Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Апоптоз-регулирующая активность ксимедона

на правах рукописи

РГБ ОД

0 0 !М!)2

ЧЕРЕПНЕВ Георгий Валентинович

АПОПТОЗ-РЕГУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ КСИМЕДОНА

14.00.25 — фармакология, клиническая фармакология

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

АВТОРЕФЕРАТ

Казань — 2002

Работа выполнена в Казанском государственном медицинском университете

Научный консультант:

доктор медицинских наук, член-корреспондент АНТ, профессор Гараев Р.С.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Дурнев А.Д.; доктор медицинских наук, Горбунов С.М; доктор биологических наук, профессор Винтер В.Г.

Ведущая организация: Российский государственный

медицинский университет, кафедра молекулярной фармакологии, г. Москва

Защита состоится 31 мая 2002 г. в 9 30 на заседании диссертационного совета Д 208.034.01 Казанского государственного медицинского университета (420012, Казань, ул. Бутлерова, 49). , >,

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского

государственного медицинского университета (420012, Казань, ул. Бутлерова, 49, корпус "Б").

Автореферат разослан "_" апреля 2002

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Киясов А. П.

РД/,7-!- £

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Прогресс в фундаментальных исследованиях программированной клеточной гибели (ПКГ) создает предпосылки для применения полученных результатов в экспериментальной и клинической медицине. ПКГ (апоптоз) — естественный физиологический многоэтапный процесс, в результате которого элиминируются "отработавшие" или поврежденные клетки и обеспечивается баланс между пролиферацией и гибелью клеточных популяций в многоклеточном организме.

Широкий спектр заболеваний сопряжен с нарушением регуляции апоптоза. Недостаточность апоптоза характерна для аутоиммунных болезней, злокачественных опухолей, гемобластозов, аллергических заболеваний, лекарственной устойчивости к антибластомным препаратам (Ярилин A.A., 1996; Напnun, 1997). Усиление апоптоза регистрируют при ишемическом повреждении тканей, генерализованных бактериальных и вирусных инфекциях, иммунодефицитах, дефектах эмбрионального развития, нейродегенеративных заболеваниях, замедлении регенерации клеток, лучевой болезни, интоксикациях, глюкокортикостероидной терапии (Ярилин A.A., 1998). В связи с этим фармакологи и клиницисты считают приоритетным направлением изыскание соединений с регулирующим воздействием на ПКГ как среди новых химических веществ, так и известных лекарственных средств (Утешев Д.Б. и др., 1998; Schmitt, Lowe, 1999). Общая фармакология апоптоза становится областью пристального внимания (Ward et al., 1999), а понимание возможностей медикаментозного контроля апоптоза приобретает растущее значение для фармацевтической промышленности (Kinloch et al„ 1999).

Поиск регуляторов апоптоза имеет предпочтительные шансы на успех в тех фармакологических группах, представители которых обладают широким спектром биологических эффектов в различных тканях-мишенях. Пристальное внимание в этом аспекте привлекает лекарственный препарат ксимедон, принадлежащий к классу пиримидиновых производных.

Ксимедон (1,2-duzudpo-4,6-duMemun-N-(ß-oi<cu3mun)-nupuMudoH-2), синтезированный в ИОФХ им. акад. А.Е. Арбузова КНЦ РАН (Резник B.C., Пашкуров Н.Г., 1966), является одним из наиболее простых негликозидных пиримидин-нуклеозидов. Ксимедон был выбран из ряда структурных аналогов и впервые фармакологически изучен как стимулятор регенерации И. В. Заиконниковой, Н.Г.

Абдрахмановой и С.М. Горбуновым (1979). С 1993 года препарат разрешен для промышленного производства и клинического применения в комплексной тера-пиии ожоговых больных (приказ МЗ РФ №287 от 07.12.93; регистрационное удостоверение № 93/287/7).

Обнаружены и исследованы различные фармакологические свойства кси-медона: радиопротекторное (Цибулькин А.П. и др., 1992), противовоспалительное (Цибулькин А.П. и др., 1993), противовирусное (Поздеев O.K., 1993), ангио-протекторное и антиатеросклеротическое (Ибрагимов О.Б. и др., 1996), антиагре-гационное (Цибулькин А.П. и др., 1996), антистрессорное и мембраностабилизи-рующее (Гараев P.C. и др., 1997). Показана способность ксимедона стимулировать посттравматическую регенерацию периферического нерва (Рагинов И.С., 2000) и повышать эффективность противовирусной вакцинации (Ильясова Г.Ф., 2000). Установлен системный характер иммуномодулирующего действия ксимедона и раскрыты механизмы этого эффекта (Слабнов Ю.Д., 1998). Опыт использования ксимедона в клинической практике обощен Измайловым С.Г. и др. (2001).

Однако, несмотря на обилие экспериментальных и клинических результатов, не разработана интегральная концепция, обобщающая в единых рамках многообразие фармакологических эффектов ксимедона в контексте потенциальной апоптоз-регулирующей активности препарата. Расшифровка механизмов реализации последней имеет самостоятельное научное значение для фундаментальных представлений о регуляции апоптоза и роли пиримидиновых производных в ПКГ, а идентификация апоптоз-модулирующей активности ксимедона может служить обоснованием его клинического применения по новым показаниям.

Цель исследования — определить основные механизмы апоптоз-регулирующей активности ксимедона.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние ксимедона на коэкспрессию человеческих белков ингибиторов апоптоза BCL-2 и BAG-1.

2. Изучить действие ксимедона на трансмембранный потенциал митохондрий (Дут) в эффекторной стадии апоптоза.

3. Оценить способность ксимедона предотвращать потерю фосфатидилсе-риновой асимметрии клеточной мембраны в пост-митохондриальной стадии апоптоза.

4. Изучить влияние ксимедона на изменение проницаемости цитоплаз-матической мембраны в процессе программированной клеточной гибели.

5. Разработать цитофлуориметрический метод одновременного определения трансмембранного митохондриального потенциала (А\;;т) и фосфатидилсе-риновой асимметрии мембраны тромбоцитов человека в цельной крови ex vivo.

6. Исследовать влияние ксимедона на трансмембранный митохондриаль-ный потенциал (Аут) и экспрессию фосфатидилсерина при конститутивной апоптоз-подобной гибели тромбоцитов человека in vitro.

7. Изучить влияние ксимедона на трансмембранный потенциал клеток прокариот (Е. coli), испытывающих дефицит питательного субстрата.

8. Охарактеризовать влияние ксимедона на активность полифункционального фермента ДНК-топоизомеразы I, участвующего в репликации, транскрипции, репарации ДНК и апоптозе.

9. В тест-системах различного уровня организации (про- и эукариоты) исследовать ксимедон на наличие генопротекторных свойств, составляющих предпосылку апоптоз-ингибирующей активности.

10. Осуществить пилотную клиническую оценку ксимедона при состояниях, характеризующихся повышенным уровнем индукции повреждений ДНК (хронический остеомиелит) и ускорением темпов программированной клеточной гибели (дистанционная у-терапия).

Научная новизна. Впервые на основании комплексного исследования апоптоз-регулирующей и антимутагенной активности негликозидного аналога пи-римидин-нуклеозидов препарата ксимедона установлена его антиапоптогенная активность в CD4+ Т клетках Jurkat и рабдомиобластах человека и раскрыты следующие механизмы этого эффекта: стимуляция коэкспрессии белков репрес-соров апоптоза BCL-2 и BAG-1; торможение падения трансмембранного митохондриального потенциала; поддержание фосфатидилсериновой асимметрии клеточной мембраны; ограничение роста проницаемости цитоплазматической мембраны.

Впервые показана избирательность антиапоптогенного действия ксимедо-на в отношении различных индукторов программированной клеточной гибели.

Разработан оригинальный цитофлуориметрический метод одновременного определения трансмембранного митохондриального потенциала (Дут) и фосфа-тидилсериновой асимметрии мембраны тромбоцитов человека в цельной крови ex vivo; впервые обнаружено, что при конститутивной каспаз-независимой апоп-тоз-подобной гибели тромбоцитов in vitro падение трансмембранного митохондриального потенциала предшествует потере фосфатидилсериновой асимметрии мембраны.

Установлен протекторный эффект ксимедона при изучении действия препарата на трансмембранный потенциал (Ду) в клетках £ coli, испытывающих дефицит питательного субстрата.

Впервые показано, что цитомегаловирус стимулирует митохондриально-зависимую программированную гибель рабдомиобластов человека in vitro, а кси-медон ограничивает этот процесс.

Впервые предложен фармакологический способ стимуляции коэкспрессии апоптоз-ингибирующих белков BCL-2 и BAG-1 в клетках человека транскрипци-онно-акгивным лекарственным препаратом ксимедон.

Научно-практическая значимость. Выявлены и экспериментально обоснованы новые показания к назначению ксимедона: 1) профилактика и/или торможение апоптоза при заболеваниях, сопровождающихся ускорением темпов ВС[.-2/ВАС-1/Дут-зависимой ПКГ; 2) защита от повреждающих эффектов эндо- и экзомутагенов, дефицит репарации ДНК.

В пилотных клинических исследованиях доказана генопротекторная активность ксимедона и его способность ограничивать повреждающие эффекты индукторов апоптоза (у-облучение) и мутагенов (кластогенные факторы сыворотки больных с хроническим гнойным воспалением).

Предложена схема скрининга фармакологических ингибиторов апоптоза с учетом их антимутагенной/ДНК-протекторной активности.

Дано предварительное экспериментальное обоснование для испытаний ксимедона в биотехнологическом производстве для замедления апоптоза и повышения производительности культур клеток-продуцентов.

Раскрытие клеточно-молекулярных механизмов антиапоптогенного и гено-протекторного действия ксимедона позволило сформулировать обобщающую концепцию, интегрирующую в единых рамках обнаруженные ранее гетерогенные фармакологические эффекты препарата и экспериментально обосновать расширение показаний к его применению. Положения, выносимые на защиту:

1. Лекарственный препарат ксимедон способен ингибировать программированную гибель клеток человека.

2. Механизмы антиапоптогеннного эффекта ксимедона опосредованы:

- стимуляцией коэкспрессии белков ингибиторов апоптоза ВС1-2 и ВАС-1;

- торможением перехода проницаемости митохондрий;

- поддержанием фосфатидилсериновой асимметрии клеточной мембраны;

- ограничением роста проницаемости цитоплазматической мембраны на дис-тальных этапах апоптотического каскада;

- стимуляцией активности фермента ДНК топоизомеразы I.

3. Антиапоптогенный эффект ксимедона проявляется в ядросодержащих клетках различной гистогенетической принадлежности, но отсутствует в безъядерных тромбоцитах.

4. Антиапоптогенное действие ксимедона избирательно в отношении индуктора программированной клеточной гибели: ксимедон защищает клетки от апоптоза, вызванного дефицитом сывороточных факторов роста, ингибитором ДНК топоизомеразы I камптотецином и цитомегаповирусом человека, но не предотвращает Раз/С095-стимулированный апоптоз.

5. Ксимедон обладает генопротекторным/антимутагенным эффектом, который сопряжен с антиапоптогенным действием препарата.

Внедрение результатов исследования. Использованные методы трехцветного цитофлуориметрического анализа программированной клеточной гибели лимфоидных популяций и тромбоцитов внедрены в клинико-лабораторную практику Республиканской клинической больницы №2 МЗ РТ и Института медицинской иммунологии Берлинского университета им. Гумбольдта.

Результаты исследования используются в преподавании соответствующих разделов студенческого практикума «Клиническая иммунология» в Институте медицинской иммунологии Берлинского университета им. Гумбольдта, на кафедре фармакологии КГМУ и кафедре микробиологии КГУ.

5

Апробация работы. Положения диссертации доложены и обсуждены на Международной конференции «Нейро-иммунные взаимодействия и окружающая среда», Санкт-Петербург, 1995; серии научных семинаров Института медицинской иммунологии Берлинского университета им. Гумбольдта, 1999; заседании научного общества фармакологов РТ, 2000, 4-ом Конгрессе РААКИ, Москва, 2001; Четвертой (1998) и Пятой (2000) международных школах иммунологии, Пущино; IV Съезде иммунологов и аллергологов СНГ, Москва, 2001; 18 Конгрессе Немецкого общества иммунологов, Галле, 2002.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 30 научных работ.

