Сравнительная оценка индукции апоптоза производными платины in vitro

Огородникова, Мария Владимировна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Сравнительная оценка индукции апоптоза производными платины in vitro

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Огородникова, Мария Владимировна Москва 2009 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.14

Автореферат диссертации по медицине на тему Сравнительная оценка индукции апоптоза производными платины in vitro

Огородникова Мария Владимировна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА ПРОИЗВОДНЫМИ ПЛАТИНЫ IN VITRO

14.00.14 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003472692

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН, профессор М.И. Давыдов).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор АЛО. Барышников доктор медицинских наук, профессор Ю.В. Шишкин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, чл. - корр. РАМН, профессор A.B. Караулов доктор биологических наук, профессор O.A. Бочарова

Ведущая организация:

ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росмедтехнологий

Защита состоится « 2009 г. в /^часов на заседании

диссертационного совета Д.001.017.01 Учреждения Российской академии медицинских наук Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан «с£Оу> г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор / Ю.В. Шишкин

Введение

Актуальность проблемы. Установлено, что результатом действия большинства химиотерапевтических препаратов является индукция последовательных необратимых событий, приводящих опухолевую клетку к гибели путем апоптоза. Особое место в этом аспекте занимают препараты, относящиеся к группе комплексных соединений платины.

С момента открытия цисплатина Б. Розенбергом в I960 году как соединения, обладающего противоопухолевой активностью, прошло около 45 лет, за это время интерес к поиску новых комплексных соединений платины возрос. В настоящее время, помимо цисплатина, широко используются такие препараты как карбоплатин, оксалиплатин, а также проходит испытания ряд новых комплексных соединений платины третьего поколения таких как сатраплатин, недаплатин, ZD0473 (JM 473), BBR3464.

Молекулярные механизмы действия циклоплатама мало изучены. Как и у других препаратов комплексных соединений платины, мишенью цитотоксического действия циклоплатама является суперспиральная ДНК. При сравнительном изучении в опытах in vitro циклоплатам в терапевтической концентрации оказался более эффективным при действии на ДНК, чем цисплатин. При этом воздействие циклоплатама на ДНК клеток лейкоза in vivo может быть обнаружено уже через 24 часа. В механизмах действия циклоплатама показано, что он модулирует p-адренорецепторную активность плазматической мембраны. Имеются данные об ингибирующем влиянии циклоплатама на протеинкиназу С.

Несмотря на такой большой интерес к препарату в клинике, in vitro циклоплатам изучен мало. Поэтому целью настоящего исследования является изучение действия

циклоплатама на индукцию апоптоза опухолевых клеток различного морфологического происхождения.

Цель работы - изучить индукцию апоптоза отечественным противоопухолевым препаратом циклоплатамом в сравнении с цисплатином, оксалиплатином, карбоплатаном.

Задачи исследования. Оценить цитотоксическую активность противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина и карбоплатина на клеточные линии с применением МТТ - теста.

1. Сравнить цитотоксическую активность циклоплатама с цисплатином, оксалиплатином и карбоплатаном.

2. Оптимизировать условия индукции и регистрации апоптоза, вызванного противоопухолевыми препаратами in vitro.

3. Оценить лекарственно-индуцированный апоптоз на клеточных линиях с применением современных методов регистрации апоптоза.

4. Изучить влияние на апоптоз циклоплатама в сравнении с цисплатином, оксалиплатином и карбоплатаном.

Научная новизна исследования. Показана цитотоксическая активность циклоплатама в сравнении с цисплатином, карбоплатаном, оксалиплатином на клеточных линиях лимфобластного, моноцитарного, меланоцитарного и эпидермального происхождения. Впервые показана способность отечественного противоопухолевого препарата платины второго поколения - циклоплатама - индуцировать апоптоз клеток линий Raji, U937, MelP, MCF-7, T47D, SKOV-3. Проведена оценка действия циклоплатама на апоптоз в сравнении с цисплатином, оксалиплатином, карбоплатаном. Применено три принципиально различных методических приема для определения популяционного анализа лекарственно-индуцированного апоптоза с использованием проточной цитофлуориметрии.

Практическая значимость исследования. Сочетание методов определения лекарственно - индуцированного апоптоза in vitro может найти применение для скрининга новых соединений и веществ с потенциальной противоопухолевой активностью и изучения их механизмов действия.

Апробация работы. Апробация диссертационной работы прошла 25 сентября 2008 г. на совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории разработки лекарственных форм, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории фармакоцитокинетики, отдела экспериментальной химиотерапии, лаборатории фармакологии и токсикологии, лаборатории трансгенных препаратов, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории

синтетических противоопухолевых веществ НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Материалы работы были представлены на III съезде онкологов и радиологов СНГ (Минск, Белоруссия, 2004 г.), на 29-м ESMO конгрессе «Annals of Oncology» (Вена, Австрия, 2004 г.), на Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологической практике» (Барнаул, 2005 г.), на IV Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2005 г.), на V симпозиуме «Биологические основы терапии онкологических заболеваний» (Москва, 2006 г.), на V съезде онкологов и радиологов СНГ (Ташкент, Узбекистан, 2008 г.), на 20-м Международном противораковом конгрессе ICACT (Париж, Франция, 2009 г.). По теме диссертации опубликованы 11 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 145 источника. Материалы диссертации изложены на 140 страницах машинописного текста и включают 25 рисунков и 23 таблицы.

Материалы и методы исследования.

Препараты, используемые для индукции апоптоза. Для исследования использовали химиотерапевтические препараты: циклоплатам (лаборатория разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва), цисплатин (TEVA Ltd., Израиль), оксалиплатин (элоксатин, Sanofi Winthrop Industrie, Франция), карбоплапш (параплатин, Bristol-Myers Squibb, Италия).

Клеточные линии. В работе использовали клеточные линии: Jurkat (Т-клеточный лимфобластоидный лейкоз человека), Raji (B-клеточный лимфобластоидный лейкоз человека), U937 (моноцитарная лимфома человека), MelP (меланома человека), SKOV-3 (рак яичников), MCF-7 (рак молочной железы), T47-D (рак молочной железы), РС-3 (рак предстательной железы). Клеточные линии получены из банка клеточных культур РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Клеточные линии выращивали в полной питательной среде при 37°С в атмосфере 5% СОг. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста.

Оиенка иитотоксического действия химиопрепаратов МТТ - тестом. МТТ - тест,

предложенный Т. Мосманном, основан на способности дегидрогеназ живых клеток

превращать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазолин-2)-2,5-

дифенилтетразолий бромид (МТТ) в голубые кристаллы формазана, не растворимые в

воде. Количество образовавшегося формазана (определяемое колориметрическим

методом после его растворения в органических растворителях) характеризует

интенсивность окислительно-восстановительных процессов в опухолевых клетках и может являться критерием степени их чувствительности к противоопухолевому воздействию химиопрепаратов. К суспензии клеток (5x104 клеток/180 мкл среды) добавляли 20 мкл химиопрепарата в концентрациях lxlO^M, 0,5х10"5М, 1хЮ'5М, О.бхЮ^М, 1x1 О^М и инкубировали в 96 луночных плоскодонных планшетах 24, 48, 72 часа при 37°С в атмосфере 5% СОг. Контролем служили интактные клетки, которые инкубировали в тех же условиях. Через 96 часов в планшет с клетками добавляли по 20 мкл МТТ в каждую лунку и инкубировали 5-6 часов при 37°С в атмосфере 5% СО2. После образования формазана планшеты центрифугировали при 2000 оборотах/минуту 710 минут, надосадочную жидкость удаляли. Осадок растворяли, добавляя в лунки по 150-200 мкл диметисульфоксида (DMSO). Планшеты помещали на 5-7 минут в термостат при температуре 37°С. Затем планшеты встряхивали на шейкере, после этого интенсивность окрашивания среды измеряли на спектрофотометре "Multiscan" при Х=540-690nm, за blank принимали лунки, содержащие среду без клеток и препаратов. Величина поглощения прямо пропорциональна числу живых клеток. Процент живых клеток вычисляли по формуле:

N1 х 100%

N0= -•

где No - процент живых клеток; N1 - средняя оптическая плотность лунок, содержащих клетки и препарат; N2 - средняя оптическая плотность контрольных лунок, содержащих только клетки. Для каждого препарата строили график зависимости «доза-эффект» и определяли ИК50 (ингибирующая концентрация - концентрация препарата, при которой гибнет 50% опухолевых клеток).

Пуоточно-иитогЬлуориметрический анализ. Проточно-цитофлуориметрический анализ проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), укомплектованном аргоновым лазером (длина волны 488 нм), с использованием программного обеспечения CELLQuest. В каждой пробе анализировалось от 2000 до 5000 событий.

Определение апоптоза методом двойного окрашивания. К суспензии клеток (5хЮ4 клеток/180 мкл среды) добавляли 20 мкл химиопрепарата в концентрациях 0,5х10"5М, 1*10"5М, lxlO^M, и инкубировали в 96 луночных плоскодонных планшетах 24, 48 и 72 часа при 37°С в атмосфере 5% СОг. Контролем служили интактные клетки, которые инкубировали в тех же условиях. После окончания инкубации клетки собирали в пробирки, осаждали на центрифуге при 1000 оборотах/минуту в течение 10 минут.

Клетки дважды отмывали в солевом фосфатном буфере (PBS) без азида, добавляли 100 мкл связывающего буфера, 5 мкл Аннексина V/FITC, 10 мкл пропидиум йодида (PI) (5 мкг/мл). Образцы встряхивали на вортексе и инкубировали в темноте 15 минут при комнатной температуре. Затем к пробам добавляли 400 мкл связывающего буфера и производили анализ на цитофлуориметре с возбуждением флуоресценции аргоновым лазером (488 нм) и регистрацией эмиссии зеленого диапазона по каналу FL1 (525 нм), а красного диапазона - по каналу FL2 (585 нм). Прямое и боковое светорассеивание регистрировали по каналам FSC и SSC.

Оценку результатов проводили по следующим параметрам: интактные (живые) клетки не связывают ни Аннексии V/FITC, ни PI (AnV" РГ), ранние апоптотические клетки окрашиваются только Аннексином V/FITC (AnV* PI"), а поздние апоптотические или некротические клетки - и Аннексином V/FITC, и PI (AnV+Pf) (рисунок 1).

Рисунок 1. Распределение опухолевых клеток, окрашенных Аннексином V/FITC/PI по флуоресценции после инкубации без химиопрепарата (а) и с препаратом (б).

Определение активной каспазы-3. К суспензии клеток (5 х 104 клеток в 180 мкл среды) добавляли 20 мкл цитостатика в концентрациях 0,5х10"5М, 1*10'5М и lxlO^M и инкубировали в 96 луночных плоскодонных планшетах 24 часа при 37°С в атмосфере 5% СОг. Контролем служили интактные клетки, которые инкубировали в тех же условиях. Клетки собирали в пробирки для подсчета клеток на проточном цитофлуориметре, осаждали при 1000 оборотах/минуту в течение 10 минут, затем дважды отмывали в холодном PBS. К пробам добавляли раствор Cytofix/Cytoperm из расчета 0,5 мл раствора на 1*Ю6 клеток и инкубировали 20 минут при +4°С. Пробы осаждали 7 минут при 1200 оборотах/минуту, дважды отмывали Perm/Wash буфером (0,5 мл на 1 пробу). К каждой пробе добавляли по 100 мкл раствора, содержащего 20 мкл антител к каспазе-3/FITC (BD) и 80 мкл Perm/Wash буфера, инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Затем

пробы промывали Perm/Wash буфером (мл на 1 пробу), ресуспендировали в 0,5 мл Perm/Wash буфера и анализировали на проточном цитофлуориметре (рисунок 2).

