Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга при различных вариантах острых лейкозов

Колбацкая, Ольга Павловна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга при различных вариантах острых лейкозов

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Колбацкая, Ольга Павловна Москва 2011 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.01.12

Автореферат диссертации по медицине на тему Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга при различных вариантах острых лейкозов

На права^ругоТшсйу>

КОЛБАЦКАЯ ОЛЬГА ПАВЛОВНА

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ КОСТНОГО МОЗГА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗОВ

14.01.12 -онкология

- 1 ДЕК 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2011

005004554

Работа выполнена в лаборатории иммунологии гемопоэза централизованного клинико-лабораторного отдела НИИ клинической. онкологии Учреждения Российской Академии Медицинских Наук Российского Онкологического Научного Центра имени Н.Н.Блохина РАМН (директор — академик РАН и РАМН М.И.Давыдов).

Научный руководитель -

Официальные оппоненты -

доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Тупицын доктор медицинских наук, профессор А.А.Ярилин доктор медицинских наук Г.С.Тумян

Ведущее учреждение -

ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования

Защита диссертации состоится /4 а 2011г. в « /а часов на заседании диссертационного совета при Российском онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Онкологического Научного Центра имени Н.Н.Блохина РАМН Автореферат разослан « ■// 2011г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Барсуков Ю.А.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Костный мозг является гемопоэтическим органом. Вместе с тем в пуле лимфоцитов костного мозга присутствуют зрелые эффекторные клетки иммунной системы, способные осуществлять гуморальный и клеточный иммунный ответ, в терминах онкологии — иммунный надзор за опухолевым процессом. Костномозговые клетки-предшественницы являются мишенью для развития острых лейкозов. Процесс изначально развивается в костном мозге, поэтому представляет большой интерес изучение иммунной системы костного мозга при диагностике острого лейкоза для оценки возможных иммунодефицитных состояний, в условиях которых пролиферирует лейкозный клон.

Существуют единичные публикации о том, что у больных острыми лейкозами (ОЛ) повышено содержание >ТК.-клеток по сравнению со здоровыми донорами в костном мозге при диагностике и в периферической крови при достижении полной ремиссии, а также о функциональной анергии цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и Т-хелперов костного мозга в остром периоде. В литературных источниках нет систематизированных данных об изменении относительного и абсолютного содержания субпопуляций Т-, В-, МК-клеток и С056+Т-клеток костного мозга больных ОЛ по сравнению с нормой, экспрессии на них молекул активации, а также о зависимости количества лимфоцитов от нозологического варианта ОЛ и фенотипических особенностей бластных клеток.

Проведение этих исследований открывает перспективу изучения субпопуляций лимфоцитов костного мозга, а также оценки взаимосвязи и различий между иммунофенотипическими характеристиками бластной и лимфоцитарной популяций клеток костного мозга больных ОЛ.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Провести сравнительную характеристику субпопуляций лимфоцитов костного мозга при различных вариантах острых лейкозов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1) Изучить относительное и абсолютное содержание Т-, В- и ИК-клеток в костном мозге больных острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) при диагностике,

2) Изучить относительное и абсолютное содержание Т-, В- и ЫК-клеток в костном мозге больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) при диагностике,

3) Сравнить относительное и абсолютное содержание субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных острым миелоидным лейкозом и острым лимфобластным лейкозом,

4) Сравнить относительное и абсолютное содержание субпопуляций лимфоцитов костного мозга при иммуноподвариантах острого лимфобластного лейкоза и морфоцитохимических вариантах острого миелоидного лейкоза,

5) Оценить субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга при диагностике острых лейкозов в зависимости от иммунофенотипа бластных клеток.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

На основании проведенного комплексного морфоцитохимического и иммунологического (трехцветная проточная цитометрия) анализа клеток костного мозга 124 больных острыми лейкозами получены новые научные данные. Установлены существенные различия в субпопуляционном составе лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ и ОЛЛ: при ОЛЛ достоверно выше количество Т-хелперов, а при ОМЛ - Т-цитотоксических клеток, что отражается на значимо более высоком иммунорегуляторном индексе у больных ОЛЛ (0,7 ± 0,04 против 1,3 ± 0,2 р=0,005). Помимо этого, в лимфоцитарной популяции костного мозга больных ОЛЛ по сравнению с больными ОМЛ выше относительное и абсолютное количества СО 19+С05+клеток, а также лимфоцитов, коэкспрессирующих маркеры С038 и НЬА-ОЯ (р<0,05).

Впервые установлены особенности субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга в зависимости от линейной принадлежности бластных клеток ОМЛ и от иммуноподварианта ОЛЛ. При гранулоцитарных острых лейкозах повышено количество Т-хелперов (СБ45+С04+) в сравнении с лейкозами моноцитарной дифференцировки (М4 и М5 по РАВ-классификации, р=0,005). В пределах В-линейных ОЛЛ выявлено, что субпопуляционный состав лимфоцитов взаимосвязан со степенью дифференцировки лейкоза: процент СБ45+СБЗ+ Т-клеток выше у больных пре-пре-В-иммуноподвариантом по сравнению с больными пре-В-иммуноподвариантом (р=0,016). При В-линейных острых лимфобластных лейкозах отмечено существенное преобладание зрелых Т-лимфоцитов (СБ45+СОЗ+) в сравнении с Т-линейными ОЛЛ (р=0,008).

каждого нозологического варианта ОЛ, так и между ОМЛ и ОЛЛ. Влияние на субпопуляционный состав лимфоцитов оказывает экспрессия на бластных клетках ОМЛ молекул СЕ)7 и НЬА-ОЯ. При ОЛЛ субпопуляционный состав Т-клеток был взаимосвязан с экспрессией на бластах молекул НЬЛ-БЯ, СБ 13 и СБЗЗ.

Полученные нами результаты дают новые факты к пониманию патогенеза острых лейкозов с точки зрения взаимодействия бластных клеток с иммунной системой костного мозга.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты проведенного исследования позволяют более точно оценить состав субпопуляций лимфоцитов костного мозга у больных острыми лейкозами. Выявление значимых различий между субпопуляциями лимфоцитов при острых миелоидных лейкозах и острых лимфобластных лейкозах позволяет оценить особенности эффекторных субпопуляций лимфоцитов у этих больных. Это, в свою очередь, способствует более углубленному пониманию механизмов противоопухолевого иммунитета у больных ОЛ, что может быть учтено при разработке протоколов иммунотерапии и иммунокоррекции при лечении ОЛ.

лимфоцитарную популяции было невозможно разграничить по уровню экспрессии CD45, так как бласты экспрессировали этот антиген на высоком уровне. Этот результат свидетельствует о необходимости разработки новых методов гейтинга для анализа лимфоцитарной популяции в подобных случаях.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация апробирована на совместной научной конференции с участием лаборатории иммунологии гемопоэза, лаборатории иммунологии опухолей, клинико-диагностической лаборатории централизованного клинико-лабораторного отдела, отделения химиотерапии гемобластозов, отделения трансплантации костного мозга и интенсивной химиотерапии, отделения биотерапии опухолей НИИ КО, отдела химиотерапии гемобластозов НИИ ДОиГ РОНЦ им Н.Н.Блохина РАМН 26 октября 2010 года.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 183 страницах, состоит из введения, 5 глав, в которых представлены данные литературы, результаты собственных исследований и выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 41 таблицей и 7 рисунками. Библиографический указатель включает 11 отечественных и 212 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Исследуемую группу составили 124 больных острыми лейкозами, проходивших морфоцитохимическую и иммунофенотипическую диагностику в лаборатории иммунологии гемопоэза (руководитель — д.м.н. проф. Н.Н.Тупицын) РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН в период с 2004 по 2010 годы. У 57 больных был установлен диагноз острого миелоидного лейкоза, у 67 больных — острого лимфобластного лейкоза. У всех больных диагноз острого лейкоза был установлен впервые, без предшествующего химиолучевого лечения или наличия миелодиспластического синдрома.

Среди обследованных больных в группе ОМЛ было 26 (45,6%) женщин и 31 (54,4%) мужчина, средний возраст у больных ОМЛ - 46,7 года. В группе ОЛЛ также было больше мужчин - 42 (62,7%), чем женщин - 25 (37,3%), средний возраст больных ОЛЛ составляет 33,3 года.

Морфоцитохимическое и иммунофенотипическое исследование бластов проводились в пунктатах костного мозга. Взятие костного мозга в количестве не более 0,5мл осуществлялось в пробирки УасЩашег с сухим ЭДТА. Из доставленных пунктатов готовили мазки для морфологического и цитохимического исследований, производился подсчет миелокариоцитов и иммунофенотипирование. Окраска морфологических препаратов проводилась по методу Паппенгейма.

Подсчет миелограммы проводился двумя морфологами (по 250 клеток) при иммерсионной микроскопии препаратов костного мозга.

При цитохимическом исследовании определяли активность в бластных клетках следующих ферментов: миелопероксидазы (МПО), липидов в реакции с Суданом черным Б, а-нафтил-ацетат-эстеразы (НЭ) самостоятельно и в реакции с ингибированием фторидом натрия (ИаР), РАБ-положительного вещества в диффузной/диффузно-гранулярной или гранулярной форме.

Диагноз ОМЛ у всех больных устанавливался на основании критериев ФАБ-классификации и последующих ВОЗ-классификаций (2001 и 2008г.г.), число бластных клеток во всех случаях превышало 20%, таблица 1.

Таблица 1. Распределение больных ОМЛ по БАВ-вариантам.

Вариант Число больных

Абсолютное Относительное (%)

МО (миелобластный с минимальной дифференцировкой) 5 8,8

М1 (миелобластный без созревания) 21 36,8

М2 (миелобластный с созреванием) 7 12,3

МЗ (промиелоцитарный) 7 12,3

М4 (миеломонобластный) 8 14,0

М4эоз.(миеломонобластный с эозинофилией) 4 7,0

М5а (монобластный без созревания) 2 3,5

М5б (монобластный с созреванием) 0 0

Мб (эритробластный) 2 3,5

М7 (мегакариобластный) 1 1,8

Всего 57 100

Иммунофенотипирование у всех больных проводилось методом прямой

иммунофлюоресценции с использованием тройной флюоресцентной метки.

Панель моноклональных антител (МКА) • включала антитела к

общелейкоцитарному антигену СИ45, стволовоклеточному антигену СИ34,

линейно-нерестриктированным антигенам СЮ38 и НЬЛ-БЯ, антигенам

миелоидной линии дифференцировки СБ13 и СБЗЗ, моноцитарной - С014 и

СБ64, эритроидной - гликофорину А (01уА), мегакариоцитарной - СБ61,

общему антигену острого лимфобластного лейкоза CD 10 (CALLA), В-линейным антигенам (CD 19, CD20, CD22, CD23), Т-линейным антигенам (CD3, CD5, CD7, CD4, CD8, CD 1а) и NK-клеточному антигену CD56. Маркер расценивался как положительный при обнаружении его более чем на 20% бластов. Для верификации диагноза использовались цитоплазматические и ядерные маркеры CD22, CD3, Tdt, МРО.

Анализ данных иммунофенотипирования проводился методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, США). Собиралось от 20 ООО до 50 ООО событий.

Установление гейта бластных клеток проводилось на основании характеристик светорассеяния в метке с общелейкоцитарным антигеном CD45. Властные клетки характеризуются более слабой экспрессией CD45 по сравнению со зрелыми лимфоцитами и созревающими/зрелыми клетками миелопоэза, рис.1.