Работа выполнена: Основной экспериментальный материал получен в период с 1990 под 2001 гг. во время учебы и работы на кафедре клинической иммунологии и аллергологии Казанского государственного медицинского университета; на кафедре фармакологии КГМУ; в лаборатории генетической токсикологии кафедры микробиологии Казанского государственного университета; в институте медицинской иммунологии Берлинского университета им. Гумбольдта, клиника Шарите, ФРГ; в Республиканском медицинском диагностическом центре МЗ РТ и в РЦПБ СПИД МЗ РТ. Клинические серии исследований выполнены на кафедре общей хирургии КГМУ в сотрудничестве с доц. В.Ю. Терещенко и к.м.н. К.В. Малышевым и в КОЦ МЗ РТ в сотрудничестве с д.м.н. A.B. Гилевым и д.м.н. Ю.Д. Слабновым (РКБ2 МЗ РТ).

Автор выражает искреннюю признательность коллективам указанных учреждений и особо благодарит ученых, под влиянием которых сформировалось его научное мировоззрение: доцента И.Е. Черепневу (КГУ), профессора И.А. .Студенцову (КГМУ),-профессора Йорга Раймаиа (институт мвдицинскои микро-" биологии и иммунологии, Университет Ульма, ФРГ) и доктора медицины Флориа-на Керна (институт медицинской иммунологии, Берлинский университет им. Гумбольдта, клиника Шарите, ФРГ).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы (65 отечественных и 283 иностранных источника). Работа объемом 240 страниц включает 28 таблиц и иллюстрирована 15 рисунками.

Содержание работы Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть работы выполнена на перевиваемой линии Т клеток человека Jurkat, линии рабдомиобластов человека RD, краткосрочных культурах периферических мононуклеаров доноров и спленоцитов линейных (СВАхС57В1) мышей, тромбоцитах доноров ex vivo, а также на беспородных белых мышах, В работе использован набор тестерных штаммов микроорганизмов Salmonella typhimurium, Е. coli', Bacillus subtilis и штамм цитомегаловируса человека CMV493, применявшийся для индукции апоптоза in vitro.

Исследования проведены на 280 мышах. Фракцию периферических мононуклеаров выделяли из венозной крови 33 доноров. Тромбоциты изучали в краткосрочных культурах разведенной венозной крови.

В исследованиях in vivo на лабораторных животных использовали дозы ксимедона 3, 30 мг/кг массы, что соответствует 0.0007, 0.007 LD50, которая составляет 4200 мг/кг (Горбунов С.М., 1979). В исследованиях in vitro и ex w'vo использовали концентрации 0,1 -1 мМ,

Методы регистрации ПКГ. Апоптоз-регулирующую активность ксимедона на уровне отдельной клетки оценивали методом проточной цитофлуориметрии на приборе "FacsCalibur" (ßecfon Dickinson). Для стимуляции программированной клеточной гибели применяли пять индукторов апоптоза с различными механизмами действия (табл. 1). Регистрировали семь маркеров программированной клеточной гибели, поэтапно характеризующих цепь событий апоптотического каскада (табл. 2).

Таблица 1. Использованные индукторы апоптоза и механизмы их действия.

Стимулятор апоптоза механизм реализации

1. бессывороточная среда инкубации дефицит факторов роста и дифференциров-т

2. цитостатик камптотецин 5 - 25 цМ ингибиция ДНК топоизомеразы I

3. aHTH-CD95 IgM мАТ 1 мкг/мл С0951_/С095 сигнальный путь

4. протонофор mCICCP 10 - 50 цМ разобщение дыхания митохондрий, 4.Дут*

5. цитомегаловирус CMV-493 цитопатическая репликация вируса

*Дут-трансмембранный митохондриальный потенциал

Маркер Реагент/производитель Методика

1. внутриклеточная экспрессия белка ингибитора апоптоза ВС1-2 aHTH-BCL-2-FITC мАТЮако Macho et al., 1996.

2. внутриклеточная экспрессия белка ингибитора апоптоза ВАС-1 анти-BAG-l +анти-1д-Р1ТС мАТ/ CN Biosciences, Inc. Протокол производителя, 1999

3. переход проницаемости митохондрий Лут-чувствитепьный флуорохром CMXRos Red/Molecular Probes Macho et al., 1996.

4. экспрессия фосфати-дилсерина липофильный флуорохром Ме-роцианин 540/S/gma Аннексии V-PEJPharMingen Mower et al., 1994. Протокол производителя, 1999

5. проницаемость плазматической мембраны флуорохром Пропидиум йо-дид/S/gma Mower et al., 1994.

6. линейный размер клетки прямое световое рассеяние Darzynklewicz et al., 1997.

7. гранулярность цитоплазмы боковое световое рассеяние Darzynkiewicz et al., 1997.

На каждый вариант опыта просчитывали не менее 25000 жизнеспособных клеток в серии из 3-4 независимых экспериментов. Перед каждым экспериментом проводили калибровку прибора при помощи флуоресцирующих микросфер (Becton Dickinson). Некротические клетки исключали на основании параметров бокового и прямого светорассеяния и окрашивания пропидиум йодидом. Результаты измерений записывали и анализировали в программе CellQuest (Becton Dickinson).

-Влияние ксимедона на трансмембранный потенциал клеток £ со// в условиях роста бактериальной популяции на минимальной среде изучали методом проточной цитометрии по Novo et al., (1999) в нашей модификации, заключающейся в использовании потенциал-чувствительного флуорохрома CMXRos.

Методы оценки геиотоксичности. Репаративный синтез ДНК, отражающий эксцизионную репарацию ДНК, оценивали в соответствии с протоколом, предложенным Белицким Г.А., Бодуновой И.В. (1982). Включение 3Н-тимидина в ДНК лимфоцитов определяли прямым жидкостным сцинтилляционным счетом радиоактивности (Martin et al., 1978).

Активность ДНК топоизомеразы I в ядерных экстрактах спленоцитов мышей регистрировали по степени релаксации суперскрученной ДНК плазмиды риС19, используемой в качестве субстрата (Баснакьян А.Г. и др., 1989). Электрофорез ДНК проводили в 0.8% агарозе, электрофореграммы окрашивали бромистым этидием (Маниатис Э. и др., 1984) и фотографировали в ультрафиолете. Единицей активности считали количество фермента, необходимое для релаксации 1 мкг ДНК за 1 ч при 37° С. Расчет активности проводили на уровне 50% релаксации ДНК плазмиды, который устанавливали денситометрией негативов электрофореграмм.

Кластогенную и антикластогенную активность ксимедона исследовали в тесте на индукцию микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей. Цитогенетический эффект препарата регистрировали по критерию хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей. (Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ. ВОЗ, Женева, 1989).

Способность ксимедона индуцировать или предотвращать возникновение точковых мутаций изучали в тесте Эймса (Ames, 1975), который проводили в соответствии с методическими указаниями Фонштейна М.М. и др. (1985). ДНК-повреждающую активность оценивали в тесте на репарацию ДНК в мутантных штаммах Е. coli, дефектных по различным путям репарации (Абипев С.К., Поро-шенко Г.Г., 1986). Влияние ксимедона на SOS ответ клетки, включающий склонную к ошибкам SOS-репарацию ДНК и активацию профага, определяли в SOS-хромотесте (Quillardet, 1982) и в тесте на индукцию профага (Heinemann, 1971). В генетических исследованиях в качестве препарата сравнения использовали ме-тилурацил, а также соединения с установленной антимутагенной (пара-аминобензойная кислота) и мутагенной (нитрозометилмочевина, нитрозогуани-дин, налидиксовая кислота, митомицин С, циклофосфан) активностью.

В клинической серии изучали влияние ксимедона на индукцию повреждений ДНК (микроядра и хромосомные аберрации) в клетках периферической крови 41 больного с хроническим остеомиелитом и лечебно-профилактическое действие 5% ксимедоновой мази на острое лучевое повреждение кожи при дистанционной Y-терапии у 42 больных злокачественными опухолями головы и шеи.

Больные с хроническим остеомиелитом в послеоперационном периоде получали ксимедон в суточной дозе 30 мг/кг per os в три приема в течение 15 дней. Частоту микроядерных полихроматофильных эритроцитов (мПХЭ) периферической крови определяли при поступлении и через 15 дней после операции. Учет хромосомных аберраций (ХА) в лимфоцитах периферической крови проводили перед началом курса, каждые два дня в течение приема препаратов и через 5 дней после завершения курса терапии (Руководство ВОЗ, Женева, 1989).

Ксимедоновую 5% мазь наносили тонким слоем на кожные покровы в проекции полей облучения непосредственно перед облучением и через 5 часов после него. Суммарная поглощенная доза для всех пациентов со злокачественными опухолями головы и шеи составила 40±4 Гр при одинаковом 5-дневном режиме фракционирования. Эффективность лечебно-профилактического действия препарата определяли по интенсивности острой лучевой реакции кожи (ОЛРК), степень тяжести которой (I-IV) оценивали, сравнивая облученный и прилегающий интактный участки кожи по критериям классификации ранних и поздних лучевых повреждений по Бардычеву М.С. (1987).

Статистическую обработку результатов исследования выполняли по критерию Колмогорова-Смирнова (программа CellQuest, Apple Macintosh Quadra 650), критерию -/-квадрат с коррекцией Yates для независимых и зависимых переменных, критерию Стьюдента и S-методу множественных сравнений Шеффе (программа STATISTICA).

Результаты исследования и обсуждение 1.Влияниексимедона на внутриклеточныеантиапоптоге н н ы е м е хан из-— мы.

Предполагая у ксимедона наличие апоптоз-регулирующей активности, мы опирались на три предпосылки: (1) фармакологический плейотропизм ксимедона, сочетающийся с цитопротекторным действием препарата, (2) стимулирующее влияние ксимедона на Т-клеточную дифференцировку и Т-зависимый иммунный ответ (Слабнов, 1998), (3) оригинальную концепцию усиления иммунного ответа, базирующуюся на подавлении апоптоза пула Т лимфоцитов (Kroemer et al., 1995).

На этом основании для исследования апоптоз-регулирующей активности ксимедона была выбрана линия человеческих Т лимфоцитов Jurkat, экспресси-

рующая CD3+TCRa¡3+CD4+CD8- фенотип. Известно, что продукт протоонкогена bcl-2 бепок BCL-2 относится к ключевым апоптоз-ингибирующим внутриклеточным регуляторам, повышающим устойчивость к апоптозу, вызванному широким спектром индукторов [р53-эависимый путь, церамид, глюкокортикостероиды, химиотерапия, фактор некроза опухоли а, недостаток факторов роста] в различных типах клеток (Zamzami et al., 1998). «Выключение» (knock-out) гена bcl-2 у мышей вызывает исчезновение лимфоидной системы после рождения (Nakayama et al., 1993). Учитывая роль bcl-2 в ПКГ и иммуногенезе, мы приступили к исследованию апоптоз-регулирующей активности ксимедона с изучения влияния препарата на внутриклеточную экспрессию BCL-2.

1.1. Ксимедон-зависимая экспрессия BCL-2. Т-лимфоциты человека линии Jurkat инкубировали в течение 72 часов в бессывороточной среде с 1 мМ ксимедона. Для определения уровня неспецифического связывания применяли изотипические lgG1-FITC антитела. В условиях проапоптогенного дефицита сывороточных факторов роста ксимедон в 1.51 раза повышал экспрессию BCL-2 в Т лимфоцитах человека линии Jurkat (табл. 3).

Таблица 3. Влияние ксимедона на экспрессию BCL-2 в условиях проапоптогенного дефицита сывороточных факторов роста (выборка п=105).

