования. Автором проанализирован материал по патофизиологическим основам ионизирующего воздействия на систему крови, изучены проблемы и перспективы фармакологической коррекции гемопоэза при лучевом воздействии, разработан дизайн исследования. Экспериментальное исследование, протоколирование результатов, анализ полученных данных и их статистическая обработка проведены лично С. А. Никишиным. В ходе сбора материала для диссертационной работы соискателем были освоены: моделирование лучевого повреждения, унифицированные методики количественного изучения клеточного состава периферической крови и костномозгового пунктата, методы вариационной статистики.

Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на I и II Международных научно-практических конференциях «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (Пенза, 2011, 2012); II Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Молодежь и наука: модернизация и инновационное развитие страны» (Пенза, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 6 - в центральных журналах, рекомендованных ВАК Минобр-науки РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, содержащего 339 источников, из них российских - 274, иностранных - 65. Работа включает 10 таблиц, 5 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Экспериментальные животные. Эксперименты были выполнены на 60 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла массой 2,5-3,0 кг. Животных содержали на стандартном пищевом рационе вивария со свободным доступом к воде. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (ETS N123, Страсбург, 18 марта 1986 г.) и Федерального закона «О защите прав животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г. и одобрены локальным этическим комитетом.

Препараты. В работе использовали субстанцию препарата дикарба-мин производства ОАО «Валентафарм» (Россия). В качестве средства сравнения в условиях экспериментальной лучевой супрессии гемопоэза был использован филграстим (лейкостим, ЗАО «Биокад», Россия).

Модель лучевого повреждения. Облучение проводилось с помощью аппарата АГАТ-С разовой очаговой дозой 5 Гр при мощности дозы 0,33 Гр/мин. Расстояние от источника ионизации до ионизируемой поверхности составляло 90 см. При этом процентная доза равнялась 94 %, а максимальная доза ионизации составила 5,31 Гр.

Дизайн исследований. С учетом цели исследования было сформировано шесть групп животных. Группа № 1 (я = 10) являлась интактной. Животные групп № 2 (и = 10), № 3 (и = 10), № 4 (я = 10), № 5 (п = 10), № 6 (п = 10) подвергались однократному воздействию ионизирующей радиации. Навески субстанции дикарбамина растворяли в воде для инъекций и вводили кроликам перорально в объеме 2,0 мл: животным группы № 3 -в дозе 4 мг/кг дважды через 1 ч и 24 ч после облучения; группы № 4 - в дозе 15 мг/кг дважды через 1 ч и 24 ч после облучения; группы № 5 - в дозе 4 мг/кг ежедневно 5 дней до облучения и 10 дней после облучения. Лейко-

стим вводили животным группы № 6 в дозе 16 мкг/кг однократно подкожно через 1 ч после облучения.

Периферическую кровь забирали из краевой вены уха животных до начала эксперимента, на 3-й, 5, 7, 10, 14, 21, 28-е сутки. Определяли: клеточный состав (абсолютное число лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов в 1 л крови), лейкоцитарную формулу периферической крови. Для исследования костного мозга проводили пункцию подвздошной кости под местным обезболиванием раствором новокаина 2 % - 2,0 мл с помощью асептической аспирации иглой Кассирского и шприцем (обезвоженными) до начала эксперимента, на 3-й, 7, 10, 14, 21, 28-е сутки. Из части полученного пунктата готовили мазки, другую разводили для подсчета миелокарио-цитов и мегакариоцитов. Производили цитологический анализ мазков пунктата. В костном мозге определяли абсолютное число миелокариоцитов, абсолютное и относительное количество бластов, промиелоцитов, мцелоцитов, метамиелоцитов, палочко-, сегментоядерных нейтрофилов, эозинофилов, пронормобластов, нормоцитов базофильной, полихроматофильной и окси-фильной генераций, моноцитов, лимфоцитов, плазматических клеток и мегакариоцитов, а также абсолютное и относительное количество клеток в состоянии митотического деления. Рассчитывали индекс созревания нейтрофилов (ИСН), индекс созревания эритроцитов (ИСЭ), лейкоэритробластиче-ское соотношение (Меньшиков В. В., 1987).

