Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Регуляция программированной клеточной гибели Т-лимфоцитов человека in vitro в норме и при иммунопатологии

Министерство здравоохранения России

Российский Государственный медицинский университет

На правах рукописи

РГБ ОД

1 3 СЕН 1923

Щигленко Наталья Александровна

Регуляция программированной клеточной гибели Т-лимфоцитов человека in vitro в норме и при иммунопатологии

14.00.36-Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- МОСКВА 1999 -

Работа выполнена в Российском Государственном медицинском университете.

Научный руководитель:

Академик РАЕН, профессор, доктор медицинских наук, Л.В.Ковальчук

. Научный консультант: Кандидат медицинских наук, доцент, А.С.Павлюк

Официальные оппоненты: Профессор, доктор медицинских наук Н.К Горлина.

Академик РАЕН, профессор, доктор медицинских наук А.А.Ярилин

Ведущее учереждение - Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Защита диссертации состоится ".......".......................1999г.

в "........" часов на заседании специализированного совета №Д0841406

Российского Государственного медицинского университета по Адресу: 117869, г.Москва, ул. Островитянова 1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Российского Государственного медицинского университета.

Автореферат разослан "......."..................................1999г.

Ученый секретарь специализированного совета

доцент Т.Е.Кузнецова

Общая характеристика работы Актуальность темы.

На современном этапе патогенетический подход в оценке иммунного статуса играет наиважнейшую роль как в выявлении основных механизмов функционирования иммунной системы при той или иной иммунопатологии, так и в выборе патогенетической терапии при ряде заболеваний (Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н., 1990). При этом речь идет о поиске методов исследования уже известных механизмов функционирования иммунной системы или сравнительно новых, позволяющих приблизится к пониманию патогенеза иммунопатологических состояний и более квалифицировано решать вопрос об их иммунокоррекции.

Поддержание биологической целостности организма является основным принципом функционирования всех его систем и в первую очередь иммунной. До настоящего времени реализацию данного процесса на клеточном уровне, прежде всего, связывали с активацией, пролиферацией, дифференцировкой и регуляцией. Исследование апоптоза в данном контексте представляет собой достаточно новый Этап развития, хотя отдельные микроскопические признаки, характерные для этого явления, были описаны еще в начале века. Апотоз в клетках взрослого организма является повсеместным и постоянно происходящим процессом. Иммунологические реакции, циклическая регрессия и возрастная инволюция некоторых органов и тканей (например, половых желез, тимуса, эпифиза) - далеко неполный перечень физиологических процессов, сопровождающихся апоптозом. По мере роста интереса в научном мире к проблемам апоптоза, встал вопрос об экспериментальной модели изучения данного феномена и, соответственно, о факторах, индуцирующих программированную клеточную гибель. Часто для индукции апоптоза используются глюкокортикостероидные гормоны. Гибель тимоцитов в процессе дифференцировки в тимусе под воздействием глюкокортикостероидных гормонов является классической моделью индукции апоптоза т укгб.

В своих исследованиях апоптотической гибели лимфоцитов мы применяли модифицированную методику А. Николетти (ЬНсо1ейу 1.,

М1'£1югай в., Pagliacci М.С. е! а1. 1991).

Данный метод был применен для экспериментального исследования апоптотического процесса в мышиных тимоцитах при помощи проточной цитометрии. Однако, при использовании лимфоцитов человека отмечается целый ряд особенностей, которые мы постарались учесть в нашей работе. Известно, что чаще всего именно в активированном состоянии клетка способна к выполнению той или иной заложенной в ней функции или программы, в том числе и апоптотической гибели. Такие известные индукторы апоптоза, как глюкокортикостероидные гормоны и вещества, обладающие цитостатическим действием, влияют на клетку в основном в активированном состоянии (Dive С., Hickman J. А. 1991). Считается,

что применение в качестве митогена - фитогеммаглютинина в культуре, позволяет смоделировать состояние активации и выявить закономерности программированной клеточной гибели лимфоцитов под воздействием активационного сигнала (Lanza L, Scudeletty М., Puppo F. et al. 1996) .

Нарушение клеточной гибели может приводить к возникновению патологических состояний и заболеваний, которые сопровождаются как дегенеративными, так и пролиферативными изменениями (OnishiY., Kizaki Н. 1994).

Повышенная активация апоптоза является звеном в патогенезе ВИЧ инфекции, нейродегенеративных и миелодиспластических заболеваний (Del Llano А. М., Lavergne J. А. 1994). Ингибирование клеточной гибели определяет опухолевые поражения различной природы, аутоиммунные и вирусные заболевания (Fisher D. 1994). В последнее время появился термин "апоптотогенные иммунодефициты" (Ковальчук Л.В, Чередеев А.Н. 1998).