Условия эксперимента Экспрессия BCL-2*, М±т % к контролю Р

1. Изотип lgG1-FITC 36.31 ± 0.09 28.1 —

2. Контроль, (0) 129.10 ±0.21 100.0 P^O.OOI

3. Ксимедон, 1 мМ 194.90 ±0.33 150.9 Р2.3<0.001

'-условные единицы флуоресценции

Известно, что один из ключевых механизмов апоптоз-ингибирующей активности BCL-2 связан с предотвращением перехода проницаемости митохондрий [ППМ] (Zamzami et а!., 1998). ППМ — раннее необратимое событие апоптотиче-ского каскада (Hirsch et al., 1998), возникающее в результате неспецифического открытия митохондриальных пор перехода проницаемости [МППП] — мульти-компонентных белковых комплексов («мегаканалов»), встроенных в места контакта внешней и внутренней мембран митохондрий (Zamzami etal., 1998). МППП участвуют в регуляции Aij/m, Са2+, pH и объема матрикса митохондрии и функционируют как Са2+-, потенциал-, pH-, NAD(P)H2/NAD(P)-, редокс-зависимые каналы

(Ichas F. et al., 1997) с несколькими уровнями субпроводимости, допускающими транспорт определенных ионов и других растворенных веществ без неспецифического критического повышения проницаемости митохондриальной мембраны (Lemaster et al., 1998). Разнообразные проапоптогенные сигналы, конвергирующие на митохондриях (общая эффекторная/митохондриальная стадия апоптоза), стимулируют открытие МППП, что ведет к выравниванию зарядов по обе стороны внутренней мембраны митохондрии - ее деполяризации: падению трансмембранного митохондриального потенциала Дут (Green, Reed, 1998). В результате разобщается окислительное фосфорилирование, митохондрия набухает и дезинтегрирует (Qian et al., 1999); апоптогенные компоненты митохондриального мат-рикса (цитохром С, прокаспаза 9, A¡f-1) поступают в, цитоплазму, где активируют каспазы и нуклеазы, вызывающие деградацию ядерных белков и нуклеиновых кислот (Tafani et al., 2000, Винтер, 2000). Учитывая вышеизложенные соображения, мы исследовали влияние ксимедона на митохондриальную стадию апоптоза.

1.2. Действие ксимедона на трансмембранный митохондриальный потенциал. Переход проницаемости митохондрий определяли по изменению трансмембранного митохондриального потенциала (Дут), который регистрировали при помощи Лут-чувствительногс митохондриального флуорохрома CMXRos методом проточной цитометрии (Macho et al., 1996). Т лимфоциты Jurkat инкубировали в бессывороточной среде в течение 24 ч в присутствие ксимедона (1 мМ). Для изучения динамики Дут клетки были окрашены CMXRos в начале и через 24 ч инкубации.

прогрессирующее падение Лут, т.е. развитие перехода проницаемости митохондрий. Ксимедон ограничивал развитие ППМ, уменьшая в 1.9 раза величину падения Дут по сравнению с контролем (табл. 4).

Таблица 4. Влияние ксимедона на трансмембранный митохондриальный потенциал в условиях дефицита сывороточных факторов роста (выборка п=105).

Условия эксперимента Alf/m*, М + m % к контролю Р

1. Контроль, 0 ч 363.32 ± 0.48 100.0 —

2. Контроль, 24 ч 238.40 ± 0.35 65.6 Pi-2<0.001

3. Ксимедон 1 мМ, 24 ч 297.70 ± 0.41 81.9 Pj.3<0.001

•-условные единицы флуоресценции

Известно, что антиапоптозный белок ВС1.-2 препятствует открытию МППП, т.е. предотвращает падение Дут и переход проницаемости митохондрий {2атггт\ г\ а1., "1998). Поэтому было логично допустить, что ксимедон-зависимое ограничение деполяризации митохондрий связано со стимуляцией экспрессии ВСЬ-2. Это предположение мы проверили в серии экспериментов, где применили двойное окрашивание (анти-ВС1--2-Р1ТС мАТ + СМХЯоз), позволяющее на уровне отдельной клетки одновременно регистрировать экспрессию ВС1.-2 и Лут.

Камптотецин индуцировал разделение общей популяции Т клеток иигка! на две субпопуляции: ВС1_-2-низкоэкспрессирующую (рис. 1, А; регион (33; ВС1.-2Н-клетки) и ВСЬ2-высокоэкслрессирующую (рис. 1, А; регион 141; ВСЬ2(+)-клетки). Показательно, что в ВС1--2(+>-субпопуляции уровень Ац1т (рис. 1, В) был существенно выше, чем в ВС!_-2н-субпопуляции (Дч,твс1-2(<-/А\;/твс1-2(-) = 2.35), т.е. под действием камптотецина при падении экспрессии ВС1.-2 ниже 400 у.е. развивался переход проницаемости митохондрий. Предварительная инкубация клеток с ксимедоном увеличивала в 1.58 раза долю ВСЬ2,+)-клеток в камптотецин-экспонированной популяции (рис. 1, Э; регион Я.2). Важно, что клетки в регионе Я2 (рис. 1, Е.) сохраняли митохондрии в состоянии поляризации (Дутвс1_-2(+)/Ач/твс1..2(-) = 2.16), т.е. экспрессировали ВС!--2мДц/га<+>-фенотип. Показательно, что по морфологическим критериям (линейные размеры и гранулярность) ВС1-2мД\|/т(+)-клетки также не были апоптозными (рис. 1, С, Р.). Таким образом, кси-медон увеличивал долю ВС1.-2-высокоэкспрессирующих неапоптозных клеток с поляризованными митохондриями (ВС1.-2<+)Ауга<+,-фенотип) в Т-лимфоцитах линии Лгка^ инкубируемых с индуктором апоптоза камптотецином без сывороточных факторов роста.

Анализ профиля экспрессии ВСЬ2 (программа СеНОиеэЦ в регионе неапоптозных по критериям прямого и бокового светорассеяния клеток показал, что ксимедон на 52.5% увеличивал экспрессию ВС1.-2 по сравнению с контролем, что совпадает с результатами, полученными в предыдущих сериях (табл. 5).

Таблица 5. Влияние ксимедона на экспрессию BCL-2 в камптотецин-экспо-нированной популяции неапоптозных Т лимфоцитов Jurkat (выборка п=105).

Условия эксперимента Экспрессия BCL-2, M ± m % к контролю Р

1. Контроль 259.39 ± 0.77 100 —

2. Ксимедон 1 мМ 39S.61 ±1.14 152.5 Р,-2< 0.001

3. Камптотецин 25 цМ 530.20 ± 2.01 204.6 Р,.з< 0.001

4. Кс 1 мМ + Камп 25 цМ 798.82 ± 2.09 307.9 Рзч< 0.001

•-условные единицы флуоресценции

Т лимфоциты Jurkat, инкубируемые с камптотецином, также повышали экспрессию BCL-2. Регистрируемая стимуляция экспрессии BCL-2 в ответ на кам-птотецин согласуется с феноменом адаптивного синтеза BCL-2 в клетках, выживших после инкубации с противоопухолевыми препаратами доксорубицином и этопозидом (Tu et al., 1996). Предварительная обработка клеток ксимедоном в 1.5 раза усиливала BCL-2-опосредованный адаптивный ответ на камптотецин (табл. 5).

Полученные результаты еще раз подтверждают общее правило, что гиперэкспрессия BCL-2 предотвращает алоптоз, вызванный рядом противоопухолевых препаратов (Walczak et al., 2000). Регистрируемый бимодальный профиль экспрессии BCL-2 (рис. 1, А), отражает, очевидно, адаптивную реакцию, которая аппроксимирует двухфазный ответ митохондрий (гиперполяризация~адаптация/де-поляризация-срыв адаптации), наблюдаемый при камптотецин-индуцированном (Poot, Pierce, 1999) и стауроспорин-индуцированном апоптозе (Scarletta et al., 2000). Резюмируя изложенное, важно подчеркнуть, что увеличение под влиянием ксимедона доли неапоптозных Т лимфоцитов с поляризованными митохондриями (ВС1--2(+)Дут(+)-фенотип) в камптотецин-экспонированных клетках представляется вполне закономерным, так как профилактическое введение ксимедона стимулирует экспрессию BCL-2, кумулятивный синтез которого негативно коррелирует с апоптозным ответом (Nieves-Niera, Pommier, 1999).

1.3. Ксимедон-зависимая экспрессия BAG-1. Сравнительно недавно идентифицирован мультифункциональный протеин BAG-1, блокирующий аполтоз и взаимодействующий с несколькими классами белков (семейство BCL-2, киназа Raf-1, некоторые тирозинкиназы рецепторов факторов роста), а также с ядерными рецепторами глкжокортикоидов [негативный регулятор], эстрогенов, ретиное-

вой кислоты. Это взаимодействие осуществляется благодаря способности ВАС-1 регулировать Нзр70/Нвс70 семейство молекулярных шаперонов (Такауата е( а!., 1998). Нам не удалось обнаружить публикаций о влиянии синтетических лекарственных препаратов на экспрессию ВАС-1 в клетках зукариот. Исходя из функциональных ВСЬ2/ВАС-1 белок-белковых взаимодействий (Но1^е1с1, 1998), мы исследовали влияние ксимедона на экспрессию ВАС-1 в контексте развития перехода проницаемости митохондрий.

Т лимфоциты линии Л(я/саГ культивировали с 1 мМ ксимедона в течение первых суток в бессывороточной среде, после чего клетки обрабатывали 5 цМ камптотецина в течение четырех суток. Результаты регистрировали через пять суток от начала инкубации. Определяли экспрессию ВАС-1, трансмембранный ммтохондриальный потенциал (А^ш) и долю клеток, коэкспрессирующих высокий уровень ВАС-1 и Дут (ВАС-1 (+,Дгут<+,-субпопуляция).

Было обнаружено, что уровень экспрессии ингибитора апоптоза ВАС-1 позитивно коррелирует с величиной Дут: ВАС-1 м-экспрессирующие клетки (рис. 2, В, Е, Н, I., регион Р52) сохраняют митохондрии в состоянии поляризации, тогда как в ВАС-1 "-негативных клетках (регион КЗ) Дут падает, т.е. Д1|/тВАС-1(+)>Ач/тВАо-1(-) (рис. 2, С, Р, I, М). Ксимедон на 98.5% увеличивал, а камптотецин на 55.7% уменьшал долю ВАС-1 (+)Дут(+)-субпопуляции (регион (42) по сравнению с контролем (рис. 2, В, Е, Н, I) и табл. 6. Предварительная инкубация клеток с ксимедо-ном частично отменяла ингибирующий эффект камптотецина: ксимедон на 63% увеличивал число ВАС-1+-экспрессирующих клеток с поляризованнышимтохон-_ дриями_в.камптотецин-экспонированной популяц1^^ Общая тенденция

фармакологических эффектов ксимедона и камптотецина сохранялась при оценке количества неапоптозных клеток на основании параметров светорассеяния (рис. 2, А, Э, С, К, регион 141).

Таким образом, обнаружен не имеющий аналогов по действию транскрип-ционно-активный синтетический лекарственный препарат с низкой общей токсичностью, стимулирующий коэкспрессию антиапоптозных генов Ьс1-2 и Ьад-1, и тормозящий переход проницаемости митохондрий в клетках человека в условиях проапоптогенного дефицита сывороточных факторов роста. Ьегг^егБ е1 а1. (1998) указывают, что "создание блокаторов перехода проницаемости

A

10' 10" 10"

Side Scatter

D10

10'

Side Scatter

10' IF" to"

Side Scatter

Side Scatter

R 10u JO1 1(Г 10* 10ч BAG-1-FITC

. R2 ч?"