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов экспериментального исследования проводили с помощью пакета статистических программ: русифицированная версия программы STATISTICA .6.0 (StatSoft - Russia, 1999), BIOSTAT (S. A. Glantz, McGrawHill). Проверка нормальности распределения проводилась по критерию Шапиро-Уилка. Оценка равенства дисперсий производилась с помощью критерия Левена. Определялись основные статистические характеристики: среднее, стандартное квадратическое отклонение. Достоверность различий рассчитана с помощью Т-критерия Стьюдента в случае равенства дисперсий, его модификации (Т-критерий с раздельными оценками дисперсий) в случае неравенства дисперсий. Критическая величина уровня значимости принята равной 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Абсолютное количество эритроцитов в периферической крови животных контрольной группы уменьшилось от 5,35 ± 0,20-1012/л в начале опыта до 3,48 ± 0,29-10|2/л (р < 0,01) в конце эксперимента. На фоне дикарбами-на в дозе 4 мг/кг в лечебно-профилактическом режиме введения и в дозе 15 мг/кг в лечебном режиме содержание эритроцитов в периферической крови животных в большинстве контрольных точек было статистически значимо выше значений показателя в группе животных без фармакологической коррекции (р2 < 0,05). На фоне дикарбамина в дозе 4 мг/кг в лечебном режиме введения в большинстве контрольных точек данный показа-

тель был статистически значимо меньше такового в группе интактных животных (р! < 0,05), однако в части контрольных точек (3-й, 21-е и 28-е сутки наблюдения) выше абсолютного количества эритроцитов у животных, составивших контрольную группу (р2 < 0,05).Содержание эритроцитов в периферической крови животных на фоне лейкостима снижалось от 5,31 ± ± 0,20 -10,2/л до 4,72 ± 0,61-10|2/л уже на 3-й сутки наблюдения; до окончания эксперимента статистически значимые различия с группой интактных животных сохранялись, увеличение абсолютного количества эритроцитов относительно значения показателя в группе контрольных животных наблюдалось лишь на 28-е сутки (р2 < 0,05).

Уровень гемоглобина после лучевого воздействия у животных контрольной группы снизился от 122,53 ± 17,30 г/л до 94,85 ± 10,60 г/л -на 14-е; 85,208 ± 12,30 г/л - на 21-е; 71,00 ± 12,30 г/л - на 28-е сутки опыта. Концентрация гемоглобина на фоне облучения и применения дикарба-мина во всех изученных режимах и дозах уменьшалась статистически значимо относительно таковой у интактных животных во второй половине опыта (р! < 0,05), вместе с тем у животных групп № 4 и № 5 на протяжении большей части эксперимента были выше значения показателя в контрольной группе (р2 < 0,05); у животных группы № 3 значения показателя статистически значимо превосходили контрольные цифры лишь на 21-е и 28-е сутки наблюдения. Концентрация гемоглобина у животных на фоне лейкостима с 10-х суток и до окончания эксперимента была статистически значимо ниже таковой у интактных животных (р! < 0,05), превышала значение показателя в контрольной группе животных только на 3-й и 28-е сутки опыта.

Облучение приводило к постепенному уменьшению абсолютного количества тромбоцитов в периферической крови животных от 312,5 ± 34,60 х х109/л до 55,60 ± 14,11-109/л (р! < 0,05) на 14-е сутки наблюдения, тяжелая тромбоцитопения сохранялась до окончания эксперимента (рис.1). Содержание тромбоцитов на фоне облучения и применения дикарбамина сохранялось на достаточно высоком уровне, динамика показателя была наилучшей при введении дикарбамина в лечебно-профилактическом режиме: значения показателя на протяжении всего периода наблюдения удерживались на уровне таковых в группе интактных животных (за исключением 5-х суток эксперимента) (р! > 0,05) (см. рис.1). Дикарбамин в лечебном режиме введения в дозе 15 мг/кг тоже препятствовал развитию тромбоцитопении, вместе с тем абсолютное количество тромбоцитов в периферической крови животных данной группы было статистически значимо меньше значения показателя в группе интактных животных на 5,10, 14 и 21-е сутки опыта (р, < 0,05). Содержание тромбоцитов на фоне лечебного введения дикарбамина в дозе 4 мг/кг на протяжении всего эксперимента было статистически значимо ниже такового у животных интактной группы (р1< 0,05) (см. рис.1).