Рисунок 2. Гистограмма распределения клеток Jurkat по флуоресценции после окрашивания моноклональными антителами к активной каспазе-3/FITC, после 72 - часовой инкубации клеток с циклоплатамом.

Исследование апоптоза методом TUNEL с использованием набора APO-DIRECTKit (BP) К суспензии клеток (5 х 104 клеток в 180 мкл среды) добавляли 20 мкл цитостатика в концентрациях 0,5х10"5М, 1*10"5М и 1 *10^М и инкубировали в 96 луночных плоскодонных планшетах 72 часа при 37°С в атмосфере 5% С02. Контролем служили интактные клетки. После окончания инкубации клетки собирали в пробирки, осаждали на центрифуге при 1000 оборотах/минуту в течение 10 минут и дважды отмывали в холодном PBS. Этот метод включает в себя две стадии: первая - фиксация исследуемого образца, вторая - окрашивание и анализ образца на проточном цитофлуориметре. Фиксация образца. К пробе добавляли раствор 1%-го парафармальдегида в PBS (рН-7,4) из расчета 1-2><106 клеток на 1 мл. Пробы помещали на лед и инкубировали 30-60 минут. Затем образцы центрифугировали 5 минут 1200 оборотах/минуту, удаляли из каждой пробы супернатант. К осадку добавляли 5 мл PBS, ресуспендировали и центрифугировали 5 минут 1200 оборотах/минуту. Повторяли процедуру еще раз. Клеточный осадок ресуспендировали в остаточном PBS, добавляли 70%-ный ледяной этанол в концентрации 1-2x106 клеток/мл. Затем пробы помещали на лед и инкубировали в течение 30 минут при -20°С. Окрашивание образцов. В набор входят так же позитивные и негативные контрольные образцы, которые хранятся при -20°С в 70%-ном этаноле. Контрольные образцы в количестве 1мл помещали в пробирки для проточного цитофлуориметра. Контрольные и опытные образцы центрифугировали 5 минут 1200 оборотах/минуту, затем удаляли надосадок. К образцам добавляли 1 мл Wash Buffer и встряхивали пробирки на

вортексе, затем центрифугировали 5 минут 1200 оборотах/минуту и удаляли надосадок.. Повторяли процедуру еще раз. К пробам добавляли 50 мкл Staining Solution, ресуспендировали осадок и инкубировали 60 минут при 37°С. После окончания инкубации к пробам добавляли 1 мл Rinse Buffer, центрифугировали 5 минут 1200 оборотах/минуту и удаляли надосадок. Повторяли процедуру еще раз. К образцам добавляли 0,5 мл PI/RNase Staining Buffer и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Анализировали образцы на проточном цитофлуориметре.

Статистическая обработка результатов Статистический анализ проводили с использованием программ «BIOSTAT» (Version 3.2), Microsoft Excel, Statistica v.5.0. Различия считали статистически достоверными при р<0,05, использовали t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна - Уитни.

Результаты исследования

Оценка цитотоксической активности препаратов группы платина с использованием МТТ — теста.

С применением МТТ - теста проведено исследование цитотоксичности противоопухолевых препаратов, относящихся к комплексным соединениям платины. В исследовании были использованы опухолевые клеточные линии из коллекции банка клеточных культур РОНЦ.

По кривым «доза - эффект», полученным после инкубации клеток с химиопрепаратами, определены значения ИК50, т.е. дозы препаратов, при которых, по данным МТТ - теста, погибало 50% опухолевых клеток.

Установлено, что циклоплатам обладает цитотоксической активностью в отношении всех клеточных линий. При увеличении концентрации циклоплатама уменьшается количество выживших клеток. В отношении клеточных линий лимфобластного происхождения: Jurkat, Raji, U937 значения ИК50 были меньше либо равны теоретической терапевтической концентрации циклоплатама (1х10"5М). При сравнении циклоплатама с оксалиплатином в концентрации IxlO^M на клеточной линии Jurkat достоверных различий между действием этих препаратов на выживаемость клеток не выявлено (р>0,05). Выживаемость клеток под действием циклоплатама, в сравнении с цисплатином и карбоплатином, оказалась ниже; так, при использовании концентрации 0,5х10"5М процент живых клеток для циклоплатама был равен 46%, тогда как для цисплатина и карбоплатина 38% и 100% соответственно. Циклоплатам обладает большей цитотоксической активностью по сравнению с цисплатином и карбоплатином. Циклоплатам имеет схожий эффект с оксалиплатином, о чем свидетельствуют значения

ИК50 (0,4x10"5М И 0,бх10"5М соответственно).

На клеточной линии Raji статистически достоверных различий при сравнении циклоплатама с цисплатином в концентрациях 0,5х10"5М, lxlO^M, а также циклоплатама с оксалиплатином в концентрации 1х10"5М не выявлено. При сравнении циклоплатама с оксалиплатином обнаружилось, что последний обладает большей цитотоксической активностью в концентрациях lxlO^M и 0,5х10"5М. Так, при использовании концентрации lxlO^M процент выживших клеток для циклоплатама составил 61%, а для оксалиплатина - 53%, при концентрации 0,5х10"5М - 55% и 36% соответственно. Циклоплатам обладает большей цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток линии Raji в сравнении с цисплатином и карбоплатином. На основании полученных данных были определены значения ИК5о для циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина: 0,55х10'5М, 0,73х10"5М, 0,15хЮ"5М соответственно.

При действии циклоплатама, цисплатина и оксалиплатина в концентрациях О.бхЮ^М, 1Х10^М на клетки линии U937 достоверных различий выявлено не было. При изучении действия циклоплатама в дозе, близкой к терапевтической in vivo - 1*10"5М, процент выживших клеток составил всего 9%. Для цисплатина, оксалиплатина и карбоплатина были построены кривые «доза-эффект» и определены значения ИК50, которые составили соответственно 0,ЗЗхЮ"5М, 0,44х10"5М и 6,6Х10"5М.

Таким образом, нами показано, что циклоплатам обладает цитотоксической активностью в отношении клеточных линий лимфобластоидного (Jurkat, Raji) и моноцитарного (U937) происхождения. При увеличении концентрации циклоплатама уменьшается количество выживших клеток. Для клеточных линий Raji и U937 значение ИК50 цисплатина меньше либо равно теоретической терапевтической концентрации, тогда как для Jurkat значение ИК50 превышает теоретическую терапевтическую концентрацию в 3,7 раза. Значение ИК50 карбоплатина для клеточной линии U937 превышает теоретическую терапевтическую концентрацию в три раза.

Также исследована цитотоксическая активность препаратов в отношении клеточных линий эпидермального (T47D, РС-3, MCF-7) и меланоцитарного (MelP) происхождения. С увеличением концентрации циклоплатама и цисплатина уменьшается процент выживших клеток. В отношении оксалиплатина и карбоплатина такой тенденции не наблюдается. Были определены значения ИК50, которые составили для циклоплатама 0,46x10"5М, для цисплатина 0,9хЮ"5М. Эффективными препаратами в отношении клеточной линии T47D рака молочной железы являются циклоплатам и цисплатин.

При сравнении циклоплатама с цисплатином на клеточной линии MelP достоверных различий в диапазоне выбранных концентраций не выявлено. Определены значения ИК50

для циклоплатама, цисплатина и карбоплатина, которые составляют 2,68х10"5М и 6,2х10'5М соответственно. Эффективным препаратом в отношении клеточной линии меланомы человека является циклоплатам, так как только его значение меньше теоретической терапевтической концентрации.

При действии препаратов на клетки линии РС-3 самый низкий процент выживших клеток (33%) получен после действия циклоплатама в дозе 1х10"*М. Значение ИК50 для циклоплатама составляет 4,47хЮ"5М.

При действии препаратов на клетки линии МСР-7 значения ИК50 для циклоплатама, цисплатина и карбоплатина составляют 5,1 хЮ"5М, 4,5х10"5М и 8,1х10'5М соответственно.

Исследование лекарственно-индуцированного апоптоза методами проточной цитофлуориметрии.

В настоящей работе было применено три принципиально различных методических приема для определения популяционного анализа лекарственно-индуцированного апоптоза с использованием проточной цитофлуориметрии.

Метод двойного прижизненного окрашивания с использованием Аннексина \7FITC в комбинации с Р1, основанный на способности Аннексина V, меченного РГГС, связываться с фосфатидилсерином, позволяет зафиксировать апоптотические клетки. В связи с тем, что транслокация фосфатидилсерина происходит и в некротических клетках Аннексии V используют в сочетании с витальным красителем Р1. Апоптотические клетки начинают взаимодействовать с Аннексином V после того, как произошла конденсация хроматина, но до утраты плазматической и ядерной мембранами, которые ограничивают проникновение Р1. В результате живые клетки не связывают ни Аннексии V, ни Р1. Апоптотические клетки с неповрежденной мембраной окрашиваются только Аннексином V, а поздние апоптотические или некротические клетки - и Аннексином V, и Р1.

Так под действием циклоплатама на клетки линии Литка! в течение 72 часов при использовании терапевтической концентрации 1хЮ'5М, число ранних апоптотических клеток (АпУ^ТГ) для циклоплатама составило 62%, для цисплатина 29% для оксалиплатина 25% и для карбоплатина 14%.

Таким образом, циклоплатам индуцирует апоптоз лучше, чем все остальные препараты. Это касается и применения максимальной дозы 1x1 О^М (рисунок 3).

К 0,5^10-5 ЫО-5 1х10-4

концентрация препарата, М

| | интаютые (живые) клетки не связали ни Аннексии V, ни Р1 (АпУ Р1") ЩЛЩ ранние апоптотические клетки окрашиваются только Аннексином У(АпУ+ РГ) | | поздние апоптотические или некротические клетки - и Аннексином V, и Р1 (АпУРГ)

Рисунок 3. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии ./игка/ после 72-часовой инкубации с химиопрепаратами, п=5 (*р>0,05, в остальных случаях р<0,05 в сравнении с интактным контролем, "р>0,05, в остальных случаяхр< 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии 1игка1 с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином в течение 72 часов (рисунок 4). После инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,5*10"5 количество апоптотаческих клеток для циклоплатама составило 76%, для цисплатина 45,8%, для оксалиплагина и карбоплатина получены недостоверные данные относительно интакпгого контроля, которые составили 8,2 и 9,1% соответственно. С увеличением концентрации химиопрепаратов популяция клеток положительных по каспазе-3 увеличивается и составляет для циклоплатама 83,2%, для цисплатина 58,9%, для оксалиплатина 28%, для карбоплатина 23,7%. При использовании максимальной дозы препаратов количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 90,1%, для цисплатина 71,4%, для оксалиплатина и карбоплатина 36 и 55,5% соответственно. Таким образом, наиболее эффективными препаратами, вызывающими высокую экспрессию активной каспазы-3 при

цисплатин

К 0,5x10-5 1x10-5 1x10-4

карбоплатин

0,5x10-5 1x10-5 1x10-«

использовании терапевтической дозы in vitro, являются циклоплатам и цисплатин (рисунок 4).

Рисунок 4. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии ЗигксА с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином в течение 72 часов, п=3 (*р > 0,05 в сравнении с интактным контролем).