44%

10' to" 10" 10 BAG-1-FITC

¿¡¡¿¿h ... R2

? 198%

т;*"г"™гг

|Ъ

о —

о

L'tf

R2

72%

10

102 lt>3 104

BAG-1-FITC

BAG-1-FITC

§ Hi

§3 о

Q 0U 10' l<r 10* 10^ CMXRos

F mu

I''.....■■——»d

10* 10* 10J 104

КОНТРОЛЬ

CMXRos

КАМПТОТЕЦИН

■I,.....*1?"-чТ-

tov 101 10^ 10J

CMXRos

М 10

10* to2 to' IC

CMXRos

КСИМЕДОН КСИМЕДОН + КАМПТОТЕЦИН

Рис. 2. Влияние ксимедона на долю неапоптозных ВАС-1 -экспрессирующих клеток с поляризованными митохондриями [регион И2, ВАС-1 (+)СМХИоБ(+)фенотип] в Т клетках иигка^ обработанных камптотециноад.

Таблица б. Влияние ксимедона на количество ВАО-1мЛут<+)-клеток в Т-лимфоцитах .Уигка», инкубируемых с камптотецином в отсутствие сывороточных факторов роста.

Условия эксперимента всего клеток Число bag-VAV'- клеток % к контролю Р

1. Контроль 100000 7855 100.0 —

2. Ксимедон 1 мМ 100000 15592 198.5 Р,.2< 0.0001

3. Камптотецин 5 цМ 100000 3483 44.3 Р,.3< 0.0001

4. Кс 1 мМ + Камп 5 |дМ юоооо 5667 72.1 Рзч< 0.0001

митохондрий без иммуносупрессорной и других нежелательных биоактивностей представляет важную новую цель в разработке лекарственных препаратов". Патогенетическое значение перехода проницаемости митохондрий при ишемиче-ском повреждении кардиомиоцитов и нейронов (Halestrap et al., 2000), аутофагии состарившихся митохондрий в непролиферирующих клетках сердца, мозга, печени (Elmore et al., 1997), старении лимфоцитов (Mather, Rottenberg, 2000), цито-кин-индуцированном апоптозе ß-клеток поджелудочной железы (Saldeen, 2000), медикаментозной и алкогольной жировой дистрофии печени (Pessayre et al., 1999), синдроме Reye (Рея) (Lemasters et al., 1998), HBV-индуцированном повреждении гепатоцитов (Rahmani et al., 2000) открывает широкие перспективы для изучения применения ксимедона в качестве блокатора перехода проницаемости митохондрий при указанных состояниях. Вместе с тем, bcl-2/bag-1-индуцирующая транскрипционная активность ксимедона служит новым молекулярным обоснованием утвержденн^ранеепротивопоказаний(ле

нию препарата, особенно с учетом того, что козкспрессия BCL-2 и BAG-1 прогрессивно нарастает после иммортализации и трансформации клеток и коррелирует с повышением устойчивости к апоптозу, вызванному ДНК-повреждающими агентами (Yang X. et al., 1998,). С другой стороны, снижение экспресии BCL-2 и Душ при старении (Tamura A, Yui К, 1995; Rottenberg, Wu, 1997) позволяет рассматривать ксимедон в качестве потенциального геропротекгора.

Возможность одновременной стимуляции экспрессии антиапоптозных генов bd-2 и Ьад-1 при помощи малотоксичного дешевого соединения 1,2-дигидро-4,6-диметил-Ы-(р-оксиэтил)-пиршидон-2 открывает новые негеноинженерные перспективы повышения производительности промышленных клеток-продуцентов мо-

ноклональных антител и рекомбинантных белковых препаратов. В настоящее время с этой целью активно разрабатываются геноинженерные методы подавления апоптоза клеточных культур в биореакторах (Al-Rubeai, Singh, 1998). В указанном контексте наличие у ксимедона Ьс/-2АЬядг-1-индуцирующей транскрипционной активности является важным преимуществом, так как повышение коэкс-прессии белков BCL-2 и BAG-1 обеспечивает существенно более высокий уровень защиты от гибели, индуцированной различными апоптогенными стимулами, чем моноэкспрессия BCL-2 или BAG-1 (Takayama et al., 1995).

2. Влияние ксимедона на дистальные этапы апоптоза. Поскольку ан-тиапоптозный эффект ксимедона реализуется на проксимальном этапе апопто-тического каскада (переход проницаемости митохондрий), следовало ожидать, что препарат способен тормозить развитие дистальных признаков апоптоза, характерных для постмитохондриальной фазы деградации. К последним относят 1) экспрессию фосфатидилсерина (ФС) на внешнем слое цитоплазматической мембраны и 2) увеличение проницаемости цитоплазматической мембраны для низкомолекулярных соединений (Zamzami et al., 1998).

Высказанное предположение мы проверили в серии экспериментов, в которых клетки одновременно окрашивали двумя флуорохромами (Мероцианин 540 [МС540], и пропидий йодид [PI]). Известно, что апоптозные клетки, экспрес-сирующие ФС, связывают липофильный Мероцианин 540, но остаются непроницаемыми для пропидиум йодида, так как до определенного этапа сохраняют ин-тактную мембрану, и, следовательно, имеют MC540(+iPIH фенотип (Mower et al., 1994).

Т лимфоциты человека линии Jurkat инкубировали в бессывороточной среде с 1 мМ ксимедона. В качестве контроля использовали клетки, культивируемые без ксимедона. Результаты регистрировали через четыре и шесть суток от начала инкубации.

В сравнении с контролем (рис. ЗА, регион R2; рис. ЗВ, регион R1) к исходу четвертых суток ксимедон на 24% (Р<0.001) увеличивал долю неапоптозных МС540н-клеток (рис. 3D, регион R2) и на 21% (Р<0.001) долю Р1('-клеток с ин-тактной мембраной (рис. ЗЕ, регион R1), т.е. тормозил вступление клеток в ФС-положительную стадию апоптоза. Показательно, что экспрессия ФС (рис. ЗА, 3D; регион R3) коррелировала с приобретением морфологических маркеров апоптоза - увеличением гранулярности (SSC) и уменьшением диаметра (FSC) клеток

19

(рис. ЗС, 3F; регион R3), что подтверждает адекватность использованного метода.

Для выяснения, на каком этапе аполтотического каскада реализуется протекторное действие ксимедона, проводили анализ распределения популяции по параметрам клеточного диаметра и проницаемости мембраны на поздних сроках инкубации.

К исходу шестых суток культивирования контрольные клетки по показателям размера и проницаемости мембраны разделились на три субпопуляции (рис. 4, А): 1) субпопуляция R1 - клетки с нормальным диаметром и непроницаемой мембраной (FSChlflhPI!") фенотип), 2) субпопуляция R2 - клетки с малым диаметром и полунепроницаемой мембраной (FSC'°WPI("/+1 фенотип), 3) субпопуляция R3 - клетки с малым диаметром и проницаемой мембраной (FSC,owPlw фенотип). Используя возможности программного обеспечения CelIQuest, мы сопоставили уровень экспрессии ФС в контрольных и инкубируемых с ксимедоном клетках для каждой из указанных субпопуляций (рис. 4, В, С, D). Экспрессия ФС последовательно нарастала в ряду R1<R2<R3. Различия в уровне экспрессии ФС между контролем и опытом отсутствовали в субпопуляциях R1 (рис. 4В) и R3 (рис. 4D), но были значительны в субпопуляции R2 (рис. 4, С: контроль - 401.71 ±3.30 у.е.; ксимедон - 188.52±4.93 у.е., Р<0.001). Как и следовало ожидать на основании профиля экспрессии ФС, инкубируемые с ксимедоном клетки в субпопуляции R2 обладали на 51.2% (Р<0.001) меньшей проницаемостью мембраны для PI по сравнению с контролем. Для субпопуляции R3 разница в проницаемости PI между контролем и опытом составила 23.2% (Р<0.001).______

--Следовательно, ксимедон ингибировал преимущественно начальные этапы экспрессии ФС и раннего роста проницаемости плазматической мембраны, т.е. переход R1-» R2 [MC540HPI<') МС5401+>Р1<">], но не предотвращал при этом уменьшение диаметра (-объема) клеток. Таким образом, препарат подавлял экспрессию не только проксимальных, но и дистальных маркеров апоптоза, вызванного дефицитом сывороточных факторов роста.

Способность ксимедона ограничивать экспрессию фосфатидилсерина может быть результатом Ьс/-2-индуцирующей активности препарата, так как известно, что один из биологических эффектов BCL-2 — предотвращение экспрессии фосфатидилсерина (Martin et al., 1995).

КСИМЕДОН, 96 ч

Рис. 3. Влияние ксимедона на экспрессию фосфатидилсерина и увеличение проницаемости плазматической мембраны Т клеток Jurkat (регион R1 в условиях проапоптогенного дефицита сывороточных факторов роста: Р1(-)-непроницаемые клетки; регион R2: ФС(-)-неапоптозные клетки; регион R3: ФС(+)-алоптозные клетки).

Г5С-Не1яИ

Ш (РЗС^РГ) Я2 (Р8С,0И,РГ/;) 1ШР8С1оиРГ)

В

ю®

2 Л 1

I I

101 10* 10* МС540

104

Регион Ш

% 5

10° 10' 1С2 101 10* МС540

1V

Регион Л2

10" 10' 1£>г 101 10* --- МС540-

Регион ИЗ

Рис 4. Дифференцированное влияние ксимедона (1 мМ) на экспрессию ФС в различных субпопуляциях Т лимфобластов иигка1 (А) Вариабельность показателей размера (РБС) и проницаемости плазматической мембраны (Р1) в контрольных клетках через 6 суток инкубации в бессывороточной среде. Регионы Я2 и ЯЗ соответствуют популяциям, обсуждаемым в тексте. Межпо-пуляционная вариабельность экспрессии ФС через 6 суток инкубации: (В) Субпопуляция 1 - контроль, 2 - ксимедон, (С) Субпопуляция И2: 1 - контроль, 2 - ксимедон, (Б) Субпопуляция ИЗ: 1 - контроль, 2 - ксимедон.

3. Действие ксимедона на РА8/С095-стимулированный апоптоз. Установлено, что апоптоз, вызванный дефицитом факторов роста, химиотерапией, глюкокортикоидами, ионизирующей радиацией, является ВС1.-2-ингибируемым (Кгоетег, МагИпег-А, 1994; 1атгат\ е1 а1., 1998). Напротив, Т-клеточный апоптоз, индуцированный стимуляцией Раз/С095 рецепторов с последующей первичной активацией каспаз, как правило, ВС1_-2-резистентный (Метоп е1 а1., 1995; Б^п е{ а1., 1997). В связи с этим представляло интерес исследовать влияние ксимедона на апоптоз, стимулированный анти-С095 1дМ моноклональными антителами.

Т клетки Jurkat инкубировали с 1 мМ ксимедона в течение первых суток в бессывороточной среде, затем в культуру вносили анти-С095 1дМ мАТ в конечной концентрации 1000 нг/мл. Через двое суток от начала инкубации определяли экспрессию ВС1.-2 и фосфатидилсерина, проницаемость цитоплазматической мембраны, Л\>%, размеры и гранулярность клеток.

Стимуляция С095 рецептора эффективно индуцировала апоптоз Т клеток, регистрируемый по снижению экспрессии В С 1.-2 с 207.90+0.42 до 79.90±0.25 у.е. (Р<0.001) (рис. 5,С), падению Дц/т с 468.24±1.09 до 281.79+1.12 у.е. (Р<0.001) (рис. 5,0), уменьшению линейных размеров с 424.61±0.35 до 264.25+0.33 у.е. (Р<0.001) (рис. 5,В) и увеличению гранулярности клеток с 260.06+0.90 до 391.15±1.24 у.е. (Р<0.001) (рис. 5,В). В клетках, инкубированных с ксимедоном, после анти-С095 стимуляции экспрессия ВСЬ2 была на 32% выше, чем в анти-С095-стимулированных клетках, инкубированных без ксимедона (79.90+0.25 у.е. « 105.55±0.34 у.е., Р<0.001), а уровень митохондриального потенциала Дч/т был больше на 7.4% (281.79+1.12 у.е. 1« 302.72±1.26 у.е,, Р<0.001). Однако, это не предотвращало уменьшения линейных размеров и роста гранулярности клеток, т.е. инкубируемые с ксимедоном Т лимфоциты ЛигкаГ после анти-С095-стимуляции приобретали морфологические признаки терминальных этапов апоп-тоза (Рис. 5,Р) при сохранении общей тенденции к снижению экспрессии ВС1.-2 (Рис. 5,в) и падению митохондриального потенциала (Рис. 5,Н).