Исход 3" су г 5-е сут 7-е суг 10-е суг 14-е суг 21-е суг 28-е сут

Шинтактные Ш облучение а облучение+Д4мг х 2-кратно кзоблучение+Д15мгх 2-кратно аоблучение+Д4мгх 16-кратно_сзоблучвние+Л ейкостиы 1 бмкг> 1-кратно

Рис.1. Динамика абсолютного количества тромбоцитов в периферической крови кроликов при радиационном воздействии и фармакологической коррекции.

Различия статистически значимы относительно: * - р1 < 0,05 интактной группы; # - р2< 0,05 контрольной группы

Содержание тромбоцитов в периферической крови животных на фоне облучения и применения лейкостима на протяжении всего опыта (за исключением 3-х суток) было статистически значимо ниже значения показателя в группе интактных животных; восстановление абсолютного количества тромбоцитов началось во второй половине эксперимента, значения показателя превысили таковые у животных контрольной группы на 14-е и 28-е сутки опыта, однако до окончания эксперимента сохранялись статистически значимые различия со значениями показателя в интактной группе животных Р1 < 0,05, р2< 0,05 (см. рис. 1).

Профилактика постлучевой тромбоцитопении является важным фармакологическим эффектом дикарбамина, так как в настоящее время в случае снижения уровня тромбоцитов единственным методом симптоматической терапии является переливание компонентов крови, связанное с риском возникновения дополнительных осложнений, а изучаемые тромбопоэтические факторы роста пока не нашли клинического применения.

Повреждающее воздействие радиации вызывало тяжелую лейкоцито-пению, которая сохранялась до 14-го дня опыта, в последующие 2 недели содержание лейкоцитов в крови постепенно увеличивалось (рис. 2). На фоне дикарбамина во всех исследованных режимах и дозах в ранний период после облучения степень лейкопении была менее выражена, чем в контрольной группе, затем наблюдалось ускоренное восстановление абсолютного количества лейкоцитов до исходного уровня (см. рис. 2). Наибольшее про-тективное действие дикарбамина наблюдалось при лечебно-профилактическом режиме введения в дозе 4 мг/кг и лечебном режиме в дозе 15 мг/кг. Лейкостим предотвращал развитие лейкопении: общее количест-

во лейкоцитов в группе животных, получавших данный препарат, на 3-й день опыта не отличалось от значений показателя в группе интактных животных, а в дальнейшем во всех контрольных точках статистически значимо превышало их (см. рис. 2).

с; о

Исход 3-й сут 5-е суг_7-е сут 10-е суг 14-е сут 21-е сут

шинтакгные

воблучение+Д4глг х 2-кратно Иоблучениеч-Д4мгх 15-кратно

28-е сут

а облучение аоблучение+Д15мгх 2-кратно в облучение+Л ейкостим 18мкг х 1-кратно

Рис. 2. Динамика абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови кроликов при радиационном воздействии и фармакологической коррекции.

Различия статистически значимы относительно: * - р, < 0,05 интактной группы; # - р2< 0,05 контрольной группы

В течение первых двух недель после лучевого повреждения в периферической крови животных отмечалась абсолютная нейтропения, значения показателя колебались в пределах от 0,13 ± 0,03-10 /л до 0,27 ± 0,05-10 /л (до облучения 2,29 ± 0,34 ■ 109/л), в конце эксперимента было отмечено некоторое накопление в крови зрелых сегментоядерных нейтрофилов (рис. 3). Дикарбамин удерживал уровень сегментоядерных нейтрофилов на протяжении большей части эксперимента выше контрольных цифр (р2< 0,05) (см. рис. 3). Наибольший защитный эффект наблюдался при лечебно-профилактическом режиме введения дикарбамина, при котором значения показателя уже с 7-х суток наблюдения были не ниже, чем таковые в группе интактных животных. Дикарбамин в лечебном режиме введения в дозе 15 мг/кг вызывал аналогичную динамику показателя (исключение составило его снижения на 14-е сутки эксперимента) (р, < 0,05). На фоне исследуемого препарата в дозе 4 мг/кг (группа № 3) абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов было статистически значимо ниже такового у интактных животных с 7-х по 14-е сутки наблюдения, вместе с тем выше уровня данных клеток в контрольной группе животных в первую неделю после облучения (р2 < 0,05). В группе с применением лейкостима абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов на 3-й день наблюдения статистически значимо сократилось от 1,99 ± 0,03 • 109/л до 1,25 ± 0,21 • 10 /л,

однако было выше показателя в контрольной группе (р! < 0,05, р2 < 0,05), в дальнейшем во всех контрольных точках значение показателя было выше такового в контрольной и интактной группах (р, < 0,05, р2 < 0,05). Наибольшее абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов было отмечено на 5-е сутки опыта, когда значение показателя превышало результат в интактной группе животных в 7 раз (р1 < 0,05) (см. рис. 3).

|

:

** 1 *# 1

«й ..*# '##1 ! V „ # 1 ###.

