Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Сравнительная оценка интрамускулярной и интрапортальной трансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы у больных сахарным диабетом I типа

ин

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ МЗ РФ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИСГИТУТ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ

УДК 616-089.843:616.37:57.086.833.4 на правах рукописи

ЕВСЕЕВ Юрий Николаевич

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИНГРАЫУСКУЛЯРНОЙ И ИНТРАПОРТАЛЬНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КУЛЬТУР ОСГРОВКОВЫХ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ I ТИПА

14.00.41 - трансплантология и искусственные органы

Автореферат диссертации на соискание'учёной степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 1993

/

/

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте трансплантологии и искусственных органов Минздрава России.

Научный руководитель -академик РАМН, доктор, медицинских наук, профессор В.И.ШУМАКОВ

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор И.Д.КИРПАТОВСКИЙ доктор медицинских наук , В.Г.ЕРУСЛИК

Ведущее учреждение - Научный центр хирургии РАМН

Защита диссертации состоится " " 1993 г.

в часов на заседании специализированного учёного совета Д.074.34.01 при Научно-исследовательском институте трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ (123436, Москва, ул. Щукинская, д. I, конференц-зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НШ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ.

Автореферат разослан 1993 г.

Учёный секретарь специализированного совета -доктор медицинских наук,

профессор А.А.ПИСАРЕВСКИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По данным ВОЗ диагностированные и латентные формы сахарного диабета (СД) составляют около Ъ% Европейской популяции, то есть СД только по частоте своей распространённости считается важнейшей медико-социальной проблемой. Но не только факт нарастания частоты ОД имеет основное значение, так же как и его омоложение, но и те последствия, к которым приводит это проградиентное по своему характеру заболевание. Причинами глубокой инвалидизации и смертности больных СД являются ХЛН, высокая частота потери зрения, ампутации конечностей вследствии сосудистых поражений, коматозные состояния, сочетание этих состояний с различными инфекциями (А.Г.Мазовец-кий и соавт.,1987; А.С.Ефимов, 1989; 1990; И.И.Дедов и соавт., 1992; Timsit J. ,1991).

Неудовлетворённость результатами традиционных методов терапии СД побуждает к постоянному поиску новых подходов в лечении заболевания. К наиболее перспективным направлениям следует отнести трансплантологические методы лечения. Полная коррекция углеводного обмена у больных СД I типа (инсулинзависимым) может быть достигнута пересадкой поджелудочной железы как васку-ляризированного органа. Небезопасность такой операции и необходимость иммуносупрессии ограничивает показания к ней случаями, когда больной нуждается одновременно в трансплантации почки (В.И.Шумаков, 1989; Robertson r.p., 1992). Однако, на этой стадии заболевания сосудистые осложнения СД - основная причина смерти таких больных - как правило, носят тяжёлый, необратимый характер ( Barker С.,1992).

Одним из перспективных направлений, обещающих как можно более раннюю нормализацию углеводного обмена и предотвращение развития поздних осложнений, является свободная трансплантация островков или культур островковых клеток поджелудочной железы (ОКПЖ). К неоспоримым преимуществам этого подхода следует отнести низкий операционный риск и возможность при определённых условиях избежать необходимости иммуносупрессии (В.И.Шумаков и соавт., I982-1990; Morris Р. et al ,1989; Barker С.,1992).

После первой клинической трансплантации микрофрагментов поджелудочной железы в 19% году ( Najarían J. et aL, 1977), в нашей стране культур ОКПЖ в 1979 году (В.И.Шумаков и соавт.,

1Ч81), на сегодняшний день в мире произведено более 1500 таких пересадок. Большой интерес к свободной трансплантации проявляют клиники США, Канацы, Англии, Германии, Швеции и других стран, но, несмотря на интенсивные экспериментальные исследования в этой области, клинические эффекты свободной трансплантации островковых клеток остаются скромными. Однако, достижения последних лет показали, что трансплантация островкового аппарата поджелудочной железы может приводить к исчезновению у реципиентов потребности в экзогенном инсулине ( БсЬагр Б. et а1, 1991;

ШхогсИ С. ег а1, 1992).

Учитывая существенные ограничения аллотрансплантации, в НИИ трансплантологии и искусственных органов разработан метод ксено-трансплантации культур ОКПЖ, который нашёл клиническое применение как дополнительный к традиционной терапии СД (В.И.Шумаков и соавт, 1985). С 1989 года в качестве источника получения культур ОКПЖ для клинической трансплантации используются новорождённые кролики, инсулин которых по аминокислотной последовательности близок к инсулину человека. Оценка эффективности трансплантации культур ОКПЖ новорождённых кроликов в зависимости от способа трансплантации у больных СД I типа определила актуальность работы.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилась оценка эффективности трансплантации культур ОКПЖ новорождённых кроликов в зависимости от способа трансплантации у больных СД I типа. Исходя из этой цели были сформулированы следующие непосредственные задачи:

1. Сравнить влияние трансплантации культур ОКПЖ на углеводный обмен, потребность в экзогенном инсулине, течение СД и некоторых вторичных осложнений у реципиентов в зависимости от способа трансплантации.

2. Изучить функционирование интрамускулярно и интрапортально трансплантированных культур ОКПЖ.

3. Оценить изменение иммунного статуса реципиентов после интрамускулярной и интрапортальной трансплантации культур ОКПЖ.

4. Разработать способ длительного сохранения интрапорталь-ного доступа и изучить некоторые параметры внутрипортальной гемодинамики и функционального состояния печени после интрапортальной трансплантации культур ОКПЖ.

Научная новизна. Впервыё установлено, что трансплантация культур ОКШ новорождённы* кроликов положительно влияет на углеводный обмен, снижает потребность реципиентов в экзогенном инсулине, стабилизирует течение лабильных форм СД и замедляет прогрессирование вторичных осложнений. Впервые осуществлена интрапортальная трансплантация культур ОКШ новорождённых кроликов. Выявлено, что эффект лечения выше при интрапортальном способа введения культур ОКПЖ. В работе впервые объективизирована Функциональная активность интрапортально трансплантированных культур ОКПЖ при транспечёночном исследовании концентрации гормонов. Показано, что умеренное изменение показателей клеточного звена иммунитета реципиентов не зависит от способа введения культур ОКПЖ. Предложен способ длительного сохранения интрапор-тального доступа.

Практическая значимость работы. Трансплантация культур ОКПЖ новорождённых кроликов, как эффективный дополнительный метод лечения СД I типа, может быть рекомендован больным с тяжёлым, лабильным течением заболевания, с наличием вторичных осложнений. Результаты клинических исследований показали более высокую эффективность и безопасность интрапортального способа введения культур ОКШ. Способ длительного сохранения интрапортального доступа позволяет повысить эффективность лечения больных СД, а также может быть полезен в других областях медицинской практики.

Внедрение результатов работы. Трансплантация культур ОКПЖ новорождённых кроликов признана эффективным дополнительным методом при лечении больных СД I типа в клинической практике НИИ трансплантологии и искусственных органов Минздрава России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ (список прилагается), получено I удостоверение на рационализаторское предложение, подана заявка на изобретение.

Апробация работы. Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены:

1) на межлабораторной научной конференции НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ (июнь, 1993);

2) на 201 заседании общества Трансплантологов г.Москвы и Московской области (г.Москва, октябрь, 1993).

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав,

заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 69 отечественных и 158 иностранных источников. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 15 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Клиническая характеристика больных и методы исследования.

В работе представлен анализ результатов исследований, проведённых у 106 больных СД I типа, которым было выполнено 115 трансплантаций культур ОКПЖ новорождённых кроликов, из них 27 повторных. Особенностью отобранных на трансплантацию культур ОКПЖ больных была тяжёлая форма СД I типа, его лабильное течение, быстрое прогрессирование или наличие сочетания нескольких осложнений диабета.

Все больные были разделены на 2 группы. Среди 73 пациентов I группы, в которую были включены больные, подвергнутые интра-мускулярной трансплантации культур ОЮТ, было 48 мужчин и 25 женщин. Возраст больных колебался в пределах от 18 до 57 лет, в среднем, составил 35,4 года. Длительность клинически манифестированного СД колебалась в пределах от 6 до 35 лет, в среднем, составила 17,4 года. Лабильное течение заболевания было выявлено у 76,8% больных, причём у 41,1% наблюдались частые (1-4 раза в сутки) и у 35,7% - редкие (1-2 раза в неделю) гипогликемические состояния. У 69,9% больных отмечались повторные кетоацидотичес-кие состояния. Большинство больных поступили в клинику в состоянии суб- и декомпенсации углеводного обмена, о чём свидетельствует среднесуточная гликемия (СГ) - 11,7^1,4 ммоль/л. Вводимая суточная доза инсулина колебалась от 18 до 96 единиц, в среднем, составила 51,3^15,4 единиц.

, Из 33 пациентов 2 группы, подвергнутых интрапортальной трансплантации культур ОКПЖ, было 24 мужчины и 9 женщин. Воздаст больных колебался в пределах от 15 до 55 лет, в среднем, составил 32,6 года. Длительность клинически манифестированного СД колебалась от 7 до 25 лет. Лабильное течение заболевания было выявлено у 87,9% обследованных, причём у 27,4% отмечались частые и у 60,6% - редкие гипогликемические состояния. У 81,8% больных отмечались повторные кетоацвдотические состояния. Большинство больных этой группы также поступили в состоянии суб- и декомпенсации углеводного обмена. СГ составила 11,6-1,0 ммоль/л. Вводи-

!.ая суточная доза инсулина колебалась от 18 до 60 единиц, в ' среднем, составила 49,3^9,7 единиц.

Распределение больных в зависимости от потребности в экзогенном инсулине представлено в таблице I.

Таблица I.

Доза инсулина I группа ! СГ *% 4М Тц больных 2 группа СГ % _ ИП Тц больных

До 30 ед/сут П,4±1,2 6,8 Ю,9±1,0 6,0

От 31 до 40 ед/сут П,3±0,9 21,9 П,8±0,9 9,1

От 41 до 50 ец/сут II,5±1,4 31,6 11,5^,0 72,8

От 51 цо 60 ед/сут 12,9±1,7 24,6 12,1—1,3 12,1

В '¡е 60 ед/сут 12,6±1,2 15,1 - -

СГ была выше допустимых значений (до 11,0 ммоль/л) в обеих группах реципиентов, причём, более высокой у больных с потребностью в экзогенном инсулине свыше 51 ед/сут.

Частота осложнений основного заболевания отображена в таблице 2.

Таблица 2.

Осложнение СД 1 гРУПпа ИМ2 ^уппа ИПТц

Кол-во б-х % Кол-во б-х %

Полинейропатия 68 93,1 31 93,9

Ангиопатия конечностей 68 93,1 31 93,9

Ангиоретинопатия 57 78,0 28 84,9

в т.ч., пролиферативная 22 30,1 12 36,4

Нефропатия (доклиническая стадия) 50 68,5 19 57,8

Трансплантационным материалом служили культуры ОКПЖ новорождённых кроликов, инсулин которых по аминокислотной последовательности близок к инсулину человека. ОКПЖ выделяли безфер-

- б -

ментативным методом (Н.Н.Скалецкий и соавт., 1990) и культивировали в течении 10-21 дня. Для интрамускулярной трансплантации использовали флотирукицую или смешанную фракцию, для интрапорталь-ной - прикреплённую.

Интрамускулярную трансплантацию культур ОКПЖ производили под местной анестевией путём пункции субапоневротического пространства правой прямой мышцы живота несколько выше пупка иглой с широким просветом и вводили через неё в мышечное ложе взвесь культур ОКПЖ.

