Автореферат и диссертация по медицине (14.01.30) на тему:Сравнительная характеристика резидентных иммунных клеток плаценты у женщин различного возраста

На правах рукописи

0034-91958

ЛИНЬКОВА Наталья Сергеевна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЗИДЕНТНЫХ ИММУННЫХ КЛЕТОК ПЛАЦЕНТЫ У ЖЕНЩИН РАЗЛИЧНОГО ВОЗРАСТА

14.01.30 - геронтология и гериатрия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 ФЕЗ 2010

Санкт-Петербург - 2010

Работа выполнена в лаборатории иммунологии старения Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Полякова Виктория Олеговна

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Аничков Николай Мильевич

доктор биологических наук Зубжицкая Людмила Борисовна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук «Институт физиологии им. И. П. Павлова» РАН

Защита диссертации состоится «2£> » 5^2010 г. в УЗ часов

на заседании диссертационного совета Д 601.001.01 при Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Россия, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3).

Автореферат разослан « 25"» -Д_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, доцент

Козина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Плацента является уникальным органом, который одновременно выполняет две разнонаправленные функции: с одной стороны, обеспечивает сохранность аллогенного фето-плацентарного комплекса от агрессии иммунной системы матери, а с другой - проявляет высокую активность против чужеродных антигенов вирусной и инфекционной природы, попадающих в материнский организм. Этот факт делает плаценту интереснейшим объектом исследования с точки зрения иммунологии, поскольку именно здесь происходит взаимодействие тканей матери и плода на молекулярном уровне.

Изучение и объяснение феномена сохранения аллогенного плода в организме матери является центральной задачей иммунологии репродукции. В настоящее время теория подавляемой иммунной агрессии организма матери против аллотрансплантанта не находит своего подтверждения. На смену ей пришла концепция взаимодействия тканей матери и плода, выработанного в процессе эволюции. В рамках этой теории молекулы и клетки иммунной системы рассматриваются как посредники репродуктивных процессов, действующие не агрессивно, а дополняющие функции друг друга [Мойей А., Ьоке УЖ, 2004].

В последние годы внимание исследователей привлечено к изучению плаценты именно на молекулярно-клеточном уровне, поскольку знания о развитии плаценты углубляются до уровня отдельных клеток [НирреПг В. е1 а1., 2006]. В настоящий момент наиболее изученными являются иммунные свойства и функции трофобласта. Однако данные о взаимодействии иммунокомпетентных клеток в децидуальной ткани, и особенно в ворсинах хориона, до сих пор остаются достаточно отрывочными, а изменения структурных свойств этих клеток в возрастной динамике практически не изучены.

Из плацентарных компонентов объектом нашего исследования был выбран ворсинчатый хорион, в силу особенностей строения он играет наиболее важную роль в осуществлении обменных процессов между кровью матери и плода. В настоящее время убедительно доказано, что наиболее активной тканью плаценты в метаболическом и функциональном плане является эпителий ворсинчатого хориона.

Широкие возможности в изучении иммунного статуса плаценты связаны с появлением ряда методов, позволяющих не только качественно оценить наличие различных субпопуляций иммунных клеток, но и количественно охарактеризовать различные иммунологические процессы, протекающие в плаценте.

Новые возможности открывает развитие молекулярной микроскопии, которая с помощью иммуногистохимических реакций позволяет на тканевом, клеточном и ультраструктурном уровнях визуализировать взаимодействие сигнальных молекул - гормонов, ферментов, рецепторов, цитокинов и др.

Анализ данных современной литературы показал, что большинство авторов изучало субпопуляции иммунных клеток плаценты на различных сроках гестации, в то время как вопрос об изменении иммунного статуса плаценты в зависимости от возраста беременных женщин изучен недостаточно. Важность проведения исследований иммунологии плаценты у женщин различных возрастных групп так же может открыть новые подходы к изучению одной из самых распространенных патологий беременности - гестозу.

Гестоз - специфический для беременности синдром, проявляющийся в нарушениях функций различных органов. Хотя эта патология является системной, а ее этиология до сих пор не совсем ясна, не вызывает сомнений ключевая роль плаценты в патогенезе гестоза. Согласно современным представлениям, физиологическую беременность можно охарактеризовать как состояние «умеренного воспаления», при котором происходит активация иммунокомпетентных клеток, а системные изменения, наблюдаемые при гестозе, являются случаем крайнего выражения такого состояния.

В связи с этим, представляет интерес изучение иммунного статуса плаценты в норме и при гестозе с целью выявления возможных иммунологических механизмов, лежащих в основе этой патологии. При этом необходимо учитывать, что иммунный статус плаценты также зависит от возраста беременной женщины. Вышеизложенные обстоятельства свидетельствуют об актуальности и необходимости проведения специального исследования иммунного статуса ворсин хориона у женщин разного возраста в норме и при гестозе.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования является сравнительное изучение иммунного статуса плаценты у женщин молодого и старшего репродуктивного возраста в норме и при гестозе.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Верифицировать различные субпопуляции клеток, принимающих участие в иммунном ответе (макрофаги, лимфоциты, дендритные и эндотелиальные клетки) в плаценте у женщин молодого и старшего репродуктивного возраста в норме и при гестозе.

2. Изучить возрастные особенности иммунного статуса плаценты в норме и при гестозе.

3. Выявить корреляции между особенностями иммунного статуса плаценты и возрастом у женщин в норме и при гестозе.

4. Оценить вклад возрастных изменений иммунного статуса плаценты в развитие патологии беременности.

Научная новизна

Впервые проведен сравнительный анализ субпопуляций иммунных клеток (макрофаги, лимфоциты, дендритные и эндотелиальные клетки) в ворсинчатом хорионе зрелой плаценты у беременных разного возраста в норме и при гестозе.

Установлено, что в ворсинчатом хорионе присутствуют три субпоплуляции иммунных клеток: натуральные киллеры (№С-клетки), Т-супрессоры и плацентарные макрофаги. Показано влияние возраста здоровых женщин и пациенток с гестозом на количество указанных субпопуляций иммунокомпетентных клеток в ворсинах плаценты. Впервые получены данные об увеличении количества Т-супрессоров в ворсинчатом хорионе здоровых женщин старше 28 лет. Установлено, что содержание ЫК-клеток и плацентарных макрофагов с возрастом не изменяется. Впервые выявлено отсутствие Т-супрессоров в плаценте молодых женщин, перенесших гестоз, и разработана концепция о роли этой клеточной субпопуляции в механизмах развития изучаемого заболевания. Показано повышение количества плацентарных макрофагов у пациен-

ток с гестозом в возрасте до 28 лет при неизменном количестве NK-клеток. Выявлено снижение количества NK-клеток и Т-супрсссоров у пациенток с гестозом старше 28 лет. Впервые построены апроксимационные зависимости между динамикой возраста и количеством иммунных клеток в плаценте.

Практическая значимость

Полученные результаты позволяют расширить представления о морфо-функциональных изменениях доношенной плаценты в связи с возрастом беременной в норме и при гестозе. Полученные данные позволяют оптимизировать эффективность диагностики воспалительных процессов в плаценте и прогнозировать риск развития патологической беременности у женщин старше 28 лет.

Положения, выносимые на защиту

1. Иммунный статус плаценты в норме формируют 3 субпопуляции клеток: NK-клетки, Т-супрессоры и плацентарные макрофаги. С возрастом, как у здоровых женщин, так и у пациенток с гестозом, происходят изменения иммунного статуса плаценты.

2. В норме при старении организма женщины количество Т-супресоров в плаценте повышается. Содержание NK-клеток и плацентарных макрофагов с возрастом не изменяется.

