Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Сравнительная оценка антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов

На правах рукописи

КОЛЕНЧЕНКО Елена Алексеевна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ НЕКРАХМАЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 2004

Работа выполнена в Институте биологии моря Дальневосточного отделения Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Хотимченко Юрий Степанович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Челомин Виктор Павлович доктор биологических наук Палагина Марина Всеволодовна

Ведущая организация: Институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН

Защита состоится 2004 года в /О часов на заседании диссерта-

ционного совета К 208.007.02 при ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет МЗ РФ» по адресу: 690990, г. Владивосток, пр. Острякова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет МЗ РФ». .

Автореферат разослан^ 2 QIC пл^лсЗр), g'ZW4 года

ДО ^2004 i

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.м.н. ""V Шмыкова И.И.

Ш£±

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

220/132-

Актуальность проблемы. Проблемы лекарственной регуляции окислительного стресса и поиск фармакологически активных веществ, обладающих аитиоксидант-ной активностью, по-прежнему остаются в центре внимания исследователей по различным направлениям экспериментапьной и клинической фармакологии (Кения и др., 1993; Lewis et al., 2000; Kanner et al., 2001; Halvorsen et al., 2002; Matthaus, 2002; Ladas et al., 2004). В физиологических условиях окислительно-восстановительные процессы, обеспечивающие энергетические потребности клеток и утилизацию кислорода в тканях, контролируются регуляторными системами, поддерживающими сбалансированное взаимодействие реакций образования продуктов оксидации и антиокислительных факторов. Нарушение этого взаимодействия, которое сопровождается активацией свободно-радикальных процессов и накоплением продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), рассматривается в качестве универсального механизма повреждения биологических мембран (Gorman et al., 1999; Halliwell, 2001; Vertuani et a!., 2004), лежащего в основе таких патофизиологических процессов, как воспаление, атерогенез и канцерогенез (Bounous, Molson, 2003), и является важным звеном в патогенезе атеросклероза (Heinecke. 1998; Азизова, 2000; Kau! et al., 2001), инфаркта миокарда (Klipstein-Grobusch et al., 1999), злокачественных опухолей (Kumaraguruparan et al., 2002; Saintot et al., 2002), перитонита (Konukoglu et al., 1999), хронического пю-мерулонефрита (Тугушева и др., 1994), острых и хронических интоксикаций тяжелыми металлами (Shaikh et al., 1999;'Gaetke, Chow, 2003).

Установление роли окислительного стресса в развитии многих заболеваний свидетельствует о том, что эндогенная антиоксидантная система не обеспечивает в достаточной степени защиту клеток и тканей от позреждающего действия свободных радикалов. Поэтому вполне оправдан поиск новых подходов и средств подавления прооксидантных процессов и активации реакций антиоксидации (Fang и al., 2002; Schlesier et al., 2002; Violi et al., 2004).

Среди природных соединений, обладающих фармакологической активностью, обращают на себя внимание некрахмальные полисахариды, такие как соли альгиновой кислоты, пектины, фукоиданы, хитозан и каррагннаны. В той или иной степени они оказывают гипохо " " " a et al., 1995; Клорр et al., 1999;

Ylitalc et al.. 2002), противоязвенный (Shibata et al., 1999; Ito et al., 2000; Yamamoto et al., 2000), аншкоагулянтнмй (Huang et al., 2003; Mourâo, 2004), энтеросорбционный (Соболев и др., 1999; Савченко, Хотимченко, 2002), иммуномодулирующий (Назарова и др., 1998; Pratt-Pearce, Phillips, 1996) и противовирусный (Ponce et al., 2003) эффекты. Некоторые из этих эффектов сопровождаются снижением уровня продуктов пере-кисного окисления липидов в крови экспериментальных животных (Хотимченко и др., 1997; Иванова, Янькова, 1998; Шевцова, 1999; Хотимченко и др., 2000; Шевцова, 2000). Кроме того, показано, что экстракты из ряда бурых и красных водорослей, содержащие соединения полисахаридной природы, проявляют антиоксидантные свойства (Xue et al., 2001; Ruperez et al., 2002; Zhang et ai, 2003). Эти данные наводят на мысль, что некрахмальные полисахариды могут обладать ацтиоксидантными свойствами. Проверке этого предположения и анализу возможных механизмов антиокси-дантногодействия некрахмальных полисахаридов посвящена настоящая работа.

Цель работы.

Цель работы состояла в сравнительной оценке и изучении механизмов антиок-сидантной активности некрахмальных полисахаридов растительного и животного происхождения.

Задачи работы:

1. Экспериментально изучи гь эффекты альгинатов кальция и натрия, низкоэте-рифицированного и высокоэтерифицированного пектинов, фукоидана, хитозана и каррагинанов на модели окислительного стресса, вызванного индукторами перекис-ного окисления липидов у лабораторных животных.

2. Исследовать профилактические эффекты некрахмальных полисахаридов на модели окислительного crpetca у лабораторных животных.

3. Исследовать аитиоксидангное действие некрахмальных полисахаридов на модели Ре2+-аскорбат1:ндуцированною перекисного окисления липидов в мембранах гепатоцитов здоровых животных и животных с экспериментальным окислительным стрессом.

4. В условиях in vitro оценить антиоксидантные эффекты некрахмальных поли-сачарнтов по восстановлению трехвалентного железа (метод FRAP).

5. В условиях in vitro изучить антиоксидантные эффекты некрахмальных полисахаридов по ингибированию Ре2+-аскорбатиндуцированного окисления твина-80 то малонового диальдегида.

6. Провести сравнительную оценку антиоксидантной аюивности некрахмальных полисахаридов и лекарственных пренаратов-антиоксидантов - милдроната и эмоксипина.

Научная новизна. Впервые проведены сравнительные исследования антиок-сидантных свойств некрахмальных полисахаридов, таких как натриевая и кальциевая соли альгиновой кислоты, пектины с разной степенью этерификации, каррагинаны, фукоидан и хитозан. Установлено, что исследованные полисахариды, за исключением высокоэтерифицированного пектина и каррагинанов, на различных моделях окислительного стресса у экспериментальных животных снижают интенсивность ПОЛ и способствуют нормализации показателей эндогенной антиоксидантной системы. На модельных системах in vitro, позволяющих судить о механизмах антиоксидантного действия тестируемых веществ, показано, что полисахариды обладают восстанавливающей активностью и ингибирукгг Ре2'-аскорбатиндуцмрованное окисление твина-80 до малонового диальдегида. Показано, что ангиоксидантных эффект полисахаридов зависит от их структуры и физико-химических свойств.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные об ан-тиоксидантных свойствах исследуемых веществ послужат базой для дальнейших исследований фармакологической активности некрахмальных полисахаридов. Эти сведения расширяют теоретические представления о закономерных связях структуры и физико-химических свойств органических соединений с фармакологической активностью. Они дополняют представления о фармакологической регуляции оксидативных процессов при патологических состояниях. Полученные данные могут стать основой для разработки новых лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для применения в качестве антиоксидантных средств.

Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на итоговой конференции Института биологии моря ДВО РАН (Владивосток, 2002, 2003), на X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), на втором съезде Российского научного общества фармакологов «Фунда-

ментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004).

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на заседаниях Семинара по морфологии, физиологии и биохимии Института биологии моря ДВО РАН. По ре-)ульгатам обсуждения диссертация была рекомендована к защите.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация выполнена на 138 страницах машинописного текста и состоит их введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 28 рисунков и 19 таблиц. Библиография состоит из 49 отечественных и 213 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 772 половозрелых белых нелинейных крысах-самцах массой 130-200 г в начале экспериментов. Живогных содержали в виварии ТИБОХ ДВО РАН.

Общая характеристика препаратов. В работе были изучены следующие препараты и вещества: низкоэтерифицированный пектин (полимер галакгуроиовой кислоты; концентрация галактуронана в молекуле пектина 67,1%, степень этерификации около 2,5%, характеристическая вязкость 201 мл/г галактуронана, молекулярная масса. вычисленная с помощью уравнения Марка-Куна-Хауинка, в среднем 20500 Да); высокоэтерифкцированный пектин (концентрация галактуронана в молекуле пектина 78,0%, степень этерификации около 61%, характеристическая вязкость 352 мл/г галактуронана, молекулярная масса, в среднем 224 кДа); зостерин-пекпш (концентрация галактуронана в молекуле пектина 74,8%, степень этерификации около 5,7%, характеристическая вязкость 340 мл/г галактуронана); альгинат кальция (полимер гулу-роновой и маннуроновой кислот; содержание уроновых кислот 77,3%, содержание кальция 72,5%, 82,5% карбоксильных групп представлены в виде кальциевой соли); альгинат натрия (характеристическая вязкость 1270 мл/г, молекулярная масса 403 кДа); хитозан; к-каррагинан: Х-каррагинан; суммарный препарат к- и Х-каррагинанов; ф\коидаи; сахароза («ДиазМ», Россия); глюкоза («ДиаэМ», Россия); 1% раствор

эмоксипина (ФГУП «Московский эндокринный завод», г. Москва); 10% раствор мил-дроната (ПАО «Гриндекс», Латвия).

Образны пектинов, альгинатов, хигозана и фукоидана получены в лаборатории фармакологии Института биологии моря ДВО РАН; к-каррагинан. Х-каррагинан и суммарный препарат к- и Х-каррагинанов получены в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН.

Методы оценки антиоксидантной активности. Ант иоксидантную активность исследуемых веществ определяли тремя способами. Во-первых, по их способное! и в условиях in vivo подавлять процессы пероксидации и акшвировать антиоксидан i ные механизмы при окислительном стрессе, вызванном активаторами ПОЛ у экспериментальных животных. Во-вторых, по способности тестируемых веществ тормозить Fe2'-аскорбагиндуцированное ПОЛ мембран гепатоцитов крыс в 0,05 М грисовом буфере (pH 7,4) (Владимиров, Арчаков, 1972). В-третьих, по их способности восстанавливать Fe3* in vitro (метод FRAP) (Benzie, Strain, 1996) и ингибировать Fe аскорбатиндуцированное окисление твина-80 (сорбитанмоноолеата) до малонояою диальдегида (Галактионова и др., 1998).