, Я

Исход 3-и сух 5-е сут 7-е сут 10-е суг 14-е сут 21-е сут 28-е сут

шинтактные а облучение

Воблучение+Д4мгх 2-кратно аоблучение+Д15мгх 2-кратно

иоблучение+Д4мгх 15-кратно Эоблучение+Л емкостям 16мкг х1-кратно

Рис. 3. Динамика абсолютного количества сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови кроликов при радиационном воздействии и фармакологической коррекции.

Различия статистически значимы относительно: * - Р1 < 0,05 интактной группы; # - р2< 0,05 контрольной группы

Палочкоядерные нейтрофилы после воздействия ионизирующего излучения и применения дикарбамина не были обнаружены в течение эксперимента (за исключением одной контрольной точки: в группе № 3 - на 10-е сутки, в группах № 4 и № 5 - на 7-е сутки), что подтверждает дифференциро-вочный эффект дикарбамина, обнаруженный ранее [Райхлин Н. Т. с соавт., 2003], а в группе облученных животных без фармакологической коррекции определялись в большинстве контрольных точек, однако их уровень был статистически значимо ниже, чем у интактных животных (р[ < 0,05). Палочкоядерные нейтрофилы после воздействия ионизирующего излучения и применения лейкостима определялись с 7-х суток эксперимента, абсолютное количество данных клеток было в 11 и 17 раз меньше такового в группе интактных животных на 7-е и 10-е сутки соответственно, во второй половине опыта количество палочкоядерных нейтрофилов было восстановлено; с 7-х суток наблюдения и до окончания эксперимента значение показателя превышало таковое в контрольной группе животных (р2< 0,05).

В контрольной группе животных дефицит лимфоцитов был глубоким на протяжении всего эксперимента, значения показателя не достигали

уровня интактных животных даже в конце эксперимента (рис. 4). Абсолютное содержание лимфоцитов на фоне дикарбамина во всех изученных режимах и дозах на протяжении исследования было статистически значимо выше, чем в группе облученных животных без фармакологической коррекции. Так, на фоне курсового лечебно-профилактического введения дикарбамина на 3-й сутки после лучевого поражения было отмечено уменьшение содержания лимфоцитов в периферической крови от 2,85 ± 0,41 ТО9/л до 1,21 ± 0,05 -109/л; в дальнейшем - их интенсивное накопление; значения показателя во всех контрольных точках были статистически значимо ниже таковых в интактной группе и выше, чем в контрольной группе (за исключением 21-х суток наблюдения). Дикарбамин в лечебном режиме введения в дозе 4 мг/кг вызывал аналогичную динамику показателя за исключением его снижения на 28-е сутки эксперимента (р! < 0,05) (рис. 4). Дикарбамин в лечебном режиме введения в дозе 15 мг/кг на 14-е и 21-е сутки опыта удерживал показатель на уровне такового у интактных животных (р, > 0,05) (см. рис. 4). Абсолютное количество лимфоцитов на фоне лейкостима на протяжении всего эксперимента за исключением последней контрольной точки было статистически выше значения показателя в группе интактных животных.

Исход_3-й суг_5-е сут 7-е сут

шинтактные

ео6лучение+Д4ыгх 2-кратно Е1облучение+Д4мгх 15-кратно_

10-е сут 14-е суг 21-е сут_28-е сут

Шоблучение

аоблучение+Д 15мгх 2-кратно О обл учен и е+Л ей костим 1 оыкг х 1-кратно

Рис. 4. Динамика абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови кроликов при радиационном воздействии и фармакологической коррекции. Различия статистически значимы относительно: * - Р1 < 0,05 интактной группы; # - р2< 0,05 контрольной группы

Таким образом, протективное действие дикарбамина в отношении лейкоцитарного состава периферической крови было достаточным, а лейкостима - избыточным в ряде контрольных точек; в частности, на 5-е сутки

опыта уровень лейкоцитов на фоне препарата превышал значения показателя в группе интактных животных в 3,6 раза, сегментоядерных нейтрофилов -в 7 раз, лимфоцитов — в 2,5 раза.