Также в нашем исследовании использован метод лекарственно-индуцированного апоптоза, основанный на определении фрагментированной ДНК в популяции опухолевых клеток линии 1игка1 после действия циклоплатама, оксалиплатина, цисплатина, карб: эплатина. Исследованные препараты индуцировали фрагментацию ДНК в процессе апоптоза клеток 1игка1 через 72 часа инкубации (рисунок 5). При действии циклоплатама в концентрации 0,5х10"5М количество апоптотических клеток составило 51,8%, для цисплатина 13,9%, для оксалиплатина 0,6% (*р > 0,05), для карбоплатина

Рисунок 5. Индукция внутринитевых разрывов ДНК клеток линии ЗигксЛ после инкубации с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином в течение 72 часов, п=4 (*р > 0,05 в сравнении с интактным контролем, "р > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

При увеличении концентрации препаратов до 1х10"5М количество апоптотических клеток для циклоплатама увеличилось и составило 83,5%, для цисплатина 74,7%, для оксалиплатина-16%, для карбоплатина-10,1%; при использовании максимальной дозы препаратов 1x1 О^М количество апоптотических клеток значительно увеличилось и составило для циклоплатама 96,1%, для цисплатина-96% (°р > 0,05), для оксалиплатина 70,8%, для карбошгатина-41,2%. Таким образом, циклоплатам в сравнении с осалиплатином и карбоплатином эффективнее индуцирует гибель клеток линии .^ка! по типу апоптоза.

При исследовании лекарственно-индуцированного апоптоза на клеточной линии Ка^ (инкубация 72 часа) под действием циклоплатама в концентрации 1хЮ"5М количество клеток в раннем апоптозе (АпУ*" РГ) составило 4,7% (*р>0,05), для цисплатина 19,0%, для оксалиплатина-13,9%, для карбоплатина-13,7% (рисунок 6). Популяция клеток, положительных по АлУ4" и РГ1", для циклоплатама составила 65,1%, для цисплатина-25,6%, для оксалиплатина - 45,7, для карбоплатина - 5,9% (*р>0,05).

К 0,5хЮ-5 ЫО-5 1Х10-" К 0,5x10-5 1*10'5 1*104

концентрация препарата, М | | интактные (живые) клетки не связали ни Аннексии V, ни Р1 (АпУ Р1') ид ранние апоптотические клетки окрашиваются только Аннексином У(АпУ+ РГ) I | поздние апоптотические или некротические клетки - и Аннексином V, и Р1 (АпУ+Р1+) Рисунок 6. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии после 72-часовой

инкубации с химиопрепаратами, п=3 (*р > 0,05, в остальных случаях р < 0,05 в сравнении с интактным контролем, "р > 0,05, в остальных случаяхр < 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии Raji с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином в течение 72 часов (рисунок 7). Количество апоптотических клеток после инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,5хЮ"5М для циклоплатама составило 32%, для цисплатина 20,5%, для оксалиплатина-34,5% и карбоплатина-10,2%. Статистически достоверной разницы между действием циклоплатама и оксалиплатина при данной концентрации не получено. С увеличением концентрации химиопрепаратов до 1хЮ"5М популяция клеток положительных по каспазе-3 увеличивается и составляет для циклоплатама 65%, для цисплатина 39%, для оксалиплатина-50,1%, для карбоплатина-16%. При использовании максимальной дозы препаратов количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 79%, для цисплатина 68,3%, для оксалиплатина и карбоплатина-70,1 % и 23,2% соответственно. Таким образом, препаратами, вызывающими высокую экспрессию активной каспазы-3 при использовании теоретической терапевтической дозы 1хЮ"5М, являются циклоплатам, оксалиплатин.

100

£ 80 к ё 60 5

§40

О О

5 20 с;

* о

1 1 1

0,5x105 1x10-5 1x10-'

концентрация препарата, М

\Рр>\ циклоплатам Мцисплагин ГШ11 оксалиплатин I | карбоплатин

Рисунок 7. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии Ка/1 с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином в течение 12 часов, п=5 (*р > 0,05 в сравнении с интактным

контролем, "р > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

Определение внутринитевых разрывов ДНК в клетках линии Яа^ проводили после инкубации с циклоплатамом, оксалиплатином через 72 часа (рисунок 8). Количество апоптотических клеток после инкубации с циклоплатамом в концентрации 0,5х10"5М составило 74%, с цисплатином 31,5%, с оксалиплатином-7,2%, с карбоплатином - 5,1%. При увеличении концентрации препаратов до 1хЮ"5М процент апоптотических клеток увеличился и составил для циклоплатама 90,2%, для цисплатина 68,8%, для оксалиплатина-7,7%, для карбоплатина-9%. При использовании максимальной дозы

препаратов 1x1 О^М доля клеток в состоянии специфического апоптоза увеличилась и составила для циклоплатама 96,3%, для цисплатина 84,2%, для оксалиплатина-53,0%, для карбоплатина-16,3%.

Рисунок 8. Индукция внутринитевых разрывов ДНК клеток линии Кар после инкубации с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином в течение 72 часов, п=5 (*р > 0,05 в сравнении с интактным контролем, "р > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

Изучение действия циклоплатама на индукцию апоптоза клеток линии ДОЗ 7 проводили в сравнении с оксалиплатином. При определении апоптотических клеток методом двойного окрашивания (инкубации 72 часа) количество ранних апоптотических клеток при использовании концентрации 0,5Х10"5М для циклоплатама составило 60%, для оксалиплатина-17%. При использовании дозы 1х10"5М количество поздних апоптотических или некротических клеток для циклоплатама и оксалиплатина уменьшилось и составило 24% и 7% соответственно. При увеличении дозы (1x10 М) популяция клеток, положительных по АпУ+ и отрицательных по Р1 увеличилась как для циклоплатама, так и для оксалиплатина и составила 77% и 39% соответственно. Количество клеток, положительных по АпУ1" и РГ1", наоборот, уменьшилось и составило для циклоплатама 15%, для оксалиплатина 14%.

Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии ДО37 с циклоплатамом, оксалиплатином в течение 72 часов (рисунок 9). После инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,5х10"5 количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 84,5%, для оксалиплатина 24,5%. С увеличением концентрации химиопрепаратов популяция клеток положительных по каспазе-3 увеличилась и составила для циклоплатама 90,5%, для оксалиплатина 50,1%. При использовании максимальной

дозы препаратов количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 99,5%, для оксалиплатина 65%.

Рисунок 9. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии 1)937 с циклоплатамом, оксалиплатином, в течение 72 часов, п—3 (*р > 0,05 в сравнении с интактным контролем, "р > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

Определение внутринитевых разрывов ДНК в клетках линии 11937 проводили после инкубации с циклоплатамом, оксалиплатином через 72 часа (рисунок 10). При концентрации 0,5x10"5 М количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 27,4%, для оксалиплатина 1,9% (*р > 0,05). При увеличении концентрации препаратов до 1хЮ"5М количество апоптотических клеток увеличилось и составило для циклоплатама 48,3%, для оксалиплатина 31%, при использовании максимальной дозы препаратов 1хЮ^М для циклоплатама количество положительных клеток по маркеру составило 86,4%, для оксалиплатина 56,8%.

циклоплатамом, оксалиплатином в течение 72 часов, п=3 (*р > 0,05 в сравнении с интактным контролем, "р > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

Определение апоптоза методом двойного окрашивания проводили после инкубации клеток линии Ме1Р с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином в течение 72 часов (рисунок 11). При концентрации 1x10 М общее количество клеток, положительных по Ал^РГ и АпУ+РГ, для циклоплатама составило 53,8%, для цисплатина 44,4%, для оксалиплатина 11,2 %, что меньше на 42,6% в сравнении с циклоплатамом. Популяция клеток, положительных по каспазе-3, составила для циклоплатама 65%, для цисплатина 29,3%, для оксалиплатина 32,6%. Таким образом, циклоплатам оказывает большей эффект на опухолевые клетки меланомы кожи Ме1Р, чем оксалиплатин и цисплатин.

К 0,5х105 1x10-5 1x10«

концентрация препарата, М | | интактные (живые) клетки не связали ни Аннексии V, ни Р1 (АпУ Р1") ЩИ) ранние апоптотические клетки окрашиваются только Аннексином УСАпУ^РГ) I I поздние апоптотические или некротические клетки - и Аннексином V, и Р1 (АпУ^ РГ)

Рисунок 11. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии Ме1Р после 72-часовой инкубации с химиопрепаратами, п=4 (*р > 0,05, в остальных случаях р < 0,05 в сравнении с интактным контролем, "р > 0,05, в остальных случаях р < 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии Ме1Р с

циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, в течение 72 часов (рисунок 12). После

инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,5x10"5 количество апоптотических клеток для

циклоплатама составило 49%, для цисплатина 24,1%, для оксалиплатина 23,5%. С

увеличением концентрации химиопрепаратов популяция клеток, положительных по каспазе-3, увеличилась и составила для циклоплатама 65%, для цисплатина 29,3%, для оксалиплатина-32,6%. Статистически достоверной разницы между действием цисплатина и оксалиплатина не получено. При использовании максимальной дозы препаратов количество апоптотаческих клеток для циклоплатама составило 77,6%, для цисплатина 33%, для оксалиплатина-50,8%.

Рисунок 12. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии Ме1Р с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, в течение 72 часов, п=3 (*р > 0,05 в сравнении с интактным контролем, "р > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

Циклоплатам оказывает больший эффект на опухолевые клетки линии рака яичников ЭКОУ-З, чем цисплатин и оксалиплатин (рисунок 13). Так, при 72 - часовой инкубации количество ранних и поздних апоптотических клеток после действия циклоплатама (1х10"5М) составило 34,2%, для цисплатина 18,1%, для оксалиплатина 18,7%. При увеличении концентрации до 1 * 1 О^М количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 66,4%, для цисплатина 32%, для оксалиплатина 9,1%.

Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии 8КОУ-3 с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином в течение 72 часов (рисунок 14). После инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,5х10"5М количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 35,4%, для цисплатина 16,1%, для оксалиплатина-17,8%. С увеличением концентрации химиопрепаратов популяция клеток, положительных по каспазе-3, в отношении циклоплатама увеличилась и составила 53,3%, для цисплатина и оксалиплатина - незначительно увеличилась и составила 21% и 26,5% соответственно. С увеличением дозы препаратов количество апоптотических клеток увеличилось и составило для циклоплатама 80%, для цисплатина 55%, для оксалиплатина- 35,4%.

цисллс11ин_

0,5*10"5 1*105 1X10"

концентрация препарата, М | | интактные (живые) клетки не связали ни Аннексии V, ни Р1 (АпУ Р1") Г"Д ранние апоптотические клетки окрашиваются только Аннексином У(АпУ РГ) I | поздние апоптотические или некротические клетки - и Аннексином V, и Р1 (АлУ РГ)

Рисунок 13. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии 5КОУ-3 после 72-часовой инкубации с химиопрепаратами, п=4 (*р > 0,05, в остальных случаях р < 0,05 в сравнении с интактным контролем, "р > 0,05, в остальных случаях р< 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

о4

К О

80 70 60 50 40 30

20 -Н 10

0,5x10'5 1хЮ-5 1хЮ4

концентрация препарата, М

[ циклоплатам [ цисплатин оксалиплатин

Рисунок 14. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии ЯКОУ-З с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, в течение 72 часов, п=3 (*р > 0,05 в сравнении с интактным контролем, р > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

Циклоплатам оказывает больший эффект на опухолевые клетки линии рака яичников МСР-7, чем цисплатин (рисунок 15). При инкубации 1х10~5М общее количество окрашенных клеток для циклоплатама составило 58,9%, для цисплатина 39,9%, для оксалиплатина 36,9%.