Биохимические методы. Содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК) ненасыщенных жирных кислот определяли по спектру поглощения раствора липидов в смеси изопропанол-гептан при длине волны 233 нм (Гаврилов. Мишкорудная, 1983). Содержание продуктов ПОЛ, взаимодействующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-акгивные продукты), в плазме крови и печени животных определяли спекгрофотометрически при длине волны 532 нм, испотьзуя молярный коэффициент экстинции е=1,56х105 М''см"' (Saton. 1978; Владимиров, Арчаков, 1972). Состояние антиоксидантной системы оценивали по содержанию восстановленного глутатиона (П?Н) (Morron et al., 1979) и тиоловых групп (SH-фуппы) в печени (Торчинский, 1971) и антиоксидантной активности (АОА) плазмы крови (Клебанов и др., 1988).

Активность аланинаминоггрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансфсразы (ACT) и содержание общего и конъюгированного билирубина в плазме крови определяли с помощью наборов реактивов фирмы «Лахема» (Чехия). Гликоген в печени лабораторных животных измеряли с антроновым реактивом, используя глюкозу в качестве стандарта (Van Handel, 1965). Содержание обших липилов в печени животных

определяли, измеряя отическую плотность образовавшейся в ходе реакции эмульсии при длине волны 434 нм (Портяная и др., 1940). Содержание общего холестерина (XJT) в плазме крови определяли с помощью наборов реактивов фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Содержание триглицеридов (ТГ) в плазме крови определяли с помощью наборов реактивов фирмы «Ольвекс Диагностикум» (Россия). Содержание белка определяли по методу Гринберга (Greenberg, Gaddock, 1982).

Статистическая обработка. Количественные данные представлены в виде Mim. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с учетом t-критерия Стьюдента для числа наблюдений п < 30; достоверными считан и результаты при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Эксперименты по исследованию антиоксидантпого действия некрахмальных полисахаридов в условиях in vivo проводили на экспериме1тшьных животных, которых разделяли на интактные, контрольные и экспериментальные группы. Интактные животные получали обычную пищу вивария на протяжении каждого эксперимента. Жиьотным контрольных групп энтералыю с помощью зонда вводили индукторы ПОЛ. Животным экспериментальных групп энтерально вводили один из активаторов ПОЛ и исследуемые полисахариды в виде растворов и суспензий.

На животных были проведены опыты по проверке терапевтического и профилактического действия полисахаридов на модели окислительного стресса, вызванного индукторами ПОЛ.

Оценка терапевтического действия некрахмальпы* полисахаридов па модели

окислительного стресса 1

Окислительный стресс, вызванный 7-дневным внутрижелудочным введением 4 « тетрахлорметана (ССЦ) в дозе 300 мг/кг массы тела, приводил к достоверным изменениям всех регистрируемых показателей состояния про- и антиоксидянтной систем и функционального состояния печени животных. В последующие 21 сут после прекращения введения индукторов ПОЛ существенных положительных сдвигов тестируемых биохимических показателей печени и плазмы крови, как правило, не происходи-

ло (контрольная-!), что свидетельствует об отсутствии самоизлечения подопытных животных за указанный период времени. На фоне развившегося окислительного стресса 2!-дневное энтеральное введение низкоэтерифицированного пектина по-разному отразилось на процессах пероксидации липидов и антиоксидянтных функциях организма животных. Введение низкоэтерифицированного пектина в дозе 10 мг/кг массы тела, с одной стороны, повысило АОА плазмы крови на 31,3%, а с другой понизило уровень ТБК-АГ1 в плазме крови на 33,5% по сравнению с группой «кон-трольная-2». На остальные биохимические показатели пектин в указанной дозе достоверно не повлиял (табл. 1)

В результате введения низкоэтерифицированного пектина в дозе 50 мг/кг массы тела содержание ТБК-АП в печени уменьшилось на 29,0%, ТБК-АП и.ДК в плазме крови - на 46,5% и 38,1% соответственно, тогда как уровень TSH в печени и АОА плазмы крови повысились на 116,1% и 38,0%, соответственно, по сравнению с группой «контрольная-2». Уровень SH-rpynn достоверно не изменился.

Введение низкоэтерифицированного пектина в дозе 250 мг/кг массы тела приводило к достоверному снижению уровня ТБК-АП в печени на 46,0%, ТБК-АП и ДК в плазме крови - на 55,8% и 45,4% соответственно и повышению уровня TSH на 174,7%, SH-rpynn - на 41,7% и АОА плазмы крови - на 67,6% (табл. 1).

Введение исследуемых полисахаридов также дозо-зависимым образом повлияло на показатели функционального состояния печени. U группе животных, получавших низкозтерифицированный пектин в дозе 10 мг/кг массы тела, только содержание гликогена было достоверно большим на 33,4%, чем в группе «контрольная-2 Пектин в дозе 50 мг/кг массы тела повышал уровень гликогена на 46,4% и снижал активности AJIT и ACT на 21,8% и 24,4% соответственно. Уровень общего и конъюгированного билирубина в плазме крови имел отчетливую тенденцию к понижению, но различия по сравнению с группой «контрольная-2» оставались недостоверными. После введения низкоэтерифицированного пектина в дозе 250 мг/кг массы тела содержание гликогена увеличилось на 71,5%, активности АЛТ и ACT понизились на 51,7% и 68,7% соответственно, а содержание общего и конъюгированного билирубина уменьшилось на 64,2% и 63,7% соответственно.

Для альгината кальция в тех же дозах наблюдали схожую картину.

Таблица 1.

В зияние низкоэтерифнцироваиного пектина на показатели про- и антиоксидантнон систем крыс с окислительным стрессом, индуцированным тетрахлорметаном

Печень Плазма крови

Группа животных ТЬК-АП, Г8Н. БН-группы, ДК, ТБК-АП, АОА,

нмоль'мг белка мкг/мг белка мкг/мг белка нмоль/мл нмоль/мл %

Итаюная-!

(п=5) 1,86±0,24 15,12±1,17 39,07±3,53 3,36±0,29 3,45±0,31 62,51±4,72

Контрольная-1 (+ ССЦ)

(п=б> 639±0,64 4,64±0,35 19,44±2.02 8,84±0,73 12,08±0,89 28,22±1.67

И|Ггактная-2

(п=5) 1.17±0,11 1734±1,68 44,13±4,84 2,45±0.16 3,04±0Л 64,78±4,93

Контроаьнаа-2 (+ ССЦ)

(п=8) 4,87±0,42 5Д2±0,48 27,13±2,84 6,59±0,52 9,57*1,07 32,08±2,81

ССЦ пектин Ю мг/кг

(п=8) 5,07±0,47 6,43±0,71 30,05±3,42 5,33±0,48 6,36±0,60* 42,11 ±3,60*

ССЦ + пектин 50 мг/кг

(п=8) 3,46±0,41* П,28±1,34** 33,52±3,68 4,08±0,61" 5,12±0,55** 44,26±4,57*

ССЦ + пектин 250мг/кг

(п=8) 2,63±0Д4"* 14,34±1,52*** 38,43*4,12* 3,60±0,44*" 4,23±0,36*" 53.78±5,93"

Примечание. *р < 0,05,' "р <0,01, *"р < 0,001 по сравнению с группой «контрольная-2», п - число животных.

На этом же фоне хитозан и фукоидан в дозе 200 мг/кг массы тела снижали уровень ТБК-АП в печени соответственно на 25,9% и 48,4%, ДК в плазме крови - на 31,8% и 40,8%. Активность AJIT понизилась на 60,8% и 57,6% и ACT - на 46,8% и 45,9% соответственно. Содержание гликогена увеличилось на 46,8% и 80,9%, а уровень общих липидов снизился на 29,2% и 36,0% соответственно. Х- Каррагинан и к-каррагинан ни на один из регистрируемых показателей не повлияли.

Оценка профилактического действия некрахмальных полисахаридов на модели

окислительного стресса

Предварительное введение альгината кальция в дозах 10 мг/кг и 50 мг/кг массы тела интаюгным животным в течение 21 дня не приводило к достоверным изменениям параметров, определяющих состояние про- и антиоксидантных систем и функциональное состояние печени по сравнению с группой «интактные-1» (табл. 2). В дозе 250 мг/кг массы тела альгинат кальция достоверно понижал уровень ТБК-АП в печени на 48,5%, ТБК-ЛП в плазме крови - на 32,2%. Профилактическое введение альгината кальция перед последующим 7-ми дневным вг,едением CCU в дозе 300 мг'кг массы тела существенно повлияло на развитие патологических изменений в печени, вызванных токсикантом. В группе животных, получавших альгинат кальция в дозе 250 мг/кг массы тела, значения активности про- и антиоксидантных систем были следующими: уровень ТБК-АП в печени был ниже на 42,5%, ТБК-АП в плазме крови - на 52,9%, ДК - на 42,5%, а уровень TSH был выше на 76,6%, SH-rpynn - на 92,7% и АОА плазмы крови - на 71,1%, чем в группе «контрольная-2». Активность АЛТ и ACT была ниже на 69,7% и 59,2%, а уровень общего и коньюгированного билирубина - на 47,0% и 48,6% соответственно (табл. 2).

-Iff**

У животных, которым предварительно вводили альгина натрия в дозе 50 мг/кг массы тела, после последующего введения ССЦ достоверно изменились четыре показателя из десяти. Уровень FSH был на 59,6%, АОА плазмы чрови на 39,2% выше, чем у животных, не получавших альгинат кальция перед введением ССЦ. Активность АЛТ и ACT была ниже на 21,6% и 30,7% соответственно. Альгинат кальция в дозе 10 мг/кг массы тела не оказал достоверного воздействия на показатели про- и антиокси-дантной систем и состояния печени, вызванные ССЦ (табл. 2).

Для ниэкотгерифицированного пектина в тех дозах наблюдали схожую картину.

Таблица 2.

Влияние предварительного введения альгината кальция на показатели про- и антиоксидантной систем крыс с

окислительным стрессом, индуцированным тетрахлорметаном

Печень Плазма крови

Группа животных ТБК-АП, TSH, SH-группы, дк. ТБК-АП, АОА,

нмоль/мг белка мкг/мг белка мкг/мг белка нмоль/мл нмоль/мл %

Иктактная-1 (п=6) 2,64±0,23 12,64±0,93 48,76±3,63 4,55±0,39 4,55±0,49 56,36±5,29

Альгинат кальция 10

mi/кг (п=5) 2,55±0,24 12,28±0,98 44,32±3,89 5,11 ±0,48 5,11±0,53 54,39±5,11

Альгинат кальция 50

мг/кг (п=5) 2,71 ±0,26 13,25*1,22 49,27±4,85 5,73±0,56 4,56±0,42 59,26±5,81

Алыинат кальция 250

мг/кг (п=5) 1,36±0,14"" 11,79±0,92 44,38±4,74 4,42±0,45 з,04±0,зГ"' 53.3б±5,03

Интактная-2

(п=6) 2,79±0Д7 12,31±1,03 47,26±4,82 4,84±0,52 4,22±0,40 59,21 ±6,02

Контрольная-2 (+ ССЦ)

(п=8) 7,97±0,74 5,13±0,49 21,73±2,36 8,65±0,77 12,37±1,23 27,10±2,75

Алы инат кальция 10

мг/кг + ССЦ (п=8) фЗ±0,68 5,48±0,31 20,46±1,98 8,15±0,73 10,34±1,28 27,64±2,29

Альгинат кальция 50

мг/кг + CCI, (п=8) б,44±0,57 8,19±0,81* 28,29±2,44 7.28±0,67 9,94±0,78 37,72±3,34*

Альгинат кальция 250

мг/кг + CCL. (п=8) 4.58±0.42" 9.06±0.87" 41.87±4.57" 4.97±0.4б" 5.83±0.59*" 46.38±4.85**

Примечание. *р < 0,05, "р <0,01, *"р < 0,001 по сравнению с группой «контрольная-2», **"р < 0,05 по сравнению с 1руппой «интактная-1 », п - число животных.