В первую неделю после облучения происходило снижение клеточно-сти у животных всех исследуемых групп. На фоне дикарбамина в первые дни после воздействия количество миелокариоцитов статистически значимо сократилось, затем началось интенсивное накопление клеток-предшественниц с восстановлением исходного уровня на 7-е сутки в опытных группах № 4, № 5 и на 14-е сутки - в опытной группе № 3 (рис. 5).

90

Исход 3-й суг 5-е сут 7-е суг 10-е суг 14-е суг 21-е сут 2В-есут

Шинтактные шоблучение

@облучение+Д4мг х 2-кратно Иоблучение+Д 15мгх 2-кратно

Шоблучение+Д4мг х 15-кратно Шоблучвние+Лейкостим 16мктх 1-кратно

Рис. 5. Динамика абсолютного количества миелокариоцитов в пунктате костного мозга кроликов при радиационном воздействии

и фармакологической коррекции. Различия статистически значимы относительно: * - Р1 < 0,05 интактной группы; I! - р2< 0,05 контрольной группы

Классической пострадиационной динамики с опустошением кроветворной ткани после облучения, транзиторным подъемом за счет задействования сохранных очагов кроветворения, повторным уменьшением общего количества клеток отмечено не было. Абсолютное количество клеток-предшественниц в пробах оставалось на достаточно высоком уровне. На фоне лейкостима абсолютное количество миелокариоцитов на 3-й сутки опыта возросло с 16,01 ± 2,96-10э/л до 27,50 ± 5,2410э/л и оставалось выше такового в группе интактных животных в течение трех недель наблюдения, а на 28-е сутки не отличалось от значения показателя в группе интактных животных.

После облучения без коррекции была выявлена пострадиационная костномозговая цитопения мегакариоцитов пролиферативного грануло-цитарного пула с дальнейшим абортивным подъемом и новым падением

абсолютных показателей. У животных, получавших дикарбамин, в первые две недели опыта отмечалось сокращение численности мегакарио-цитов в среднем вдвое (рис. 6). Во второй половине месяца мегакарио-цитарный росток был полностью восстановлен. На фоне лейкостима не наблюдалось восстановления мегакариоцитарного ростка с нормализацией показателя.

В контрольной группе отмечалось длительное и глубокое торможение митотической активности миелокариоцитов. В группе с использованием ди-карбамина во всех изученных режимах и дозах на 3-й сутки количество митозов сократилось в среднем в 2 раза (pi < 0,05, р2 < 0,05), этот пострадиационный дефицит был полностью скорректирован в опытных группах №4 и № 5 - на 7-е сутки, № 3 - только на 14-е сутки. В дальнейшем на фоне дикарбамина продолжалось увеличение числа митозов в костном мозге с наибольшим значением показателя на 21-е сутки эксперимента у животных всех групп.

900 800 700 600 # 500 f 400 300 200 100 О

Рис. 6. Динамика абсолютного количества мегакариоцитов в пунктате костного мозга кроликов при радиационном воздействии и фармакологической коррекции.

Различия статистически значимы относительно: * - Р! < 0,05 интактной группы; # - р2< 0,05 контрольной группы

На фоне лейкостима не наблюдалось пострадиационного снижения митотической активности миелокариоцитов в течение всего эксперимента. Абсолютное количество делящихся предшественников на протяжении всего опыта статистически значимо превышало значение показателя у ин-тактных животных: на 3-й сутки опыта - в 2,7 раза, в дальнейшем до конца эксперимента находилось в пределах от 0,175 ± 0,035-10 /л до 0,342 ± 0,059- 109/л (р,< 0,05).

*

Чя

rmtrsTífpr ffl.1*#### ЦП .*#%# „*#**## I***?«* Я? II

1ЯИИ1,1111дм, iüisi т IflLiin Шушу т ji.il ,1

Исход 3-й сут 5-е сут 7-е суг 10-е сут 14-е суг 21-е суг 28-е суг

Т^нтактныв а облучен и в

@облучение+Д4мг х 2-кратно 0облучение+Д15игх 2-кратно

ваоблучение+Д4мг х 16-кратно воблучвние+Леикостим 16ыкгх 1-кратно

Радиационное повреждение вызывало костномозговую палочкоядер-ную и сегментоядерную нейтропению продолжительностью до двух-трех недель (рис. 7, 8). В конце третьей недели отмечалось транзиторное увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов, через неделю - повторное падение, содержание сегментоядерных нейтрофилов во второй половине опыта постепенно повышалось до 3,09 ± 0,54Т09/л.