Исследования последних лет выявили немаловажную роль процесса апоптоза в развитии вторичного иммунодефицита при хронической почечной недостаточности (ХПН) (Savill J. 1994).

Известно, что данная патология характеризуется выраженной прогрессирующей анемией и нарастающей лимфопенией. Доказано, что в качестве одной из основных причин развития иммунодефицита при ХПН выступает полифуранкарбоновая кислота (ПФК) (N iwa Т., Yazawa Т., KodamaT, UeharaY.. et al. 1990).

Данное соединение, накапливаясь в сыворотке уремических больных, вызывает массовую гибель клеток предшественниц эритроидного ряда. Нам представлялось целесообразным изучить влияние ПФК на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов,

как здоровых доноров, так и больных ХПН.

Изучение апоптогенеза при тех или иных патологических состояниях лежит в основе их целенаправленной иммунокоррекции. В настоящее время, в клинической практике широкое применение получили препараты интерферонов и их индукторы, применяющиеся для лечения многих иммунопатологических состояний. Механизм их действия остается до конца невыясненным. В связи с вышеизложенным нам показалось актуальным изучить влияние индуктора интерферона, препарата "Полудан", представляющего синтетический комплекс ПолиА:ПолиУ, на пролиферативную активность и апоптоз в культуре лимфоцитов в норме и при хронической почечной недостаточности.

Для количественного анализа апоптоза наиболее быстрым и простым в техническом плане является метод проточной цитометрии с использованием различных ДНК красителей, в частности, пропидий йодида. Морфологические признаки апоптоза были изучены очень давно. На основании морфологической характеристики, выделяют несколько основных стадий апоптоза. Одной из задач, которую мы себе поставили, был сравнительный анализ двух методов количественной оценки: метод проточной цитометрии и количественный анализ по морфологическим критериям.

Все вышесказанное свидетельствует об актуальности проблемы, связанной с изучением программированной клеточной гибели лимфоцитов человека в норме и при иммунопатологии.

В связи с этим целью нашей работы явилось следующее: изучение программированной клеточной гибели лимфоцитов человека in vitro и влияние на нее дексаметазона, полифуранкарбоновой кислоты и синтетического комплекса ПолиА:ПолиУ в норме и при хронической почечной недостаточности.

Задачи.

1. Выработка оптимальных условий количественного анализа апоптоза лимфоцитов периферической крови человека in vitro методом проточной цитометрии.

2. Морфологическая оценка апоптотических изменений лимфоцитов.

3. Проведение сравнительного анализа морфологического и цитометрического методов определения апоптоза.

4. Изучение действия различных агентов на пролиферативную

активность апоптоз лимфоцитов здоровых доноров в культуре in vitro (кортикостероиды, ПФК, комплекс ПолиА:ПолиУ).

5. Изучение влияния дексаметазона, полифуранкарбоновой кислоты и синтетического комплекса ПолиА:ПолиУ на апоптоз лимфоцитов больных ХПН в культуре in vitro.

6. Иммунофенотипический анализ лимфоцитов больных ХПН в культуре.

Научная новизна.

Разработана модель количественной оценки апоптоза лимфоцитов периферической крови контрольной группы здоровых доноров с использованием различных доз дексаметазона с помощью проточной цитометрии. Проведен сравнительный анализ цитометрического анализа апоптоза и морфологической оценки при помощи световой микроскопии. Изучено влияние различных доз полифуранкарбоновой кислоты на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов здоровых доноров и больных в терминальной стадии хронической почечной недостаточности. Выявлен значительный апоптогенный эффект у полифуранкарбоновой кислоты.

Исследовалось влияние синтетического комплекса ПолиА:ПолиУ на апоптоз лимфоцитов в норме и у больных с ХПН. Изучая фенотип лимфоцитов в условиях культивации in vitro, получены экспериментальные доказательства, что иммунодефицит у больных с ХПН, сопровождающийся лимфопенией лимфоцитов, протекает при непосредственном участии ПФК, за счет индукции апоптоза и угнетения пролиферативной активности лимфоцитов, преимущественно CD4 субпопуляции. Отмечено некоторое снижение чувствительности лимфоцитов больных ХПН к индукции апоптоза под влиянием дексаметазона и ПФК, по сравнению с культурой здоровых доноров.

Выявлены значительные различия влияния митогена ФГА на апоптоз лимфоцитов в норме и у больных с ХПН. На основании полученных нами данных сделан вывод об имеющемся у больных ХПН эффекте предактивации CD4+ лимфоцитов in vivo, приводящей к усиленной апоптотической гибели лимфоцитов.

Экспериментальные исследования влияния синтетического комплекса ПолиА:ПолиУ выявили его способность предотвращать гибель и повышать жизнеспособность лимфоцитов в культуре in vitro как здоровых доноров, так и больных ХПН. Полученные результаты могут служить основанием для дальнейшего изучения ПолиА:ПолиУ с

целью применения его для патогенетической терапии заболеваний, связанных с дефектом процесса апоптоза.

Практическая значимость.

На современном этапе не всегда при помощи существующих методов исследования, удается полно раскрыть механизм развития той или иной иммунопатологии. С введением термина "апоптоз" и изучением участия данного механизма в патогенезе развития различных заболеваний, а также индукция или наоборот ингибиция программированной клеточной гибели под влиянием различных веществ, в том числе и лекарственных препаратов, обусловило потребность в оценке данного процесса. Разработанная нами модель количественной оценки активационно индуцированного in vitro апоптоза лимфоцитов позволяет оценивать данный процесс при помощи проточной цитометрии в динамике. Данный метод также позволяет исследовать влияние различных веществ и лекарственных препаратов на апоптоз, а также изучать апототические процессы в связи с пролиферативной активностью лимфоцитов.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на симпозиуме РААКИ (Москва, 1998), на IV Международном конгрессе по иммунореабилитации (Сочи, 1998), на IV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1999), на конференции кафедры иммунологии РГМУ и отдела иммунологии MJ1K (Москва, 1999), на V Международном конгрессе по иммунореабилитации (Тенериф, 1999).

Публикации

По результатам исследования опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав:" Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты собственных исследований", "Обсуждение результатов" и "Выводы". Работа иллюстрирована 8 таблицами и 11 рисунками, содержит источников литературы, из которых отечественных и иностранных.

Содержание работы

Материалы и методы исследования.

Исследования выполнены на мононуклеарных клетках (МНК), выделенных из периферической венозной крови, обследуемых лиц на градиенте плотности фиколл-верографина (d=1,077 г/см3) по методу Воут в модификации A.C. Павлюка. и соавторов (1982).

Контрольную группу составили 35 клинически здоровых доноров в возрасте от 20 до 29 лет, 28 мужчин и 7 женщин.

Группу больных составили лица, страдающие терминальной стадией хронической почечной недостаточностью в течение 1-1,5 лет. Всего обследовано 25 больных в возрасте от 14 до 18 лет (16 женщин и 9 мужчин). После выделения клетки ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2мМ глутамина и 0,5 мл раствора пенициллина (20000 ЕД/мл), 0,5 мл раствора стрептомицина (20000 мкг/мл) и культивировали в 24-луночных планшетах (Sigma) в термостате при 37° С во влажной атмосфере с 5% С02.

Для индукции апоптоза в культуре использовали дексаметазон.

Для стандартизации метода использовали различные концентрации дексаметазона (Sigma) 10'12,10~e, 10"6, 1СИ, 10"3мг/мл. Данные концентрации иногда использовались по литературным данным для индукции апоптоза в культуре лимфоцитов in vitro (Lanza L, Scudeletty M., Puppo F. et al. 1996) . Так же отличалось время культивации клеток: 8, 16, 24, 36, 48, 72, 96 часа, что соответствовало временным периодам, рекомендуемым в различных методических рекомендациях по алоптозу. В качестве митогена использовали фитогеммаглютинин (ФГА) (Bacto) в концентрации 10 мкг/мл. Культивация проводилась в 24-луночных планшетах (Sigma) с концентрацией лимфоцитов 2x106/мл. После оценки жизнеспособности и подсчета, лимфоциты в концентрации 200 тыс/мл обрабатывали РНК-азой (Sigma), после чего для проникновения красителя в ядро, клетки в течение 30 мин. инкубировали в гипотоническом растворе 0,1% трисцитратного буфера и 0,1% Тритона-Х, образующего микропоры в клеточной мембране. Затем клетки окрашивали пропидий йодидом (BioRad) в концентрации 10 мкл. на 1 млн.клеток и инкубировали при температуре 4°С в темном месте в течение 30 мин, после чего анализировали на проточном цитометре фирмы Becton Dickenson. Анализ количества ДНК проводился при помощи гистограммы, соответствующей флуоресценции красителя пропидий йодид.

Параллельно с оценкой характеристики мононуклеарных клеток при помощи проточной цитометрии проводился анализ лимфоцитов по морфологическим характеристикам. Цитопрепараты анализировались световой микроскопией, в масляной эмерсии при увеличении в 90 раз. Клетки анализировали по следующим морфологическим критериям апоптоза: 1. уплотнение и сегрегация хроматина; 2. распад ядра на фрагменты; 3. образование апоптозных телец; 4. фагоцитоз апоптозных телец соседними клетками. Подсчет производился по всем четырем признакам, за 100% принимали 100 лимфоцитов в одном цитопрепарате.

Оценку пролиферативной активности лимфоцитов учитывали по включению 3Н-тимидина традиционным методом бласттрансформации (Павлюк A.C. с соавторами 1982).

Влияние ПФК на культуру лимфоцитов изучали в концетрациях соответствующих таковым in vivo у больных ХПН - 20 мкг/мл, 50 мкг/ мл, 100 мкг/мл и 150 мкг/мл.

Пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов в культуре изучали, используя следующие концентрации синтетического комплекса ПолиА: ПолиУ -

0,001 МЕ/мл, 0,01 МЕ/мл, 0,1 ME/мл и 1МЕ/мл.

Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили, используя мультипараметрический двухцветовой метод иммунофлуоресцентного анализа при окрашивании МонАт (Culter), коньюгированными с флуоресцеинизотиоцианатом и фикоэритрином, на проточном цитофлуориметре типа FACScan (Becton Dickinson). На поверхности лимфоцитов определяли экспрессию CD3+, CD4+, CD8+ .CD16+ и CD56+ маркеров. Процедуру окрашивания проводили по стандартной методике, описанной в Monoclonal Antibody Source Book, Becton Dickinson, 1988.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы Startgraf. Для каждой серии данных вычисляли среднее арифметическое (М), ошибку среднего (т). В таблицах результаты представлены в виде М±т. Для сравнения средних использовали t-критерий Стьюдента.

Результаты собственных исследований и их обсуждение.

Результаты индукции дексаметазоном апоптоза в культуре лимфоцитов человека in vitro представлены в таблице 1. Как видно из полученных данных, при минимальной концентрации дексаметазона в культуре 10'12мг/мл, на 96 час инкубации гибель лимфоцитов достигает 32%. При наибольшей концентрации дексаметазона 10"3мг/мл, в тот же временной промежуток, гибель лимфоцитов достигала 70% и выше. В первом случае время постановки реакции достигает 4-х суток, что неудобно, прежде всего из-за длительности культивации, во втором случае массовая гибель лимфоцитов может помешать сравнительной характеристике при воздействии на культуру более сильных индукторов апоптоза, к примеру, ионизирующего излучения. Мы посчитали, что 50% апоптотических клеток в культуре - наиболее приемлемая величина для изучения и сравнительной характеристики влияния как факторов способствующих более интенсивной гибели лимфоцитов в культуре, так и факторов, ингибирующих эту гибель или предотвращающих ее вовсе.

Таблица 1. Влияние концентраций дексаметазона в различные временные

периоды на относительное содержание апоптотических лимфоцитов.

Концентрация дексаметазона мг/мл

Ю-12 ю-9 10'6 Ю-4 10"3

Время культивации в часах Относительное содержание в %. апоптотических лимфоцитов в культуре in vitro

8 1±0,3* 2±0,5 5±1,1* 8±1,5* 12±2,1+*

16 2±0,8 5±1,3 10±1,8* 15±1,6* 18±1,2**

24 4±1,1 8±1,5* 14±0,9* 23±1,8* 27±0,6**

36 10±0,7 15+1,2 19±0,5* 30±1,7* 35±1,2**

48 16±1,5 21±0,8 25+1,2* 33±2,3* 41±2,5**

72 23±0,7 27±1,3 35±1,5* 42±2,3* шиш

96 30±1,5 37±2,5 44±1,3 51±2,6* 67±3,2**

* р<0,05 **р<0,()1

Данный показатель мы получили при концентрации дексаметазона 10"4 мг/мл на 96-й час инкубации. Тот же результат получен при инкубации в течение 72 часов с концентрацией дексаметазона I0"3 мг/ мл, что показалось нам более приемлемыми, так как эти временные параметры дают возможность одновременной оценки как воздействия различных факторов как на апоптоз лимфоцитов в культуре, так и на их пролиферативную активность.

Таким образом, наша экспериментальная модель оценки активационно-индуцируемого апоптоза представляет следующее.

Мононуклеарные клетки инкубируются в концентрации 2 х 10 6/ мл в общем объеме 2 мл., в 24-луночных планшетах. В качестве митогена используется ФГА в концентрации 10 мкг/мл, в качестве индуктора апоптоза - дексаметазон в концентрации Ю'3 мг/мл. Время культивирования клеточной культуры составляет 72 часа, в термостате при температуре 37°С с 5 % С02 в атмосфере. При таких условиях, относительное содержание лимфоцитов, ушедших в апоптоз, составляет у здоровых доноров в данной модели: в контроле с ФГА - 8±0,3 %, при добавлении в культуру дексаметазона в концентрации 10"3 мг/мл - 50±1,5 %. Количественный анализ проводился при помощи проточной цитометрии.

Параллельно изучали пролиферативную активность лимфоцитов методом бласттрансформации (таблица 2). Индекс стимуляции в культуре с ФГА составил -83,0±2,2 , при добавлении в культуру дексаметазона 10"3 мг/мл этот показатель снизился до 65,0±2,3 . Таким образом, наблюдается обратно пропорциональная связь пролиферативной активности и апоптоза лимфоцитов здоровых доноров в культуре in vitro.

Таблица 2. Влияние дексаметазона на пролиферативную активность лимфоцитов здоровых доноров.

N=35 контроль ФГА (10мкг/мл) ФГА + дексаметазон (10'3 мг/мл)*

Импульсы в мин. 353±25 29300±672 22945±384*

Индекс стимуляции 83,0±2,2 65,0±2,3*

р< 0,05

Одновременно с анализом апоптоза лимфоцитов методом проточной цитометрии мы количественно оценивали процент апоптотических клеток в культуре на 72-й час культивации с отработанной концентрацией дексаметазона, по морфологическим критериям:

1-конденсация хроматина.

2-начальная стадия образования апоптозных телец.

3-конечная стадия образования апоптозных телец.

4-фагоцитоз апоптотических клеток.

Как видно из представленных данных (таблица 3), суммарный процент клеток, полученный по всем морфологическим критериям, составляет 49,4±3,8%, что сравнимо с полученными в тех же условиях результатами при помощи проточной цитометрии. Таким образом, мы можем говорить о возможности количественной оценки апоптоза по морфологическим критериям.

Таблица 3. Количественная оценка апоптоза по морфологическим критериям.

N=35 Конденсация хроматина Распад ядра на фрагменты Образование апоптозных телец Фагоцитоз соседними клетками Средний показатель по всем признакам

ФГА 10мкг/мл 2,0±0,1% 3,1 ±0,3% 2,2±0,1% 2,0±0,2% 9,3±0,7%

Дексаметазон 10'3мг/мл 17,0±0,1% 13,2±1,0% 11,2±1,5% 8,0±1,2% 49,4±4,8%

При оценке влияния различных доз ПФК на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов здоровых доноров мы применяли дозы ПФК соответствующие ее содержанию в сыворотке уремических больных: от 20 до 150 мкг/мл. Пролиферативную активность лимфоцитов изучали при помощи реакции бласттрансформации. Данные пролиферативной активности и относительного содержания апоптотических лимфоцитов представлены в таблице 4.

Как видно из результатов, представленных в таб. 4, самый высокий индекс стимуляции в культуре лимфоцитов с ФГА - 83,0±2,2. Дексаметазон, в применяемой нами концентрации 10"3 мг/мл вызывает снижение индекса стимуляции до 65,0±2,3. При добавлении в культуру ПФК в дозах от 20 до 150 мкг/мл индекс стимуляции дозозависимо снижается. Так, при минимальной дозе ПФК 20 мкг/мл индекс стимуляции составляет 54,0±2,9, а при добавлении в культуру ПФК в максимальной концентрации (150 мкг/мл) индекс стимуляции равнялся 10,9±2,6, что достоверно ниже индекса стимуляции в культуре с ФГА и с дексаметазоном.

Таблица 4. Влияние различных концентраций ПФК на пролиферативную активность и процент апоптоза лимфоцитов здоровых

доноров в культуре in vitro на 72 час культивации.

N=35 Контроль (ФГА) Дексаметазон 10"3 мг/мл Содержание ПФК в культуре мкг/мл

20 50 100 150

Индекс стимуляции 83,0±2,2* 65,0±2,3* 54,0±2,9* 34,8±5,7" 19,7±4,9" 10,9±2,6

Процент июптотических лимфоцитов 8,0±0,3» 50,0±3,6" 57,0±0,6* 60,0±1,2» 65,0±0,5» 69,0±0,8"

* р<0,05 **р<0,01

При анализе влияния ПФК на активационно - индуцируемый апоптоз в культуре лимфоцитов здоровых доноров получены следующие результаты: ПФК дозозависимо увеличивает процент апоптотических клеток в культуре. При максимальной концентрации ПФК в культуре лимфоцитов здоровых доноров уровень апоптоза в культуре достигает почти 70% лимфоцитов, при минимальной концентрации апоптоз составляет 55,0±1,6 % (таблица 4). Выше представленные результаты свидетельствуют как о дозозависимом угнетении ПФК пролиферативной активности лимфоцитов, так и о дозозависимом эффекте данного соединения на программированную клеточную гибель. Результаты сравнительной оценки влияния ФГА, дексаметазона и максимальной концентрации ПФК (150 мкг/мл) на процент апоптотических клеток в культуре при помощи проточной цитометрии представлены на рисунок 1. Как видно из рисунка ПФК является более мощным индуктором апоптоза

в культуре лимфоцитов здоровых доноров по сравнению с дексаметазоном

Рисунок 1. Цитометрический анализ апоптоза лимфоцитов здоровых доноров индуцированного активацией под влиянием дексаметазона и ПФК.

ы

Л

ФГА(8%)

ФГА+ дексаметазон 103мг/мл(50%)

ФГА+ПФК150мкг/мл(70%)

При изучении влияния комплекса ПолиА:ПолиУ на пролиферативную активность лимфоцитов здоровых доноров в тесте бласттрансформации, получены следующие результаты, представленные в Таблице 5. Индекс стимуляции дозозависимо увеличивался под влиянием синтетического комплекса ПолиА:ПолиУ. Как видно из представленных данных, в культуре с ФГА индекс стимуляции составляет - 56,4±1,5. При добавлении синтетического комплекса ПолиА:ПолиУ индекс стимуляции дозозависимо увеличивался от 59,7+1,2 до 78,0+2,6. При статистической обработке, индекс стимуляции, полученный при максимальной концентрации ПолиА:ПолиУ (1 МЕ/мл) в культуре, достоверно выше такового у лимфоцитов, стимулированных только ФГА.

Таблица 5. Влияние синтетического комплекса ПолиАгПолиУ на пролиферацию лимфоцитов здоровых доноров в культуре in vitro.

N=35 Контроль ФГА (10мкг/мл) ФГА + ПолиА:ПолиУ (МЕ/мл)

0,0001 0,001 0,1 1

Импульсы в мин. 353±25 18463±672 19780±798 226371937 257381862 28693±983

Индекс стимуляции 56,4±1,5 59,7±1,2 64,7±2,8 71,6±2,1 78,0±2,6*

*р< 0,05

Данные влияние синтетического комплекса ПолиА:ПолиУ на апоптоз лимфоцитов в культуре in vitro представлены на рнсунке 2. Как видно из полученных результатов, при добавлении в культуру ПолиА:ПолиУ в различных концентрациях процент апоптоза лимфоцитов достоверно и дозозависимо уменьшался по сравнению с таковыми в культурах клеток с ПФК и дексаметазоном. Так, в культуре дексаметазсн + ПолиА:ПолиУ относительное содержание апоптотических лимфоцитов в культуре здоровых доноров при максимальной концентрации ПолиА:ПолиУ составляет 27+1,5%, что

достоверно ниже данных в культуре с дексаметазоном - 50,0+3,6 %. В культуре ПФК + ПолиА:ПолиУ процент апоптотических клеток снизился до 42,3±1,8 по сравнению с данными в культуре с ПФК (150 мкг/мл) - 69,0±0,8%. При добавлении ПолиА: ПолиУ в контрольную культуру с ФГА показатели аполтоза достоверно не изменялись.

Рисунок 2. Влияние синтетического комплекса ПолиА:ПолиУ на апоптоз лимфоцитов здоровых доноров в культуре in vitro.

1 2 3 4 5

1-контроль, 2-ФГА, З-Поли А Поли У (0,001 МЕ/мл), 4-ПолиА ПолиУ (0,01 МЕ/мл), 5-ПолиА ПолиУ (0,1 МЕ/мл), 6-ПолиА ПолиУ (1 МЕ/мл)

И ФГА (10 мкг/мл) 0 дексаметазон (10-3 мкг/мл) □ ПФК (150 мкг/мл)]

Данные влияния ПФК на апоптоз в культуре лимфоцитов больных с ХПН представлены в таблице 6. При анализе индуцированного активацией апоптоза лимфоцитов больных ХПН оказалось, что в культуре с ФГА определяется максимальный процент гибнущих клеток - 68,2±3,4%. Минимальное содержание погибших путем апоптоза лимфоцитов в культуре с дексаметазоном составило 35,5+3,2%. В максимальной дозе ПФК данный показатель увеличивается до 55,3±2,1% (Рисунок 3).

Таблица 6. Влияние различных концентраций ПФК на апоптоз лимфоцитов больных ХПН в культуре через 72 часа инкубации.

N=25 Контроль Дексаметазон 10"3 мг/мл Концентрации ПФК в культуре мкг/мл

20 50 100 150

Процент апоптоти- ческих чимфоцитов 68,2±3,4* 35,5+2,2*» 42,0±1,6* 47,0±0,5* 50,0±1,8* 55,312,1*

*р<0,05 * *р<0,01

Таким образом, самые значительные различия мы видим в контрольной культуре с ФГА: наиболее низкий процент апоптоза у лимфоцитов здоровых доноров и самый высокий у больных с ХПН. Возможно это обусловлено тем , что лимфоциты больных ХПН в циркуляции находятся под воздействием множества активационных факторов и сигналов. Как известно, процесс активации лимфоцита может реализоваться или путем пролиферации, или через апоптотическую гибель при дополнительной нагрузке, будь-то антигенное воздействие или стимуляция митогеном. При хронической почечной недостаточности на лимфоциты воздействует множество негативных активационных сигналов, обеспечивающих эффект предстимуляции и дополнительное воздействие, что в данной ситуации может служить толчком к апоптотической гибели клеток.

Рисунок 3. Цитометрический анализ апоптоза лимфоцитов, индуцированных активац *ей у больных ХПН под влиянием дексаметазона и ПФК.

ФГА (10 мкг/мл)-68%

ПФК (150 мкг/мл)-55%

Дексаметазон (10 3 мг/мл)-35%

Сравнивая данные влияния дексаметазона и ПФК на апоптоз лимфоцитов в культуре больных ХПН (Рисунок 3) с показателями, полученными в культуре здоровых доноров (Рисунок 1), можно сделать предположение о наличии частичной резистентности к глюкокортикостероидным гормонам и к полифуранкарбоновой кислоте. Снижение чувствительности возможно связано с терапией глюкокортикостероидными гормонами, которую получало большинство данных пациентов, что по-видимому отразилось на выживании устойчивых лимфоцитарных клонов. Вероятно, такой же механизм связан с низкой отвечаемостью на воздействие полифуранкарбоновой кислоты. Выше упоминалось, что в сыворотке больных с уремией концентрация полифуранкарбоновой кислоты постепенно нарастает в зависимости от стадии данной патологии. Мы обследовали больных в терминальной стадии ХПН, когда концентрация ПФК в сыворотке достигает максимальных значений.

Можно предположить, что длительное воздействие данного соединения, для которого характерна мощная индукция апоптоза, приводит, как и в случае с терапией глюкокортикостероидными гормонами, к выживанию более резистентных к апоптозу клонов лимфоцитов. Данный эффект может быть связан непосредственно с повышением экспрессии антиапоптотических генов у лимфоцитов.

Иммунофенотипирование проводили по стандартной методике представленной выше. Лимфоциты анализировали до и после инкубации в культуре in vitro. Показатели иммунофенотипирования представлены в таблице 7.

Как видно из полученных результатов: у больных отмечается снижение CD3+ лимфоцитов (49±1,5%) и резкое уменьшение CD4+ субпопуляции (28±2,0%) без значительного изменения показателя CD8 (20±.1,8%)

После культивации во всех трех культурах лимфоцитов: с ФГА, с ПФК и при инкубации с дексаметазоном наблюдается резкое уменьшение CD3+ лимфоцитов до 18%, за счет снижения CD4+ субпопуляции до 5%. Соотношение CD4/CD8 (иммунорегуляторный индекс) после культивации достигает 0,3, а показатели по CD8+ субпопуляции меняются менее значительно - 11%.. Эти данные свидетельствуют о том, что иммунодефицитное состояние при хронической почечной недостаточности, сопровождающееся резким снижением количества лимфоцитов, возможно обусловлено массовой гибелью CD4+ субпопуляции путем апоптоза.

Таблица 7. Показатели иммунофенотипирования.

Относите льное содер жание лим4 эцитов %

Условия культивации CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 CD16

До культивации 49±1,5 28±2,0 20±1,8 1,4 5±1,2

После 72 часов культивации ФГА 10 мкг/мл 21±1,2* 7±0,2** 12±0,3 0,5** 2±0,1

Дексамеазон 10'3 мг/мл 18±1,3» 5±0,3** 13±0,2 0,4** 1±0,2

ПФК 150 мкг/мл 19±2,0* 6±0Д** 11±0,3 0,6** 3±0,1

*р< 0,05 **р<0,01

Мы изучали влияние комплекса ПолиА:ПолиУ на апоптоз лифоцитов больных ХПН в культуре in vitro. Данные представлены в таблице 8. Из полученных результатов видно, что в культуре с ФГА процент апоптотических клеток при максимальной концентрации ПолиА: ПолиУ достоверно уменьшался до 40,2±2,5%. В культуре с ПФК этот показатель составил 36,5±1,6%, а при добавлении дексаметазона процент клеток ушедших в апоптоз уменьшился до 23,2±2,1%, по сравнению с показателями без добавления ПолиА:ПолиУ. Таким образом, мы можем говорить о протективном действии комплекса ПолиА:ПолиУ и увеличении процента выживших клеток в культуре лимфоцитов у больных с ХПН.

Таблица 8. Влияние различных концентраций синтетического комплекса ПолиАгПолиУ на апоптоз лимфоцитов больных ХПН.

Содержание апоптотических клеток в культуре лимфоцитов в %

Культивация без ПолиА :ПолиУ Концентрация ПолиА:ПолиУ МЕ/мл

0,001 0,01 0,1 1

Контроль(ФГА) 68,2± 3,4 62,0±0,8 55,5±1,3 48,0±1,5 * 40,2 ±2,5 *

Дексаметазон СЮ'3 мг/мл) 35,5± 2,2 32,0±0,2 30,0±0,8 27,0±0,5 23,2±2,1 • *

ПФК (150 мкг/мл) 55,3± 2,1 48,5±1,5 45,0±0,8 39,0±1,5 * 36,5±1,6 * .

*р<0,05

Мы сравнили данные влияния различных концентраций ПолиА:ПолиУ на процент содержания апопт отических клеток, в культуре лимфоцитов с ПФК и дексаметазоном у здоровых доноров-(Рисунок 2) и больных ХПН (Таблица 8). Из полученных результатов видно, что вне зависимости от факторов, индуцирующих апоптоз в культуре лимфоцитов, синтетический комплекс ПолиА:ПолиУ дозозависимо снижает процент клеток, гибнущих путем апоптоза, и способствуют выживанию их в культуре не только у здоровых доноров, но и у больных с ХПН. Все вышеперечисленное свидетельствует о том, что ПолиА:ПолиУ протективно действует на лимфоциты при ХПН, а также возможно и при других "патологиях. Это открывает новые возможности применения данного препарата в лечении различных заболеваний, в особенности.тех, в патогенезе которых важную роль играет активация апоптоза.

Выводы.

1. Отработанная модель апоптоза, индуцированного активацией, позволяет количественно оценивать программированную гибель Т-лимфоцитов человека в культуре in vitro под влиянием различных факторов.

2. Полифуранкарбоновая кислота является мощным индуктором апоптоза и дозозависимо угнетает пролиферативную активность лимфоцитов здоровых доноров в культуре in vitro.

3. Дексаметазон и полифуранкарбоновая кислота в меньшей степени индуцируют апоптоз в культуре лимфоцитов больных ХПН по сравнению со здоровыми донорами.

4. Т-лимфоциты периферической крови больных ХПН в значительно большей степени подвержены апоптотической гибели в культуре in vitro с ФГА, чем активированные лимфоциты здоровых доноров.

5. CD4+ лимфоциты в наибольшей степени подвержены гибели в культуре у больных ХПН под воздействием различных апоптотических факторов.

6. Синтетический комплекс ПолиА:ПолиУ частично отменяет проапоптогенное действие ПФК и дексаметазона и способствует выживаемости клеток в культуре лимфоцитов in vitro у здоровых доноров и больных ХПН.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Влияние полифуранкарбоновой кислоты на пролиферативную активность и апоптоз лимфоцитов человека//БЭБИМ 1999 (соавт. JI.B. Ковальчук, A.C. Павлюк, JI.A. Харламова, В.Н. Синюхин).

2. Влияние полифуранкарбоновой кислоты на пролиферативную активность лимфоцитов в культуре in vitro. // соавт. JI. В. Ковальчук, А. С. Павлюк, Н. В. Чирун). Jlw^ii^v^f^fcU toA'cic ßgß

3. Количественная оценка апоптоза лимфоцитов человека в норме и при патологии // J. Immunorehabilitation 1998, №8, Р 8 (соавт. JI.B. Ковальчук, A.C. Павлюк, Н.В. Чирун).

4. Клиническая значимость лекарственного воздействия на апоптоз лимфоцитов человека//Материалы VI Всерос. Нац. Конгресса С.. 37 , 1999 (соавт. J1.B. Ковальчук, A.C. Павлюк).

5. Синтетический комплекс ПолиА:ПолиУ отменяет влияние дексаметазона и ПФК как индукторов апоптоза лимфоцитов. // J. Immunorehabilitation 1999, № 2, С13. (JI.B Ковальчук, A.C. Павлюк, А.А Каспаров).

Автор выражает благодарность доктору медицинских наук, зав. лабораторией иммунологии ин-та Урологии В.Н Синюхину за оказанную помощь в проделанной работе.

Сдано в набор 17.05.99.

Подписано в печать 18.05.99.

Формат 60x84 1/16. Бумага писчая.

Печать офсетная.

Усл.пл. 1,4.

Заказ 2199. Тираж 100.

Отпечатано в Курской городской типографии, г. Курск, ул. Ленина, 77.