3. У молодых пациенток с гестозом количество NK-клеток не изменяется, содержание плацентарных макрофагов повышается, а Т-супрессоры отсутствуют. При старении организма на фоне гестоза количество NK-клеток и плацентарных макрофагов понижается, появляются Т-супрессоры.

4. Изменения структурно-функциональной организации иммунных клеток плаценты у молодых женщин и женщин старшей возрастной группы являются важным фактором риска развития патологической беременности.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Глава 1 - обзор литературы - представляет собой анализ данных литературы по особенностям онтогенеза ворсинчатого хориона и других образований плаценты, этиологии и патогенеза гестоза с точки зрения иммунологии, а так же различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, используемых в данном исследовании. Глава 3 представляет изложение собственных данных изучения иммунного статуса плаценты у беременных различных возрастных групп и нормально протекающей беременности и гестозе, а также обсуждение полученных результатов. Текст диссертации изложен на 130 страницах, содержит 10 таблиц, иллюстрирован 28 рисунками. Список литературы содержит 159 источников, из них отечественных - 40, зарубежных - 119.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Апробация и реализация диссертации

Материалы диссертации доложены на XII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009); Всероссийской конференции студентов и молодых ученых с международным участием, посвященной 65-летию ЯГМА «Актуальные вопросы медицинской науки» (Ярославль, 2009); Всероссийской научной конференции, посвященной 150-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова «Современные проблемы общей и частной патологической анатомии» (Санкт-Петербург, 2009); XVII Всероссийской конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (Санкт-Петербург^ 2009); Весенней геронтологической конференции (Белгород, 2009); Научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2009); Всероссийской научно-практической конференции ' : «Амбулаторно-клиническая практика - платформа женского здоровья» (Москва, ■ 2009); II международной конференции «Ранние сроки беременности» (Москва, РУДН, 2009); XIII пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущийо, 2009); Международной научно-практической конференции с международным участием «Осенняя ■ геронтологическая конференция в Белгороде» (Белгород, 2009) VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009).

Результаты исследований используются в научной, педагогической и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН и НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отга СЗО РАМН.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика исследуемого материала <

. . Исследования, проведены на плацентах первородящих женщин разных возрастных групп, с нормально протекавшей беременностью и гестозом в третьем триместре беременности. Материал для исследования (60 плацент со сроком , гестации 37-40 недель) был получен в родильном отделении Научно-Исследовательского института акушерства и гинекологии им. Д.О. Отга СЗО РАМН.

Исследуемый материал был разделен на четыре группы в зависимости . от возраста и наличия гестоза: группа 1 - здоровые женщины молодого и среднего репродуктивного возраста (19 - 27 лет; п=16);

группа 2 - здоровые женщины старшего репродуктивного возраста (28 - 40 лет; п=14);

группа 3 - женщины с гестозом молодого и среднего репродуктивного возраста (19 - 27 лет; п=13);

группа 4 - женщины с гестозом старшего фертильного возраста (28 - 40 лет; п=17).

Женщины в возрасте от 28 лет (2 и 4 группа) относятся к старшему репродуктивному возрасту. По данным литературы [Айламазян Э.К. и др., 2007; Хавинсон В.Х., Коновалов С.С., 2009] именно у женщин старше 28 лет в 80% случаев наблюдаются многочисленные инволюционно-дистрофические изменения плаценты, по своему характеру сходные с инволюцией органов при старении. При этом дистрофические изменения плаценты у женщин старше 28 лет охватывают не только строму ворсин, но и иммунные клетки плаценты.

В связи с тем, что основной целью работы являлось сравнительное изучение иммунного статуса плаценты у женщин различного возраста в норме и при гестозе, для исследования были взяты плаценты со сроком гестации 37-40 недель от первородящих женщин молодого и среднего (от 19 до 27 лет), а так же старшего (от 28 до 40 лет) репродуктивного возраста.

Гистологические методы

Фрагменты плацент объемом 1 см3 фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (pH 7.2), обезвоживали с помощью автоматической станции проводки материала Leica TP 1020 и заливали в парафин. Для морфологического изучения срезы окрашивали гематоксилином-эозином по стандартной методике.

Иммуногиетохимические методы

Для иммуногистохимического исследования использовали первичные моноклональные мышиные анти-человеческие антитела к следующим маркерам: NK-клеток CD 16 (1:30, Novocastra), Т-лимфоцитов (киллеров и супрессоров) CD4 и CD8 (ready to use, Novocastra), В-лимфоцитов CD20 (1:30, Dako), маркеру взаимодействия между В- и Т-лимфоцитами CD40 (1:30, Novocastra), эндотелиальных клеток CD106 (1:75, Novocastra), дендритных клеток CD83 (1:30, Novocastra) и макрофагов CD68 (1:60, Novocastra). В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные анти-мышиные и анш-кроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit), с последующим проявлением пероксидазы хрена диаминобензидином (все реагенты от Novocastra).

Выбор указанного диапазона маркеров иммунных клеток определяется целью работы, и позволяет оценить наличие тех субпопуляций иммунных клеток плаценты, которые описаны в литературе.

NK-клетки представляют собой лимфоциты, лишенные маркеров Т- и B-лимфоцитов. Название этих клеток обуславливает их функцию - лизис клеток без развития реакции иммунного ответа. NK-клетки являются наиболее многочисленной субпопуляцией иммунных клеток плаценты.

Т-лимфоциты дифференцируются в тимусе и участвуют в регуляции силы иммунного ответа и распознавании измененных клеток собственного организма. В процессе дифференцировки Т-лимфоциты дают начало субпопуляциям Т-супрессоров, Т-хелперов и Т-киллеров. B-лимфоциты человека развиваются

в печени на ранних сроках гестации и участвуют в распознавании чужеродных антигенов и передаче информации о них Т-хелперам.

Плацентарные макрофаги ворсин хориона, известные так же под названием клеток Кащенко-Гофбауэра (ККГ), являются одной из субпопуляций лейкоцитов, фагоцитирующих чужеродные клетки. Дендритные клетки (ДК) имеют общее происхождение с плацентарными макрофагами, но в отличие от последних, индуцируют первичный иммунный ответ и неспособны к фагоцитозу.

Эндотелиальные клетки (ЭК) плаценты, хотя и не относятся к клеткам иммунной системы, но играют исключительно важную роль в регуляции их миграции и степени активности.

Морфометрическое исследование и статистическая обработка результатов

Для оценки результатов иммуногистохимического окрашивания было проведено морфометрическое исследование с использованием системы компьютерного захвата микроскопических изображений Nikon Eclipse 400 и лицензионной программы для их анализа Videotest Morphology 5.0. Для каждого препарата фотографировали 5 полей зрения при увеличении х400.

В качестве морфометрических показателей были выбраны площадь экспрессии (отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения, в %) и оптическая плотность экспрессии (в условных единицах - у.е.). Указанные показатели являются общепринятыми параметрами для оценки экспрессии сигнальных молекул в клетках и тканях [Автандилов Г.Г., 2002; 2006].

Статистическая обработка всех экспериментальных данных включала в себя подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки и проводилась в программе Microsoft Excel с использованием t-критерия Стьюдента на двустороннем уровне значимости р<0.05 и оценки достоверности для разностных вариационных рядов.