Шинтактные иоблучение

аоблучение+Д4мгх 2-кратно 0облучение+Д15мгх 2-кратно

аоблучение+Д4мг х 15-кратно иоблучение+Лейкостим 16мкгх 1-кратно

Рис. 7, Динамика абсолютного количества сегментоядерных нейтрофилов в пунктате костного мозга кроликов при радиационном воздействии и фармакологической коррекции. Различия статистически значимы относительно: * - Р1 < 0,05 интактной группы; # - р2 < 0,05 контрольной группы

Исход_3-й суг_5-е суг_7-е сут_10-е суг 14-е сут_21-е сут 28-е сут

Шинтактные Иоблучение

Воблучение+Д4мг х 2-кратно 0облучение+Д15мгх 2-кратно

иоблучение+Д4мг х 15-кратно ез обл учени е+Л ейкостим 1 вмкг х 1 - кратно

Рис. 8. Динамика абсолютного количества палочкоядерных нейтрофилов в пунктате костного мозга кроликов при радиационном воздействии и фармакологической коррекции. Различия статистически значимы относительно: * - р, < 0,05 интактной группы; # - р2< 0,05 контрольной группы

На фоне днкарбамнна сокращение численности палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов было менее выраженным, чем в группе контроля, а дальнейшее накопление клеток - более интенсивным. Показатели достигли уровня интактных животных в опытных группах № 4, № 5 на 7-е сутки эксперимента, в группе № 3 - лишь на 14-е сутки. Наиболее устойчивая динамика накопления сегментоядерных нейтрофилов отмечена на фоне лечебного введения дикарбамина в дозе 15 мг/кг (см. рис. 7). Абсолютное количество костномозговых палочкоядерных нейтрофилов на фоне лей-костима статистически значимо превышало значения показателя в группе интактных животных на протяжении всего эксперимента в 1,4-2,2 раза, сегментоядерных нейтрофилов - в 1,3 - 1,7 раза (см. рис. 7, 8).

ИСН через трое суток после радиационного повреждения составил 1,51 ± 0,22 (р] < 0,05) (0,85 ± 0,016 у интактных животных). В дальнейшем отмечалось интермиттирующее изменение показателя в пределах 0,34 ± 0,03...2,42 ± 0,16. ИСН у животных группы № 3 через трое суток после повреждения и повышался до 1,64 ± 0,24 (р, < 0,05, р2 = 0,223), в дальнейшем до конца эксперимента составлял 0,90 ± 0,11...0,95 ± 0,12. Значение индекса у животных группы № 4 через трое суток после повреждения было равно 1,03 ± 0,14 (р, < 0,05, р2< 0,05), к 5-м суткам повышалось до 2 26 ± 0,53 (р! < 0,05, р2 < 0,05), затем снижалось, составив в конце наблюдения 0,49 ± 0,13 (р, < 0,05, р2< 0,05). ИСН в опытной группе № 5 через трое суток после повреждения и использования дикарбамина составил 1,01 ± 0,23 (р! < 0,05, р2< 0,05), на 7-е и 10-е сутки не отличался от такового в группе интактных животных (р, > 0,05, р2 < 0,05), в дальнейшем наблюдалось снижение показателя до 0,39 ± 0,13 (р, < 0,05, р2 < 0,05).Таким образом, сравнительная оценка показателя выявила уменьшение продолжительности послелучевой супрессии дифференцировочных процессов на фоне дикарбамина относительно контрольной группы животных. Продолжительность супрессии зависела от дозы исследуемого препарата: наиболее раннее восстановление активности дифференцировки наблюдалось у животных группы № 5, наиболее позднее - в опытной группе № 3. ИСН на фоне лейкостима на протяжении всего эксперимента не отличался от значения индекса в группе интактных животных (р, > 0,05).

Однократное воздействие ионизирующей радиации вызывало статистически значимое уменьшение. ИСЭ - от 0,64 ± 0,07 до 0,57 ± 0,06 (р = 0,027) к концу эксперимента. На фоне дикарбамина и лейкостима статистически значимых изменений ИСЭ не отмечалось.

