Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Сравнительная оценка специфической фармакологической активности различных гемостатических средств местного и системного действия

На правах рукописи

ТЕР-АРУТЮНЯНЦ АРТЕМ АНДРЕЕВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ ГЕМОСТАТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ МЕСТНОГО И ____СИСТЕМНОГО ДЕЙСТВИЯ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология 14.00.29. - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2009

003470413

Работа выполнена в учреждении Российской академии медицинских наук Гематологическом

научном центре РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Андрей Павлович Момот кандидат медицинских наук Галина Геннадьевна Белозерская

Официальные оппоненты:

ЗДН РФ, доктор медицинских наук, профессор Рошен Джафарович Сейфулла Доктор медицинских паук, профессор Марина Васильевна Леонова

Ведущая организация:

Государственное учреждение научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В.Закусова РАМН

Защита состоится «_»_ 2009 года в 14.00 часов на заседании

диссертационного совета Д.208.072.01 при Российском государственном медицинском университете Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию но адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, г. Москва,ул. Островитянова д. 1).

Автореферат разослан «__»_2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Джанашия П.Х.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Профилактика и остановка кровотечений имеют важнейшее значение в различных областях клинической медицины, прежде всего в гематологии (Воробьев Л.И. 2005; Giangrandc Р. 2005; Yanada M., и соавт. 2007), хирургии (Fraser I.S., и соавт. 2008), травматологии (Licnhart II.G, и соавт. 2008), онкологии (Lichtigcr В. and Huh Y. 2008), акушерстве (Mercier F.J. и соавт. 2008) и др. в связи с увеличением числа больных с геморрагическими проявлениями, широким использованием аптикоагуляитов (гепаринов и препаратов кумарипового ряда) (Akoglu Е. и соавт. 1994), внедрением в медицинскую практику лекарств, обладающих наряду с необходимыми терапевтическими эффектами гспатотоксическим действием.

Особую роль играет разработка гсмостатических средств в медицине катастроф и для оказания помощи при критических и неотложных состояниях в условиях боевых действий (Blackbournc L.II. 2008; Spinella P.C. 2008). Развитие военной науки и техники неизбежно сопровождается появлением новых видов поражений, увеличением их количества, усилением тяжести патологического процесса, в том числе геморрагических осложнений при огнестрельных ранениях, воздействиях ядерного и химического оружия (Hess J.R, Ilolcomb J.B 2008; Чазов Е.И, и соавт. 1984).

Актуальность данного исследования связана и с тем, что зачастую препараты для остановки кровотечений, традиционно применяемые в медицинской практике, недостаточно эффективны и неспособны привести к действенному снижению кровопотсри, что опасно развитием геморрагического шока, острого ДВС-сипдрома, ишемии и некрозов жизненно важных органов. Это обусловлено широким разнообразием причин, способствующих возникновению гематомпого и/или микроциркуляторного типа кровоточивости (Баркагап З.С., Момот А.П., 2001). Клинический опыт показывает, что при плановых хирургических вмешательствах на печени, почках, селезенке при целостности магистральных артерий и вен капиллярно-паренхиматозные кровотечения являются основными источниками операционной кровопотери (Абакумов М.М. и соавт. 2002; Schustcr R, и соавт. 1990; Jacobson L.E, и соавт. 1992). Для их остановки прибегают к местной гипотермии, используют лазерное облучение кровоточащих тканей (Koshclcv V.N, Chalyk IuV. 1992), аппликацию жидкого азота, термо- (Schuster R, и соавт. 1990) и ультразвуковую коагуляцию (Vaezy S, и соавт. 2004), парентерально вводят свежезамороженную плазму и ее продукты - факторы свертывания крови (изолировано или в различных комбинациях), амбсп, эпсилоп-амипокапроповую кислоту, ингибиторы ссриповых протсипаз (трасилол, гордокс), адроксоп,

3

эгамзилат, ссротонин, окситоцин, питуитрин и ряд других препаратов, обладающих различными механизмами остановки кровотечений (Баркаган З.С., Момот А.П. 2001; Tien И, и соавт. 2007; Ranucci M. и соавт. 2008; Hedner U, и соавт. 2007; Fraser I.S. и соавт. 2008; Franchini M. И соавт. 2007). В числе средств, обладающих местным гемостатичееким эффектом, обычно используют тромбин, фибриноген, фактор XIII, апротинин, фибриповые и полимерные пленки и композиции (ЛбоянцР.К. и соавт. 1999; Mannucci P.M., 1998).

Тем не менее, появление новых, перспективных препаратов и композиций, обладающих системным или местным гемостатичееким действием требует углубленного изучения их эффективности в контролируемых (модельных) условиях эксперимента, что и было выполнено в настоящей работе.

Цель исследования: Сравнительное исследование специфической фармакологической активности различных гемостатических средств системного и местного действия.

Задачи исследования:

1. Провести анализ прокоагуляционной местной и системной гемостатической активности препарата «НовоСэвеп» в модельных экспериментах у интактных кроликов и в условиях коагулопатии, вызванной гепарином и варфарином.

2. Исследовать специфическую фармакологическую активность образцов отечественного активированного рекомбинантного фактора VII (рФУПа) в условиях экспериментальной модели на интактных кроликах и при гипокоагуляции, обусловленной гепарином и варфарином.

3. Провести сравнительный анализ результатов исследования гемостатической активности препарата «НовоСэвеп» и экспериментальных серий нового отечественного рФУПа.

4. Провести сравнительное исследование местной кровоостанавливающей способности средств различного химического строения и механизма действия при их аппликации на раневую поверхность печени кроликов.

Научная новизна

1. Оценена в эксперименте па кроликах гемостатичсская активность отечественного рФУПа при его внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг в сравнении с «НовоСэвсн»

2. Выявлена высокая эффективность отечественного рФУПа в условиях экспериментальной коагулопатии, обусловленной наиболее распространенными в клинической практике аптикоагулянтами - гепарином и варфарином

3. Сочетание системного и местного воздействия отечественного рФУПа приводит к более результативному кровоостанавливающему эффекту по сравнению с применением его или системно, или местно

4. Впервые в эксперименте на модели капиллярного кровотечения оценена местная гемостатическая активность аппликатов, включающих факторы свертывания крови: «НовоСэвсн», отечественный препарат рФУПа, растворимый фибрип-мопомер, комбинация фибрин-мономера с эпсилон-аминокапроновой кислотой, а также активаторов факторов свертывания крови: эхитокс, либстокс, анцистрон.

Практическая значимость работы

Установлено, что отечественный рФУПа проявляет в условиях внутривенного введения близкую гемостагическую активность к препарату «НовоСэвсн», что свидетельствует о целесообразности его дальнейших доклинических и клинических испытаний.

Включение отечественного рФ VI (а в состав гсмостатических средств, предназначенных для местного применения (аппликации), может расширить спектр использования данного рскомбинантпого белка.

Применение белка крови фибрин-мономера самостоятельно или в комплексе с эпсилон-аминокапроновой кислотой может лечь в основу разработки гемостатической композиции, предназначенной, для остановки паренхиматозных кровотечений при местном применении.

Положения, выносимые на защиту:

]. Внутривенное введение препарата «НовоСэвсн» в дозе 90 мкг/кг интактным кроликам сокращает протромбиповое время (ПВ) свертывания плазмы, повышает активность

5

<I>VII ii плазме крови и сокращает время остановки кровотечения и объем кровопотери.

2. Внутривенное введение отечественного рФУПа приводит к сокращению значений ПВ и возрастанию активности ФУП в плазме животных. Введение отечественного рФУНа сокращает время остановки кровотечения и объем кровопотери.