Для изучения влияния ксимедона на экспрессию фосфатидилсерина и проницаемость плазматической мембраны при С095-зависимом апоптозе клетки одновременно окрашивали мероцианином 540 и пропидий йодидом. Через 48 часов инкубации в бессывороточной среде доля неалоптозных МС540нР1("'-клеток составила 61.7+0.2% (табл. 7). Стимуляция анти-С095 антителами снизила долю

неапоптозных МС540(*)Р1(">-клеток до 3.2±0.07%. Профилактическое введение ксимедона незначительно повышало резистентность Т клеток к С095-индуци-рованному апоптозу: доля МС540нР1()-клеток увеличилась с 3.2+0.07% до 7.4±0.11% (табл. 7).

Таблица 7. Влияние ксимедона (1 мМ) на количество неапоптозных МС540(')Р1(')-клеток в анти-С095 стимулированных Т-лимфоцитах лишенных сыво-

роточных факторов роста.

Условия эксперимента всего клеток МС540,,Р11,-клетки Р

Аб.ч. / М±т,% % к контр

1. Контроль 50000 30855/61.7+0.2 -

2. aHTH-CD95 мАТ 50000 1592 / 3.2±0.07 5.2 Pi-2< 0.0001

3. Ксимедон 50000 33345 / 66.7±0.2 108.1 P-¡-3 < 0.0001

4. Кс+анти-С095 50000 3691 / 7.4±0.11 12.0 Р2-4 < 0.0001

Таким образом, несмотря на ограничение падения экспрессии BCL-2 в С095-стимулированных Т клетках, ксимедон не оказывал заметного апоптоз-ингибирующего эффекта при Сй95-индуцированном апоптозе. Этот противоречивый, на первый взгляд, результат получает объяснение, если учесть, что в Т клетках Jurkat функционирует С095-сигнальный путь i типа, реализующийся через Fas/DISC-опосредованную активацию каспазы-8 и далее каспазы-3, независимо от B¡d/BCL-2/i\ym митохондриального контура (Scaffidi et al., 1998,1999).

В естественных условиях Т клетки после антигенной стимуляции обычно экспрессируют BCL-2 и BCL-xL; неспособность последних блокировать Fas-опосредованный апоптоз позволяет элиминировать аутореактивные клетки и обеспечивает нормальную регуляцию иммунного ответа (Moreno et al., 1996). Поэтому отсутствие антиапоптогенного эффекта от ксимедон-стимулированной экспрессии BCL-2 в условиях Fas-зэвисимой гибели Т клеток может иметь позитивное значение для применения ксимедона в качестве физиологического иммуностимулятора с минимальным побочным про-аутоиммунным эффектом. Представляется вероятным, что ксимедон-индуцированная коэкспрессия BCL-2 и BAG-1 в Т клетках отчасти имитирует состояние физиологической Аг- или супер-Аг-стимулированной активации Т лимфоцитов in vivo, сопровождаемой временной (до 48 часов) блокадой апоптоза, необходимой для экспансии популяции, в

результате индукции генов-превенторов апоптоза, например, bag-1 (Yang Y. et al., 1998).

4. Протонофор-стимулированная деполяризация митохондрий.

Протонофорный разобщитель окислительного фосфорилирования карбонил цианид т-хлорофенил-гидразоном (mCICCP) вызывает быструю деполяризацию митохондрий вследствие прямого переноса протонов липофильной молекулой mCICCP по всей поверхности внутренней митохондриальной мембраны (Macho et al., 1996). В Т лимфоцитах Jurkat ксимедон в концентрации 1 мМ не предотвращал деполяризацию митохондрий, индуцированную 10-50 цМ mCICCP. На наш взгляд, это связано с тем, что белок BCL-2, экспрессию которого стимулирует ксимедон, будучи физиологическим ингибитором тока через митохондриальные поры перехода проницаемости, не может препятствовать mCICCP-индуциро-ванной деполяризации, развивающейся по МППП-независимому механизму.

5. Антиапоптогенный эффект кисмедона при вирус-индуцирован-ном апоптозе. Поскольку регенераторные и цитопротекторные эффекты ксиме-дона обнаружены в клетках различной гистогенетической принадлежности: мио-кардиоцитах (Кудашкин, 1997), нейронах (Рагинов, 2000), эндотелии сосудов (Ибрагимов, 1994), представляло интерес установить, сохраняет ли препарат апоптоз-регулирующую активность в нелимфоидных клетках и при действии биологических индукторов апоптоза. Мы исследовали влияние ксимедона на апоптоз эмбриональных клеток человека линии RD — недифференцированных раб-домиобластов, происходящих из поперечно-полосатой мускулатуры (Marchai et al., 1997).. ___

"Атголтоз клеток7?0 вызывали а) дефицитом сывороточных факторов роста и б) штаммом цитомегаловируса человека НСМ\/-493 в сочетании с дефицитом сыворточных факторов роста. Культуру ЯО инфицировали в момент времени ^ и инкубировали в течение 20 ч в бессывороточной среде, содержащей 1 мМ ксимедона, а также в среде без ксимедона. В качестве контроля использовали не-инфицированные клетки /?0, инкубируемые в бессывороточной среде с ксимедо-ном или без него. После завершения культивирования клетки отслаивали механически, отмывали и окрашивали флуоресцентными красителями, регистрирующими митохондриальный потенциал (СМХРоэ) и экспрессию фосфатидилсерина (МС540). Отсутствие сывороточных факторов в течение 20 ч инкубации вызыва-

по увеличение доли ФС-зкспрессирующих МС540(+)-клеток в 1.82 раза по сравнению с исходным уровнем, но не влияло на митохондриальный потенциал (табл. 8). При сочетанном действии НСМ\/-493 и дефицита сывороточных факторов роста через 20 часов регистрировали снижение митохондриального потенциала в 1.91 раза. Последнее, однако, не сопровождалось дополнительным приростом доли ФС-зкспрессирующей субпопуляции, т.е. аддитивный эффект НСМ\/-493 в отношении экспрессии ФС отсутствовал (табл. 8).

Таблица 8. Влияние ксимедона на митохондриальный потенциал и экспрессию фосфатидилсерина в НСМ\Л493-экспонированных клетках КО в условиях про-апоптогенного дефицита сывороточных факторов роста.

Флуоро-хром Время,ч Я О + НСМ\Л493

Контроль 1 ксимедон 1 мМ Контроль 3 ксимедон 1 мМ

2 4

СМХЯоэ, Ед. фл. 1 = 0 1 = 20 1414+10.45 1380±10.19 1236+9.72** 1414±10.45 740+5.91* 1115.4±6.77**

МС5401"'/ МС540(+), %/% ( = 0 1 = 20 78+6.2/22±1.3 60±3.9/40±2.1* 74±4.9*/26±1.3** 78+6.2/22+1.3 57+3.2/43±2.6* 50±3.0/50±3.0

достоверность отличий и 3((0)—3(е2о), Р < 0,01.

"достоверность отличий 1{4гс)—2^20) и З^го)—4{1М), Р < 0,01.

Ксимедон в 4.5 раза снижал прирост экспрессии ФС в клетках, лишенных сывороточных факторов роста, и в 2.25 раза уменьшал СМ\/-493-индуцированное падение митохондриального потенциала, не подавляя при этом экспрессию ФС в вирус-экспонированных клетках (табл. 8). Таким образом, в рабдомиобластах человека ксимедон дифференцированно ингибировал экспрессию митохондриаль-ных и мембранных маркеров ПКГ в зависмости от комбинации действующих про-апоптогенных факторов, которые, вероятно, а клетках Йй активируют различные сигнальные пути ПКГ. Заметим, что антиапоптогенный эффект ксимедона при дефиците сывороточных факторов роста сохраняется в клетках различной гисто-генетической принадлежности (Т лимфоциты и рабдомиобласты).

Впервые обнаружена возможность фармакологического подавления депо-ларизации митохондрий, индуцированной цитомегаловирусом человека. Это от-

крывает новые перспективы патогенетической терапии CMV-инфекции, которая сопровождается снижением Аг-индуцированного пролиферативного ответа и увеличением частоты апоптоза периферических лимфоцитов (van den Berg А.Р. et al„ 1995).

6. Ксимедон и апоптоз-подобная гибель тромбоцитов. Для подтверждения транскрипционно-зависимого характера антиапоптогенного эффекта кси-медона мы исследовали влияние препарата на "апоптоз-подобную конститутивную каспаза-независимую гибель тромбоцитов" человека in vitro (Brown et al., 2000). Для этого был разработан оригинальный метод трехцветного (CD61-FITC/AnnexinV-PE/CMXRos) проточного цитофлуориметрического анализа мито-хондриального потенциала и экспрессии фосфатидилсерина в тромбоцитах цельной крови. Впервые было показано, что при старении тромбоцитов человека, инкубируемых в бессывороточной среде, падение трансмембранного потенциала митохондрий тромбоцита предшествует исчезновению фосфатидилсериновой асимметрии тромбоцитарной плазматической мембраны, что повторяет последовательность событий апоптотического каскада для ядросодержащих клеток. Ксимедон in vitro в концентрации 1 мМ не влиял на динамику падения Д\ут и экспрессию фосфатидилсерина при старении тромбоцитов, инкубируемых в бессывороточной среде. Отсутствие антиапоптогенного эффекта ксимедона в безъядерных клетках косвенно свидетельствует в пользу bcl-2lbag-1-транскрипционно-зависимого механизма действия препарата.

В совокупности полученные результаты доказывают, что ксимедон как транскрипционно-активный лекарственный препарат увеличивает апоптозорези-

стентность различных типов ядерных клеток и регулирует фундаментальные ВСЬгУВАС-Шц/т-зависимые механизмы ПКГ, будучи протектором митохондри-альных функций. Кгоетег е1 а1. (1995) выделяют пять основных уровней реализации апоптоз-ингибирующих эффектов модуляторов апоптоза: 1) прямая нейтрализация апоптоз-индуцирующего сигнала до или во время взаимодействия со специфическими рецепторами 2) перепрограммирование клетки ко-стимулами (функциональный антагонизм) 3) подавление трансдукции сигнала 4) вмешательство в клеточный цикл 5) подавление катаболических реакций, вовлеченных в выполнение ПКГ. С переходом на более высокую ступень указанного ряда падает специфичность антиапоптогенного эффекта модулятора по отношению к

индуктору ПКГ и растет его общая токсичность. Например, большинство соединений, которые ингибируют ПКГ лимфоцитов in vitro на дистальных этапах апоп-тотического каскада (ингибиторы синтеза ДНК, РНК, белка, модуляторы транс-дукции сигналов, хелаторы Са2\ большие дозы Zn), не могут быть применены in vivo из-за неспецифического влияния на функцию многих типов клеток и значительного нарушения общего метаболизма (Kroemer, Martinez, 1994). Поскольку ксимедон смещает внутриклеточное равновесие в сторону синтеза антилетальных белков BCL-2 и BAG-1 и препятствует вступлению клетки в средние этапы апоптотического каскада (эффекторная/митохондриальная стадия ПКГ), то исходя из указанной классификации, уровень его апоптоз-ингибирующего эффекта соответствует второй ступени по классификации Kroemer (функциональный антагонизм). Для лекарственного препарата это является несомненным преимуществом, так как обеспечивает оптимальное сочетание защиты в отношении достаточно широкого спектра "частных" индукторов ПКГ ( сигнальные пути которых конвергируют на митохондриях), протекторный эффект в различных типах клеток и низкую общую токсичность.