На экспериментальных животных были проведены две серии опытов по оценке антиоксидантного действия некрахмальных полисахаридов на Ре2*-аскорбатиндуци-рованное ПОЛ в мембранах гепатоцитов крыс. В первой серии эксперимента живот ным вводили исследуемые полисахариды. Во второй серии экспериментов животным вводили полисахариды на фоне окислительного стресса, индуцированного ацетатом свинца.

По завершении опытов лабораторных животных декапитировали под легким эфирным наркозом и изялекали печень. Навеску печени гомогенизировали в 50 мМ трис-НС1 буфере (рН 7,4), цетрифугировали при 10000 g в течение 10 мин и отделяли полученный супернатант от осадка. В супернаганте определяли исходный уровень ТБК-АП. Индукцию ПОЛ осуществляли добавлением к супернатанту 10 мкМ раствора сернокислого железа и 0,5 мМ раствора аскорбиновой кислоты. Через 30 минут отбирали пробы инкубационной смеси и определяли в них содержание ТБК-АП.

Оценка антиоксидантного действия некрахмальных полисахаридов на

модели Ге2+-аскорбатиндуциронанного псрекисногс окисления линидов в мембранах гепатоцитов крыс

Внутрижслудочное введение экспериментальным животным 2% растворов низ-коэтерифипированного пектина, высокоэтернфшшрованного пектина, алминага натрия и альганата кальция в дозе 150 мг/кг массы тела в течение 14 дней приводило к изменению показателя исходного уровня ТБК-АП п печени, но различия ко сравнению с интактной группой животных оставались недостоверными. В результате введения растворов низкоэтерифицированного пектина, альганата натрия и альгнната кальция исходный уровень ТБК-АП был ниже соответственно на 21,0%, 24,4% и 26,5%, чем в интактной группе животных. После введения высокоэтернфшшрованного пектина уровень ТБК-АП был на 28,2% выше, чем в интактной группе ((абл. 3).

После запуска Ре^-аскорбатиндуцированного ПОЛ мембран гепатоцитов в интактной группе животных повышение уровня ТБК-АП через 30 мин инкубации достигло 64,3% (р < 0,05). Увеличение содержания ТБК-АП в группах жиаогаых, получавших высокоэтерифицированный пектин, низкоэтерифицированный пекгин, алый-нат натрия и альгинат кальция, на 30-й минуте инкубации составило по отношени о к

исходному уровню 65,3%, 31,6%, 48,3% и 41,7% (р < 0,05) соответственно. Уровень ГИК-АГI через 30 мин инкубации в группах животных, получавших низкоэтерифиии-ровашшй пектин, альгинат нагрия н альгинат кальция, был на 58,7%, 47,7% и 55,0% соотвектвенно ниже (р < 0,05), а в группе, получавшей высокоэтерифицированный пешим, на 32,1% выше (р < 0,05), чем в интактной группе животных (табл. 3).

Таблица 3.

Влияние некрахмальных полисахаридов на Ре2+-аскорбятиндуцированное ПОЛ в мембранах гепатоцнтов крыс

Группа животных

ТБК-АП, нмоль/мг белка

Исходное значение

30 мин инкубации

Ингактиая (п=6)

Низкоэтерифицированный пектин (п=5) Альгинат натрия (п-6)

Альгинат кальция (п=7)

Высокоэтерифицированный пектин (п=6)__

2,38*0,24 1,88±0,17

1,80±0,19 1,75±0,20 3,05±0,32

6,65±0,63 2,75±0,33*

3,48±0,36* 3,04±0,32* 8,80±0,68*

Примечание. * р < 0,05 по сравнению с интактной группой, п - число животных.

Содержание ТБК-АП на 30-й мин инкубации в группах животных, получавших 2% расгворы низкоэтерифицированного пектина, альгината кальция, суммарного препарата Х- и к-каррагинанов и фукоидана в дозе 150 мг/кг массы тела в течение 21 дня, достоверно не отличалось от исходных значений.

Оценка антноксидантиого действия некрахмальных полисахаридов на модели Гег+-аекорбатиндуцированного перекисного окисления липидов мембран гепатоцнтов крыс с окислительным стрессом

Поражение печени, вызванное 10-дневным ведением ацетата свинца в дозе 50 мг.'кг массы гела в пересчете на металл, приводило к повышению исходного уровня

ТБК-АП в печени на 95,4% по сравнению с интактной группой животных. На фоне развившегося окислительного стресса внутрижелудочное введение лабораторным животным 2% растворов низкоэтерифицированного пектина и альгината натрия в дозе 150 мг/кг массы тела в течение 5 дней приводило к достоверному снижению исходного уровня ТБК-АП соответственно на 46,2% и 42,4% по сравнению с контрольной группой животных (табл. 4).

. Таблица 4.

Влияние некрахмальных полисахаридов на Ре'^-аскорбатиидуцнроваиное ПОЛ в мембранах гепатоцитов крьк с окислительным стрессом

ТБК-АП,

Группа животных _нмоль/мг белка

Исходное значение 30 мин инкубации

Интактная (п=5) 2,16*0,(6 5,83*0,39

Контрольная (+ ацетат свинца) 4,22*0,38 11,82*0,67

(п=6)

Ацетат свинца + пектин (п=7) 2,27*0,18* 3,85*0,35*

Ацетат свинца + альгинат 2,43*0,24» 3,57*0,32*

натрия (п=6)

Примечание. * р < 0,05 по сравнению с контрольной группой, п - число животных

При индукции ПОЛ мембран гепатоцитов системой Ре2+-аскорбат повышение уровня ТБК-АП в интактной и контрольной группах животных через 30 мин инкубации достигло 63,0% и 64,3% соответственно (р < 0,05). Увеличение содержания ТБК-АП продуктов в группах животных, получавших ннзкоэтерифицированный пектин » альгинат. натрия, на 30-й минуте инкубации составило по отношению к исходному уровню 41,0% и 31,9% соответственно (р <0,05). В конце инкубации уровень ТБК-АП в группах, которым на фоне окислительного стресса вводили низкоэтерифицированный пектин и альгинат натрия, был на 67,4% и 69,8% соответственно ниже (р < 0,05), чем в контрольной группе животных (табл. 4).

В экспериментальных группах животных, получавших на фоне окислительного стресса, вызванного 15-дневным введением ацетата свинца в дозе 50 мг/кг массы те-

ла, 2% растворы альгината кальция, суммарного препарата Х- и к-каррагинанов и фу-коидана в дозе 150 мг/кг массы тела в течение 10 дней, достоверного повышения уровня ТБК-АП по сравнению с исходными значениями на 30 мин инкубации не наблюдалось.

Полученные результаты предполагают наличие у некрахмальных полисахаридов, за исключением высокоэтерифицированного пектина и Х- и к-каррагинанов, ан-тиоксидантного эффекта. На наш взгляд, механизм антиоксидантного действия не-крохмальных полисахаридов может быть обусловлен их способностью связывать в желудочно-кишечном тракте и выводить из организма прооксидантные вещества, например, тяжелые металлы, за счет наличия в их структуре гидроксильных и карбоксильных групп, способствующих ионообменному действию (Story et al., 1976). Косвенно об этом свидетельствует отсутствие аналогичных эффектов у каррагинанов, которые практически лишены энтеросорбционной активности (Yermak, Khotimchenko, 2003).

Вполне возможно, что механизм антиоксидантного действия некрахмальных полисахаридов связан со способностью напрямую взаимодействовать с оксидантами и свободными радикалами. На эту мысль наводят, во-первых, исследования антиок-сидантных свойств полисахаридов in vitro, выделенных из бурых водорослей Laminaria japónica (Хае et al., 2001), Fucus vesiculosus (Ruperez et al., 2002) и красной водоросли Porphyra haitanesis (Zhang et al., 20Ó3), во-вторых, фарчакокинетнческие ис-счедования 3Н-зостеркна-пектина из морской трапы Zostera asiatica, доказывающие возможность резорбтивного действия низкоэтерифициропанною пепина (Попов и др , 1990). Последние авторы предполагают, что низкомолекулярные фрагменты пек-тина-зостерина с молекулярной кассой менее 10 кОа, состапляющие 15-20% всего полисахарида, способны абсорбироваться в кровь и накапливаться во внутренних органах экспериментальных животных. В этом случае возможно прямое аотирадикаль-ное действие полисахаридов.

Однако методы, используемые для оценки антиоксидантной активности веществ в условиях in vivo, не дают возможности судить о механизме их антиоксидант-чого действия. Существует другой подход к изучению антиоксидантной активности тестируемых веществ: он основан на исследовании антиоксидантных свойств в «чистых» модельных системах in vitrt Использование достаточно полного набора таких

систем позволяет выяснить конкретный механизм антиоксидантного действия исследуемых фармакологически активных соединений, в том числе полисахаридов.

В настоящей работе нами были использованы два in vitro метода оценки анти-оксидангной активности полисахаридов. В первом методе оценивали восстанавливающую активность полисахаридов in vitro (метод FRAP). Во втором методе об анти-оксидантной активности судили по ингибированию Ре2+-аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до малонового диальдегида.

Оценка антиоксидяптиой активности некрахмальных полисахаридов методом FRAP

Метод FRAP позволяет оценить восстанавливающую активность исследуемых веществ по восстановлению трехвалентного железа в условиях in vitro. Процесс восстановления железа запускали путем добавления образцов полисахаридов в виде 0,1%, 0,5% и 1% растворов в инкубационную смесь, содержащую трехвалентное железо, 2,4,6-трипиридил-8-триазин и ацетатный буфер (рН 3,6). Об антиоксидангной активности полисахаридов судили по количеству образовавшегося в течение 60 мин двухвалентного железа и выражали в мкМ Fe2+.