Интрапортальную трансплантацию культур ОКПЖ производили под местной анестезией путём обнаружения в предбрюшинной клетчатке и бужирования пупочной вены с последующей катетеризацией воротной вены. Введение культур ОКПЖ производили после внутри-портального введения гепарина (5000 ец) с интраоперационным контролем внутрипортального давленияна хирургическом мониторе МХ-03.

С целью длительного сохранения интрапортального доступа применяли подкожную имплантацию трансумбиликального интрапортального катетера (приоритетная справка №93021170).

Для установления эффективности трансплантации культур ОКПЖ, помимо рутинных клинико-лабораторных исследований в динамике, определяли концентрации инсулина, С-пептида и глюкагона методом радиоиммунного анализа в пробах крови, полученных из печёночной и воротной вены при транспечёночном исследовании в условиях ангиографической операционной. Кроме этого, определяли процент гликозилированного гемоглобина (HbAj) колометрическим методом по Шнек-Шроцеру с помощью диагностического тест-набора фирмы "Boehringer Mannheim GmbH".

Иммунологическое обследование больных заключалось в определении абсолютного (в I мл) и относительного (в %) количества лимфоцитов, Т—, В—, "активных", соотношения ТаД, определении субпопуляций лимфоцитов с хелперной и- супрессорной активностью и их соотношение. Использовались стандартные методики, включая метод розеткообразования, а также методы с использованием моно-клональных антител (J1T-I, JIT-4, ЛГ-8). Кроме того, определяли состояние иммунореактивности обследованных с использованием антигенспециФичных методов - реакции торможения миграции лейкоцитов (FTMJI) с тканевыми антигенами и определения уровня компле-ментфиксирущих антител (КФА).

Из инструментальных методов диагностики использовали рацио-

изотопное изучение тканевого кровотока методом радиоиндикации по клиренсу Тс 99М из внутритканевого цепо при помощи рациоцирку-лограйа. 3 своей работе № использовали рентгеноконтрастную пор-тогра^ию, которую выполняли на ангиографе фирмы CGR, ультразвуковое измерение диаметра воротной вены на сонографе фирмы "COMBISON" динамическую радиоизотопную сцинтиграфию печени, используя реагент "МЕЗИДА", тропный к гепатоцитам, меченый Тс 99. Оценка Функции печени производилась программной регистрацией прохождения этого препарата через печень на компьютере гамма-камеры Фирмы "Nuclear Chicago".

Результаты исследования и их обсуздение.

В посттрансплантационном периоде снижение уровня глюкозы крови у реципиентов начиналось чаще всего на 7-10 сутки. Однако, у 6 реципиентов I группы (8,2%) и у 12 - из 2 группы (36,4$), отмечались неглубокие гипогликемические состояния на 1-2 день. Вероятно, причиной снижения гликемии в первые сутки после трансплантации был выброс инсулина из повреждённых во время трансплантации бета-клеток. Напротив, в 23 случаях в I группе (31,5%) и в 2 случаях во 2 группе реципиентов (6,0%), снижение гликемии наступало спустя 1-2 месяца.

Снижение уровня глюкозы в крови после трансплантации культур ОКПЖ сопровождалось гипогликемическими состояниями, в связи с чем,плавно уменьшали дозу экзогенного инсулина.

Таблица 3.

Изменение гликемии у реципиентов после трансплантации культур ОКПЖ

Способ введения жтур До Тц Среднесуточная гликемия (ммоль/л) Срок после Тц

14 дней I мес 3 мес 6 мес 10-12 мес

I группа ИМ Тц 10.9 ч.о

2 группа ИП Тц hZ,6m

* Р < 0,05 относительно исходного значения

* Р С 0,05 относительно значения I группы

Через 14 дней после трансплантации среднесуточная гликеуия (СГ) составила в I группе 10,8*1,0 шоль/л, и во 2 - 10,1*0,9 ммоль/л, то есть заметно снизилась относительно дотранспланта-ционных значений. Одной из важнейших целей лечения СД является достижение компенсации углеводного обмена. Признаками хорошей компенсации являются гликемия не выше II,0 ммоль/л в течении суток и аглюкозурия (А.С.Ефимов и др., 1990). В период с I по б месяц после трансплантации СГ не превышала 9,1*1,1 ммоль/л в I группе и 8,9*0,8 ммоль/л во 2 группе реципиентов. Более выраженное снижение СГ отмечалось у реципиентов 2 группы, которая через 6 месяцев после трансплантации достигла 8,0*0,3 ммоль/л, что достоверно отличалось от показателя реципиентов I группы (Р < 0,05).

Другим важнейшим критерием оценки компенсации углеводного обмена у реципиентов в отдалённые сроки после трансплантации культур ОКПЖ является динамика гликозилированного гемоглобина (Нв А^) (таблица 4).

Таблица 4.

Изменение уровня гликозилированного гемоглобина у реципиентов после трансплантации культур ОКПЖ (в %).

Способ введения 8ЙГГО До Тц Срок 3 мес после Тц 6 мес 10-12 мес

I группа ИМ Тц 13,8*1,0 9,2*0,6* 9,5*0,1* 10,2*0,4*

"ипТц^ 12,9*1,5 8,3*0,2* 8,4*0,3* 8,7*0,9**

* Р < 0,05 относительно исходного значения ж Р < 0,05 относительно значения I группы

Следует отметить статистически достоверное снижение уровня НвА^, как внутри каждой группы, относительно исходного значения (Р< 0,05), так, и более выраженное снижение НвА2 через 10-12 месяцев после трансплантации во 2 группе реципиентов, относи* тельно значения I группы (Р < 0,05), что свидетельствует о более высокой эффективности интрапортального введения культур ОКПЖ.

Очевидно, что снижение суточной дозы экзогенно вводимого инсулина у реципиентов после трансплантации культур ОКПЖ происходило на фоне улучшения углеводного обмена, о чём свидетельствует положительная динамика СГ и НвА^.