К 0,5-105 1 10! МО'4

концентрация препарата, М | | интактные (живые) клетки не связали ни Аннексии V, ни Р1 (АпУ РГ)

щааа ранние апоптотические клетки окрашиваются только Аннексином У(АпУ+ РГ)

I: : : | поздние апоптотические или некротические клетки - и Аннексином V, и Р1 (АпУ*РГ)

Рисунок 15. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии МСР-7 после 72—часовой

инкубации с химиопрепаратами, пЫ (*р > 0,05, в остальных случаях р < 0,05 в сравнении с

интактным контролем, "р > 0,05, в остальных случаях р < 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии МСР-7 с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином в течение 72 часов (рисунок 16). После инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,5x10"5 количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 25,9%, для цисплатина - 15,8% (*р > 0,05), для оксалиплатина -23,2% (°р > 0,05). С увеличением концентрации химиопрепаратов популяция клеток, положительных по каспазе-3, незначительно увеличилась и составила для циклоплатама 35,6%, для цисплатина 16,3% (*р > 0,05), для оксалиплатина-19,3%. При использовании максимальной дозы препаратов количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 64,9%, для цисплатина 25,1%, для оксалиплатина - 20,6% (°р > 0,05).

Таким образом, из полученных данных мы можем сделать вывод о том, что наиболее эффективным препаратом, вызывающими высокую экспрессию активной каспазы-3, является циклоплатам.

Рисунок 16. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии \iCF-7 с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином, в течение 72 часов, п=3 (*р > 0,05 в сравнении с интактным контролем, "р > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

Эффективным препаратом в отношении клеточной линии Т47-Э является циклоплатам (рисунок 17). При концентрации 1х10"5М общее количество окрашенных клеток для циклоплатама составило 32%, для цисплатина 30,5%, для оксалиплатина 21,5%.

Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии Т47-Б с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином в течение 72 часов (рисунок 18). При описании полученных результатов использовали данные за вычетом интактного контроля. После инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,5x10"5 количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 35,9%, для цисплатина 15,9%, для оксалиплатина 4,2%, что не является статистически достоверным значением в сравнении с интактным контролем. С увеличением концентрации химиопрепаратов популяция клеток, положительных по каспазе-3, увеличилась и составила для циклоплатама 50,5%, для цисплатина 27,3%, для оксалиплатина-11,4%. При использовании максимальной дозы препаратов количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 49,2%, для цисплатина 50,1%, для оксалиплатина-29%.

концентрация препарата, М

|-1 интактные (живые) клетки не связали ни Аннексии V, ни Р1 (АпУ Р1")

["•^¿Д ранние апогтготические клетки окрашиваются только Аннексином У(АпУ+ РР)

| поздние апоптотические или некротические клетки — и Аннексином V, и Р1 (АпУ* РГ)

Рисунок 17. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток линии Т47-П после 72—часовой инкубации с химиопрепаратами, п=3 (*р > 0,05, в остальных случаях р < 0,05 в сравнении с интактным контролем, "р > 0,05, в остальных случаях р <0,05 в сравнении с циклоплатамом).

Рисунок 18. Экспрессия активной каспазы-3 после инкубации клеток линии Т47-0 с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином в течение 72 часов, п=3 (*р > 0,05 в сравнении с интактным контролем, "р > 0,05 в сравнении с циклоплатамом).

Выводы

1. Циклоплатам и оксалиплатин в сравнении с цисплатином и карбоплатином обладают более выраженной цитотоксической активностью по отношению к опухолевым клеточным линиям лимфобластоидного (Jurkat, Raji) и моноцитарного происхождения (U937).

2. Установлено, что цитотоксические эффекты циклоплатама и цисплатина по отношению к опухолевым клеткам эпителиального (T47-D) и меланоцитарного происхождения (MelP) вьппе, чем цитотоксические эффекты карбоплатина и оксалиплатина.

3. Препараты группы комплексных соединений платины - циклоплатам, цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин - индуцируют гибель опухолевых клеток линий Jurkat, Raji и U937 по механизму апоптоза.

4. Уровень индуцированного апоптоза возрастает с увеличением концентрации и/или длительности инкубации опухолевых клеток с химиопрепаратами.

5. Препараты группы комплексных соединений платины - циклоплатам, цисплатин, оксалиплатин - индуцируют апоптоз популяций клеток линий как меланоцитарного (MelP), так и эпителиального происхождения (SKOV-3, T47-D, РС-3). При действии циклоплатама уровень апоптоза вьппе, чем при действии цисплатина и оксалиплатина.

6. Противоопухолевые препараты группы платины значительно сильнее индуцируют апоптоз и оказывают более выраженное цитотоксическое действие в отношении клеток лимфобластоидного и моноцитарного происхождения по сравнению с клетками эпителиального и меланоцитарного происхождения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Молекулярные механизмы действия препаратов платины. // Российский биотерапевтический журнал. №1, т.З, 2004, С.14-19. (Авторы: Вартанян A.A., Огородникова М.В.).

1. Индукция апоптоза препаратами группы платины. И Материалы III съезда онкологов и радиологов СНГ. Минск, 2004, С.344. (Авторы: Огородникова М.В., Барышников А.Ю.).

3. The investigation of platinum drugs reactivity in patients with CLL in vitro. // 29th ESMO Congress Annals of Oncology. Vienna, Austria, 2004, vl5, Р.Ш159. (Shishkin Yu.V., Ogorodnikova M.V., Baiyshnikov A.Yu.).

4. Сравнительная оценка индукции апоптоза противоопухолевыми препаратами циклоплатамом и оксалиплатином. // Российский биотерапевтический журнал, №1, т.4,

2005, С.65-66. (Авторы: Огородникова М.В., Лысюк Е.Ю., Шишкин Ю.В., Барышников А.Ю.).

5. Сравнительная оценка апоптоза индуцированного циклоплатамом и океалиплатином методом проточной цитофлуориметрии. // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологической практике». Барнаул, 2005, С.96-97. (Авторы: Огородникова М.В., Лысюк Е.Ю., Шишкин Ю.В., Барышников А.Ю.).

6. Оценка цитотоксической активности препаратов группы платина с использованием МТТ-теста. И Проблемы клинической медицины №1, 2006, С.39-42. (Авторы: Огородникова М.В., Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.).

7. Исследование цитотоксической активности циклоплатама в отношении клеточной линии рака молочной железы T47D. // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи». Барнаул, С.218-219. (Авторы: Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.).

8. Исследование циклоплатам и оксалиплатин индуцированного апоптоза методами in vitro. // Материалы V симпозиума «Биологические основы терапии онкологических заболеваний». Москва, 2006, С.17. (Авторы: Огородникова М.В., Барышников А.Ю.).

9. Сравнительное изучение действия циклоплатама и оксалиплатина на индукцию апоптоза методом проточной цитофлуориметрии. // Российский биотерапевтический журнал. №4, т.5, 2004, С.73-78. (Авторы: Огородникова М.В., Барышников А.Ю., Оборотова H.A., Шишкин Ю.В.).

10. Сравнительная оценка действия циклоплатама и оксалиплатина на экспрессию активной каспазы-3. // Материалы V съезда онкологов и радиологов СНГ. Ташкент, 2008, С.61. (Авторы: Огородникова М.В., Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.).

11. Flow cytometry of apoptosis induction by cycloplatam and oxaliplatin on PC3 cell line. // 20th International Congress on Anti-Cancer Treatment. Paris, France, 2009, P.432-433. (Shishkin Y.V., Ogorodnikova M.V., Baryshnikov A.Y.).

Подписано в печать 19.05.09 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

_Заказ № 443 Тираж 100 экз._

Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Оглавление диссертации Огородникова, Мария Владимировна :: 2009 :: Москва

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Противоопухолевые препараты, индуцирующие апоптоз опухолевых клеток.

1.2. Молекулярные механизмы действия препаратов группы платина.

1.2.1. Взаимодействие цисплатина с ДНК.

1.2.2. Соединения платины и апоптоз.

1.2.3. Лекарственная резистентность и соединения платины.

1.2.4.Маркеры резистентности к цисплатину

1.2.5.Трансмембранный перенос соединений платины и их локализация в клетке.

1.3. Характеристика методов регистрации апоптоза.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Материалы и реактивы.

2.2. Клеточные линии.

2.3. Оценка цвгготоксического действия химиопрепаратов МТТ-тестом.

2.4. Проточно-цитофлуориметрический анализ.

2.5. Определение апоптоза методом двойного окрашивания.

2.6. Определение активной каспазы-3.

2.7.Исследование апоптоза методом TUNEL с использованием набора АРО

DIRECT Kit.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Оценка цитотоксической активности препаратов группы платина с использованием МТТ - теста.

3.1.Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов цикл 01 и I агам а, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии Jurkat (Т-клеточный лимфобластоидный лейкоз человека).

3.2.Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии Raji (В-клеточный лимфобластоидный лейкоз человека).

3.3. Определение цитотоксической активности пр отив о опухол е в ы х препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии U 937(моноцитарная лимфома).

3.4. Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии T47D (рак молочной железы).

3.5. Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии меланомы человека mel Р.

3.6. Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии рака предстательной железы PC - 3.

3.7. Определение цитотоксической активности противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина на клеточной линии рака молочной железы MCF-7.

3.8. Обобщение результатов полученных методом МТТ.

Глава 4. Исследование лекарственно-индуцированного апоптоза методами проточной цитофлуориметрии.

4.1. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/PI, каспазы-3, Tunel на клеточной линии Jurkat.

4.2. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/PI, каспазы-3, Tunel на клеточной линии Raji.

4.3. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/PI, каспазы-3, Tunel на клеточной линии U937.

4.4. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваншш Аннексин/PI, каспазы-Зна клеточной линии mel Р.

4.5. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/PI, каспазы-3 на клеточной линии SKOV-3.

4.6. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/PI, каспазы-3-3, на клеточной линии MCF-7.

4.7. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/PI, каспазы-3 на клеточной линии T47D.

4.8. Определение лекарственно-индуцированного апоптоза методом двойного окрашиваниия Аннексин/PI, каспазы-3 на клеточной линии РС-3.

Введение диссертации по теме "Онкология", Огородникова, Мария Владимировна, автореферат

В соответствии с современными представлениями, злокачественную опухоль можно рассматривать как заболевание клетки, в основе которого лежит повреждение ее генома, вследствие чего возникает нарушение четко сопряженных в нормальной клетке процессов пролиферации и дифференцировки в сторону усиления пролиферации, снижение способности к физиологическому механизму гибели клеток — апоптозу - программе самоликвидации, заложенной в геноме всех клеток. Исследования конца 20 века привели к формированию концепции, согласно которой в ответ на первичные повреждения внутриклеточных мишеней противоопухолевыми препаратами разного механизма действия в опухолевой, клетке происходит индукция апоптоза. Особое место в этом аспекте занимают препараты, относящиеся к группе комплексных соединений платины.

С момента открытия цисплатина Б. Розенбергом в 1960 году как соединения, обладающего противоопухолевой активностью, прошло около 45 лет; за это время интерес к поиску новых комплексных соединений платины возрос. В настоящее время, помимо цисплатина широко используются такие препараты как карбоплатин, оксалиплатин, а также проходят испытания ряд новых комплексных соединений платины третьего поколения: таких как сатраплатин, недаплатин, ZD0473 (JM 473), BBR3464 [74].