В пределах лимфоцитарного ряда клеток цитопенический эффект наблюдался в первые две недели после облучения (рис. 9). Транзиторное увеличение данных клеток в пунктате было отмечено на 21-е сутки наблюдения. Дикарбамин во всех изученных схемах и дозах удерживал количество лимфоидных элементов на 3-й сутки эксперимента на статистически

более высоком уровне относительно группы контроля, а в дальнейшем способствовал более быстрому восстановлению их количества. Восстановление численности лимфоцитов в опытных группах № 4, № 5 произошло на 7-й день эксперимента, в группе № 3 - через две недели после облучения. В лимфоцигарном ряду на фоне лейкостима на 3-й сутки после облучения абсолютное количество клеток превышало значение показателя в группе интактных животных в 2,3 раза, затем уровень клеток постепенно снижался, однако статистическая значимость различий сохранялась до 21 -х суток включительно (р, < 0,05, р2 < 0,05).

Рис. 9. Динамика абсолютного количества лимфоцитов в пунктате костного мозга кроликов при радиационном воздействии и фармакологической коррекции. Различия статистически значимы относительно: * - Р1 < 0,05 интактной группы; # - р2< 0,05 контрольной группы

ВЫВОДЫ

1. Дикарбамин в лечебно-профилактическом режиме в дозе 4 мг/кг и лечебном режиме в дозе 15 мг/кг проявлял более выраженный гемато- и миелопротекторный эффекты, чем в лечебном режиме в дозе 4 мг/кг, что обусловлено более низкой курсовой дозой последней схемы введения.

2. Дикарбамин при лучевой миелосупрессии в изученных режимах введения и дозах обеспечивал сохранность на достаточно высоком уровне в периферической крови количества циркулирующих эритроцитов, препятствовал развитию тяжелой послелучевой тромбоцитопении, снижению числа лейкоцитов за счет сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов и ускорял процесс восстановления количества лейкоцитарных клеток до исходного уровня.

3. Лейкостим при радиационном повреждении системы крови в изученной дозе обеспечивал сохранность ее лейкоцитарного состава, однако был менее эффективен, чем дикарбамин, в предупреждении послелучевого дефицита циркулирующих тромбоцитов и эритроцитов.

4. Дикарбамин при миелосупрессии, индуцированной лучевым воздействием, в изученных режимах введения и дозах сокращал период костномозговой цитопении, способствовал нормализации процессов пролиферации и дифференцировки субпопуляций миелокароцитов; протективное действие препарата, в отличие от лейкостима, охватывало все ростки кроветворения.

5. Лейкостим при радиационном повреждении системы крови в изученной дозе защищал и стимулировал нейтрофильный, моноцитарный, лимфоцитарный ростки кроветворения, протективные свойства препарата в отношении эритрокариоцитарного и мегакариоцитарного рядов были выражены в значительно меньшей степени, чем у дикарбамина.

.ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Целесообразно дальнейшее экспериментальное исследование при лучевом воздействии гемато- и миелопротекторного эффекта дикарбамина в лечебно-профилактическом режиме введения и лейкостима в лечебном режиме введения (с другими временными промежутками между облучением и введением лейкостима). Лечебный режим введения дикарбамина в дозе 15 мг/кг может быть использован для реализации гемато- и миелопротекторного эффекта препарата в случае невозможности применения лечебно-профилактического режима.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Моисеева, И. Я. Изучение гематопротекторной эффективности дикарбамина в условиях экспериментального пострадиационного костномозгового синдрома / И. Я Моисеева, А. И. Зиновьев, С. А. Никишин, В. Е. Небольсин // Вопросы онкологии. - 2012. - Т. 58. - № 1. -С. 81-84.

2. Моисеева, И. Я. Влияние дикарбамина на костномозговое кро-ве-творение в условиях экспериментального костномозгового синдрома / И. Я. Моисеева, Л. В. Ионичева, С. А. Никишин, А. И. Зиновьев,

B. Е. Небольсин // Вопросы онкологии. - 2012. - Т. 58. - № 5. -

C. 663-^66.

3. Моисеева, И. Я. Гематопротекторные эффекты дикарбамина при курсовом лечебно-профилактическом введении в условиях экспе-

рименталыюго радиогенного повреждения системы крови / И. Я. Моисеева, JL В. Ионичева, С. А. Никишин, А. И. Зиновьев, В. Б. Небольсин // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2012. - Т. 23. - № 3. - С. 36-41.