7. Действие ксимедона на трансмембранный потенциал клеток прокариот. Основываясь на сходстве энергетической организации митохондрий и бактерий (цепь переноса электронов, протонный градиент, F0FrAT<t>a3a) и признании существования ПКГ в бактериальных популяциях (Ameisen, 1996; Lewis, 2000), мы исследовали влияние ксимедона на трансмембранный потенциал Ац/ бактерий на примере Е. coli (штамм 392), культивируемых на минимальной среде М9 (прокариотная аналогия проапоптогенного дефицита сывороточных ростовых факторов). У бактерий, не имеющих митохондрий, как компонент протонодви-жущей силы вовлечен в генерацию АТФ, транспорт глюкозы, хемотаксис и выживание при низком pH (Novo et al., 1999). Ксимедон в концентрации 1 мМ вносили в культуру с наступлением фазы несбалансированного роста, клетки инкубировали в течение 24 часов, за 10 минут до завершения инкубации в культуру добавляли Ду-чувствительный флуорохром CMXRos в конечной концентрации 3.5 цМ. Клетки отмывали центрифугированием, фиксировали в 1% растворе забуференного параформальдегида и анализировали на проточном цитометре в программе CellQuest.

Через 24 ч инкубации ксимедон (1 мМ) увеличивал значение мембранного потенциала на 39.6% по сравнению с контролем (40,97±0 ,11 у.е. vs 57,20±0,14 у.е., Р<0.001), т.е. способствовал сохранению энергообеспечивающего протонного градиента и целостности плазматической мембраны в условиях исчерпания питательного субстрата. Полученные результаты согласуются с допущением о существовании гомологий в ряду бакгерия-митохондрия-эукариотическая ПКГ (Lewis, 2000) и предполагают влияние ксимедона на эволюционно консервативные механизмы регуляции ПКГ. Одним из последних может быть система коли-цинов — канал-образующих бактериальных белков, демонстрирующих структурное сходство с семейством BCL-2, и потому рассматриваемых как возможный эволюционный предшественник апогттотической машины зукариот (Green, Reed, 1998).

8. ДНК-топоизомераза I. Учитывая антиапоптогенный эффект ксимедона в отношении классического индуктора ПКГ камптотецина (ковалентно связывает и ингибирует ДНК топоизомеразу I) и обратную корреляцию базальной экспрессии BCL-2 с вторичной фрагментацией ДНК после камптотецин-индуцированного повреждения ДНК (Goldwasser F. et а!., 1996), мы исследовали влияние ксимедона на активность фермента ДНК-топоизомеразы I, участвующего в репликации, транскрипции, репарации ДНК и апоптозе.

Инкубация спленоцитов мышей линии СВАхС57В1 с ксимедоном и метилу-рацилом приводила к увеличению ДНК топоизомеразной активности в ядерных экстрактах клеток (таблица 9).

Ксимедон и метилурацил в концентрации 1 мМ и вызывали появление полосы релаксированной субстратной ДНК в сочетании с размытостью фореграм-мы, обусловленной возникновением спектра молекул ДНК с различной злекгро-форетической подвижностью. Тестируемые соединения обладали сопоставимой активностью.

Таким образом, получены доказательства ксимедон-индуцированной дес-пирализации ДНК интерфазных лимфоцитов. Это создает предпосылки реализации матричных функций конденсированных фрагментов хроматина, согласуется с транскрипционной активностью препарата и коррелирует с повышением под влиянием ксимедона устойчивости Т клеток Jurkat к камптотецин-индуцированному апоптозу.

Таблица 9. Влияние ксимедона и метилурацила на активность ДНК-топоизмеразы I в спленоцитах мышей линии CBAxC57BI (М+т)

Условия опыта Активность фермента, ед.опт.плотн. релаксированной ДНК/мкг плазмиды По отношению к контролю (100%)

Контроль 8.5 ±1.5 —

Ксимедон, 1 мМ 23.2 ± 3.9 272.9 (р<0.01)

Метилурацил, 1 мМ 20.7 ±5.1 243.5 (р<0.05)

9. Репаративный синтез ДНК и апоптоз. Накоплено немало фактов, иллюстрирующих сложность и неоднозначность взаимодействия процессов репарации и апоптоза (Тронов, 1999). Установлено, что отдельные соединения [N-ацетилцистеин], предотвращающие апоптоз, обладают антимутагенным эффектом (Aluigi et al., 2000). Это не противоречит современным представлениям, в соответствии с которыми последствиями повреждения ДНК в клетках млекопитающих могут быть: 1) безошибочная репарация ДНК, 2) апоптоз/некроз или 3) репарации с ошибками, приводящая к изменениям последовательности ДНК и возможно, неоплазии, а в случае митохондриальной ДНК - к метаболическим дисфункциям (Fehrenbach, Northoff, 2001). Врожденный или приобретенный дефицит репарации ДНК, вызывающий накопление нерепарируемых разрывов ДНК или ошибочную репарацию, запускает программу апоптоза (Ярилин, 1998). С другой стороны, увеличение экспрессии антиапоптозных белков [BAG-1] коррелирует с резистентностью к апоптозу, индуцированному повреждением ДНК (Yang et al., 1998). Поскольку ксимедон стимулирует эксресиию BCL-2 и BAG-1 и защищает Т лимфоциты Jurkat от апоптоза, вызванного ДНК-повреждающим агентом кампто-тецином, было логично исследовать генопротекторную активность препарата.

В первой серии экспериментов мы изучили влияние ксимедона на репаративный синтез ДНК, отражающий эксцизионную репарацию ДНК, в Т- и В-обогащенных популяциях лимфоцитов периферической крови доноров in vitro. Было установлено, что спонтанный фон репаративного синтеза ДНК в В-обогащенной популяции был в 2.7 раза выше, чем в Т-обогащенной популяции (табл. 10). Обнаруженная закономерность согласуется с результатами исследования Knudsen et al. (1992), в котором авторы также констатировали более высокий уровень репаративного синтеза ДНК в B-обогащенной популяции лимфоци-

тов человека. По нашему мнению, одно из вероятных объяснений этого феномена может заключаться в необходимости генерации в Т- и B-лимфоцитах различного функционального оптимума соматических мутаций и других внутригеномных реаранжировок (рейтинг генов). Ксимедон в T-обогащенной популяции дозозави-симо усиливал репаративный синтез ДНК, проявляя большую активность в сравнении с метилурацилом (табл. 10). В B-обогащенной популяции метилурацил не стимулировал рапаративного синтеза ДНК, в то время как ксимедон увеличивал его на 156.7% в наибольшей из исследованных концентраций.

Таблица 10. Влияние ксимедона и метилурацила на репаративный синтез>ДНК в Т- и B-обогащенных популяциях лимфоцитов доноров (п=33)

Вещество, мМ Обогащенная Популяция Синтез ДНК, имп/минхЮ"4 кл, М±т Индекс индукции, %

0 Т 16.3 ±3.1 -

0 В 44.6 ± 10.4 -

Ксимедон

0,1 Т 27.2 ±4.1 66.9 (Р<0.05)

0,1 в 40.5 ±10.2 -

1.0 т 31.3 ±6.4 92.0 (Р<0.05)

1,0 в 114.5 ±13.7 156.7 (Р<0.01)

Метилурацил

0,1 Т 19.1 +4.2 17.2 (Р>0.05)

0,1 в 51.8 ±9.5 16.1 (Р>0.05)

1,0 т 26.5 ± 3.7 62.6 (Р<0.05)

1,0 в 45.0 ± 14.3 -

Для уточнения механизмов, опосредующих ксимедон-зависимую стимуляцию репаративного синтеза ДНК в лимфоцитах, а также для исследования связи этого феномена с активностью ДНК-полимеразы (5 - ключевого фермента, ответственного за репаративный синтез ДНК, был применен ингибиторный анализ. Для избирательного подавления ДНК-полимеразы р использовали 2',3'-дидезокситимидин (сИТ, 8 мкг/мл), который вносили в культуральную среду после инкубации спленоцитов линейных мышей с ксимедоном (табл. 11).

Таблица 11. Влияние ксимедона на репаративный синтез ДНК в спленоцитах мышей CBAxC57BI.

Вещество Синтез ДНК, имп/минхЮ"4 кл, М ± m Индекс индукции, %

0 33.8 + 3.7 -

Ксимедон, 0,1 мМ 61.3 ±5.6 81.4 (Р<0.01)

Ксимедон, 0,1 мМ + ddT, 8 мкг/мл 36.9 ±4.2 9.1 (Р>0.05)

Как и в предыдущих сериях экспериментов, ксимедон достоверно усиливал репаративный синтез ДНК. Инкубация клеток с ddT отменяла этот эффект, редуцируя синтез до исходного уровня, что свидетельствует об участии ДНК-полимеразы ß в реализации эффектов ксимедона. Поскольку доказано, что клетки, дефектные по ДНК полимеразе ß, гиперчувствительны к индукции апоптоза, вызванного ДНК-повреждагощими агентами (Ochs et al„ 1999), то можно предположить, что стимуляция активности ДНК-лолимеразы ß под влиянием ксимедона вносит свою лепту в суммарный антиапоптогенный эффект препарата.

10. Генопротекторные эффекты ксимедона.

10.1 Антикластогенная активность ксимедона. Установлено, что мутагены циклофосфан и митомицин С индуцируют хромосомные повреждения и апоптотическую гибель клеток, роль триггера которой выполняют ошибочно (неполностью) репарированные первичные повреждения ДНК (Ochs et al., 1999). С учетом установленной антиапоптогенной активности ксимедона представляло интерес выяснить, способен ли препарат защищать клетки от цитогенетических нарушений, вызванных мутагенами с проапоптогенным эффектом. Генопротек-торную активность ксимедона и референс-препарата ПАБК оценивали по их способности понижать частоту циклофосфан-индуцированных хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей СВАхС57В1. Профилактическое введение препаратов в дозе 3 мг/кг в течение 6 суток достоверно понижало частоту циклофосфан-индуцированных аберраций хромосом на 23.1% (ксимедон) и 34.6% (ПАБК).

Антикластогенный потенциал ксимедона и ПАБК оценивали по их способности уменьшать митомицин С-стимулированное (2 мг/кг однократно) образование микроядерных полихроматофильных эритроцитов (мПХЭ) в костном мозге

беспородных белых мышей. Профилактическое введение ксимедона и ПАБК в дозе 30 мг/кг в течение 10 дней достоверно понижало частоту митомицин С-индуцированных мПХЭ на 25.6% и 24.0%, соответственно. Таким образом, кси-медон защищал клетки от сопряженного генотоксичного и апоптогенного действия ДНК-повреждающих агентов (циклофосфан, митомицин С, камптотецин). По-видимому, при индукции первичных повреждений ДНК ксимедон способствует более эффективной репарации ДНК и тормозит вход клетки в апоптоз.

10.2 Эффекты ксимедона в бактериальных тест-системах

10.2.1. Ксимедон и точковые мутации. Учитывая эволюционный консерватизм и высокую гомологию механизмов репарации ДНК про- и эукариот (Ланцов В.А., 199В), а также протективный эффект ксимедона в "голодающих" клетках Е. coli, исследования были продолжены на ряде бактериальных тест-систем, регистрирующих точковые мутации.

Генотоксичную и антимутагенную активность ксимедона и метилурацила изучали в тесте Эймса (Ames, 1975) с использованием четырех индикаторных бактериальных штаммов Salmonella typhimurlum, позволяющих регистрировать мутации типа замены пар оснований и сдвига рамки считывания. Было установлено, что в стандартном для метода диапазоне концентраций (0.1-1000 мкг/чашку) ксимедон и метилурацил не проявляли мутагенной активности.

Антимутагенную активность ксимедона и метилурацила оценивали по их способности подавлять индукцию точковых мутаций типа замены пар оснований и сдвига рамки считывания в условиях индуцированного мутагенеза. Ксимедон дозозависимо ингибировал индукцию мутаций типа замены пар оснований, вызванных-действием супермутагена - нитрозометилмачевины"(НММ) в диапазоне" концентраций 1 - 1000 мкг/чашку). Процент угнетения варьировал от 61 до 83%, что по классификации Семенова В.В. (1995) соответствует антимутагенному эффекту "средней" силы. Аналогичная картина наблюдалась при индукции мутаций типа сдвига рамки считывания. Антимутагенная активность метилурацила была сопоставима с таковой для ксимедона. Антимутагенный эффект препаратов сохранялся в отношении косвенных индукторов цикпофосфана и аминофлуорена при их метаболической активации In vitro микросомальной фракцией печени мышей.