Сй 45 СУ 5

Рис.1. Пример гейтинга по С045/58С лимфоцитарной и бластной популяций костного мозга при ОЛЛ ю В-линейных предшественников (пре-пре-В иммуноподвариант), Ю-лимфоциты, И2-бласты.

Распределение больных по подвариантам ОЛЛ представлено в таблице 2.

Таблица 2. Распределение больных ОЛЛ по иммуноподвариантам.

I__

Вариант Число больных

Абсолютное Относительное(%)

Про-В 6 9

Пре-пре-В 28 42

Пре-В 1 1,5

Пре-Т 32 47,5

Всего 67 100

В работе нами применены два метода оценки процента лимфоцитов в костном мозге больных ОМЛ — морфологический (по миелограмме) и проточно-цитометрический. Пример цитометрического определения лимфоцитов приведен на рис.2.

СО 45 РЕЯ СР (5) БЭС-НядМ (2)

R1 - гейт лейкоцитов, R2 - гейт лимфоцитов, R3 - ядерные эритроидные клетки, эритроциты, тромбоциты, дебрис. По данным цитометрии количество лимфоцитов среди лейкоцитов - 3,2%. Цитометрически определяемый процент лимфоцитов среди миелокариоцитов составляет 3,13% (с поправкой на содержание ядерных эритроидных клеток по миелограмме).

Оба метода хорошо коррелировали между собой, достоверных различий в процентном содержании лимфоцитов, определяемых морфологически и цитометрически, не установлено. Поскольку цитометрически можно более точно подсчитать процентное содержание лимфоцитов при их низком количестве (при высоком бластозе) ввиду возможности оценки десятков тысяч клеток, то при дальнейшем изложении приводим проценты лимфоцитов в соответствии с цитометрическим методом.

Следует отметить, что в большинстве случаев на основании гейтинга по экспрессии CD45 бластная и лимфоцитарная популяции четко разделялись во всех случаях OMJI, а при OJIJI в части случаев (исключены из анализа) бласты характеризовались яркой экспрессией С045-антигена. Подтверждением эффективности разделения служило отсутствие зрелых Т или В-клеток в бластном гейте и, напротив, отсутствие клеток с маркерами предшественников в лимфоцитарном гейте.

Все цитометрические данные были проанализированы на персональном компьютере с использованием программы WinMDI 2.8. Статистическая обработка данных проведена с помощью пакета программ SPSS 15 и включала корреляционный анализ, сравнение средних. При определении достоверности параметрических признаков применялся критерий Стыодента. Сравнительный анализ непараметрических данных производился при помощи построения таблиц сопряженности признаков (с использованием критерия х2).

Результаты исследования

Нами были изучены морфологические, цитохимические и иммунофенотипические особенности клеток костного мозга 124 больных острым лейкозом при диагностике заболевания. Применен метод гейтинга клеток костного мозга по С045/85С и подтверждена возможность разделения лимфоцитарной и бластной популяций по уровню экспрессии общелейкоцитарного антигена СБ45. Это дало нам возможность изучить состав популяций резидуального лимфоцитарного ростка и выявить изменения в их соотношении, характерные для больных острым лейкозом.

Нами также было обнаружено, что не во всех случаях ОЛЛ возможно провести гейтинг по СБ45/85С, так как у половины больных Т-линейным ОЛЛ (59,4%) и у 14,3% больных В-линейным ОЛЛ отмечалась выраженная экспрессия общелейкоцитарного антигена СБ45 на бластах, и отделить лимфоцитарную популяцию от бластной было невозможно. Эти случаи исключены из дальнейшего анализа.

В составе лимфоцитарных популяций костного мозга больных острым лейкозом (ОМЛ и ОЛЛ) преобладали зрелые Т-клетки, также присутствовали В-клетки, ЫК-клетки и СГ)3+С056+Т-клетки.

По результатам нашей работы было определено, что существуют достоверные различия количественного состава лимфоцитарных популяций в зависимости от нозологического варианта острого лейкоза. Эта закономерность характерна как для двух основных вариантов (ОМЛ и ОЛЛ), так и для морфоцитохимических вариантов ОМЛ и иммунофенотипических вариантов ОЛЛ. Помимо этого, были выявлены достоверные различия содержания лимфоцитарных популяций в зависимости от особенностей иммунофенотипа бластных клеток.

Острые миелоидные лейкозы

Содержание миелокариоцитов в анализируемой группе больных ОМЛ (57 человек) в среднем составило 116,0 ± 17,1 х 109/л, с широким диапазоном от 7,0 до 625,0 х 109/л. Преобладали случаи с нормоклеточным костным мозгом (в диапазоне 44,5 — 196 тыс/мкл) — 49,2%, у трети больных костный мозг был гипоклеточным — 19 (33,3%) и лишь у 10 (17,5%) гиперклеточным. Властные клетки в костномозговых пунктатах больных ОМЛ составляли в среднем 72,9 ± 2,7% от всех миелокариоцитов (диапазон 20 — 97,4%).

Относительное содержание лимфоцитов костного мозга, выявляемых морфологически и цитометрически, достоверно не различалось — 6,1 ± 0,8% и 5,5 ± 0,7% (р>0,05). В абсолютных цифрах содержание лимфоцитов, определенных двумя методами, также было практически одинаковым — 4,1 ± 0,7 и 3,7 ± 0,4 тыс/мкл (р>0,05). Пунктаты с нормальным процентом лимфоцитов составляли большинство случаев — 47,4%, со сниженным — 38,6% случаев и с повышенным — всего 14% случаев.

Общее количество Т-лимфоцитов, которое оценивалось нами по экспрессии СБ7-маркера, в костном мозге больных ОМЛ составило 68,5 ± 2,1%, по экспрессии СБЗ-маркера — 75,3 ± 2,0%, по экспрессии СБ5-маркера — 72,8 ± 2,0%. Наши результаты соответствуют тем количествам СБ7+ и СЭЗ+Т-клеток, которые были определены Яа1е1 Я. й а1. (2005) при изучении субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных ОЛ.

Уровень Т-хелперов составил в среднем 27,0 ± 1,2%, ЦТЛ — 43,2 ± 1,5% среди лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ. Процент СВ56-КЮЗ-№С-клеток в костном мозге больных ОМЛ — 13,4 ± 1,3%, процент СВ56+СОЗ+Т-клеток — 8,4 ± 1,2%, а процент В-лимфоцитов — 11,6 ± 1,1%.

Наши результаты показали, что существует различие в содержании клеток-эффекторов костного мозга больных ОМЛ в зависимости от морфоцитохимического варианта: относительное содержание Т-хелперов и

иммунорегуляторный индекс достоверно выше при моноцитоидном варианте ОМЛ по сравнению с гранулоцитарным, таблица 3.

Таблица 3. Сравнение относительных и абсолютных количеств СЭ4+ Т-клеток между гранулоцитарными и моноцитоидными ОМЛ.

Субпопуляция Количество Варианты ОМЛ Р

Гранулоцитар-ный Моноцитоид-ный

М ± т (п=40) М±ш(п=14)

СБ4+ Отн.(%) 25,8 ± 1,4 30,4 ± 2,2 0,005

Абс. (тыс/мкл) 1,0 ±0,2 1,2 ±0,3 0,408

СБ4/С08 0,6 ± 0,04 0,9 ±0,1 0,017

В целом, иммунорегуляторный индекс костного мозга больных ОМЛ составил 0,7 ± 0,04, что свидетельствует о преобладании субпопуляции ЦТЛ над Т-хелперами. В случае моноцитоидных ОМЛ СБ4/СБ8-соотношение составило 0,9 ±0,1, что означает практически равное количество ЦТЛ и Т-хелперов. Но при гранулоцитарном ОМЛ процент ЦТЛ почти вдвое превышал процент Т-хелперов, о чем свидетельствует С04/С08-соотношение 0,6 ± 0,04. Это наблюдение можно объяснить либо большей выраженностью ответа ЦТЛ на развитие лейкемического клона и/или меньшим токсическим воздействием бластов на Т-хелперы в случае моноцитоидных ОМЛ.

Новым фактом, установленным в нашей работе, явилось повышение количества лимфоцитов, коэкспрессировавших линейно не рестриктированные маркеры (С038+НЬА-0К+), в группе больных острыми

моноцитоидными лейкозами по сравнению с больными гранулоцитарным ОМЛ (р=0,035), таблица 4.

Таблица 4. Сравнение между гранулоцитарными и моноцитоидными ОМЛ количества лимфоцитов, коэкспрессирующих активационные маркеры С038 и НЬД-ОЯ.

Субпопуляция Количество Варианты ОМЛ Р

Гранулоцитар-ный Моноцитоид-ный

М ± ш (п=34) М ± ш (п=13)

СБ38+ НЬА-ОЯ+ Отн.(%) 4,7 ± 0,8 8,4 ± 1,8 0,035

Абс. (тыс/мкл) 0,2 ± 0,04 0,3 ±0,1 0,102

В настоящее время является общепризнанным тот факт, что экспрессия различных линейно не рестриктированных антигенов (С034, С038, СБ56) является прогностически значимой при ОМЛ, поэтому мы провели оценку лимфоцитарных субпопуляций в зависимости от особенностей иммунофенотипа бластов. Наше предположение о том, что иммунофенотипические особенности бластных клеток могут влиять на состав лимфоцитарных популяций, подтвердилось полученными результатами.

Изучение субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ в зависимости от иммунофенотипических особенностей бластных клеток выявило ряд закономерностей. Так, при коэкспрессии на миелобластах Т-лимфоцитарного антигена СБ7 достоверно выше проценты СГ35+ и СП8+Т-клеток, а также активированных СБ38+ лимфоцитов по сравнению с С07-негативными ОМЛ, таблица 5.

Таблица 5. Сравнение субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ (М0-М5а варианты) в зависимости от экспрессии на бластных клетках антигена СГ)7.

Субпопуляции лимфоцитов Иммунофенотип ОМЛ Р

СБ7>=20% (п=Ю) СЭ7<20% (п=44)

СБ38 (отн.) (%) 31,2 ±6,6 17,8 + 2,0 0,010

СБ 38 (абс.) (тыс/мкл) 1,3 ±0,5 0,7 ± 0,2 0,110

СБ8 (отн.) (%) 49,4 ± 4,6 41,1 + 1,5 0,032

СБ8 (абс.) (тыс/мкл) 2,0 ± 0,5 1,4 ±0,2 0,228

СЭ5 (отн.) (%) 81,0 ±4,3 70,1 ±2,2 0,038

СБ5 (абс.) (тыс/мкл) 3,2 ± 0,8 2,6 ± 0,4 0,469

Сравнение субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ в зависимости от уровня экспрессии на бластных клетках антигена НЬА-ОЯ показало, что при экспрессии данного антигена имеется статистически достоверное повышение относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих активационный маркер НЬА-ОЛ (р=0,028). Но абсолютные количества НЬА-011-позитивных лимфоцитов при сравнении достоверно не различаются (р=0,348). При повышенной экспрессии НЬА-ОИ-маркера отмечается достоверное повышение как относительного количества

лимфоцитов с активационным маркером СЭ23 (р=0,004), так и их абсолютного количества (р=0,026), таблица 6.

Таблица 6. Сравнение субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ (варианты М0-М5а) в зависимости от экспрессии на бластных клетках антигена НЬА-1Ж.