Среди комплексных соединений двухвалентной платины большой интерес представляет отечественный препарат циклоплатам - 8(-)-малатоамин (циклопентиламин) платино(П), который был синтезирован П.А. Чельцовым в лаборатории координационных соединений платиновых металлов Института общей и неорганической химии им. Н.С. Курнакова РАН. Циклоплатам обладает хорошей растворимостью в воде, широким спектром и высокой противоопухолевой активностью, отсутствием нефротоксичности и перекрестной резистентности с известными платиновыми и некоторыми цито стати ками других групп [12]. Лиофилизированная форма циклоплатам а, разработанная в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН разрешена для медицинского применения при раке яичников, мезотелиоме плевры и множественной миеломе. Получены частичные ремиссии у больных плоскоклеточным раком легкого, желудка, яичников и шейки матки. В РОНЦ им. Н.Н. Блохина при монотерапии рака яичников эффективность препарата достигала 54%. Циклоплатам применялся при лечении рака предстательной железы - в монотерашш и в комбинации с винбластином. У больных с гормонорезистентным раком предстательной железы при монотерапии объективный эффект достигнут в 7% случаев, в 30% -в комбинации с другими препаратами.

Молекулярные механизмы действия циклоплатама мало изучены. Как и у других препаратов комплексных соединений платины, мишенью цитотоксического действия циклоплатама является суперспиральная ДНК. При сравнительном изучении в опытах in vitro циклоплатам в терапевтической концентрации оказался более эффективным при действии на ДНК, чем цисплатин [9]. При этом воздействие циклоплатама на ДНК клеток лейкоза in vivo может быть обнаружено уже через 24 час. В механизмах действия-циклоплатама показано, что он модулирует (З-адренорецепторную активность плазматической мембраны [8]. Имеются данные об ингибирующем влиянии циклоплатама на протеинкиназу С [18].

Несмотря на такой большой интерес к циклоплатаму в клинике in vitro этот препарат был изучен мало.

Цель работы - изучить индукцию апоптоза отечественным противоопухолевым препаратом циклоплатамом в сравнении с цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином.

Задачи исследования.

1. Оценить цитотоксическую активность противоопухолевых препаратов циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина и карбоплатина на клеточные линии с применением МТТ - теста.

2. Сравнить цитотоксическую активность циклоплатама с цисплатином, оксалиплатином и карбоплатином.

3. Оптимизировать условия индукции и регистрации апоптоза, вызванного противоопухолевыми препаратами in vitro.

4. Оценить лекарственно-индуцированный апоптоз на клеточных линиях с применением современных методов регистрации апоптоза.

5. Изучить влияние на апоптоз циклоплатама в сравнении с цисплатином, оксалиплатином и карбоплатином.

Научная новизна исследования. Показана цитотоксическая активность циклоплатама в сравнении с цисплатином, карбоплатином, оксалиплатином на клеточных линиях лимфобластоидного, моноцитарного, меланоцитарного и эпидермального происхождения. Впервые показана способность отечественного противоопухолевого препарата платины второго поколения — циклоплатама - индуцировать апоптоз клеток линий Raji, U937, MelP, MCF-7, T47D, SKOV-3. Проведена оценка действия циклоплатама на апоптоз в сравнении с цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином. Применено три принципиально различных методических приема для определения популяционного анализа лекарственно-индуцированного апоптоза с использованием проточной цитофлуориметрии.

Заключение диссертационного исследования на тему "Сравнительная оценка индукции апоптоза производными платины in vitro"

выводы

2. Установлено, что цитотоксические эффекты циклоплатама и цисплатина по отношению к опухолевым клеткам эпителиального (T47-D) и меланоцитарного происхождения (MelP) выше, чем цитотоксические эффекты карбоплатина и оксалиплатина.

5. Препараты группы комплексных соединений платины - циклоплатам, цисплатин, оксалиплатин - индуцируют апоптоз популяций клеток линий как меланоцитарного (MelP), так и эпителиального происхождения (SKOV-3, T47-D, РС-3). При действии циклоплатама уровень апоптоза выше, чем при действии цисплатина и оксалиплатина.

Заключение.

Платиновые производные заняли прочные позиции в химиотерапии злокачественных новообразований. Среди других современных противоопухолевых средств они считаются особо перспективными, поэтому интенсивно разрабатываются в ряде стран, в том числе и в России. В ряду новых платиновых производных существует два препарата, достигших третьей фазы клинических испытаний и разрешенных для практического применения — это оксалиплатин и оригинальное отечественное производное платины - циклоплатам.

В настоящее время известно, что большинство противоопухолевых препаратов индуцируют гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза.

В наптих исследованиях мы сравнили действие на цитотоксическую активность и индукцию апоптоза отечественного производного платины циклоплатама с зарубежными препаратами цисплатином, карбоплатином и оксалиплатином. В качестве модельной системы нами был выбрана панель клеточных линий различного происхождения, которая включала линии рака молочной железы, яичников, меланомы кожи, предстательной железы, Т-клсточного лимфобластоидного лейкоза, В- клеточного лимфобластоидного лейкоза, моноцитарной лимфомы.

На первом этапе нами проведено исследование по определению цитотоксической активности циклоплатама на клеточные линии в сравнении с другими платиновыми производными: цисплатином, оксалиплатином, карбоплатином. Показано, что циклоплатам обладает цитотоксической активностью в отношении всех клеточных линии. При увеличении концентрации циклоплатама уменьшается количество живых клеток. В отношении клеточных линий лимфобластного происхождения Jurkat, Raji, U937 значения ИК50 меньше либо равно теоретической терапевтической концентрации циклоплатама (1х10~5М).

При сравнении циклоплатама с оксалиплатином на клеточной линии

116

Jurkat в концентрации достоверных различии между действием этих препаратов на выживаемость опухолевых клеток не выявлено (р>0,05). Выживаемость опухолевых клеток под действием циклоплатама в сравнении с цисплатином и карбоплатином ниже, так, при использовании концентрации 0,5х10"5М процент выживших клеток для циклоплатама был равен 46,3%, тогда как для цисплатина и карбоплатина 37,7% и 100% соответственно. Циклоплатам обладает большей цитотоксической активностью по сравнению с цисплатином, карбоплатином. Циклоплатам имеет схожий эффект с оксалиплатином, о чем свидетельствуют значения ИК5о (0,4хЮ~5М и 0,6x10^ соответственно).

При сравнении циклоплатама с цисплатином на клеточной линии Raji статистически достоверных различий/ не выявлено при концентрации 0,5хЮ~5М, 1х104М, а также для циклоплатама с оксалиплатином в концентрации 1х10"5М. При сравнении циклоплатама с оксалиплатином последний обладает большей цитотоксической активностью в концентрациях lxlO^M, 0,5хЮ"5М. Так, при использовании концентрации 1x10"^ процент живых клеток для циклоплатама составил 61,4 % для оксалиплатина 52,5%, при концентрации 0,5 х

105М — 55,1% и 36,3% соответственно. Циклоплатам обладает большей цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток линии Raji в сравнении с цисплатином и карбоплатином. На основании полученных данных были определены значения ИК50 для циклоплатама, цисплатина, оксалиплатина которые составили 0,55хЮ"3М, 0,73хЮ"5М, 0,15хЮ"5М соответственно. При сравнении циклоплатама с другими препаратами в концентрации все полученные данные были достоверны (р>0,05).

При действии циклоплатама, цисплатина и оксалиплатина на клетки линии U937 в концентрациях О^хЮ^М, lxlO^M достоверных различий выявлено не было. При изучении действия циклоплатама в дозе близкой к терапевтической in vivo — 1хЮ"5 М, процент живых клеток составил 9,2 %.

Для цисплатина, оксалиплатина, карбоплатина были построены кривые

117 доза-эффекг» и определены значения ИК50, которые составили 0,ЗЗх10"5М, 0,44хЮ"5М, 6,6хЮ"5М соответственно.

Таким образом, нами показано, что циклоплатам обладает цитотоксической активностью в отношении клеточных линии лимфобластоидного происхождения Jurkat, Raji, и моноцитарного происхождения U937. При увеличении концентрации циклоплатама уменьшается количество живых клеток. В отношении клеточных линий значения ИК50 меньше либо равно теоретической терапевтической концентрации циклоплатама и оксалиплатина. Для клеточных линий Raji, U937, значение ИК50 цисплатина меньше либо равно теоретической терапевтической концентрации, тогда как для Jurkat значение ИК50 превышает теоретическую терапевтическую концентрацию для в 3,7 раза. Значение ИК5о карбоплатина для клеточной линии U937 превышает теоретическую терапевтическую концентрацию в 3 раза, для линий Jurkat, Raji значений получено не было.

Также нами была исследована цитотоксическая активность в отношении клеточных линий эпидермального - T47D, РС-3, MCF-7 и меланоцитарного происхождения- mel Р.

С увеличением концентрации циклоплатама и цисплатина уменьшается процент живых клеток. В отношении оксалиплатина и карбоплатина такой тенденции не наблюдается. Были определены значения ИК50 для циклоплатама - 0,46х10"5М, и цисплатина - 0,9х10"5М. Для оксалиплатина и карбоплатина эти значения не были получены. Эффективными препаратами в отношении клеточной линии рака молочной железы T47D являются циклоплатам и цисплатин.

При сравнении циклоплатама с цисплатином на клеточной линии mel Р достоверных различий в пределах выбранных концентраций не выявлено.

Определены значения ИК50 для циклоплатама цисплатина и карбоплатина и составляют 0,93хЮ"5М, 2,68x1 0"5М, 6,2хЮ'5М соответственно. Эффективным препаратом в отношении клеточной линии меланомы человека является

118 циклоплатам, так как только его значение меньше теоретической терапевтической концентрации.

При действии препаратов на клетки линии РС-3 самый низкий процент выживших клеток получен после действия циклоплатама в дозе lxlO^M и составил 33%. Значение ИК50 для циклоплатама составило 4,47><10"5М. При действии циклоплатама и цисплатина на клетки линии MCF-7 в концентрации 1хЮ"5М и 0,5x1 О^М полученные результаты статистически недостоверны. Значения ИК50 для циклоплатама, цисплатина, карбоплатина составляют 5ДхЮ"5М, 4,5хЮ~5М, 8ДхЮ~5М соответственно.

В настоящей работе было применено три принципиально различных методических приема для определения популяционного анализа лекарственно - индуцированного апоптоза с использованием проточной цитофлуориметрии.

Метод двойного прижизненного окрашивания с использованием

Аннексина V-FITC в комбинации с PI, основанный на способности

Аннексина V меченного F1TC связываться с фосфатидилсерином, позволяет зафиксировать апоптотические клетки. В связи с тем, что транслокация фосфатидилсерина происходит и в некротических клетках Аннексии V используют в сочетании с витальным красителем PI. Апоптотические клетки начинают взаимодействовать с Аннексином V после того, как произошла конденсация хроматина, но до утраты плазматической и ядерной мембранами способности ограничивать проникновение PI. В результате живые клетки не связывают ни Аннексии V, ни PI. Апоптотические клетки с неповрежденной мембраной окрашиваются только Аннексином V, а поздние апоптотические или некротические клетки - и Аннексином V, и PI. Так под действием циклоплатама в течение 72 часов при использовании терапевтической концентрации 1х10"5М число ранних апоптотических клеток (AnV^PI") для циклоплатама составило 62%, для цисплатина - 29,2% для оксалиплатина

25%, для карбоплатина 14%. Как видно циклоплатам действует на клеточную линию лучше чем все остальные препараты. Это касается и

119 применения максимальной дозы 1 хЮ"4 Моль.