В рамках корреляционного анализа проводили расчет нелинейного критерия корреляции Спирмана, с помощью которого определяли наличие и характер связи между экспрессией маркеров иммунных клеток плаценты и возрастом женщин. На основе данных, полученных при анализе коэффициента корреляции, в программе Microsoft Excel строили экспериментальные и аппроксимирующие графические зависимости [Афифи А. И др., 1982; Леонов В.П., 1990].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования иммунного статуса плаценты у женщин в возрасте до 28 лет в норме и при гестозе

В плацентах здоровых женщин моложе 28 лет присутствуют CD8+ клетки, тогда как при гестозе они не были выявлены ни у одной из пациенток (табл. I, 2).

CD16+ клетки присутствовали в большом количестве как в плацентах здоровых женщин в возрасте до 28 лет, так и у женщин с гестозом (табл. 1,2). Было установлено, что NK-клеток в норме примерно в 4 раза, а при гестозе в 2 раза больше, чем макрофагов и Т-супрессоров. При этом относительная площадь

окрашивания и оптическая плотность С016+ клеток в I и III группах достоверно не отличалась (табл. 1,2).

В ворсинах плаценты у молодых женщин площадь экспрессии СЕ)68 при гестозе была примерно в 2 раза, а оптическая плотность - в 1.5 раза выше по сравнению с нормой (табл. 1,2).

Маркер СЭ20 у здоровых женщин отсутствовал, у пациенток с гестозом он был обнаружен в 4 плацентах из 13 исследованных. Площадь экспрессии и оптическая плотность в СВ20+ препаратах составили соответственно от 4 до 20% и от 0.28 до 0.41 у.е. Большой разброс полученных значений, по-видимому, определяется малым объемом выборки, а также значительной вариабельностью реакций организма беременных женщин на развитие гестоза. С04, СБ40, СИ83 и СБ 106 не были обнаружены ни в группе здоровых женщин, ни у пациенток с гестозом моложе 28 лет.

Таблица 1

Площадь экспрессии СБ8+, С016+ и СБ68+ в плаценте у женщин моложе 28 лет

Показатель СЭ8+ С016+ СБ68+

I группа (контроль) III группа (гестоз) I группа (контроль) III группа (гестоз) I группа (контроль) III группа (гестоз)

а= 12 п=12 п=16 п=14 п=16 п=12

Средний возраст, пет 23.67±1.02 24.55±1.93 25.5&Н.16 24.55±1.93 25.63±1.76 23.58±2.07

Площадь экспрессии % 1.16±0.36 0.00-^0.00* 4.68±0.91 3.90±1.12 1.03±0.33 2.14±0.42*

*- р<0.05 по сравнению с показателем в контрольной группе

Таблица 2

Оптическая плотность экспрессии СБ8+, СШ6+ и СБ68+ _ в плаценте у женщин моложе 28 лет__

Погазатель СБ8+ СБ 16+ С068+

I группа (контроль) Шгруппа (гестоз) I группа (котроль) П1группа (гестоз) I группа (контроль) III группа (гестоз)

п=12 п=12 п—16 п=14 п=16 п=12

Средний возраст, пет 23.67±1.02 24.55±1.93 25.58±1.16 24.55±1.93 25.63±1.76 23.58±2.07

Оптическая плотность, у.е., 0.13±0.04 0.00±0.00* 0.23±0.02 0.26±0.05 0.17±0.04 0.25±0.07*

* - р<0.05 по сравнению с показателем в контрольной группе

Полученные результаты позволяют выдвинуть гипотезу о взаимодействии иммунных клеток плаценты у молодых женщин с нормально протекающей беременностью и гестозом.

• При нормально протекающей беременности у женщин в возрасте до 28 лет в ворсинах зрелой плаценты ЫК-клетки составляют 68% всех иммунных клеток,

макрофаги - 31% и Т-супрессоры -17 %. При этом Т-киллеры, В-лимфоциты, ДК и ЭК в норме не выявляются.

• В норме у женщин в возрасте до 28 лет возможна следующая схема взаимодействия иммунокомпетентных клеток в ворсинах плаценты. Ж-клетки ворсин участвуют в ранней фазе иммунного ответа, секретируя цитокины и гранулоцитарно-макрофагальный колонийстимулирующий фактор. Для контроля над цитотоксической функцией клеток трофобласт экспрессирует антиген МНС-О (особую форму МНС I). МНС-в способен угнетать активность клеток и ингибировать развитие Т-клеточной реакции. Важную роль в защите тканей плода от иммунной агрессии матери так же принимают Т-супрессоры. Плацентарные макрофаги, активность и пролиферация которых по положительной обратной связи регулируется ЫК-клетками, участвуют в презентации антигена и ингибируют пролиферацию дендритных клеток путем синтеза индоламин-2,3-диоксигеназы, расщепляющей триптофан, необходимый для активации ДК. Таким образом, ККГ участвуют в защите полуаллогенного плода от иммунной реакции матери.

• У молодых пациенток с гестозом в ворсинах зрелой плаценты ЫК-клетки составляют 65% всех иммунных клеток, что значимо не отличается от нормы, при этом количество плацентарных макрофагов достоверно возрастает с 17 до 35%. В отличие от нормы в плацентах женщин, перенесших гестоз, отсутствуют Т-супрессоры. При этом примерно у 1/3 пациенток с гестозом были обнаружены В-лимфоциты, которые в норме не наблюдались. Так же как и у здоровых женщин, Т-киллеры, ДК и ЭК при гестозе не обнаружены.

Полученные данные подтверждают имеющиеся в литературе предположения о том, что иммунные клетки плаценты играют ключевую роль в патогенезе гестоза. Так, значительное повышение экспрессии плацентарных макрофагов в ворсинах хориона может приводить к нарушению инвазии трофобласта, что может быть связано с апоптозом эндоваскулярных клеток. Апоптоз, в свою очередь, может индуцироваться макрофагами по двум путям: через секрецию ЮТа, действующего на рецепторы, экспрессируемые трофобластом, или с помощью расщепления триптофана индоламин-2,3-диоксигеназой, продуцируемой макрофагами. Отсутствие Т-супрессоров в ворсинах плаценты при гестозе может привести к бесконтрольной активации агрессивных Т-клеток против полуаллогенногых тканей плода и усугублению патологии. Роль В-лимфоцитов, появляющихся в плаценте при гестозе, до конца не ясна. В норме 1Ь-10, секретируемый трофобластом, подавляет пролиферацию В-клеток, вероятно, при гестозе секреторная функция трофобласта нарушается, что и выражается в появлении В-лимфоцитов в ворсинах хориона.

Результаты исследования иммунного статуса плаценты у женщин в возрасте старше 28 лет в норме и при гестозе

Относительная площадь окрашивания на СБ16+ положительные клетки в плацентах здоровых женщин старше 28 лет была в 2 раза выше, чем у пациенток старшего фертильного возраста с гестозом (табл. 3). При этом оптическая плотность С01б+ клеток в норме и при гестозе достоверно не отличалась (табл. 4).

Было установлено, что в плацентах здоровых женщин старше 28 лет около 42% всех иммунных клеток составляют СБ8+ клетки, тогда как при гестозе их количество резко падает и достигает только 21% (табл. 3,4).

Плацентарные макрофаги в ворсинах хориона оказались самой малочисленной популяцией иммунных клеток у здоровых женщин старше 28 лет. У пациенток с гестозом площадь и оптическая плотность экспрессии не отличались от группы контроля. Несмотря на это, можно предположить, что плацентарные макрофаги, продуцирующие провоспалительные цитокины, играют значительную роль в развитии воспаления в плаценте при гестозе. Эту гипотезу подтверждает изменение процентного соотношения иммунокомпетентных клеток ворсин хориона в норме и при гестозе. Так, у здоровых женщин старше 28 лет ЫК-клетки составляют 47%, Т-супрессоры - 42% и ККГ - 11%; в то время как у пациенток с гестозом той же возрастной категории это соотношение смещается в сторону увеличения плацентарных макрофагов за счет резкого снижения двух других субпопуляций иммунокомпетентных клеток, в результате чего МК-клетки составляют 55%, Т-супрессоры - 21% и ККГ -28%.