В результате экспериментальной работы было установлено, что все исследуемые полисахариды в той или иной степени обладают восстановительной способностью. Для полисахаридов с большей восстановительной способностью наблюдали более сильную зависимость этой способности от концентрации вещества в растворе. Как правило, увеличение концентрации полисахарида в 10 раз (от 0,1% до 1%) приводило к увеличению содержания восстановленного железа, полученного через 60 мин после начала инкубации, в среднем в 4,4-8,5 раза.

Максимальной восстанавливающей способностью обладал пектин-зостерин (рис.) и фукоидан. Количество образовавшегося восстановленного железа в реакции с 1% раствором зостерина через 60 мин инкубации составляло 740,5±18,8 мкМ Fe2+, а с фукоиданом - 412,3±8,4 мкМ Fe2+. Менее выраженные восстановительные свойства были обнаружены у пектинов с высокой и низкой степенью этерификации (61% и 2.5% соответственно) и у суммарного препарата Х- и к-каррагинанов. Количество образовавшегося восстановленного железа в реакции с 1% раствором высоко зтерифи-цированного пектина через 60 мин инкубации составляло 229,4±2,7 мкМ Fe2\ с низ-

коэтерифидированным пепином - 201,1±6,4 мкМ Ре2+, а с суммарным препаратом и к-каррагинанов - 237,6±4,4 мкМ Ре2+. Наименьшей восстановительной способностью среди исследуемых полисахаридов обладали хитозан и альгинат натрия. Количество образовавшегося восстановленного железа в реакции с 1% раствором хитозана через 60 мин инкубации составляло 114,0±1,7 мкМ Ре2+, а с альгинатом натрия -67,1±1,0 мкМ Ре2*.

мкМ Реа+

Время, мни

Рис, Динамика восстановления трехвалентного железа пектином-зостерином.

1-1% раствор, 2 - 0,5% раствор, 3 - 0,1% раствор.

Дня меньших концентраций полисахаридов (0,1% и 0,5% растворы) наблюдалась схожая картина. Так, количество образовавшегося восстановленного жепеза в реакции с 0,5% раствором пеетина-зостерина через 60 мин инкубации составляло 415,3±10,1 мкМ Fe2* (рис.), с фукоиданом - 249,1*8,2 мкМ Fe2+, с высокоэтерифици-рованным пектином - 158,0±3,6 мкМ FeI+, с низкоэтерифицированным пектином -143,3*1,5 мкМ FeJ+, с суммарным препаратом Х- и к-каррагинанов - 144,5*2,2 мхМ Рй**, с хитотаном - 71,7*1,2 мкМ FeJ+ и с альгинатом натрия - 53,2*0,8 мкМ Fe,+. Количество образовавшегося восстановленного железа в реакции с 0,1% раствором пек-гина-зостернна через 60 мич инкубации составляло 101,2*3,7 мкМ Fe2+ (рис.), с фукоиданом - 54,6*1.2 мкМ Fe2\ с высокоэтерифицированным пектином - 39,3*1,6 мкМ Fc2+. с щзкотгерифицированным пектином - 44,5*2,3 мкМ Fe , с суммарным

препаратом Х- и к-каррагинанов - 35,9*0,7 мкМ Ре2+, с хитозаном - 17,7±0,9 мкМ Ре2+ и с альгинатом натрия - 15,3*1,1 мкМ Ре2*.

Для более полного раскрытия механизмов антиоксидантного действия некрахмальных полисахаридов важными представлялись исследования по оценке антиокси-дантной активности у представителей моносахаридов и дисахаридов. Мы изучали восстанавливающие свойства глюкозы (моносахарид) и сахарозы (дисахарид). Кроме того, с практической точки зрения большой интерес вызывали данные по сравнению количественных показателей антиоксидантной активности полисахаридов с таковыми лекарственных препаратов, применяемыми в медицине в качестве антиоксидантных средств. Для этого были выбраны эмоксипин и милдронат.

Глюкоза и сахароза обладали очень низкой восстановительной способностью; в диапазоне от 0,1% до 1% концентраций сахарозы и глюкозы дозо-зависимого эффекта не наблюдали. Количество образовавшегося восстановленного железа в реакции с 1% раствором глюкозы через 60 мин инкубации составляло 13,9*0,9 мкМ Ре2*, в реакции с 0,5% раствором глюкозы - 11,9±0,7 мкМ Ре2*, в реакции с 0,1% раствором глюкозы - 11,2±0,4 мкМ Ре2*. Количество образовавшегося восстановленного железа в реакции с 1% раствором сахарозы через 60 мин инкубации составляло 12,8±0,8 мкМ Ре2*, в реакции с 0,5% раствором с. сахарозы - 11,8±0,9 мкМ Ре2*, в реакции с 0,1% раствором сахарозы - 10,7*1,0 мкМ Ре2*.

Милдронат и эмоксипин обладали низкой восстановительной способностью по сравнению с исследуемыми полисахаридами, при этом, у эмоксипина восстановительная способность была выше, чем у милдроната. Увеличение концентрации лекарственных препаратов в 10 раз (от 0,1% до 1%) приводило к увеличению содержания восстановленного железа через 60 мин инкубации в 1,9 раза. Количество образовавшегося восстановленного железа в реакции с 1% раствором эмоксипина через 60 мин инкубации составляло 49,1*1,0 мкМ Ре2*, с 1% раствором милдроната - 26,2*0,7 мкМ Ре2*. Количество образовавшегося восстановленного железа в реакции с 0,5% раствором эмоксипина через 60 мин инкубации составляло.38,1 ±0,9 мкМ Ре2*, в реакции с 0,5% раствором милдроната - 21,9±0,7 мкМ Ре2*. Количество образовавшегося восстановленного железа в реакции с 0,1% раствором эмоксипина через 60 мин инкубации составляло 25,8*0,6 мкМ Ре2*, в реакции с 0,1% раствором милдроната - 13,6*0,5 мкМ Ре2*.

Для наглядной сравнительной оценки восстанавливающих свойств тестируемых веществ использовали условный параметр, «удельная восстанавливающая активность» (УВА), который находили как отношение количества образовавшегося двухвалентною железа к количеству исследуемого вещества в инкубационной смеси.

Таблица 5.

Удельная восстанавливающая активность (мкМ FeI+/r) некрахмальных полисахаридов, глюкозы, сахарозы, эмоксипина и милдронята, измеренная по восстановлению трехвалентного железа (метод FRAP)

Исследуемое вещество 15 мин инкубации 30 мин инкубации 60 мин инкубации

Зостерин 309,3*6,6 447,8*12,7 630,0*16,0

Фукоидан 176,2*2,6 244,№4,3 350,8*7,2

Суммарный препарат Х- и к- каррагинанов 132,9*1,6 157,8*2,3 202,1*3,7

Высокоэтерифицированный пектин 110,7*1,3 144,7*1,6 195,1*2,3

Низкоотерифицированный пектин 106,3*2,7 130,7*3,7 171,1*5,5

Хитозан 66,8*1,2 80,0*1,5 97,0*1,5

Алы инат натрия 30,2*1,3 40,0*1,0 57,1*0,9

Эмоксипин 20,1*0,3 28,5*0,7 41,8*0,9

Милдронат 10,2*0,5 14,7*0,6 ' 22,3*0,6

Глюкоза 6,9±0,5 10,0*0,9 11,8*03

Сахароза 7,8±0,б 8,4*0,6 10,9*0,7

Исследуемые вещества в таблице 5 размещены по мере снижения удельной восстанавливающей активности. Из таблицы видно, чго пектин-зостерин обладает максимальной удельной восстанавливающей активностью. Показатель удельной

восстанавливающей активности фукоидана в среднем на 44,3% ниже, чем у пектина-зостерина. Уровень удельной восстанавливающей активности суммарного препарата Х- и к- каррагинанов. высокотпхрифицированного пектина и низкотгерифипирован-ного пектина в среднем на 67,9%, 69,0% и 72,8% соответственно ниже по сравнению с таковым у зостерипа. У хитозана и альгинзта натрия показатель удельной восстанавливающей активности в среднем на 84,6% и 90,9% соответственно ниже, чем у зостерипа. Уровень удельной восстанавливающей активности эмоксипина и милд-роната в среднем иа 93,4% и 96,5% соответственно ниже по сравнению с таковым у пектина-зостерина. У глюкозы и сахарозы показатель удельной восстанавливающей активности самый низкий по сравнению со всеми тестируемыми вещестаами, который в среднем на 98,1% и 98,3% соответственно ниже, чем у пектина-зостерина (табл. 5).

Оценка аптпоксидантной активности некрахмальных полисахаридов по пнгибироваиию Ре^-аскорбатиндуцированного окисления твипа-ЯО до малопового диальдегида

Для измерения способпосги тестируемых веществ тормозить Ре2+-аскорбатиндупированное окисление Твина-80 до чалонового пиальдегита в инкубационную среду, содержащую водные растворы твина-80, сернокислого железа и аскорбиновой кислота, вводили полисахариды в виде 0.1%. 0,5% и 1% растворов. Полученную смесь инкубировали в течение 48 ч при температуре 37°С. Об антиокси-дантной активности судили по степени ингибирования ими Ре2+-аскорбатиндуци-ромнного окислеш« твика-80 до мшганового диальдегида и выражали в процентах.

Обнаружено, что из всех тестируемых полисахаридов максимальной ингиби-рующей активностью обладает хитозан. В концентрации 1% степень ингибирования Ре,*-ас1шрби гиндуцированного окисления твина составляла 27,3*1,1%. Если показать внгибирмошей активности 1% хитозана принять за 100%, то антиоксидантная активность фукоидана составляет 87,2%, милдроната - 85,7%, альгината кальция -52,0%, алыината натрия - 44,7%. зостерина и низкоэтерифицированного пектина -39,9%, вь-соколсрифицированного пектина - 37,4%. а эчоксипина - 23.8% (табл. 6).

Таблица 6.