Субпопуляции Иммунофенотип ОМЛ

лимфоцитов Р

НЬА-ОЯ>=20% НЬА-БК< 20%

НЬА-ОЫ (отн.) 25,6 ± 2,5 16,0 + 2,8 0,028

(%) (п=38) (п=16)

НЬА-БИ (абс.) 0,9 ± 0,2 0,6 ± 0,2 0,348

(тыс/мкл) (п=37) (п=17)

СБ23 (отн.) 6,6 ± 1,7 21,5 ±6,3 0,004

(%) (п=33) (п=14)

СБ23 (абс.) 0,3 ± 0,1 1,0 + 0,5 0,026

(тыс/мкл) (п=33) (п=14)

Острые лимфобластные лейкозы

Содержание миелокариоцитов в анализируемой группе больных ОЛЛ (67 человек) в среднем составило 176,6 ± 22,5 тыс/мкл с широким диапазоном от 5,0 до 720 тыс/мкл. Преобладали случаи с нормоклеточным костным мозгом (в диапазоне 44,5 — 196 тыс/мкл) — 47,6%, почти в трети случаев ОЛЛ клеточность была повышена (27,2%) и в 20,4% случаев отмечено снижение абсолютного количества миелокариоцитов. Властные

клетки в костномозговых пункгатах больных ОЛЛ в среднем составляли 86,5 ± 1,8% от всех миелокариоцитов (диапазон 28,2 - 99,2%).

Мы определили цитометрическим методом количество лимфоцитов в костном мозге больных ОЛЛ со слабой экспрессией СБ45-маркера на бластах аналогично тому, как был проведен подсчет числа лимфоцитов в костном мозге больных ОМЛ. При сравнении между собой относительных количеств лимфоцитов костного мозга больных ОЛЛ, подсчитанных морфологически и цитометрически, достоверных различий не выявлено (4,0 ± 0,6% против 4,8 ± 0,8%, р=0,242). В абсолютных цифрах содержание лимфоцитов по результатам двух методов также было практически одинаковым: 4,0 ± 0,7 тыс/мкл морфологически и 4,4 ± 0,6 тыс/мкл цитометрически (р=0,641). В большинстве пунктатов (61%) отмечалось снижение процента лимфоцитов, нормальное относительное количество лимфоцитов было в 36,4% случаев и повышенное — всего в 2,6% случаев.

Среди субпопуляций костного мозга больных ОЛЛ мы определили 71,1 ± 2,5% С07-позитивных Т-лимфоцитов, 71,5 ± 2,3% СБЗ+Т-клеток и 74,1 ± 2,1% СБ5+Т-клеток, что также соответствует результатам, приведенным в статье 11а1е1 К. е1 а1. (2005). Уровень Т-хелперов составил 33,0 ± 1,9%, ЦТЛ — 36,3 ± 2,3%. Относительное содержание СБ56+СБЗ-КК-клеток было в среднем 15,2 ± 1,9%, СБ56+СВЗ+Т-клеток — 10,9 ± 5,4%, а уровень В-лимфоцитов — 10,2 ± 1,2%, что соответствует тем количествам СБ19+клеток, которые приведены в статье 11а1е1 Я. е1 а1.

При изучении субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных В-линейными ОЛЛ нами были выявлены новые данные, свидетельствующие о достоверных различиях в количестве Т-лимфоцитов в зависимости от степени дифференцировки лейкоза. Так, процент С1)3+Т-клеток выше у больных пре-пре-В-иммуноподвариантом по сравнению с больными пре-В-подвариантом (р=0,016), таблица 7.

Таблица 7. Сравнение количества СБЗ+ субпопуляции Т-лимфоцитов костного мозга у больных В-ОЛЛ (пре-пре-В и пре-В иммуноподварианты).

Количество СБЗ+ лимфоцитов Больные В-ОЛЛ (М ± т) Р

Пре-пре-В иммуноподвариант (п=24) Пре-В иммуноподвариант (п=13)

Отн. (%) 75,2 ± 2,5 62,1 ±5,4 0,016

Абс. (тыс/мкл) 2,6 ± 0,4 2,6 ± 0,5 0,928

Обнаружено, что субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга больных ОЛЛ взаимосвязан с линейной коммитированностью бластных клеток: относительное содержание зрелых СБЗ+Т-клеток существенно выше при лейкозах из В-линейных предшественников по сравнению с пре-Т-клеточными лейкозами (р=0,006), таблица 8.

Таблица 8. Сравнение количества СБЗ+ субпопуляции костного мозга при В-линейных и Т-линейных ОЛЛ.

Количество СБЗ+ субпопуляции Больные ОЛЛ (М ± ш) Р

В-линейные подварианты (п=27) Пре-Т подвариант (п=12)

Отн. (%) 75,6 ±2,1 62,1 ±5,4 0,006

Абс.(тыс/мкл) 2,7 ± 0,4 2,6 ± 0,5 0,844

Мы можем предположить, что бластные клетки ОЛЛ из В-линейных предшественников отличаются либо большей иммуногенностью по сравнению с пре-Т-иммуноподвариантом, либо более высоким уровнем активационно-индуцированного апоптоза Т-лимфоцитов в случае Т-ОЛЛ.

Взаимосвязь лимфоцитарных популяций и особенностей иммунофенотипа бластов характерна также и для ОЛЛ. С помощью непараметрических тестов мы выявили, что у стволовоклеточных ОЛЛ достоверно выше процент СБЗ+Т-клеток в случае В-линейных по сравнению с Т-линейными лейкозами (76,4 ± 2,2% против 59,3 ± 11,4% р=0,022). Но сравнение абсолютных количеств СОЗ+Т-клеток между этими группами достоверных различий не выявило.

При С038-позитивных ОЛЛ количество СОЗ+Т-клеток достоверно выше в случае В-линейных ОЛЛ по сравнению с пре-Т ОЛЛ (73,3 + 2,5% против 62,1 ± 5,4% р=0,042). Абсолютные количества СОЗ+ лимфоцитов не различались (р=0,710).

Этот факт чрезвычайно важен и нуждается в дальнейшем изучении. Дело в том, что в целом по группе экспрессия СБ38 не ассоциировалась с большей выраженностью уровней Т-клеток. Однако в группе С038-позитивных ОЛЛ проценты СОЗ+ клеток в костном мозге больных В-линейными ОЛЛ были достоверно выше, чем при Т-линейных ОЛЛ, что отражает общую закономерность преобладания СОЗ+ клеток в костном мозге больных В-линейными ОЛЛ в сравнении с Т-линейными ОЛЛ при диагностике. Важно отметить, что прямой ассоциации экспрессии С038 с В-линейностью не отмечено. Напротив, частота экспрессии С038-антигена при лейкозах из В-линейных предшественников составила 69,3%, а при Т-линейных -100%.

Сравнение С056-негативных В-линейных ОЛЛ и пре-Т ОЛЛ выявило достоверные различия в субпопуляциях Т-клеток. Относительные количества СЭЗ+ Т-лимфоцитов были достоверно выше в случае В-ОЛЛ (75,0 ± 2,5%

против 58,3 ± 5,7% р=0,004), а также и С05+Т-лимфоцитов (77,4 ± 2,4% против 65,0+4,9% р=0,015). Абсолютные количества СБЗ+ и С05+Т-клеток достоверно не различались (р>0,050).

Сравнение субпопуляций костного мозга больных ОМЛ и ОЛЛ

Впервые нами был выявлен факт, что у больных острым лейкозом может существовать значительный дисбаланс содержания клеток-эффекторов, который отмечается преобладанием Т-хелперов или ЦТЛ в зависимости от нозологического варианта ОЛ. При сравнении относительного содержания субпопуляций Т-лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ и ОЛЛ нами было отмечено, что процент ЦТЛ достоверно выше у больных ОМЛ (р=0,011), а процент Т-хелперов достоверно выше у больных ОЛЛ (р=0,006). Достоверные различия иммунорегуляторных индексов С04/С08 у этих двух групп больных (р=0,003) подтверждают сделанное нами наблюдение (табл.9). Высокий иммунорегуляторный индекс, полученный нами при оценке Т-клеточных субпопуляций костного мозга больных ОЛЛ (1,3 ± 0,2), свидетельствует о преобладании Т-хелперов над ЦТЛ.

Таблица 9. Сравнение относительных и абсолютных количеств СБ4+ Т-клеток и С08+ Т-клеток больных ОМЛ и ОЛЛ.

Субпопуляции Количество лимфоцитов Больные ОМЛ (п=57) Больные ОЛЛ (п=34) Р

СБ4+ Отн.(%) 27,0 ± 1,2 33,0 ± 1,9 0,006

Абс. (тыс/мкл) 1,0 ±0,1 1,3 ±0,2 0,160

CD8+ Отн. (%) 43,2 ± 1,5 36,3 ±2,3 0,011

Абс. (тыс/мкл) 1,5 ±0,2 1,3 ±0,2 0,371

CD4/CD8 0,7 ± 0,04 1,3 ±0,2 0,003

Общее количество Т-клеток, которое оценивалось по экспрессии CD3, CD5 и СБ7-антигенов, у больных OMJT и OJIJI не различалось, как и относительное содержание CD56+CD3-NK-KiieTOK, С056+Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов (р>0,05). Мы можем предполагать, что количественные различия в содержании лимфоцитарных популяций костного мозга при развитии острого лейкоза в основном затрагивают клетки-эффекторы (Т-хелперы и ЦТЛ).

Мы выявили, что в зависимости от варианта острого лейкоза существуют различия в составе В-лимфоцитарной популяции. Так, у больных ОМЛ статистически достоверно выше процент С1Э22+В-лимфоцитов (12,0 ±1,5% против 6,5 ±0,9% р=0,004) по сравнению с больными ОЛЛ, но абсолютные количества данной субпопуляции достоверно не различаются (р=0,084). Напротив, у больных ОЛЛ достоверно выше количество CD 19+С05+субпопуляции В-лимфоцитов как в относительном значении (1,8 ± 0,3% против 4,8 ± 1,1% р=0,002), так и в абсолютном (0,1 ± 0,02тыс/мкл против 0,2 ± 0,06тыс/мкл, р=0,010).

Мы можем предполагать, что лейкемический клон оказывает воздействие и на гуморальное звено иммунитета костного мозга, механизмы которого различаются в зависимости от биологии бластных клеток, варианта ОЛ.

Сравнение количества лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ и ОЛЛ, коэкспрессирующих маркеры CD38+ и HLA-DR+, показало, что у больных ОЛЛ достоверно выше как относительное количество данной

субпопуляции (11,8 ± 2,7% против 5,6 ± 0,8% р=0,004), так и абсолютное (0,6 ± 0,2 тыс/мкл против 0,2 ± 0,04тыс/мкл, р=0,013).

Нами также было выявлено, что состав лимфоцитарных популяций различается при экспрессии линейно не рестриктированных антигенов на бластах, независимо от варианта ОЛ: при НЬА-ЭЯ-негативных острых миелоидных лейкозах отмечено более высокое содержание Т-лимфоцитов (СБ45+СОЗ+клеток) по сравнению с НЬД-ОЯ-негативными острыми лимфобластными лейкозами (75,6 ±3,9% против 55,2 ±7,7% р=0,016), в то время как сравнение популяций клеток-эффекторов ОМЛ и ОЛЛ без учета экспрессии Н1А-Б11-антигена не выявило достоверных различий в количестве СБЗ+ Т-клеток (р>0,05).