3. При внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг отечественный рФУПа обладает сопоставимой специфической фармакологической активностью с препаратом «НовоСэвен»

4. Препарат «НовоСэвен» и отечественный рФУПа способны купировать действие гепарина, устранять антикоагулянтый эффект варфарина, уменьшая время остановки кровотечения и объем кровопотери.

5. Местным гсмостатическим действием обладают белок крови фибрин-мономер, отечественный pOVIIa и препарат «НовоСэвен», а также эхитокс.

Личный вклад автора

Автором была проведена серия экспериментов на 201 кролике породы «Шиншилла» по изучению специфической фармакологической активности средств системного и местного действия (43 образца). Диссертантом освоены и лично проводились современные методики исследования системы гемостаза, в том числе и па моделях коагулопатии: определение основных параметров активности системы гемостаза, оценка активности образцов рФУПа in vitro и ex vivo, а также определение местной и системной гемостатической активности на модели капиллярно-паренхиматозного кровотечения в эксперименте.

Апробация диссертации

По материалам исследования были сделаны доклады на 12-ом Всероссийском съезде сердечно сосудистых-хирургов (Москва 2006) на тему «Оценка гемостатического действия рекомбипантного FVIIa (NovoSevcn) в эксперименте», Всероссийской конференции молодых ученых (Москва 2008) - «Специфическая фармакологическая активность рФУПа (НовоСэвен) в условиях экспериментальной гинокоагуляции» и Всероссийской конференции с международным участием «Тромбозы, кровоточивость ДВС-сиидром: современные подходы к диагностике и лечению» - «Исследование гемостатической активности отечественного рФУПа на модели тромбоцитопепии при острой лучевой болезни у кроликов».

6

Апробация диссертации проведена па заседании проблемной комиссии «Патология гемостаза» (протокол №15 от 29.09.2008).

Публикации: по теме дисссргации опубликовано 11 печатных работ в отечественной литературе, в том числе 3 работы в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура работы

Диссертация изложена па 168 страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 таблицами и 45 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 241 источник, в том числе 77 отечественных и 164 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В экспериментах in vitro исследовалась и сопоставлялась удельная коагуляциопная активность образцов отечественного активированного фактора свертывания крови VII (рФУПа) с активностью зарубежного препарата рФУПа "NovoSevcn®" выпускаемого в Дании фирмой «NovoNordisk» (далее «НовоСэвсп»).

В исследованиях ex vivo, были охарактеризованы плазменная и клеточная составляющие системы гемостаза у иптактных лабораторных животных при введении им отечественного или зарубежного рФУПа. Также исследование фармакологической активности отечественного рФУПа и препарата «НовоСэвсп» проводили на животных с фармакологически обусловленной гипокоагуляцией вызываемой варфарином и гепарином.

Плазменный гемостаз изучали с помощью определения времени свертывания цельной крови (ВСЦЬС) по методу Ли-Уайт и активированного частичного тромбопластипового времени - АЧТВ (огражающего интегральное состояние гемостаза после контактной активации), протромбинового времени - ПВ (отражающего суммарную активность факторов протромбинового комплекса, продуцируемых печенью), тромбипового времени - ТВ и концентрации фибриногена (отражающих уровень фибриногена и состояние финального

7

этапа фибринообратовапия). Была определена активность ФVII в плазме животных по J. Morrisscy. Исследована афегационная способность тромбоцитов по методу G. Вот, определено число тромбоцитов по методу B.Walkowiak и соавторов (данные методы отражают состояние тромбоцитарного гемостаза, наиболее быстро реагирующего па внешние воздействия).

Заключительной частью работы стали серии острых экспериментов in vivo, в которых исследования были направлены на изучение гемостатической активности рФУПа при его внутривенном введении на моделях паренхиматозного кровотечения. Моделированное кровотечение вызывалось у иптактпых животных с нормальной функцией гемостаза, а также у животных с спровоцированной гипокоагуляцисй, вызываемой непрямым антикоагулянтом (варфарииом). С помощью специального приспособления, производили резекцию печени. Остановку развившегося капиллярно-паренхиматозпого кровотечения выполняли путем равномерного наложения на всю площадь раневой поверхности марлевого тампона. Время остановки кровотечения определяли по секундомеру. Критерием оценки момента остановки кровотечения являлось полное отсутствие проникновения крови через поверхность и края наложенного марлевого тампона. Настоящий метод описан в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» под редакцией В.П. Фисслко.

Эксперименты на лабораторных животных были выполнены на 201 кролике породы «Шиншилла» обоего пола массой 2,5 - 4 кг. Количество циркулирующей крови у данных животных составляет по разным данным от 5,45% до 7,69 % массы тела. Этот факт обуславливает возможность проводить опыты сопровождающиеся кровопотерей до 40 мл крови без нарушения гемостазиологических требований. Кроме того, толерантность тромбоцитов кролика к различным лекарственным средствам близка к таковым у человека, что обуславливает схожую реакцию со стороны клеточного гемостаза на изучаемые лекарственные вещества.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование специфической фармакологической активности препарата «НовоСэвен»

в эксперименте у иптактпых кроликов и при индуцированной коагулопатии

В настоящее время все чаще применяются продукты генно-инженерных технологий, которые становятся альтернативой белкам из донорской крови. В результате серии научных

исследований появилась новая технология остановки кровотечений с помощью препарата «НовоСэвеп» - рскомбинантного активированного фактора свертывания VII fpOVIIa).

В соответствии с полученными данными клинического применения рФУНа при острых кровотечениях и в хирургической практике определено, что наиболее эффективной является доза 90 мкг/кг.

В настоящем разделе работы была поставлена задача исследовать гсмостатичсскую активность препарата «НовоСэвеп» в эксперименте у интактпых кроликов и при индуцированной коагулопатии. Во всех экспериментах по исследованию гсмостатической активности данный препарат вводился в дозе 90 мкг/кг.

Коагуляциопная активность препарата «НовоСэвеп»

В ходе экспериментов было показано, что препарат «НовоСэвеп» дозозависимо влияет на время свертывания дефицитной по фактору VII плазмы крови человека. Время образования фибринового сгустка составило 69,5±5,1; 81,016,4; 102,4±4,8; 143,4±8,9 сек при использовании рФУПа в концентрации 1000; 100; 10 и 1 нг/мл, соответственно. При проведении контрольного исследования было установлено, что при инкубировании дефицитной по фактору VII плазмы с одним растворителем pcDVIIa время образования фибринового сгустка составляло 262,8 сек.

Влияние препарата «НовоСэвеп» па основные коагулогичсскне показатели ex vivo

В данной серии экспериментов было исследовано влияния препарата «НовоСэвеп» на основные показатели свертываемости крови при его внутривенном введении кроликам в дозе 90 мкг/кг. Показано, что через 15 и 60 мин после внутривенного введения «НовоСэвеп» в дозе 90 мкг/кг укорачивалось ПВ и значительно возрастала активность CDVII по сравнению с исходной его активностью. Другие показатели коагулограммы (АЧТВ, ТВ, концентрация фибриногена) в динамике не менялись, без изменений остались также число и агрегация тромбоцитов в течение всего периода наблюдений.

Исследование гсмостатичсской активности препарата «ИовоСэвен» в эксперименте на животных

Для изучеиия гемостатической активности препарата «НовоСэвсн» было определено время остановки кровотечения и измерен объем кровопотсри в остром эксперименте на двух группах кроликов. Животным первой группы внутривенно вводился физиологический раствор (0,9% раствор хлорида натрия) в объеме, равном объему растворителя препарата «НовоСэвен» (контрольный эксперимент). Животным второй группы был введен препарат «ИовоСэвен» в дозе 90 м кг/кг массы тела.

У животных первой группы через 60 мин после введения физраствора время остановки кровотечения было сокращено в среднем па 4,3% от исходных значений, а к концу наблюдения (через 180 мин) время остановки кровотечения достигало 94,6±7,1% от исходного уровня. При введении животным препарата «НовоСэвен» наблюдалось укорочение времени остановки кровотечения, через 60 мин. При этом прослеживалась аналогичная динамика изменения объема кровопотери на протяжении всего эксперимента. В контрольной группе животных данный параметр оставался в диапазоне исходных значений. Таким образом, в эксперименте на животных был продемонстрирован гемостатический эффект препарата «НовоСэвен» на протяжении первых 3-х часов после его внутривенного введения.

Исследование способности препарата «НовоСэвен» купировать гепарин-индуцированную гипокоагулицию

Для демонстрации антикоагулянтного действия гепарина мы использовали такие показатели коагулограммы как АЧТВ и в ВСЦК. Первой группе кроликов внутривенно вводился гепарин в дозе 500 МЕ/кг (контрольная группа), второй группе (опытная группа) помимо гепарина проводилась инфузия препарата «НовоСэвен» в дозе 90 мкг/кг (инъекция препарата «НовоСэвен» производилась спустя 5 минут после введения гепарина).

Полученные данные (табл. №1) показали, что через 30 мин после инфузии гепарина в крови обеих сравниваемых групп животных произошло удлинение АЧТВ. Через 60 минут данный показатель у кроликов, которым вводили только гепарин, максимально удлинился и достиг в среднем 210 сек. В то же время бедная тромбоцитами плазма животных, получавших как гепарин, так и «НовоСэвен», показала укорочение данного показателя (до 68 сек), а через

120 мин данный показатель составил 25 сек, при этом в контрольной группе ЛЧТВ составило 36 сек.

Таблица №1

Влияние препарата «ПовоСэвеп» на длительность свертывания плазмы и крови у кроликов с гепарин-индуциробапной коагулопатией, (X \ т)

Группы животных Контрольная группа (Гепарин 500 МЕ/кг) Опытная группа (Гепарин 500 МЕ/кг

Временные «НовоСэвсн» )

экспериментальные точки АЧТВ,с (п=9) ВСЦК, с (п=5) АЧТВ, с (п=6) ВСЦК, с (п=5)

Исходные данные 17,2± 1,7 139±10 16,9±1,9 139±10

Через 30 мин после введения 193,7±10,4 >1800 176,2±7,5 >1800

Через 60 мин после введения 210,4±9,0 * >1800* 68,5±5,9 * 1583±112*

Через 90 мин после введения 70,7±7,2 * 1562±98* 36,4±6,2 * 1269±83*

Через 120 мин после введения 36,3±2,9 * 1029±107 25,1 ±4,1 * 1027±103

Через 180 мин после введения 21,2±2,3 431±20 21,1±2,6 463±31

* - достоверное различия между соответствующими данными в одном временном интервале

при р<0,05

Схожие по своей динамике и направленности данные были получены и при исследовании образцов крови сравниваемых групп кроликов по методике ВСЦК.

Анализ полученных данных позволяет заключить, что введение препарата «НовоСэвсн» животным с гепарип-индуцированной коагулопатией в значительной мере нейтрализует антикоагулянтпос действие гепарина.

Исследование способности препарата «НовоСэвсн» купировать варфарин-ипдуцированпую гипокоагуляцию

В следующей серии экспериментов исследована способность препарата «НовоСэвсн» нейтрализовать коагулопатию обусловленную медикаментозным снижением синтеза в печени факторов протромбинового комплекса - VII, IX, X и II. Коагулопатию у кроликов вызывали с помощью пероралыюго введения антикоагулянта непрямого действия -варфарина в дозе 0,15 мг/кг массы тела, что соответствовало максимальной суточной дозе препарата при лечении больных. Животные получали варфарин на протяжении 3 дней.

Для иллюстрации действия антикоагулянта проводилось исследование ВСЦК и ПВ бедной тромбоцитами плазмы. В остром эксперименте определяли время остановки

11

кровотечения и объем кровопотсри у животных, получавших варфарин (контрольная группа) или комбинацию варфарина с препаратом «НовоСэвен». Последний вводился внутривенно в дозе 90 мкг/кг (опытная ipynna).

Результаты исследования показали, что по окончанию перорального введения варфарина у экспериментальных животных наступало состояние гипокоагуляции, проявляющееся удлинением ВСЦК с 225 сек до 571 сек и ПВ с 10,2 сек до 15,2 сек. Введение препарата «НовоСэвен» животных с варфарин-индуцироваппой гипокоагуляцией на временном экспериментальном интервале в 30 минут приводило к укорочению ПВ, данный показатель оставался стабильно коротким в течение трех часов наблюдения.

Гемостатичсская активность препарата «НовоСэвен» при его введении животным с варфарин-индуцироваппой гипокоагуляцией проявилась сокращением времени остановки кровотечения по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе на протяжении всего периода наблюдений. При оценке объема потерянной крови в данных экспериментах была установлена похожая тенденция. Спустя 60 мин после введения препарата «НовоСэвен» объем кровопотери снизился в 2,6 раза по сравнению с таковым в контрольной группе.

Исследование и анализ специфической фармакологической активности отечественного препарата рФУПа па иптактпых кроликах и при экспериментальной коагулопатии

В настоящем разделе работы проводилось исследование специфической фармакологической активности образцов отечественного рекомбинаптпого активированного фактора VII (рФУПа), предназначенного для внутривенного введения, и представлен сравнительный анализ активности отечественных образцов pOVIIa с препаратом «НовоСэвен». Исслсдоваппыс образцы рФУПа были предоставлены Институтом биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Коагуляционная активность образцов отечественного рФУПа

Исследовалась коагуляционная активность 14 серий отечественного рФУПа. Исследования проводили в диапазоне начальных концентраций отечественного рФУПа в дефицитной по фактору ФУП плазме крови от 1 до 1000 нг/мл. В качестве эталона для

сравнения исследуемого параметра использовали разведения препарата «ПовоСэвен» в концентрациях, эквивалентных концентрациям отечественного рФУПа.

Задачей данного исследования явилось выявление серий отечественного pOVIIa которые бы совпадали или были бы максимально близки но значениям времени образования фибринового сгустка под действием препарата «ПовоСэвен». По результатам работы было выделено несколько серий отечественного рФУПа, обладающих сопоставимой фармакологической активностью с препаратом «ПовоСэвен». В данную группу вошли серии: 1,2,3,4.

Влияние образцов отечественного рФУ'Па на показатели гемостаза в эксперименте ex vivo

Интактпым животным внутривенно вводились растворы разных серий отечественного рФУПа или препарата «ПовоСэвен» (вещество сравнения). Доза действующего вещества составляла 90 мкг/кг массы тела. Оценку основных параметров коагулограммы производили спустя 60 минут после ипфузии рФУНа.

В результате проделанной работы выяснилось, что все исследуемые серии отечественного рФУПа вызывали увеличение активности ФУП (в среднем на 38,8%) и укорочение ПВ (в среднем до 5,4 сек) при их внутривенном введении кроликам в дозе 90 мкг/кг. В тоже время инфузия препарата «НовоСэвеп» приводила к сопоставимым сокращениям значений ПВ (до 5,3 сек) и возрастанию активности ФУИа (па 36,9%) в плазме животных. При этом показатели коагулограммы такие как АЧТВ, тромбиновое время, концентрация фибриногена, число и агрегациопныя активность тромбоцитов достоверно не изменялись.

Исследование гемостатическон активности отечественных образцов рФУПа в эксперименте на животных

В данном разделе работы проводилось исследование гемостатической активности четырех серий отечественного ФУПа. (табл. №2)

Сравнение результатов фармакологического действия четырех серий отечественного рФУНа показало стойкий гемостатический эффект уже на 30 минуте наблюдения. При этом сокращение времени остановки кровотечения составляло от 34,3 до 57,1%. Через 60 минут после инъекции сокращение времени кровотечения достигало от 48,4 до 55,7%. При анализе результатов объема кровопотери выявлено стойкое уменьшение этого параметра,

13

коррелирующее с сокращением времени остановки кровотечения. Уменьшение объема кровопотсри через 30 и 60 минут наблюдения составляло 42,5-64,1% и 52,8-70,8%, соответственно. Показатели времени остановки кровотечения и объема кровопотсри отличались при исследовании различных серий рФУНа, но оставались соизмеримыми с результатами исследования препарата «НовоСэвен».

Таблица №2

ВлияниерФУНа (отечественные образцы, препарат «НовоСэвен») и физраствора на время остановки кровотечения и объем кровопотери в эксперименте на животных, (Х±т)

Вводимое вещество Временные экспериментальные точки

До введения 30 мин 60 мин 120 мин 180 мин

Время остановки кровотечения, %

рФУНа серия №1 (п=4) 54,6±9,5* 22,8±3,5* 33,1±5,2* 38,4±5,0

рФУНа серия №2 (п=4) 42,9±8,3* 41,3±9,2 57,1±3,5 68,7±4,0

рФУНа серия №3 (п=4) 100 55,9±3,8 51,6±5,3 72,1 ±6,5 76,2±4,2

рФУНа серия №4 (п=4) 65,7±9,9 44,3±4,5 62,5±5,6 70,2±7,2

«НовоСэвен» (п=9) 84,9±3,6 54,6±5,2 66,6±6,8 62,015,6

Физраствор (4=6) 78,5±6,9 95,7±4,2 92,9±5,5 94,6±7,1

Объем кровопотери, %

рФУНа серия №1 (п=4) 35,9±5,2 33,5±3,5 21,9±4,5 27,6±3,7

рФУПа серия №2 (п=4) 53,8±8,3* 47,2±4,9 15,8±8,9* 32,7±3,7

рФУНа серия №3 (п=4) 100 57,5±6,6 29,2±4,6 37,6±5,5 54,8±8,4

рФУНа серия №4 (п=4) 55,8±8,6 32,3±5,8 55,2±6,3 44,0411,4

«НовоСэвен» (п=9) 86,4±3,5 46,8±5,5 44,6±9,1 66,5±13,4

Физраствор (П=6) 73,5±8,5 76,0±7,2 91,2±5,3 95,2±6,3

* - различия значений параметров гемостаза в сравнении со соответствующими значениями в группе экспериментов с применением препарата «НовоСэвен» статистически

достоверны при р<0,05

Исследование способности отечественного рФУПа купировать гспарии-индуцированную гипокоагуляцию

Первой группе животных внутривенно вводили среднсмолекулярпый гепарин в дозе 500 МЕ/кг. Второй группе наряду с гепарином вводили препарат «НовоСэвсн» в дозе 90 мкг/кг. Третьей группе помимо гепарина инфузировали отечественный рФУПа серии №1 в дозе 90 мкг/кг. Для оценки антикоагулянтпого действия отечественного рФУНа использовали такие показатели коагулограммы как АЧТВ и ВСЦК.

В результате эксперимента было отмечено, что до введения веществ статистически значимых различий между средними значениями АЧТВ в сопоставляемых группах не наблюдалось и они составляли 17,2±1,2, 16,6±1,9 и 19,9±1,8 сек, соответственно. В дальнейшем через 30 минут после инъекции гепарина значение АЧТВ в трех группах удлинилось и составляло 176,2-193,7 секунд. Через 60 минут у животных, получивших только гепарин, данный показатель достиг своего максимума и составил 210,4±9,0 сек., в то время как АЧТВ во второй и третьей группе составляло 68,5±5,9 и 111,5±12,3 сск, соответственно. Сокращение данного показателя прослеживалось у второй и третьей группы до 120 минутного интервала эксперимента. Спустя 180 минут после инъекций значения АЧТВ втрех группах сравнялись(21,1-23,1 сек).

Время свертывания цельной крови до инъекций составляло 139-145 сек. После проведения инфузии гепарина венозная кровь животных каждой группы не сворачивалась в течение более 30 минут (1800 сек.). Спустя 60 минут после инъекций первой группе цельная венозная кровь пе приобрела способность к свертыванию. В тоже время образцы крови второй и третьей групп животных, образовывали сгусток на 1583±112 и 1521±132 сек, соответственно. Эффект сокращенного ВСЦК проявлялся во второй и третьей группе к 90 минуте наблюдения. При этом значения ВСЦК в первой, второй и третьей группах составили 1562±98, 1269±83 и 1292±78 сек, соответственно. На 120 и 180 минуту наблюдения значения ВСЦК между тремя группами не отличались.

Исследование способности отечественных образцов рФУПа купировать варфарип-ипланированную гиппкоагулмцию

Задачей данного раздела работы было исследование способности отечественного рФУПа при его внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг купировать антикоагуляитный эффект, вызванный трехдневным пероральным введением варфарина в дозе 0,15 мг/кг.

В данном исследовании определено ВСЦК и ПВ. В серии острых экспериментов оценивали время остановки кровотечения и объем кровопотери животных с варфарин-ипдуцироваппой гипокоагуляцией после внутривенного введения им отечественного образца рФУПа в дозе 90 мкг/кг.

Рисунок №1

Изменение ИВ после введения отечественного рФУИа или препарата «НовоСэвеи» животным с варфарип-ипдуцированиой гипокоагуляцией

153 т Т

15В

".14

Я12

Ж2

п=Ж п=15

й::

п=12

52

-м-

5,5

5Э

Интактные Варфарин- 30 мин после ВОминпо&пе 90 мин после 120 мин после 1БОминпосле

животные индуцированная введения введения введения ¡ведения введения

ги по коагуляция

Экспериментальные этапы

!□ Препарат «НовоСзвен», п=5 □ Отечественный рФУИа, п=5|

Результаты исследования показали, что при экспериментальной варфарин-индуцированной коагулопатии время свертывания цельной крови увеличивалось с 238±21 секунд до 458±16 секунд, а ПВ - с 9,2±0,2 секунд до 15,8±0,3 секунд.

В результате сравнения значений ПВ при применении отечественного рФУПа и препарата «НовоСэвсп» не было выявлено достоверных различий между ними (Рис. №1). При этом оба вещества сокращали данный показатель до 5,2-5,6 сек. (30 минут после

инъекции). Данный эффект сохранялся в обеих группах животных до конца наблюдения (180 мин). Исследование гсмостатичсской активности отечественного рФУИа при его внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг животным с варфарин-ипдуцировапной гипокоагуляцией показало, что уже через 30 минут после инъекции происходило сокращение времени остановки кровотечения в 2 раза, что совпадает с данным показателем при применении препарата «НовоСэвен» (2,1 раза). Спустя 60 и 120 минут наблюдения время остановки кровотечения составляло 56,1±6,8% и 54,3±5,9%, а при применении препарата «НовоСэвен» 34,1±4,8 и 30,1±5,5. К концу эксперимента время остановки кровотечения было равно 53,1±6,3%, а при использовании препарата «НовоСэвен» показатель составлял 44,2±3,6% от исходного значения. Также было зафиксировано сокращение объема кровопотери. Так, на интервалах 30, 60 и 120 минут после введения отечественного рФУНа объем кровопотери сокращался до 36,1±7,5, 45,717,3 и 55,7±5,8%, а при использовании препарата «НовоСэвен» данный показатель сократился до 51,5 ± 4,2, 30,9 ± 3,9 и 29,6 ± 5,1 % на соответствующих временных интервалах. Объем кровопотери через 180 минут после инъекций составлял 55,5±4,5% и 24,4±2,0%, соответственно. Таким образом, внутривенная инфузия отечественного рФУНа животным с варфарин-ипдуцировапной гипокоагуляцией приводила к существенному сокращению как времени остановки кровотечения, так и объема кровопотери.

Оценка местной кровоостанавливающей активности композиций на основе применения факторов свертывания крови и их активаторов

В настоящем разделе работы на раневой поверхности печени кролика исследовалась гемостатическая активность белков крови: тромбина, фибриногена, фибрин-мономера «ООО Технология Стандарт», препарата «НовоСэвен» («Novo Nordisk») и отечественного рФУНа, изготовленного в Институте Биооргапичсской химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Также в данном разделе было проведено исследование гемостатической активности рФУНа при сочетании его воздействия системно и мсстпо.

Эксперименты по определению гемостатической активности отечественного рФУНа при его внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг и местной аппликации в количестве 263 мкг/см2 в остром опыте на животных показали, что через 60 минут после внутривенного введения отечественного рФУНа время остановки кровотечения сократилось примерно в 2 раза и составляло 123±19 секунды. Местная аппликация на раневую поверхность порошка отечественного рФУНа в дозе 263 мкг/см2 па фоне введенного внутривенно отечественного

17

рФУПа п дозе 90 мкг/кг приводила к уменьшению времени остановки кровотечения до 45±10 секунд и резкому снижению объема кровопотери - до нескольких капель крови (Рис. №2).

Рисунок N°2

Изменение гемостатического эффекта от сочетания системного и местного воздействия

отечественного рФУПа

ИИ

17.1 =f=

До применения рфVIIа

Внутривенная инъекция 90- Местное нанесение спустя 60 мкг/кг минут после tft инъекции-2ВЗ

мкг/см2

о Время остановки, %

□ Кровопотеря, %

Следующим этапом работы явилось проведение сравнительного исследования гемостатичсской активности препарата «НовоСэвен» и отечественного рФУНа наносимых в форме порошка па раневую поверхность печени интактного кролика. При аппликации порошка препарата «НовоСэвен» па раневую поверхность в дозе 263 мкг/см2 происходило резкое сокращение времени остановки кровотечения до 25,3% при контроле 100%. В результате местного нанесения порошка отечественного рФУПа в той же дозе время остановки кровотечения сокращалось до 28%.

При исследовании местной кровоостанавливающей способности аппликаций на основе белков крови, было показано, что нанесение порошка фибриногена в различных дозах па раневую поверхность печени пе приводило к выращенному гсмостатичсскому эффекту из-за низкой адгезивной способности, которая не позволяла веществу удерживаться па кровоточащей раневой поверхности, а фиксация вещества марлевой салфеткой оказалась неэффективной. В результате исследования местной гемостатичсской активности различных

18

порошка тромбина, в дозах соответствующих 125, 250 и 500 NIH в момент нанесения па раневую поверхность смывались током крови и не оказывали влияния па гсмостатический эффект. Нанесение на кровоточащую рапу печени порошка тромбина 750 и 1250 N111 приводило к быстрому образованию тромбов, но отсутствие фиксирующей основы не позволяло осуществить законченный гемостаз. Фиксация порошка тромбина в дозе соответствующей 500 NIII на рапе при помощи марлевой салфетки, приводило к укорочению времени остановки кровотечения в два раза по сравнению с контрольным значением. Увеличение количества тромбина до 625, 750 и 1250 NIII приводило к существенному сокращению времени остановки кровотечения до 42,7±6,4, 33,4±4,0 и 31,4±3,4%, соответственно.

Исследование местного апплицирования порошка фибрин-мономера в дозах 25 и 50 мг/см2 показало низкий гемостатический эффект, так как вещество смывало током крови. Однако, увеличение дозы лиофилизата фибрин-мономера (100, 125, 150, 200 mi ■/см1) сокращало время остановки кровотечения до 17,3±1,6%, 17,8±1,6%, 16,2±1,0%, 14,9±1,6%, соответственно. В результате проведения эксперимента была отмечена выраженная адгезивная способность фибрин-мономера, которая проявилась эффективным гемостазом без фиксации субстанции на кровоточащей ране. Добавление эпсилон-аминокапроновой кислоты в состав композиции из текстильного носителя и белка крови фибрин-мономера приводило к укорочению времени остановки кровотечения до 12,3±7,2% от контрольного значения.

В следующей группе экспериментов была исследована гсмостатическая активность некоторых активаторов свертывания крови, в качестве которых были использованы фирмы «Технология Стандарт». Были исследованы следующие вещества: анцистрон, эхитокс, лебитокс. Анцистрон, обладая тромбипоподобным действием, превращает фибриноген в фибрин, однако при этом отщепляя только фибрипоиептиды Л. Еще одной особенностью является то, что он пе активирует XIII фактор свертывания крови и не блокируется антитромбином, а также комплексом «генарин-аптитромбин III». Лебетокс — осуществляет запуск свертывания крови путем активации фактора X. Эхитокс, обладает прямым активирующим действием на протромбин. При этом получившийся тромбин в отличие от физиологического тромбина малоподвержен инактивации гепарином и комплексом «антитромбин III - гепарин».

Это послужило основанием для испытания данных веществ на способность останавливать экспериментальное кровотечение. Однако, выполняя настоящий раздел работы, мы не пытались рекомендовать именно эти вещества как гемостатичсские средства местного действия. Однако в случае выраженного эффекта какого-либо соединения мы

19

считали бы целесообразным в дальнейшей работе провести испытания кровоостанавливающего действия нетоксичных дериватов этих белков в условиях местной аппликации.

Полученные данные показали, что наибольшим кровоостанавливающим эффектом обладал раствор эхитокса с содержанием вещества 866 мкг/мл, при его использовании время остановки кровотечения составляло 122±12 сек. Вторым по гемостатической активности оказался также раствор эхитокса с меньшим содержанием вещества (4,31 мкг/мл), время остановки кровотечения составляло 185±23 сек. Менее заметное кровоостанавливающие влияние было выявлено при нанесении на рану раствора содержащего 1250 мкг/мл лсбитокса. Время остановки кровотечения при аппликации данного раствора па рану печени составляло 192±13 сек. Низким гсмостатическим эффектом обладали растворы лебитокса в концентрациях 312,50 мкг/мл и 0,16 мкг/мл, а также растворы, содержащие анцистороп в концентрациях 45 и 2,5 NIH/мл, времена остановки кровотечения соответственно составляли 206±19, 256±2\, 248±24 и 262±31 сек, соответственно. Контрольное время остановки кровотечения составляло 278±40 сек.

Выводы:

1. Внутривенное введение препарата «НовоСэвен» в дозе 90 мкг/кг интактным кроликам сокращает протромбиповос время свертывания плазмы в 1,6 раза, повышает активность ФУП в плазме крови на 37,5% и на 60 минуте наблюдения сокращает время остановки кровотечения и объем кровопотери соответственно на 45,4% и 53,2%

2. Внутривенное введение отечественного рФУПа приводит к сокращению значений ПВ в 1,7 раза и возрастанию активности ФУП в плазме животных на 37,7%. Введение отечественного рФУПа па 30 минуте наблюдения сокращает время остановки кровотечения и объем кровопотери на 45,7% и на 53,3% соответственно

3. Анализ экспериментальных данных in vitro, ex vivo и in vivo показывает, что при внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг отечественный рФУПа обладает сопоставимой специфической фармакологической активностью с препаратом «НовоСэвен»

4. Препарат «11овоСэвен» и отечественный рФУПа способны купировать действие гепарина через 60 минут после их введения и устранять антикоагулянтый эффект

20

варфарина, уменьшая время остановки кровотечения и объем кровоиотсри примерно в 2,5 раза

5. Изучение местного гсмостатичсского действия исследованных нами

прокоагуляциоппых белков показало, что наиболее выраженной способностью к остановке кровотечений обладают фибрин-мономер в дозе 100 мг/см2, фибрин-мономер в сочетании с ЭАКК, отечественный рФУПа в дозе 263мг/см2 и препарат «НовоСэвен» 263мг/см2, а также раствор эхитокса в концентрации 866 мкг/мл, менее заметным кровоостанавливающим действием обладали растворы апцистропа и лебетокса

Практические рекомендации:

Результаты исследования используются для проведения дальнейших доклинических и клинических испытаний отечественного рФУНа. Применение белка крови фибрин-мономера самостоятельно или в комплексе с эпсилои-амипокапроновой кислотой, может лечь в основу разработки гемостатической композиции, предназначенной, для остановки паренхиматозных кровотечений при местном применении.

Список печатных работ по теме диссертации:

1. Г.Г. Белозерская, В.А. Макаров, Е.А. Жидков, Л.С. Малыхипа, O.A. Сергеева, A.A. Тер-Арутюпянц, Л.В. Макарова. Гемостатичсские средства местного действия (обзор).// Химико-фармацевтический журнал, 2006, Т.40, №7, С.9-15.

2. Белозерская Г.Г., Васильева Т.М., Тер-Арутюнянц A.A., Макаров В.А., Малыхина Л.С., Сергеева O.A. // Исследование специфической фармакологической активности препарата НовоСэвен в эксперименте // Гематология и трапсфузиология, 2007, №3, С.23-27

3. A.A. Тер-Арутюпяпц, Г.Г. Белозерская, В.А.Макаров, Т.М. Васильева, Л.С. Малыхипа. Оценка гемостатического действия рекомбинантпого FVIIa (NovoScvcn) в эксперименте // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания», тезисы двенадцатого всеросийского съезда сердечно-сосудистых хирургов, Москва, 2006, 28-31 октября, Т.7, №5, С.225.

4. Л.Л. Тср-Лрутюнянц, Г.Г. Белозерская, Т.М. Васильева, А.П. Момот, J1.C. Малыхина,

B.А. Макаров. Исследование влияиия (Vila (NovoScvcn) на системный и локальный гемостаз. // Материалы научно-практической конференции Сборник статей: «Новое в гематологиии трасфузиологии», Киев, 2006, Выпуск 6, С.129-136.

5. A.A. Тср-Арутгапянц, Т.М. Васильева, Г.Г. Белозерская, А.П. Момот, В.А. Макаров Исследование активности и влияния на тромбоцитарную функцию рскомбипантного fVIIa (NovoScvcn) in vitro. Комплексное определение параметров плазменного и клеточного гемостаза ex vivo. // Материалы II международного симпозиума «Гемостаз -проблемы и перспективы», Киев, 2006, 8-9 сентября, С. 219-224

6. Макаров В.А., Белозерская Г.Г., Малыхина Л.С., Малыхина С.Г., Васильева Т.М., Дрозд 11.11., Пструхипа Г.Н., Мифтахова Н.Т., Климанова Е.В., Лапикова Е.С., Сергеева O.A. ,Тср-Лрутюнянц A.A., Толстенков A.C. Лекарственная регуляция функции гемостаза. // Проблемы патологии системы гемостаза, Барнаул, 2007, стр. 135-139

7. Белозерская Г. Г., Тср-Арутюиянц A.A., Макаров В. А., Сергеева О. А., Малыхина Л.

C., Исследование влияния фармакологически активных веществ па местную остановку кровотечения // Материалы Ш съезда фармакологов России «Фармакология -практическому здравоохранению», Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 г, 1, с. 1607

8. Тср-Арутюнянц A.A., Белозерская Г.Г., Васильева Т.М., Малыхина Л.С., Малыхина С.Г., Сергеева O.A., Макаров В.А. Специфическая фармакологическая активность рФУПа (НовоСэвен) в условиях экспериментальной гипокоагуляции // Бюллетень НЦССХ им. А.П. Бакулева РАМН «Сердечно-сосудистые заболевания», тезисы двенадцатой ежегодной сессии Научного центра ссрдсчно-сосудистой хирургии им. А.П. Бакулева РАМИ, Москва, 2008, 18-20 мая, Т.9, №3,С.144.

9. Белозерская Г.Г., Тср-Арупопяпц A.A., Воробъев А.И, Малыхина A.C., Сергеева O.A., Малыхина С.Г., Васильева Т.М., Макаров В.А. Оценка специфической фармакологической активности рекомбинаптного активированного фактора VII на моделях экспериментальной гипокоагуляции у кроликов // Гематология и трапсфузиология, 2008, №4, С.35-41

10. Тер-Арутюняпц A.A., Белозерская Г.Г., Васильева Т.М., Малыхина Л.С., Сергеева O.A., Макаров В.А. Специфическая фармакологическая активность препарата НовоСэвен в условиях экспериментальной гипокоагуляции // Материалы конференции «Достижения в гематологии и трансфузиологии», 2009, С.47

11. Тер-Арутюняпц A.A., Белозерская Г.Г., Момот Л.П., Сергеева O.A., Малыхипа J1.C., Васильева Т.М., Васильева Т.М., Макаров В.А. Сравнительное исследование специфической фармакологической активности отечественного рФУНа и препарата «НовоСэвен» // Материалы четвертой всероссийской конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореалогия в сердечно-сосудистой хирургии», 2009,4-6 февраля, С. 517

Подписано в печать 27.04.2009 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Лcgis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: (495) 785-00-38 www.autoref.webstolica.ru

Актуальность исследования

Профилактика и остановка кровотечении имеет важнейшее значение в различных областях клинической медицины, прежде всего в гематологии [29], [127], [241], хирургии [126], травматологии [166], онкологии [165], акушерстве [85], [175] в связи с увеличением числа больных с геморрагическими проявлениями, широким использованием антикоагулянтов (гепаринов и препаратов кумаринового ряда) [81], [162], внедрением в медицинскую практику препаратов, обладающих, наряду с необходимыми терапевтическими эффектами, геиатотоксическим действием.

Особую роль играет разработка гемостатических средств в медицине катастроф и для оказания помощи при критических и неотложных состояниях в условиях боевых действий [90], [226]. Развитие военной науки и техники неизбежно сопровождается появлением новых видов поражений, увеличением их количества, усилением тяжести патологического процесса, в том числе геморрагических осложнений, при огнестрельных ранениях, воздействиях ядерного и химического оружия [35], [73], [143].

Актуальность данного исследования связана и с тем, что зачастую препараты для остановки кровотечений, традиционно применяемые в медицинской практике, недостаточно эффективны и неспособны привести к действенному снижению кровопотери, что опасно развитием геморрагического шока, острого ДВС-синдрома, ишемии и некрозов жизненно важных органов. Это обусловлено широким разнообразием причин, способствующих возникновению гематомного и/или микроциркуляторного типа кровоточивости [13]. Клинический опыт показывает, что при плановых хирургических вмешательствах на печени, почках, селезенке, при целостности магистральных артерий и вен капиллярно-паренхиматозные кровотечения являются основными источниками операционной кровопотери [1], [150], [216]. Для их остановки прибегают к местной гипотермии, используют лазерное облучение кровоточащих тканей [158], аппликацию жидкого азота, термо- [216] и ультразвуковую коагуляцию [235], парентерально вводят свежезамороженную плазму и ее продукты - факторы свертывания крови (изолировано или в различных комбинациях), амбен, эпсилон-аминокапроновую кислоту, ингибиторы сериновых протеиназ (трасилол, гор доке), адроксон, этамзилат, серого ни н, окситоцин, питуитрин и ряд других препаратов, обладающих различными механизмами остановки кровотечений [13], [124], [125], [126], [134], [202], [206], [62J, [232]. В числе средств, обладающими местными гемостатическими эффектами, обычно используют тромбин, фибриноген, фактор XIII, апротинин, фибриновые и полимерные пленки и композиции [2], [199].

Тем не менее, появление новых, перспективных препаратов, обладающих системным или местным гемостатическим действием требует углубленного изучения их эффективности в контролируемых (модельных) условиях эксперимента, что и было выполнено в настоящей работе.

Цель работы: Сравнительное исследование специфической фармакологической активности различных гемостатических средств системного и местного действия.

Задачи исследования:

1. Провести анализ прокоагуляционной местной и системной гемостатической активности препарата «НовоСэвен» в модельных экспериментах у интактных кроликов и в условиях коагулопатии, вызванной гепарином и варфарипом.

2. Исследовать специфическую фармакологическую активность образцов отечественного активированного рекомбинантного фактора VII (рФУПа) в условиях экспериментальной модели на интактных кроликах и при гипокоагуляции, обусловленной гепарином и варфарином.

3. Провести сравнительный анализ результатов исследования гемостатческой активности препарата «НовоСэвен» и экспериментальных серий нового отечественного рФУПа.

4. Провести сравнительное исследование местной кровоостанавливающей способности средств различного химического строения и механизма действия при их аппликации на раневую поверхность печени кроликов.

Научная новизна

1. Оценена в эксперименте на кроликах гемостатическая активность отечественного рФУПа при его внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг в сравнении с препаратом «НовоСэвен»

2. Выявлена высокая эффективность отечественного рФУПа в условиях экспериментальной коагулопатии, обусловленной наиболее распространенными в клинической практике антикоагулянтами - гепарином и варфарином

3. Сочетание системного и местного воздействия отечественного рФУПа приводит к более результативному кровоостанавливающему эффекту, по сравнению с применением его или системно, или местно.

4. Впервые в эксперименте на модели капиллярного кровотечения оценена местная гемостатическая активность аппликатов, включающих факторы свертывания крови: «НовоСэвен», отечественный препарат рФУПа, растворимый фибрин-мономер, смесь фибрин-мономера с эпсилон-аминокапроновой кислотой, а также активаторов факторов свертывания крови.

Практическая значимость

1. Установлено, что отечественный рФУПа проявляет в условиях внутривенного введения близкую гемостатическую активность к препарату «НовоСэвен», что свидетельствует о целесообразности его доклинических и клинических испытаний

2. Включение отечественного рФУПа в состав гемостатических средств, предназначенных для местного применения (аппликации), может расширить спектр использования данного рекомбинантного белка

3. Применение белка крови фибрин-мономера самостоятельно или в комплексе с эпсилон-аминокапроновой кислотой, может лечь в основу разработки гемостатической композиции, предназначенной, для остановки паренхиматозных кровотечений при местном применении

Выводы:

1. Внутривенное введение препарата «НовоСэвен» в дозе 90 мкг/кг интактным кроликам сокращает протромбиновое время свертывания плазмы в 1,6 раза, повышает активность ФУН в плазме крови на 37,5% и на 60 минуте наблюдения сокращает время остановки кровотечения и объем кровопотери соответственно на 45,4% и 53,2%

2. Внутривенное введение отечественного рФУПа приводит к сокращению значений ПВ в 1,7 раза и возрастанию активности ФУП в плазме животных на 37,7%. Введение отечественного рФУНа на 30 минуте наблюдения сокращает время остановки кровотечения и объем кровопотери на 45,7% и на 53,3% соответственно

3. Анализ экспериментальных данных in vitro, ex vivo и in vivo показывает, что при внутривенном введении в дозе 90 мкг/кг отечественный рФУПа обладает сопоставимой специфической фармакологической активностью с препаратом «НовоСэвен»

4. Препарат «НовоСэвен» и отечественный рФУПа способны купировать действие гепарина через 60 минут после их введения и устранять антикоагулянтый эффект варфарина, уменьшая время остановки кровотечения и объем кровопотери примерно в 2,5 раза

5. Изучение местного гемостатического действия исследованных нами прокоагуляционных белков показало, что наиболее выраженной способностью к остановке кровотечений обладают фибрин-мономер в дозе 100 мг/см , фибрин-мономер в сочетании с ЭАКК, отечественный рФУПа в дозе 263мг/см" и препарат «НовоСэвен» 263мг/см~, а также раствор эхитокса в концентрации 866 мкг/мл, менее заметным кровоостанавливающим действием обладали растворы анцистрона и лебетокса

Заключение:

В настоящем исследовании было проведено изучение и дана сравнительная оценка специфической фармакологической активности гемостатических средств системного действия на основе pOVIIa. В работу были включены исследования in vitro, ex vivo и острые эксперименты на животных, проведенные на нескольких типах экспериментальных моделей, что позволило дать объективную оценку специфической фармакологической активности вошедших в настоящую работу веществ. Это имеет важное значение для ориентации дальнейших исследований врачей гематологов и фармакологов, а также может оказаться полезным в сфере экспериментальной медицины при создании новых кровоостанавливающих средств системного и местного действия. Также в данном исследовании была изучена способность к обеспечению локального гемостаза некоторых ранее не использовавшихся для этих целей белковых веществ и средств на основе активаторов различных этапов свертывания крови, наносимых в виде порошка и раствора.

На первом этапе работы было проведено исследование по изучению специфической фармакологической активности препарата «НовоСэвен» в эксперименте. Исследование in vitro показало, что препарат «НовоСэвен» дозозависимо влияет на время свертывания дефицитной по фактору VII плазмы крови человека. При этом коагуляционная активность препарата при использовании pOVIIa в концентрации 1000; 100; 10 и 1 нг/мл, соответственно, составляла 69,5; 81,0; 102,4 и 143,4 секунд. Совместное использование дефицитной по фактору VII плазмы с растворителем настоящего препарата (контрольное вещество) приводило к образованию фибринового сгустка через 262,8 секунд. В экспериментах ex vivo показано, что внутривенное введение препарата «НовоСэвен» интактным кроликам в дозе 90 мкг/кг сокращало протромбиновое время в 1,6 раза и повышало активность в плазме крови OVII на 37,5%, при этом не влияя на другие показатели коагулограммы (АЧТВ, ТВ, концентрацию фибриногена, число и агрегационную способность тромбоцитов). В серии острых экспериментов на модели парехиматозного кровотечения было подтверждено гемостатическое действие препарата «НовоСэвен». Показано, что через 60 минут после внутривенного введения данного препарат в дозе 90 мкг/кг наступает сокращение времени остановки кровотечения на 45,4%, а уменьшение объема кровопотери - на 53,2% от исходных значений исследуемых параметров. Отмечено ослабление гемостатического действия препарата через 180 минут после его введения.

Было установлено, что настоящий препарат в указанной дозе при внутривенной инфузии способен снимать антикоагулянтное действие прямых или непрямых антикоагулянтов. Так, внутривенная инъекция высокой дозы нефракционированного гепарина (500 МЕ/кг) приводила к выраженной гипокоагуляции, зафиксированной в эксперименте удлинением ВСЦК и АЧТВ. Сохраняющееся состояние коагулопатии у здорового животного продолжалось не менее 2 часов после инъекции антикоагулянта. Внутривенная инфузия препарата «НовоСэвен» в средней дозе (90 мкг/кг) приводила к 3-х кратному сокращению АЧТВ, а также укорочению ВСЦК через 1 час после одновременного применения вещества и гепарина. Эффект выраженого устранения гипокоагуляции наблюдался в течение 2-х часов после введения антикоагулянта.

В следующей части работы был показан эффект непрямого антикоагулянта варфарина. Пероральное применение данного препарата в максимальной суточной дозе для человека (0,15 мг/кг массы тела) у кроликов вызывало удлинение ПВ и ВСЦК. Так ПВ и ВСЦК спустя 3 дня перорального ежедневного введения антикоагулянта кроликам приводило к удлинению соответствующих параметров с 10,2 до 15,2 секунд и с 225 до 571 секунд, соответственно. После применения препарата «НовоСэвен» в дозе 90 мкг/кг наступала нейтрализация антикоагулянтного эффекта - в течение 3 часов после инфузии сохканялось сокращенное в 3 раза ПВ. В экспериментах in vivo продемонстрирован гемостатический эффект препарата «НовоСэвен» у животных с варфарин-обусловленной гипокоагуляцией, наступающий через 30 минут после его введения, при этом время остановки кровотечения сокращалось на 44,5%, а объем кровопотери на 42,7% относительно аналогичных параметров у животных, не получивших данный препарат. Инфузия препарата животным с варфарин-обусловленной коагулопатией приводила к укорочению времени остановки кровотечения и уменьшению объема кровопотери в 2,7 раза. Примечательно, что некоторые животные с варфарин-индуцированной гипокоагуляцией не доживали до 180 минутной отметки наблюдения, при этом введение препарата «НовоСэвен» позволяло в 100% случаях проводить наблюдение до данного интервала. Результатом настоящих экспериментов явилось подтверждение системного гемостатического действия препарата «НовоСэвен». Определены интервалы времени начала и окончания специфического фармакологического действия данного препарата в состоянии нормы, а также при нарушениях гемостаза, связанных с применением антикоагулянтов в условиях проведенного нам эксперимента. Обнаружена достоверно фиксируемая коагуляционная активность препарата «НовоСэвен» в нескольких концентрациях в экспериментах in vitro. В целом, определены критерии и границы их значений для изучения, а в последующем, и сравнительной оценки гемостатического действия отечественных образцов pOVIIa.

Следующим этапом работы стало изучение отечественного pOVIIa. Была исследована коагуляционная активность 14 серий данного белка. В ходе подготовки к экспериментам было отмечено длительное растворение серии №13. Растворение серии №14 оказалось неосуществимым. Приготовление растворов остальных серий отечественного pOVIIa не сопровождалось затруднениями. В результате проведенных в условиях in vitro экспериментов было определено, что серии отечественного pOVIIa №1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10 обладают сопоставимой коагуляционной активностью с препаратом «НовоСэвен», а равновесная смесь нескольких изученных образцов имеет эквивалентную препарату «НовоСэвен» активность.

Из отобранных образцов в эксперименты ex vivo и in vivo вошли 4 серии отечественного pOVIIa. В данной группе экспериментов было показано, что внутривенное введение отечественного pOVIIa серий №1, 2, 4 или препарата «НовоСэвен» в дозе 90 мкг/кг приводило к сопоставимым сокращеням значений ПВ н возрастанию активности OVIIa в плазме животных. При этом, показатели коагулограммы, такие как АЧТВ, тромбииовое время, концентрация фибриногена, число и агрегационная активность тромбоцитов достоверно не изменялись.

В отдельной группе исследований было определено влияние одной из наиболее коагуляционно-активных серий отечественного pOVIIa в максимальной терапевтической дозе pOVIIa (270 мкг/кг) на основные коагулогические показатели у интактных кроликов. Показано, что через 60 минут после внутривенного введения исследуемого вещества значительно возросла активность OVIIa по сравнению с его активностью до начала эксперимента. При этом разница показателя между значениями на исходном и конечном этапе эксперимента составила 61,4%. В тоже время сократилось, и протромбнновое время свертывания бедной тромбоцитами плазмы с 8,5±0,1 сек до значения менее 4,5 сек. Изменилась составляющая тромбоцитарпого гемостаза - спустя 60 минут после введения pOVIIa исследуемой серии незначительно сократилось число тромбоцитов. Так, после введения исследуемого рекомбинантного белка крови число тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме составило 75,7±5,2% при исходном значении 100.

В острых экспериментах in vivo определено, что отечественный pOVIIa серий №1, 2, и 4, вводимый в дозе 90 мкг/кг, оказывал гемостатический эффект через 30 минут после введения интактным животным. При этом сокращение времени остановки кровотечения составляло 34,3 - 57,1%. Выявлено стойкое уменьшение объема кровопотери, коррелирующее с сокращением времени остановки кровотечения. Через 30 минут наблюдения сокращение показателя составило 42,5-64,1%. Спустя 60 минут после введения отечественного рФУИа в указанной дозе сокращение времени остановки кровотечения достигало в среднем 60% (использование препарата «НовоСэвен» приводило к 45,4% сокращению данного параметра), а объем кровопотери уменьшался на 64,5% (препарат «НовоСэвен» - 53,2%). Аналогично иследовашгям способности препарата «НовоСэвен» купировать действие антикоагулянтов, были также проведены эксперименты с использованием отечественного рФУПа. В результате данных экспериментов было установлено, что отечественный рФУИа снимает действие нефракционированного гепарина через 1 час после одновременного введения веществ. Данный эффект проявился 2-х кратным сокращением АЧТВ и укорачением ВСЦК. Достоверное сокращение АЧТВ также отмечалось при очистке образцов плазмы экспериментальных животных сорбентом гепарина. Отчетливо проявлялся эффект купирования действия антикоагулянта варфарина отечественным рФУПа. Данный белок снимал антикоагулянтный эффект в течение трех часов наблюдения, 3-х кратно сокращая ПВ свертывания плазмы. В острых экспериментах in vivo введение вещества животным с варфарин-обусловленной коагулопатией приводила к укорочению времени остановки кровотечеппя и уменьшению объема кровопотери в 2,5 раза, при этом также, как и в случае применения препарата «НовоСэвен». На основании проведенных эксперименттов можно заключить, что исследованный нами отечественный рФУПа близок по своей специфической фармакологической активности к препарату «НовоСэвен».

В заключительной части работы были проведены эксперименты по исследованию веществ, впервые применяемых для местной остановки кровотечения. Был установлено усиление гемостатического эффекта отечественного pOVIIa при его одновременном использовании системно и местно. Так, спустя 60 минут после внутривенной инъекции данного вещества в дозе 90 мкг/кг время остановки кровотечения сокращалось на

53,3%, а объем кровопотери на 63,7% относительно исходных показателей. Дополнительное местное нанесение рФУНа на раневую поверхность позволило достичь более эффективного гемостаза, при этом сокращение времени кровотечения достигало 82%. Также отмечена высокая кровоостанавливающая способность белка крови фибрин-мономера при его местной аппликации на раневую поверхность печени интактных кроликов, а также маточного раствора эхитокса. Менее активно действовали растворы анцистрона и лебитокса.