Ингибирование Ре"-аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до малоиового диальдегида некрахмальными полисахаридами, милдронатом и эмокснпином in vitro

Исследуемое вещество Степень ингибировання, %

0,1% раствор 0,5% раствор 1% раствор

Хитозан 18,2±0,5 22,1 ±0,9 27,3±1,1

Фукоидан 6,4±0,4 17,8±0,7 23,8±0,7

Милдронагг 8,6*0,6 16,3*0,5 23,4±0,5

Альгинат кальция 5,0±0,3 8,7±0,5 14,2±0,7

Альгинат натрия 3,9±0,3 9,7±0,7 12,2±0,5

Зостерин к 1,7±0,3 5,3±0,4 10,9±0,6

Низкоэтерифицированный пектин. 2,<Ж),3 7,7±0,5 10,9±0,4

Высокоэтерифицированный пектин б,0±0,3 10,0±0,6 10,2±0,7

Эмоксипин 2,0±0,3 6,5±0,4 6,5±0,4

ВЫВОДЫ

1. На модели окислительного стресса, индуцированного активаторами перекис-ного окисления липидов у крыС, пектины, альгинат кальция, фукоидан и хитозан снижают уровень ТБК-акгавных продуктов и диеновых конъюгатов в печени и крови, Повышают уровень восстановленного глутатиона, тиоловых групп в печени и антиок-сидантную активность плазмы крови.

2. Профилактическое введение экспериментальным животным альгината кальция и низкоэтерифицированного пектина дозо-зависимым образом ослабляет развитие окислительного стресса, вызванного тетрахлорметаном.

3. Низкоэтерифицированный пектин, альгинат натрия, альгинат кальция, фукоидан и суммарный препарат Х- и к-каррагинанов при энтеральном введении ин-

тактным животным подавляют Ре2+-аскорбатиндуцированное окисление липидов мембран гепатоцитов.

4. Низкоэтерифицированный пектин, альгинат натрия, альгинат кальция, фу-коидан и суммарный препарат Х- и к-каррагинанов при энтеральном введении животным с окислительным стрессом, вызванным ацетатом свинца, подавляют FeJ+-аскорбатиндуцированное окисление липидов мембран гепатоцитов.

5. Восстанавливающая активность некрахмальных полисахаридов в условиях in vitro (метод FRAP) повышается в ряду: альгинат натрия, хитозан, низкоэтерифицированный пектин, высокоэтерифицированный пектин, суммарный препарат Х- и к-каррагиНанов, фукоидан, зостерин.

6. Некрахмальные полисахариды дозо-зависимым образом ингибируют Fe2+-аскорбатиндуцированное окисление твина-80 до малонового диальдегида. Ингиби-рующая активность повышается в ряду: высокоэтерифицированный пектин, низкоэтерифицированный пектин, зостерин, альгинат натрия, альгийат кальция, фукоидан, хитозан.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Хотимченко М.Ю., Коленченко Е.А., Тюпелеев П.А., Хотимченко Ю.С., Ковалев В.В., Сергущенко И.С. Гиполипидемическое действие полиуронидов при экспериментальной свинцовой интоксикации // Человек и лекарство: X Рос. нац. конгр., тез. докл. - М., 2003. - С. 680.

2. Хотимченко М.Ю., Сергущенко И.С., Коленченко Е.А. Влияние низкоэтери-фицированного пектина на уровень гормонов щитовидной железы при свинцовой интоксикации//Человек и лекарство: X Рос. нац. конгр., тез. докл. -М„ 2003. - С. 681..

3. Петракова М.В., Коленченко Е.А., Ковалев В.В., Хотимченко Ю.С. Сорбция холевой кислоты пектинами in vitro // Фундаментальные проблемы фармакологии' Второй съезд Рос. науч. об-ва фармакологов, тез докл. - М.: РАМН, 2003. - С. 73

4. Хасина Э.И., Коленченко Е.А., Сгребнева М.Н., Ковалев В.В., Хотимченко Ю.С. Антиоксидантная активность низкоэтерифицированного пектина из морской травы Zostera marina II Биол. моря. - 2003 - Т. 29, №5. С 291-293.

5. Коленченко Е.А., Хотимченко М.Ю., Петракова М.В. Сравнительная антиок-сидангная активность полисахаридов // Человек и лекарство: XI Рос. нац. конгр., тез. докл. - М., 2003. - С. 530-531.

6. Khotimchenko Yu.S., Kolenchenko Е.А., Khotimchenko M.Y., Kovalev V.V. Healing and preventive effects of low-esterified pectin on liver injury induced by carbon tetrachloride in rats // Oriental Pharmacy and Experim. Medicine. - 2004. - Vol. 4, № 1. - P. 28-36.

Лишний ПЛД № 63-19 от 02 12.19991 Зак. № 63 п. Формат 60xí4 Vl6. Уел п. я 1,0. Тираж 100 экз. Подписано в печать 25 10 2004 г Печать офсетная с оригинала заказчика.

Отпечатано в типографии ОАО «ДАЛЬПРИЙОР» 690105, г. Владивосток, ул. Бородинская, 46/50, тел 32-70-49 (32-44)

I

I

1

t

РНБ Русский фонд

2006-4 20391

Актуальность проблемы. Проблемы лекарственной регуляции окислительного стресса и поиск фармакологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью, по-прежнему остаются в центре внимания исследователей по различным направлениям экспериментальной и клинической фармакологии (Кения и др., 1993; Lewis et al., 2000; Kanner et al., 2001; Halvorsen et al., 2002; Matthaus, 2002; Ladas et al., 2004). В физиологических условиях окислительно-восстановительные процессы, обеспечивающие энергетические потребности клеток и утилизацию кислорода в тканях, контролируются регуляторными системами, поддерживающими сбалансированное взаимодействие реакций образования продуктов оксидации и антиокислительных факторов. Нарушение этого взаимодействия, которое сопровождается активацией свободно-радикальных процессов и накоплением продуктов перекисного окисления липидов, рассматривается в качестве универсального механизма повреждения биологических мембран (Gorman et al., 1999; Halliwell, 2001; Vertuani et al., 2004), лежащего в основе таких патофизиологических процессов, как воспаление, атерогенез и канцерогенез (Bounous, Molson, 2003), и является важным звеном в патогенезе атеросклероза (Heinecke, 1998; Азизова, 2000; Kaul et al., 2001), инфаркта миокарда (Klipstein-Grobusch et al., 1999), злокачественных опухолей (Kumaraguruparan et al., 2002; Saintot et al., 2002), перитонита (Konukoglu et al., 1999), хронического гломерулонефрита (Тугушева и др., 1994), острых и хронических интоксикаций тяжелыми металлами (Shaikh et al., 1999; Gaetke, Chow, 2003).

Установление роли окислительного стресса в развитии многих заболеваний свидетельствует о том, что эндогенная антиоксидантная система не обеспечивает в достаточной степени защиту клеток и тканей от повреждающего действия свободных радикалов. Поэтому вполне оправдан поиск новых подходов и средств подавления прооксидантных процессов и активации реакций антиоксидации (Fang et al., 2002; Schlesier et al., 2002; Violi et al., 2004).

Среди природных соединений, обладающих фармакологической активностью, обращают на себя внимание некрахмальные полисахариды, такие как соли альгиновой кислоты, пектины, фукоиданы, хитозан и каррагинаны. В той или иной степени они оказывают гипохолестеринемический (Miura et al., 1995; Knopp et al., 1999; Ylitalo et al., 2002), противоязвенный (Shibata et al., 1999; Ito et al., 2000; Yamamoto et al., 2000), антикоагулянтный (Huang et al., 2003; Mourâo, 2004), энтеросорбционный (Соболев и др., 1999; Савченко, Хотимченко, 2002), иммуномодулирующий (Назарова и др., 1998; Pratt-Pearce, Phillips, 1996) и противовирусный (Ponce et al., 2003) эффекты. Некоторые из этих эффектов сопровождаются снижением уровня продуктов пере-кисного окисления липидов в крови экспериментальных животных (Хотимченко и др., 1997; Иванова, Янькова, 1998; Шевцова, 1999; Хотимченко и др., 20006; Шевцова, 2000). Кроме того, показано, что экстракты из ряда бурых и красных водорослей, содержащие соединения полисахаридной природы, проявляют антиоксидантные свойства (Xue et al., 2001; Ruperez et al., 2002; Zhang et al., 2003). Эти данные наводят на мысль, что некрахмальные полисахариды могут обладать антиоксидантными свойствами. Проверке этого предположения и анализу возможных механизмов антиоксидантного действия некрахмальных полисахаридов посвящена настоящая работа.

Цель работы.

Цель работы состояла в сравнительной оценке и изучении механизмов антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов растительного и животного происхождения.

Задачи работы:

1. Экспериментально изучить эффекты альгинатов кальция и натрия, низкоэтерифицированного и высокоэтерифицированного пектинов, фукоида-на, хитозана и каррагинанов на модели окислительного стресса, вызванного индукторами перекисного окисления липидов у лабораторных животных.

2. Исследовать профилактические эффекты некрахмальных полисахаридов на модели окислительного стресса у лабораторных животных.

3. Исследовать антиоксидантное действие некрахмальных полисахаридов на модели Ре2+-аскорбатиндуцированного перекисного окисления липи-дов в мембранах гепатоцитов здоровых животных и животных с экспериментальным окислительным стрессом.

4. В условиях in vitro изучить антиоксидантные эффекты некрахмальных полисахаридов по восстановлению трехвалентного железа (метод FRAP).

5. В условиях in vitro изучить антиоксидантные эффекты некрахмальл I ных полисахаридов по ингибированию Fe -аскорбатиндуцированного окисления твина-80 до малонового диальдегида.

6. Провести сравнительную оценку антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов и лекарственных препаратов-антиоксидантов -милдроната и эмоксипина.

Научная новизна. Впервые проведены сравнительные исследования антиоксидантных свойств некрахмальных полисахаридов, таких как натриевая и кальциевая соли альгиновой кислоты, пектины с разной степенью эте-рификации, каррагинаны, фукоидан и хитозан. Установлено, что исследованные полисахариды, за исключением высокоэтерифицированного пектина и каррагинанов, на различных моделях окислительного стресса у экспериментальных животных снижают интенсивность перекисного окисления липидов и способствуют нормализации показателей эндогенной антиоксидантной системы. На модельных системах in vitro, позволяющих судить о механизмах антиоксидантного действия тестируемых веществ, показано, что полисахариды обладают восстанавливающей активностью и ингибируют Fe2+-аскорбатиндуцированное окисление твина-80 до малонового диальдегида. Впервые показано, что антиоксидантных эффект полисахаридов зависит от их структуры и физико-химических свойств.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные об антиоксидантных свойствах исследуемых веществ послужат базой для дальнейших исследований фармакологической активности некрахмальных полисахаридов. Эти сведения расширяют теоретические представления о закономерных связях структуры и физико-химических свойств органических соединений с фармакологической активностью. Они дополняют представления о фармакологической регуляции оксидативных процессов при патологических состояниях. Полученные данные могут стать основой для разработки новых лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для применения в качестве антиоксидантных средств.

Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на итоговой конференции Института биологии моря ДВО РАН (Владивосток, 2002, 2003), на X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2003), на 2-ом съезде Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), на XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004).

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на заседаниях Семинара по морфологии, физиологии и биохимии Института биологии моря ДВО РАН. По результатам обсуждения диссертация была рекомендована к защите.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация выполнена на 138 страницах машинописного текста и состоит их введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 28 рисунков и 19 таблиц. Библиография состоит из 49 отечественных и 213 зарубежных источников.

выводы

1. На модели окислительного стресса, индуцированного активаторами перекисного окисления липидов у крыс, пектины, альгинат кальция, фукои-дан и хитозан снижают уровень ТБК-активных продуктов и диеновых конъ-югатов в печени и крови, повышают уровень восстановленного глутатиона, тиоловых групп в печени и антиоксидантную активность плазмы крови.

2. Профилактическое введение экспериментальным животным альги-ната кальция и низкоэтерифицированного пектина дозо-зависимым образом ослабляет развитие окислительного стресса, вызванного тетрахлорметаном.

3. Низкоэтерифицированный пектин, альгинат натрия, альгинат кальция, фукоидан и суммарный препарат Х- и к-каррагинанов при энтеральном введении интактным животным подавляют Ре2+-аскорбатиндуцированное окисление липидов мембран гепатоцитов.

4. Низкоэтерифицированный пектин, альгинат натрия, альгинат кальция, фукоидан и суммарный препарат Х- и к-каррагинанов при энтеральном введении животным с окислительным стрессом, вызванным ацетатом свинца, подавляют Ре2+-аскорбатиндуцированное окисление липидов мембран гепатоцитов.

5. Восстанавливающая активность некрахмальных полисахаридов в условиях in vitro (метод FRAP) повышается в ряду: альгинат натрия, хитозан, низкоэтерифицированный пектин, высокоэтерифицированный пектин, суммарный препарат Х- и к-каррагинанов, фукоидан, зостерин.

6. Некрахмальные полисахариды дозо-зависимым образом ингибируют Ре2+-аскорбатиндуцированное окисление твина-80 до малонового диальдеги-да. Ингибирующая активность повышается в ряду: высокоэтерифицированный пектин, низкоэтерифицированный пектин, зостерин, альгинат натрия, альгинат кальция, фукоидан, хитозан.

Заключение

Представленный в обзоре материал свидетельствует о наличии у некрахмальных полисахаридов большого разнообразия фармакологических эффектов, таких как гипохолестеринемический, энтеросорбционный, антибактериальный, противовирусный, противоопухолевый, антикоагулянтный, противоязвенный, иммуномоделирующий. Один из механизмов действия полисахаридов может быть обусловлен их антиоксидантной активностью. Об этом свидетельствует ряд работ, демонстрирующих, что под влиянием пектинов и альгинатов происходит снижение уровня ТБК-активных продуктов и диеновых конъюгатов в сыворотке крови экспериментальных животных (Хо-тимченко и др., 1997; Иванова, Янькова, 1998; Шевцова, 1999; Хотимченко и др., 20006; Шевцова, 2000). Эти данные наводят на мысль, что некрахмальные полисахариды могут обладать антиоксидантными свойствами. Однако в литературе практически отсутствуют сведения об антиоксидантной активности полисахаридов (Xue et al., 2001; Ruperez et al., 2002; Zhang et al., 2003), что и определило тему настоящей работы.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Общая характеристика экспериментальных животных

Работа проводилась на 504 белых нелинейных крысах-самцах массой 130-200 г в начале экспериментов. Животных содержали в виварии ТИБОХ ДВО РАН. Во время экспериментальных исследований животные находились в специальных пластмассовых клетках со стружечной подстилкой по 34 в каждой. Животные имели 12-часовой цикл (день - ночь) содержания и свободный доступ к воде и пище. В состав стандартной диеты входили (г/100 г): казеин, 21,0; целлюлоза, 5,3; подсолнечное масло, 7,0; холестерин, 1,0; сахароза, 15,0; крахмал, 45,9; метионин, 0,3; минералы, 3,5 и смесь витаминов, 1,0. Все животные помимо сбалансированного рациона получали овес, хлеб, свежие овощи и фрукты, мел, а в зимнее время также были добавлены комплексные поливитаминные препараты.

Основные требования к содержанию, выбору и подготовке животных для экспериментов выполняли с принятыми в настоящее время рекомендациями. При разделении животных на группы проводили их ранжирование по массе тела с целью обеспечения идентичности указанных групп по данному показателю. Содержание животных, наркоз, декапитацию проводили в соответствии с рекомендациями Европейской конвенции по охране позвоночных животных (European., 1986).

2.2. Общая характеристика препаратов

В работе были исследованы следующие препараты и вещества:

1. Низкоэтерифицированный пектин - порошок. Полимер галактуроно-вой кислоты. Концентрация чистого галактуронана в молекуле используемого пектина составляла 67,1%, степень этерификации около 2,5%. Свободные и метилированные карбоксильные группы расположены в случайном порядке. Характеристическая вязкость препарата составила 201 мл/г галактурона-иа. Молекулярный вес, вычисленный с помощью уравнения Марка-Куна

ПК

Хауинка, составлял в среднем 20500 Да.

2. Высокоэтерифицированный пектин — порошок. Концентрация чистого галактуронана в молекуле пектина составляла 78%, степень этерификации около 61%. Свободные и метилированные карбоксильные группы расположены в случайном порядке. Характеристическая вязкость препарата составила 352 мл/г галактуронана. Молекулярный вес, вычисленный с помощью щ, уравнения Марка-Куна-Хауинка, составлял в среднем 224 кДа.

Низкоэтерифицированный и высокоэтерифицированный пектины были изготовлены ООО НПФ «Востокфарм» из пектина полученного от компании Copenhagen Pectin A/S, Lille Skensved, Дания. Пектины представляли собой мелкий однородный порошок кремового цвета с наличием частиц более светлого и более темного цвета. Массовая доля влаги в исследуемых образцах составляла не более 10%.

3. Зостерин-пектин из морской травы Zostera marina. Концентрация чистого галактуронана в молекуле пектина составляла 74,8%, степень этери-фикации около 5,7%, характеристическая вязкость 340 мл/г галактуронана.

4. Альгинат натрия - порошок. Полимер гулуроновой и маннуроновой кислот. Характеристическая вязкость 1270 мл/г галактуронана, молекулярная масса - 403 кДа. Альгинат натрия типа HV РС-35-0-351-0 был произведен компанией Kelco Div.

5. Альгинат кальция - порошок. Содержание уроновых кислот - 77,3%, содержание кальция - 72,5%. 82,5% карбоксильных групп представлены в виде кальциевой соли. Альгинат кальция был изготовлен ООО НПФ «Востокфарм» из альгината натрия.

6. Хитозан, выделенный их хитина панциря камчатского краба. Изготовлен ООО НПФ «Востокфарм».

7. Х-Каррагинан, выделенный из красной морской водоросли Chondrus crispatus, предоставлен Тихоокеанским институтом биоорганической химии ДВО РАН.

8. к-Каррагинан, выделенный из красной морской водоросли Chondrus crispatus, предоставлен Тихоокеанским институтом биоорганической химии ДВО РАН.

9. Суммарный препарат Х- и к-каррагинанов, выделенный из красной морской водоросли Chondrus crispatus, предоставлен Тихоокеанским институтом биоорганической химии ДВО РАН.

10. Фукоидан, полученный из бурой водоросли Laminaria japónica. Изготовлен ООО НПФ «Востокфарм».

11. Агар бактериологический - порошок («Sigma», США). Представляет собой смесь агарозы и агаропектина.

12. Камедь карайи, выделенная из дерева рода Sterculia («Sigma», США). Представляет собой частично ацетилированный полимер, состоящий из остатков галактозы, рамнозы и глюкуроновой кислоты. Молекулярный вес в среднем составлял 9500 кДа.

13. Камедь рожкового дерева, выделенная из семян Ceratonia siliqua («Sigma», США). Представляет собой линейный полимер, состоящий из остатков маннозы, при этом каждый 4-й остаток маннозы имеет заместитель в виде галактозы. Молекулярный вес в среднем составлял 310 кДа.

14. Сахароза («ДиаэМ», Россия).

15. Глюкоза («ДиаэМ», Россия).

16. Эмоксипин - 1% раствор (ФГУП «Московский эндокринный завод», г. Москва). По химической структуре представляет собой 3-окси-б-метил-2-этил-пиридина гидрохлорид. Препарат относится к группе антиок-сидантов, обладающих ангиопротекторной, антигипоксической и антиагрега-ционной активностью (Клебанов и др., 2001).

17. Милдронат - 10% раствор (ПАО «Гриндекс», Латвия). Препарат представляет собой четвертичное аммониевое соединение; по химической структуре - это 3-(2,2,2-триметилгидразиний) пропионат, который является аналогом у-бутиробетаина, предшественника карнитина. Препарат обладает антиоксидантной и антигипоксической активностью (Суслина и др., 2003).

2. 3. Методы оценки антиоксидантной активности некрахмальных полисахаридов

Антиоксидантную активность исследуемых веществ определяли тремя способами. Во-первых, по их способности в условиях in vivo подавлять процессы пероксидации и активировать антиоксидантные механизмы при окислительном стрессе, вызванном различными активаторами перекисного окисления липидов у экспериментальных животных. Во-вторых, по способности исследуемых веществ тормозить Ре2+-аскорбатиндуцированное перекисное окисление липидов мембран гепатоцитов в 0,05 М трисовом буфере (рН 7,4). В-третьих, по их способности восстанавливать Fe3+ in vitro (модифицированный метод FRAP) и ингибировать Ре2+-аскорбатиндуцированное окисление твина-80 до малонового диальдегида.

На экспериментальных животных были проведены три серии опытов: по проверке лечебного действия (1 серия), профилактического действия (2 серия) и лечебно-профилактического действия (3 серия) некрахмальных полисахаридов на модели окислительного стресса, вызванного различными индукторами перекисного окисления липидов. В качестве индукторов перекисного окисления липидов использовали следующие вещества: тетрахлорметан (ССЦ), ацетат свинца и этанол. Указанные вещества вводили внутрижелу-дочно, натощак, за 1 ч до кормления животных. Ацетат свинца растворяли в дистиллированной воде, а тетрахлорметан - в оливковом масле. Интактные животные получали обычную виварийную пищу.