Таким образом, ксимедон и метилурацил подавляли индукцию точковых мутаций разных типов, вызванных в клетках Salmonella typhimurium прямыми и косвенными мутагенами.

10.2.2. Влияние ксимедона ни индукцию системы SOS-ответа. Способность препаратов модулировать индуцибельную систему SOS-ответа бактерий оценивали в SOS-хромотесте и тесте на индукцию профага. SOS-ответ в бактериальных клетках запускается при остановке репликации или образовании первичных повреждениий ДНК и включает в себя нарушение клеточного деления, ошибочную репарацию ДНК, ведущую к образованию мутаций, индукцию профага и ряд других феноменов (Howard et al., 1993). Следовательно, экспрессия генов SOS-ответа, например, sfi А гена, регистрируемая в использованном нами SOS-хромотесте (Quillardet et al., 1982), может служить индикатором генотоксич-ности различных физических и химических факторов.

Ксимедон и метилурацил в диапазоне концентраций от 0.1 мМ до 10 мМ не индуцировали SOS-ответа на тестерном штамме Е. coli PQ37. Была также изучена генопротекторная активность препаратов, которую оценивали по их способности подавлять SOS-ответ, вызванный митомицином С или налидиксовой кислотой. Эксперименты проводили в двух модификациях: 1) одновременное воздействие на тестерный штамм индуктора SOS-ответа и исследуемого соединения 2) предобработка штамма тестируемым препаратом в течение 2 часов. В концентрации 0.1 мМ метилурацил и ксимедон обладали одинаковой активностью и на 40-45% (Р<0.05) подавляли индукцию SOS-ответа, вызванного налидиксовой кислотой, но не влияли на митомицин С-индуцированный ответ. Регистрируемый эффект сохранялся в обеих модификациях эксперимента, что указывает на ма-ловероятность десмутагенного действия соединений. Известно, что налидиксо-вая кислота запускает SOS-ответ с последующей "апоптоз-подобной гибелью" Е. coli (Dahan-Grobgeld et al., 1998), характеризующейся рядом биохимических, генетических и морфологических признаков ПКГ эукариот. Следовательно, вызванное ксимедоном подавление SOS-ответа на налидиксовую кислоту может свидетельствовать о проявлении эквивалентов апоптоз-ингибирующей активности препарата на уровне прокариот.

Для подтверждения результатов оценки ксимедона в SOS-хромотесте мы использовали близкий по механизму тест на индукцию профага, которая рассматривается как один из компонентов SOS-ответа клетки на повреждение ее ге-

35

нома. Регуляторные белки встроенного репрессированного фага "чувствуют" предстоящую гибель бактериальной клетки-хозяина и переводят фаг на литиче-ский цикл развития (Пташне М., 1988).

Исследование влияния ксимедона на спонтанный фон фагоиндукции в ли-зогенных штаммах Вас. subtilis <p105wt, Е. coli рВг показало, что в концентрациях 0.6 мМ и 3 мМ препарат понижал уровень спонтанной индукции фага в 2.5 - 5 раз. Это подтверждает способность ксимедона ингибировать SOS-ответ и подавлять апоптоз-подобную гибель прокариот.

11. Пилотная клиническая оценка ксимедона при состояниях, характеризующихся повышенным уровнем индукции повреждений ДНК и ускорением темпов программируемой клеточной гибели. Исследовали влияние ксимедона на частоту хромосомных аберраций и микроядер в лимфоцитах и эритроцитах больных хроническим гнойным остеомиелитом (основная группа 41 пациент). Выбор указанной патологии был основан на следующих соображениях. Во-первых, системные воспалительные болезни и инфекции характеризуются нестабильностью генома в результате самоподдерживающейся продукции низкомолекулярных кластогенных факторов (фактор некроза опухоли а, интерлейкин-1р, интерферон-у, 4-гидроксиноненаль), вызывающих аберрации хромосом, сестринские хроматидные обмены, разрывы нитей ДНК и точковые мутации (Fuchs et al., 1995). Во-вторых, основной этиологический фактор гнойного остеомиелита Staphylococcus aureus индуцирует апоптоз остеобластов (Tucker et al., 2000) и Т лимфоцитов (Yoon et al., 1999) при экспериментальном остеомиелите у мышей.

-В-зависимости oi 1нжеа и процесса у больных хроническим остеомиелитом

частота микроядер превышала соответствующий показатель здоровых индивидуумов от 2 до 5 раз; частота хромосомных аберраций была выше в 2 - 2.5 раза и также коррелировала с клиническим течением. Ксимедон (30 мг/кг/ в сутки per os, 15 дней) снижал частоту микроядерных полихроматофильных эритроцитов (мПХЭ); величина подавления кластогенеза (18-53%) варьировала в зависимости от тяжести заболевания и была максимальной при комбинации ксимедона и внутрикостной терапии антибиотиками (Р<0.001). Снижение частоты мПХЭ при лечении ксимедоном коррелировало с ускорением заживления раны, редукцией клинико-биохимических признаков воспаления, увеличением абсолютного коли-

чества Т клеток. Частота лимфоцитов с аберрациями хромосом в процессе лечения ксимедоном снизилась с 4.67±0.70% до 2.44±0.51% (Р=0.018).

Резюмируя полученные результаты, мы предлагаем следующее объяснение иммуногенетической коррекции ксимедоном: при действии ДНК-повреждающих агентов препарат способствует сохранению стабильности генома. При этом результирующий генопротекгорный эффект может быть опосредован митохондриальными, ДНК-полимераза (5- и ДНК-топоизомераза 1-зависимыми механизмами. Это ослабляет вторичную апоптоз-индуцированную иммуноде-прессию и апоптотическую гибель остеобластов в очаге воспаления.

Протекторный эффект ксимедона по отношению к у-облучению - физическому мутагену и индуктору апоптотической гибели клеток - оценивали по влиянию ксимедоновой мази на развитие острой лучевой реакции кожи (ОЛРК) в процессе дистанционной у-терапии у больных злокачественными опухолями головы и шеи (основная группа 42 пациента, контрольная группа 64 пациента). 5%-ную мазь наносили тонким слоем на кожные покровы в проекции полей облучения непосредственно перед облучением и через 5 часов после него. Суммарная поглощенная доза (СПД) составляла 40±4 Гр при одинаковом 5-дневном режиме фракционирования.

При всех исследованных СПД (10-20-30-40 Гр) ОЛРК Ш-1\/ степени не наблюдали. При СПД до 20 Гр доля ОЛРК I степени в контрольной группе составила 25%, ОЛРК в основной группе отсутствовала. При СПД 30 Гр в контрольной группе наблюдали 65.6% ОЛРК I степени и 34.4% ОЛРК И степени. Ксимедон при указанной СПД сокращал долю ОЛРК I степени в 3.9 раза и полностью блокировал развитие ОЛРК II степени. При СПД 40 Гр в контрольной группе регистрировали 40.6% ОЛРК I степени и 59.4% ОЛРК II степени. В основной группе при СПД 40 Гр у 38.1% обследуемых ОЛРК отсутствовала, ОЛРК I степени регистрировали у 47.6%, ОЛРК II степени - у 14.3%. Таким образом, ксимедон в 4.1 раза уменьшал долю ОЛРК II степени при СПД 40 Гр. Обнаруженный защитный эффект ксимедона согласуется с установленными механизмами действия препарата, возможно тормозящими такие эффекты -/-облучения, как падение ДУт (1_оиад1е е! а1., 1999), снижение экспрессии ВСЬ2, блок клеточного цикла и увеличение частоты микроядер (В^ау е1 а1., 2000).

Заключение. Очевидно, что ксимедон как митохондриальный протектор и транскрипционно-активный препарат регулирует ряд важных контрольных точек -"decision points" (BCL-2 / BAG-1 / Аут/ ДНК-полимераза ß / ДНК-топоизомераза I / SOS-ответ), расположенных на пересечении путей мутагенеза, антимутагенеза и программированной клеточной гибели. В результате препарат способствует переключению клеточного ответа на безошибочную репарацию и репликацию ДНК и ингибирует вступление клетки в апоптоз (рис. 6).

Важно заметить, что указанная схема per se не является умозрительной конструкцией, а реализуется как один из физиологических механизмов ответа клетки на повреждение ДНК. Schwarz et al. (2002) впервые показали, что цитокин IL-12, стимулируя экспрессию ферментов эксцизионной репарации ДНК, способен защитить клетки человека от апоптоза, вызванного УФ-индуцированными повреждениями ДНК. Таким образом, идентификация эндогенных биорегуляторов, предотвращающих апоптоз за счет стимуляции репарации ДНК, указывает на существование специализированного сигнального пути, в рамках которого могут получить объяснение генопротекторный и антиапоптогенный эффекты ксимедона.

Влияние ксимедона на эволюционно консервативные (про- и зукариоты), и, следовательно, в значительной мере универсальные механизмы клеточного ответа на повреждение, детерминирует определенный уровень видовой и клеточной неспецифичности антиапоптогенного эффекта препарата, частное содержание которого есть производное от типа ткани. Например, коррекция количественного и функционального Т-клеточного иммунодефицита, репаративная регенерация кожи, слизистых, эндотелия, периферического нерва, печени, торможение ПКГ прокариот. В прикладном яг.прктя пппучр.нныр.-рр-чупьтатм-птор^йацтг-прр---спекгивы направленного синтеза нетоксичных ингибиторов апоптоза в рамках группы негликозидных аналогов пиримидин-нуклеозидов, содействуют развитию методической базы клинической фармакологии модуляторов апоптоза и экспериментально обосновывают расширение показаний для ксимедона.

индукторы апоптоза

со <0

ГАММА-РАДИАЦИЯ

МУТАГЕНЫ: ЦФ,НММ,2-НФ,2-АФ — повреждение

ДНК\

КЛАСГОГЕНЫ: МИТОМИЦИН С:

АНТИБЛАСГО МНЫЕ СРЕДСТВА; КАМПТОТЕЦИН ГИДРОКСИМОЧЕВИНА

ДЕФИЦИТ СЫВОРОТОЧНЫХ ФАКТОРОВ РОСТА

СТИМУЛЯЦИЯ Га8/С095-РЕЦЕПТ0РА

ЦИТОМЕГАЛОВИРУС

АПОПТОЗ

\

КСИМЕДОН

^ыеразя бета |

КЕБТГПГПО АЛ ЛтеЕСНиМ

ДНК топонзомераза I I

г~

ПРОЛИФЕРАЦИЯ

ОШИБОЧНАЯ

805- и ЗОБ-подошия

гесА-завжимый I БОв-ответ I

Б ОССТАН ОБЛЕНИЕ ДНЕ С ОШИБКАМИ

ТОЧК

МУГ ХА ШШЮЯДРА

РЕГЕНЕРАЦИЯ

т

Рис. 6. Апоптоз-регупирующая и антимутагенная активность ксимедона. (1 - ингибиция ксимедоном, —>■ - стимуляция ксимедоном)

АНТИМУТАГЕННЫЙ

ЭФФЕКТ: БАХТЕИ1И, МЫШИ, ЧЕЛОВЕК

Выводы

1. Лекарственное средство пиримидинового ряда ксимедон обладает анти-апоптогенной и генопротекторной активностью, регулируя молекулярные механизмы ВС1_-2/ВАО-1/Дут-зависимой программированной клеточной гибели.

2. Ксимедон (1 мМ) стимулирует экспрессию антиапоптозных белков человека BCL-2 и BAG-1 в CD4+ Т лимфоцитах Jurkat в условиях проапоптогенного дефицита сывороточных факторов роста и при действии индуктора апоптоза ингибитора ДНК топоизомеразы I камптотецина, однако не подавляет протонофор-и анти-СОЭб/Раэ-стимулированный апоптоз.

