Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Сравнительная фармакологическая характеристика антигипоксантов олифена и амтизола как средств патогенетической терапии туберкулеза

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова

' Г Гг ^ На правах рукописи

2 2 АПР 1935

АНТОНЕНКОВА Елена Викторовна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИГИПОКСАНТОВ ОЛИФЕНА И АМТИЗОЛА КАК СРЕДСТВ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ТУБЕРКУЛЕЗА (экспериментальное исследование)

14.00.25 - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкг-Истербург 1996

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова

На правах рукописи

АНТОНЕНКОВА Елена Викторовна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИГИПОКСАНТОВ ОЛИФЕНА И АМТИЗОЛА КАК СРЕДСТВ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ТУБЕРКУЛЕЗА (экспериментальное исследование)

14.00.25 - фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-нсследователь-ском институте фтизиопульмонологии

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор А.Е.Александрова

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки,

доктор медицинских наук, профессор П.П.Денисенко

доктор медицинских наук И.Г.Бодаина

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургская Государственная медицинская академия

Защита состоится " /•¥" 1996 года в _/£. часов на заседании

Диссертационного совета К.074.37.02 при Санкт-Петербургском государственном медицинском университете имени академика И.П.Павлова (197089, Санкт-Петербург, улица Л.Толстого, дом 6/8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова.

Автореферат разослан " ? " апреля 1996

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Э.Э.Звартау

Актуальность проблемы. Одним из ранних важных сдвигов в ряду многочисленных метаболических и функциональных нарушений, сопровождающих прогрессирование туберкулеза, является гипоксия тканей (Ильницкий И.Г. и др., 1990; Визель A.A., 1991; Демихова О.В. и др., 1995). Развитию кислородной недостаточности и энергетического дисбаланса при данной инфекции способствуют: непосредственное повреждение легочной ткани, туберкулезная интоксикация, ведущая к нарушению митохондриального дыхания и постепенному разобщению окисления и фосфорилирования (Малюк В.И., 1984; Александрова А.Е. и др., 1988; Атаман A.B. и др., 1989). Изменение митохондриальных функций обусловлено и усилением процессов перекисного окисления липидов, которые инициируются как гипоксией, так и туберкулезной интоксикацией (Костина З.С. н др., 1988; Характер Ж.З. и др., 1990; Скакун Н.П., 1991). Среди причин нарушения доставки кислорода и нарастания гипоксии выделяют повреждение микроциркуляторного русла (Уварова O.A.. Ерохин В.В., 1988; Кузник Б.И. и др., 1989), что, в свою очередь, поддерживается сдвигами в свертывающей системе крови (Худзнк Л.Б. и др., 1988; Приймак A.A. й др., 1995 и др.).

Кислородное голодание тканей при туберкулезе усугубляют и используемые противотуберкулезные средства (Коржов В.И., 1988; Проток Р.Г., Радловская З.Т., 1990; Toshiaki S et al., 1984; Khedum S.M. et al., 1992).

_ i

Возникающий в результате кислородной недостаточности энергетический дефицит в организме существенно отражается ha течении энерго-завнсимых процессов (иммунологической реактивности, регенерации, воспаления, гемокоагуляции и др.) (Романова JI.K., 1984; Яковлев Г.М. и др., 1990; Г'оранчук В.В., 1993; Breimer D.D., 1987 и др.).

Основываясь на роли гипоксии в патогенезе туберкулеза в конце 70-х годов А.Е.Александровой было предложено включать в состав средств патогенетической терапии лекарственные препараты, повышающие сопротивляемость организма к кислородному голоданию. Установлено, что введение в комплексную терапию туберкулеза некоторых антигипоксантов сопровождается повышением эффективности этиотропного лечения (Александрова А.Е., 1985; 1988; Борисова Л.Е., 1988; Мишин В.Ю., 1992).

Среди антигипоксантов в настоящее время наиболее известны олн-фен и амтизол, относящиеся к разным химическим классам. По данным литературы препараты обладают выраженным защитным эффектом при пшоксиях разного генеза, что показано в эксперименте и клинике (Алек-

сандрова А.Е., 1978; 1994; Смирнов A.B. и др., 1992; 1994; Филев Л.В. и др., 1993; Пастушенков JI.B., Лесиовская Е.Е., 1994 и др.).

Цель работы. Изучение некоторых» полезных для фтизиатрии, сторон фармакологической активности олифена и амтизола и сравнительная оценка эффективности их использования при экспериментальном туберкулезе.

Задачи исследования.

1. В условиях in vitro изучить непосредственное действие исследуемых веществ на рост микобактерий туберкулеза и их влияние на активность основных туберкулостатиков.

2. Определить и сравнить острую токсичность олифена и амтизола при различных путях их введения.

3. Дать сравнительную оценку лечебного действия указанных антигипок-сантов, применяемых в сочетании с этиотропной терапией на стандартной модели генерализованного туберкулеза у животных.

4. Оценить выраженность гипоксических проявлений у животных при развитии инфекции и в процессе их лечения.

5. Дать сравнительную оценку антиоксидатных свойств амтизола и олифена.

6. Охарактеризовать состояние макрофагального звена системы иммунитета у инфицированных и леченных антигипоксантами животных.

7. Изучить противовоспалительное действие олифена и амтизола.

8. Сравнить особенности влияния данных препаратов на регенераторные процессы.

9. Исследовать влияние олифена и амтизола на показатели гемокоагуля-ционного потенциала зараженных животных.