Для исследования лечебного действия некрахмальных полисахаридов был проведен ряд экспериментов. В первом опыте крысам с окислительным стрессом, вызванным введением 1,0 мл тетрахлорметана в дозе 300 мг/кг массы тела животного в течение 7 дней, энтерально водили 1,0 мл раствора низкоэтерифицированного пектина и альгината кальция в дозах 10, 50 и 250 мг/кг массы тела, а фукоидана, хитозана, Х-каррагинана и к-каррагинана в дозе 200 мг/кг массы тела в течение 21 дня. Во втором опыте крысам с окислительным стрессом, вызванным введением ацетата свинца в дозе 100 мг/кг в течение 15 дней, внутрижелудочно вводили раствор низкоэтерифицированного пектина в дозе 200 мг/кг массы тела в виде 1% геля в течение 15 дней. В третьем эксперименте лабораторным животным в начале вводили ацетат свинца в дозе 100 мг/кг массы тела в течение 20 дней, а затем раствор низкоэтерифицированного пектина в дозе 200 мг/кг массы тела в виде 1% геля в течение 14 и 28 дней.

Для исследования профилактического действия полисахаридов крысам в начале эксперимента вводили внутрижелудочно 1,0 мл раствора низкоэтерифицированного пектина и альгината кальция в дозах 10, 50 и 250 мг/кг массы тела за 1 час до кормления в течение 21 дня, а на 22 день - тетрахлор-метан в дозе 300 мг/кг за 1 час до кормления в течение 7 дней.

Для исследования лечебно-профилактического действия полисахаридов крысам ежедневно в течение 7 дней вводили 1% раствор пектина-зостерина в дозе 100 мг/кг массы тела, а через 1ч- 40% раствор этилового спирта в дозе 7 мл/кг.

По завершении экспериментов животных декапитировали под легким эфирным наркозом, собирали кровь, извлекали печень и хранили их при -20°С до проведения анализов.

Для определения в печени животных содержания продуктов перекис-ного окисления липидов, взаимодействующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты), после индукции перекисного окисления липидов системой Бе -аскорбат брали навеску печени, промывали физиологическим раствором, гомогенизировали при 0-4°С в 50 мМ трис-НС1 буфере (рН 7,4) и центрифугировали при 10000 % в течение 10 мин. В супернатанте определяли концентрацию белка. К супернатанту добавляли 10 мкМ раствор Бе и 0,5 мМ раствор аскорбиновой кислоты, затем смесь инкубировали в течение 30 мин в водяном термостате при 37°С при постоянном перемешивании. Через is I

30 мин с момента добавления прооксидантов (10 мкМ раствор Fe и 0,5 мМ раствор аскорбиновой кислоты) из смеси отбирали аликвоту в 1,0 мл и реакцию останавливали добавлением к ней 1,0 мл 30% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 1,0 мл 0,75% тиобарбитуровой кислоты (ТБК). Полученную смесь перемешивали и нагревали в горячей водяной бане в течение 15 мин, а затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Содержание ТБК-активных продуктов (ТБК-АП) в надосадочной жидкости определяли спектрофотомет-рически при длине волны 532 нм, используя молярный коэффициент экстин-ции 8=1,56x105 М*1 см* (Владимиров, Арчаков, 1972).

Для определения способности некрахмальных полисахаридов в уело-виях in vitro ингибировать Fe -аскорбатиндуцированное окисление твина-80 до малонового диальдегида к 2,0 мл 1% твина-80 добавляли 0,2 мл 1 мМ раствора FeS04 • 7НгО, 0,2 мл 10 мМ раствора аскорбиновой кислоты и 0,2 мл 0,1%, 0,5% или 1% раствора полисахарида, в контрольную пробу - соответствующее количество дистиллированной воды. Смесь инкубировали 48 ч при 37°С, затем к 2,0 мл смеси приливали 1,0 мл 40% раствора ТХУ, выдерживали 60 мин и центрифугировали при 8000 об/мин 15 мин. После этого к 1,0 мл надосадочной прибавляли 2,0 мл 0,25% раствора ТБК и кипятили в водяной бане в течение 15 мин. Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 532 нм против дистиллированной воды. Расчет проводили по формуле:

А, где Dk и D„ - оптическая плотность соответственно контрольной и опытной проб (Галактионова и др., 1998).

Для определения восстанавливающей способности полисахаридов in vitro (модифицированный метод FRAP), к 0,3 мл свежеприготовленного реагента (0,5 мкМ раствор FeCb • 6Н20, 0,25 мкМ раствор 2,4,6-трипиридил-8

РОССИЙСХАЯ 'ГОСУДАРСТВЕННАЯ 41 БИШЮТЕКА триазина в 1 мкМ НС1 и 75 мкМ ацетатный буфер (рН 3,6)) добавляли 0,04 мл 0,1%, 0,5% или 1% раствора полисахарида или дистиллированной воды. Восстановительную способность определяли спектрофотометрически по количеI ству образовавшегося в течение 60 мин окрашенного комплекса Fe с 2,4,6-трипиридил-Б-триазином при длине волны 593 нм (Benzie, Strain, 1996).

2.4. Биохимические методы

Содержание уроновых кислот определяли колориметрическим ш-гидроксидифениловым методом (Blumenkrantz, Asboe-Haunsen, 1973).

Степень этерификации пектинов устанавливали титриметрическим методом (Афанасьев и др., 1984).

Характеристическую вязкость определяли в смеси 0,05 М раствора NaCl и 0,005 М раствора оксалата натрия при температуре 25°С и рН 6,0, использую вискозиметр Уббелода. Характеристическая вязкость связана с молекулярным весом империческим уравнением Марка-Куна-Хауинка (Krav-tchenko, Pilnik, 1990).

Содержание первичных продуктов перекисного окисления - диеновых конъюгатов (ДК) ненасыщенных жирных кислот - определяли по характерному спектру поглощения раствора липидов в смеси изопропанол-гептан. К 0,2 мл плазмы крови приливали 4,0 мл смеси изопропанол-гептан (1:1), встряхивали 10-15 мин на шейкере, прибавляли 1,0 мл раствора НС1 (рН 2,0), 2,0 мл гептана и интенсивно встряхивали. Через 20-30 мин отбирали верхний гептановый слой, в котором измеряли оптическую плотность при длине волны 233 нм (Гаврилов, Мишкорудная, 1983).

Для определения в печени экспериментальных животных содержания продуктов перекисного окисления липидов, взаимодействующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты), навеску печени промывали физиологическим раствором, гомогенизировали при 0-4°С в 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4) и центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин.

В супернатанте определяли концентрацию белка. К 1,0 мл супернатанта добавляли 1,0 мл 30% раствора ТХУ и 1,0 мл 0,75% раствора ТБК. Полученную смесь перемешивали и нагревали в горячей водяной бане в течение 15 мин, а затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Содержание ТБК-АП в на-досадочной жидкости определяли спектрофотометрически при длине волны 532 нм, используя молярный коэффициент экстинции £=1,56x105 М"1 см (Владимиров, Арчаков, 1972).

Содержание ТБК-АП в плазме крови экспериментальных животных определяли следующим образом. К 0,3 мл плазмы крови добавляли 3,0 мл 30% раствора ТХУ, 1,0 мл 0,65% раствора ТБК и 2,5 мл 0,05 М раствора сульфата натрия. Полученную смесь нагревали в горячей водяной бане в течение 15 мин, а затем центрифугировали 5 мин при 3000 об/мин. Количество ТБК-АП в надосадочной жидкости определяли спектрофотометрически при длине волны 532 нм, используя молярный коэффициент экстинции е=1,56х105М"1см"1 (Saton, 1978).

Для измерения восстановленного глутатиона (TSH) навеску печени гомогенизировали в 50 мМ трис- НС1 буфере (рН 7,5) при 0-4°С и центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Затем к 1,0 мл супернатанта приливали 0,12 мл 50% раствора ТХУ, пробу ставили на 30 мин на холод и потом центрифугировали 10 мин при 10000 g. К 0,2 мл супернатанта приливали 1,8 мл 0,2 М трис-HCl (рН 8,5), 0,02 мл раствора Эллмана и определяли оптическую плотность раствора при длине волны 412 нм (Moron et al., 1979).

Содержание тиоловых групп (SH-группы) в печени животных определяли следующим образом. Из смеси содержащей 3,0 мл белкового центрифу-гата, 2,0 мл 0,2 М фосфатного буфера (рН 8,0) и 5,0 мл дистиллированной воды отбирали аликвоту в 3,0 мл и добавили 0,02 мл реактива Эллмана. Через 2 мин измеряли оптическую плотность пробы при длине волны 412 нм (Торчинский, 1971).

Оценку показателя интегральной антиоксидантной активности (АОА) плазмы крови проводили методом с применением желточных липопротеи-дов. Суспензию желточных липопротеидов получали путем гомогенизирования желтка куриного яйца, содержащего два типа липидно-белковых комплексов, соответствующих по липидному и белковому составу липопротеи-дам очень низкой и низкой плотности плазмы крови, в равном объеме раствора, содержащего 40 мМ фосфатный буфер (рН 7,45) и 105 мМ КС1. Полученную суспензию перед использованием разводили в 25 раз тем же буфером. Анализ проводили следующим образом. К 1,0 мл суспензии желточных липопротеидов добавляли 1,0 мл плазмы крови и 7,0 мл фосфатного буфера (рН 7,45). Перекисное окисление липидов во всех пробах инициировали добавлением 1,0 мл 25 мМ раствора БеБОд • 7НгО, который готовили перед употреблением; конечный объем пробы составлял 10,0 мл. Контрольная проба плазму крови не содержала. В нулевую пробу добавляли только фосфат

Л I ный буфер (рН 7,45) и раствор Бе . Пробы инкубировали при 37°С в течение 15 мин при интенсивном перемешивании. Скорость перекисного окисления липидов определяли по количеству накопленных в образце продуктов, реагирующих с ТБК. После инкубации отбирали по 2,0 мл из каждой пробы, приливали по 1,0 мл 20% ТХУ и 0,1 мл

10"'М ионола в этаноле. Содержимое пробирок перемешивали и центрифугировали 15 мин при 900 К 2,0 мл полученного супернатанта добавляли 1,8 мл ТБК-реагента (0,5% раствор ТБК в 0,3% растворе додецилсульфата натрия). Смесь инкубировали в кипящей бане в течение 15 мин, пробирки охлаждали, добавляли по 2,0 мл хлороформа и после интенсивного встряхивания вновь центрифугировали при тех же условиях. В водной фазе измеряли оптическую плотность контрольной и опытных проб против контрольной пробы при длине волны 532 нм. Антиокси-дантную активность плазмы крови рассчитывали по формуле:

АЛк-Ай АОА = —-га- -100%,

ДА, где ADK =D'K-D° , ADM = Z>° , - оптическая плотность, измеренная в суспензии желточных липопротеидов с плазмой крови до инкубации; D'K, Dl, — оптическая плотность, измеренная в тех же образцах в момент времени t (через 15 мин инкубации). Измерение ADK и ADM было необходимо для того, чтобы учесть исходную степень окисленности суспензии желточных липопротеидов и плазмы крови (Клебанов и др., 1988).