К настоящему времени опубликовано большое количество экспериментальных и исследовательских работ, в которых изучалось взаимодействие лимфоцитарной и бластной популяций костного мозга больных острым лейкозом, где было отмечено выраженное прямое токсическое воздействие миелобластов на лимфоциты и нарушение механизма "двойного распознавания" Т-лимфоцитами лимфобластов. Но, помимо этого, мы можем предположить наличие пока не выявленных механизмов взаимодействия лимфоцитарной и бластной популяций, зависящих от особенностей фенотипа бластов и экспрессии на них линейно не рестриктированных молекул и антигенов, характерных для другого варианта острого лейкоза. Поэтому мы считаем, что изучение одной лишь лимфоцитарной популяции костного мозга больных острым лейкозом без учета особенностей бластной популяции является неполным.

выводы

1) На основании проведенного комплексного морфоцитохимического и иммунологического (трехцветная проточная цитометрия) исследования у 124 больных установлено, что острые лейкозы взрослых характеризуются специфическими для каждой нозологической формы изменениями субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга при диагностике заболевания.

2) Субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга больных острым лимфобластным лейкозом характеризуется достоверно более высокими уровнями зрелых Т-хелперных клеток (СБ45+С04+) в сравнении с уровнями этих клеток у больных острым миелоидным лейкозом (р=0,011).

3) В костном мозге больных острым миелоидным лейкозом присутствуют зрелые цитотоксические клетки (С045+С08+) в значительно большем количестве по сравнению с числом этих клеток у больных острым лимфобластным лейкозом (р=0,01).

4) Иммунорегуляторный индекс (соотношение С04/С08) лимфоцитов костного мозга значимо более высокий у больных острым лимфобластным лейкозом, чем у больных острым миелоидным лейкозом (1,3 ± 0,2 и 0,7 ±0,1, р=0,005).

5) Выявлена взаимосвязь количества лимфоцитов-эффекторов костного мозга с линейной коммитированностью бластных клеток острых миелоидных лейкозов: содержание Т-хелперов и иммунорегуляторный индекс СЮ4/'С08 значимо более высокие при гранулоцитарных лейкозах в сравнении с лейкозами моноцитарной дифференцировки (р=0,005 и р=0,017 соответственно).

6) Степень активации лимфоцитов костного мозга взаимосвязана с линейной коммитированностью бластных клеток острых миелоидных лейкозов: процент лимфоцитов, коэкспрессирующих маркеры СБ38 и НЬА-БЯ,

достоверно выше при моноцитоидных ОМЛ, чем при гранулоцитарных (р=0,035).

7) Отмечается зависимость состава Т-лимфоцитов костного мозга от линейной принадлежности бластных клеток ОЛЛ: содержание зрелых Т-лимфоцитов (СБ45+СОЗ+) значимо выше при лейкозах из В-линейных предшественников в сравнении с лейкозами из Т-линейных предшественников (р=0,008).

8) Иммунофенотипические особенности бластных клеток взаимосвязаны с субпопуляционным составом лимфоцитов костного мозга больных острыми лейкозами: при НЬЛ-ОЯ-негативных острых миелоидных лейкозах наблюдается достоверно более высокое содержание СЭЗ+Т-клеток в сравнении с НЬЛ-ОЯ-негативными острыми лимфобластными лейкозами — 75,6 ± 3,9% и 55,2 ± 7,7% (р=0,016).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1)Колбацкая О.П., Андреева Л.Ю., Серебрякова И.Н., Тупицын H.H. Субпопуляции лимфоцитов костного мозга у больных острыми лейкозами. Детская онкология. 2005; №4. стр.28-33.

2)Купрышина H.A., Френкель М.А., Колбацкая О.П., Андреева Л.Ю., Серебрякова И.Н., Тупицын H.H. Липиды в бластах при остром лимфобластном лейкозе. Клиническая геронтология. 2005; т. 11. №10. стр.31-34.

3)Колбацкая О.П., Серебрякова И.Н., Андреева Л.Ю., Тупицын H.H. Иммунный статус костного мозга при диагностике острых лейкозов. Сборник «Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической онкологии. 2006. Оренбург, стр. 100-110.

4)Колбацкая О.П., Тупицын H.H. Лимфоциты костного мозга при диагностике острых лейкозов. Медицинская иммунология. 2006; том8. №2-3. стр.342.

5)Лебедева Н.Б., Купрышина H.A., Колбацкая О.П., Гривцова Л.Ю., Жарова З.Д., Френкель М.А. Сравнительная иммуноморфологическая характеристика бластов при ОЛЛ взрослых. Онкология и радиология Казахстана. 2010. №3-4 (16-17).

Подписано в печать 06.10.11 . Формат 60x84/16. Бумага офисная «БуеЮСору». Тираж 100 экз. Заказ №1015 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

Оглавление диссертации Колбацкая, Ольга Павловна :: 2011 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 2. СУБПОПУЛЯЦИИ КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ ОМЛ.

ГЛАВА 3. СУБПОПУЛЯЦИИ КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ ОЛЛ.

ГЛАВА 4. СРАВНЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ ОМЛ И ОЛЛ.

Введение диссертации по теме "Онкология", Колбацкая, Ольга Павловна, автореферат

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Костный мозг, как известно, является гемопоэтическим органом. Вместе с тем в пуле лимфоцитов костного мозга присутствуют зрелые эффекторные клетки иммунной системы, способные осуществлять гуморальный и клеточный иммунный ответ, в терминах онкологии — иммунный надзор за опухолевым процессом. Костномозговые клетки-предшественницы являются мишенью для развития острых лейкозов. Процесс изначально развивается в костном мозге, поэтому представляет большой интерес изучение иммунной системы костного мозга при диагностике острого лейкоза для оценки возможных иммунодефицитных состояний, в условиях которых пролиферирует лейкозный клон.

Существуют единичные публикации о том, что у больных OJI повышено содержание NK-клеток по сравнению со здоровыми донорами в костном мозге при диагностике [Vidríales М.В. et al., 1993] и в периферической крови при достижении полной ремиссии [Torelli G.F. et al., 2005], а также о функциональной анергии цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и Т-хелперов костного мозга в остром периоде [Yotnda Р. et al., 1999]. Но в литературных источниках нет систематизированных данных об изменении относительного и абсолютного содержания субпопуляций Т, В, NK-клеток и CD56+T-KneTOK костного мозга больных ОЛ по сравнению с нормой, экспрессии на них молекул активации, а также о зависимости количества лимфоцитов от нозологического варианта ОЛ и фенотипических особенностей бластных клеток (экспрессии на них линейно не рестриктированных антигенов).

Существуют две основные причины практически полного отсутствия данных по субпопуляционному составу лимфоцитов костного мозга у больных острым лейкозом при диагностике:

1) с внедрением иммунофенотипической диагностики острых лейкозов основным объектом исследования являлись бластные клетки и основное внимание было уделено выделению бластных клеток и установлению иммуноподварианта лейкоза;

2)сложности разделения лимфоцитов и бластов иммуноцитофлюориметрическими методами.

В последние годы появилась возможность точной идентификации популяции бластных клеток и отграничения ее от популяции лимфоцитов иммуноцитофлюориметрическими методами. Для этих целей, помимо характеристик светорассеяния бластных клеток, необходимо учитывать экспрессию на них общелейкоцитарного антигена СБ45. Бластные клетки отличаются слабой экспрессией СВ45, а зрелые лимфоциты (Т, В, №С, СБ56+Т) напротив - выраженной экспрессией СБ45. Проведение этих исследований открывает перспективу изучения, с одной стороны, субпопуляций лимфоцитов костного мозга, а, с другой стороны, оценки взаимосвязи и различий между иммунофенотипическими характеристиками бластной и лимфоцитарной популяций клеток костного мозга больных ОЛ.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1) Изучить относительное и абсолютное содержание Т-, В- и ЫК-клеток в костном мозге больных острым миелоидным лейкозом при диагностике,

2) Изучить относительное и абсолютное содержание Т-, В- и МК-клеток в костном мозге больных острым лимфобластным лейкозом при диагностике,

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

На основании проведенного комплексного морфоцитохимического и иммунологического (трехцветная проточная цитометрия) анализа клеток костного мозга 124 больных острыми лейкозами получены новые научные данные. Установлены существенные различия в субпопуляционном составе лимфоцитов костного мозга больных OMJI и OJIJI: при OJIJI достоверно более высокое количество Т-хелперов, а при OMJI - Т-цитотоксических клеток, что отражается на значимо более высоком иммунорегуляторном индексе у больных OJIJI (0,7 ± 0,04 против 1,3 ± 0,2 р=0,005). Помимо этого, в лимфоцитарной популяции костного мозга больных OJIJI по сравнению с больными OMJI выше относительное и абсолютное количества CD19+CD5+iaieTOK, а также лимфоцитов, коэкспрессирующих маркеры CD38 и HLA-DR (р<0,05).

Впервые установлены особенности субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга в зависимости от линейной принадлежности бластных клеток OMJI и иммуноподварианта OJIJI. При гранулоцитарных острых лейкозах повышено количество Т-хелперов (CD45+CD4+) в сравнении с лейкозами моноцитарной дифференцировки (М4 и М5 по FABклассификации, р=0,005). В пределах В-линейных ОЛЛ выявлено, что субпопуляционный состав лимфоцитов взаимосвязан со степенью дифференцировки лейкоза: процент С045+СБЗ+ Т-клеток выше у больных пре-пре-В-иммуноподвариантом по сравнению с больными пре-В-иммуноподвариантом (р=0,016). При В-линейных острых лимфобластных лейкозах отмечено существенное преобладание зрелых Т-лимфоцитов (СВ45+СЭЗ+) в сравнении с Т-линейными ОЛЛ (р=0,008).

Впервые нами было выявлено, что при диагностике острых лейкозов взрослых субпопуляционный состав лимфоцитов взаимосвязан с иммунофенотипическими особенностями бластов. Это обнаружено в результате сравнения количества лимфоцитарных популяций как в пределах каждого нозологического варианта ОЛ, так и между ОМЛ и ОЛЛ. Так, при НЬЛ-БЯ-негативных ОМЛ в костном мозге наблюдается достоверно более высокое содержание СБЗ+Т-клеток в сравнении с НЬЛ-БЯ-негативными ОЛЛ (р=0,016).

В случае С07-позитивных ОМЛ достоверно выше относительное содержание СЭ5+ и СБ8+ Т-клеток, а также активированных СБ38+ лимфоцитов (р<0,05) в сравнении с СВ7-негативными ОМЛ; при коэкспрессии на миелобластах ЛЬА-БЯ-антигена выше относительное количество активированных лимфоцитов (НЬА-Б11+ и С038+), при коэкспрессии СБ4-антигена выше относительное и абсолютное количества СБЗ8+лимфоцитов (р<0,05).

Относительное содержание СБЗ+ и СБ5+Т-клеток выше в случае НЬА-БК-позитивных ОЛЛ, чем в отсутствие экспрессии НЬЛ-БЯ-антигена, при коэкспрессии С056-антигена на лимфобластах выше абсолютное количество Т-хелперов (р=0,034), в отсутствие коэкспрессии миелоидного маркера СБ 13 выше абсолютные количества СБ5+, СБ4+ и СБ8+Т-клеток (р<0,05). Напротив, СЭЗ 3-позитивные ОЛЛ характеризовались более высоким относительным содержанием СЭ7+ Т-клеток и СБ 19+С05+лимфоцитов (р<0,05).

Это дает новые факты к пониманию патогенеза острых лейкозов с точки зрения взаимодействия бластных клеток с иммунной системой костного мозга.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты научного исследования, проведенного в ходе выполнения данной диссертационной работы, позволяют более точно оценить состав субпопуляций лимфоцитов костного мозга у больных острыми лейкозами. Выявление качественных различий между субпопуляциями лимфоцитов при острых миелоидных лейкозах и острых лимфобластных лейкозах позволяет оценить особенности эффекторных субпопуляций лимфоцитов у этих больных. Это, в свою очередь, способствует более углубленному пониманию механизмов противоопухолевого иммунитета у больных ОЛ, что может способствовать разработке протоколов иммунотерапии и иммунокоррекции при лечении ОЛ.

Непосредственное практическое значение имеет доказанная возможность проточно-цитометрического определения процентного содержания лимфоцитов костного мозга для последующего их анализа в абсолютных цифрах. Изучены и количественно подтверждены возможности разграничения бластной и лимфоцитарной популяций клеток костного мозга иммуноцитофлюориметрически на основе характеристик рассеяния света лазерного луча клетками и уровней экспрессии ими общелейкоцитарного антигена СБ45. В ходе работы при цитометрическом анализе костного мозга выявлены случаи В-линейных и Т-линейных ОЛЛ, когда бластную и лимфоцитарную популяции было невозможно разграничить по уровню экспрессии СБ45, так как бласты экспрессировали этот антиген на высоком уровне. Этот результат свидетельствует о необходимости разработки новых методов гейтинга для анализа лимфоцитарной популяции подобных случаев.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследуемую группу составили 124 больных, из них 57 больных острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) и 67 больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ). У всех больных диагноз острого лейкоза был установлен впервые, без предшествующего химиолучевого лечения или наличия миелодиспластического синдрома. Диагноз всем больным был установлен в лаборатории иммунологии гемопоэза (руководитель - д.м.н. проф. Н.Н.Тупицын, морфоцитохимическая диагностика - д.м.н. проф. М.А.Френкель) РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН М.И.Давыдов) за период с 2004 по 2010 годы.

Морфоцитохимическое и иммунофенотипическое исследование бластов проводились в пунктатах костного мозга. Взятие костного мозга в количестве 0,5мл осуществлялось в пробирки УасЩатег с сухим ЭДТА. Из доставленных пунктатов готовили мазки для морфологического и цитохимического исследований, производился подсчет миелокариоцитов и иммунофенотипирование. Окраска морфологических препаратов проводилась по методу Паппенгейма.

Оценка показателей количества миелокариоцитов (клеточности) костного мозга проводилась в соответствии с данными гематологических норм (А.И.Воробьев и соавт., 2003г., Луговская С.А.и соавт., 2007г.). Подсчет клеточности костного мозга проводился под микроскопом при использовании камеры Горяева, а также при использовании автоматического анализатора клеток крови ЬАВГХ. Содержание миелокариоцитов выражалось в количестве клеток х 109/л.

При цитохимическом исследовании определяли активность в бластных клетках следующих ферментов: миелопероксидазы (МПО), липидов в реакции с Суданом черным Б, а-нафтил-ацетат-эстеразы (НЭ) самостоятельно и в реакции с ингибированием фторидом натрия (NaF), PAS-положительнош вещества в диффузной/диффузно-гранулярной или гранулярной форме. Количество бластов с положительной цитохимической реакцией оценивалось в процентном количестве.

Диагноз OMJI у всех больных устанавливался на основании критериев ВОЗ-классификации (2001г.), число бластных клеток во всех случаях превышало 20%, таблица 1.

Иммунофенотипирование у всех больных проводилось методом прямой иммунофлюоресценции с использованием тройной флюоресцентной метки. Панель моноклональных антител (МКА) включала антитела к общелейкоцитарному антигену CD45, стволовоклеточному антигену CD34, линейно-нерестриктированным антигенам CD38 и HLA-DR, антигенам миелоидной линии дифференцировки CD13 и CD33, моноцитарной - CD14 и CD64, эритроидной - гликофорину A (GlyA), мегакариоцитарной - CD61, общему антигену острого лимфобластнош лейкоза CD10 (CALLA), В-линейным антигенам (CD19, CD20, CD22, CD23), Т-линейным антигенам (CD3, CD5, CD7, CD4, CD8) и NK-клеточному антигену CD56. Маркер расценивался как положительный при обнаружении его более чем на 10% бластов для CD34 и более чем на 20% бластов для остальных антигенов. Для установления варианта острого лейкоза (OMJI и OJIJI) использовалась одна и та же панель МКА, за исключением того, что для диагностики пре-Т варианта OJIJ1 использовался кортико-тимоцитарный маркер CDla. Панели MICA и количества обследованных больных OMJI и OJIJI представлены в таблицах 2 и 3.

Анализ данных иммунофенотипирования проводился методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, США). Собиралось не менее 10 ООО событий.

Установление гейта бластных клеток проводилось на основании характеристик светорассеяния в метке с общелейкоцитарным антигеном CD45 (Иммунодиагностика лейкозов человека. Пособие для врачей. Н.Н.Тупицын и соавт., 2003г.). Бластные клетки характеризуются более слабой экспрессией CD45 по сравнению со зрелыми лимфоцитами и созревающими/зрелыми клетками миелопоэза.

Таблица 1. Распределение больных OMJI по FAB-вариантам.

Вариант Число больных

Абс. Отн. (%)

МО (миелобластный с минимальной дифференцировкой) 5 8,8

М1 (миелобластный без созревания) 21 36,8

М2 (миелобластный с созреванием) 7 12,3

МЗ (промиелоцитарный) 7 12,3

М4 (миеломонобластный) 8 14,0

М4эоз.(миеломонобластный с эозинофилией) 4 7,0

М5а (монобластный без созревания) 2 3,5

М5б (монобластный с созреванием) 0 0

Мб (эритробластный) 2 3,5

М7 (мегакариобластный) 1 1,8

Всего 57 100

Таблица 2. Панель МКА для диагностики ОМЛ и количества обследованных больных.

Антигены Число обследованных больных

Абс. Отн. (%)

Стволовоклеточный CD34 57 100

Общелейкоцитарный CD45 57 100

Линейно не рестриктированные CD38 56 98,2

HLA-DR 56 98,2

Миелоидные CD13 57 100

CD33 57 100

Моноцитарные CD14 13 23,4

CD64 55 96,4

Общий антиген ОЛЛ (CALLA) CD10 57 100

В-линейные CD19 57 100

CD20 57 100

CD22 37 64,9

CD23 49 85,9

Т-линейные CD3 56 98,2

CD5 57 100

CD7 57 100

CD4 57 100

CD8 57 100

NK-клеточный CD56 56 98,2

Диагноз ОЛЛ устанавливался на основании критериев, изложенных в главе "Иммунодиагностика лейкозов и лимфом" (Н.Н.Тупицын, глава в руководстве "Онкогематология", 2003г.).

Таблица 3. Панель МКА для диагностики ОЛЛ и количества обследованных больных.

Антигены Число обследованных больных

Абс. Отн. (%)

Стволовоклеточный CD34 67 100

Общелейкоцитарный CD45 67 100

Линейно не рестриктированные CD38 62 92,5

HLA-DR 67 100

Миелоидные CD13 66 98,5

CD33 66 98,5

Моноцитарные CD14 13 19,4

CD64 60 89,6

Общий антиген ОЛЛ (CALLA) CD10 67 100

В-линейные CD19 67 100

CD20 67 100

CD22 58 86,6

CD23 26 38,8

Т-линейные CD3 65 97,0

CD5 67 100

CD7 67 100

CD4 60 89,6

CD8 60 89,6

NK-клеточный CD56 56 83,6

Кортико-тимоцитарный CDla 32 48,0

Таблица 4. Распределение больных ОЛЛ по иммуноподвариантам.

Вариант Число эольных

Абсолютное Относительное (%)

Про-В 6 9

Пре-пре-В 28 42

Пре-В 1 1,5

Пре-Т 32 47,5

Всего 67 100

Проточно-цитометрическое определение содержания лимфоцитов в пунктатах костного мозга больных ОМЛ.

При морфологическом подсчете лимфоцитов в костном мозге больных ОМЛ при диагностике и часто тотальном бластозе достоверно установить их процентное содержание затруднительно. Это обусловлено тем, что обычно подсчитывается 500 миелокариоцитов (250+250). Для точного установления числа лимфоцитов в костном мозге в случае тотального бластного поражения возможно использование метода проточной цитометрии, позволяющего анализировать десятки тысяч миелокариоцитов. При морфологическом исследовании костного мозга обычно подсчитывается 500 клеток. В пунктатах больных острым лейкозом часто отмечается выраженное угнетение нормального гемопоэза, и количество лимфоцитов в миелограмме величиной в 0,1-0,2% математически соответствует 1-2 клеткам на 1000 подсчитанных клеток. При анализе пунктата проточно-цитометрический метод позволяет проанализировать до 10000 событий в целом, и количество лимфоцитов 0,1-0,2%, подсчитанное цитометрически, действительно соответствует 1-2 клеткам на 1000 проанализированных клеток и поэтому является более достоверным.

Цитометрический процент лимфоцитов в пунктатах больных ОМЛ был подсчитан следующим образом (рис.1):

Рис.1 .Иммунофенотипирование костного мозга больной П.Е, 23 лет, (диагноз: ОМЛ, МЗ-подвариант):

- гейт лейкоцитов, - гейт лимфоцитов, Ю - ядерные эритроидные клетки, эритроциты, тромбоциты, дебрис. По данным цитометрии лимфоцитов (в пределах лейкоцитов) - 3,2%, процент клеток в гейте КЗ -8,3% (по данным морфологии эритроидный росток - 8,0%). Процент лимфоцитов по данным морфологии -2,2%. Цитометрически определяемый процент лимфоцитов составил - 3,13% (пояснения в тексте).

При выделении лейкоцитарного гейта на основании экспрессии общелейкоцитарного антигена С045 (гейт ИЛ) дополнительно выделялся лимфоцитарный гейт (112). Далее проводилась коррекция с учетом выраженности эритроидного ростка (по данным миелограммы). Процентное количество лимфоцитов было подсчитано по формуле:

СО 45 РЕР? СР (5) УЭ БЭС-НеДО (2)

Ь=(Х:У)х100%, где Ь - процент лимфоцитов в лейкоцитарном гейте, X - число клеток в лимфоцитарном гейте, У - число клеток в лейкоцитарном гейте.

Затем по показателям миелограммы рассчитано процентное количество неэритроидной фракции: К = (100% клеток миелограммы - % эритроидного ростка): 100, и результат (А) получен по формуле: А = L х К.

Пример гейтинга по экспрессии CD45 на бластах и лимфоцитах.

Прежде всего следует отметить, что на основании гейтинга по экспрессии CD45 бластная и лимфоцитарная популяции четко разделялись во всех случаях OMJI (см.рис. 2). В таблице 5 приведено сравнение количества клеток с Т-лимфоцитарными маркерами в бластном и лимфоцитарном гейтах; на основании полученных данных можно утверждать, что в лимфоцитарном гейте не было примеси бластов.

Таблица 5. Сравнение количества клеток с Т-лимфоцитарными маркерами (CD5, CD7, CD4 и CD8) в бластном и лимфоцитарном гейтах (больной З.В., 60 лет, OMJI МО-вариант).

Маркер Властный гейт Лимфоцитарный гейт

CD7 1,2 69,4

CD5 1,2 67,2

CD4 2Д 34,0

CD8 1,2 40,6

СР45РегСР

Рис.2 Пример гейтинга по экспрессии антигена С045 на бластах и лимфоцитах костного мозга больного З.В., 60 лет, (ОМЛ, МО-вариант). Гейт Ш-лимфоциты, гейт Я2-бласты, гейт 1?3-гранулоциты.