Научная новизна. В результате проведенного исследования впервые в эксперименте изучена возможность применения антигипоксанта амтизола в качестве средства патогенетической терапии туберкулеза легких и проведено сопоставление его эффективности с другим антигипоксантом олифеном. Обнаружено, что амтизол обладает некоторым непосредственным ингибирующим действием на жизнеспособность микобактерий туберкулеза и усиливает туберкулостатическую активность изониазида. В сравнительном аспекте дана фармакологическая характеристика исследуемых антигипоксантов. Выявлены и сопоставлены их противовоспалительная активность, антиоксидантные свойства, влияние на процессы

регенерации, иммунотропная активность, действие на свертывающую систему крови.

Практическая значимость работы. Выявленные в экспериментальных исследованиях особенности фармакодинамики олифеиа и амтизола будут способствовать обоснованному их назначению конкретным больным туберкулезом, повысят результативность фармакотерапии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Туберкулезный процесс, вызванный у экспериментальных животных, приводит к развитию гипоксии, активации ПОЛ, гиперкоагуляции крови, снижению функциональной активности макрофагов. Присоединение к этиотропной терапии экспериментального туберкулеза антигипоксан-тов олифена или амтизола сопровождается существенным повышением эффективности лечения.

2. Благоприятное действие олифена и амтизола при туберкулезной инфекции реализуется за счет проявления нескольких сторон их фармакологического действия (антигипоксическая, антиоксидантная, иммуномо-дулирующая, противовоспалительная, анаболическая, антикоагулянг-ная). Ведущей является антигипоксическая активность, создающая возможность улучшения энергетического обеспечения различных, в том числе защитных, функций организма.

3. Определенный вклад в высокую эффективность амтизола при туберкулезе вносит наличие у препарата непосредственного ингибирую-щего действия на жизнеспособность микобактерйй и усиление им специфической активности изониазида.

Реализация результатов работы. По результатам исследования составлено инструктивное письмо "Выбор антигипоксантоЬ п качестве средств патогенетической терапии туберкулеза"'(1993).

Апробация комплексного лечения больных туберкулезом легких с введением п терапию олифена проведена в клинике Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмоиологии МЗ и МП РФ.

Данные о повышении эффективности этиотропной терапии с помощью присоединения к ней олифена или амтизола включены в соответствующие разделы лекционного курса на кафедрах фармакологии и фтшиопульмонологни Санкт-Петербургской Государственной медицинской академии, а также на кафедре фтизиопульмоиологии Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования.

А

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Всесоюзном конгрессе по болезням органов дыхания (Челябинск, 1991; Москва, 1994); на XI-ом съезде врачей-фтизиатров (Санкт-Петербург, 1992); Всероссийской конференции "Антигипоксанты и актопротекторы" (Санкт-Петербург, 1994); Ii-ом Национальном конгрессе по профилактической медицине (Санкт-Петербург, 1995); 11-ом и Ш-ем Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995; 1996); 1-ом Съезде Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995); научной конференции молодых специалистов и фтизиопульмонологов России (Москва, 1995); на юбилейной научной сессии Уральского НИИ фтизиопульмонологии (Екатеринбург, 1996). По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на j^Ol страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, двух глав с изложением использованных методов и результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, указателя литературы, включающего 392 источника, в том числе 293 отечественных и 99 иностранных. Работа содержит 14 таблиц и 15 рисунков.

Материалы и методы исследования

В работе использовались два антигипоксанта - олифен (п-диокси-о-фенилен), синтезированный в Институте особо чистых биопрепаратов, и амтизол (3,5-диамино-1,2,4-тиадиазол), полученный на кафедре фармакологии Военно-медицинской академии им.С.М.Кирова.

Острую токсичность (ЛД50) соединений определяли в экспериментах на 180 белых беспородных мышах при внутрибрюшинном, внутривенном и пероральном пути введения.

Противотуберкулезную активность олифена и амтизола in vitro изучали стандартным методом на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена в отношении лабораторной культуры М.tuberculosis штамм H37R.V. Плотность микобактериальной суспензии в среде составляла 1»107 клеток/мл; подсчет выросших колоний осуществляли через 2-3 недели экспозиции в термостате при +37°С.

Комбинированное действие олифена или амтизола с основными туберкулостатиками оценивали методом "шахматной доски" (Matsen J.M., Barry A.L., 1974). При определении влияния антигипоксантов на

специфический эффект изониазида или рифампицииа использована методика поверхностного дозированного наслоения микобактериальной взвеси (плотность 5»107 клеток/мл) в модификации Вишневского Б. И. и Ильиной Т.Б. (1980). Посев микобактерий туберкулеза (МБТ) производили в жидкую среду Сотона с 10% нормальной лошадиной сыворотки, содержащую требуемые концентрации противотуберкулезных препаратов в сочетании с антигипоксантамн или без них. Окончательные результаты учитывали на 8-10 сутки инкубации посевов в термостате (+37°С).

Опыты по изучению и сопоставлению эффективности включения в комплексную терапию экспериментального туберкулеза олифена или амтизола поставлены на 260 белых беспородных мышах и 70 кроликах породы шиншила. Животных заражали внутривенно культурой М.bovis штамм 8: мышей - в дозе 0,1 мг полувлажной культуры, взвешенной в 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия, а кроликов - в дозе 0,1 мг/кг в объеме 0,5 того же раствора. Этиопотогенетическую терапию начинали на 15-20 день после инокуляции инфекта мышам - на фоне развившихся макроскопических изменений в легких, кроликам - при регистрации заметной потери веса тела на фоне внешних проявлении интоксикации. Мышам, в качестве этиотропных средств, в течение четырех недель вводили изониаэид (подкожно) или рифампицин (перорально) в субтерапевтических дозах 5 мг/кг. Кроликам ежедневно курсом в три недели инъецировали внутримышечно изониазид в дозе 6 мг/кг. Растворителем для туберкулостатиков служил 0,9% NaCl.

На фоне этиотропной терапии в течение 10 дней животные получали олифен или амтизол в двух дозах 30 мг/кг и 50 мг/кг в водном растворе (по 0,2-0,5мл). В каждой серии опытов присутствовала группа нелечен-ных животных (контроль заражения), а также группа контроля лечения (животные, получавшие только этиотропну!о терапию изониазидом или рифампицином).

По окончании экспериментов эвтаназию животных производили в соответствии с Методическими рекомендациями МЗ СССР (1985).

Эффективность лечения экспериментального туберкулеза оценивали по динамике массы тела животных, коэффициентам масс легких, индексам их поражения (Александрова А.Е., Ариэль Б.М., 1993), высеваемости микобактерий из селезенок. Гистологическое исследование проводили на срезах ткани легких, окрашенных эозином и гематоксилином. Воздушность легочной паренхемы регистрировали по методу точечного счета (Henning А., 1956).

Для изучения газового состава крови применяли "Биологический микроанализатор типа ОР-21-/3" (Венгрия). Изменения парциального давления кислорода (рОг), углекислого газа (рС О2) и pH определяли в крови a.carotis у кроликов, прямым методом. С помощью номограмм, приложенных к прибору, рассчитывали избыток буферных оснований (BE).

Концентрацию молочной (МК) и пировиноградной (ПК) кислот регистрировали в сыворотке венозной крови кроликов энзиматическим методом (Кочетов Г.А., 1980) на спектрофотометре СФ-26.

О состоянии перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по уровню малонового диальдегида (МДА), определяемого в крови кроликов по методике Michara М. и Uchiyama М. (1978) в модификации Андреевой Л.И. и др. (1988).

Антиоксидантную активность олифена и амтизола in vitro исследовали по их способности ингибировать образование активных форм кислорода (АФК) хемилюминесцентным методом (McPhail L.C. et al., 1979) на люминометре LKBI2S1 (Швеция), соединенном с персональным компьютером Olivetti (Италия). Генерацию АФК вызывали двумя способами: в системе гипоксантин-ксантиноксидаза-люминол (Шаронов Б.П., Чурилова И.В., 1992) и стимуляцией форболкмиристатацетатом нейтро-филов, выделенных из периферической крови доноров по методике Eggletow Р. et al. (1989).

О состоянии макрофагального звена системы иммунитета судили по интенсивности продукции, перитонеальными макрофагами мышей супероксиданиона, которую устанавливали в модифицированном Чесно-ковым В.И. и др. тетразолиевом тесте (1985). Данный метод позволяет оценить ' среднюю цитохимическую активность (ЦХА) одного макрофага.

Процессы регенерации в легких и печени изучали в двух сериях опытов (по 65 крыс в каждой). Под поверхностным эфирным наркозом производили левостороннюю пневмонэктомию (Романова Л.К., 1963) или удаляли 2/3 (левую и медиальную доли) печени (Higgins G.M., Anderson R.M., 1931). Олифен и амтизол вводили внутрь в дозе 50 мг/кг в течение десяти дней после операции. В каждой серии опытов выделяли группу крыс, не получавших лечение (контроль). На 1, 3, 5, 14 и 25-е сутки после частичной резекции животных забивали декапитацией, регенерирующий орган извлекали и взвешивали. Гистологические препараты легких и печени окрашивали эозином и гематоксилином. Учитывали выраженность пролиферативных процессов в печени по изменению мито-

тического индекса (МИ), отражающего число митозов на 1000 гепатоцитов.

Противовоспалительное действие олифена и амтизола исследовали на двух моделях асептического воспаления. Антигипоксангы (50 мг/кг) или препараты сравнения бутадион (75 мг/кг) и индометацин (5 .мг/кг) вводили внутрь в 2% растворе крахмала. Контрольные животные получали эквиобъемное количество крахмальной слизи. На 49 белых мышах моделировали "каррагениновый отек" лапок (Тринус Ф.П. и др., 1975). Животные лечились ежедневно в течение 3 дней л за 1 час перед, а также сразу после инъецирования флогогенного агента; спустя 15 часов регистрировали величину отека. В опыте на 42 крысах воспроизводили модель "ватной гранулемы" (Swingle K.F., Shideman F.E., 1972) с последующей оценкой процессов экссудации и пролиферации. Препараты вводили по схеме: в течение 6 дней и.за 2 часа до операции и еще в течение 6 дней после нее.

Изменения в свертывающей системе крови определяли у 20 кроликов с помощью ряда коагуляционных тестов: активное время рекальци-фикации (АВР); активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ); троМбиновое время (ТВ); концентрация фибриногена (Ф); по Рутберг; протромбиновый индекс (ПИ); число тромбоцитов (Тр); этано-ловый тест (Эт); фибриноген В (фВ) (Козлов A.B. и др., 1993).

Оценка различий между сравниваемыми средними величинами осуществляли по параметрическому тесту Стыодента-Фишера (Урбах В.Ю., 1967), а также непараметрическим методом Уилкоксона-Манна-Уитни (Гублер Е.В., 1978). Взаимосвязь между величинами различных показателей определяли методом корреляционного анализа (Сиськов^.И., 1975).

Результаты собственных исследований и их обсуждение

В экспериментальном исследовании проведено сравнительное изучение двух наиболее известных современных антигипоксантов олифена и амтизола в качестве средств патогенетической терапии туберкулеза легких.

Определение острой токсичности испытуемых соединений при разных путях их введения показало, что при пероральном применений антигнпоксантов величины ЛД50 были наибольшими, превышающими 1000 мг/кг. Олнфен и амтизол в нашей работе использовались pet ös fs лозах 30 и 50 мг/кг, что составляло в среднем 1/20 и 1/50 от ЛДва,

ю

Результативность присоединения к этиотропной терапии экспериментального туберкулеза олифена или амтизола изучена в опытах на двух Видах животных (мыши, кролики), инфицированных микобактери-ями туберкулеза. Установлено, что сочетанное применение каждого из антигипоксантов с изониазидом либо рифампицином способствовало улучшению большинства определяемых критериев тяжести течения заболевания по сравнению с аналогичными в группах контроля заражения и контроля лечения. Наиболее существенный прирост эффективности терапии был получен при использовании антигипоксантов в дозе 50 мг/кг.

Включение олифена или амтизола в комплексное лечение генерализованного туберкулеза у кроликов приводило к меньшей, чем при монотерапии изониазидом, потере веса тела (-3,85% и -3,00% против -5,02% соответственно) и к достоверному уменьшению индексов поражения легких (1,50±0,24 усл.ед. и 1,61±0,18 усл.ед. против 2,05+0,12 усл.ед.). Оценка гистологических препаратов легких кроликов и мышей выявила благоприятное течение инволюции туберкулезного воспаления под воздействием антигипоксантов, что отразилось в снижении, вплоть до полного исчезновения, альтеративного характера специфических поражений, и в значительном (в 1,3-1,5 раза) увеличении воздушности легочной ткани.

На мышах с замедленным темпов развития туберкулезного процесса амтизол в комбинации с туберкулостатиками, по сравнению с олисре-ном в том же' сочетании, проявил несколько более выраженное терапевтическое дейстьие. При этом амтизол снижал на фоне терапии изониазидом коэффициенты масс легких с 1,46±0,07 усл.ед. (в контроле лечения) до 1,23±0,07 усл.ед. (Р<0,05) и индексы их поражения соответственно с 2,50+0,18 усл.ед. до 1,58±0,18 усл.ед. (Р<0,01), а на фоне лечения рифампицином - бактериовыделение из селезенок до 100,00 колоний против 150,00+17,70 (Р<0,02).

В реализации лечебного эффекта амтизола при туберкулезе существенным, по-видимому, является обнаруженное нами в опытах in vitro непосредственное подавляющее влияние данного производного тиадиа-зола на рост микобактерий туберкулеза (МИК составила 100 мкг/мл). В литературе имеются сведения о наличии среди тиадиазолов соединений, обладающих специфической активностью, соответствующей резервным противотуберкулезным препаратам (Комарова Т.Н. и др., 1989; Глотова Т.Е. и др., 1990; Виноградова Т.И., 1994; Shukla H.R. et al.. 1984). Амтизол по степени выраженности ингибирующего действия на рост МВТ почти в десять раз уступал последним. Обладая относительно низ-

и

кой антимикобактериальной активностью, соединение в комбинации с изониазидом проявило выраженную степень синергизма. Так, совместное применение изониазида в 1/2 МИК и амтизола в 1/2 МИК приводило к бактериостатическому действию, равному эффекту полной дозы использованного туберкулостатика. В отличие от амтизола олифен в эквимо-лярных дозах не оказывал непосредственного ингибирующего влияния на рост М.tuberculosis и не обладал способностью потенцировать противотуберкулезную активность туберкулостатиков.

Как показали исследования, при прогрессировании инфекционного процесса у нелеченных кроликов наблюдались отчетливые изменения газометрических тестов крови. Так, Через 6 недель после заражения в артериальной крови регистрировали сдвиг рН в кислую сторону по сравнению с аналогичными параметрами у интактных животных, снижение напряжения кислорода с 78,П±2,83 мм рт.ст. до 41,5±1,97 мм рт.сг. (Р<0,001), увеличение дефицита буферных оснований при относительном повышении парциального давления углекислого газа с 38,33±0,35 мм рт.ст. до 43,75±3,09 мм рт.сг.. Монотерапия изониазидом способствовала улучшению лишь показателя рОз (60,83+2,3 мм рт.ст.) что, вероятно, связано с некоторым снижением под влиянием туберкулостатика даже в субтерапевтической дозе тяжести течения заболевания, уменьшением проявлений интоксикации. Подключение олифена или амтизола к этио-тропному лечению приводило к дальнейшему восстановлению рОг (до 71,14±1.29 мм рт.ст. и 65,67±3,01 мм рт.ст.; Р<0,001), полной нормализации рСОг и рН крови, существенному снижению дефицита буферных оснований.

Показателем развивающейся в процессе течения заболевания кислородной недостаточности является и зарегистрированное нами нарастание уровня молочной кислоты в крови инфицированных нелеченных кроликов (5,47±0,47 ммоль/л против 2,77±0,23 ммоль/л у интактных; Р<0,001). Это свидетельствует о том, что в условиях кислородного голодания происходит активация анаэробного гликолиза, являющеюся аварийным механизмом энергообеспечения, и снижение работы аэробного звена окисления углеводов (Виноградов В.М. и др., 1973; Мусил Я. я др., 1984; Рябов Г.А., 1988; Лукянова Л.Д. и др., 1992). Подтверждением сказанного служит и достоверное увеличение соотношения МК/ПК с 10,44+1,17 до 17,70±1,19 (Р<0,01). У животных, которым вводили в суб-герапевтической дозе изониазид, содержание МК в л.рови оставалось достаточно высоким (4,47±0,40 ммоль/л) и биохимическое равновесие

между кислотами (15,21 ±1,25) по-прежнему было сдвинуто в сторону лактата. Присоединение к антибактериальной терапии олифена или амтизола более выраженно отразилось на уровне МК, концентрация которой с 5,47±0,47 ммоль/л снизилась до 3,85±0,24 ммоль/л (Р<0,02) и 3,47±0,12 ммоль/л (Р<0.01) соответственно. Содержание ПК колебалось в незначительных пределах. Следовательно олифен и амтизол, увеличивая долю аэробного окисления углеводов, способствуют достаточно быстрой утилизации метаболитов (Смирнов A.B. и др., 1992; Александрова А.Е., 1994; Пастушенков JI.B., Лесиовская Е.Е., 1994) и в условиях туберкулезной инфекции.

Корреляционный анализ, проведенный между динамикой показателей тяжести течения туберкулезного процесса и кислотно-основного состояния организма под влиянием олифена и амтизола, выявил тесную зависимость выраженности лечебного эффекта препаратов от их анти-гипоксической активности. ♦

Прогрессирование заболевания у кроликов, сопровождалось интенсификацией процессов ПОЛ, что проявилось в значительном увеличении уровня МДА в-крови (4,02±0,3 нмоль/мл против 2,91±0,09 нмоль/мл у интактных; Р<0,001). Существенно повышенной концентрация МДА в крови животных оставалась и на фоне лечения туберкулостатиком (3,98±0,13 нмоль/мл). Подключение же к этиотропной терапии испытуемых антигипоксантов способствовало устранению избытка МДА. Содержание последнего под влиянием олифена (50 мг/кг) снизилось до 3,00±0,17 нмоль/мл (Р<0,01) и под влиянием амтизола (50 мг/кг) - до 2,96±0,17 нмоль/мл. (Р<0,002). Однако не удалось обнаружить корреляционной зависимости между антиоксидантными и антигипоксическими свойствами препаратов.

В опытах in vitro выявили непосредственное антиоксидантное действие изучаемых соединений в отношении свободных радикалов кислорода. В первой серии экспериментов регистрировали 50%-ое снижение хемилюминесценции, вызванной Ог в системе гипоксантин-ксантин-оксидаза-люминол при использовании олифена в концентрации 8,5» 10 } мг, а амтизола - 2,5» 10 3 мг. Во второй серии опытов антигипоксанты в концентрации 1 • Ю 3 мг/мл с разной степенью выраженности ингибирова-ли люминолзависимое свечение, инициированное АФК, выделяемыми стимулированными нейтрофилами. При сравнении препаратов по их способности взаимодействовать с кислородными радикалами, генерируемыми в разных системах, обнаружено, что олифен более чем на!'порядок

был эффективнее по своей способности дисмутировать Ог и в два-три раза превосходил амтизол при регистрации разных АФК.

Таким образом, оба изученные соединения показали достаточно высокую антиоксидантную активность^ В литературе имеются сведения об успешном использовании антиоксидантов в качестве средств патогенетической терапии туберкулеза (Соколова Г.Б. и др., 1989; Венгерова О.А., 1990; Андржеюк Н.И. и др., 1994 и др.). Однако, корреляционный анализ, проведенный нами, указал на отсутствие, тесной взаимосвязи между проявлением антиокислительной активности испытанных препаратов и их лечебным действием.

Известно, что при гипоксии, развивающейся в том числе и на фоне прогрессировать туберкулезного процесса, нарушается энергетический потенциал клеток, в связи с чем страдает целый ряд энергоемких функций организма. Так, большинство иммунных реакций являются энергозависимыми (БпкИеп 1.Е. е1 а1., 1981: Кагштку М.Ь., Вас^еу ТА., 1983 и др.). Об этом же свидетельствуют и данные об участии гипоксии различного генеза в формировании иммунной недостаточности (Кузьминицкии Б.Б. и др., 1991; Горанчук В.В., 1993) и в частности дефектов фагоцитирующих клеток (Макарова Н.В., Ратников В.И., 1991; Сег1асЬ Н. е1 а1., 1993). В литературе имеются сведения о понижении функциональной активности макрофагов при туберкулезе: нарушение выработки О! снижение поглотительной способности и угнетение секреторной функции их лизосомального аппарата (Чернушенко Е.Ф. и др., 1986; Селедцова Г.В., Козлоз В.А., 1991; Александрова А.Е., Заболотных Н.В., 1994 и др.).

Результаты данного исследования свидетельствуют о том, что при использовании изониазида или рифампицина в субтерапевтических дозах, супероксидпродуцирующая функция перитонеальных макрофагов продолжала оставаться сниженной (2,38±0,37 усл.ед.; Р<0,05 и 2,14±0,58; Р<0,05 соответственно) по сравнению с аналогичным уровнем ннтактных животных (3,79±0,36 усл.ед.). Присоединение антигипоксантов к этио-тропной терапии сопровождалось заметным уменьшением, вызванного туберкулезным процессом, торможения активности макрофагов. Олифен, используемый в комплексе с изониазидом или рифампицином повышал уровень ЦХА соответственно до 3,90±0,48 усл.ед. (Р<0,05) и до 4,01±0,46 усл.ед. (Р<0,05),а амтизол в аналогичных комбинациях - до 3,60±0,37 усл.ед. (Р<0,05) и до 4,31 ±0,64 (Р<0,05).

Поскольку для туберкулеза характерными являются выраженные нарушения репаративных процессов (Батманов Н.Я., Стростенко Е.В..

1976; Ерохин B.B. и др., 1982; Осташко О.М., Ариэль Б.М., 1994 и др.), эффективное течение которых требует больших затрат энергии (Романова JI.K., 1984; Breimer D.D., 1987 и др.), нами изучено влияние олифена и амтизола на скорость и качество восстановительных реакций в легких и печени - органах наиболее подверженных деструктивным изменениям.

Установлено, что введение олифена или амтизола после односторонней пневмонэктомии у крыс, по сравнению с прооперированными нелеченными животными, приводило к достоверно более быстрому накоплению массы органа. Последняя к 25 дню после операции в группе, где крысы не получали лечение, соответствовала лишь 77% (1,16г), а при применении олифена (1,51г) или амтизола (1,50г) достигала веса одновоз-растного контроля (100% - 1,50г). Гистологическое изучение ткани легкого показало, что у опытных животных по сравнению с контрольными наблюдались структурные изменения: уменьшение отека, гемоди-намических расстройств, эмфизем^атозных проявлений, несколько более раннее значительное утолщение межальвеолярных перегородок за счет увеличения в них клеточных элементов. Эти улучшения, способствуя сохранению растяжимости ткани, определяют снижение тяжести острой дыхательной недостаточности, предотвращают развитие гипоксической гипоксии, возникающей после обширных резекций (Билич Г.Л., 1987). Сравнительная оценка гистологического материала выявила несколько более благоприятное течение компенсаторно-гипертрофической перестройки под действием олифена, обусловленное, по-видимому, его более выраженным противоотечным эффектом, а также положительным влиянием на микроциркуляцию.

Заметная стимуляция репаративных процессов в легких под влиянием олифена обнаружена нами при генерализованном туберкулезе у кроликов, что проявилось в способности препарата восстанавливать структуру (многорядность) бронхиального эпителия, значительно нарушенную у зараженных нелеченных и получавших монотерапию изониазидом животных.

Исследуемые соединения проявили стимулирующее влияние и на процессы регенерации в печени. У животных, которым после частичной гепатэктомии вводили антигипоксанты, по сравнению с нелеченными, отмечено более интенсивное и раннее восстановление массы регенерирующей печени. К 25 дню после операции масса органа под воздействием олифена и амтизола достигала 6,6±0,17г и 6,6±0,14г соответственно, что было на уровне значений печени интактных крыс (6,5±0,04г против

5,72±0,14г в контроле). При гистологическом исследовании было установлено, что применение каждого из препаратов способствовало сокращению деструктивно-реактивной фазы регенерации, более быстрому восстановлению клеточных структур гепатоцнтов. Обнаружено стимулирующее влияние испытуемых веществ на интенсивность процессов пролиферации в печени. У животных, получавших в послеоперационном периоде олифен или амтизол число гепатоцитов, вступивших в митоз было заметно выше (максимальный МИ составил соответственно 17,50±1,97%о и 13,30±2,25%о) чем у крыс, подвергшихся только резекции (максимальный МИ - 8,86±1,41%>). Анализ динамики митоти-ческой активности клеток печени леченных животных показал, что олифен способствовал поддержанию большего, чем амтизол уровня пролиферации гепатоцитов. При этом к концу наблюдения пролифера-тивная волна не заканчивалась,, а общее число митозов в группе с использованием олифена составило 4,25±0,84%о, что достоверно превышало аналогичное в группе с применением амтизола - 1,67±0,42"/„1) ц 0,75±0,56%о у контрольных животных.

В патогенезе туберкулезной инфекции большая роль принадлежит процессам воспаления, развитие которых, связанное с преобладанием экссудативных или пролиферативных реакций, определяет характер течения заболевания и возникающие клинические его формы. В работе использовались две модели асептического воспаления: "ватная гранулема" и "каррагенинонвый отек". На модели "ватной гранулемы" исследованные антигипоксанты .показали высокую противовоспалительную активность, не уступающую эффекту известного антифлогистика бутади-она. Так, полученные весовые параметры, характеризующие экссудагив-ную и пролиферативную фазы воспаления, под влиянием олифена (370,30±20,25 мг и 84,00±7,00 мг) и амтизола (408,00±17,50 мг и 92,40±7,10 мг) были достоверно снижены по сравнению с аналогичными в контроле (777,00±20,62 мг и 169,70±7,83 мг) и сопоставимы'с действием бутадиона (427,00±39,00 мг и 113,50+12,1 мг). При изучении способности задерживать развитие индуцированного каррагенином отека лапок мышей более значительное проявление эффекта было выявлено у амтизола (Р<0,001). Данный препарат снижал интенсивность отека с 84,94±3,88% до 39,5613,52% (Р<0,001), олифен - до 73,51±2,84% (Р<0,05), а бутадион -до 29,28±4,82% (Р<0,001). Поскольку на модели "ватной гранулемы" оценивается преимущественно пролиферативная' фаза, а при индукции каррагенином - экссудативная фаза, воспаления, можно полагать, что в

реализации антифлогистического эффекта испытанные вещества различаются именно степенью антиэкссудативной активности. В определенной степени изученный эффект, вероятно, связан с антиоксидантными свойствами олифена и амтизола, поскольку известно, что в очаге воспаления интенсифицируются процессы ПОЛ (Струков А.И., 1983; Насыров Х.М. 1987; 1995; Spyriounis D.M. et al.,1993 и др.).

Учитывая, с одной стороны, то, что у больных туберкулезом легких на разных этапах течения специфического процесса часто обнаруживаются гипергемокоагуляционные сдвиги (Худзик Л.Б. и др., 1988; Каминская Г.О. и др., 1991 и др.), а с другой, известное негативное влияние кислородной недостаточности на свертывающую систему крови (Альфонсов В.В. и др., 1987; Пак Г.Д. и др., 1990 и др.), нами изучено влияние олифена и амизола на гемокоагуляционный потенциал у зараженных МБТ животных. Показано, что у кроликов через 4 недели после иифицирования развивалась выраженная гиперкоагуляция крови, что проявилось в снижении времени рекальцификации (с 57,00 сек до 32,25 сек; Р=0,05), уменьшении активированного парциального тромбоплапи-нового времени (с 28,33 сек до 22,00 сек; Р=0,05). гиперфибриногенемии (4,42г/л до 6,88г/л; Р=0,05), увеличении протромбинового индекса (до 111,76%). Наряду с указанными изменениями, присутствие в крови фибринмономерных комплексов (что документировалось положительными этаноловым тестом и пробой на фибриноген В) отражало процесс ее внутрисосудистого свертывания (Баркаган З.С., 1988). Это согласуется с данными многих авторов, отмечавших у больных с различной распространенностью специфических поражений в легких, латентнопротекающую патологическую внутрисосудистую активацию системы гемостаза (Приймак A.A. и др., 1990; Макинский А.И. и др., 1991 и др.). Применение монотерапии изониазидом практически не повлияло на нормализацию регистрируемых показателей коагулограммы. Присоединение же к антибактериальной терапии антигипоксантов сопровождалось коррекцией обнаруженных качественных нарушений в системе свертывания крови. При использовании олифена ÄBP возрастало до 43,25 сек (Р=0,05), а АПТВ - до 33,00 сек (Р=0,05); Г!И составил 98,29%; концстрация Ф понизилась до 4,55 г/л (Р=0,05); Эт и фВ стали отрицательными. Введение амтизола способствовало увеличению АВР и АПТВ соответственно до 45,00 сек и 29,00 сек (Р=0,05), восстановлению ПИ (101,82%), нормализации уровня Ф (4,42 г/л; Р=0,05). Эти данные совпадают с недавно появившимися сообщениями об антикоагуляционных свойствах олифена и амтизола (Перенеч Н.Б. и др., 1993; Мельникова В.Н. и др.,

1994; Сингаевский С.Б. и др., 1994). Есть сведения и об антиагрегацион-ной активности этих соединений в отношении тромбоцитов и эритроцитов (Вельских А.Н., 1991; Тулупов А.Н., 1991).

Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что олифен и амтизол наряду с антигипоксической активностью обладают выраженными антиоксидантными свойствами, противовоспалительным действием, способностью стимулировать процессы регенерации, а также корригирующим влиянием на нарушения в макрофагальном звене иммунитета и свертывающей системе крови, которые сопровождают туберкулезный процесс. В проявлении изученных фармакологических эффектов у двух разных по химической структуре и механизму действия антигипоксантов не выявлено значительных различий. Это позволяет высказать предположение, что исследованные нами фармакологические стороны действия веществ обусловлены, в основном, реализацией антигипоксической активности и, появившимися благодаря этому благоприятными возможностями энергетического обеспечения защитных функций организма.

В современной фтизиатрии для наиболее полного излечения больных туберкулезом легких применяется длительная (до 12-18 месяцев) и интенсивная комплексная терапия, включающая, помимо нескольких этнотропных препаратов, патогенетические и симптоматические средства. Это создает чрезмерную медикаментозную нагрузку и повышает риск развития побочных реакций. Известно, что особенно часто осложнения лекарственной терапии встречаются при сочетанном применении большого числа препаратов (Северова Е.Я., 1977; Соколова Г.Б. и др., 1995 и др.). Использование антигипоксантов в качестве средств патогенетической терапии туберкулеза создает возможность добиваться универсального корригирующего эффекта многих, нарушенных при данной патологии, энергоемких функций организма и, таким образом, избавить больного от вынужденной политерапии с ее выраженными побочными эффектами.

ВЫВОДЫ

1. Развитие туберкулезного процесса у экспериментальных животных сопровождается нарушением окислительно-восстановительных процессов, снижением функциональной активности макрофагального звена иммунитета, активацией свертывающей системы крови. Применение изониазида или рифампишша в условиях наших экспериментов не приво-

дияо к значительной коррекции отмеченных патофизиологических сдвигов.

2. Олифен и амтизол, используемые в дозе 50 мг/кг в течение 10-12 дней, повышали эффективность этиотропной терапии животных (кролики, мыши), инфицированных туберкулезом.

3. В опытах in vitro амтизол обладал некоторым ингибирующим действием на жизнеспособность микобактерий туберкулеза и в 2 раза усиливал туберкулостатическую активность изониазида.

4. Введение олифена или амтизола в комплексную терапию экспериментального туберкулеза сопровождалось ускоренным восстановлением кислотно-основного состояния и газового состава крови. Установлена корреляционная зависимость между лечебным эффектом олифена или амт изола и их антигипоксической активностью.

5. Антигипоксанты, применяемые на фоне этиотропного лечения, снижали перекисное окисление липидов, инициированное туберкулезной инфекцией. Выявлено непосредственное антиоксидантное действие препаратов, более выраженное у олифена.

6. Олифен и амтизол проявили корригирующее влияние на, сниженную туберкулезным процессом,функциональную активность макрофагов.

7. Препараты оказывали значительное противовоспалительное действие, не уступающее эффекту широко известного антифлогистика бутадиона. Оба антигипоксанта ингибировали как экссудативную, так и пролиферативную фазы воспаления. Антиэкссудативный эффект был более выраженным у амтизола.

8. Антигипоксанты проявили свойства стимуляторов регенерации печени и компенсаторной гипертрофии легких, способствуя более быстрому накоплению массы регенерирующего органа и нормализации цитологической картины. При этом олифен несколько превосходил амтизол.

9. Сочетанное применение олифена или амтизола с туберкулостатн-ком приводило к коррекции гиперкоагуляционных сдвигов, сопровождающих туберкулезный процесс.

10. Способствуя достижению универсального корригирующего эффекта многих нарушенных при туберкулезе энергоемких функции организма, применение антигипоксантов создает возможность уменьшить количество назначаемых больному патогенетических средств и таким образом снизить риск развития побочных реакций от чрезмерной лекарственной нагрузки.

Практические рекомендации

Проведенные • экспериментальные исследования позволяют рекомендовать при выборе средств патогенетической терапии туберкулеза легких отдавать предпочтение веществам с поливалентным действием, к которым относятся антигипоксанты олифен и амтизол.

Так как амтизол обладает некоторой антимикобактериальной активностью и способностью усиливать специфический эффект изониазида его целесообразно использовать при непереносимости туберкулостати-ков, а также у больных с выраженными экссудатннными проявлениями в связи с его более значительным антиэкссудативным эффектом, чем у олифена. Назначение олифена предпочтительнее при меструктивных нарушениях в легких и наличии побочных эффектов со стороны печени, так как он оказывает более заметное чем амтизол действие на интенсивность репаративных процессов.

К настоящему времени в терапевтическом отделении Спб НИИ фтизиопульмонологии накоплен первый опыт клинического изучения олифена. Получены положительные 'результаты при включении данного антигипоксанта в комплексную этиопатогенетическую терапию больных с деструктивным туберкулезом легких.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Александрова А.Е., Борисова Л.Е., Царапкина Л.Д., Антоненкова Б.В., Боддышева A.B. Средства, обладающие антигипоксической активностью, > в патогенетической терапии туберкулеза легких // Актуальные вопросы лечения больных туберкулезом на современном этапе. - Якутск, 1990. - С. 50-51.

2. Александрова А.Е., Антоненкова Е.В., Борисова JI.E., Царапкина Л.Д. Антигипоксанты в терапии туберкулеза - экспериментальное исследование // Всезогоэ.конгресс по болезням органов дыхания, 2-й: Сб.резюме. - Челябинск, 1991. -Реф. 388.-С. 133.

3. Александрова А.Е., Заболотных Н.В., Щербакова Н.М., Антоненкова Е.В. Экспериментальное обоснование использования новых средств патогенетической терапии туберку чеза // Съезд врачей-фтизиатров, XI-й: Тез.докл. - С. - Петербург, 1992.-С. 288.

Антоненкова Е.В. Сравнительная характеристика олифена и амтизола как средств патогенетической терапии туберкулеза // Антигипоксанты и актопротекторы. Итоги и перспективы. - С.-Петербург, 1994. - С. 11.

5. Александрова А.Е., Антоненкова Е.В., Силиции М.А. Фармакологическая характеристика двух' антигипоксантов как средств патогенетической терапии

туберкулеза II Национальный конгресс по болезням органов дыхания, 4-й: Тез.докл. -М., 1994. - Реф. 400.

6. Александрова А.Е., Антоненкова Е.В. Сравнитёлная фармакологическая характеристика двух антигипоксантов как средств патогенетической терапии туберкулеза // Туберкулез как объект научных исследований. - С.-Петербург, 1994. - Т. II - С. 26-30.

7. Антоненкова Б.В., Синшшн М.А. Влияние олифена и амтизола на показатели гемостаза //Туберкулез как объект научных исследований. - С.-Петербург, 1994. - Т. II -С. 31-35. '

8. Александрова А.Е., Антоненкова Е.В., Ремезова О.В. Корригирующее влияние антигипоксантов при нарушениях свертываемости крови // Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", II-й: Тез.докл. - М., 1995. - С. 217.

9. Антоненкова Е.В. Использование антигипоксантов в комплексном лечении экспериментального туберкулеза // Научн.конференция молодых специалистов-фтизиопульмонологов России "Клинические и экспериментальные исследования во фтизиатрии и пульмонологии", 1-ая: Тез.докл. - М., 1995. - С.

10. Антоненкова Е.В. Спектр фармакологической активности антигипоксантов олифена и амтизола // Съезд Росс.научного общества фармакологов, 1-й: Тез.докл. -

■ М , 1995.-С.22.

П. Александрова А.Е., Виноградова Т.И., Литвинов A.B., Антоненкова Е.В., Ерешко С.В. Методы профилактики и устранения гепатотоксичности противотуберкулезных препаратов II Национальный конгресс по профилактической медицине, 2-й: Тез.докл. - С.Петербург, 1995. - С. 8.

12. Антоненкова Е.В. Антиоксидантная активность антигипоксантов олифена и амтизола, используемых в качестве средств патогенетической терапии туберкулоа // Материалы научн.сессии, посвященной 65-летию Уральского НИИ фтизиопуль-монологии. - Екатеринбург, 1996. - С.

13. Александрова А.Е., Антоненкова Е.В. Амтизол - новое средство патогенетической терапии туберкулеза // Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", III-й: Тез.докл. - М., 1996. - С.