Активность аланинаминотрансферазы (AJIT) и аспартатаминотрансфе-разы (ACT) в плазме крови определяли с помощью наборов реактивов «Jla-хема» (Чехия). 0,25 мл субстратно-буферных растворов для определения АЛТ или ACT нагревали 5 мин при 37°С, затем добавляли 0,05 мл плазмы крови и инкубировали 60 мин при 37°С. К смеси добавляли 0,25 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и выдерживали 20 мин при комнатной температуре. После этого добавляли 2,5 мл 0,4 н. раствора NaOH, тщательно перемешивали и спустя 10 мин измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 520 нм.

Содержание общего и конъюгированного билирубина в плазме крови определяли с помощью наборов реактивов фирмы «Лахема» (Чехия).

Содержание общих липидов в печени животных определяли, добавляя к 0,2 мл центрифугата печени порциями, периодически встряхивая, 3,8 мл смеси Блюра (3 части 96° этилового спирта и 1 часть сернокислого эфира). Затем содержимое пробирки встряхивали 2-3 мин и погружали на 20 с в кипящую водяную баню. После охлаждения восстанавливали первоначальный объем (4,0 мл) смесью Блюра и профильтровывали смесь через бумажный фильтр. К 2,0 мл фильтрата прибавляли 10,0 мл 1% раствора серной кислоты. Через 60 мин измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 434 нм (Портяная и др., 1990).

Гликоген в печени лабораторных животных измеряли с антроновым реактивом (Van Handel, 1965), используя глюкозу в качестве стандарта.

Содержание общего холестерина (ХЛ) в плазме крови определяли с помощью наборов реактивов фирмы «Вектор-Бест» (Россия).

Содержание триглицеридов (ТГ) в плазме крови определяли с помощью наборов реактивов фирмы «Ольвекс Диагностикум» (Россия).

Содержание белка определяли по методу Гринберга (Greenberg, Gad-dock, 1982).

2.5. Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Statistica, v. 5. О». Для статистического анализа и обработки результатов исследования рассчитывали средние арифметические величины и ошибки средних арифметических. Оценку достоверности различия результатов экспериментальных наблюдений производили в сравнении с контролем с применением t-критерия Стьюдента для малых величин (п < 30). Уровень значимости считали достоверным при р < 0,05 (Гублер, 1978).

Г л а в а 3. ОЦЕНКА АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ НЕКРАХМАЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ В УСЛОВИЯХ IN VIVO НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ С ОКИСЛИТЕЛЬНЫМ

СТРЕССОМ

Эксперименты по исследованию антиоксидантного действия некрахмальных полисахаридов животного и растительного происхождения проводились на экспериментальных животных, которых разделяли на группы: ин-тактные, контрольные и экспериментальные. Интактные животные (негативный контроль) получали обычную пищу вивария на протяжении каждого эксперимента. Животным контрольных групп (позитивный контроль) энте-рально с помощью зонда вводили различные индукторы перекисного окисления липидов, такие как тетрахлорметан, ацетат свинца и этанол. У каждого из этих веществ механизмы начального повреждающего действия различны, но в конечном итоге все они активируют перекисное окисление липидов. Животным экспериментальных групп внутрижелудочно вводили один из индукторов перекисного окисления липидов и исследуемые полисахариды в виде растворов и суспензий.

По завершении экспериментов животных декапитировали под легким эфирным наркозом, собирали кровь и извлекали печень.

Для оценки процессов перекисного окисления липидов определяли содержание диеновых конъюгатов в плазме крови и ТБК-активных продуктов в печени и плазме крови. О состоянии системы антиоксидантной защиты судили по показателю интегральной антиоксидантной активности плазмы крови, содержанию в печени восстановленного глутатиона и тиоловых групп. Для оценки функционального состояния печени в плазме крови определяли содержание общего и конъюгированного билирубина, активность аланинами-нотрансферазы и аспартатаминотрансферазы. О нарушении жирового и углеводного обмена судили по содержанию в печени общих липидов и гликогена, а в плазме крови - общего холестерина и триглицеридов.

Поражение печени, вызванное 7-дневным введением тетрахлорметана в дозе 300 мг/кг массы тела, приводило к достоверным изменениям всех регистрируемых биохимических показателей. Уровень диеновых конъюгатов в плазме крови повысился в среднем на 78,7-163,1%, ТБК-активных продуктов в печени - на 141,6-243,5%, в плазме крови - на 177,0-250,1%. Содержание восстановленного глутатиона и тиоловых групп уменьшилось в среднем на 56,3-69,3% и 46,7-54,0% соответственно. Антиоксидантная активность плазмы крови упала более чем в 2 раза по сравнению с интактными животными-1 (табл. 1, 2, 3, 10, 11). В плазме крови происходило значительное повышение активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, в среднем в 5,0-7,0 и 6,4-11,4 раза соответственно, а также возрастал уровень общего и конъюгированного билирубина, в среднем в 2,5-4,5 и 2,6—4,7 раза соответственно. Содержание общих липидов в печени увеличилось на 201,3%, а содержание гликогена уменьшилось в среднем на 67,0-71,2% (табл. 4, 5, 6, 12, 13).

Введение ацетата свинца в дозе 100 мг/кг массы в пересчете на металл в течение 15 и 21 сут приводило к заметным изменениям регистрируемых биохимических показателей. Уровень ТБК-активных продуктов в печени повысился в среднем на 96,2-151,6%, тогда как содержание восстановленного глутатиона и тиоловых групп уменьшилось в среднем на 53,4-55,8% и 46,152,9% соответственно. Содержание в плазме крови общего холестерина и триглицеридов увеличилось в среднем на 22,3-30,6% и 13,3-31,9% соответственно (табл. 7, 8,9).

7-дневное введение 40% этанола в дозе 7 мл/кг массы тела способствовало повышению уровня ТБК-активных продуктов в плазме крови на 19,1% и в печени — на 80,4%. Содержание общего холестерина и триглицеридов в плазме крови увеличилось на 62,0% и 59,0% соответственно (табл. 14).

В последующие 14-28 сут после прекращения введения индукторов пе-рекисного окисления липидов существенных положительных сдвигов регистрируемых биохимических показателей печени и плазмы крови, как правило, не происходило (контрольная-1), что свидетельствует об отсутствии самоизлечения подопытных животных за указанный период времени.

На экспериментальных животных были проведены три серии опытов: по проверке лечебного действия (1 серия), профилактического действия (2 серия) и лечебно-профилактического действия (3 серия) некрахмальных полисахаридов на модели окислительного стресса, вызванного различными индукторами перекисного окисления липидов.

3.1. Оценка лечебного действия некрахмальных полисахаридов на модели окислительного стресса

После 7-дневного введения тетрахлорметана животные всех групп получали стандартную виварную пищу в течение 4 дней. Начиная с 5 дня экспериментальной группе животных вводили с помощью зонда растворы низ-коэтерифицированного пектина и альгината кальция в течение 21 дня. На фоне развившегося окислительного стресса пероральное введение исследуемых полисахаридов в различных дозах по-разному отразилось на процессах пероксидации липидов и антиоксидантных функциях организма животных. Так, введение низкоэтерифицированного пектина и альгината кальция в дозе 10 мг/кг массы тела, с одной стороны, повысило антиоксидантную активность плазмы крови соответственно на 31,3% и 23,6%, а с другой стороны, понизило уровень ТБК-активных продуктов в плазме крови на 33,5% и 22,6% соответственно по сравнению с группой «контрольная-2». На остальные биохимические показатели состояния печени и плазмы крови, как пектин, так и альгинат в указанной дозе существенно не повлияли.

Результаты оценки состояния систем перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты у животных, получавших оба полисахарида в дозе 50 мг/кг массы тела, показали статистически достоверные отличия по всем показателям по сравнению с группой «контрольная-2», за исключением уровня тиоловых групп (табл. 1, 2). В результате введения пектина содержание ТБК-активных продуктов в печени уменьшилось на 29,0%, ТБКактивных продуктов и диеновых конъюгатов в плазме крови — на 46,5% и 38,1% соответственно, тогда как уровень восстановленного глутатиона и ан-тиоксидантная активность плазмы крови повысились на 116,1% и 38,0% соответственно (табл. 1). Под влиянием альгината кальция происходило снижение уровня ТБК-активных продуктов в печени и плазме крови на 48,9% и 38,0% соответственно, а диеновых конъюгатов в плазме - на 50,0%. Уровень восстановленного глутатиона и антиоксидантная активность плазмы крови были выше, чем в группе «контрольная-2», на 66,7% и 55,4% соответственно (табл. 2).

Введение пектина и альгината кальция в дозе 250 мг/кг массы тела приводило к более выраженным изменениям всех регистрируемых показателей по сравнению с аналогичными параметрами в группе «контрольная-2». Об ослаблении процессов перекисного окисления липидов под действием пектина и альгината кальция свидетельствовало снижение уровня ТБК-активных продуктов в печени соответственно на 46,0% и 53,9%, ТБК-активных продуктов в плазме крови - на 55,8% и 49,6%, диеновых конъюгатов в плазме - на 45,4% и 32,0% и, напротив, повышение уровня восстановленного глутатиона на 174,7% и 122,4%, тиоловых групп - на 41,7% и 45,6% и антиоксидантной активности плазмы крови - на 67,6% и 73,2% соответственно (табл. 1,2) указывало на активацию антиперекисных механизмов.

Хитозан и фукоидан в дозе 200 мг/кг массы тела снижали уровень ТБК-активных продуктов в печени соответственно на 25,9% и 48,4%, а диеновых конъюгатов в плазме крови - на 31,8% и 40,8%. Лямбда и каппа каррагинаны ни на один из регистрируемых показателей не повлияли (табл. 3).

Введение исследуемых полисахаридов также дозо-зависимым образом повлияло на показатели функционального состояния печени. В группе животных, получавших низкоэтерифицированный пектин в дозе 10 мг/кг массы тела, только содержание гликогена было достоверно большим на 33,4%, чем в группе «контрольная-2». Альгинат кальция в этой же дозе на показатели состояния печени не повлиял.