Как упоминалось ранее, для определения апоптоза мы также использовали методы определения активной каспазы-3 и определение внутринитевых разрывов ДНК (Tunel) в клетке. Мы определили, что циклоплатам в сравнении с другими препаратами платины индуцирует активную каспазу-3 и внутринитевые разрывы ДНК в клетках линии Jurkat лучше, чем другие препараты. Так при действии концентрации 1хЮ"5М для циклоплатама количество апоптотических клеток составило 76%, для цисплатина - 51%, для оксалиплатина - 20,8%, для карбоплатина - 16,5%. При определении внутринитевых разрывов ДНК процент положительных клеток по маркеру составил для циклоплатама -83,5%, цисплатина 74,7%, для оксалиплатина 16%, карбоплатина 10,1%. При увеличении концентрации до lxlO"4 Моль получены статистически не достоверные данные при сравнении циклоплатама и цисплатина, которые составили 90,5% и 88,6%. Для оксалиплатина и карбоплатина наблюдается увеличение популяции апоптотических клеток, которое составляет 70,8% и 41,2% соответственно. Таким образом, циклоплатам в сравнении с оксалиплатином и карбоплатином эффективнее индуцирует гибель клеток линии Jurkat по типу апоптоза.

При исследовании лекарственно-индуцированного апоптоза на клеточной линии Raji после инкубации 72 часа под действием циклоплатама в концентрации 1хЮ"5М, количество клеток в раннем апоптозе (AnV^PI ) для циклполатама составило 4,7% (*р>0,05), для цисплатина 19,0%, для оксалиплатина 13,9%, для карбоплатина, 13,7%, соответственно. Популяция клеток положительных по AnV* и Р1* для циклоплатама составила 65,1%, для цисплатина - 25,6%, для оксалиплатина -45,7, для карбоплатина -5,9% №Х>,05).

При определении активной каспазы -3 количество апоптотических клеток при действии концентрации 1х10"5М составило циклоплатама 61,7%, для цисплатина 35,7%, для оксалиплатина 46,8%, для карбоплатина -12,7%.

120

Данные по определению внутринитевых разрывов ДНК показали, что при использовании концентрации lxlO'^M количество процент положительных клеток по маркеру составляет для циклоплатама-91,3%, для цисплатина -69,9%, для оксалиплатина-16%, для карбоплатина 10,1%. Циклоплатам является наиболее эффективным препаратом, малоэффективным -карбоплатин.

Изучение действия циклоплатама на индукцию апоптоза клеток линии U937 мы проводили в сравнении с оксалиплатином. При определении апоптотических клеток методом двойного окрашивания после инкубации 72 часа количество ранних апоптотических клеток при использовании концентрации 0,5*10"5M для циклоплатама составляет 60%, для оксалиплатина 17%. При использовании дозы 1хЮ~5 М количество поздних апоптотических или некротических клеток для циклоплатама и оксалиплатина уменьшилось и составило 24% и 7 % соответственно. При увеличении дозы (lxxlO^M) популяция клеток положительных по AnV* и отрицательных по PI ~ увеличилась как для циклоплатама так и для оксалиплатина и составила 77% и 39% соответственно. Количество клеток положительных по AnV* и Pf наоборот уменьшилось и составило для циклоплатама 15%, для оксалиплатина 14%. При определении активной каспазы-3 количество апоптотических клеток при действии циклоплатама составило 81,2% (0,5х10~5М) и увеличивается до 96,2% (1хЮ~5М). Количество клеток положительных по маркеру Tunel также увеличилось и составило 27,4% (0,5хЮ"5М), 56,1% (1хЮ"5М), 90,5% (МО^М).

При определении апоптоза методом двойного окрашивания на клеточной линии меланомы кожи MelP при концентрации 1х 1 О^М общее количество клеток положительных по AnV* и Pf и AnV* PI " для циклоплатама составило 53,8%, для цисплатина 44,4%, для оксалиплатина

11,2 %, что меньше на 42,6% по сравнению с циклоплатамом. Популяция клеток положительных по каспазе-3 составила для циклоплатама 65%, для цисплатина 29,3%, для оксалиплатина 32,6%. Таким образом циклоплатам

121 оказывает большей эффект на опухолевые клетки линии меланомы кожи Mel Р, чем оксалиплатин и цисплатин.

Циклоплатам оказывает большей эффект на опухолевые клетки линии рака яичников SKOV-3 чем цисплатин и оксалиплатин. Так при инкубации 72 часа количество ранних и поздних апоптотических клеток после действия концентрации 1*10~5M для циклоплатама составило 34,2%, для цисплатина 18,1%, для оксалиплатина 18,7%. При увеличении концентрации до 1*10"*М количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 66,4%, для цисплатина 32%, для оксалиплатина 9,1%. Определение активной каспазы-3 проводили после инкубации клеток линии SKOV-3 с циклоплатамом, цисплатином, оксалиплатином в течение 72 часов. После инкубации с химиопрепаратами в дозе 0,510 ~5М количество апоптотических клеток для циклоплатама составило 35,4%, для цисплатина 16,1%, для оксалиплатина-17,8%. С увеличением концентрации химиопрепаратов популяция клеток, положительных по каспазе-3, в отношении циклоплатама увеличилась и составила 53,3%, для цисплатина и оксалиплатина - незначительно \ увеличилась и составила 21% и 26,5% соответственно. С увеличением дозы препаратов количество апоптотических клеток увеличилось и составило для циклоплатама 80%, для цисплатина 55%, для оксалиплатина- 35,4%.

Циклоплатам оказывает большей эффект на опухолевые клетки линии рака яичников MCF-7, чем цисплатин. При инкубацййО 1 "5М общее ^ количество окрашенных клеток для циклоплатама составило 58,9%, для цисплатина 39,9%, для оксалиплатина 36,9%. При определении активной каспазы-3 при использовании максимальной дозы количество апоптотических клеток составило 52,6%, 12,8%, 10,9% соответственно.

Эффективными препаратам в отношении клеточной линии T47-D является циклоплатам. При концентрации 410 ~5М общее количество окрашенных клеток для циклоплатама составило 32%, для цисплатина 30,5%, для оксалиплатина 21,5%. Данные по каспазе -3 показывают, что самым эффективным препаратом является циклоплатам - 49,2%, тогда как для

122 цисплатина и оксалиплатина только процент апоптотичвеских клеток составил 27,3% и 11,4% соответственно.

Таким образом полученные данные показывают, что при изучении эффективности препаратов группы платины препаратом оказывающим высокий эффект в отношении клеточных линий является циклоплатам исключение составляют линии MCF-7 и РС-3', где полученные значения LD50 превышают теоретическую терапевтическую дозу in vitro в пять раз.

Применяя современные методы определения апоптоза мы показали, что противоопухолевые препараты циклоплатам, цисплатин, оксалиплатин, карбоплатин индуцируют гибель опухолевых клеточных линий разного происхождения по механизму апоптоза.

Показано, что противоопухолевые препараты циклоплатам, Цисплатин, Оксалиплатин также индуцируют гибель клеток линий полученных от больных с солидными опухолями: меланома кожи, рак яичников, рак молочной железы, рак предстательной железы. В сравнении с цисплатином и оксалиплатином - при использовании теоретической терапевтической дозы in vitro циклоплатам эффективнее индуцирует гибель опухолевых клеток по типу апоптоза.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Огородникова, Мария Владимировна

1. Багрова С.Г. Результаты IT фазы клинического изучения циклоплатама при резистентных солидных опухолях. // Вопросы онкологии. 2001. Том 47.№ 6. Стр.752-756

2. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза.- Mi: Эдиториал УРСС,2002.-320с.

3. Владимирская Е.Б. Биологические основы противоопухолевой терапии.-М.: Агат-Мед, 2001.-110с.

4. Горбачева Л.Б., Васильева С.В. и др. Новый противоопухолевый препарат циклоплатам: цитотоксичность и межнитивые сшивки ДНК.// Антибиотики и химиотерапия,1999, Том 44 №4. Стр. 9-12.

5. Горбунова В.А., Оборотова Н.А.,Чельцов П.А., и др. Новый препарат платины второго поколения циклоплатам, лиофилизированный. // Вестник РОНЦ: - 2001. - №4. - С. 53-57.

6. Горбунова В.А. Препарат* циклоплатам. Результаты клинических испытаний при резистентных солидных опухолях // Вестн. моек, онкол. общества. 2004. - № 11. С. 11-14.

7. Семенов Н.Н. Активность оксалиплатина (элоксатина) при платиночувствительных опухолях // Фарматека. 2005. - № 18. - С. 63-65.

8. Солнцева Т.И. Влияние циклоплатама на мембранные свойства опухолевых клеток: p-адренергические рецепторы и адгезия на пластике // Циклоплатам: Сб. научи, тр. / М.: ОНЦ РАМН, 1993. -С.100 -106.

9. Стручков В.А. Механизм действия циклоплатама на структуры ДНК опухолевых клеток // Циклоплатам: Сб. научн. тр. / М.: ОНЦ РАМН, 1993.-С. 90-99.

10. Матвеев Б.П., Бухаркин Б.В., Калинин С.А. Химиотерапия гормонорезистентного рака предстательной железы.//Урология. 2005. №4. Стр.20-23

11. Матвеев Б.П., Горбунова В.А., и др. Циклоплатам в лечении больныхраспространенным раком предстательной желез ы//Ур ология нефрология.1996.№3 Стр.34-36.

12. Оборотова Н.А. Противоопухолевые субстанции и их лекарственные формы, созданные в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН // В сб. Экспериментальная онкология на рубеже веков. Под редакцией Давыдова М.И. и Барышникова А.Ю. М. - 2003. С. 5-58.

13. Трещали на Е.М., Жукова О., Герасимова Г.К. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ. // В книге Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. М.

14. Фильченков А.А, Стойка Р.С. Апоптоз и рак, К.: Морион, 1999. -184 с.

15. Швембергер И.Н., Гинкул Л.Б. Апоптоз: Роль в нормальном онтогенезе и патологии. 2002. Вопросы онкологии, Том 28. №2. Стр. 153-171.

16. Al-Sarraf М. Treatment of locally advanced head and neck cancer: historical and critical review. // Cancer Control 2002. - Vol.9. - P. 387399.

17. Arando D., Wilson A.J. et al Molecular mechanisms of action and prediction of response to oxaliplatin in colorectal cancer cells. BrJCancer.// 2004-V16-P.260-261.

18. Bacso Z., Everson R.B. et al. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. //Cancer Reasearch -2000-Vol. 60. P. 46234628

19. Barry M.A., Behnke C.A. and Eastman A. Activation of programmed cell death (apoptosis) by cisplatin, other anticancer drugs, toxins and hyperyheremia // Biochem. Pharmacol. -1990. -Vol.40. -P.2353-2362.

20. Basil A., Akkaraju G.R. Regulation of caspase activation and cis-diamminedichloroplatinum(II) induced cell death by protein kinase C. // Biochemistry. -1999. Vol. 38. - P. 4245-4251.

21. Benhar M., Engelberg D., Levitzki A. ROS, stress-activated kinases and stress signaling in cancer. // EMBO Rep. 2002. Vol. 3. - P. 420-425.