3. Антиапоптогенное действие ксимедона (1 мМ) проявляется в ограничении падения Дц/m, торможении потери фосфатидилсериновой асимметрии цито-плазматической мембраны и замедлении роста ее проницаемости.

4. Ксимедон ограничивает падение Дут при CMV-индуцированном апопто-зе человеческих эмбриональных рабдомиобластов RD.

5. В процессе апоптоз-подобной гибели человеческих тромбоцитов при их старении in vitro ксимедон не влияет на динамику Дут и исчезновение фосфатидилсериновой асимметрии цитоплазматаческой мембраны.

6. В клетках Е. coli, испытывающих дефицит ростовых факторов, ксимедон повышает трансмембранный потенциал, т.е. способствует сохранению энерго-обеспечивающего протонного градиента и целостности цитоплазматаческой мембраны в условиях голодания.

7. Ксимедон стимулирует активность мультифункционального фермента ДНК топоизомеразы I, участвующего в репликации, транскрипции, репарации ДНКи апоптозе.--------

8. Ксимедон обладает генопротекторным (антимутагенным) эффектом в организмах различного эволюционного уровня, ингибируя индукцию точковых мутаций и SOS-ответ в клетках прокариот, усиливая зависимый от ДНК полимеразы р репаративный синтез ДНК в лимфоцитах, снижая частоту хромосомных аберраций в клетках костного мозга и образование микроядер в клетках эритроидного ряда.

9. В пилотной клинической оценке препарата при состояниях, характеризующихся повышенным уровнем индукции повреждений ДНК и ускорением темпов программированной клеточной гибели (хронический остеомиелит и лучевая

терапия), обнаружен защитный эффект ксимедона, который согласуется с экспериментально установленными механизмами действия препарата.

10. Сформулирована новая концепция, в соответствии с которой ксимедон как малотоксичный антиапоптоген и митохондриальный протектор регулирует ряд важных контрольных точек (BCL-2 / BAG-1 / Дут / ДНК-полимераза р / ДНК-топоизомераза I / SOS-ответ) на пересечении путей мутагенеза/антимутагенеза и апоптоза, содействуя переключению на репаративный путь клеточного ответа на повреждение.

Практические рекомендации

1. Предложен цитофлуориметрический метод одновременного определения трансмембранного митохондриального потенциала (Лут) и фосфатидипсе-риновой асимметрии мембраны тромбоцитов человека в цельной крови ex vivo.

2. При поиске лекарств с апоптоз-регулирующим эффектом следует учитывать, что антимутагенная активность может быть прогностическим маркером ан-тиапоптогенного действия.

3. Рекомендуется изучение возможностей применения ксимедона как препарата с антиапоптогенным эффектом для профилактики и терапии заболеваний, характеризующихся ускорением темпов ВС1.-2/ВАС-1/Дут-заБИСимой программированной клеточной гибели: ишемическое повреждение клеток, нейроде-генеративные заболевания, цитомегаловирусная инфекция, синдром Рейе, стеа-тоз печени, HIV-инфекция.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Черепнев. Г.В. Сравнительное изучение анаболических и антимутагенных эффектов некоторых пиримидиновых производных // Учёные практическому здравоохранению. Материалы докладов конференции учёных Казанского ГИДУВа, Казань, 1989, с. 22-23.

2. Черепнева И.Е. Карамова Н.С. Черепнев Г.В. Спонтанный и модифицированный внеплановый синтез ДНК в лимфоцитах крови человека // Объём и методы гено-токсич. оценки и побоч. эффектов биол. актив, веществ; Всес. симп., Ленинград 22-26 мая 1989: Тез. докл. — Л., 1989. — с. 103-104.

3. Карамова Н.С., Черепнев Г.В. К вопросу о спонтанном и модифицированном уровне внепланового синтеза ДНК Т- и В-лимфоцитов человека // Матер, зонал. конф. мол. учен.-биол.: "Актуал. пробл. совр. биол.". Казань, 13-15 фев., 1989/ Казан, ун-т. — Казань, 1989. — с. 128-132. Библ. 17 назв. - Рус. — Деп. в ВИНИТИ 05.12.89 № 7214—В89.

4. Цибулькина В.Н., Черепнев Г.В. Внеплановый синтез ДНК в покоящихся Т- и В-лимфоцитах: перспективный подход к оценке иммуномодуляторов II Тезисы докладов I Съезда Иммунологов России. Новосибирск, 1992, с. 522-523.

5. Черепнев Г.В., Добровольская МЛ. Мутагенная активность пиримидиновых производных в микроядерном тесте II Экоген. — 1994. — №4. — с. 54.

6. Добровольская М.А., Карамова Н.С., Черепнев Г.В. Микроядерный тест в оценке стабильности генома И 7 Межреспубликанская научная конференция ВУЗов "Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высоко-молекулярных соединений", Казань, 1994, с. 87-88.

7. Черепнев Г.В., Зулкарнеева З.Р. Нейрореабилитация на уровне генома: теоретические основы и экспериментальные предпосылки // Неврологический вестник. — 1995. — т. XXVII. — вып. 1-2. — с. 27-30.

8. Черепнев Г.В. Ксимедон ингибирует индуцированный SOS-ответ в клетках прокариот // Мутагены и канцерогены окружающей среды. Проблемы антимутагенеза. Тезисы докладов российской конференции. — Казань: КГМУ. — 1996, с. 36-37.

9. Слабнов Ю.Д., Гилев A.B., Черепнев Г.В. Профилактическое действие ксимедоно-вой мази при острых лучевых поражениях кожи после дистанционной у-терапии у больных злокачественными опухолями головы и шеи // Казанский мед. ж. — 1996. — т. 77, —№3. —с. 182-184.

10. Слабнов Ю.Д., Черепнев Г.В., Цибулькин А.П., Гараев P.C. Механизмы системного иммуномодулирующего действия пиримидиновых производных II Экспер. и клин, фармакол., 1997. — т. 60. — № 3. — с. 65-67.

11. Слабнов Ю.Д., Черепнев Г.В., Цибулькин А.П., Каримова Ф.Г., Гараев P.C. Влияние пиримидиновых производных на систему регуляции активного транспорта кальция в иммунокомпетентных клетках II Экспер. и клин, фармакол., 1997. — т. 60. — №6. — с. 44-46.

12. Слабнов Ю.Д., Черепнев Г.В., Цибулькин А.П., Каримова Ф.Г., Гараев P.C. Влияние пиримидиновых производных на сульфгидрильный статус иммунокомпетентных клеток in vivo: взаимосвязь с Са2+-АТФазной и антимугагенной активностью II Экспер. и клин, фармакол., 1998. — т. 61. — №1. — с. 40-43.

13. Слабнов Ю.Д., Черепнев Г.В., Каримова Ф.Г., Гараев P.C. Влияние пиримидиновых производных на аденилатциклазную систему регуляции иммунокомпетентных клеток in vitro II Бюл. экспер. биол. мед., 1998. — т. 125. — №6. — с. 663-665.

14. Цибулькин А.П., Слабнов Ю.Д., Поздеев O.K., Черепнев Г.В., Гараев P.C., Иста-мов Х.И. Моделирование экспрессии ключевых молекул мембран иммунокомпетентных клеток пиримидиновыми производными: обоснование системности иммунопо-тенцирующего эффекта // Иммунология, 1998. — №4. — с. 29-33.

15. Черепнев Г.В., Слабнов Ю.Д., Цибулькин А.П., Каримова Ф.Г., Гараев P.C. Ксимедон восстанавливает Т клеточный иммунный ответ, ингибированный у-

облучением in vivo: взаимосвязь с Са2+-АТФазной и ДНК-релаксирующей активностью II Бюл. экспер. биол. мед., 1999. — т. 127 — №1. — с. 66-70.

16. Черепнев Г.В., Терещенко В.Ю., Малышев К.В., Семенов В.В., Слабнов Ю.Д., Га-раев P.C. Иммуномодулятор ксимедон снижает уровень индуцированных повреждений ДНК в клетках костного мозга и периферической крови: возможности иммуноге-нетической коррекции // Экспер. и клин, фармакол., 1999. — т. 62 — №2. — с. 31-35.

17. Слабнов Ю.Д., Визель A.A., Черепнев Г.В., Фирсов О.В., Сабирова Л.А. Обоснование применения системного иммуномодулятора ксимедона у больных с иммунологической недостаточностью при деструктивных формах туберкулеза легких II Пробп. туб., 2000; №3. -с. 28-32.

18. Черепнев Г.В., Малышев К.В., Слабнов Ю.Д., Семенов В.В., Резник B.C. Потенциальная роль антимутагенного эффекта препарата ксимедона в модификации им-мунореактивности II Экспер. и клин, фармакол., 2000. — т. 63 — N26. — с. 43-48.

19. Челышев Ю.А., Черепнев Г.В., Сайткулов К.И. Апоптоз в нервной системе// Онтогенез, 2001. — т. 32 —№2. — с. 118-129.

20. Черепнев Г.В., Велижинская Т.А., Абашев Р.З. Оценка раннего апоптоза субпопуляций мононуклеаров периферической крови человека ex vivo: клинически адаптированный анализ трансмембранного митохондриального потенциала и экспрессии CD антигенов методом трехцветной проточной цитометрии // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии. 4-й Конгресс РААКИ. Сборник трудов. Том II. Тезисы докладов. Москва, 29-31 мая 2001 г., с. 121.

21. Черепнев Г.В., Мустафин И.Г. Влияние ксимедона на программированную гибель эмбриональных рабдомиобластов линии RD // Казань, Казан, ун-т. 2001. - 6 с.-Библ. 6 назв. - Рус. -Деп. в ВИНИТИ 09.08.2001, - № 1845-В2001.

22. Черепнев Г.В. Возможности фармакологической регуляции апоптоза // Казань, Казан, ун-т. 2001. - 9 с. - Библ. 40 назв. - Рус. - Деп. в ВИНИТИ 09.08.2001, - № 1846-В2001.

23. Черепнев Г.В., Велижинская Т.А. Апоптоз-подобная гибель тромбоцитов человека /л vitro: падение трансмембранного митохондриального потенциала A\ym предшествует исчезновению липидной асимметрии цитоплазматической мембраны // Аллергология и иммунология, 2001. — т. 2 — №2. — с. 137-138.

24. Челышев Ю.А., Черепнев Г.В. Молекулярные и клеточные аспекты фармакологической стимуляции регенерации нерва II Экспер. и клин, фармакол., 2001. — т. 64 — №3, —с. 67-71.

25. Харисова Э.З., Черепнев Г.В. Гетерогенность бактериальной популяции и анти-биотикорезистентность // II Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века". Тезисы докладов. Казань, 2001, с. 101.

26. Черепнев Г.В. Ксимедон стимулирует экспрессию человеческих белков ингибиторов апоптоза BCL-2 и BAG-1 // Казань, Казан, ун-т. 2001. - 8 с. - Библ. 19 назв. - Рус. - Деп. в ВИНИТИ 21.11.2001, - № 2435-В2001.

27. Черепнев Г.В. Антиапоптогенный эффект ксимедона в перевиваемой линии Т клеток человека // Казань, Казан, ун-т. 2001 .-7с,- Библ. 7 назв. - Рус. - Деп. в ВИНИТИ 21.11.2001,-№2434-В2001.

28. Tcherepnev G„ Zulkarneeva Z. Neurorestoration at the gene level: theoretical aspects and experimental prerequisites // The 1995 International Co-Conference on Environmental Pollution and Environment. Thesis. St. Petersburg, Russia, 1995. — p. 181.

29. Chelyshev Yu. A., Cherepnev G.V., Saitkulov К. I. Apoptosis in the Nervous System. Russian Journal of Developmental Biology, 2001. — Vol. 32 — №2. — p. 92-102.

30. Cherepnev G., Kern F., Volk H.-D. A novel inhibitor of mitochondrial permeability transition upregulates Bcl-2 expression and attenuates apoptosis in a human T cell line. 18th Spring Meeting of the German Society of Immunology. Abstracts., 2002, Halle (Saale), p. 33.