Все цитометрические данные были проанализированы на персональном компьютере с использованием программы WinMDI 2.8. Статистическая обработка данных проведена с помощью пакета программ SPSS 15 и включала корреляционный анализ, сравнение средних. При определении достоверности параметрических признаков применялся критерий Стьюдента. Сравнительный анализ непараметрических данных производился при помощи построения таблиц сопряженности признаков (с использованием критерия %2).

Заключение диссертационного исследования на тему "Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга при различных вариантах острых лейкозов"

выводы

2) Субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга больных острым лимфобластным лейкозом характеризуется достоверно более высокими уровнями зрелых Т-хелперных клеток (СБ45+СБ4+) в сравнении с уровнями этих клеток у больных острым миелоидным лейкозом (р=0,011).

3) В костном мозге больных острым миелоидным лейкозом присутствуют зрелые цитотоксические клетки (СБ45+СБ8+) в значительно большем количестве по сравнению с числом этих клеток у больных острым лимфобластным лейкозом (р=0,01).

4) Иммунорегуляторный индекс (соотношение СЭ4/С08) лимфоцитов костного мозга значимо более высокий у больных острым лимфобластным лейкозом, чем у больных острым миелоидным лейкозом (1,3 ± 0,2 и 0,7 ± 0,1, р=0,005).

5) Выявлена взаимосвязь количества лимфоцитов-эффекторов костного мозга с линейной коммитированностью бластных клеток острых миелоидных лейкозов: содержание Т-хелперов и иммунорегуляторный индекс СБ4/СБ8 значимо более высокие при гранулоцитарных лейкозах в сравнении с лейкозами моноцитарной дифференцировки (р=0,005 и р=0,017 соответственно).

7) Отмечается зависимость состава Т-лимфоцитов костного мозга от линейной принадлежности бластных клеток ОЛЛ: содержание зрелых Т-лимфоцитов (СБ45+СБЗ+) значимо выше при лейкозах из В-линейных предшественников в сравнении с лейкозами из Т-линейных предшественников (р=0,008).

8) Иммунофенотипические особенности бластных клеток взаимосвязаны с субпопуляционным составом лимфоцитов костного мозга больных острыми лейкозами: при ША-БЯ-негативных острых миелоидных лейкозах наблюдается достоверно более высокое содержание СБЗ+Т-клеток в сравнении с ША-БЯ-негативными острыми лимфобластными лейкозами — 75,6 ± 3,9% и 55,2 ± 7,7% (р=0,016).

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Колбацкая, Ольга Павловна

1. Владимирская, Е.Б. Биологические основы лейкемогенеза // «Механизмы кроветворения и лейкемогенеза» — Издательство «Династия» 2007. — С.67-85.

2. Владимирская Е.Б. Кроветворение и его регуляция // «Механизмы кроветворения и лейкемогенеза». Издательство «Династия». - 2007. -С.34-59.

3. Грибова И.А., Воробьев П.А., Гематологическая норма. В руководстве по гематологии под ред.акад. А.И.Воробьева. Изд.4-е, С.61-63. Издательство «Ньюдиамед» М. 2007.

4. Дризе Н.И. «Различия между лейкозными и нормальными кроветворными стволовыми клетками» // Онкогематология. 2006. -№1-2. - С.5-9.

5. Купрышина H.A. Иммунофенотипическая и морфоцитохимическая характеристика острых миелоидных лейкозов с экспрессией антигена стволовых клеток CD34. // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Москва. -2006.

6. Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е., Долгов В.В. Лабораторная гематология. // «Издательство Триада» 2006.

7. Савченко В.Г., Паровичникова E.H. Острые лейкозы // «Клиническая онкогематология». 2007.- Медицина. - С.409-501.

8. Тупицын H.H. Структура и функции иммунной системы человека // «Клиническая Онкогематология» 2007.- Медицина. - С. 46-65.

9. Френкель М.А., Чигринова Е.В., Купрышина H.A., Павловская А.И. Диагностическое значение исследования отпечатков трепанобиоптатов костного мозга больных неходжкинскими лимфомами. // Клин. Лаб. Диагност.- 2007. №11. - С.44-48.

10. Чертков И.Д., Дризе Н.И. Стволовые клетки в кроветворении // «Клиническая онкогематология» 2007,- Медицина. - С. 12-32.

11. Юрковский О.И., Грицюк A.M. «Общеклинические анализы в практике врача». М.1997.

12. Abbas А.К., Murphy К.М., Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes. // Nature. 1997. - V.383. - P.787.

13. Alderson M.R., Armitage R.J., Maraskovsky E., Tough T.W., Roux E., Schooley K., Ramsdell F., Lynch D.H. Fas transduces activation signals in normal human T lymphocytes. // J.Exp.Med. 1993. - V.178. - P.2231.

14. Andreoni C., Rigal D., Bonnard M. and Bernaud J. Phenotypic analysis of a large number of normal human bone marrow samples by flow cytometry. // Blut. 1990. - V.61. - P. 271-277.

15. Andersen M.H., Shrama D., thor Straten P. and Becker J.C. Cytotoxic T cells. // J.Invest.Dermatol. 2006. - V.126. - P.32-41.

16. Appelbaum F.R. New targets for therapy in acute myeloid leukemia. // Leukemia. 2003. - V.17. - P.492-495.

17. Bain В .J., Clark D.M., Lampert I. A., Wilkins B.S., Bone marrow pathology // Blackwell Science. Third edition. - 2001. - P. 1-50.

18. Bauer S., Groh V., Wu J.et.al. Activation of NK cells and T cells by NKG2D, a receptor for stress-inducible MICA. // Science. 1999. - V.285. - P.727-729.

19. Becker J.C., Czerny C., Brocker E.B. Maintenance of clonal anergy by endogenously produced IL-10. // Int.Immunol. 1994.- V.6. - P. 1605.

20. Bendall L.J., Kortlepel K., Bradstock K.F.,,Gottlieb D.J. Natural killer cells adhere to bone marrow fibroblasts and inhibit adhesion of acute myeloid leukemia cells. // Leukemia. 1995. - V.9- P.999-1005.

21. Biagi E., Marin V., Giordano Attianese G.M.P., Dander E., D'Amico G., Biondi A. Chimeric T-cell receptors: new challenges for targeted immunotherapy in hematologic malignancies. // Haematologica. 2007. -V.92(03).-P,381-388.

22. Blakely A., Gorman K., Ostergaard H., et.al. Resistance of cloned cytotoxic T lymphocytes to cell-mediated cytotoxicity. // J.Exp.Med. 1987. - V.166. -P. 1970.

23. Bonnet D., Dick J.E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. // Nat. Med. -1997. V.3. - P.730-737.

24. Bottino C., Moretta L., Pende D., Vitale M., Moretta A. Learning how to discriminate between friends and enemies: a lesson from natural killer cells. // Mol.Immunol. 2004. - V.41. - P.569-575.

25. Bordignon C., Carlo-Stella C., Colombo M.P., De Vincentiis A., Lanata L., Lemoli R.M., Locatelli F., Olivieri A., Rondelli D., Zanon P., Tura S. Cell therapy: achievements and perspectives. // Haematologica. 1999. - V.84. -P. 1110-1149.

26. Brown V.I., Seif A.E., Reid G.S.D., Teachey D.T., Grupp S.A. Novel molecular and cellular therapeutic targets in acute lymphoblastic leukemia and lymphoproliferative disease. // Immunol. Res. 2008. - 42(1-3). - P.84-105.

27. Buggins A.G.S., Arno M.J., Milojkovic D.et.al. Characterization of an AML-derived immunomodulatory factor(s) that inhibit T cell activation and the signal transduction pathways involved. (Абстракт) // Blood. 2000. -V.96.-P.501a.

28. Buggins A.G.S., Lea N., Gaken J.et.al. Effect of costimulation and the microenvironment on antigen presentation by leukemic cells. // Blood. -1999. V.94. - P.3479-3490.

29. Caligiuri MA. Human natural killer cells. // Blood. 2008. - V.112. - №3. -P.461-469.

30. Caligiuri M.A., Velardi A., Scheinberg D.A., Borrello I.M. Immunotherapeutic approaches for hematologic malignancies. // Hematology. 2004. - P.337.

31. Cardoso A.A., Seamon M.J., Afonso H.M., Ghia P., Boussiotis V.A., Freeman G.J., Gribben J.G., Sallan S.E., Nadler L.M. Ex vivo generation of human anti-pre-B leukemia-specific autologous cytolytic T cells. // Blood. -1997. V.90. - №2. - P.549-561.

32. Cardoso A.A., Schultze J.L., Boussiotis V.A., Freeman G.J., Seamon M.J., LaszloS., Billet A., Sallan S.E., Gribben J.Gand Nadler L.M. Pre-B acute lymphoblastic leukemia cells may induce T-cell anergy to alloantigen. // Blood. 1996. - V.88. - P.41-48.

33. Chen L., Linsley P.S., Hellstrom K.E. Costimulation of T-cells for tumor immunity. // Immunol.Today. 1993. -V14. -P.483.

34. Clark P., Normansell D.E., Innes D.J. and Hess C.E. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. //Blood. 1986. - V.67. P. 1600-1606.

35. Cooper M.A., Fehniger T.A., Caliguri M.A. The biology of human natural killer cell subsets. // Trends Immunol. 2001. - V.22. - P.633-640.

36. Crans H.N. and Sakamoto K.M. Transcription factors and translocations in lymphoid and myeloid leukemia. // Leukemia. 2001. - V.15. - P.313-331.

37. Dean M., Fojo T., Bates S. Tumor stem cells and drug resistance. // Nat.Rev.Cancer. 2005. - V.5. - P.275-284.

38. Delespesse G, Ohshima Y., Shu U., Yang L.-P., Demeure C., Wu C.-Y., Byun D.-G., Sarfati M. Differentiation of naive human CD4 T cells into Th2/Thl effectors. //Allergol.Int. 1996. - V.46. - P.63.

39. Demanet C., Mulder A., Deneys V., Worsham M.J., Maes P., Claas F.H., et.al. Down-regulation of HLA-A and HLA-Bw6, but not HLA-Bw4, allospecificities in leukemic cells: an escape mechanism from CTL and NK attack? // Blood. 2004. - V.103. - P.3122-3130.

40. Djeu J.Y., Jiang K. and Wei S. A view to a kill: signals triggering cytotoxicity. // Clin.Cancer Res. 2002. - V.8. - P.636-640.

41. Duval M., Yotnda P., Bensussan A., Oudhiri N., Guidal C., Rohrlich P., Boumsell L., Grandchamp В., Vilmer E. Potential antileukemic effect of gamma-delta T cells in acute lymphoblastic leukemia. // Leukemia. 1995. - V.9. -P.863-868. (абстракт).

42. Elisseeva O.A., Oka Y., Tsuboi A., Ogata K., Wu F., Kim E.H. et.al. Humoral immune responses against Wilms tumor gene WT1 product in patients with hematopoietic malignancies. //Blood. 2002. - V.99 - P. 3272-3279.

43. Elkins W.L., Pickard A., Pierson G.R. Deficient expression of class-I-HLA in some cases of acute leukemias. // Cancer Immunol.Immunother.- 1984. -V.18(2).- P.91-100.

44. Ensslin A.S., Formby B. Comparison of cytolytic and proliferative activities of human gamma-delta and alpha-beta T cells from peripheral blood against various human tumor cell lines. // F. Natl. Cancer Inst. -1991. V.83. -P. 1564-1569.

45. Exley M., Garcia J., Balk S.P., Porcelli S. Requirements for CDld recognition by human invariant Va24+CD4-CD8- T cells. // J.Exp.Med. -1997. V.186. - P.109-120.

46. Fukahori S. Quantification of WT1 mRNA by competitive NASBA in AML patients. // Kurume Med.J. 2001. - V.48. - P. 129-134.

47. Gaiger A., Carter L., Greinix H., Carter D., McNeill P.D., Houghton R.L.et.al. WT1-specific serum antibodies in patients with leukemia. // Clin.Cancer Res. 2001.- V7.(Suppl). - P.761-765.

48. Gaiger A., Reese V., Disis M.L., Cheever M.A. Immunity ti WT1 in the animal model and in patients with acute myeloid leukemia. // Blood. -2000. V.96. -P.1480-1489.

49. Galea-Lauri J. Immunological weapons against acute myeloid leukaemia. // Immunology. 2002. - V.107. - P.20-27.

50. Gansuvd B., Hagihara M., Yu Y., Inoue H., Ueda Y., Tsuchiya T.et.al.Human umbilical cord blood NKT cells kill tumors by multiple cytotoxic mechanisms.// Hum.Immunol. 2002. - V.63. - P.164-175.

51. Gao L., Bellantuono I., Elsasser A., Marley S.B., Gordon M.Y., Goldman J.M. and Stauss H.J. Selective elimination of leukemic CD34+ progenitor cells by cytotoxic T lymphocytes specific for WT1. // Blood. 2000. -V.95. - №7. - P.2198-2203.

52. Gimmi C.D., Freeman G.J., Gribben J.G., Gray G, Nadler L.M. Human T-cell clonal anergy is induced by antigen presentation in the absence of B7 costimulation. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1993. - V.90. - P.6586.

53. Girardi M., Oppenheim D.E., Steele C.R.et.al. Regulation of cutaneous malignancy by gamma-delta T cells. // Science. 2001. - V.294. - P.605-609.

54. Gorman K., Liu C.C., Blakely A., Young J.D., Torbett B.E., Clark W.T. Cloned cytotoxic T lymphocytes as target cells. I I. Polarity of lysis revisited. //J.Immunol. 1988. - V. 141. -P.2211.

55. Grimwade D.and Enver T. Acute promyelocytic leukemia: where does it stem from? // Leukemia. 2004. - V.18. - P.375-384.

56. Groh V., Rhinehart R., Secrist H., Bauer S., Grabstein K.H., Spies T. Broad tumor-associated expression and recognition by tumor-derived gamma-delta T cells of MICA and MICB. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V.96. -P.6879-6884.

57. Groh V., Steinle A., Bauer S., Spies T. Recognition of stress-induced MHC molecules by intestinal epithelial gamma-delta T cells. // Science. 1998. -V.279- P.1737-1740.

58. Groh V., Wu J., Yee C., Spies T. Tumor-derived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and T-cell activation. // Nature. 2002. - V.419. -P.734-738.

59. Guan Y., Gerhard B., Hogge D.E. Detection, isolation and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). // Blood. 2003. - V.101. - P.3142-3149.

60. Guan Y., Hogge D.E. Proliferative status of primitive hematopoietic progenitors from patients with acute myelogenous leukemia (AML). // Leukemia. 2000. - V.14. - P.2135-2141.

61. Harding F.A., Arthur J.G.M., Gross J.A., Raulet D.H., A J.P. CD28-mediated signalling co-stimulates murine T-cells and prevents induction of anergy in T-cell clones. // Nature. 1992. - V356. - P.607.

62. Hayday A.C. yS Cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. //Annu. Rev. Immunol. 2000. - V. 18. - P.975-1026.

63. Henkart P.A. Lymphocyte-mediated cytotoxicity: two pathways and multiple effector molecules. // Immunity. 1994. - V.l. - P.343.

64. Heslop H.E., Stevenson F.K., Molldrem J.J. Immunotherapy of hematologic malignancy. // Hematology. 2003. - P.331-349.

65. Hoelzer D., Gokbuget N., Ottmann O., Pui C.-H., Relling M.V., Appelbaum F.R., van Dongen J.J.M., Szczepanski T. Acute Lymphoblastic Leukemia. // Hematology.-2002.-P.162-192.

66. Hope K.J., Jin L., Dick J.E., Acute myeloid leukemia originates from a hierarhy of leukemic stem cell classes that differ in self-renewal capacity. // Nat.Immunol.-2004.-V.5. P.738-743.

67. Hung K., Hayashi R., Lafond-Walker A., Lowenstein C., Pardoll D., Levitsky H. The central role of CD4+ T cells in the antitumor immune responce. // J.Exp.Med. 1998. - V.188. - №12. - P.2357-2368.

68. Igney F.H.and Krammer P.H. Immune escape of tumors: apoptosis resistance and tumor counterattack. // J.Leukoc.Biol. 2002. - V.71. - P.907-920.

69. Imai C., Iwamoto S., Campana D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. // Blood. 2005. - V.106. - №1. - P.376-383.

70. Janeway A.C., Travers P., Walport M., Capra J.D. Immunobiology. // Garland publishing. fourth edith. - 1999.

71. Jiang S.B., Ojcius D.M., Young J.D. Perforin binding to cells and lipid membranes determined by a simple competition assay. // J.Immunol.Methods. 1990. - V.126. - P.29.

72. Jiang S.B., Ojcius D.M., Persechini P.M., Young J.D., Resistance of lymphocytes to perforin-mediated killing: inhibition of perforin binding activity by surface membrane proteins. // J.Immunol. 1990. - V.144. -P.998.

73. Ju S-T., Cui H., Panka D.J., Ettinger R., Marshak-Rothstein A. Participation of target Fas protein in apoptosis pathway induced by CD4+ Thl and CD8+ cytotoxic T cells. // Proc Natl Acad Sci USA. 1994. -V.91. -P.4185.

74. Kagi D., Ledermann В., Burki K., Zinkernagel R.M., Hengartner H. Molecular mechanisms of lymphocyte-mediated cytotoxicity and their role in immunological protection and pathogenesis in vivo. // Annu Rev. Immunol. 1996. - V.14. - P.207.

75. Kennedy J.A.and Barabe F. Investigating human leukemogenesis: from cell lines to in vivo models of human leukemia.// Leukemia. 2008. - V.22. - Р.2029-2040.(абстракт).

76. Konopleva M., Zhao S., Hu W., et.al. The anti-apoptotic genes Bcl-X(L) and Bcl-2 are over-expressed and contribute to chemoresistance of non-proliferating leukaemic CD34+ cells. // Br.J.Hematol. 2002. - V.118. -P.521-534.

77. Lamb L.S.Jr., Lopez R.D. yS T cells: a new frontier for immunotherapy? // J.BBMT. -2005.- V. 11. P. 161 -168.

78. Lamb L.S.Jr., Musk P., Ye Z.et.al. Human gamma-delta (+) T lymphocytes have in vitro graft vs leukemia activity in the absence of an allogeneic response. // Bone Marrow Transplant. 2001. - V.27. - P.601-606.

79. Lehmann C., Zeis M., Schmitz N., and Uharek L. Impaired binding of perforin on the surface of tumor cells is a cause of target cell resistance against cytotoxic effector cells. // Blood. 2000. - V.96. - №2. - P.594-600.

80. Lee P.T., Benlagna K., Teyton L., Bendelac A. Distinct functional lineages of human V(a) 24 natural killer T cells. // J.Exp.Med. 2002. -V.195. - P.637-641.

81. Leung W. Immunotherapy in acute leukemia. // Semin. Hematol. 2009.- 46(1). P.89-99.

82. Linn Y.C., Lau L.C., Hui K.M. Generation of cytokine-induced killer cells from leukaemic samples with in vitro cytotoxicity against autologous and allogeneic leukaemic blasts. // Br.J.Hematol. 2002. - V.l 16. - P.78-86.

83. Lotzova E., Savary C.A., Herbermann R.B. Inhibition of clonogenic growth of fresh leukemia cells by unstimulated and IL-2-stimulated NK-cells of normal donors. // Leuk. Res. 1987. - V.ll. - P.1059-1066.

84. Lowdell M.W., Craston R., Samuel D., Wood M.E., O'Neill E. Evidence that continued remission in patients treated for acute leukaemia is dependent upon autologous natural killer cells. // Br.J.Immunol. 2002. -V.l 17. -P.821-827.

85. Lowdell M.W., Koh M.B.C. Immunotherapy of AML: future directions. // J.Clin.Pathol. 2000. - V.53. - P.49-54.

86. Lowin B., Hahne M., Mattmann C., Tschopp J. Cytolytic T-cell cytotoxicity is mediated through perforin and Fas lytic pathways.// Nature. -1994.-V.370.-P.650.

87. Lunberg A., Gribben J., Lazo S., Nadler L. Expression and induction of B7 on leukemic cells isolated from patients with hematologic malignancies. // Blood. 1994. - V.82. - P.123a.

88. Lynch D., Ramsdell F., Alderson M. Fas and FasL in the homeostatic regulation of immune responses. // Immunol.Today. 1995. - V.16. - P.569.

89. Maeda T., Yamada Y., Moriuchi R., Sugahara K., Tsuruda K., Joh T., Atogami S., Tsukasaki K., Tomonaga M., Kamihira S. Fas gene mutation in the progression of adult T cell leukemia. // J.Exp.Med. 1999. - V.l89. -P.1063-1071.

90. Mayers S., Tongio M.M., Falkenrodt A., Pfeiffer В., Bergerat J.P. Expression of HLA antigens on leukemic cells.// J.Immunogenet. 1982. -V.9(2).-P.l 11-120.

91. Mazza J.J. Manual of Clinical Hematology. 1994.-Sec edn. Little, Brown and Company, Boston, Massachusetts 8.

92. Meeh P.F., King M., O'Brien R.L., Muga S., Buckhalts P., Neuberg R., Lamb L.S.Jr. Characterization of the y5T cell responce to acute leukemia. // Cancer Immunol.Immunother. 2006. - V.55. - P. 1072-1080.

93. Metelitsa L.S., Weinberg K.I., Emanuel P.D.and Seeger R.C. Expression of CD Id by myelomonocytic leukemias provides a target for cytotoxic NKT cells. // Leukemia. 2003. - V.17. - P.1068-1077.

94. Milojkovic D., Buggins A.G.S., Lea N.C.et.al. Suppression of T cell proliferation by AML cells is an early event in GO to G1 transition involving inhibition of pRB phosphorylation by cyclin d-cdk6/4. (Абстракт) // Blood.- 2000. V.96. - P. 146a.

95. Molofsky A.V., Pardal R., Morrison S.J., Diverse mechanisms regulate stem cell self-reneval. // Curr. Opin. Biol. 2004. - V.l6. - P.700-707.

96. Moretta A., Biassoni R., Bottino C., Mingari M.C., Moretta L. Natural cytotoxicity receptors that trigger human NK-cell-mediated cytolysis. // Immunol.Today. 2000. - V.21. - P. 228-234.

97. Moretta A., Bottino C., Mingari M.C., Biassoni R.and Moretta L. What is a Natural Killer cell? // Nature Immunology. 2002.- V.3. - № 1. - P.6-8.

98. Moretta A., Marcenaro E., Parolini S., Ferlazzo G. and Moretta L. NK cells at the interface between innate and adaptive immunity.// Cell Death and Differentiation. 2008. - V.15. - P.226-233.

99. Moretta L. and Moretta A. Unravelling natural killer function: triggering and inhibitory human NK receptors. // The EMBO Journal. 2004. - V.23. -№2.- P.255- 259.

100. Mosmann T.R., Li L. Functions of CD8 T cell subsets secreting different cytokine patterns. // Semin. Immunol. 1997. - V.9. - P.87.

101. Munker R., Lubbert M., Yonehara S., Tuchnitz A., Mertelsmann R., Wilmanns W. Expression of the Fas antigen on primary human leukemia cells. //Ann.Hematol. 1995. - V.70. - P. 15.

102. Nagata S., Golstein P. The Fas death factor. // Science. 1995. - V.267. -P. 1449.

103. Nagorsen D., Scheibenbogen C., Marineóla F.M., Letsch A.and Keilholz U. Natural T cell immunity against cancer. // Clin.Cancer Res. 2003. - V.9. - P.4296-4303.

104. Nakamura M., Ross D.T., Briner T.J., Gefter M.L. Cytolytic activity of antigen-specific T cells with helper phenotype. // J. Immunol. 1986. -V.136. -P.44.

105. O'Connor GM., Hart O.M., Gardiner C.M. Putting the Natural Killer cells in its place.// Immunology. 2005. - V.117.- P. 1-10.

106. Ogawa T., Kitagawa M., Hirokawa K. Age-related changes of human bone marrow: a histometric estimation of proliferative cells, apoptotic cells, T cells, B cells and macrophages. //Mechanisms of Ageing and Development. 2000.- V.117.-P.57-68,

107. Ohminami H., Yasukawa M., Fujita S. HLA class I-restricted lysis of leukemia cells by a CD8+ cytotoxic T-lymphocyte clone specific for WT1 peptide. // Blood. 2000. - V.95. - №1. - P.286-293.

108. Ojcius D.M., Jiang S., Persechini P.M., Detmers P.A., Young J.D. Cytoplasts from cytotoxic T lymphocytes are resistant to perforin-mediated lysis. // Mol. Immunol. 1991. - V.28. - P. 1011.

109. Ozaki S., York-Jolly Y., Kawamura H., Berzofsky J.A. Cloned protein antigen-specific, la-restricted T cells with both helper and cytolyticactivities: Mechanisms of activation and killing. // Cell Immunol. 1987. -V.105.-P.301.

110. Patmasiriwat P., Fraizer G., Kantarjian H. and Saunders G.F. WT1 and GATA1 expression in myelodysplasia syndrome and acute leukemia // Leukemia. -1999.- V.13.- P.891-900.

111. Pende D., Parolini S., Pessino A. et.al. Identification and molecular characterization of NKp30, a novel triggering receptor involved in natural cytoxicity mediated by human natural killer cells. // J.Exp.Med.- 1999. -V.190. -P.1505-1516.

112. Pui C.-H., Relling M.V., Downing J.R. Acute Lymphoblastic Leukemia //New Engl.J. Med.-2004.-P. 1535-1548.

113. Purton L.E., Dworkin S., Olsen G.H. et.al. RARgamma is critical for maintaining a balance between hematopoietic stem cell self-renewal aqnd differentiation. // J.Exp.Med. 2006. - V.203. - P. 1283-1293.

114. Ranheim E.A., Kipps T.J. Activated T cells induce expression of B7/BB1 on normal or leukemic B cells through a CD40-dependent signal. // J.Exp.Med.- 1993.-V.177.-P.925.

115. Raulet D.H. Interplay of natural killer cells and their receptors with the adaptive immune response. // Nat.Immunol. 2004. - V.5. - P.633-640.

116. Rego E.D., Garcia A.B., Viana S.R.and Falcao R.P. Age-related changes of lymphocyte subsets in normal bone marrow biopsies //Cytometry. -1998. V.34. -P. 22-29.

117. Reya Т., Morrison S.J., Clarke M.F.et.al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. //Nature. -2001. V.414. -P.105-111.

118. Romagnani S. Lymphokine production by human T cells in disease states. // Annu.Rev. Immunol. 1994. - V.12. - P.227.

119. Romanski A., Bug G., Becker S., Kampfmann M., Seifried E., Hoelzer D., Ottmann O.G., Tonn T. Mechanisms of resistance to natural killer cellmediated cytotoxicity in acute lymphoblastic leukemia. // Exp.Hematol. -2005. V.33(3). - P.344-352. (абстракт).

120. Rosenfeld C., Cheever M.A. and Gaiger A. WT1 in acute leukemia, chronic myelogenous leukemia and myelodysplasia syndrome: therapeutic potential of WT1 targeted therapies. //Leukemia. 2003. - V.17. - P.1301-1312.

121. Rouvier E., Luciani M.F., Golstein P. Fas involvement in Ca2+ -independent T cell-mediated cytotoxicity. // J.Exp.Med. 1993. - V.177. -P. 195.

122. Ruggeri L., Capanni M., Urbani E. et.al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. // Science. 2002. - V.295. - P.2097-2100.

123. Salih H.R., Rammensee H.G., Steinle A. Cutting edge: down-regulation of MICA on human tumors by proteolytic shedding. // J.Immunol. 2002. -V.169. -P.4098-4102.

124. Salih H.R., Antropius H., Gieseke F.et.al. Functional expression and release of ligands for the activating immunoreceptor NKG2D in leukemia. // Blood. 2003. - V. 102. - P. 1389-1396.

125. Seaman W.E., Natural killer cells and Natural killer T-cells // Arthritis & Rheumatism. 2000. - V.43. - №6. - P. 1204-1217.

126. Spada F.M., Koezuka Y., Porcelli S.A. CDld-restricted recognition of synthetic glycolipid antigens by human natural killer T cells. // J.Exp. Med. 1998. -V188. -P.1529-1534.

127. Tajima F., Kawatani T., Endo A., Kawasaki H. Natural killer cell activity and cytokine production as prognostic factors in adult acute leukemia. // Leukemia. 1996. - V.10. - P.478-482.

128. Takahashi Т., Haraguchi К., Chiba S., Yasukawa M., Shibata Y., Hirai H. Va24+ natural killer T-cell responses against T-acute lymphoblastic leukemia cells: implications for immunotherapy. // Br.J.Haematol. 2003. -V. 122. -P.231-239.

129. Terstappen L.W., Levin J. Bone marrow cell differential counts obtained by multidimensional flow cytometry. // Blood Cells. 1992. - 18(2) - P. 311-330 (абстракт).

130. Tite J.P., Janeway Jr.C.A. Cloned helper T cells can kill В lymphoma cells in the presence of specific antigen: la restriction and cognate vs. noncognate interactions in cytolysis. // Eur.J. Immunol. 1984. - V.14. -P.878.

131. Toes R.E.M., Ossendorp F., Offringa R.and Melief C.J.M. CD4 T cells and their role in antitumor immune responses. // J.Exp.Med. 1999. - V.189. - №5. - P.753-756.

132. Tratkiewicz J.A., Szer J. Loss of natural killer cell activity as an indicator of relapse in acute leukemia. // Clin.Exp.Immunol.- 1990. -V.80(2).- P.241-246.

133. Urlacher A., Falkenrodt A., Tongio M.M., Mayers S. HLA-class-I antigens on normal and leukemic cells (quantitative analysis). // Tissue Antigens. 1987. - V.29(5). - P.237-245.

134. Van Parijs, Abbas A. Homeostasis and self-tolerance in the immune system: Turning lymphocytes off. // Science. 1998. - V.280. - P.243.

135. Velders M.P., ter Horst S.A.J., and Kast W.M. Prospects for immunotherapy of acute lymphoblastic leukemia. // Leukemia. 2001. -V.15. -P.701-706.

136. Verheyden S., Bernier M. and Demanet C. Identification of natural killer cell receptor phenotypes associated with leukemia. // Leukemia. 2004. -V.18. - P.2002-2007.

137. Vivier E., Nunes J.A., Vely F. Nature Killer Cell Signaling Pathways. // Science. -2004. -V.306. №26. -P.1517-1519.

138. Vollmer M., Li L., Schmitt A., Greiner J., Reinhardt P., Ringhoffer M.et.al. Expression of human leukocyte antigens and co-stimulatory molecules on blasts of patients with acute myeloid leukaemia. // Br.J.Haematol. -2003. V. 120.-1000-1008.

139. Wendt K., Wilk E., Buyny S., Buer J., Schmidt R.E. and Jacobs R. Gene and protein characteristics reflect functional diversity of CD56dim and CD56bright NK ceUsjj j Leukoc>Biol 2006.- V.80. P.1529-1541.

140. Williams N.S., Engelhard V.H. Identification of a population of CD4+ CTL that utilizes a perforin- rather than a Fas ligand-dependent cytotoxic mechanism. // J.Immunol. 1996. - V.156. -P.153.

141. Wodnar-Filipowicz A., Kalberer C.P. Function of Natural Killer cells in immune defence against human leukemia. // Swiss. Med. Wkly.- 2006. -№.136. P.359-364.

142. Wu F., Oka Y., Tsuboi A., Elisseeva O.A., Ogata K., Nakajima H.et.al. Thl-based humoral immune responses against Wilms tumor gene WT1 product in the patients with hematologic malignancies. // Leukemia. 2005. -V.19. -P.268-274.

143. Yamada S., Komiyama A. Decrease in number of CD 16+ CD45RA+ cells and defective production of natural killer cytotoxic factor in childhood acute lymphoblastic leukemia. // Leuk. Res. -1991. V. 15. - P.785-790.

144. Yang L., Han Y., Saurez Saiz F. and Minden M.D. A tumor suppressor and oncogene: the WT1 story. // Leukemia.- 2007.- V.21. P.868-876.

145. Yan Y., Steinherz P., Klingemann H.-G., Dennig D., Childs В., McGuirk. and O'Reilly R.J. Antileukemia activity of a Natural Killer cell line against human leukemias. // Clin.Cancer Res. 1998. - V.4. - P.2859-2868.

146. Yasukawa M. Immunotherapy for leukemia targeting the Wilms' tumor gene. // Leuk.Lymphoma. 2001. - V.42. - №3. - P.267-273 (абстракт).

147. Yotnda P., Mintz P., Grigoriadou K., Lemonnier F., Vilmer E. and Langlade-Demoyen P. Analysis of T-cell defects in the specific immune response against acute lymphoblastic leukemia cells.// Exp.Hematol. -1999. V.27. - P.1375-1383.

148. Zhang X.L., Komada Y., Chipeta J., Li Q.-S., Inaba H., Azuma E., Yamamoto H., Sakurai M. Intracellular cytokine profile of T cells from children with acute lymphoblastic leukemia. // Cancer Immunol. Immunother. 2000. - V.49. - P. 165-172.

149. Zeytun A., Hassuneh M., Nagarkatti M., Nagarkatti P. Fas-Fas Ligand-based interactions between tumor cells and tumor specific cytotoxic T lymphocytes: A lethal two-way street. // Blood. 1997. - V.90. - P. 1952.

150. Zhu J. and Paul W.E. CD4 T cells: fates, functions and faults. // Blood. -2008. V.112. - №5.- P.1557-1569.

Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга при различных вариантах острых лейкозов

Автореферат диссертации по медицине на тему Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга при различных вариантах острых лейкозов

Оглавление диссертации Колбацкая, Ольга Павловна :: 2011 :: Москва

Введение диссертации по теме "Онкология", Колбацкая, Ольга Павловна, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга при различных вариантах острых лейкозов"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Колбацкая, Ольга Павловна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций