Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Сравнительная оценка металлсвязывающей активности низкоэтерифицированных и высокоэтерифицированных пектинов

На правах рукописи

КОВАЛЁВ Валерий Владимирович

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТАЛЛСВЯЗЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ НИЗКОЭТЕРИФИЦИРОВАННЫХ И ВЫСОКОЭТЕРИФИЦИРОВАННЫХ ПЕКТИНОВ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

?

Владивосток - 2004

Работа выполнена в Институте биологии моря Дальневосточного отделения Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Хотимченко Юрий Степанович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Зориков Пётр Семёнович, доктор биологических наук

Кушнерова Наталья Фёдоровна

Ведущая организация: НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

диссертационного совета К 208 007 02 при ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет МЗ РФ» по адресу 690990, г Владивосток, пр Острякова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет МЗ РФ»

Защита состоится

часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета, к м.н.

Шмыкова И И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фундаментальной проблемой теорегтической фармакологии является установление закономерных связей между структурой химических соединений и их воздействием на живой организм. Удобным объектом для анализа таких связей могут служить пектиновые вещества, представляющие интерес и как потенциальный источник новых лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище (Thakur et al., 1997; Хотимченко и др., 2001; Sun et al., 2002; Nangia-Makker et al., 2002), и как материал для современных фармацевтических технологий (Miyazaki et al., 2006; Semde et al., 2000; Liu et al., 2003; Cheng, Lim, 2004).

Пектины относятся к классу полимерных углезодов и, как большинство полисахаридов, являются гетерогенными по структуре, молекулярной массе и физико-химическим свойствам. Их состав различается в зависимости от источника сырья, места произрастания растений и условий выделения (Chang et al., 1994). Первичными блоками полимерной цепи пектинов являются остатки D-галактуроновой кислоты, соединенные друг с другом а(1-И)-связью. Пектиновая цепь может состоять от нескольких десятков до нескольких сотен галакту роковых блоков (Thibault et al., 1993). между которыми на разных расстояниях друг от друга располагаются остатки L-рамнозы. Or основной линейной цепи рамногалаетуронана берут начало боковые цепи, состоящие из 8-20 молекул нейтральных Сахаров, таких как D-галакгопираноза, L-арабннофураноза, D-ксилопираноза, О-гяюкопираноза, L-фукопиэаноза, D-апиоза, 2-O-Merwi-D-ксилсза и 2-О-метилфукоза (Schob, Voragen, 1996; Thakur et al., 1997; Ridley et al., 2001). В зависимости от относительного количества карбоксильных групп в остатках галакгуроновой кислоты, ^тарифицированных метиловым спиртом, различают высокометохсилированные и нкзкометоксилированные пектины. Bcî эти структурные особенности молекул полисахарида создают разнообразие физико-химических параметров пектинов, что должно отражаться на их биологических и фармакологических свойствах.

В спектре фармакотерапевтич<*ских эффектов пектинов их способность снижать уровень сывороточного холестерина и липопроггеинов низкой плотности (Gonzalez et al, 1998; Vergara-Jimenez et al, 1998; Bladergroen et al, 1999), связывать тяжелые металлы (Kohn1987; ""»gpwaki g» al, 1997). уреииуияяп. экскрецию желчных ки-

FOC НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИ01ЕКА С Петербург J00ÊPK

•ft

слот (Garcia-Diez et al 1996), проявлять антимутагенную активность в отношении нитроаромагтическнх соединений (Hensel and Meier, 1999) и ингибироваггь пролиферацию злокачественных клеток (Heitman et al, 1992; Hsieh and Wu, 1995). Пектинсодер-жашие препараты оказывали лечебные эффекты у больных с гиперхолестеринемией (Groudeva et al., 1996; Knopp et al, 1999), сахарным диабетом (Levitt et al., 1980) и nep-систирующей диареей (Rabbani et al., 2001). Вместе с тем, аналэт литературы свиде-тельствуег о существенных противоречиях как в результатах близких по содержанию работ, так и в их интерпретации. Эти противоречия обусловлены отсутствием стандартизованных препаратов исследованных пектинов. В различных работах используются пектины неодинакового происхождения, с разной степенью этерификации, с разной молекулярной массой и с неодинаковыми реологическими свойствами. Лишь в единичных работах предприняты попытки установить связь структуры пектинов с их фармакологической активностью, например, с гипохолестеринемическнм действием (Kishimoto et al., 1995; Yamaguchi et al., 1995; Trautwein et al., 1998), воздействием на активность микрофлоры кишечника (Langhout et al., 1999) и сорбцией желчных кислот (Dongowski, 1995). Отсутствие в литературе достаточных сведений о закономерных связях между физико-химическими характеристиками пектинов, такими как вязкость, массовая доля полиуроновых кислот, относительное содержание свободных карбоксильных групп, с одной стороны, и фармакологическими эффектами, с другой стороны, определило цели и задачи настоящей работы.

Цель работы. Цель работы состояла в установлении зависимости металлсвя-зывакнцих свойств пектинов от их физико-химических характеристик.

Задачи работы:

1. Получить пектины с заданной степенью этерификации в диапазоне от 1 до 60% и охарактеризовать их физико-химические свойства по относительному содержанию свободных карбоксильных групп, содержанию ангидрогалактуроновой кислоты, характеристической вязкости и теоретической сорбционной емкости.

2. Определить сорбционные характеристики пектинов с разной степенью этерификации по отношению к ионам меди, свинца, кадмия, ртути, цинка и жечеза.

3. Изучить влияние рН среды на сорбционную активность пектинов с разной степенью этерификации при чзаимодействии с металлами.

4. Провести сравнительную оценку металлсвязываклцей активности пектинов с одинаковой степенью этерификации, полученных методом щелочной деттерифихации и способом смешивания низкоэтерифицированных и высокоэтерифицированных пектинов.

5. Оценить металлсвязывающую, гиполипидемическую и антитоксическую активность пектинов с разной степенью этерификации у экспериментальных животных.

Научная новизна. В работе впервые проведен анализ связи физико-химических свойств пектинов с их металлсвязывающей активностью. Исследованы сорбционпые свойства пектинов, различающихся относительным содержанием эте-рифицированных и деэтерифицированных карбоксильных групп, полягалактуроновой кислоты, вязкостью. Установлено, что эффективность связывания металлов пектинами in vitro зависит от их физико-химических свойств, при этом более значимую роль играют такие параметры, как степень этерификации и содержание свободной ангид-рогалактуроновой кислоты. Характеристическая вязкость играет меньшую роль, по крайней мере, по отношению к связыванию изученных металлов. Существенное влияние на связыьаиие металлов пектинами оказывает кислотность среды. Сдвиг рН в щелочную сторону приводит к повышению сорбционной емкости по меди, кадмию, свинцу и железу. Сорбционная емкость пектинов по ртути практически не зависит от рН среды.

В качестве важного количественного параметра сорбционной активности пектинов предложен показатель теоретической сорбционной емкости, позволяющий более точно судить о количестве карбоксильных групп, участвующих в связывании металлов.

Установлено, что эффективность выведение тяжелых металлов из организма экспериментальных животных с помощью пектиновых веществ зависит от степени этерификации пектинов. Гиполипидемическая и гепатопротекгорная активность пектинов не зависит от степени их этерификации.

Практическая значимость. На основе результатов экспериментальных исследований по оценке металлсвязывающей активности пектинов с разной степенью этерификации разработана технологическая схема производства биологически активных добавок к пище, активным компонентом которых является низкоэтерифицированный

пектин Материалы и технологические схемы внедрены в производство на Научно-производственной фирме «Востокфарм» (Владивосток).

Предложены к выпуску биологически активные пищевые добавки, сертифицированные в Федеральном центре Госсанэпиднадзора, зарегистрированные в Министерстве здравоохранения Российской Федерации (регистрационные удостоверения К« 77.99.04.916.Б.000361.08.03 и № 77.99.04.916.Б.000363.08.03), которые разрешены для реализации через аптечную сеть в качестве источника пищевых волокон.

Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на Всесоюзном семинаре «Проблемы производства продукции из красных и бурых водорослей» (Владивосток, 1987), Региональной конференции Сибири и Дальнего Востока «Перспективы развития малотоннажной химии» (Красноярск, 1989), 2-м съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995), 5,6 и 11-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 1999, 2004), 12-м съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998), 4-м Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище: XXI век» (Санкт-Петербург, 2000), 2-м съезде Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация выполнена на 133 страницах машинописного текста и состоит их введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы.

Работа содержит 16 рисунков и 36 таблиц. Библиография состоит из 219 отечественных и зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение металлов в растворах и биологических образцах. Для изучения сорбционных характеристик пектинов в отношении металлов применяли титри-метричесхий (комплексонометрический) метод определения меди, свинца, кадмия, ртути, цинка и железа, используя в качестве металлоиндигаторов мурексид, ксилено-лопый оранжевый и эриохром черный Т (Пилипенко, Пятницкий, 1990).

Для сравнительной оценки сорбцнонной емкости пектинов и препаратов сравнения применяли метод иои-селективных электродов. Количественный анализ металлов в растворе проводили с использованием иономера NICO (Elit), модель 3320 pH Meter и ион-селективных электродов для соответствующих ионов металлов: свинец-селективный электрод ХС-РЬ-001, медь-селективный электрод «Вольта-3000», кадмий-селективный электрод XC-Cd-01 и ртуть-селективный электрод «Вольта». В ходе эксперимента в пробу, содержащую 100 мг исследуемого сорбента, титрованием добавляли раствор исследуемого металла с концентрацией 0,2 мг/мл. С помощью ион селективного электрода осуществляли постоянный контроль концентрации свободных ионов в исследуемом растворе. Титрование прекращали при достижении в растворе концентрации исследуемого металла 0,05 мг/мл. После этого, исходя из полученного объема раствора, вычисляли общее количество металла, находящегося в растворе в свободном состоянии. Количество металла, связавшегося с 100 мг сорбента, вычисляли как разность между количеством металла, которое попью на титрование и количеством металла, находящегося в растворе в вице свободных ионов.

Содержание свинца в биологическом материале определяли атомно-абсорбционным методом. Для этого материал (фекалии) высушивали в термостате при температуре 80-85°С до постоянной массы и измельчали. Навески массой 100-200 мг переводили в раствор с помощью мокрого озоленкя в смеси концентрированных кислот (HN03:HC104,2:1, об/об). Процесс минерализации осуществляли в стеклянных колбах при 180"С в течение 10 ч и прекращали после обесцвечивания образцов. Высушенный и обесцвеченный остаток пере pan ворили в 0,1 н. HCl. В качестве контроля использовали соответствующие объемы смесей кислот, которых подвергали аналогичной сбработке. Содержание металлов определяли ка атомно-абсорбционном спектрофотометре «Shimadzu AA-610S» (Япония). Расчеты проводили относительно стандартных растворов соответствующих металлов (Julshamn et al., 19?9; Никанороп, Жу-лидов, 1991).

Сырьевые источники изучаемых препаратов. Для получения различных образцов пектина использовали высокоэтерпфицирог чнный пектин, произведений компанией Copenhagen Pectin A/S, Lille Skensved (Дания). Коммерческий пектин очищали от балластных веществ промывкой водно-спиртовыми растворами и высушивали. Полученные образцы имели следующие характеристики: содержание чисто-

го галактуронана в молекуле пекткиа 79,4%, степень этерификации 60,2%, характеристическая вязкость 915 мл/г галактуронана.

Для сравнительных исследований получали образцы низкоэтерифицированного пектина из морской травы Zostera marina, собранной в зал. Петра Великого (Японское море) в весенне-летний период.

Характеристика экспериментальных животных. Экспериментальные исследования были выполнены на 135 половозрелых белых нелинейных крысах-самцах массой 150 - 200 г. Животных содержали в виварии ТИБОХ ДВО РАН. Во время экспериментальных исследований крыс помешали в специальные пластмассовые клетки со стружечной подстилкой по 5-6 животных в каждой. В эксперименте по оценке выведения тяжелых металлов с фекалиями животные содержались в индивидуальных обменных клетках. Все животные помимо сбалансированного рациона получали овес, хлеб, свежие овощи и фрукты, мел, также в зимнее время были добавлены комплексные поливитаминные препараты.

Основные требования к содержанию, выбору и подготовке животных для экспериментов осуществляли с принятыми рекомендациями. При разделении животных на группы проводили их ранжирование по массе тела с целью обеспечения идентичности указанных групп по данному показателю. Содержание животных, наркоз, дека-питацию проводили в соответствии с рекомендациями Рабочей группы Федерации Европейского Сообщества по науке лабораторных животных (Копаладзе, 1998).

Биохимические методы. Степень этерификации и содержание ангидрогалак-туроновой кислоты в пектинах определяли титриметрическим методом (Afanasyev et al., 1984). Характеристическую вязкость определяли, используя вискозиметр Уббело-де. Молекулярную массу вычисляли по эмпирическому уравнению Марка-Хауинка (Kravtchenko, Pilnik, 1990).

ОбщиР холестерин в сыворотке крови определяли спектрофотометрическим методом, длина волны 580 нм (Портяная и да., 1990). Определение активности алани-наминотраисферазы и аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови проводили с помощью наборов реактивов «Биолахема-тест». Содержание диеновых коньюгатов ненасыщенных жирных кислот оценивали по характерному спектру поглощения раствора липидов в смеси изопропан-гексан. К 2,0 мл гомогената приливали 4,0 мл смеси изопропанол-гексан (1:1), встряхивали 10-15 мин на шейкере и прибавляли 1,0 мл

раствора HCl (рН-2,0) и 2,0 мл гоксана. Смесь встряхивали и через 20-30 мин отбирали гексановый слой, в котором измеряли оптическую плотность при длине волны 232 нм (Владимиров, Арчаков, 1972)

Для определения малонового дйальдегида к 1,0 мл гомогената добавляли 1,0 мл 30% раствора трихлоруксусной кислоты н 1,0 мл 0,75% раствора тиобарбтуровоЯ кислоты. Полученную смесь перемешивали и ставили на водяную баню на 13 мин, а затем центрифугировали. Оптическую плотность кадосадочной жидкости, содержащей водорастворимые продукты перекисного окисления липидов, определяли при длине волны 532 нм (Yagy, 1984).

Для измерения восстановленного глутатиона в печени, кусочки органа гомогенизировали, к 1 мл супернатанта приливали 120 мкл 50% раствора трихлоруксусной кислоты, пробу ставили на 30 мин на холод и центрифугировали. К ОД мл супернатанта приливали 1,8 мл 0,2 М трис-HCl (рН~8,5), 20 мкл раствора Эллмана. и определяли оптическую плотность раствора при длине волны 412 нм (Anderson, 1985).

Статистическая обработка результатов. Для статистического анализа и обработки результатов исследования рассчитывали средние арифметические величины и ошибки средних арифметических. Оценку достоверности различия результатов экспериментальных наблюдений проводили в сравнения с контролем с применением t-критерия Стьюдента для малых величии (п < 30).

Для оценки результатов исследований с несколькими выборками использовали метод однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующими проведением post hoc теста Tkuey's. Уровень значимости считали достоверным при р < 0,05 (Гублер, 1978, Fan, Li, 2000). ■

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Способы получения я стандартизация препаратов пизкоэтеряфицированных пектинов

Для получения образцов пектина со степенью этерификации мензе 60,0% применяли модифицированный нами метод щелочной деэтерификации высокоэтерифи-цированного пектина (СЭ=60,2%) в водном растворе этанола. Исходный высокоэте-рифицироваиный пектин предварительно очищали промывкой 50% раствором этаяо*

ла. Для работы использовали мелкодисперсную фракцию, прошедшую через сию с размером ячеи 74 мкм. Собственно процесс деэтерификации осуществляли следующим образом. 20,0 г порошка пектина суспендировали в 200,0 мл 50% этанола и при интенсивном перемешивании добавляли 1 М раствор NaOH в 50% этаноле. Раствор щелочи вводили небольшими порциями, по 1-2 мл, во избежание как локального, так и общего (во всем реакционном объеме) скачка рН. Для визуального контроля процесса в реакционную среду добавляли индикатор фенолфталеин (10-20 мг). Очередную порцию щелочи добавляли в систему только после обесцвечивания индикатора. После того как в систему было введено примерно 95% расчетного количества щелочи, производился отбор пробы цля определения степени этерификации, и по результатам анализа осуществлялась корректировка добавляемого количества щелочи. После достижения заданной степени этерификации реакционную смесь подкисляли при интенсивном перемешивании 1М раствором НС1 в 50% этаноле до рН 5-6 (по индикаторной бумаге). Готовый пектин отделяли от водно-спиртового раствора на фильтре и промывали 300 мл 50% этанола, затем 150 мл 95% этанола. Промытый пектин сушили при 70° С.

В готовом образце пектина определяли содержание свободной ангидрогалакту-роновой кислопгы, общее содержание ангидрогалактуроновой кислоты, степень этерификации и характеристическую вязкость пектина. На основании полученных данных рассчитывали теоретическую сорбционную емкость для каждого образца пектина, основываясь на модели взаимодействия полиуронидов с катионами поливалентных металлов. Данная модель предполагает, что для образования прочного комплекса металла и пектина необходимо чтобы в связывании каждого катиона металла участвовали два остатка ангидрогалактуроновой кислоты, содержащие свободные карбоксильные группы, то есть молярное соотношение свободной ангидрогалактуроновой кислоты и металла должно быть 2:1.

По выше приведенной методике деэтерификации было получено 7 образцов пектинов, которые вместе составляли ряд с равномерным увеличением степени этерификации от 1,2% до 60,2 %. Интервал изменения величины степени этерификации между соседними образцами составлял около 10% (табл. 1). Образцы пектинов, подвергшиеся деэтерификации (образцы I - VI), имеют сравнительно близкое содержание ангидрогалактуроновой кислоты - от 66.6% до 73,7%. С уменьшением степени этери-

фикации пектина с 60.2% до 1,2% произошло увеличение содержания свободной ан-гидрогалактуроновой кислоты - с 31,6% до 72,8% и связанной с ней величины теоретической сорбционной емкости - с 0,90 ммоль/г до 2,07 ммоль/г.

Таблица 1.

Физико-химические характеристики исследуемых образцов пектинов

Наименование показателя Условное обозначение образцов

1 11 111 IV V VI VII

Степень этерификации, % 1,2 9,6 18,8 27,4 40,1 52,0 60,2

Общее содержание ангидрогалактуроновой кислоты, % 73,7 72,5 66,6 67,8 70,4 72,0 79,4

Содержание свободной (не ^тарифицированной) ангидрогалактуроновой кислоты, % 72,8 65,5 54,1 49,2 42,2 34,6 31,6

Характеристическая вязкость, мл/г ангидрогалактуроновой кислоты 408 427 433 452 533 570 915

Теоретическая сорбцион-ная емкость по отношению к двухвалентным металлам, ммоль металла/г пектина 2,07 1,86 1,54 1,40 1,20 0,98 0,90

Физико-химические характеристики образца пектина, полу ченного нами из морской травы Zostera marina и используемого в дальнейшей работе, были следующими- степень этерификации - 7,9%, общее содержание ангидрогалактуроновой кислоты - 70,0%, содержание свободной ангидрогалактуроновой кислоты - 64,5%, характеристическая вязкость 620 мл/г ангидрогалактуроновой кислоты, теоретическая сорбцнонкая емкость по отношению к двухвалентным металлам - 1,83 ммояь металла/г пектина.

Кроме метода щелочной деттерификации образцы пектина с заданной степенью этерификации получали путем смешивания образцов пектина с более высокой и более низкой, чем необходимая, степенью этерификации в определенной пропорции, которую находили из уравнения:

т. СЭ-СЭ, А. —-—* ' —г. где т. СЭ, -СЭ. А,

ш„ - количество пектина с низкой степенью этерификации, г, т. - количество пектина с высокой степенью этерификации, г; СЭ. - степень этерификации низкоэтерифи-цированного пектина, %; СЭ. - степень этерификации высокоэтерифицированного пектина, %; СЭ, - заданная степень этерификации, %; А, • содержание ангидрогалак-туроновой кислоты в высокоэтерифициро ванном пектине, %; А, - содержание ангид-рогалактуроновой кислоты в низкоэтерифииированном пектине, %.

Металлсвязывающая активность пектинов с разной степенью этерификации

ш

В ходе предварительных экспериментов изучали кинетику сорбции на модели связывания пектинами нонсв меди, устанавливали зависимость сорбционной активности пектинов от концентрации металла в растворе. В последующих экспериментах изучали величину сорбционной емкости пектинов с разной степенью этерификагии по отношению к меди, свинцу, кадмию, ртути, цинку, двухвален гному и трехвалентному железу в зависимости от кислотности среды. Для изучения процессов сорбции был разработан метод непосредственного взаимодействия сухого порошка пектина и раствора металла. Образующийся гель пекгата металла занимал малый объем и легко отделялся от жидкой фазы фильтрованием. Для работы использовали фракцию с размерами частиц 125-177 мкм. Навеску сухого пектина массой около 50 мг помещали в пробирку и последовательно добавляли рассчитанное количество металла в виде 0,1 М раствора, 1 0 мл 1 М буфера с нужным значением рН и доводили объем жидкой фазы до 5,0 мл добавлением рассчитанного количества дистиллированной воды. Содержимое пробирки после добавления каждого компонента тщательно перемешивали. Пробирку герметично закрывали, и полученную смесь инкубировали г течение 30 мин при постоянном перемешивании По окончании процесса сорбции жидкую фазу

отделяли фильтрацией череч капроновый фильтр с размером ячеи около 50 мкм. В полученном фильтрате определяли остаточное содержание металла титриметриче-ским методом.

Изучение кинетики сорбции проводили с образцом I, имеющим наибольшую теоретическую сорбционную емкость (ТСЕ). В качестве связываемого металла использовали медь. Процесс сорбции осуществляли с помощью оригинального устройства, состоящего из инкубационной ячейки с фильтрующим элементом из капроновой сетки и сборной емкости, снабженной поршнем. Сетка фильтра имела размер ячеи около 100 мкм, что позволяло жидкости быстро проходить через нее. Условия проведения сорбции были следующие. В инкубационную емкость помещали 50,0 мг пектина, в сборнике готовили рабочий раствор, содержащий 1,5 мл 0,1 М раствора СивО.», 1,0 мл 1 М ацетатного буфера с рН 6,0 и 2,5 мл дистиллированной воды. Количество меди в растворе составляло 0,15 ммоль, около 150% по отношению к ТСЕ взятого образца пектина. Для запуска процесса сорбции инкубационную ячейку и сборник соединяли, и рабочий раствор перемещали поршнем. Одновременно запускался секундомер. Инкубационную ячейку закрывали крышкой, и ее содержимое перемешивали в течение заданного промежутка времени, после этого жидкость отсасывали, отбирали 2,5 мл фильтрата, в котором определяли остаточное содержание металла. После этого к оставшемуся объему жидкости добавляли 0,5 мл ацетатного буфера, объем 0,1 М раствора Сгё04, соответствующий количеству меди, содержавшейся в пробе, взятой для анализа, и дистиллированную воду до 2,5 мл. Процедуру сорбции повторяли в течение заданных промежутков времени. В ходе эксперимента установлено, что состояние обменного равновесия достигается через 10 мин и в дальнейшем увеличения сорбции не происходит.

В следующей серии экспериментов определяли зависимость сорбционной активности пектина от исходной концентрации металла в растворах пр> различных значениях рН. Кислотность среды изменяли в пределах рН 2,0-8,0. Дня поддержания нужного значения рН среды использовали буферные растворы. При выборе буферов учитывали, что кроме регулирования рН буфер должен с'.еспечивать растворимость .указанных металлов за счет образования с ними растворимых комплексов, достаточно прочных, чтобы все количестао металла находилось в растворе, но при этом значительно уступающих по прочности комплексу металл - пектин. Экспериментальным

путем были подобраны три буферных состава, удовлетворяющие указанным требованиям и перекрывающие весь рабочий диапазон рН: глициновый буфер (глицин/ НКОз) для диапазоне рН 2,0-3,0; ацетатный буфер (уксусная кислога/ КаОН) для диапазона рН 4,0-6,0; трис-буфер (трис/ ЬГЫОз) для диапазона рН 7,2-8,0. При всех значениях рН при равновесной концентрации металла равной 0,01 моль/л достигается состояние близкое к насыщению. В дальнейшем сорбционную емкость пектинов определяли при остаточной концентрации металлов в растворе 0,01 ± 0,0005 моль/л. Абсолютная сорбционная емкость по меди у всех образцов пектина снижалась с увеличением степени этерификации при всех значения рН. При увеличение рН с 2,0 до 8.0 сорбционная емкость повышалась в среднем в 2 раза. Относительная сорбционная емкость по меди, выраженная в процентах от ТСЕ, не зависела от степени этерификации пектинов. В целом аналогичную картину наблюдали при изучении сорбции свинца при рН от 2,0 до 6,0 и цинка при рН от 2,0 до 8,0. Опюсительная сорбционная емкость по кадмию при всех значениях рН от 2,0 до 8,0 существенно зависела от степени этерификации пектина. Сорбция ртути не зависела от рН растворов, в которых происходило взаимодействие металла с пектином. Сорбционная емкость по ртути (в мг/г сорбента) у всех образцов пектинов практически не изменялась при увеличении рН от 2,0 до 6,0, за исключением обоазцов со степенью этерификации 52,0% и 60,2%, у которых различия в сорбционной емкости между крайними значениями рН составляли 6,7% и 10,1%, соответственно. Значения относительной сорбционной емкости у образцов пектинов со степенью этерификации 1,2%, 9,6% и 18,8% не зависели от рН растворов. Уже при рН 2,0 эти значения относительной сорбционной емкости достигают максимума. У остальных образцов максимум насыщения наступал при рН 4,0. Опюсительная сорбционная емкость по двухвалентному железу у всех образцов пектинов возрастала с увеличением рН среды. При значениях рН от 3,0 до 8,0 величины относительной сорбционной емкости по этой иону у образцов пектина с различной степенью этерификации заметно различались, а при рН 2,0 эти различия были незначительны. Относительная сорбционная емкость по трехвалентному железу снижалась, хотя и незначительно, с повышением степени этерификации только при рН 2,0. У образца со степенью этерификации 60,2% эта величина была на 28,7% меньше, чем у образца со степенью этерификации 1,2%. При остальных рН наблюдали противопо-

ложную картину: позышение степени этерификации приводило к увеличению относительной сорбционной емкости.

Кинетика связывания всех металлов пектином, выделенным из морской травы Zostera marina, напоминала таковую пектина со степенью этерификации 9,6%.

Значения сорбционной емкости по меди, свинцу и кадмию у образцов пектина, полученных методом щелочной летгерификации и методом смешивания, практически не различались; отличия не превышали 2%.

Полученные данные по изучению связывания металлов пектинами, различающимися физико-химическими свойствами, подчеркивают важность стандартизации препаратов пектинов, исследуемых на их фармакологическую активность.

Сравнительная опенка связывания металлов пектинами и лекарственными препаратами in vitro

Для оценки металлсвязывающей эффективности серосодержащих, комплексо-образующих соединений, сорбентов и пектинов с рязной степенью этерификации использовали метод ион-селективных электродов.

Максимальная металл связываюшак активность по отношению к свинцу была обнаружен у унитиола. Активность натрия тиосульфата и ЭДТА ниже в среднем на 12,7 и 17,4% соответственно, чем таковая унитиола. Активность образца пектина со степенью этерификации 1,2% ниже в среднем на 40,8%, образца пектина со степенью этерификации 60,2% - на 90,9%, активированного угля - на 98,2%, полифепана - на 99,0%. Препараты смеюгы, микрокристаллической целлюл тзы и энтеродеза сорбировали такое низкое количество свинца, которое надежно не регистрировалось методом ион-селективных электродов. Сорбционная емкость по свинцу образца пектин-I прс вышала таковую образца пектин-VII в 6,5 раза. Сорбционная емкость по этому металлу у низкоэтерифицированного пектина со степенью этерификации 1,2% превышает таковую активированного угля и полифепана в 32,8 и 58,9 раза (табл. 2).

Максимальная сорбционная активность по кадмию была установлена у натрия тиосульфата Активность ЭДТА ниже активности тиосульфата натрия на 82,4%, а унитиола - на 98,5%. Сорбционная емкость образцр пектина со степенью этерификации 1,2% на 60,4% ниже сорбционной активности тиосульфата нагрия. Связующая

активность активированного угля и полифепана была ниже активности тиосульфата натрия более чем в 80 раз. Препараты смекты, микрокристаллической целлюлозы и знтеродеза сорбировали столь низкое количество кадмия, что оно не определялось методом ион-селективных электродов. Этим же методом не удалось определить способность пектина со степенью этерификации 60,2% связывать кадмий in vitro, так как в растворе этого пектина с кадмием происходило образование геля с большой вязкостью. В этих условиях кадмиевый электрод не фиксировал изменения э.д.с. раствора. Связывание кадмия пектином со степенью этерификации 1,2% превышает активность унитиола в 26,3 раза, ЭДТА в 2,2 раза, активированного угля и полифепана в среднем в 32,2 раза.

Наибольшая связывающая активность в отношении ртути обнаружена у унитиола. Активность пектина со степенью этерификации 1,2% ниже на 61,5%, а пектина со степенью этерифика (ни 60,2% - на 89,4%. Сорбционная активность препаратов активированного угля, смекты, полифепана, микрокристаллической целлюлозы и знтеродеза не определялась методом ион-селективных электродов. Металлсвязывшощая активность в отношении ртути у образца пектин-I превышает таковую образца пектин-VII в 3,6 раза (табл. 2).

Таблица 2.

Сорбционная емкость различных препаратов по свинцу, кадмию и ртути

(метод нон селективных электродов)*

Препарат Сорбционная емкость, ммоль Ро/г препарата Сорбционная емкость, ммоль Cd/r препарата Сорбционная емкость, ммоль Си/г препарата

Унитиол 2,884*0,233 0,044±0,020 1,887*1,115

ЭДТА 2,517±0,181 0,515*0,169 1,710*0,141

Натрия тиосульфат 2,381±0,189 2,925*0,224 н.о.**

Пепин I (СЭ***«1,2) . 1,707*0,137 1,158±0,133 0,725*0,060

Пектин VII (СЭ=60Д) 0,262±0,018 н.о.** 0,200*0,018

Уголь активный 0 052±0,007 0,036*0,004 около 0

Полифепан i 0,029*0.015 0,036*0,005 икало 0

Примечанье: *в таблице приведены средние результаты трех экспериментов, ** н.о. - не определяли, ** СЭ - степень этерификации.

По связыванию меди наибольшая активность была обнаружена у унитиола. Активность натрия тиосульфата меньше на 62,2%, ЭДТА - на 53,3%, пектина со степенью этерификации 1,2% - на 75,9%, пектина со степенью этерификации 60,2% - на 95,5%. Очень низкая активность проявил активированный уголь, а активность препаратов смекгы, микрокристаллической целлюлозы, полифепана и энтеродеза была близка к нулевой. Связывающая активность в отношении меди образца пектии-1 превышает таковую образца пекши-VII в 5,4 раза.

Влияние пектинов с разной 'тепепью этерификации на выведение свинца у крыс

Эксперименты по оценке способности пектинов выводить из организма крыс депонированный в органах и костях свинец проводили следующим образом. В начале опыта животных разделили на две группы. Первая группа - контрольная. Вторая группа объединяла всех подопытных животных, которым на первом этапе вводили энтерально с помощью зонда ацетат свинца в дозе 100 мг/кг массы тела в сутки 21 дня. В течение последующих 7 дней все животные находились на обычном рационе. После этого животных, получавших ацетат свинца, разделили на 4 группы по 4-6 крыс в каж дой. Каждая крыса содержалась в отдельной клетке. Начиная с 28-го дня эксперимента, 1-й подоттной группе за час до кормления вводили 1-1°,5 мл дистиллированной воды. 2-й подопытной группе вводили пектин со степенью этерификации 1,2% в виде водного раствора. 3-й подопытной группе вводили пектин со степенью этерификации 52,0%. 4-й подопытной группе вводили пектин со степенью этерификации 60,2%. Доза всех образцов пектина составила 0,5 г/кг массы тела в сутки. На ?5-й, 42-й и 49-й дни эксперимента от каждой крысы в течение суток собирали фекалии, их взвешивали, высушивали в термостате при температуре 60-80°С в течение 24 ч и определяли в них содержание свинца атомжьабсорбциснным методом. После этого вычисляли суточную экскрецию свинца.

Перед началом эксперимента концентрация свинца в фекалиях во всех группах была одинаковой. Через 3 недели энтерального введения ацетата свинца концентрация свинца увеличилась в среднем в 130-170 раз. Через неделю после прекращегия введения свинца концентрация свинца резко уменьшилась, но оставалась примерно в

1,9 - 2,2 раза выше исходной концентрации. Через неделю после начала введения пектинов различия между группами крыс различались, но не достоверно. Еше через неделю только в группе крыс, которым вводили пектин со степенью этерификации 1,2%, концентрация свинца была больше, чем в контрольной группе (+РЬ) на 30,2% (Р < 0,05). Еще через неделю в группе крыс, которым вводили пектин со степенью этерификации 1,2%, концентрация свинца была больше, чем в контрольной группе (+РЬ) на 64,С%(Р < 0,01).

Таблица 3.

Суточная экскреция свинца (мкг) с фекалиями у крыс с экспериментально повышенным уровнем свинца в организме после энтерального введения пектинов с разной степенью этернфикацни

Группа животных Сроки эксперимента, сутки

0 21 28 35 42 49

Контроль I (-РЬ) 183,8± 16,2 237,4± 23,8 212,9± 16,3 234,6± 20,9 209,9± 18,3 235,3± 20,4

Контроль II (+РЬ) 156,3± 13,7 31,2± 3,2 мг 406,5± 36,2 353,9± 31,0 320,8± 28,4 202,2± 17,3

Пектин I (СЭ-U) 177,8± 16,2 30,2± 2,6 мг 434Д± 38,2 479,6± 44,7 481,1± 46,5' 383,8± зиь

Пектин VI (СЭ=52,0) 165,6± 16,0 32,8± 2,7 ж 370Д± 34,9 465,1± 46,3 482,5± 47,3* 282,1± 24,5е

Пектин VII (СЭ-60,2) Р5,9± 16,4 31,6± 2,8 394,4± 37,8 407,5± 38,9 351,0± 32,7е 247,7* 23,3е

Примечание: - Р < 0,05 при сравнении с группой «контроль II», ь - Р < 0,01 при сравнении с группой «контроль II»,с - Р < 0,05 при сравнении с группой «пектин I».

Результаты вычисления суточной экскреции свинца примерно отражают те же закономерности. Но достоверные различия между группами «пектин VII». с одной стороны, и остальными двумя пектиновыми группами, с другой стороны, были отмечены на 42-й и 49-й дни эксперимента (табл. 3).

Результаты проведенного эксперимента показали, что эффективность пектинов по выведению свинца, депонированного во внутренних органах лабораторных животных, зависит от степени этерификации пектина. Она выше у пектинов с меньшей степенью этерификации.

Гиполипидемическая активность пектинов

На модели гиперлипидемии, вызванной внутрижелудочным введением с кормом холестерина (2%), свиного сала (5%) и холевой кислоты (0,25%) в течение 21 дня, образцы пектина со степенью этерификации 1,2%, 52,0% и 60,2% в дозе 50 мг/кг массы тела в сутки препятствовали повышению уровня тр 1глицеридов и общего холестерина в сыворотке крови и печени крыс (табл. 4). Достоверных различий по всем исследованным показателям между группами, получавшими пектины с разной степенью этерификации, не было выявлено.

Таблица 4.

Показатели липидного обмена у крыс с алиментарной (жировой/ гиперлнпнде-мией, получавших пектины с разной степень этерификации

Группа животных В сыворотке крови В печени

Общий холестерин, ммоль/л Триглице- риды, ммоль/л Холестерин-ЛПВП, ммоль/л Общий холестерин, мкмоль/г Триглице- риды, мкмоль/г

Контрогьная п=6 1,1 ±0,08 0,8 ±0,04 0,7 ± 0,04 12,7 ± 1,38 19,0 ±0,86

Гиперлипиде-мия, п=8 3,2 ±0,18 2,1 ±0,21 0,5 ± 0,03 26,9 ± 2,24 44,8 ± 3,36

Пектин-1 (СЭ=и),п=8 2,3 ±0,14* 1,3 ±0,10* 0,7 ± 0,09 17,1 ± 1,35* 28,6 ± 2,31*

Пектин-VI (СЭ=52,0), п=8 2,2 ± 0,16* 1,2 ± 0,08* 0,7 ± 0,06 18,3 ± 1,41 29,7± 2,37*

Пектин-VII (СЭ=60,2), п=8 2,2 ±0,14* 1,4 ±0,11* 0,6 ± 0,07 15,6 ± 1,23* 34,6 ±3,17*

Примечание: * - Р < 0,05 при сравнении с группой «гнперлипидемия».

На модели гиперлипидемии, вызванной вы^окоуглеводным рационом, ко>да к рациону добавляли сахарозу (20%) в течение 30 дней, все образцы пектинов в мозе 50

мг/кг в сутки также препятствовали повышению уровня холестерина и триглицеридов в сыворотке крови и печени. Достоверных различий по всем исследованным показателям между группами, получавшими пектины с разной степенью этерификации, и на данной модели также не было выявлено.

Антитоксическая активность пектинов

На модели тетрахлорме^ановой интоксикация изучали антитоксическое действие пектинов. ССЦ вводили внутрижелудочно в дозе 300 мг/кг/сут в I мл оливкового масла в течение 7 дней. После этого вводили пектины в дозе 0,25 г/кг/сут в течение 21 дня. Об эффективности пектинов судили по биохимическим показателям в крови животных, которым вводили пектины или дистиллированную воду (табл. 5).

Таблица 5.

Влияние пектинов на активность аланинамннотрансферазы (АлАМТ) и аспяр-татамннотрансферазы (АсАТ), уровень малоиового диальдегида (МДА) и диеновых коньюгатов в сыворотке крови крыс с тетрахлорметановой интоксикацией

Группа животных АлАТ (мккат/л плазмы) plasma) АсАТ (мккат/л плазмы) МДА (нмоль/мл плазмы) Диеновые коньюпгты (нмоль/мл плазмы)

Контрольная (-ССЦ), п=5 0,52±0,04 0,34±0,03 3,04±0,21 2,45*0,16

Контрольная (+ССЦ), п=6 3,62*0,24 2,17±0,18 9,57±1,07 6,59±0,52

Пектин-1 (СЭ=1Д), п=8 1,74±0,22* 0,68±0,06* 4ДЗ±0,Зб* 3,60*0,44»

Пектин-VI (СЭ=52,0),п=8 1,96±0,28* 0,73±0,12* 5,84±0,47* 3,49±0,38*

Пектин-VII (СЭ-60,2),п=8 2,18±0,34* 0,88±0,14* 5,63±0,50* 3,15±0,36*

Примечание: * - Р < 0,05 при сравнении с группой «контроль-П».

Полученные данные показывают, что пектины с разной степенью этерифика-ции в исследованной дозе по антитоксической активности на модели тетрахлормета-нового поражения крыс не отличаются друг от друга.

Выявленные эффекты пектинов, как показано в работе, зависят от свойств самих пектинов. Нам удалось показать, что, по крайней мере, металлсвязывакмцая активность зависит от степени этерификация молекулы пектина. В то же время гипохо-лестеринемический н гепатопротекторный эффекты в наших экспериментах не зависели от этого параметра. По-видимому, механизм этих эффектов отличается от механизма, обусловленного связывающими свойствами пектинов. Прикладное значение имеют эксперименты, в которых показано, что образцы пектинов с заданной степенью этернфикации, полученные разными методами (щелочной деэтерификации и методом смешивания), практически не отличаются друг от друга по металлсвязываю-щей активностью. Этот факт, на наш взгляд, будет иметь большое значение для фармацевтического производстьа пектинов.

ВЫВОДЫ

1. Модифицированным методом щелочной деэтерификации получены образцы пектинов со степенью этернфикации 1,2%, 9,6% 18,8%, 27,4%, 40,1%, 52,0% и 60,2% и установлены чх физико-химические характеристики. Показано, что характеристическая вязкость пектина снижается с уменьшением степени этернфикации, при этом содержание ангидрогалактуроновой кислоты не изменяется. Все полученные образцы отнесены к высокомолекулярным пектинам.

2. Абсолютная сорбционная емкость пектинов по отношению ко всем исследованным металлам повышается с уменьшением степени этернфикации. Относительная сорбционная емкость пектинов по отношению к кадмию и двухвалентному железу повышается с уменьшением степени этернфикации. Относительная сорбционная емкость пектинов по отношению к меди, свинцу, цинку и ртути не зависит от степени этернфикации при рН выше 4,0.

3. При увеличении рН среды абсолютная и относительная сорбционная емкость пектинов по отношению к большинству исследованных металлов повышается. Сорбционная емкость по ртути у низкоггерифицированных пектинов не зависит от рН, а у

высокоэтерифицированных эта зависимость выражена слабо. Абсолютная сорбцион-ная емкость по трехвалентному железу повышается с увеличением рН, а относительная сорбционная емкость по этому металлу при рН 2,0 повышается с понижением степени этерификации, а при рН 3,0 и больше повышается с увеличением степени этерификации.

4. Образцы пектинов с заданной степенью этерификации, полученные методом щелочной деэтерификации и способом смешивания низкоэтерифицированных и вы-сокоэтерифицированных пектинов, характеризуются близкими значениями сорбци-онной емкости по меди, свинцу и кадмию.

5. В опытах на экспериментальных животных показано, что способность пектинов выводить из организма тяжелые металлы зависит от степени этерификации их молекул. Гиполипидемическая и гепатопротективная активность пектинов не зависит от их степени э^ерификиции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пзктины с низкой степенью этерификации могут рассматриваться как перспективный источник для разработки лекарственных препаратов, предназначенных для связывания тяжелых металлов.

1. Биологически активные добавки к пище, содержащие низкоэтерифицирован-ные (низкометоксилированные) пектины, можно рекомендовать к клиническому изучению в качестве средств профилактики и коррекции хронических отравлений тяжелыми металлами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Патент 2000064 Российская Федерация, МПК7 А 23 Ь 1/0524. Способ получения пектина из морских трав / А.А. Артюков, Ю.Н. Лоенко, В.В. Ковалев, Е.А. Платова, Ю.В. Федосов, Г.Б. Еляков - № 05037519 ; заявл. 15.04.<»2 ; опубл. 07.09.93, Бюл. № 33-36.

2. Лямкин Г.П., Артюков А А., Ковалев В.В, Лоенко Ю.Н. Влияние зосгерина, яльгинага натрия л различных видов пектинов из связывание и выведение свинца из

организма II Тез. докл. Всесоюз. семинара «Проблемы производства продукции из красных и бурых водорослей». Владивосток, 1987. С. 67-68.

3. Ковалев В.В., Артюков A.A., Лоенко Ю.Н., Лямкин Г.П. Использование морской травы зостеры для получения низкоэтерифицированного пектина И Тез. докл. Регион, копф. Сибири и Дальнего Востока «Перспективы развития малотоннажной химии». Красноярск, 1989. С. 143.

4. Савченко О.В., Ковалев В.В., Янкина Т.А., Степанов Д.Ю., Шевцова О.И., Хотимченко Ю.С. Профилактика свинцовой интоксикации альгинатами и пектинами у крыс // Тез. докл. II съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск, 1995. С. 382-383.

5. Хотимченко Ю.С., Ковалев В.В., Савченко О.В., Кропотов A.B. Детоксици-рующие свойства альгината кальция при свинцовой интоксикации экспериментальных животных II Тез. докл. V Рос. национ. конгр. «Человек и лекарство». Москва, 1998. С. 632.

6. Хасина Э.И., Ковалев В.В., Тюпелеев П.А., Шевцова О.И., Хотимченко Ю.С. Роль пектинов в регуляции гомеостаза организма, i арушенного алиментарными факторами /' Тез. докл. XVII съезда физиологов России. Ростов-на-Дону, 1998. С. 506.

7. Хасина Э.И., Тюпелеев П.А., Ковалев В.В., Шевцова О.И., Хотимченко Ю.С. Гепатопротекторное действие зостерина при интоксикации организма крыс экообу-словлснными алиментарно-токсическими факторами //Тез. докл. межвуз. науч. практ. конф. Саратов, 1998. С. 165.

8. Хотимченко Ю.С., Шевцова О.И., Ковалев В.В., Хасина Э.И. Влияние поли-сорбовита на перекисное окисление липидов при токсическом поражении печени // Тез. докл. VI Рос. национ кошр. «Человек и лекарство». Москва, 1999. С. 73.

9. Хотимченко М.Ю., Ковалев В.В., Зиганшина O.A. Оценка энтеросорбцион-ной активности различных сорбентов при свинцовой интоксикации экспериментальных животных // Матер. IV межд. симпоз. «Биологически активные добавки к пище: XXI век», Санкт-Петербург, 2000. С. 271-272.

10 Х<тгдченко ЮС, Хасина Э.И. Ковалев В.В., Шевцова О.И., Шестакова С В Эффективности, пищевых некрахмальных полисахаридов при экспериментальном токсическом гепатите //Вопр. питания. 2000. Т. 69, № 1/2. С. 22-26.

11. Хотимченко Ю.С., Одинцова М.В., Ковалев В.В. Полисорбовит. - Томск: Изд-воНТЛ, 2001.132 с.

12. Хотимченко Ю.С., Ковалев В.В., Савченко О.В., Зиганшина О.Л Физико-химические свойства, физиологическая активность и применение альгииатов - полисахаридов бурых водорослей // Биология моря. 2001. Т.27, № 3. С. 151-162.

13. Сер!ущенко И.С., Ковалев В.В., Бедняк В.Е., Хотимченко Ю.С. Сравнительная оценка металлсвязывающей активности низкоэтерифицированного немина из морской травы Zoslera marina и других сорбентов // Биология моря. 2004 Т. 30, № 1.С. 83-85.

14. Сфргущенко И.С., Ковалев В.В. Сравнительная оценка металлсвязывающей способности некрахмальных полисахаридов // Тез. докл. XI Рос. национ. коигр. «Человек и лекарство». Москва, 2004. С. 574.

15. Khotimchenko Yu.S., Kolenchenko Е.А., Khotimchenko M.Y., Kovalev V.V. Healing and preventive effects of low-esterified pectin on liver injury induced by carbon tetrachloride in rats // Oriental Pharmacy and Experimental Medicine. 2004. Vol. 4. P. 28-36.

Лицензия ПОДЛ»63-19от02.12.1999 г. Зак. 69п. Формат 60x84 '/|6. Усд. п. л. 1,0 Тираж 100 экз. Подписано в печать 04.11.2004 г. Печать офсетная с оригинала заказчика.

Отпечатано в типографии ОАО «Дальприбор». 690105, г. Владивосток, ул. Бородинская, 46/50, тел. 32-70-49 (32-44)

л

я i

I

о,

I ¡

РНБ Русский фонд

2006-4 20675

Актуальность проблемы. Фундаментальной проблемой теоретической фармакологии является установление закономерных связей между структурой химических соединений и их воздействием на живой организм. Удобным объектом для анализа таких связей могут служить пектиновые вещества, представляющие интерес и как потенциальный источник новых лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище (Thakur et al., 1997; Хотимченко и др., 2001а, б; Sun et al., 2002; Nangia-Makker et al., 2002), и как материал для современных фармацевтических технологий (Miyazaki et al., 2000; Semde et al., 2000; Liu et al., 2003; Cheng, Lim, 2004).

Пектины относятся к классу полимерных углеводов и, как большинство полисахаридов, являются гетерогенными по структуре, молекулярной массе и физико-химическим свойствам. Их состав различается в зависимости от источника сырья, места произрастания растений и условий выделения (Chang et al., 1994). Первичными блоками полимерной цепи пектинов являются остатки D-галактуроновой кислоты, соединенные друг с другом а(1—>4)-связью. Пектиновая цепь может состоять от нескольких десятков до нескольких сотен галактуроновых блоков (Thibault et al., 1993), между которыми на разных расстояниях друг от друга располагаются остатки L-рамнозы. От основной линейной цепи рамногалактуронана берут начало боковые цепи, состоящие из 8-20 молекул нейтральных Сахаров, таких как D-галактопираноза, L-арабинофураноза, D-ксилопираноза, D-глюкопираноза, L-фукопираноза, D-апиоза, 2-0-метил-0-ксилоза и 2-О-метилфукоза (Schols, Voragen, 1996; Thakur et al., 1997; Ridley et al., 2001). В зависимости от относительного количества карбоксильных групп в остатках галактуроновой кислоты, этерифицирован-ных метиловым спиртом, различают высокометоксилированные и низкометоксили-рованные пектины. Все эти структурные особенности молекул полисахарида создают разнообразие физико-химических параметров пектинов, что должно отражается на их биологических и фармакологических свойствах.

В спектре фармакотерапевтических эффектов пектинов их способность снижать уровень сывороточного холестерина и липопротеинов низкой плотности (Gonzalez et al., 1998; Vergara-Jimenez et al., 1998; Bladergroen et al., 1999), связывать тяжелые металлы (Kohn, 1987; Dongowski et al., 1997), увеличивать экскрецию желчных кислот (Garcia-Diez et al 1996), проявлять антимутагенную активность в отношении нитроароматических соединений (Hensel, Meier, 1999) и ингибировать пролиферацию злокачественных клеток (Heitman et al, 1992; Hsieh and Wu, 1995). Пек-тинсодержащие препараты оказывали лечебные эффекты у больных с гиперхолесте-ринемией (Groudeva et al., 1996; Knopp et al, 1999), сахарным диабетом (Levitt et al., 1980) и персистирующей диареей (Rabbani et al., 2001). Вместе с тем, анализ литературы свидетельствует о существенных противоречиях как в результатах близких по содержанию работ, так и в их интерпретации. Эти противоречия обусловлены отсутствием стандартизованных препаратов исследованных пектинов. В различных работах используются пектины неодинакового происхождения, с разной степенью эте-рификации, с разной молекулярной массой и с неодинаковыми реологическими свойствами. Лишь в единичных работах предприняты попытки установить связь структуры пектинов с их фармакологической активностью, например, с гипохоле-стеринемическим действием (Kishimoto et al., 1995; Yamaguchi et al., 1995; Trautwein et al., 1998), воздействием на активность микрофлоры кишечника (Langhout et al., 1999) и сорбцией желчных кислот (Dongowski, 1995). Отсутствие в литературе достаточных сведений о закономерных связях между физико-химическими характеристиками пектинов, такими как вязкость, массовая доля полиуроновых кислот, относительное содержание свободных карбоксильных групп, с одной стороны, и фармакологическими эффектами, с другой стороны, определило цели и задачи настоящей работы.

Цель работы. Цель работы состояла в установлении связи физико-химических свойств пектинов с их металлсвязывающей активностью.

Задачи работы:

1. Получить пектины с заданной степенью этерификации в диапазоне от 1 до 60% и охарактеризовать их физико-химические свойства по относительному содержанию свободных карбоксильных групп, содержанию ангидрогалактуроновой кислоты, характеристической вязкости и теоретической сорбционной емкости.

2. Определить сорбционные характеристики пектинов с разной степенью этерификации по отношению к ионам меди, свинца, кадмия, ртути, цинка и железа.

3. Изучить влияние рН среды на сорбционную активность пектинов с разной степенью этерификации при взаимодействии с металлами.

4. Провести сравнительную оценку металлсвязывающей активности пектинов с одинаковой степенью этерификации, полученных методом щелочной деэтерифи-кации и способом смешивания низкоэтерифицированных и высокоэтерифициро ванных пектинов.

5. Оценить металлсвязывающую, гиполипидемическую и антитоксическую активность пектинов с разной степенью этерификации у экспериментальных животных.

Научная новизна. В работе впервые проведен анализ связи физико-химических свойств пектинов с их металлсвязывающей активностью. Исследованы сорбционные свойства пектинов, различающихся относительным содержанием эте-рифицированных и деэтерифицированных карбоксильных групп, полигалактуроно- ' вой кислоты, вязкостью. Установлено, что эффективность связывания металлов пектинами in vitro зависит от их физико-химических свойств, при этом более значимую роль играют такие параметры, как степень этерификации и содержание свободной ангидрогалактуроновой кислоты. Характеристическая вязкость играет меньшую роль, по крайней мере, по отношению к связыванию изученных металлов. Существенное влияние на связывание металлов пектинами оказывает кислотность среды. Сдвиг рН в щелочную сторону приводит к повышению сорбционной емкости по меди, кадмию, свинцу и железу. Сорбционная емкость пектинов по ртути практически не зависит от рН среды.

В качестве важного количественного параметра сорбционной активности пектинов предложен показатель теоретической сорбционной емкости, позволяющий более точно судить о количестве карбоксильных групп, участвующих в связывании металлов.

Установлено, что эффективность выведение тяжелых металлов из организма А экспериментальных животных с помощью пектиновых веществ зависит от степени этерификации пектинов. Гиполипидемическая и гепатопротекторная активность пектинов не зависит от степени их этерификации.

Практическая значимость. На основе результатов экспериментальных исследований по оценке металлсвязывающей активности пектинов с разной степенью этерификации разработана технологическая схема производства биологически активных добавок к пище, активным компонентом которых является низкоэтерифици-рованный пектин. Предложены к выпуску биологически активные пищевые добавки, сертифицированные в Федеральном центре Госсанэпиднадзора, зарегистрированные в Министерстве здравоохранения Российской Федерации (регистрационные удостоверения № 001310.Р.643.11.99 и № 001310.Р.643.11.99, которые разрешены для реализации через аптечную сеть в качестве источника пищевых волокон.

Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на Всесоюзном семинаре «Проблемы производства продукции из красных и бурых водорослей» (Владивосток, 1987), Региональной конференции Сибири и Дальнего Востока «Перспективы развития малотоннажной ,химии» (Красноярск, 1989), 2-м съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995), 5, 6 и 11-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998, 1999, 2004), 12-м съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998), 4-м Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище: XXI век» (Санкт-Петербург, 2000), 2-м съезде Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация выполнена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы.

114 ВЫВОДЫ

1. Модифицированным методом щелочной деэтерификации получены образцы пектинов со степенью этерификации 1,2%, 9,6%, 18,8%, 27,4%, 40,1%, 52,0% и 60,2% и установлены их физико-химические характеристики. Показано, что характеристическая вязкость пектина снижается с уменьшением степени этерификации, при этом содержание ангидрогалактуроновой кислоты не изменяется. Все полученные образцы отнесены к высокомолекулярным пектинам.

2. Абсолютная сорбционная емкость пектинов по отношению ко всем исследованным металлам повышается с уменьшением степени этерификации. Относительная сорбционная емкость пектинов по отношению к кадмию и двухвалентному железу повышается с уменьшением степени этерификации. Относительная сорбционная емкость пектинов по отношению к меди, свинцу, цинку и ртути не зависит от степени этерификации при рН выше 4,0.

3. При увеличении рН среды абсолютная и относительная сорбционная емкость пектинов по отношению к большинству исследованных металлов повышается. Сорбционная емкость по ртути у низкоэтерифицированных пектинов не зависит от рН, а у высокоэтерифицированных эта зависимость выражена слабо. Абсолютная сорбционная емкость по трехвалентному железу повышается с увеличением рН, а относительная сорбционная емкость по этому металлу при рН 2,0 повышается с понижением степени этерификации, а при рН 3,0 и больше повышается с увеличением степени этерификации.

4. Образцы пектинов с заданной степенью этерификации, полученные методом щелочной деэтерификации и способом смешивания низкоэтерифицированных и высокоэтерифицированных пектинов, характеризуются близкими значениями сорб-ционной емкости по меди, свинцу и кадмию.

5. В опытах на экспериментальных животных показано, что способность пектинов выводить из организма тяжелые металлы зависит от степени этерификации их молекул. Гиполипидемическая и гепатопротективная активность пектинов не зависит от их степени этерификации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

На основе результатов экспериментальных исследований по оценке металлсвязывающей активности пектинов с разной степенью этерификации нами совместно с сотрудниками кафедры фармакологии Владивостокского государственного медицинского университета разработана технологическая схема производства биологически активных добавок к пище, активным компонентом которых является низко-этерифицированный пектин. Предложены к выпуску две пищевые добавки. Первая добавка представляет собой смесь высокоэтерифицированного пектина со степенью этерификации 60,2% и низкоэтерифицированного пектина со степенью этерификации 1,2%. Согласно нормативной документации суммарное относительное содержание свободных (неэтерифицированных) карбоксильных групп в молекулах пектинов этого препарата должно составлять 50%. Содержание полиуроновых кислот - не менее 40%. Вторая добавка содержит низкоэтерифицированный пектин, нанесенный на сахарозу. Согласно нормативной документации суммарное относительное содержание свободных (неэтерифицированных) карбоксильных групп в молекулах пектинов этого препарата должно быть не менее 95%.Содержание полиуроновых кислот в пектине - не менее 60%.

Токсикологические испытания были проведены во Владивостокском государственном медицинском университете. Было установлено, что исследованные в остром и подостром токсиколого-гигиенических экспериментах биологически активные добавки на основе низкоэтерифицированных пектинов оказались безопасными при длительном пищевом использовании и были рекомендованы для гигиенической сертификации по критериям безопасности.

По внешнему виду добавки представляет собой гранулы или мелкий однородный порошок от светло-серого до кремового цвета; допускается наличие вкраплений частиц более темного или более светлого цвета. Для обеспечения безопасности эти добавки должны удовлетворять требованиям органов Госсанэпиднадзора. Остаточные количества пестицидов, содержание токсичных элементов и радионуклидов и микробиологические показатели должны удовлетворять «Гигиеническим требованиям к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов». Материалы и разработанные технологические схемы внедрены в производство на Научно-производственной фирме «Востокфарм» (Владивосток). Обе добавки были сертифицированы в Федеральном центре Госсанэпиднадзора, зарегистрированы в Министерстве здравоохранения Российской Федерации (регистрационные удостоверения № 77.99.04.916.Б.000361.08.03 и № 77.99.04.916.Б.000363.08.03) и разрешены для реализации через аптечную сеть в качестве источника пищевых волокон.