До трансплантации культур ОКПЖ старались оптимизировать режим инсулинотерапии. После трансплантации все больные оставались на тех же видах инсулина, и, по возможности, на той же кратности его введения в течении суток. Соб;:пдение этого правила облегчает интерпретацию полученных результатов в отношении снижения потребности в экзогенном инсулине у реципиентов после трансплантации культур ОКПЖ (таблица 5).

Таблица 5.

Изменение дозы экзогенного инсулина у реципиентов после

трансплантации культур ОКПЖ (ед/сут).

Способ введения культур ОКПЖ ** До Тц 14 дней Срок I мес после 3 мес Тц 6 мес 10-12 мес

I группа ИМ Тц абс. ч. -%?7 47,4 44,1

% 100 89,5 80,3 78,1 81,5 92,4

2 группа ИП Тц абс. ч. %% %% 3Й0,4«

% 100 81,7 66,9 53,3 52,1 75,2

* Р < 0,05 относительно исходного значения ж Р < 0,05 относительно значения I группы

Через 14 дней после трансплантации суточная доза вводимого инсулина была уменьшена, особенно заметно во 2 группе реципиентов, где составила 81,7% от исходной дозы. Через I, 3 и 6 месяцев после трансплантации потребность в экзогенном инсулине у реципиентов достоверно снижалась и составила, соответственно, 41,2*13,2 ед/сут, 40,1*13,0 ед/сут и 41,8*13,3 ед/сут в I группе, и 33,0*9,0 ед/сут, 26,3*6,9 ед/сут и 25,7*6,2 ед/сут во 2 группе реципиентов (Р < 0,05). Наибольшее снижение потребности в экзогенном инсулине произошло у реципиентов после интрапортальной

трансплантации культур ОКПЖ, у которых в период "с 3 цо 10-12 месяцев после трансплантации потребность в экзогенном инсулине была достоверно ниже показателей I группы (Р < 0,05).

В I группе реципиентов изменение суточной цозы экзогенного инсулина не было однозначным. У большинства реципиентов (82,2%) в период 1-6 месяцев после трансплантации потребность в экзогенном инсулине снизилась на 18-22%. Однако, у 10 больных (13, снижения потребности в экзогенном инсулине не отмечалось, а у 3 больных (4,1%). перенесших острые респираторные вирусные инфекции отмечалось незначительное повышение потребности в экзогенном инсулине. Напротив, у 4 реципиентов (5,5%) было зафиксировано значительное снижение суточной дозы экзогенного инсулина - до 50% от исходной, что сопоставимо с показателями реципиентов 2 группы.

Большое внимание при проведении трансплантации культур ОКПЖ уделялось гипогликемическим состояниям у реципиентов. До трансплантации гипогликемические состояния наступали внезапно и не были связаны с нарушением режима у 76,8% больных I группы и у 87,9% больных 2 группы. После трансплантации они либо вообще прекращались, либо становились более редкими, носили лёгкий характер и быстро устранялись приёмом пищи. Этот эффект отмечался уже через I месяц после трансплантации, а в период 3-6 месяцев достигал максимального уровня. Отсутствие гипогликемических состояний было у 89,0% реципиентов I группы и у 93,9% реципиентов 2 группы, против 23,2% и 12,1%, соответственно, до трансплантации. В случаях, когда гипогликемические состояния полностью не купировались, отмечалось улучшение их распознавания. Гипогликемические состояния наступали постепенно, больные чувствовали их приближение и могли их предотвратить. Через 3-6 месяцев после трансплантации постепенное наступление гипогликемических состояний отмечалось у 75% реципиентов I группы и у 100% - 2 группы.

Наиболее продолжительное влияние трансплантации культур ОКПЖ на гипогликемические состояния отмечалось после интрапор-тальной трансплантации. Так, через 10-12 месяцев у 81,8% реципиентов 2 группы не было гипогликемических состояний, а из тех пациентов, у кого они сохранялись, в 83,3% случаев они наступали постепенно, в сравнении, с 47,5% и 47,4%, соответственно, у реципиентов I группы. В послеоперационном периоде у всех пациентов обеих групп не наблюдалось гипо- или гипергликемических ком и

этот эффект сохранялся до I года.

Под влиянием трансплантации культур ОКПЖ значительно уменьшился болевой синдром, обусловленный дистальной Формой диабетической полинейропатии. У 35 из 43 реципиентов (81,4%) I группы, обследованных нами через 3 месяца после трансплантации, боли в конечностях значительно уменьшились или полностью купировались. Через 6 месяцев этот эффект удерживался у 74,2% обследованных, а через 10-12 месяцев - у 50%. Во 2 группе отмечался более высокий процент реципиентов, у которых значительно уменьшился или полностью купировался болевой сиццром. Так, через 3 месяца после трансплантации 87,8$ реципиентов не предъявляли жалоб на боли в ч конечностях, через 6 месяцев - 82.,7% и через 10-12 месяцев -76,1%.

Все показатели, отражающие состояние тканевого кровотока у больных с диабетическими ангиопатиями нижних конечностей обеих групп, достоверно отличались от значений контрольной группы (Р < 0,01). Период полувыведения изотопа из тканевого депо увеличивался в 1,5 раза, тканевой кровоток существенно снижался в покое и особенно резко, почти в 3 раза, падал при физической нагрузке в условиях ишемии. Установлено, что под влиянием трансплантации культур ОКПЖ происходило уменьшение периода полувыведения Тс 99М, повышение тканевого кровотока. По сравнению с исходными значениями, эти изменения достигли статистически значимых величин (Р < 0,05). Наиболее чёткие данные получены при измерении тканевого кровотока при физической нагрузке в условиях ишемии нижней конечности у реципиентов I группы. Статистически достоверных различий меящу группами не обнаружено.

Мы полагаем, что более выраженное уменьшение суточной дозы инсулина, более выраженные клинические и лабораторные изменения и их продолжительность в случаях интрапортальной трансплантации, связаны с местом введения культур ОКПЖ. В на^м исследовании нашли своё подтверждение экспериментальные данные о том, что интрапортальный путь введения культур ОКПЖ является более предпочтительным с точки зрения физиологии и условий приживления и функционирования трансплантированных культур ОКПЖ.

При исследовании концентрации С-пептида сыворотки крови выявлено, что у 29 из 56 реципиентов (51,8%) I группы и у 18 из 33 реципиентов (54,5%) 2 группы, исходный базальный уровень С-пептвда был равен нулю. Как отрицательные значения, интерпрети-

ровали вое показатели ниже порога чувствительности метода. У всех, исходно С-пептиднегативных реципиентов I группы, концентрация С-пепти.да оставалась на субпороговых значениях и после трансплантации, а из 18, исходно С-пептиднегативных пациентов 2 группы, только у 5, после операции концентрация С-пептцца не превысила порогового уровня (таблица 6).

Таблица 6.

Концентрация С-пептида крови у реципиентов после трансплантации культур ОКПЖ (в пмоль/л).

Способ Исход-введения ное зна-культур чение ОКГШ С-пептида До Тц Срок 14 дней после Тц I мес 3-6 мес

Контрольная группа здоровых доноров п=20 0,266^0,07

I группа С-пептид ИМ Тц позитив п=27 0,108 „ -0,08 0,163 _ ¿0,03** 0,166 ¿0,05 0,152 ¿0,03**

2 группа С-пептид ИП Тц негатив п=13 — 0,111 ¿0,03 0,173 ¿0,02 0,158 ¿0,04

С-пептид позитив п=15 0,115 „ ¿0,06* 0,281 „„ ¿0,09*** 0,180 „„ ¿0,04 0,188 ___ ¿0,07**

* Рк< 0,01 относительно значения контрольной группы

Р < 0,05 относительно исхдного значения ж Р < 0,05 относительно значения I группы

У С-пептидпозитивных больных обеих групп исходная концентрация была более чем в 2 раза меньшей по сравнению с значением контрольной группы (?к < 0,01). Через_14 дней после трансплантации концентрация С-пептида повышалась относительно дотрансплан-тационных значений как в I группе реципиентов (Р < 0,05), так и во 2 группе (Р < 0,05), причём, во 2 группе реципиентов более значительно, по сравнению с I группой (Р < 0,05). В период 3-6' месяцев после трансплантации наметилась тенденция к снижению концентрации С-пептида крови у реципиентов обеих групп, но оставалась в пределах нормальных значений. У 13, исходно С-пептид-

негативных больных 2 группы, был отмечен рост концентрации С-пептида, который через I и в период 3-6 месяцев после трансплантации достиг нормальных значений и составил, соответственно, 0,173^0,02 пмоль/л и 0,158^0,04 пмоль/л.

В случаях интрапортального введения культур ОКПЖ отмечалось более выраженное повышение концентрации С-пептида периферической крови, что на наш взгляд, связано с лучшими условиями функционирования трансплантированных бета-клеток.

В случаях интрапортальной трансплантации культур ОКПЖ одномоментное определение концентрации гормонов в воротной и в печёночной вене позволяет объективизировать степень функциональной активности трансплантата. В условиях ангиографической операционной производили катетеризацию печёночной вены и обнажали имплантированный во время трансплантации, с целью длительного сохранения интрапортального доступа,трансумбиликальный интрапортальный катетер. Осуществляли одновременный забор проб крови (5 мл) из воротной и из печёночной вены. После этого, с целью селективной стимуляции трансплантированных культур ОКПЖ, вводили в воротную вену 20 мл 2С$ раствора глюкозы и производили забор проб крови через I мин, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 60 мин. Полученные данные по концентрации инсулина, С-пептида и глюкагона суммированы в таблице 7.

Следует отметить, что уже в исходе отмечалась разница концентрации инсулина - 4,9±0,6 - 6,1±1,0 мкед/мл (Р < 0,05) и С-пептида - 0,12±0,04 - 0,21±0,08 пмоль/л (Р < 0,05) медщу воротной и печёночной веной, соответственно. По нашему мнению, более высокие концентрации инсулина и С-пептица в печёночной вене, являются отражением функционирования интрапортально трансплантированных культур ОКПЖ.

Через I минуту после селективной стимуляции глюкозой, при которой исключается влияние возможной остаточной эндокринной Функции поджелудочной железы больного, отмечалось возрастание концентрации инсулина в печёночной вене до 9,1—1,3 мкед/мл (Р < 0,05), что более чем в 2 раза превысило его концентрацию в воротной вене, и увеличение на порядок концентрации С-пептвда в печёночной вене - 1,20-0,46 пмоль/л (Р < 0,05), при Почти неизменных концентрациях в воротной вене. Неравномерный рост концентрации инсулина и С-пептида в печёночной вене после стимуляции, которые секретируются бета-клетками в эквимолярных

Таблица 7.

Концентрация гормонов при транспечёночном исследовании у реципиентов после интрапортальной трансплантации культур ОКПЖ.

Воротная вена Печёночная вена время Инсулин С-пептиц Глюкагон Инсулин С-пептид Глюкагон _(мкед/мл) (пмоль/л) (пг/мл) (мкед/мл) (пмоль/л) (пг/мл)

исход ^04 ^08* Щ&

I мин ±0,07 >?г& 1л20 „ 'ЙЛ

5 мин 1& -6,10 ^08 ъи

15 мин -6,09 ъч.

30 мин ?б?5« ^05

60 мин ад* г8й -б Дн -6^07

* Р < 0,05 относительно исходного значения ж Р< 0,05 относительно значения в воротной вене, при п=5

количествах, объясняется тем, что вьщеленный инсулин метаболи-зируется в печени, где осуществляет свой биологический эффект, а С-пептид поступает в печёночную вену. Полученный ответ на селективную стимуляцию убедительно доказывает функционирование трансплантированных культур ОКПЖ новорождённых кроликов.

Начиная с 5 минуты после стимуляции глюкозой отмечалось снижение концентрации инсулина и С-пептида в печёночной вене. По-видимому, это является отражением функционального истощения бета-клеток после стимуляции, необходимого для восстановления энергетики клеток и синтеза инсулина.

Через 30 минут после селективной стимуляции глюкозой отмечалось повышение концентрации глюкагона в воротной и в печёночной вене, что объясняется гипогликемией в результате секреции инсулина трансплантированными бета-клетками после стимуляции. Относительно низкие концентрации глюкагона свидетельствуют, е одной стороны, что на момент исследования имелась удовлетворительная компенсация углеводного обмена у реципиентов, а с другой,

о превалировании количества бета-клеток в трансплантационном материале. Транспечёночное исследование концентрации гормонов позволило проводить прямой мониторинг Функционирования интра-портально трансплантированных культур ОКПЖ и адекватно снижать у реципиентов дозу экзогенно вводимого инсулина.

Было выполнено 27 повторных трансплантаций культур ОКПЖ. В 19 случаях произведена интрамускулярная, в 3 - интрапорталь-ная и в 5 случаях - повторная 2-х кратная интрапортальная трансплантация. Показаниями к повторным трансплантациям культур ОКПЖ служили: ухудшение общего состояния больных, связанное с декомпенсацией углеводного обмена, увеличение потребности в экзогенном инсулине, появление симптомов вторичных осложнений, наблюдавшихся до предыдущей трансплантации. В 18 случаях, в качестве предыдущей трансплантации осуществлялась аллотрансплантация культур ОКПЖ трупов плодов. При ретроспективной сравнительной оценке алло- и ксенотрансплантации культур ОКПЖ у данных больных, основные результаты ксенотрансплантации оказались принципиально сходными. В целом, они близки к результатам аллотрансплантации культур ОКПЖ. Однако, следует отметить, что снижение потребности в экзогенном инсулине было менее выражено (18-22^ от исходной дозы, в сравнении, с 20-60% - при аллотрансплантации).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что повторные трансплантации культур ОКПЖ новорождённых кроликов позволяют пролонгировать компенсацию СД, и что необходимо стремиться проводить их не позже возврата нежелательных симптомов и лабораторных показателей.

Развивая это положение, мы предприняли повторные интрапор-тальные трансплантации культур ОКПЖ у 5 больных на высоте эффекта предыдущей трансплантации, осуществить которые позволил способ длительного сохранения интрапортального доступа с помощью подкожной имплантации трансумбиликального интрапортального катетера. Повторные интрапортальные трансплантации проводились через 4-6 недель после предыдущей. К этому времени потребность в экзогенном инсулине у реципиентов снизилась, в среднем, на 48,6% при СГ 8,8*0,8 ммоль/л. У 3 больных было проведено транспечёночное исследование концентрации гормонов и выявлена высокая Функциональная активность трансплантированных бета-клеток. Через I месяц после повторной интрапортальной трансплантации культур ОКПЖ на высоте эффекта предыдущей, потребность в экзо-

генном инсулине снизилась на 71,4% относительно исходной, а через 3 месяца достигла 81,7^ и составила, в среднем, У,1-1,3 ед/сут. Инсулинонезависимость достигнута не была, однако, такая возможность имеется, если предпринять повторные многократные интрапор-тальные трансплантации культур ОКПЖ.

При изучении характера иммунореактивности у реципиентов с помощью набора стандартных тестов до и в принятые сроки после трансплантации культур ОКПЖ уделялось особое внимание способу трансплантации. При изучении показателей клеточного звена иммунитета было установлено, что количество Т-ликгЬоцитов у реципиентов I группы на I сутки практически снизилось до показателей контрольной группы здоровых доноров крови (1227±260 в мкл), на 7-10 сутки происходила дальнейшая нормализация данного показателя и на 14-20 сутки количество Т-лимйоцитов вновь увеличивалось до исходного повышенного уровня (1668^294 в мкл), по сравнению, с данными контрольной группы. Количество полиаффинных Т-лимфоци-тов и "активных" Т-лимфоцитов практически не отличалось от исходного уровня, но было выше показателей контрольной группы на всех сроках наблюдения. Индекс активации (Та/Г) на протяжении всего срока наблюдения оставался увеличенным, соответствуя значениям исходного уровня. Исследование показателей клеточного звена иммунитета реципиентов 2 группы показало, что динамика изменений оказалась принципиально схожей с I группой. Однако, отмечалось несколько большее увеличение количества Т-лим{юцитов на 14-20 сутки после трансплантации (2П5±209 в мкл), но эта разница не достигла статистически-значимой величины.

При изучении показателей гуморального иммунитета выявлено, что количество В-лимфоцитов у реципиентов I группы было ниже показателей контрольной группы на всех сроках наблюдения, а у реципиентов 2 группы был отмечен рост количества В-лимфоцитов, уровень которых достиг через 14-20 суток после трансплантации 925±59 в мкл, что более чем в 2 раза превысило показатель контрольной группы (Р< 0,05) и более чем в 4 раза - дотранспланта-ционноё значение (Р< 0,05). Концентрация сывороточных иммуноглобулинов классов 3, М, А у реципиентов обеих групп на протяжении всего срока исследований не изменялась и оставалась на уровне показателей контрольной группы.

Наряду с оценкой иммуниго статуса реципиентов по унифицированным стандартным тестам, состояние иммунореактивности опре-

деляли также с использованием антигенспециФичнкх ¡/етсдов. •>' £0 реципиентов 2 группы изучена активность Т т-эФФекторов и уровень КФА до трансплантации культур СКПЖ новорождённых кроликов и после. Активность Тгз -эффекторов обратно пропорциональна ингибиции реакции торможения миграции лейкоцитов (РГМЛ) с тканевыми антигенами и выражается в виде индекса миграции лейкоцитов. При обследовании больных до трансплантации, у 36,4% показатели РТМЛ соответствовали нормальным значениям (индекс миграции 103-109%, норма - 100%), тогда как у 27,2% выявлена активация Тгзт-эФФекторов к антигенам ОКПЖ новорождённых кроликов (индекс миграции 58-78%). У 36,4% обследованных отмечалось снижение активности Тгзт-эфФекторов (индекс миграции 136-171%). Одновременно, у 55% больных выявлены КФА к суммарным антигенам ОКПЖ новорождённых кроликов, уровень которых колебался от 1,1 до 4,9 условных единиц. После трансплантации культур ОКПЖ уровень КФА в ранние сроки (7-14 дней) снижался, однако, к концу I месяца у ряда больных вновь нарастал. Также отмечалась нормализация или снижение активности Трзт-эфФекторов (индекс миграции, в среднем, составил 100-125%).

Результаты проведённых исследований не выявили выраженных изменений иммунного статуса реципиентов, что свидетельствует о удовлетворительной элиминации в процессе культивирования ОКПЖ новорождённых кроликов клеток носителей поверхностного антигена класса II, инициирующих отторжение. Тагам ня сбрпружено достоверных различий в клеточном звене иммунитет,, реципиентов при разных способах трансплантации. Активация Тгзт-эффекторов и высокие уровни КФА до трансплантации в результате сенсибилизации к антигенам ОКШ могут быть использованы для прогнозирования функционирования трансплантата.

Изучена клиническая безопасность длительной имплантации трансумбиликального интрапортального катетера и интрапортальной трансплантации культур ОКПЖ новорождённых кроликов. С целью длительного сохранения интрапортального доступа у больных ОД I типа, необходимого для повторных интрапортальных трансплантаций культур ОКШ и транспечёночных исследований концентрации гормонов, было выполнено 14 имплантаций трансумбиликального интрапортального катетера. Во всех случаях послеоперационные* раны после имплантации катетера и повторных использований интрапортального доступа заживали первичным натяжением, местных вое-

палительных явлений не отмечалось. При повторном использовании интрапортального доступа отмечался незначительный Фиброз подкожной жировой клетчатки в области нахождения коннектора катетера. Надёжная герметизация катетера с помощью завинчивающегося в коннекторе мавдрена и использование биосовместимого тромбо-резистентного материала позволило снизить риск возникновения осложнений со стороны внутрипортальной гемодинамики. С этой целью проводилось ультразвуковое измерение диаметра воротной вены, который, как признак состояния внутрипортального давления, практически не изменялся,и составил 14,9*2,3 мм до трансплантации и 14,8*3,1 мм через 2-4 недели после трансплантации культур ОКПЖ и имплантации трансумбиликального интрапортального катетера. Интрапортальная трансплантация малой по объёму и весу мелкодисперсной культуры ОКПЖ не влияет на внутрипортальное давление, так как она не в состоянии вызвать эмболии крупной вены (сегмента) внутрипечёночного отдела воротной вены, что было подтверждено при рснтгеноконтрастной портографии. Это исследование проводилось через II—15 дней после трансплантации во время транс- . печёночного исследования концентрации гормонов. Было отмечено отсутствие дефектов наполнения, просвет воротной вены нормальной величины, разветвление внутри печени равномерное, интенсивность контрастирования в паренхиматозной фазе равномерное.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что интрапортальная трансплантация культур ОКПЖ новоровдённых кроликов и подкожная имплантация трансумбиликального интрапортального катетера не оказывает отрицательного влияния на состояние внутрипортальной гемодинамики.

Изучение функционального состояния печени у реципиентов после интрапортальной трансплантации культур ОКПЖ новорождённых кроликов представляется важным и необходимым. В литературе, практически не встречается работ, посвящённых функциональному состоянию печени после интрапортальной ксенотрансплантации ОКПЖ. При оценке биохимических показателей крови отмечено, что уровень билирубина и общего белка практически не изменялся на протяжении всего срока наблюдения. Из этого следует, что две наиболее важные функции печени - обезвреживающая и синтетическая - не страдают после интрапортальной трансплантации культур ОКПЖ. Было отмечено некоторое возрастание активности трансаминаз на I неделе после трансплантации (АсАТ 0,54*0,02 мМ/л, АлАТ 0,61*0,04

мМ/л, против, 0,31±0,03 г.-М/л и 0,42-!:0,С6 г.-^М/л, соответственно, до трансплантации), но, в среднем, сна не превысила границ нории Только у 2 реципиентов активность трансаминаэ превысила уровень I мМ/л, но через 2 недели после трансплантации их активность нормализовалась. Через I неделю после трансплантации уровень активности щелочной ФосФатазы составил 174—12,1 ед, что было на верхней границе нормы, в дальнейшем активность щелочной ^осйатазы снизилась до 143-^5,9 ед. Из этого следует, что в раннем послеоперационном периоде у некоторых реципиентов отмечалось незначительное повреждение гепатоцитов. Однако, на основании полученных данных при проведении динамической радиоизотопной сцннтиграйии печени до и через 2-3 недели после трансплантации можно утверждать, что поглотительно-экскреторная способность гепатоцитов после интрапортальной трансплантации культур 0К1Ш практически не изменялась. В целом, можно утверждать, что функция печени не нарушалась под влиянием трансплантации ОКПЕ.

Таким образом, можно считать имплантацию интрапортального катетера и способ интрапортальной трансплантации культур ОКПЖ новорождённых кроликов клинически безопасными.

в и в о д и

1. Трансплантация культур ОКПЖ новорождённых кроликов оказывает благоприятное влияние на углеводный обмен, уменьшает потребность реципиентов в экзогенном инсулине, стабилизирует течение лабильных форм сахарного диабета I типа и замедляет прогрессирование вторичных осложнений. Эффект лечения выше при интрапортальном введении культур ОКПЖ.