Таблица 3

Площадь экспрессии CD8+, CD16+ и CD68+ в плаценте у женщин старше 28 лет

Показатель CD8+ CD 16+ CD68+

II группа (контроль) IV группа (гестоз) П группа (контроль) IV группа (гестоз) II группа (контроль) IV группа (гестоз)

п=10 п=11 п=14 п=16 п=14 п=17

Средний возраст, лет 33.82+0.99 35.40±1.90 33.50+1.12 34.56±1.64 33.50±1.12 34.64+1.6 2

Площадь экспрессии, % 3.67±1.02 0.63+0.19* 4.02±1.09 2.18+0.55* 0.99+0.28 1.13±0.32

* - р<0.05 по сравнению с показателем в контрольной группе

Таблица 4

Оптическая плотность экспрессии и СБ68

в плаценте у женщин старше 28 лет

Показатель CD8+ CD 16+ CD68+

II группа (контроль) IV группа (гестоз) П группа (контоль) IV группа (гестоз) II группа (контроль) IV группа (гестоз)

п=10 п=11 п=14 п=16 п=14 п=17

Средний возраст, лет 33.82±0.99 35.40+1.90 33.50±1.12 34.56+1.64 33.50±1.12 34.64+1.62

Оптияеска я плотность, у.е. 0.32±0.03 0.17+0.02* 0.27+0.08 0.30±0.09 0.16±0.04 0.22+0.06

*- р<0.05 по сравнению с показателем в контрольной группе

Вероятно, при старении организма женщины иммунный статус плаценты меняется, в нем начинают преобладать агрессивные субпопуляции иммунных клеток, а подавление излишней активности этих клеток становится недостаточным.

Экспрессия других маркеров - СБ4, СБ20, СБ83 и СБ 106 не была обнаружена ни в группе здоровых женщин, ни у пациенток с гестозом старше 28 лет.

Полученные данные позволяют сделать предположения об иммунном статусе плаценты у женщин старше 28 лет с нормально протекающей беременностью и гестозом.

• При нормально протекающей беременности у женщин в возрасте старше 28 лет в ворсинах зрелой плаценты ЫХ-клетки составляют 47% всех иммунных клеток, Т-супрессоры - 42 % и макрофаги - 11% . При этом Т-киллеры, В-лимфоциты, ДК и ЭК в норме не выявляются.

• Возраст женщины старше 28 лет является фактором риска развития патологической беременности, в основе которого лежат иммунологические механизмы, протекающие в плаценте. Ж-клетки ворсин, составляющие большую часть всех иммунных клеток ворсинчатого хориона, участвуют в ранней фазе иммунного ответа, секретируя цитокины. Низкое процентное соотношение плацентарных макрофагов по сравнению с другими субпопуляциям иммунокомпетентных клеток может указывать на недостаточную реализацию антигенпрезентирующей функции в общей схеме иммунного ответа. Большое количество Т-супрессоров в плацентах женщин старше 28 лет с одной стороны, играет положительную роль, ингибируя активность агрессивных иммунных клеток матери против полуаллогенного плода, а с другой стороны носит отрицательный характер. Подавление иммунной реакции Т-супрессорами, в сочетании с недостаточной антигенпрезентирующей способностью плацентарных макрофагов, может привести к ослаблению иммунного ответа и развитию вирусных и инфекционных заболеваний в системе мать-плацента-плод. В целом, полученные результаты свидетельствую об ослаблении иммунного ответа и нарушении взаимодействия между субпопуляциями иммунных клеток в плаценте у женщин старше 28 лет.

• У пациенток старшего фертильного возраста, перенесших гестоз, в ворсинах плаценты ГДС-клетки составляют 55% всех иммунных клеток, что незначительно превышает норму, количество плацентарных макрофагов возрастает с 11 до 28%, а содержание Т-супрессоров достоверно понижается в 2 раза - с 42 до 21%.

• Изменение процентного соотношения различных субпопуляций иммунных клеток у женщин старшего фертильного возраста, перенесших гестоз, может указывать на механизмы развития этой патологии беременных. По-видимому, ключевую роль в механизмах развития гестоза играет резкое уменьшение субпопуляции Т-супрессоров в сочетании с возрастанием количества ККГ. Увеличение количества Т-супрессоров может указывать на дальнейшее подавление иммунного ответа, которое наблюдалось и у здоровых женщин старше 28 лет, а при гестозе только усугубилось. Увеличение при гестозе популяции плацентарных макрофагов, вероятно, служит компенсаторным иммунологическим механизмом, повышающим эффективность презентации антигена и активирующим МК-клетки.

Корреляция между экспрессией Ж-клеток в плаценте и возрастом женщин в норме и при гестозе

У здоровых женщин младшей и старшей возрастной групп площадь и оптическая плотность экспрессии маркера ЫК-клеток не различались и составили соответственно 4.68±0.91 % и 4.02±1.09 %; 0.23±0.02 и 0.27±0.08 у.е. Полученные данные свидетельствуют, что количество и концентрация №С-клеток в ворсинах хориона не зависят от возраста женщин при нормально протекающей беременности. Приведенные данные были подтверждены результатами корреляционного анализа.

Коэффициенты корреляции между выборками из возраста и площади экспрессии и возраста и оптической плотности экспрессии составили соответственно 0.12 и 0.17, что, в обоих случаях, свидетельствует о наличии связи слабой тесноты между исследуемыми величинами (табл. 5).

Таблица 5

Корреляция между показателями экспрессии СБ8+, СШ6+ и СБ68+ и возрастом женщин

Исследуемые параметры СБ8+ СШ6+ С068+

Коэф. Спир мана Теснота связи Коэф. Спир мана Теснота связи Коэф. Спир мана Теснота связи

I и II группы площадь экспрессии 0.43 умеренная 0.12 слабая -0.03 слабая

оптическая плотность 0.55 умеренная 0.17 слабая 0.18 слабая

III и IV группы площадь экспрессии 0.84 высокая 0.47 умеренная 0.40 умеренна я

оптическая плотность 0.85 высокая 0.13 слабая -0.35 умеренна я

Коэффициенты 0.12 и 0.17 указывают на отсутствие зависимости между параметрами экспрессии СБ 16 и возрастом здоровых женщин, что подтверждается данными аппроксимации - уравнения у1=-0.0064х+4 и у2=0.0001х+0.2272 - линейные, а описываемые ими прямые проходят практически параллельно оси абсцисс (рис. 1А, Б).

У пациенток с гестозом старше 28 лет площадь экспрессии СБ 16 ниже почти в 2 раза с 3.90±1.12 % до 2.18±0.55 % (р<0.05) по сравнению с группой молодых женщин. Оптическая плотность экспрессии в группах женщин моложе и старше 28 лет достоверно не различалась и составила соответственно 0.26±0.05 и 0.30±0.08 у.е.

Коэффициент корреляции при исследовании относительной площади окрашивания и возраста женщин составил 0.47, что свидетельствует о наличии положительной связи умеренной тесноты (табл. 5). Указанная зависимость может быть аппроксимирована полиномом четвертой степени

у,= -0.15х4+6.3х -147.1х2+1806х-9064.7 (рис. 2А).

Полученное уравнение показывает, что максимальное количество Ж-клеток в плаценте характерно для женщин в возрасте 20-24 лет, а уже к 26 годам этот показатель резко падает и продолжает плавно снижаться с возрастом.

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Возраст, лет

32 34 36 38 Возраст, лет

Рис. 1. Зависимость экспрессии СБ 16 в плаценте от возраста женщин с нормально протекающей беременностью: А - площади экспрессии, Б - оптической плотности экспрессии. Черная кривая с точками - экспериментальные данные, сплошная линия - аппроксимирующая прямая.

Рис. 2. Зависимость экспрессии СБ16 в плаценге от возраста пациенток с гестозом: А- площади экспрессии, Б - оптической плотности экспрессии. Черная кривая

с точками - экспериментальные данные, сплошная линия - аппроксимирующая зависимость.

Коэффициент Спирмана для выборок из оптической плотности и возраста женщин с гестозом составил 0.13, что указывает на наличие положительной связи слабой тесноты (табл. 5) и подтвервдается данными статистического анализа по Стьюденту и видом аппроксимирующей прямой у2=0.0074х+0.035 (рис. 2Б).

Обобщая полученные данные, можно предположить, что у здоровых женщин количество и концентрация NK-клеток в ворсинах плаценты с возрастом не изменяется, и остается стабильно высокой. У пациенток с гестозом старше 28 лет количество NK-клеток в плаценте 2 раза ниже, чем у молодых женщин с гестозом. С одной стороны, этот фактор может играть положительную роль, тормозя взаимную активацию NK-клеток и ККГ и, тем самым, снижая риск развития сильного воспаления, характерного для гестоза, но, с другой стороны, уменьшение количества NK-клеток может привести к недостаточному распознаванию трансформированных клеток и повышению риска развития опухолей.

Корреляция между экспрессией Т-супрессоров в плаценте и возрастом женщин в норме и при гестозе

При исследовании экспрессии маркера CD8 у здоровых женщин было установлено, что у пациенток старше 28 лет площадь экспрессии больше в 3.2 раза (3.67±1.02 %) по сравнению с молодыми первородящими (1.1б±0.36 %, р<0.05). Оптическая плотность экспрессии у женщин старшей возрастной группы была в 2.5 раза больше по сравнению с молодыми женщинами (р<0.05) и составила соответственно 0.13±0.09 и 0.32±0.09 у.е.

Коэффициент Спирмана для выборок из возраста и площади экспрессии составил 0.43, что свидетельствует о наличии нелинейной положительной связи умеренной тесноты (табл. 5). Полученная зависимость может быть аппроксимирована логарифмическим уравнением yi=6Ln(x)-17 и свидетельствует о нарастании концентрации плацентарных макрофагов при увеличении возраста женщин (рис. ЗА).

Коэффициент Спирмана для выборок из возраста и оптической плотности составил 0.55, что указывает на положительную связь умеренной тесноты (табл. 5). Полученную зависимость описывали параболическим уравнением у=0.05х2-1.5х+13,- из которого видно, что с 18 до 22 лет концентрация Т-супрессоров в плаценте понижается, а с 25 лет она вновь начинает расти (рис. 3). Полученные данные свидетельствуют об увеличении количества и концентрации Т-супрессоров у здоровых женщин старше 25 лет в 2.5-3 раза по сравнению с молодыми женщинами.

У рожениц с гестозом зависимость Т-супрессоров от возраста значительно отличалась от того, что было характерно для нормы. У пациенток с гестозом в возрасте до 28 лет Т-супрессоры отсутствовали, тогда как у старородящих женщин с гестозом площадь окрашивания CD8+ клеток составила 0.63±0.19% , а оптическая плотность 0.17±0.05 у.е.

Коэффициенты корреляции между выборками из возраста и площади экспрессии и возраста и оптической плотности составили соответственно 0.85 и 0.84, что свидетельствует о нелинейной положительной связи высокой тесноты между исследуемыми величинами, причем обе эти связи могут быть описаны

полиномиальными уравнениями четвертой и третьей степени: у,=-0.1х4+4.3х3-85х2+785х-3714 и у2=-0.1х3+Зх2-85х2-40х+209 (рис. 4А, Б).

Аппроксимирующие зависимости показывают, что с 31 года в плацентах пациенток с гестозом появляются Т-супрессоры, до 36 лет их количество резко возрастает, а затем плавно снижается. У женщин моложе 31 года при гестозе Т-супрессоры отсутствуют.

Повышение содержания 'Г-супрессоров плаценты у здоровых женщин старшего возраста является дополнительным фактором риска развития инфекционных и вирусных заболеваний. Однако анализ плацент пациенток с гестозом показал, что при этой патологии у молодых женщин Т-супрессоры отсутствуют, что может привести к развитию сильной воспалительной реакции и тяжелой степени гестоза, тогда как возраст старше 28 лет, в данном случае является благоприятным фактором, так как у женщин этой группы Т-супрессоры в плаценте присутствуют, что снижает воспаление и обеспечивает более легкое течение гестоза.

18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 Возраст, лет

0,6

J °'5

I

о

§ 0,3

R

| 0'2

g o,i

о 0,0

Мг-

\ /У

\ л

18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 Возраст, лет

Рис. 3. Зависимость экспрессии CD8 в плаценте от возраста женщин с нормально протекающей беременностью: А — площади экспрессии, Б - оптической плотности. Черная кривая с точками - экспериментальные данные, сплошная линия - аппроксимирующая кривая.

* 4

3

18 22 26 30 34 38 42 Возраст, лет

18 22 26 30 34 38 42 Возрас-г, лет

Рис. 4. Зависимость экспрессии СБ8 в плаценте от возраста женщин с гестозом: А- площади экспрессии, Б - оптической плотности. Черная кривая с точками

- экспериментальные данные, сплошная линия - аппроксимирующая кривая.

Корреляция между экспрессией плацентарных макрофагов и возрастом женщин в норме и при гестозе

У здоровых женщин различных возрастных групп площадь экспрессии и оптическая плотность СБ68+ клеток достоверно не различались и составили у женщин моложе 28 лет 1.03±0.33% и 0.17±0.04 у.е., а у первородящих старшего возраста 0.99±0.28% и 0.16±0.04 у.е.

Коэффициенты корреляции между выборками из возраста и площади экспрессии и возраста и оптической плотности составили соответственно -0.03 и 0.18, что, в обоих случаях, свидетельствует о наличии связи слабой тесноты (табл. 5). Полученные коэффициенты указывают на отсутствие зависимости между исследуемыми величинами, что подтверждаете.'! данными аппроксимации

- уравнения у1=-0.05х+2.4 и у2=-0.003х+0.095 линейные, а описываемые ими прямые проходят практически параллельно оси абсцисс (рис. 5А, Б). Полученные данные позволяют предположить, что у здоровых женщин количество и концентрация ККГ в ворсинах плаценты с возрастом не изменяются.

У женщин старше 28 лет с гестозом площадь экспрессии снизилась в 2 раза с 2.14±0.42 % до 1.13±0.32 % (р<0.05) по сравнению с группой молодых женщин. Оптическая плотность экспрессии в группах женщин моложе и старше 28 лет достоверно не изменялась и составила соответственно 0.25±0.07 и 0.22±0.06 у.е.

Коэффициент корреляции между площадью экспрессии и возрастом женщин составил 0.4, что свидетельствует о наличии положительной связи умеренной тесноты (табл. 5). Указанная зависимость может быть аппроксимирована логарифмическим уравнением у1=-2Ьп(х)+8 (рис. 6А). Коэффициент Спирмана для выборок из оптической плотности и возраста женщин с гестозом составил -0.35, что указывает на наличие отрицательной связи умеренной тесноты (табл. 5), которая описывается уравнением у2=-0.001х+0.264 (рис. 6Б).

А Б

Рис. 5. Зависимость экспрессии СБ68 в плаценте от возраста женщин с нормально протекающей беременностью: А - площади экспрессии, Б - оптической плотности. Черная кривая с точками - экспериментальные данные, сплошная линия - аппроксимирующая прямая.

В норме количество плацентарных макрофагов с возрастом не изменяется, что свидетельствует о сохранности защитной функции иммунной системы у женщин старше 28 лет. При этом у пациенток с гестозом после 28 лет количество ККГ снижается почти в 2 раза, что с одной стороны, может служить положительным фактором, свидетельствующим об уменьшении воспаления у женщин старшего возраста, а с другой стороны, об угасании с возрастом защитной функции иммунной системы.

А Б

Рис. 6. Зависимость экспрессии СБ68 в плаценте от возраста пациенток с гестозом: А - площади экспрессии, Б - оптической плотности. Черная кривая с точками - экспериментальные данные, сплошная линия - аппроксимирующая зависимость.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ проведенных исследований влияния возраста беременной на иммунный статус плаценты в норме и при гестозе позволяет предложить собственную гипотезу изменения взаимодействия иммунокомпетентных клеток плаценты в зависимости от возраста женщин и характера течения беременности.

У здоровых женщин в возрасте до 28 лет соотношение иммунокомпетентных клеток в ворсинах плаценты составляет 5:1:1, где наиболее многочисленной субпопуляцией иммунных клеток являются МК-клетки, а затем в равных пропорциях следуют Т-супрессоры и плацентарные макрофаги. Вероятно, указанное соотношение различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток ворсин хориона оптимально обеспечивает иммунный ответ, основными составляющими которого являются: уничтожение поврежденных и трансформированных клеток, осуществляемое КГК-клетками, борьба с чужеродными агентами, обеспечиваемая ККГ и защита полуаллогенного плода от иммунной агрессии матери, поддерживаемая Т-супрессорами.

С возрастом у здоровых женщин соотношение указанных субпопуляций иммунокомпетентных клеток в ворсинах плаценты смещается в сторону увеличения Т-супрессоров и составляет 4:4:1. При этом содержание ЫК-клеток и ККГ в ворсинах хориона остается неизменными по сравнению с женщинами в возрасте до 28 лет. Вероятно, увеличение количества Т-супрессоров в ворсинах плаценты стимулируется антигенпрезентируюгцими клетками, аналогично тому,

как это происходит в децидуальной ткани. Возникающее с возрастом угасание иммунологических реакций, обеспечиваемое возрастанием количества Т-супрессоров в ворсинах хориона с одной стороны, увеличивает риск развития бактериальных и вирусных инфекций, но, в то же время, препятствует развитию воспалительных реакций, лежащих в основе патогенеза различных заболеваний.

Оценка иммунного статуса плаценты у здоровых женщин различных возрастных групп позволяет выдвинуть предположения о некоторых механизмах развития гестоза. У молодых женщин, перенесших гестоз, количество всех субпопуляций иммунокомпетентных клеток снижается по сравнению с нормой, а Т-супрессоры отсутствуют, при этом соотношение ЫК-клеток и плацентарных макрофагов составляет 4:2. Отсутствие Т-супрессоров, сдерживающих иммунную агрессию матери против полуаллогенного плода, по-видимому, является ключевым фактором в развитии сильной воспалительной реакции, характерной для гестоза. Это предположение подтверждается клиническими данными о том, что наиболее тяжелые формы гестоза характерны для юных и молодых первородящих женщин.

• С возрастом у пациенток, перенесших гестоз, количество иммунокомпетентных клеток плаценты хотя и снижено по сравнению с нормой, но более близко к ней по сравнению с пациентками молодого возраста и составляет 4:1:2, где наибольшая доля приходится на 1МК-клетки, затем ККГ и меньше всего распространены Т-супрессоры. У женщин старшего возраста за счет появления субпопуляции Т-супрессоров менее выражена воспалительная реакция, что обеспечивает более легкое течение гестоза. Снижение воспалительной реакции у женщин с гестозом старшей возрастной группы так же обеспечивается уменьшением содержания ККГ и 1МК-клеток, что, кроме того, может указывать на угасание с возрастом защитной функции иммунной системы. При этом максимальное количество 1МК-клеток в плаценте характерно для женщин в возрасте 20-24 лет, а уже к 26 годам этот показатель резко падает и продолжает плавно снижаться с возрастом. Этот фактор может трать положительную роль, тормозя взаимную активацию МК-клеток и ККГ и, тем самым, снижая риск развития сильного воспаления, усугубляющего патологические процессы, характерные для гестоза.

ВЫВОДЫ

1. Иммунный статус плаценты в норме формируют 3 субпопуляции клеток: ЫК-клетки, Т-супрессоры и плацентарные макрофаги. С возрастом, как у здоровых женщин, так и у пациенток с гестозом, происходят структурно-функциональные изменения иммунного статуса плаценты.

2. У здоровых женщин в возрасте до 28 лет в ворсинах плаценты присутствуют ЫК-клетки, Т-супрессоры и плацентарные макрофаги в соотношении 5:1:1

3. У здоровых женщин старше 28 лег соотношение ЫК-клеток, Т-супрессоров и плацентарных макрофагов составляет 4:4:1. При этом количество Т-супрессоров у женщин старше 28 лет возрастает в 3 раза по сравнению с молодыми женщинами. Содержание №С-клеток и плацентарных макрофагов с возрастом не изменяется.

4. В возрасте с 18 до 22 лет количество Т-супрессоров в ворсинах плаценты у здоровых женщин снижается, а начиная с 25 лег, это показатель возрастает и к 28 годам количество Т-супрессоров увеличивается в 2.5-3 раза.

5. У пациенток с гестозом в возрасте до 28 лет количество Ж-клеток не изменяется, содержание плацентарных макрофагов повышается в 2 раза, а Т-супрессоры отсутствуют. Указанные изменения иммунного статуса плаценты могут играть важную роль в механизмах патогенеза гсстоза у молодых первородящих женщин.

6. С возрастом у женщин, перенесших гестоз, количество Ж-клеток и плацентарных макрофагов соответственно понижается в 1.5 и в 2 раза, появляются Т-супрессоры. Снижение количества Ж.-клеток и плацентарных макрофагов указывает на угасание иммунных реакций в плаценте.

7. В возрасте 20-24 лет в плацентах пациенток с гестозом наблюдается максимальное количество Ж-клеток, к 26 годам этот показатель резко падает и продолжает плавно снижаться с увеличением возраста.

8. Выявленные возрастные изменения структурно-функционального характера в иммунных клетках плаценты у женщин как при нормально развивающейся беременности, так и при гестозе, являются важным фактором риска развитая патологической беременности у женщин старшей возрастной группы, тяжесть которой усугубляется с увеличением возраста беременной.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У женщин старшей возрастной группы рекомендуется проводить расширенное исследование иммунного статуса для прогнозирования риска развития патологической беременности.

2. В схеме лечения гестоза у беременных женщин старшего репродуктивного возраста рекомендуется учитывать действие лекарственных препаратов, побочным действием которых может быть изменение иммунного статуса, способное усугубить неблагоприятное течение беременности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ

1. Роль плацентарных макрофагов в патогенезе гестоза у женщин разных возрастных групп/ Н.С. Линькова, A.B. Костылев., И.Н.Костючек,

B.О. Полякова, И.М. Кветной//Успехи геронтологии. - Т. 22. - №3. - 2009. - С. 503-506.

2. Экспрессия CD8 как маркера риска невынашивания беременности у женщин с гестозом/ Н.С. Линькова, A.B. Костылев, И.Н. Костючек , В.О. Полякова// Вестник Российского университета дружбы народов. Серия Медицина. Акушерство и гинекология. - №6. - 2009. - С. 326-331.

Тезисы

3. Взаимодействие некоторых субпопуляций иммунокомпетентных клеток плаценты у женщин различного возраста на фоне гестоза/ Н.С. Линькова,

A.B. Костылев, H.A. Пальченко., В.О. Полякова, И.Н. Костючек//Сб. матер, (статьи, тезисы докладов) весенней геронгологической конференции. -Белгородский государственный университет. - Белгород, 2009. - С. 29-30.

4. Возрастные особенности экспрессии сигнальных молекул - маркеров иммунокомпетентных клеток ворсинчатого хориона/ A.B. Костылев, Н.С. Линькова, И.Н. Костючек, В.О. Полякова // Сб. матер. VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - Москва, 2009. -

C. 118-119.

5. Возрастные особенности экспрессии сигнальных молекул - маркеров клеток плаценты при гестозе/ Н.С. Линькова, A.B. Костылев, И.Н. Костючек,

B.О. Полякова // Сб. матер. VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». - Москва, 2009. - С. 134-135.

6. Зависимость количества Т-супрессоров в плаценте от возраста женщин в норме и при гестозе/ Н.С. Линькова, A.B. Костылев, И.Н. Костючек, В.О. Полякова, И.М Кветной //Сб. научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 65-летию ЯГМА «Актуальные вопросы медицинской науки». - Ярославль, 2009. - С. 90-91.

7. Изменение иммунного статуса плаценты у женщин разного возраста/ Н.С. Линькова, A.B. Костылев, И.Н. Костючек, В.О. Полякова, И.М. Кветной // Сб. научных работ студентов и молодых ученых Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 65-лстию ЯГМА «Актуальные вопросы медицинской науки». - Ярославль, 2009. - С. 90.

8. Корреляция возраста женщин и иммунного статуса плаценты при гестозе / Н.С. Линькова., A.B. Костылев, И.Н. Костючек, И.М. Кветной // Сб. тез. Всероссийской научно-практической конференции «Амбулаторно-клиническая практика - платформа женского здоровья». - Москва, 2009. - С. 155-156.

9. Костылев A.B. Роль Т-лимфоцитов плаценты в развитии угрозы невынашивания беременности на фоне гестоза/ A.B. Костылев, Н.С Линькова., И.Н. Костючек // Матер, всероссийской научной конференции, посвященной 150-летию кафедры патологической анатомии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. - Санкт-Петербург, 2009. -С. 66-67.

10. Линъкова Н.С. Корреляция экспрессии макрофагов плаценты у женщин различного возраста в норме и при гестозе/ Н.С. Линькова, A.B. Костылев, И.Н. Коспочек//12-я Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина».

- Санкт-Петербург, 2009. -С. 185-186.

11. Натуральные киллеры в плаценте у женщин различного фертильного возраста в норме и при патологии/ Н.С. Линькова, A.B. Костылев, И.Н. Коспочек, И.М. Кветной//Сб. тез. Всероссийской научно-практической конференции «Амбулаторно-клиническая практика - платформа женского здоровья». -Москва, 2009.-С.156-158.

12. Причины невынашивания беременности у женщин старшего фертильного возраста/Н.С. Линькова, A.B. Костылев, И.Н. Коспочек, H.A. Пальченко,

B.О. Полякова//Матер. Международной научно-практической конф. с международным участием «Осетия геронтологическая конференция в Белгороде», Белгородский государственный университет. - Белгород, 2009. -

C. 19-20.

13. Роль макрофагов и дендритных клеток в иммунном ответе плаценты при гестозе/Н.С. Линькова, A.B. Костылев, И.Н. Костючек, В.О.Полякова, И.М. Кветной//Тез. в матер. конф. «Нейроиммунология» в журнале «Нейроиммунология». - Санкт-Петербург, 2009. - Т.VII. - №1.-С. 61.

14. Роль тучных клеток в иммунной функции последа при переношенной беременности/Н.С. Линькова, A.B. Костылев, В.О. Полякова, И.М. Кветной// Сб. тез. XIII Международной школы-конференции молодых ученых «Биология

- наука XXI века», Пущино, 2009. - С. 106-107.

15. Роль CD4+ лимфоцитов в иммунологическом «старении» плаценты/ Н.С. Линькова, A.B. Костылев, В.О. Полякова, H.A. Пальченко, И.М. Кветной// Матер. Международной научно-практической конф. с международным участием «Осенняя геронтологическая конференция в Белгороде», Белгородский государственный университет. - Белгород, 2009. - С. 20-21.

16.CD8 как маркер угрозы выкидыша у женщин различных возрастных групп на фоне гестоза/Н.С. Линькова, A.B. Костылев, И.Н. Костючек, А.О. Дурнова, H.A. Пальченко, В.О. Полякова//Сб. тез. к научно-практической конф. молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», СПбМАПО. - Санкт-Петербург, 2009. - С. 191-192.

Линькова Наталья Сергеевна СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЗИДЕНТНЫХ ИММУННЫХ КЛЕТОК ПЛАЦЕНТЫ У ЖЕНЩИН РАЗЛИЧНОГО ВОЗРАСТА// Автореф. дис. канд. биол. наук: 14.01.30 - СПб., 2010. - 22 с.

Подписано в печать 20.01.2010. Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ_52. Отпечатано с готового оригинал-макета. ЗАО "Принт - Экспресс" 197376, С.-Петербург, ул. Большая Монетная, 5 лит. А

Актуальность темы

Плацента является уникальным органом, который одновременно выполняет две разнонаправленные функции: с одной стороны, обеспечивает сохранность аллогенного фето-плацентарного комплекса от агрессии иммунной системы матери, а с другой — проявляет высокую активность против чужеродных антигенов вирусной и инфекционной природы, попадающих в материнский организм. Этот факт делает плаценту интереснейшим объектом исследования с точки зрения иммунологии, поскольку именно здесь происходит взаимодействие тканей матери и плода на молекулярном уровне.

Изучение и объяснение феномена сохранения аллогенного плода в организме матери является центральной задачей иммунологии репродукции. В настоящее время теория подавляемой иммунной агрессии организма матери против аллотрансплантанта не находит своего подтверждения. На смену ей пришла концепция взаимодействия тканей матери и плода, выработанного в процессе эволюции. В рамках этой теории молекулы и клетки иммунной системы рассматриваются как посредники репродуктивных процессов, действующие не агрессивно, а дополняющие функции друг друга [Мойей А, Ьоке УЖ, 2004].

В последние годы внимание исследователей привлечено к изучению плаценты именно на молекулярно-клеточном уровне, поскольку знания о развитии плаценты углубляются до уровня отдельных клеток [НирреЛг В. е! а1., 2006]. В настоящий момент наиболее изученными являются иммунные свойства и функции трофобласта. Однако данные о взаимодействии иммунокомпетентных клеток в децидуальной ткани, и особенно в ворсинах хориона, до сих пор остаются достаточно отрывочными, а изменения структурных свойств этих клеток в возрастной динамике практически не изучены.

Из плацентарных компонентов объектом нашего исследования был выбран ворсинчатый хорион, в силу особенностей строения он играет наиболее важную роль в осуществлении обменных процессов между кровью матери и плода. В настоящее время убедительно доказано, что наиболее активной тканью плаценты в метаболическом и функциональном плане является эпителий ворсинчатого хориона.

Широкие возможности в изучении иммунного статуса плаценты связаны с появлением ряда методов, позволяющих не только качественно оценить наличие различных субпопуляций иммунных клеток, но и количественно охарактеризовать различные иммунологические процессы, протекающие в плаценте.

Новые возможности открывает развитие молекулярной микроскопии, которая с помощью иммуногистохимических реакций позволяет на тканевом, клеточном и ультраструктурном уровнях визуализировать взаимодействие сигнальных молекул - гормонов, ферментов, рецепторов, цитокинов и др.

Анализ данных современной литературы показал, что большинство авторов изучало субпопуляции иммунных клеток плаценты на различных сроках гестации, в то время как вопрос об изменении иммунного статуса плаценты в зависимости от возраста беременных женщин изучен недостаточно. Важность проведения исследований иммунологии плаценты у женщин различных возрастных групп так же может открыть новые подходы к изучению одной из самых распространенных патологий беременности - гестозу.

Гестоз - специфический для беременности синдром, проявляющийся в нарушениях функций различных органов. Хотя эта патология является системной, а ее этиология до сих пор не совсем ясна, не вызывает сомнений ключевая роль плаценты в патогенезе гестоза. Согласно современным представлениям, физиологическую беременность можно охарактеризовать как состояние «умеренного воспаления», при котором происходит активация иммунокомпетентных клеток, а системные изменения, наблюдаемые при гестозе, являются случаем крайнего выражения такого состояния.

В связи с этим, представляет интерес изучение иммунного статуса плаценты в норме и при гестозе с целью выявления возможных иммунологических механизмов, лежащих в основе этой патологии. При этом необходимо учитывать, что иммунный статус плаценты также зависит от возраста беременной женщины. Вышеизложенные обстоятельства свидетельствуют об актуальности и необходимости проведения специального исследования иммунного статуса ворсин хориона у женщин разного возраста в норме и при гестозе.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационного исследования является сравнительное изучение иммунного статуса плаценты у женщин молодого и старшего репродуктивного возраста в норме и при гестозе. Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. Верифицировать различные субпопуляции клеток, принимающих участие в иммунном ответе (макрофаги, лимфоциты, дендритные и эндотелиальные клетки) в плаценте у женщин молодого и старшего репродуктивного возраста в норме и при гестозе.

2. Изучить возрастные особенности иммунного статуса плаценты в норме и при гестозе.

3. Выявить корреляции между особенностями иммунного статуса плаценты и возрастом у женщин в норме и при гестозе.

4. Оценить вклад возрастных изменений иммунного статуса плаценты в развитие патологии беременности.

Научная новизна

Впервые проведен сравнительный анализ субпопуляций иммунных клеток (макрофаги, лимфоциты, дендритные и эндотелиальные клетки) в ворсинчатом хорионе зрелой плаценты у беременных разного возраста в норме и при гестозе.

Установлено, что в ворсинчатом хорионе присутствуют три субпоплуляции иммунных клеток: натуральные киллеры (1чГК-клетки), Т-супрессоры и плацентарные макрофаги. Показано влияние возраста здоровых женщин и пациенток с гестозом на количество указанных субпопуляций иммунокомпетентных клеток в ворсинах плаценты. Впервые получены данные об увеличении количества Т-супрессоров в ворсинчатом хорионе здоровых женщин старше 28 лет. Установлено, что содержание ЫК-клеток и плацентарных макрофагов с возрастом не изменяется. Впервые выявлено отсутствие Т-супрессоров в плаценте молодых женщин, перенесших гестоз, и разработана концепция о роли этой клеточной субпопуляции в механизмах развития изучаемого заболевания. Показано повышение количества плацентарных макрофагов у пациенток с гестозом в возрасте до 28 лет при неизменном количестве МС-клеток. Выявлено снижение количества №С-клеток и Т-супрессоров у пациенток с гестозом старше 30 лет. Впервые построены апроксимационные зависимости между динамикой возраста и количеством иммунных клеток в плаценте.

Практическая значимость

Полученные результаты позволяют расширить представления о морфо-функциональных изменениях доношенной плаценты в связи с возрастом беременной в норме и при гестозе. Полученные данные позволяют оптимизировать эффективность диагностики воспалительных процессов в плаценте и прогнозировать риск развития патологической беременности у женщин старше 28 лет.

Положения, выносимые на защиту

1. Иммунный статус плаценты в норме формируют 3 субпопуляции клеток: ЫК-клетки, Т-супрессоры и плацентарные макрофаги. С возрастом, как у здоровых женщин, так и у пациенток с гестозом, происходят изменения иммунного статуса плаценты.

2. В норме при старении организма женщины количество Т-супресоров в плаценте повышается. Содержание МС-клеток и плацентарных макрофагов с возрастом не изменяется.

3. У молодых пациенток с гестозом количество МК-клеток не изменяется, содержание плацентарных макрофагов повышается, а Т-супрессоры отсутствуют. При старении организма на фоне гестоза количество МК-клеток и плацентарных макрофагов понижается, появляются Т-супрессоры.

4. Изменения структурно-функциональной организации иммунных клеток плаценты у молодых женщин и женщин старшей возрастной группы являются важным фактором риска развития патологической беременности.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертационная работа является научной темой, выполняемой по основному плану НИР Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

выводы

1. Иммунный статус плаценты в норме формируют 3 субпопуляции клеток: NK-клетки, Т-супрессоры и плацентарные макрофаги. С возрастом, как у здоровых женщин, так и у пациенток с гестозом, происходят структурно-функциональные изменения иммунного статуса плаценты.

2. У здоровых женщин в возрасте до 28 лет в ворсинах плаценты присутствуют NK-клетки, Т-супрессоры и плацентарные макрофаги в соотношении 5:1:1

3. У здоровых женщин старше 28 лет соотношение NK-клеток, Т-супрессоров и плацентарных макрофагов составляет 4:4:1. При этом количество Т-супрессоров у женщин старше 28 лет возрастает в 3 раза по сравнению с молодыми женщинами. Содержание NK-клеток и плацентарных макрофагов с возрастом не изменяется.

4. В возрасте с 18 до 22 лет количество Т-супрессоров в ворсинах плаценты у здоровых женщин снижается, а начиная с 25 лет, это показатель возрастает и к 28 годам количество Т-супрессоров увеличивается в 2.5-3 раза.

5. У пациенток с гестозом в возрасте до 28 лет количество NK-клеток не изменяется, содержание плацентарных макрофагов повышается в 2 раза, а Т-супрессоры отсутствуют. Указанные изменения иммунного статуса плаценты могут играть важную роль в механизмах патогенеза гестоза у молодых первородящих женщин.

6. С возрастом у женщин, перенесших гестоз, количество NK-клеток и плацентарных макрофагов соответственно понижается в 1.5 и в 2 раза, появляются Т-супрессоры. Снижение количества NK-клеток и плацентарных макрофагов указывает на угасание иммунных реакций в плаценте.

7. В возрасте 20-24 лет в плацентах пациенток с гестозом наблюдается максимальное количество NK-клеток, к 26 годам этот показатель резко падает и продолжает плавно снижаться с увеличением возраста.

8. Выявленные возрастные изменения структурно-функционального характера в иммунных клетках плаценты у женщин как при нормально развивающейся беременности, так и при гестозе, являются важным фактором риска развития патологической беременности у женщин старшей возрастной группы, тяжесть которой усугубляется с увеличением возраста беременной.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У женщин старшей возрастной группы рекомендуется проводить расширенное исследование иммунного статуса для прогнозирования риска развития патологической беременности.

2. В схеме лечения гестоза у беременных женщин старшего репродуктивного возраста рекомендуется учитывать действие лекарственных препаратов, побочным действием которых может быть изменение иммунного статуса, способное усугубить неблагоприятное течение беременности.