4. Моисеева, И. Я. Модификация гематосупрессивиого действия ионизирующего излучения дикарбамином / И. Я. Моисеева, Л. В. Ионнчева, С. А. Никишин, А. И. Зиновьев, В. Е. Небольсин // Вопросы онкологии. - 2013. - Т. 59.-№ 1. - С. 99-104.

5. Моисеева, И. Я. К вопросу о миелопротектороном эффекте лей-костима в условиях экспериментального лучевого повреждения костного мозга / И. Я. Моисеева, JI. В. Ионичева, О. П. Родина, С. А. Никишин // Современные проблемы науки и образования. — 2013. — № 1. -URL: http://www.science-education.ru/107-8558 (дата обращения: 12.03.2013).

6. Моисеева, И. Я. Сравнительное исследование миелопротектор-нон эффективности дикарбамина в различных дозах и режимах введения в условиях экспериментального костномозгового синдрома / И. Я. Моисеева, С. А. Никишин, О. А. Водопьянова, С. А. Ионова, В. Е. Небольсин // Современные проблемы науки и образования. — 2013. — № 2. - URL: http://www.science-education.ru/108-8766(ÄaTa обращения: 05.04.2013).

7. Моисеева, И. Я. Изучение гематопротекторной эффективности дикарбамина и мексамина в условиях экспериментального костномозгового синдрома / И. Я. Моисеева, С. А. Никишин, А. И. Зиновьев // Материалы I Междунар. науч.-практ. конф. «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области»: электронное науч. издание. - Пенза : ФГУП НТЦ «Информрегистр». Депозитарий электронных изданий, 2011. - С. 264-267 .

8. Никишин, С. А. Влияние дикарбамина на клеточный состав периферической крови и кроветворной ткани костного мозга в условиях экспериментального пострадиационного повреждения системы крови / С. А. Никишин, JI. В. Ионичева, И. Я. Моисеева // Материалы I Междунар. науч.-практ. конф. «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области»: электронное науч. издание. — Пенза : ФГУП НТЦ «Информрегистр». Депозитарий электронных изданий, 2011.-С. 293-297.

9. Никишин, С. А. К вопросу о гематопротекторном эффекте дикарба-мина в лечебном режиме введения в условиях лучевого повреждения кроветворного костного мозга / С. А. Никишин, И. Я. Моисеева, Л. В. Иониче-ва, Д. Д. Киселева // Материалы II Междунар. науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых «Молодежь и наука: модернизация и инновационное развитие страны»: электронное науч. издание. - Пенза : ФГУП НТЦ «Ин-формрегистр». Депозитарий электронных изданий, 2012. - С.142-146.

10. Никишин, С. А. К вопросу о миелопротекгорном эффекте дикарбами-на в лечебном режиме введения в условиях лучевого повреждения кроветворного костного мозга / С. А. Никишин, Д. Д. Киселева, И. Я. Моисеева, Л. В. Ионичева // Материалы II Междунар. науч.-практ. конф. «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области»: электронное науч. издание. - Пенза : ФГУП НТЦ «Информрегистр». Депозитарий электронных изданий, 2012. - С. 86-91.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Гр - грей

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИИ - ионизирующее излучение

ИСН - индекс созревания нейтрофилов

ИСЭ - индекс созревания эритрокариоцитов

ККМ - красный костный мозг

ЛБ - лучевая болезнь

ОЛБ - острая лучевая болезнь

СПЖ - средняя продолжительность жизни

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

Научное издание

НИКИШИН Сергей Александрович

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕМАТО -И МИЕЛОПРОТЕКТОРНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДИКАРБАМИНА И ЛЕЙКОСТИМА ПРИ ЛУЧЕВОЙ СУПРЕССИИ ГЕМОПОЭЗА (Экспериментальное исследование)

14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология (медицинские науки)

Редактор Т. В. Веденеева Технический редактор С. В. Денисова Компьютерная верстка С. В. Денисовой

Подписано в печать 17.04.13. Формат 60x841/16. Усл. печ. л. 1,39. Тираж 100. Заказ № 008051 .

Издательство ПГУ. 440026, Пенза, Красная, 40. Тел./факс: (8412) 56-47-33; с-таИ:Нс@рг^и.ги