2. функциональная активность интрамуск.улярно трансплантированных культур ОКПЖ новорождённых кроликов может быть оценена при исследовании концентрации С-пептида крови, а интрапортально трансплантированных - ещё путём выявления разницы концентрации инсулина и С-пептида между во'ротной и печёночной веной и регистрацией ответа на селективную стимуляцию глюкозой.

3. Повторные интрамускулярные трансплантации культур ОКПЖ новорождённых кроликов оказывают аналогичный эффект, а повторные интрапортальные трансплантации на высоте эффекта предыдущих приводят к усилению клинического эффекта и к дальнейшему снижению потребности реципиентов в экзогенном инсулине.

4. Трансплантация культур ОКПЖ новорождённых кроликов приводит к умеренной активации клеточного звена иммунитета в первые 20 дней, вне зависимости от способа трансплантации. После интра-портальной трансплантации увеличивается количество В-лимфоцитов. Выявление комплементфиксирующих антител и активации Тгзт-эффекто-ров к суммарному антигену ОКПЖ новорождённых кроликов может быть использовано для прогнозирования Функционирования трансплантата.

5. Способ длительного сохранения интрапортального доступа у больных сахарным диабетом I типа с помощью имплантации транс-умбиликального интрапортального катетера позволяет осуществлять повторные интрапортальные трансплантации культур ОКПЖ и проводить транспечёночные исследования концентрации гормонов.

6. Интрапортальная трансплантация культур ОКПЖ новорождённых кроликов и имплантация трансумбиликального интрапортального катетера не оказывает влияния на внутрипортальную гемодинамику и Функциональное состояние печени.

7. Интрамускулярная трансплантация культур ОКПЖ новорождён-

них кроликов показана больным с тяжёлой лабильной Формой сахарного диабита I типа, а интрапортальная трансплантация, обеспечивания более лучшую компенсацию .углеводного обмена и более выраженное снижение потребности в экзогенном инсулине - больным с быстро прогрессирующими вторичными осложнениями.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Трансплантация культур ОКПЖ новорождённых кроликов может быть рекомендована в качестве дополнительного эффективного метода лечения сахарного диабета I типа.

2. Метод показан больным с тяжёлой формой сахарного диабета I типа, его лабильным течением, наличием вторичных осложнений.

3. Интрапортальное введение культур ОКПЖ новорождённых кроликов является более эффективным.

4. Больным с быстро прогрессирующими вторичными осложнениями рекомендуются повторные интрапортальные трансплантации культур ОКПЖ на высоте эффекта предыдущих.

5. Способ длительного сохранения интрапортального доступа с помощью имплантации трансумбиликального интрапортального катетера позволяет повысить эффективность лечения больных сахарным диабетом I типа, а также может быть полезен в других областях практической медицины.

6. Выявление комплементфиксирующих антител и активации Тгдт,-эФФекторов к суммарному антигену ОКПЖ новорождённых кроликов может быть использовано для прогнозирования функционирования трансплантата.

Список научных работ по теме диссертации

1. Интрапортальная ксенотрансплантация культур островк~вь.\ клеток поджелудочной железы больным сахарным диабетом / В.И.Шумаков, Н.Н.Скалецкий, Ю.Н.Евсеев, А.В.Подшивалин, Е.А.Немец, Г.В.Гайдамакина // Биосовместимость.- 1993,-т.1.- №4.- С. I9I-I96.

2. Влияние интрапортальной трансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы новорождённых кроликов на углеводный обмен реципиентов с сахарным диабетом I типа / В.И.Шумаков, Ю.Н.Евсеев, А.В.Подшивалин, Н.Н.Скалецкий // Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы

в лечении инсулинзависимого сахарного диабета. Материалы симпозиума. г.Ташкент, 1993.

3. Результаты длительной имплантации трансумбиликального интрапортального катетера / Ю.Н.Евсеев // Международная конференция "Раны и раневая инфекция". Тезисы докладов. г.Москва, 1993, С. 343-345.

4. Оценка эффективности трансплантации культур островковых клеток поджелудочной железы у больных сахарным диабетом методами радиоиццикации / А.В.Подшивалин, Ю.Н.Евсеев, А.Е.Ермоленко, В.В.Ильницкий // 201 заседание общества трансплантологов г.Москвы и Московской области. г.Москва, октябрь 1993.

5. Inhibition of insulin release by distantly acting products of blood mononuclear cells in vitro. / V.Ablamunita, Yu.N.Yeveeyev // First International Congr Cell Transpl Soc. Abstracts, 1992.

6. Intraportal xenotransplantation of islet cell cultures in diabetic patients / V.I.Shumakov, N.N.Skaletsky, Yu.N.Yeveeyev, A.V.Podshyvalin, E.A.Nemets, G.V.Gaydamakina // Biomaterial Living System Interactions. 1995. Vol 1, N 4, P. 179-184.

По материалам диссертации признано рационализаторским предложение:

I. Способ длительного сохранения интрапортального доступа у больных сахарным диабетом. Соавторы В.И.Шумаков, В.И.Севастьянов Ё.А.Немец, Г.В.Гайдамакина (удостоверение № 1/93 от 27.05.93).

Подана заявка и получена приоритетная справка № 9302П70 от 22.04.93 г. на предполагаемое изобретение "Трансумбиликальный интрапортальный катетер длительного применения". Соавторы В.И.Шумаков, В.И.Севастьянов, Е.А.Немец, Г.В.Гайдамакина.

УКАЗАТЕЛЬ ИСПШЬЗУгШХ СОКРй^-ЯИ."

ИМ Тц - интрамускулярная трансплантация

ИП Тц - интрапортальная трансплантация

К5А - комплементФиксирующие антитела

НвА^- - гликозилированный гемоглобин

ОКПЖ - островковые клетки поджелудочной железы

РТМЛ - реакция торможения миграции лейкоцитов

СГ - среднесуточная гликемия

СД - сахарный диабет