22. Beretta G.L., Righetti S.C., Lombardi L. et al. Electron microscopy analysis of early localization of cisplatin* in ovarian carcinoma cells. // UltrastructPathol.-2002. Vol.26.-P. 331-334

23. Boulikas T. DNA lesion-recognizing proteins and the p53 connection. -1996. Vol; 16. - P.225-242.

24. Boulikas Т., Lundstrom K. Viral and non-viral vectors in gene therapy: technology development and* clinical trials. // Technol Cancer Res Treat. -2003.-P. 471-86.

25. Boulikas Т., Vougiouka M. Cisplatin and platinum drugs at the molecular level. // Oncol Rep. 2003. - Vol.16. - P. 1663-1682.

26. Bossy-Wetzel E, Green DR. Detection of apoptosis by Annexin V labeling. Methods Enzymol 2000;322:15-18.

27. Brabec V., Kasparkova J. Modifications of DNA by platinum complexes relation to resistance of tumors to platinum antitumor drugs.//Drug Resistance Updates -2005-V.8.-P.131-146

28. Bniijnincx P.C., Sadler P.J. New trends for metal complexes with anticancer activity.// Current opinion in Chemical Biology -2007 -V.12.-P.l-10

29. Caglar К., Kinalp С., Arpaci F et al. Cmniilative prior dose of cisplatin as a cause of the nephrotoxicity of high-dose chemotherapy followed by analogous stem-cell transplantation. // Nephrol Dial. Transplant. 2002: -Vol. 17.-P.1931-1935

30. Calabresi P. and Chabner B.A. Chemotherapy of neoplastic diseases // In Pharmacological Basis of Therapeutics, Eight Edition. -1990. -P.1202-1263.

31. Capizzi R.L. Amifostine reduces the incidence of cumulative nephrotoxicity from cisplatin: laboratory and clinical aspects. // Semin Oncol. 1999. - Vol. 26. - P. 72-81

32. Caraceni A., Martini C., Spatti G. et al. Recovering optic, neuritis during systemic cisplatin and carboplatin, chemotherapy. // Acta Neurol Scandr -1997.-Vol: 96.-P. 260-261

33. S.G. Chaney, S.L. Campbell, B. Temple, E. Bassett, Y. Wu and M. Faldu, Protein interactions with platinum-DNA adducts: from structure to function, J InorgBiochem 98 (2004) (10), pp. 1551-1559.

34. Chollet P., Bensmaine M.A., Brienza S. Single agent activity of oxaliplatin in heavity pretreated advanced epithelial ovarian cancer // Ann. Oncol. -1996.-Vol. 7.-P. 1065-1070.

35. Crown J., Donovan N. et al: Caspase 3 in Brest Cancer.// Clinical Cancer Research -2003-V9.-P.738-742.

36. Denkert C., Schmitt W.D., Berger S. et al. Expression of mitogen-activated kinase phosphatase-1 (MKP-l) in primary human ovarian carcinoma. // Int J Cancer. 2002. - Vol. 102. - P. 507-513.

37. Douglas J. Taatjes • Burton E. Sobel • Ralph C. Budd Morphological and cytochemical determination of cell death by apoptosis Histochem Cell Biol (2008) 129:33-43

38. Earnshaw W.C. Nuclear changes in apoptosis. // Curr.Opin. Cell Biol. -1995.-Vol.7.-P.337-343.

39. Eastman A., Schulte N., Sheibani N. et al. Mechanism of resistance to platinum drugs. // In: Nicolini M ed. Platinum and other metal coordination compounds in cancer chemotherapy. Boston . 1988. — P. 178-196.

40. Edelman J.M. Past, present and future of gemcitabine and carboplatin regimens in an advanced non-small cell lung cancer. // Lung Cancer. — 2002.-Vol. 38.-P. 37-43.

41. Emert-Sedlak L., Shangary S et al. Involvement of cathesin D in chemotherapy-induced cytochrome с release, caspase activation, and cell death. Mol Cancer Ther. 2005 V.5 P.733-742

42. Epstein R.G. Drug-induced DNA damage and tumor chemosensitivity // J. Clin. Oncol. -1990. Vol.8. - 2062-2084.

43. Fadok V.A., Voelker P.A., Campbell J.J. et al. Exposure of phosphatidylethanol-amine on the surface of apoptotic cells // Exp. Cell. Res.-1992. -Vol.232. -P.430-434.

44. Falcieri E, Martelli AM, Bareggi R et al. The protein kinase inhibitor staurosporine induces morphological changes typical of apoptosis in MOLT-4 without concomitant DNA fragmentation. Biochem Biophys Res Com. -1993. -Vol.193. -P.19-23.

45. Foster R.S. Early stage testis cancer. // Curr Treat Options Oncol. 2001. -Vol. -2. -P. 413-419.

46. Gelasco A., Lippard SJ. NMR solution structure of a DNA dodecamer duplex containing a cis-ammineplatinum(II) d(GpG) intrastand cross-link, the major adduct of the anticancer drug cisplatin. // Biochemistry. 1998. -Vol. 37.-P. 9230-9239.

47. Galea A.M., Murray V. The interaction of cisplatin and analogues with DNA in reconstituted chromatin. // Biochim Biophys Acta. 2002. - Vol. -1579.-P. 142-152.

48. Galluzzi L, Maiuri MC, Vitale I, Zischka H, Castedo M, Zitvogel L, Kroemer G Cell death modalities: classiWcations and pathophysiological implications. Cell Death DiVer.- -2007.- Vol. 14.-P. 1237-124

49. Gavrieli Y, Sherman Y, and Ben Sasson S. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation // J. Cell Biol. -1992. -Vol.119. -P.493-501.

50. Gong J.G., Costanzo A., Yang H.Q. et al. The tyrosine kinase c-Abl regulates p73 in apoptotic response to cisplatin-induced DNA damage. // Nature. -1999. Vol. 399. - P. 708-712.

51. Gorczyca W., Gong J., Darzynkiewicz Z. Detection of DNA strand breaks individual apoptotic cells by the in situ by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays // Cancer Res. -1993a. -Vol.52. -P.1945-1951.

52. Gown AM, Willingham MC Improved detection of apoptotic cells in archival paraYn sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3 // J Histochem Cytochem.- 2002.-Vol 50,- P.449-454.

53. Godard Т., Deslandes E., Lebailly P. et al. Early detection of staurosporine-induced apoptosis //Histchem. Cell Biol. -1999. -Vol.112. -P.155-161.

54. Hickman J.A. Apoptosis induced by anticancer drugs // Cancer Met. Rev. -1992. -Vol.11.-P.121-139.

55. Harries M., Kaye S.B. Recent advances in the treatment of epithelial ovarian cancer. // Expert Opin Investig Drugs. 2001. - Vol. - 110. - P. 1714-1724.

56. Hay M.P. ZD-0473 AstraZeneka. // Curr. Opin Investig.Drugs. 2000. -Vol. l.-P. 263-266.

57. Henkels K.M., Turchi J.J. Cisplatin-induced apoptosis proceeds de caspase-3-dependent and -independent pathways in cisplatin-resistant and -sensitive human ovarian cancer. // Cancer Res. 1999. -Vol. 59. p. 30773083.

58. Hesketh R. Gene therapy for cancer. In: The oncogene and tumor suppressor gene // Hesketh R ed. Cambridge, UK. 1997. - P. 61-69.

59. Hill J.M., Speer R.J. Organo-platinum complexes as antitumor agents. // Anticancer Res. 1982. - Vol. 2. -P.173-186.

60. Inuma H., Maruyama K., Okinaga К et al. Intracellular targeting therapy of cisplatin-encapsulated transferring-polyethylene glycol liposome on peritoneal dissemination of gastric cancer. // Int J Cancer. 2002. - Vol. 99.-P. 130-137.

61. Ito Y, Shibata M-A, Kusakabe K, Otsuki Y Method of specific detection of apoptosis using formamide-induced DNA denaturation assay// J Histochem Cytochem.- 2006,-Vol 54.- P.683-692.

62. Jamieson E.R., Jacobson M.P., Barnes C.M. et al. Structural and kinetic studies of cisplatin-modified DNA icosamer binding to HMGG1 domain B. // 1999. Vol. 274. - P.2346-12354.

63. Jansen B.A., Brower J., Reedijk J. et al. Glutation induces cellular resistance against cationic dinuclear platinum anticancer drugs. // J Inorg Biochem. 2002. - Vol. 89. - P. 197-202.

64. Kaufmann S.H. Induction of endonucleolytic DNA cleavage in humanacute myelogenous leukemia cells by etoposide, camtothecin, and other131cytotoxic anticancer drugs: a cautionary note // Cancer Res.- 1989. -Vol.49. -P.5870-5878.

65. Kaufmann S.H., Desnoyers S., Ottaviano Y. et al. Specific proteolytic cleavage of Poly (ADP-ribose) polymerase: an early marker of chemotherapy-induced apoptosis // Cancer Res.- 1993. Vol.53. - P.3976-3985.

66. Kigawa J., Sato S., Shimada M. et al. p53 gene status and chemosensitivity in ovarian cancer. // Hum Cell. 2002. - Vol. 14. г P.165-171.

67. Koo MS, Kwo YG et al. Signaling and function of caspase and c-jun N-terminal kinase in cisplatin-induced apoptosis // Mol Cells. 2002. -Vol.13. -P.l94-201.

68. Koopman G., Reutelingsperger C.P.M., Kuijten. G.A.M., Keehnen R.M.J., Pals S T. & van Ors M.H.J. Annexin V for Flow Cytometric Detection of phosphatidylserine exspression on В cells undergoing apoptosis // Blood. -1994. Vol.84. - P.1415-1420.

69. Kosmidis P., Mylonakis N., Nikolades C. et al. Paclitaxe! plus carboplatin versus gemcitabine plus paclitaxel in advanced non-small cell* lung cancer: a phase in randomized trial. // J Clin Oncol. 2002. - Vol. 20. - P.3565-3567.

70. Labat-Moleur F., Guillerment C., Lorimier P. TUNEL apoptic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement // The

71. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. -1998. -Vol.46 (3). -P.327-334.

72. T. Latif, L. Wood and C. Connell et al., Phase П study of oral bis(aceto)ammine dicWoro(cyclohexamine)platinum(TV) (JM-216, BMS-182751) given daily x 5 in hormone refractory prostate cancer (HRPC) // Invest New Drugs.- 2005.-Vol. 1.-P. 79-84.

73. Lazebnik YA, Kaufinann SH, Desnoyers S. et al. Cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE //Nature. -1994, Vol.371. -P.346-347.

74. Lee E.K., Regenold W.T., Shapiro P. Ras-mediated activation of ERK by cisplatin induces cell death independently of p53 in osteocarcoma and neuroblastoma cell lines. // Anticancer Drugs. 2002. - Vol. 13. - P. 859968.

75. Levresse V., Marek L., Blumberg D. et al. Regulation of platinum-compounds cytotoxicity by the c-Jun N-Terminal kinase and c-Jun signaling pathway in small-cell lung cancer cells. // Mol Pharmacol. -2002. Vol. 62. - P. 689-697.

76. Lin W.L., Li D.G. et al. Clinical and experimental study of oxaliplatin in treating human gastric carcinoma. World J Gastroenterol. //2004-V.19-P.2911-2915.

77. Lin X., Okuda Т., Holzer A. et al. The copper transporter CTRI regulates cisplatin uptake in Saccharomyces cerevisasiae. // Mol Pharmacol. 2002. -Vol. 62.-P. 1154-1159.

78. Ling Y.H., Priebe W. and Perez-Soler R. Apoptosis induced by anthracycline antibiotics in P388 parent and multidrug-resistant cells // Cancer Res.- 1993. Vol.53. - P.1845-1852.

79. Liu W., Staecker H., Stupak H et al. Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells. // Neuroreport. 1998. - Vol. 9.-P. 2609-2614.

80. Mandic A. Cisplatin induces endoplasmatic reticulum stress and nucleus-independent apoptotic pathway. // J Biol Chem. 2003, - Vol. 278. - P. 9100-9196.

81. Mani S: Graham M.A. Bregman D.B., et al- Oxaliplatin: a review of evoling concepts //Cancer Invest.- 2002 Vol. 20 - P.246-63:

82. Mattern J., Stammler G., Koomagi R. et al. Spontaneous apoptosis in ovarian-cancer: an unfavorable prognostic factor: // Int J Oncol: — 1998. — Vol. 12.-P. 351-354.

83. Meyerhardt J.A., Fuchs C.S. Chemotherapy options for gastric cancer. // Semin Radiat Oncol. 2002. Vol. 12. -P: 176-186.

84. Mizutani Y., We X.X., Yoshida O. Chemoimmunosensitization of the T24 human bladder cancer line to Fas-mediated cytotoxicity and apoptosis by cisplatin and 5-fluorouracil. // Oncol Rep. -1999: Vol: 6: -P. 979-982.

85. Mu D:, Tursum M., Duckett D R. et al. Recognition and repair of compound DNA lesions (base damage and mismatch) by human mismatch repair and exicision repair systems. // Mol Cell Bioh 1997. - Vol. \1. - P: 760-769;

86. Muracami T, bis X, and? Cong J et al: Induction; of apoptosis by 5-Azacytidine: Drug Concentration-dependent Differences in Cell Cycle Specificity // Cancer Res. -1995. Vol.55. P.3093-3098:

87. Nagata J., Kijima H., Hatanaka H. et al. Reversal of drug resistance using hammerhead ribozymes against multidrug resistance-associated protein and multidrug resistance 1 gene. // Int J Oncol. 2002. - Vol. 21. - P. 10211026.

88. Najajreh Y., Perez X.M., Nawarro-Ranninger C. et ah. Novel soluble cationic trans-diaminedichloroplatinum(II) complexes that are active against cisplatin resistant ovarian cell lines. // J Med Chem. 2002. - Vol. 45.-P. 5189-5195.

89. Negoescu A., Lorimier P., Labat-Moleur F. et al. TUNEL: Improvement and evaluation of the method for in situ apototic cell identification. // BIOCHEMICA. -1997. -No.2.

90. Nehme A., Baskaran R., Nabel S. et al. Induction of JNK and c-Abl signaling by cisplatin and oxaliplatin in mismatch repair-proficient and -deficient cells. // Br J Cancer. 1999. - Vol. -79. - P. 1104-1110.

91. Niedner H., Christen R., Lin X. et al. Identification of genes that mediate sensitivity to cisplatin. // Mol Pharmacol. 2001. - Vol. 60. - P. 11531160.

92. Orih M. Fertig G. Presentation of an Assay Format for the Specific Assessment of Caspase 3. // BIOCHEMICA.- 2000.- Vol 4.- P- 35-38.

93. Pasetto L.M., D'Andrea M.R. et al. The development of platinum compounds and their possible combination. // Critical Reviews in Oncology// Hematology 2006 - Vol.60 - P.59-75.

94. P. Perego, L. Gatti and S.C. Righetti et al., Development of resistance to a trinuclear platinum complex in ovarian carcinoma. // Int J Cancer.- 2003.-Vol. 5.- P. 617-624.

95. Pestell K.E., Hobbs S.M., Titley J.C. et al. Effect of p53 status on sensitivity to platinum complexes in a human ovarian cancer cell line. // 2000.-Vol. 57.-P. 503-511.

96. Prchal J:T., Throckmorton D.W:, Caroll A-J. et al. A common progenitor for human myeloid and lymphoid cells // Nature. -1978: -Vol 274. -P.590-5911

97. Rabik CIA Dolan M.E. Molecular mechanisms of resistance and toxicity associated with platinating agents.//Cancer Treatment Reviews-2007-Vol.33-P. 9-23

98. Reed E. Platinum analogs. In: De Vita V.T., Hellman S A. Eds. Cancer principles and practice of oncology. Philadelphia: JB Lippincort. // 1993. -P. 390-400

99. Reed E. Platmum-DNA adduct< nucleotide excision repair, and platinum based anti-cancer chemotherapy. // Cancer Treat Rev. 1998: - Vol. 24. -P.331-344.

100. Reed E. Cisplatin: // Cancer Chemother Biol Response Modif. 1999. -Vol. 18. -P.145-152.

101. Riedl SJ, Shi Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis.//Nat Rev Mol Cell Biol. -2004. Vol 11/- P.897-907.

102. Rose W., Schuring J. Preclinical antitumor and toxicological proffle of carboxyplatin. // Caner Treat Rev. 1985. - Vol. 18.-P. 1-19.

103. Sandercock J., Parmar M.K., Torn V. et al. First line treatment for advanced ovarian cancer: paclitaxel, platinum and the evidence. // Br. J. Cancer. 2002. - Vol: 87. - P. 815-824.

104. Schaaf G.J., Maas R.F., de Groene E.M et al. Management of oxidative stress by heme oxygenase-1 in cisplatin-induced toxicity in renal tubular cells. // Free Radic Res. 2002. - Vol. 36. - P. 835-843.

105. Scheeff E.D., Briggs J.M., Howell S.B. Molecular modeling of the intrastand guanine-guanine DNA adducts produced by cisplatin and oxaliplatin. // Mol Pharmacol. 1999. - Vol. 56. - P. 633-643.

106. Screnci D., Er H.M., Hasmbley T.W. et al. Stereoselective peripheral sensory neurotoxicity of diaminocyclohexane platinum enantiomers related to ormaplatin and oxaliplatin. // Br J cancer. 1997. - Vol. 7. - P. 502-510.

107. Sen S. and D'lncalci M. Apoptosis: biochemical events and relevance to cancer chemotherapy // FEBS Lett. -1992. -Vol307. -P.122-127.

108. Sessa S., Capri G., Gianni L. et al. Clinical and pharmacological phasel study with accelerated titration design of a daily times five schedule of BBR3464, a novel cationic triplatimim complex. // Ann Oncol. 2000. -Vol. 1 l.-P: 977-983.

109. Sharp S.Y, O'Neill C.F., Rogers P. et al. Retention of activity by the new generation platinum agents AMD0473 in four human tumor cell lines possessing acquired resistance to oxaliplatin. // Eur J Cancer. 2002. - Vol. 38.-P. 2309-2315.

110. Shen D.W., Goldenberg S., Pastan I. et al. Decreased accumulation of 14C.carboplatin in human cisplatin-resistant cells results from reduced' energy-dependent uptake. // J cell Physiol. 2000. - Vol. 183. - P. 108116.

111. Skladanowski A. and Konopa J. Adriamycin and daunomycin induce programmed cell death-(apoptosis) in tuinor cells // Biochem. Pharmacol. -1992. -Vol.46. -P.375-382.

112. Steart D.J. Mechanisms of resistance to cisplatin and carboplatin//Critical Reviews in Oncology/Hematology -2007- V.63-P. 12-31

113. C.N. Sternberg, P. Whelan and J. Hetherington et al., Phase Ш trial of satraplatin, an oral platinum plus prednisone versus prednisone alone in patients with hormone-refractoiy prostate cancer// Oncology. -2005,- Vol. 1.-P.2-9.

114. Storlad В., Pavlakis N. Oxaliplatin for the treatment of cisplatin -resistant cancer: A systematic review. // Cancer Treatment Reviews -2007. Vol.33. - P.347-357

115. Susan Elmore. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. // Toxicol Pathol. 2007. - Vol: 35.- P. 495-516.

116. Takemura G., Fujiwara H. Morphological- aspects of apoptosis inheart diseases. // J Cell Mol Med.- 2006. Vol. 10. P.56-75.

117. Tanaka M., Kuwahara E., ShimizuT. et al. New drug BMS-182751. // Biol Pharm Bull. 1999. - Vol. 22. - P.521-526.

118. Tokuchi Y., Isobe H., Takekawa H. et al. Predicting chemotherapeutic response to small-cell lung cancer of platinum compounds by thallium-201 singlphoton emission computerized tomography. // Br J Cancer. - 1998. -Vol. 77. -P.1363-1368.

119. Veal G.J., Griffin M.J., Price E. et al. A phase 1 study in paediatric patients to evaluate the safety and pharmacokinetics of SPI-77, a liposome encapsulated formulation of cisplatin. // Br J cancer. 2001. - Vol.84. - P. 1029-1035.

120. Wan-Long Lin, Ding-Guo Li. et al. Clinical and experimental study of oxaliplatin in treated human gastric carcinoma. // World J. Gastroenterol -2004- Vol. 10(19) P.2911-2915.

121. Woessman W., Chen X., Borkhardt A. Ras-mediated activation of ERK by cisplatin induces cell death independently of p53 in osteocarcoma and neuroblastoma cell lines. // Cancer Chemother Pharmacol. 2002. - Vol. 50.-P. 397-404.

122. Wyllie A.H., Morris R.G., Smith A.L. and Dunlop D. Chromatin cleavagein apoptosis: association with condensed chromatin morphology and139dependence on macromolecular synthesis // Am. J. Pathology. -1984. -V.142. -P.67-77.

123. Yamada H., Uchida N., Maekawa R. et al. Sequence-dependent antitumor efficacy of combination chemotherapy with nedaplatin, a newly developed platinum, and paclitaxel. // Cancer Lett. 2001. - Vol. - 172. - P.17-25.

124. Yunmbam M.K., Li Q.Q., Mimnaugh E.G. et al. Effects of the proteasome inhibitor ALLnL on cisplatin sensitivity in human ovarian tumor cells. // Int J Oncol. 2001. - Vol. 19. - P.741-748.

125. Zhang W., Zhang C., et al. Nuclear translocation of apoptosis inducing factor is associated with cisplatin induced apoptosis in LNCaP prostate cancer cells.// Cancer Latters 2007- Vol.255.- P.127-134

126. Zhang Т., Guan M., Jin H.Y., Lu Y. Reversal of multidrug resistance by small interfering double-stranded RNAs in ovarian cancer cells. // Gynecol Oncol.- 2005.- Vol. 97.- P. 501-507.

127. Zhen W., Link С J., O'Connor P.M. et al. Increased gene-specific repair of cisplatin interstand crosslinks in cisplatin resistant human ovarian cancer cells. // Mol Cell Biol. 1992. - Vol. 12. - P.3689-3698.

128. Zhong X., Li X., Wang G., et al. Mehanisms underlying the synergistic effect of SU5416 and cisplatin on cytotoxicity in human ovarian tumor cells.// Int S Oncol.- 2004.- Vol. 25. P. 445-51.

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Сравнительная оценка индукции апоптоза производными платины in vitro

Автореферат диссертации по медицине на тему Сравнительная оценка индукции апоптоза производными платины in vitro

Оглавление диссертации Огородникова, Мария Владимировна :: 2009 :: Москва

Введение диссертации по теме "Онкология", Огородникова, Мария Владимировна, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Сравнительная оценка индукции апоптоза производными платины in vitro"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Огородникова, Мария Владимировна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций