Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Специфические показатели гуморального иммунитета у больных раком молочной железы

На правах рукописи

ГАДЕЦКАЯ Нина Александровна

СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

(14 00 14 - онкология)

Автореферат

диссертации р кандиде

Москва - 2007

003177840

Работа выполнена в ГУ Российский онкологический научный центр им Н Н Блохина РАМН (директор - академик М И Давыдов)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор 3 Г Кадагидзе доктор медицинских наук, профессор В П Летягин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В А Хайленко доктор медицинских наук, профессор Б В Пинегин

Ведущая организация:

Российская медицинская академия последипломного образования

на заседании диссертационного совета (К 001 17 01) при ГУ Российский онкологический научный центр им НН Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российский онкологический научный центр им Н Н. Блохина РАМН Автореферат разослан 4// 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Ю А Барсуков

Защита диссертации состоится

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Иммунные механизмы противоопухолевой защиты чрезвычайно многообразны Главными эффекторами, осуществляющими цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток, считаются Т-киллеры (С08+) и №С-клетки Т-лимфоциты реализуют свое действие через распознавание посредством ТС И. (Т-клеточного рецептора) опухолеассоциированных пептидов в контексте молекул Н1А на мембране злокачественных клеток Поскольку иммунизация Т-клеток осуществляется профессиональными АПК (антигенпрезентирующими клетками), то большое внимание в современных исследованиях уделяется дендритным клеткам и вакцинам на их основе Реализация цитотоксического действия примированных Т-киллеров возможна только в отношении опухолевых клеток, экспрессирующих молекулы НЬА-1 класса Напротив, действие МК-клеток возможно в отношении клеток с видоизмененными или утраченными молекулами НЬА

Т-клетки и МК-клетки не распознают углеводные детерминанты опухолевых клеток Вместе с тем, значительная часть опухолеассоциированных антигенов - это углеводные (карбогидратные, отсюда аббревиатура СА) антигены На их определении во многом основаны диагностика и мониторинг опухолевого процесса по сывороточным маркерам (СА 15-3, СА 125, СА 19-9 и тд) Углеводные детерминанты опухолевых клеток эффективно распознаются антителами - то есть эффекторами гуморального иммунитета

В последние годы гуморальный иммунитет не изучался столь интенсивно, как клеточный иммунитет у больных раком молочной железы Вместе с тем, накоплен

J

большой фактический материал, указывающий на важную роль В-клеточного звена иммунитета у больных раком молочной железы

1 В-лимфоциты так же, как и Т-лимфоциты инфильтрируют опухолевую ткань и характеризуются функциональной активностью, проявляющейся в формировании фолликулоподобных структур со светлыми центрами

2 В-клетки, инфильтрирующие ткань молочной железы, олигоклональны, могут иметь специфичность к опухолеассоциированным антигенам

3 У части больных раком молочной железы отмечается массивная плазмоклеточная инфильтрация опухоли, иммуноглобулины этих клеток олигоклональны, часть клонов специфична к опухолевым антигенам

4 В эксперименте внутривенное введение небольшого числа раковых клеток иммунным животным не сопровождается развитием опухоли Эти клетки эффективно элиминируются антителопосредованными иммунными механизмами

5 При наличии микрометастазов рака молочной железы в костном мозге выявляются кластеры плазматических клеток

6 Существуют опухолеассоциированные углеводные детерминанты (выявляемые антителами Ьи-ВОШ-07), экспрессия которых клетками рака молочной железы ассоциирована с неблагоприятным прогнозом Учитывая их высокую иммуногенность и возможность индукции специфического антительного ответа, эти молекулы могут явиться потенциальными мишенями противоопухолевой иммунотерапии

Все выше сказанное дает основание для проведения исследований В-клеточного звена иммунитета на современном уровне с учетом углубленного субпопуляционного состава и клональности В-лимфоцитов, а также плазмоцитов крови и костного мозга, оценки наличия специфических антител к опухолеассоциированным детерминантам в сыворотке крови больных

Целью настоящей работы явилась характеристика показателей В-клеточного звена иммунитета у больных раком молочной железы

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1 Охарактеризовать субпопуляции и клональность В-клеток периферической крови у больных раком молочной железы

2 Изучить титры антител к опухолеассоциированному дисахариду Gal 3 1-3 GclNAc в сыворотке крови больных и здоровых доноров

3 Изучить особенности связывания опухолеассоциированного дисахарида Gal 3 1-3 GclNAc В-клетками у больных раком молочной железы

4 Сопоставить показатели гуморального иммунитета с клинико-морфологическими характеристиками рака молочной железы

Научная новизна

Впервые детально изучены субпопуляции В-лимфоцитов периферической крови больных раком молочной железы Особенностью иммунофенотипа В-лимфоцитов у больных раком молочной железы в сравнении с донорской группой является более высокая экспрессия антигена CD23 В 67% случаев рака молочной железы среди В-лимфоцитов крови присутствуют высокоаффинные к Lec В-клетки, которые включают 2 популяции - CD5+ и CD5- Выраженный антительный ответ на Lec наблюдается у 30% больных раком молочной железы Высокие титры анти-Le' антител находятся в реципрокных взаимоотношениях с сывороточными уровнями опухолеассоциированного антигена СА 15-3 и практически не наблюдаются при высоких концентрациях маркера У больных с высокими титрами анти-Le' отмечаются повышенные концентрации сывороточного IgM

Научно-практическая значимость

Научно-практическая значимость работы определяется тем, что на основе анализа взаимоотношений Ьес-связывающих СБ5-позитивных В-лимфоцитов и лактозами-связывакмцих В-клеток (отсутствие корреляционных связей) может быть разработан алгоритм для более точной оценки содержания анти-Ьес специфичных В-клеток в периферической крови Содержание В-лимфоцитов, специфически связывающих 1лс, в случаях наличия высокоаффинной популяции этих клеток достоверно выше, чем количество В-лимфоцитов, связывающих лактозамин

Результаты работы позволили уточнить роль В-клеточного звена в противоопухолевом иммунитете у больных раком молочной железы Выделены группы больных с наличием антительного ответа на опухолеассоциированный антиген 0а1[31-30сМАс Случаи с отсутствием гуморальной иммунной реакции на опухолеассоциированный дисахарид могут рассматриваться как группа больных, подлежащих дальнейшему изучению на предмет возможной иммунизации (вакцинации) или адоптивной терапии соответствующими моноклональными антителами

Апробация диссертации и публикации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены 6 июля 2007 года на научной конференции лаборатории клинической иммунологии опухолей, лаборатории иммунологии гемопоэза, хирургического отделения опухолей молочных желез, хирургического отделения опухолей женской репродуктивной системы, отделения трансплантации костного мозга и интенсивной химиотерапии НИИ КО ГУ РОНЦ им НН БлохинаРАМН Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах, 5 глав, в которых представлены данные литературы и результаты собственных исследований, заключения, выводов, библиографического указателя Работа иллюстрирована таблицами и рисунками Библиографический указатель включает 4 отечественных и 97 зарубежных источников

ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования клеточных и антительных показателей гуморального иммунитета проведено у 102 больных раком молочной железы

Показатели В - клеточного звена иммунитета были проанализированы у 21 первичной больной РМЖ (до лечения)

Средний возраст этих больных составлял 56,8 лет ± 2,4 года Возрастные показатели колебались в пределах от 35 до 75 лет, медиана составила 56 лет

Характеристика больных по стадиям заболевания и гистологическим типам опухоли представлена в таблицах 1 и 2

Контрольная группа включала 9 женщин в возрасте от 27 до 49 лет (6 здоровых доноров, 3 пациентки с фиброаденомой молочной железы)

У всех пациенток были оценены уровни экспрессии основных активационных антигенов в пределах В-клеток (СБ 19+)

Таблица 1

Характеристика больных раком молочной железы по стадиям заболевания.

Стадия шм Количество больных

Абс %%

I тшомо 3 14

Па Т1ШМ0 4 33

Т21Ч0М0 3

ПЪ Т2№М0 2 10

Ша Т2№М0 2 14

ТЗШМО 1

ШЬ Т4Ы0М0 1 24

Т4ШМ0 4

IV Т2ШМ1 1 5

Таблица 2. Гистологический тип опухоли

Гистологический тип опухоли Число больных

Инфильтрирующий протоковый рак 15

Инфильтрирующий дольковый рак 2

Аденогенный рак 1

Цитологическая верификация 3

Характеристика субпопуляций В-лимфоцитов в пределах СО 19+ В-клеток проводилась с помощью трехцветной проточной цитометрии

Общую популяцию лейкоцитов выделяли путем стандартного лизиса эритроцитов Мононуклеарную фракцию выделяли путем центрифугирования в

градиенте фиколл-верографин Из 5 мл гепаринизированной периферической крови больных РМЖ выделялась фракция мононуклеаров Для этого кровь, разведенную в 2 раза забуференным физиологическим раствором с добавлением бычьего сывороточного альбумина (ЗФР-БСА), наслаивали на фиккол-верографин и центрифугировали при 100С^ 40 мин при комнатной температуре Мононуклеары собирали пастеровской пипеткой из интерфазы и дважды отмывали ЗФР-БСА

С выделенными клетками проводили прямую реакцию иммунофлуоресценции (РИФ) в 96-луночном планшете Для этого в каждую из 12 лунок вносили взвесь клеток в количестве не менее 100 ООО Далее в каждую лунку добавлялся коктейль антител в соответствии с панелью и аккуратно ресуспензировался пипеткой Каждое МКА брали в количестве 10 мкл на лунку, суммарный объем МКА в лунке- 30 мкл Клетки инкубировали с антителами в течение 30 мин при 4°С По окончании времени инкубации клетки дважды отмывали от несвязавшихся антител путем центрифугирования в течение 5-7 мин при 1000g Затем клетки переносили в специальные пластиковые пробирки для счета на проточном цитометре

Оценка реакции осуществлялась на проточном, 5-параметровом, цитометре РАСБсап (ВО, США) Сбор и анализ клеток осуществлялся в гейте СБ 19+ клеток, включающим только популяцию В-лимфоцитов Субпопуляции В-лимфоцитов в пределах СВ19+ В-клеток характеризовались на основании коэкспрессии антигенов, представленных в таблице 3 Подсчет абсолютного числа клеток в мкл крови осуществлялся на основании числа лейкоцитов и процентного соотношения лимфоцитов в гемограмме на день исследования

Таблица 3. Комбинации использованных МКА

№ пробирки Проба Р1ТС (Р1-1) Проба РЕ (И-2) Проба Ре/Су5 (Н-З)

1 1йС1 - 1йС1

2 СБ45 - СЭ19

3 1дС1 СШ9

4 СИ5 СР20 С019

5 СВ23 НЬА-ОЯ СЭ19

6 С038 СБЮ СВ19

7 С071 СБ95 СШ9

8 Ы СБ19

9 ЪО С05 С019

10 С05 СР19

11 ЬА СВ5 С019

12 Лактозамин НТС С05 С019

13 Ье'-НТС СВ5 СЭ19

На первом этапе анализа идентифицировали В-клетки и определяли их процентное содержание в пределах лейкоцитов СВ45++ Далее в пределах гейта В-лимфоцитов определяли экспрессию различных дифференцировочных антигенов на клетках

Исследование концентрации опухоле-ассоциированного антигена М1ГС-1 (СА 15-3) и антител к нему (аяти-Ье°) в сыворотке крови больных раком молочной железы проведены у 81 больной раком молочной железы на различных стадиях наблюдения и лечения, в том числе, при прогрессировании заболевания и высоких уровнях СА 15 3 в сыворотке крови пациенток Диагноз во всех случаях был морфологически верифицирован Продолжительность заболевания на момент исследования составила от 1 мес до 17 лет у 15 (18,5%) больных - свыше 5 лет, у 26 (32,1%) - от 2 до 5 лет, у 13 (16%) - от 1 до 2 лет, у 21 (25,9%) - менее года, у 6 (7,4%) продолжительность заболевания не уточнена У всех этих больных были изучены как концентрация МиС1 (СА 15 3) в сыворотке крови, так и антитела к углеводной (Са1|}1-301сКАс) детерминанте этой молекулы У 80 больных были определены концентрации иммуноглобулинов 3 классов М, в, А

Определение специфических антител к Ьес в сыворотке крови Планшеты были нагружены полиакриламидными коньюгатами Сахаров, 10 мкг/мл в 0,05М Ыа-карбонатном буфере, рН 9,6, в течение 1 часа при 37°С Затем планшеты были блокированы РВБ (забуференный фосфатом физиотогический

раствор), содержащим 3% BSA (бычий сывороточный альбумин), в течение 1 часа при 37°С и трижды отмыты раствором PBS, содержащим 0,1% Tween-20 (отмывочный буфер) Сыворотку крови больных раком молочной железы (в последовательных двукратных разведениях, начиная с 1 50) добавляли в лунки с конъюгатами Сахаров в количестве 100 мкл на лунку и инкубировали в течение 1 часа при 37°С, после чего трижды отмывали буферным раствором На следующем этапе планшеты были инкубированы с антителами к иммуноглобулинам человека, меченными биотином (SouthernBiotec) в разведении 1 5000 в PBS, содержащем 0 3% BSA, в течение 1 часа при 37°С и затем отмыты Цветовая реакция проявлялась 30 минутной инкубацией с ОДМ фосфатом натрия/0,1М кислым цитратным буфером, содержащим 0,04% о-фенилендиамина и 0,03% перекиси водорода Реакцию останавливали добавлением 50 мкл IM H2SO4 Абсорбцию регистрировали при длине волны 492 нм на многопараметровом счетчике (Victor2 тм , PerkinElmer, US) Каждое исследование дублировалось

Маркер CA 15 3 определяли в сыворотке крови больных раком молочной железы и в донорской группе стандартным яммуноферментным методом (ELISA) с использованием реактивов фирмы Рош

Уровни иммуноглобулинов классов IgG, IgM, IgA в сыворотке крови больных раком молочной железы определяли методом радиальной иммунодиффузии по Манчини с использованием тест-систем производства «НПЦ Медицинская иммунология», Россия

Статистическая обработка полученных результатов проводилась на персональном компьютере с использованием программы SPSS и включала корреляционный анализ (коэффициент корреляции R, Пирсона), сравнение средних (критерий Стьюдента, t), анализ сопряженности признаков (Хи-квадрат) и точный критерий Фишера с доверительным интервалом 95% Использованы как

параметрические, так и непараметрические тесты Различия считались статистически значимыми при р<0,05 (95% точности)

РЕЗУЛЬТАТЫ

Субпопуляции В-лимфоцитов у больных раком молочной железы Ьес-специфичные В-клетки

Показатели В - клеточного звена иммунитета были проанализированы у 21 первичной больной РМЖ (до лечения)

Средний возраст больных составлял 56,8 лет ± 2,4 года Возрастные показатели колебались в пределах от 35 до 75 лет, медиана составила 56 лет

Контрольная группа включала 9 женщин в возрасте от 27 до 49 лет (б здоровых доноров, 3 пациентки с фиброаденомой молочной железы)

У всех пациенток были оценены уровни экспрессии основных антигенов, позволяющих судить о степени зрелости, активации и субпопуляционном составе В-лимфоцитов (Сй 19+)

г

На первом этапе анализа идентифицировали В-клетки и определяли их процентное содержание в пределах лейкоцитов СБ45++ как показано на рисунке 1 Далее в пределах гейта В-лимфоцитов определяли экспрессию различных дифференцировочных антигенов на клетках

ЯВЙР?*"*-*

1С5 10:

10: СО 45 РГГС

В

Рис. 1. Гейт для анализа субпопуляционного состава В-клеток. А. Выделение гейта лейкоцитов на основании экспрессии СГ>45 (ось X -экспрессия С045 ИТС, гейт К1, на цитограмме выделен красным цветом)

Б. Гейт В-клеток ( СО 19+ ) - 142. По оси абсцисс экспрессия В-клеточного антигена С019 РЕ/Су5.

Показатели крови и уровни содержания В-клеток в контрольной группе были в пределах нормы.

Средние уровни В-лимфоцитов больных составили 7,6±0,8% от всей популяции лимфоцитов при медиане 7,5% и разбросе 0,7-13,8 %

В целом по группе В-клетки (СБ 19+) характеризовались мономорфной экспрессией СО 20 и НЬА БИ, отсутствием СБЮ, наличием С038 на части клеток Большинство В-клеток экспрессировали мембранные ^ М Содержание В-лимфоцитов с различными изотипами иммуноглобулинов было следующим ^М 85,2% ±2,8 (49,2 - 99,4%), ДО - 18,7%±5,7 (1,2-96,7%), 1ЙА 10,4%±1,3 (1,9-22,4%)

В-клетки были поликлональны по типам легких цепей мембранных иммуноглобулинов 1§к в среднем 62,6±2,3%, ^А. 36,3±2,1% В одном случае отмечено явное преобладание (моноклональность) каппа-типа В-лимфоцитов

В значительном проценте изученных образцов (18 из 20 - 90% от всех случаев) на В-клетках выявлялась экспрессия активационного антигена СБ23 (от 32,8 до 94,5%) одновременно с экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости 11 типа (НЬА ОЯ)

В 7 из 19 изученных случаев (36,8%) на В- клетках (С019+С020+) выявлялась экспрессия антигена С05 (от 22,1 до 48,3%) У 14 из 19 больных (73,6%) В-клетки коэкспрессировали активционный антиген СШ8 с разбросом от 25,4% до мономорфной экспрессии (98,3%) Экспрессия молекул СЕЛ1, СОЮ, СЭ95 бьыа гетерогенной Данные представлены в таблице 4

Таблица 4. Иммунофенотшшческая характеристика В-лимфоцитов у больных раком молочной железы и в контрольной группе

Антиген %% В-клеток Среднее±ош ср , Разброс, п Р(дост

Больные РМЖ Доноры различий)

СО 10 11,1±2,9%, 12,7±1,4, 0,75

0,0-49,7,19 6,7-17,4, 7

СО 71 22,4±3,5, 12,6±2,7, 0,10

0,9-55,8,19 2,2-21,2, 8

СИ 95 9,2±1,5, 8,4+1,9, 0,77

0,1-25,1,19 1-16,1,8

СБ23 59,5±5,5, 39,3±4,8, 0,039

1,9-94,5, 20 21,4-58,9,8

С05 21,9±3,3, 23,2±5,0, 0,83

4,6-48,3,19 8,5-50,9,8

СВ20 97,0+0,5, 97,9+0,6, 0,31

90,3-99,9, 19 95-100,8

СБ38 49,2+6,8,7,1-98,3, 19 44,1±4,1, 25-58,7, 7 0,66

Достоверных различий между сравниваемыми группами по большинству популяций не выявлено Содержание С023 позитивных клеток было достоверно выше у больных раком молочной железы

У всех пациенток нами проанализировано наличие специфических рецепторов к дисахариду Ьес на мембране В-лимфоцитов на основании способности В-клеток связывать опухолеассоциированный дисахарид Са1р1-ЗСк^Ас (Ьес) в составе флуорохромного зонда Ьес-РАА-Аи (в дальнейшем обозначаемым Ьес) В качестве контроля к Ьес использовался меченый флуорохромом лактозамин - дисахарид, схожий по структуре с 1_ес ГСа1[И-401сКАс) Флуоресцентно меченые пробы были любезно представлены профессором Н В Бовиным (ИБХ, Москва)

У 85% больных РМЖ (18 из 21) и у 75% доноров (6 из 8) выявлялись В-клетки, связывающие дисахарид Ьес Средние уровни Ьес-связывающих В-клеток у больных РМЖ составляли 6,0% (0,73 - 32,0%, Ме - 2,5%), у доноров соответственно- 5,4% (1,5-16,0%), различия не достоверны р = 0,31 В-клетки, связывающие большие количества Ьес и дающие яркий флуоресцентный сигнал при проточно-цитометрическом анализе, выявлены в 67% (14 из 21) больных раком молочной железы 0,6 - 3,9% (Ме - 0,9%)

Пример связывания Ьес с В-клетками, включая клетки с ярким флуоресцентным сигналом, представлен на рис.2.

о

Кь

tf> —

а

о

о Ъ

Рис. 2. Пример выраженной экспрессии Lec на В-лимфоцитах. CD19+ В-лимфоциты накоплены в гейте R2. Оценка экспрессии CD5 (РЕ, ось Y) и связывания Le' (FITC - ось X). Около 50% Ьес-связывающих В-лнмфоцнтов составляют CD5+ В-клетки (1,5% клеток Le"+ CD5+, общее количество Lec+ - 3,13%).

Одним из направлений работы явилась оценка связывания Lec с субпопуляцией С05-позитивных В - клеток. Именно эти клетки, как известно, во многом определяют антительный ответ на углеводные антигены и продуцируют т.н. естественные антитела IgM класса.

Lec+ CDS+B-клетки были оценены в 12 случаях из 21.

Во всех случаях рецепторы к Lec+ были экспрессированы как на CD5-познтивных, так и на CD5-негативных В-лимфоцитах. CDS-позитивные В- клетки составляли в среднем 50% от В-клеток, высокоаффинных к Lec+, как представлено на рис. 2.

Таким образом, полученные в работе данные свидетельствуют о гетерогенности В-лимфоцитов у больных раком молочной железы. По большинству

маркеров они были сходны с донорской группой, лишь пропорция С023-позитивных В-клеток была более выраженной у больных раком молочной железы

Отмечено связывание флуоресцентно меченого дисахарида Galpl-3GlcNAc В-лимфоцитами больных раком молочной железы и В-лимфоцитами доноров Впервые показано, что мембранные рецепторы С05-позитивных В-лимфоцитов способны связьюать дисахарид Gal|31-3GlcNAc Это может служить указанием на участие данной популяции клеток в противоопухолевом иммунном ответе на раковые клетки, экспрессирующие изучаемую углеводную детерминанту на мембране Показатели гуморального противоопухолевого иммунитета у больных первичным операбельным раком молочной железы

Мы проанализировали, существуют ли взаимосвязи между наличием (уровнями) Gal$l-3GlcNAc (Ьес)-специфичных В-лимфоцитов и клиническими характеристиками рака молочной железы, уровнями MUC1 (антиген, в структуре которого присутствует детерминанта Gaipi-3GlcNAc), концентрацией иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови и некоторыми другими показателями

Клиническая характеристика больных во взаимосвязи с наличием и процентом Ье°-специфичных В-клеток представлена в таблице 5

Таблица 5

Клиническая характеристика больных и содержание Ье'-специфичных В-клеток

№пп Инициалы TNM Клиническая Размер Процент Lec-

стадия опухоли специфичных

(см) В-клеток

(CD19+)

1 Ж-а T4N0M0 1П6 1,5x1,5 3,9

2 Сач-а T2NlpN0M0 116 2,0x2,5 2,7

3 3-а T4N2M0 Шб 5,0x5,5 1,45

(мульт)

4 А-а ТШОМО I 1,0x1,5 (мульт) 0,6

5 Кол-а Т41Ч1рГОМ0 П16 4,0x3,0 0,76

6 Л-а Т2рТШ1рН0М0 I 2,0x1,5 (мульт) 1,72

7 В-а Т1ММ0 Па 1,0x1,2 1,5

8 Я-а ТЗ(рТ1)Н2(рШ) МО Па 2,0x2,0 2,48

9 Сиз-а Т4(рТ2)К 1 (рИ2) МО Шб 2,5 х 2,7 0

10 Куз-а Т21Ч0М0 Па 2,0x1,5 0

И Мол-а тзтмо Ша 7,0 х 5,0 0

12 Л-е Т4Ы2М0 Шб нет 2,1

13 Ч-а ТШ0М0 I 2,0x2,0 0

14 Н-а ТШ1М0 Па 1,5x1,0 (мульт) 0

15 С-а ТШ1М0 Па 0,9

16 Л-а Т2ШМ0 Пб 3,0x3,0 (мульт) 0

17 Т-а Т2ШрШМ0 Ша 2,8x2,7 1,26

18 Мер-а Т2К0М1 IV 4,0x4,5 0

19 Б-а Т2ШрИ2М0 Ша 2,5x2,8 0,8

20 А-а Т2И0М0 Па 3,5x2,0 1,4

21 К-а Т2ШМ0 Па 1,36

Отмечена вдвое более высокая частота опухолей малого размера (Т1) в группе пациенток с наличием высокоаффинньгх В-клеток, 28,6% и 14,3% соответственно, с другой стороны индекс ТЗ отмечен в одном случае в каждой группе При оценке сопряженности признаков взаимосвязи между ними не установлено (р>0,05)

При наличии гуморального ответа метастазы в лимфоузлах обнаруживаются несколькореже (64,3% и 85,7%), различия не достоверны Средний возраст

пациенток с наличием высокоаффинных к Ьес В-клеток и без таковых не различался (55,7 ± 2,6 и 58,9±5,3 соответственно, р=0,5)

Проведение сопоставлений в зависимости от гистологического типа опухоли в данной группе пациенток было невозможным ввиду малого количества случаев инфильтративного долькового рака (2 случая)

Наличие высокоаффинных В-клеток не имело прямой ассоциации с повышенными уровнями антител к Ьес (СШ > 2,0) в сыворотке крови больных При наличии высокоаффинных В-клеток высокие уровни антител определялись вдвое реже, чем при их отсутствии (21,4% и 42,9%, р = 0,3)

Сравнение средних уровней иммуноглобулинов в сыворотке крови в зависимости от наличия или отсутствия высокоаффинных В-клеток не выявило достоверных различий для ^М 204,4±42,5 и 235,6+54,3, р = 0,76, для 210,7±19,3 и 229,3±26,9, р = 0,58, для ^А 176,4+21,8 и 192,7+32,9, р = 0,68

Наряду с анализом связывания 0а1|31-301сЫАс с В-лимфоцитами нами подробно изучен субпопуляционный состав В-клеток Эти исследования проведены у 30 женщин (21 больная раком молочной железы и 9 - группа сравнения /6 доноров, 3 пациентки с мастопатией/)

Оценили наличие корреляционных связей между процентом Ьес -связывающих В-клеток и их субпопуляций (высокоаффинные, С05-позитивные) с другими популяциями В-лимфоцитов, различающихся по иммунологическим маркерам

Общий процент Ье°-позитивных В-клеток находился в прямой корреляционной связи с пропорцией СБ19+СВ5+ лимфоцитов (К=0,404, р=0,037), с процентом В-лимфоцитов, связывающих лактозамин (11=0,402, р=0,031), а также с относительным содержанием СЭ5+ В-лимфоцитов, связывающих Ьес (Я=0,973, р=0,000) Последняя корреляция была наиболее высоко достоверной, что, вероятнее

всего, свидетельствует о важной (доминирующей) роли данной субпопуляции (СБ5+) лимфоцитов в связывании дисахарида Ьес

В свою очередь, С05-позитивные Ьес -связывающие В-лимфоциты находились в достоверной корреляционной связи с В-клетками, экспрессирующими СР38 (11=0,519, р=0,048), общим процентом СВ5-позитивных В-лимфоцитов (11=0,583, р=0,011), зрелых С05-позитивных СШ0+ В-клеток (11=0,581, р=0,011) и ^М-позитивных С05+ В-лимфоцитов (К=0,532, р=0,023) Корреляции с пропорцией В-клеток, связывающих лактозамин, в том числе, С05-позитивных В-лимфоцитов не выявлено (р=0,377 и р=0,479 соответственно) Это является дополнительным подтверждением того, что дисахарид-связывающие В-лимфоциты действительно являются аитиген-специфичными (Ьес-специфичными), отсутствует связывание за счет лектинов мембраны В-клеток, в частности, галектинов Различие между лактозамином и Ьес касается только связи между галактозой и глюкозой -Са1(И-301сКАс в Ьес и Са1р1-4С1сКАс в лактозамине Неожиданным оказалось обнаружение отрицательной корреляционной связи между пропорцией Ьес-связывающих СВ5+ В-клеток и процентом В-лимфоцитов, экспрессирующих НЬА-БЯ (Я= -0,559, р=0,02) Рассматривая эту находку в сочетании с высокой корреляцией с С038-позитивными лимфоцитами, можно предполагать определенную плазмоцитоидную дифференцировку СБ5+ В-лимфоцитов, специфичных к Ьес

Другим вариантом анализа, предпринятым нами для характеристики Ьес-специфичных В-клеток, явилось сравнение средних пропорций субпопуляций В-лимфоцитов в переделах группы больных с наличием высокоаффинных В-лимфоцитов и без таковых

Процент Ьес+ СБ5+ В-клеток в группе больных с высокоаффинными к Ьес-лимфоцитами в пять раз выше, чем у пациентов с отсутствием этих клеток

3,3±1,3% и 0,59±0,26%, р = 0,086 Средний процент CD5+ В-клеток в этих группах составил 19,5±4,1% и 2б,1±5,4%, р=0,3

Субпопуляции В-лимфоцитов не были взаимосвязаны с наличием более высоких титров антител к Lec (ОД > 2,0) в сыворотке крови больных раком молочной железы и доноров

Взаимосвязь GalBl-3GlcNAc (Ъе'Усвязываюших лимфошггов с концентрацией гликопротеина MUC1 в сыворотке крови больных раком молочной железы.

СА 15 3 - это показатель в условных единицах, который отражает концентрацию муцинов MUC1 в сыворотке крови Наиболее часто данная маркерная характеристика используется при диагностике и мониторинге эффективности терапии рака молочной железы В данном тесте молекула MUC1 определяется иммуноферментным методом с использованием 2 моноклональных антител (МКА) к белковой части гликопротеина Оба МКА - 115D8 и DF3 -распознают эпитопы в высокоиммуногенной области тандемных повторов МКА DF3 направлены против детерминанты TRPAPGS, детерминанта МКА 115D8 точно не установлена (в более широком понимании - это один из антигенов мембран жировых глобул)

Как показали предшествующие исследования лаборатории иммунологии гемопоэза, антиген MUC1 (антитела ICO-25) экспрессирован практически в 100% случаев рака молочной железы, причем отмечается как мономорфная, так и мозаичная экспрессия на опухолевых клетках Однако не все детерминанты молекулы MUC1 представлены на раковых клетках В норме дисахаридная последовательность Galpl-3GlcNAc, скрыта другими углеводными детерминантами, не является концевой, не доступна для антител и не выявляется как антиген Нарушение процессов гликозилирования при раке приводит к достаточно частой экспрессии Gal(31-3GlcNAc - 56% случаев на начальных стадиях (Шинкарев С А , 2004) и 72% при раке молочной железы в целом (Rye et al, 1994)

У 21 больной операбельным раком молочной железы на этапе диагностики, до операции оценка сывороточных уровней MUC1 (CA 15 3) проведена в параллели с изучением способности B-клеток и их субпопуляций связывать Lec У большинства больных уровни онкомаркера были в пределах нормы или ближе к верхней границе нормы, что, по-видимому, обусловлено ранними (операбельными) стадиями рака молочной железы Вместе с тем, уровни CA 15 3 у этих больных операбельным раком молочной железы при диагностике (7,88 - 107,6, среды - 23,47) были достоверно более высокими, чем в контрольной группе здоровых женщин (5,86 -17,19, средн - 13,07), р = 0,033

Взаимосвязь между уровнями MUC1 и антител к MUC1 (анти-Le1*) в сыворотке крови больных операбельным раком молочной железы

В анализируемой группе больных изучили наличие антител к Lec в сыворотке крови Ввиду сложности анализа и перехода к строго количественным концентрационным параметрам данные представлены в виде единиц оптической плотности (ОД) - показателя, который является основой для пересчета в любых ELISA тест-системах и достаточно точно отражает уровни Lec специфичных антител Данный показатель в анализируемой группе больных находился в диапазоне 0,3 - 2,7 (средн 1,67 ± 0,59) В контрольной группе здоровых женщин соответствующие цифры были достоверно более высокими 1,76-3,17 (средн 2,6 + 0,53, р = 0,001)

Этот анализ на ограниченном числе пациентов позволяет констатировать, что концентрация маркера в сыворотке больных раком молочной железы достоверно выше, чем в норме, а уровни антител к углеводной части этого антигена -достоверно ниже

Мы сравнили средние значения концентрации антител к Lec в сыворотке крови в группах больных с наличием и отсутствием метастазов (N) В группе больных с отсутствием метастазов уровни антител были несколько ниже

(1,48±0,37) в сравнении с группой больных, у которых метастазы определялись (1,75±0,11) Однако различия не были достоверными, р=0,37

При анализе сопряженности признаков также не выявлено ассоциации между наличием метастазов и повышенными титрами антител к Ьес Частота повышенных уровней АТ к Ьес (более 1,99) была большей в группе N0 (33,3%) в сравнении с пациентами или М+ (28,6%), различия не достоверны р = 0,8 Взаимосвязь между концентрацией в крови опухоле-ассоциированного антигена С А 15 3 (углеводная детерминанта МЦС1) и специфическими показателями связывания Ьес (другая углеводная детерминта МЦС1) сывороткой крови больных раком молочной железы (наличием антител к Ье")

Анализ, проведенный у первичных операбельных больных раком молочной железы и у здоровых женщин, позволил установить своего рода реципрокные взаимоотношения между концентрацией в сыворотке крови опухолеассоциированного гликопротеина МиС1 (СА 15 3) и антителами к одной из его углеводных детерминант (СаЩЬЗИсЫАс) Концентрация СА15 3 у больных раком молочной железы была достоверно выше, чем в норме, а уровни антител, напротив, - достоверно ниже

Для того, чтобы оценить, насколько эта тенденция, в действительности, отражает некую закономерность или полученные данные являются всего лишь случайным совпадением, мы провели дополнительные исследования у 81 больной раком молочной железы на различных стадиях наблюдения и лечения, в том числе, при прогрессировании заболевания и высокими уровнями СА 15 3 в сыворотке крови пациенток Диагноз во всех случаях был морфологически верифицирован Продолжительность заболевания на момент исследования составила от 1 мес до 17 лет у 15 (18,5%) больных - свыше 5 лет, у 26 (32,1%) - от 2 до 5 лет, у 13 (16%) -от 1 до 2 лет, у 21 (25,9%) - менее года, у 6 (7,4%) продолжительность заболевания не уточнена У всех этих больных были одновременно изучены как концентрация

МиС1 (СА 15 3) в сыворотке крови, так и антитела к углеводной (Оа1|31-ЗС1сКАс) детерминанте этой молекулы

В анализируемой группе концентрация М11С1 (СА 15 3) находилась в диапазоне 5,70 - 585,2 Ед/мл, среда - 49,39 Ед/мл Уровни анти Ьес (ОД) составили от 0,52 до 3,21 (среди - 1,65) Взаимоотношения между этими двумя показателями характеризовались обратной корреляционной связью (И = - 0,131), которая, однако, не являлась достоверной (р = 0,19)

Нормальные концентрации С А 15 3 в сыворотке крови имели место у 59 пациенток, повышенные - у 22 Сравнение этих 2 групп по уровням анти-Ье° в сыворотке крови выявило интересные закономерности Отмечены достоверно более высокие значения анти-Ьес (ОД) в группе больных с нормальным содержанием СА 15 3, в сравнении с группой больных, у которых уровни маркера были повышены 1,76 ± 0,08 и 1,36 ± 0,1 соответственно, р = 0,004

В группе пациенток с достаточно высокими уровнями анти-Ьес (ОД > 2,0, 25 больных) в сыворотке отмечены значительно более низкие значения маркера СА15 3, чем у больных с низкими и средними значениями анти-Ьес (< 2,0, 56 больных) среднее 29,99 ± 9,3 и 58,05 ±13,1 соответственно Однако в этом случае различия между группами были не достоверны, р = 0,08

Как видно из представленных данных, повышение уровней С А 15 3 в основном ассоциируется с достаточно низким связыванием Ьес сывороткой крови пациенток Наиболее наглядно взаимосвязь между двумя показателями иллюстрирует анализ сопряженности признаков с оценкой достоверности по критерию Хи-квадрат Эти данные представлены в таблице 6

Таблица 6 Взаимосвязь уровней С А 15 3 и анти-Ьес в сыворотке крови

больных раком молочной железы

Уровень С А 15 3 Уровень анти Ьес

Низкий (СЮ<2,0) Высокий (СЮ>=2,0)

Нормальный 37 (66,1%) 22 (88,0%)

Повышен 19 (33,9%) 3 (12,0%)

Всего 56 (100%) 25 (100%)

Хи-квадрат = 4,2, р=0,034

При наличии высоких уровней связывания Ьес сывороткой крови больных лишь в трех случаях (12%) отмечено повышение СА15 3 в сыворотке крови больных Частота случаев повышения маркера в группе сравнения почти в 3 раза выше (34%) Взаимосвязь между признаками высоко достоверна (р=0,034)

Полученные данные хорошо согласуются с классическими данными по гуморальному иммунитету из области инфекционной иммунологии При развитии гуморального иммунного ответа на тот или иной патоген или токсин нарастание титров антител сопровождается снижением уровня антигена в крови за счет клиренса комплексов антиген-антитело При отсутствии выработки антител концентрация антигена в крови может оставаться высокой Нейтрализующей способностью обладают в основном пентамерные антитела ^М-класса. В рассматриваемом случае антигеном является дисахарид (в составе высокомолекулярного гликопротеина), и весьма вероятный сценарий иммунного ответа состоит в продукции ^М

Взаимосвязь наличия антител к Ьес с концентрацией иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови больных раком молочной железы Сопоставили концентрации сывороточных иммуноглобулинов различных классов с уровнями анти-Ьес активности Получены весьма интересные закономерности

Достоверно более высокие сывороточные уровни ^М (331,4±34,9 и 228,3± 25,5, р=0,023) определялись в случаях достаточно высокой связывающей способности Ьес (ОБ>=2,0) сыворотками крови больных раком молочной железы

Достоверно более высокие сывороточные уровни (282,0± 11,5 и 235,8+ 10,0, р=0,007) определялись в случаях достаточно высокой связывающей способности Ьес сыворотками крови больных раком молочной железы

Достоверно более высокие сывороточные уровни 1§А (242,6± 13,2 и 198,3± 9,1, р=0,008) определялись в случаях достаточно высокой связывающей способности Ьес сыворотками крови больных раком молочной железы

Как было отмечено нами ранее, уровни связывания Ьес находились в обратной связи с концентрацией маркера С А 15 3 Отмечена прямая зависимость между анти-Ьес и концентрацией иммуноглобулинов различных классов в сыворотке крови Мы проанализировали концентрации иммуноглобулинов в группах с повышенным и нормальным содержанием СА15 3 Взаимосвязи уровней СА15 3 с концентрацией иммуноглобулинов классов М, в и А не выявлено

Наиболее наглядно взаимосвязь между концентрацией иммуноглобулинов сыворотки и антительной активностью к Ьес демонстрирует анализ сопряженности этих признаков с использованием критерия Хи-квадрат Для проведения этого анализа мы разделили больных на 3 группы в зависимости от концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови сниженная концентрация, нормальная, повышенная концентрация К группе со сниженной концентрацией относили больных, уровни иммуноглобулинов в сыворотке которых были ниже нижнего диапазона нормы на 30 МЕ/мл К группе с повышенной концентрацией относили больных, уровни иммуноглобулинов в сыворотке которых были выше верхнего диапазона нормы на 30 МЕ/мл Нормы лаборатории клинической иммунологии опухолей ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН

Взаимосвязь между уровнями ^М и связыванием анти-Ьес представлена в таблице 7

Таблица 7 Взаимосвязь между уровнями ^М и связыванием анти-Ьес

Уровни связывания анти-Ьес Уровни ^М

Сниженный Нормальный Повышенный

Низкий (00<2,0) 15 (27,3%) 17 (30,9%) 23 (41,8%)

Высокий (00>2,0) 1 (4,0%) 5 (20,0%) 19 (76,0%)

Хи- квадрат = 9,2, р= 0,005

Сниженных уровней в анализируемых больных не отмечено При высоких

00 (> 2) повышение отмечено в 100% случаев, а при более низких значениях СЮ - в 81,8% (р=0,03)

Взаимосвязи с уровнями ^А не отмечено, р=0,08

выводы

1 Высокоаффинные к Lec В-лимфоциты выявляются у 67% больных операбельным раком молочной железы с невысокой частотой (<5% В-клеток)

2 Значительную пропорцию (%%) Ьес-специфичных В-лимфоцитов составляют С05-позитивные клетки, относящиеся к лимфоцитам естественного иммунитета Особенностей субпопуляционного состава Ье'-специфичных В-лимфоцитов не обнаружено

3 Концентрация антител к Lec достоверно более высокая в сыворотках крови здоровых женщин в сравнении с больными операбельным раком молочной железы (средние OD 2,6 и 1,67 соответственно, р=0,001)

4 Уровни антител к Lec взаимосвязаны с концентрацией опухолеассоциированного маркера CAI 5 3 Достоверно более высокие значения анти- Lec наблюдаются при нормальном содержании маркера в сравнении со случаями с повышенным уровнем CAI5 3 (средние OD 1,76 и 1,36 соответственно, р=0,004)

5 Высокая активность (> 2 OD) анти- Lec в сыворотках крови больных раком молочной железы достоверно связана с повышением концентрации иммуноглобулинов крови, в основном IgM-класса (р=0,005)

Список опубликованных работ

1 N.A.Gadetskaya, L Yu Andreeva, N N Tupitsyn Peculiarities of Lec-specific humoral immune response in breast cancer patients //Allergology and immunology in pediatrics Abstracts of the congress "Immune-mediated diseases From theory to therapy Moscow 3-8 October, 2005 -V 6 (Suppl 1) N5 -P 29 (E-ll)

2 Н.А.Гадецкая, Л Ю Андреева, ННТупицын Клеточные показатели специфического гуморального иммунного ответа на антиген Lec у больных раком молочной железы //Аллергология и иммунология в педиатрии Материалы Международного Конгресса «Иммунитет и болезни от теории к терапии -2005 -Т 6 (Приложение 1) -№5 - С 169 (Д5)

3 Е В Артамонова, ЗГКадагидзе, ВПЛетягин, ЛВМанзюк, С А Шинкарев, Н.А.Гадецкая, Н Н Тупицын От теории к практике MUC-1 - новая мишень для терапии злокачественных опухолей //Иммунология гемопоэза -2006 -Т 3 -№1 -С 56-69

4 Е V Artamonova, Z G Kadagidze, A Yu Baryshmkov, V Р Letyagin, L V Manzuk, S A Shinkarev, N.A.Gadetskaya, N N Tupitsyn From theory to practice MUC-1 is a new target for cancer therapy //Haematopoiesis immunology -2006 -V 3 -N2 -PP 46-57

5 Н.А.Гадецкая, Л Ю Гривцова, 3 Г Кадагидзе, В П Летягин, Н Н Тупицын Субпопуляции В-лимфоцитов у больных раком молочной железы Lec -специфичные В-клетки //Маммология -2006 -№2 -С 63-67

Подписано в печать 23 10 2007 г

Печать трафаретная

Заказ № 1072 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Иммунные механизмы противоопухолевой защиты чрезвычайно многообразны. Главными эффекторами, осуществляющими цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток, считаются Т-киллеры (CD8+) и NK-клетки. Т-лимфоциты реализуют свое действие через распознавание посредством TCR (Т-клеточного рецептора) опухолеассоциированных пептидов в контексте молекул HLA на мембране злокачественных клеток. Поскольку иммунизация Т-клеток осуществляется профессиональными АГПС (антигенпрезентирующими клетками), то большое внимание в современных исследованиях уделяется дендритным клеткам и вакцинам на их основе. Реализация цитотоксического действия примированных Т-киллеров возможна только в отношении опухолевых клеток, экспрессирующих молекулы HLA-I класса. Напротив, действие NK-клеток возможно в отношении клеток с видоизмененными или утраченными молекулами HLA.

Т-клетки и NK-клетки не распознают углеводные детерминанты опухолевых клеток. Вместе с тем, значительная часть опухолеассоциированных антигенов - это углеводные (карбогидратные, отсюда аббревиатура С А) антигены. На их определении во многом основаны диагностика и мониторинг опухолевого процесса по сывороточным маркерам (СА 15-3, СА 125, СА 19-9 и т.д.). Углеводные детерминанты опухолевых клеток эффективно распознаются антителами - то есть эффекторами гуморального иммунитета.

В последние годы гуморальный иммунитет не изучался столь интенсивно, как клеточный иммунитет у больных раком молочной железы. Вместе с тем, накоплен большой фактический материал, указывающий на важную роль В-клеточного звена иммунитета у больных раком молочной железы:

1. В-лимфоциты так же, как и Т-лимфоциты инфильтрируют опухолевую ткань и характеризуются функциональной активностью, проявляющейся в формировании фолликулоподобных структур со светлыми центрами.

2. В-клетки, инфильтрирующие ткань молочной железы, олигоклональны, могут иметь специфичность к опухолеассоциированным антигенам.

3. У части больных раком молочной железы отмечается массивная плазмоклеточная инфильтрация опухоли, иммуноглобулины этих клеток олигоклональны, часть клонов специфична к опухолевым антигенам. 4. В эксперименте внутривенное введение небольшого числа раковых клеток иммунным животным не сопровождается развитием опухоли. Эти клетки эффективно элиминируются антителопосредованными иммунными механизмами.

5. При наличии микрометастазов рака молочной железы в костном мозге выявляются кластеры плазматических клеток.

6. Существуют опухолеассоциированные углеводные детерминанты (выявляемые антителами LU-BCRU-G7), экспрессия которых клетками рака молочной железы ассоциирована с неблагоприятным прогнозом. Учитывая их высокую иммуногенность и возможность индукции специфического антительного ответа, эти молекулы могут явиться потенциальными мишенями противоопухолевой иммунотерапии.

Все выше сказанное дает основание для проведения исследований В-клеточного звена иммунитета на современном уровне с учетом углубленного субпопуляционного состава и клональности В-лимфоцитов, а также плазмоцитов крови и костного мозга, оценки наличия специфических антител к опухолеассоциированным детерминантам в сыворотке крови больных.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика показателей В-клеточного звена иммунитета у больных раком молочной железы.

ЗАДАЧИ

1 Охарактеризовать субпопуляции и клональность В-кпеток периферической 1 * крови у больных раком молочной железы. vGal P 1-3 GclNAc в сыворотке крови больных и здоровых доноров. ^/Изучить особенности связывания опухолеассоциированного дисахарида Gal Р 1-3 GclNAc В-клетками у больных раком молочной железы. Сопоставить показатели гуморального иммунитета с клинико-морфологическими характеристиками рака молочной железы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые детально изучены субпопуляции В-лимфоцитов периферической крови больных раком молочной железы. Особенностью иммунофенотипа В-лимфоцитов у больных раком молочной железы в сравнении с донорской группой является более высокая экспрессия антигена CD23. В 67% случаев рака молочной железы среди В-лимфоцитов крови присутствуют высокоаффинные к Le° В-клетки, которые включают 2 популяции - CD5+ и CD5-. Выраженный антительный ответ на Lе° наблюдается у 30% больных раком молочной железы. Высокие титры анти-Lе° антител находятся в реципрокных взаимоотношениях с сывороточными уровнями опухолеассоциированного антигена С А 15-3 и практически не наблюдаются при высоких концентрациях маркера. У больных с высокими титрами анти-Le0 отмечаются повышенные концентрации сывороточного IgM.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Полученные в работе результаты могут иметь практическую значимость как для клинической онкоиммунологии, так и для онкологии.

Значимость для онкоиммунологии определяется тем, что разработан алгоритм для более точной оценки содержания анти-Le0 специфичных В-клеток в периферической крови больных раком молочной железы. Отличием этих клеток от В-лимфоцитов, неспецифически связывающих Le° за счет галектинов, является высокая аффинность и экспрессия антигена CD5.

Результаты работы позволили уточнить роль В-клеточного звена в противоопухолевом иммунитете у больных раком молочной железы. Выделены группы больных с наличием антительного ответа на опухолеассоциированный антиген Gal(31-3GclNAc. Случаи с отсутствием гуморальной иммунной реакции на опухолеассоциированный дисахарид могут рассматриваться как группа больных, подлежащих дальнейшему изучению на предмет возможной иммунизации (вакцинации) или адоптивной терапии соответствующими моноклональными антителами.

ВЫВОДЫ: J Особенности гуморального иммунитета у больных раком молочной железы заключаются в наличии В-лимфоцитов и антител, специфичных к опухоле-ассоциированному дисахариду Lec. £ J^^^At^- $ iff? 7

X) Высокоаффинные к Lec В-лимфоциты выявляются у 67% больных операбельным раком молочной железы с невысокой частотой (<5% В-клеток).

Значительную пропорцию Ьес-специфичных В-лимфоцитов составляют CD5-позитивные клетки, относящиеся к лимфоцитам естественного иммунитета. Особенностей субпопуляционного состава Ьес-специфичных В-лимфоцитов не обнаружено.

Концентрация антител к Lec достоверно более высокая в сыворотках крови здоровых женщин в сравнении с больными операбельным раком молочной железы.

Уровни антител к Lec взаимосвязаны с концентрацией опухоле-ассоциированного маркера СА15.3. Достоверно более высокие значения анти- Lec наблюдаются при нормальном содержании маркера в сравнении со случаями с повышенным уровнем СА15.3 (р=0,004).

Высокая активность анти- Lec в сыворотках крови больных раком молочной железы ассоциируется с повышением концентрации иммуноглобулинов крови, в основном IgM-класса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В настоящей работе нами предпринята попытка изучения особенностей специфического гуморального иммунитета у больных раком молочной железы.

В качестве мишени противоопухолевого иммунитета избран дисахарид Gaip 1-3 GlcNAc (Lec). Данный антиген присутствует в составе высокомолекулярных муцинов MUC1 и не экспрессирован в клетках нормального эпителия молочных желез. При раке молочной железы антиген выявляется в 56,872% случаев. Что особенно важно, экспрессия антигена ассоциируется с неблагоприятным прогнозом при ранних стадиях рака молочной железы. Последнее было подтверждено норвежскими учеными (Rye et al., 1993) и результатами работ российских онкологов при раннем (pTl-2N0M0) раке молочной железы (Шинкарев С.А., 2004).

Дисахарид является иммуногенным, и к нему получены моноклональные антитела LU-BCRU-G3 (Rye et al., 1993).

Мы оценили 2 типа проявлений специфического В-клеточного иммунитета в отношении антигена GaJ(31-3GlcNAc: на уровне В-лимфоцитов и на уровне антител сыворотки крови больных.

Здесь очень важно отметить, что оценка гуморального иммунитета в отношении углеводных детерминант является чрезвычайно сложной задачей. Это обусловлено тем, что помимо специфических антител существует другой класс соединений - лектинов, способных связываться с сахарами. Применительно к исследуемому нами антигену - Gaipi-3GlcNAc, в состав которого входит галактоза, - это лектины, связывающие галактозу, или галектины.

Галектины могут присутствовать как на мембране клеток, так и растворимой форме в сыворотке крови. Их концентрация может возрастать при инфекциях или иной патологии. Наиболее типичным примером является маннозосвязывающий лекгин, продуцируемый, как и С-реактивный белок, гепатоцитами в ответ на провоспалительный цитокин интерлейкин-6 при инфекциях.

Для оценки того, насколько специфичны мембранные рецепторы В-лимфоцитов к дисахариду Galpl-3GlcNAc, а не к галактозе, входящей в его состав, мы провели сравнение связывания с В-лимфоцитами двух флуоресцентно-меченых дисахаридов - Gaipi-3GlcNAc (Lec) и Gaipi-4GlcNAc (лактозамин). Различия между этими дисахаридами касаются лишь связей между галактозой и N-ацетил-глюкозамином: pi-З и pi-4. pjj f ' Как показали наши исследования, представленные в главе 3, наряду со Ф сходством, имеются и существенные различия в связывании этих дисахаридов В-клетками.

Общий процент Ьес-позитивных В-клеток находился в прямой корреляционной связи с пропорцией CD19+CD5+ лимфоцитов, с процентом В-лимфоцитов, связывающих лактозамин, а также с относительным содержанием CD5+ В-лимфоцитов, связывающих Lec. Корреляционные связи между процентным содержанием лимфоцитов, специфичных к Lec и к лактозамину, свидетельствуют о возможном вкладе галектинов во взаимодействие В-лимфоцитов с Gaipi-3GlcNAc (Lec). Вместе с тем, коэффициент корреляции был невысок (0,439), однако, связь между признаками носила достоверный характер (р=0,046).

Нами не установлено взаимосвязи между процентом В-лимфоцитов, связывающих лактозамин, и процентом CD5+ В-лимфоцитов, связывающих Gaipi

3GIcNAc (Lec), R=0,246; p=0,377. Кроме того, не отмечено корреляции относительно содержания CD5+ В-клеток, связывающих лактозамин, с общим процентом Lec -специфичных В-лимфоцитов (R=0,173; р=0,537), а также с процентом Ьес-специфичных CD5+ В-лимфоцитов (R=0,198; р=0,479). Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что связывание лактозамина и Lec за счет галектинов может иметь место только на популяции СБб-негативных Влимфоцитов. Напротив, специфическое связывание L ес мембранными иммуноглобулинами с наибольшей долей вероятности осуществляется CD5позитивными В-клетками. Это чрезвычайно важное наблюдение, которое однозначно указывает на роль CD5+ В-клеток в реализации гуморального иммунного ответа на опухолеассоциированный дисахарид Gaipi-3GlcNAc (Lec).

Данный подкласс В-клеток способен генерировать «естественные» полиреактивные и аутоиммунные антитела IgM-класса. Кроме того, эти клетки

JL/ отвечают на ряд тимус-независимых антигена I класса, например, липополисахарид.

Особое внимание следует уделить наличию выокоаффинных к Lec В-лимфоцитов. Мы выделили эту минорную фракцию В-клеток у 67% больных J ^ттерйбежяЮм- раком молочной железы на основании яркого флуоресцентного 4 свечения. Подобный феномен может быть обусловлен только наличием большого числа антигенсвязывающих структур В-лимфоцитов. Сходное выраженное связывание не было отмечено для лактозамина. То есть, по-видимому, плотность галектинов на мембране В-лимфоцитов невысока и они связывают относительно небольшие количества галактозосодержащих Сахаров. Напротив, специфическое связывание Galpl-3GlcNAc (Lec) за счет мембранных иммуноглобулинов носит высокоаффинный характер, и эти клетки выявляются у большинства больных раком молочной железы, хотя и в минорном количестве. Справедливость того, что связывание большого числа флуоресцентных зондов Gaipi-3GlcNAc (Lec), дающих при проточной цитометрии сильный люминисцентный сигнал, не обусловлена галектинами, подтверждается следующим фактом. Нами не обнаружено корреляции между процентным содержанием лактозамин-связывающих Влимфоцитов и процентом высокоаффинных по отношению к Lec В-клеток (R=0,189; р=0,13), а корреляция этих клеток с CD5+ В-лимфоцитами, взаимодействующими с лактозамином, носила даже отрицательный (недостоверный) характер (R=-0,151).

На основании полученных нами данных были разработаны дифференциально-диагностические критерии разграничения В-лимфоцитов, специфичных к Lec за счет мембранных иммуноглобулинов, и В-лимфоцитов, способных связывать дисахарид за счет галектинов:

Связывание за счет галектинов происходит СБ5-негативными В-лимфоцитами;

Связывание за счет галектинов происходит с низким аффинитетом;

Мембранные иммуноглобулины В-лимфоцитов, специфичные к Gal(31-3GlcNAc (Lec) характеризуются высокой плотностью на мембране и связывают большие количества дисахарида (высокоаффинные В-клетки). Высокоаффинные к Lec В-клетки присутствуют как во фракции CD5+, так и во фракции CD5- В-лимфоцитов.

Истинное представление об относительном содержании Ьес-специфичных В-лимфоцитов может дать общий процент В-клеток, связывающих Lес, за вычетом процента В-лимфоцитов, связывающих лактозамин. Процент лактозамин связывающих В-клеток при наличии высокоаффинных к Lec В-лимфоцитов был существенно ниже, чем процент клеток, связывающих Lec (1,96 и 10,75%), а при отсутствии высокоаффинных В-клеток эти показатели были примерно одинаковыми (2,03 и 2,5%).

Рассмотрим показатели связывания Lec на уровне гуморальных факторов, присутствующих в сыворотках крови больных. Как мы уже отмечали, это связывание может быть обусловлено как антителами, так и галектинами. Для исключения неспецифической составляющей (галектиновой) мы во всех случаях определяли связывание сывороток как с лактозамином, так и с Gal(31-3GlcNAc

Lec). При этом связывание с лактозамином рассматривалось нами как фоновое 9 неспецифическое) и вычиталось из соответствующих показателей OD. (

При проведении этого анализа отмечены чрезвычайно интересные и новые закономерности. Установлено, что уровни антител к Lec достоверно более высокие в сыворотках крови здоровых доноров, чем у больных раком молочной железы. Означает ли это, что при низких титрах антител к дисахариду риск возникновения рака повышен или речь идет об истощении пула анти-Le0 иммуноглобулинов сыворотки за счет их сорбции на опухоли, предстоит уточнить в дальнейших исследованиях. Однако последнее предположение нельзя исключить, так как исследования сывороток проводились на этапе диагностики до операции.

Антигенная детерминанта Le° входит в состав опухолевых муцинов MUC1, уровни которых в сыворотке крови больных раком молочной железы повышены (опухоле-ассоциированый маркер СА 15-3). Сопоставление концентрации СА 15-5 в сыворотке крови с антителами к одной из углеводных детерминант этого муцина, проведенное на большой группе больных раком молочной железы, позволило впервые установить реципрокные взаимоотношения между циркулирующим антигеном и специфическими антителами к нему. Полученные данные хорошо согласуются с классическими данными по гуморальному иммунитету из области инфекционной иммунологии. При развитии гуморального иммунного ответа на тот или иной патоген или токсин нарастание титров антител сопровождается снижением уровня антигена в крови за счет клиренса комплексов антиген-антитело. При отсутствии выработки антител концентрация антигена в крови может оставаться высокой. Нейтрализующей способностью обладают в основном пентамерные антитела IgM-класса. В рассматриваемом случае антигеном является дисахарид (в составе высокомолекулярного гликопротеина), и весьма вероятный сценарий иммунного ответа состоит в продукции IgM.

Специфичность данного феномена подтверждена тем, что концентрация иммуноглобулинов различных классов ни коим образом не коррелировала с уровнями маркера СА 15.3 в сыворотке крови. Вместе с тем, при высоких титрах анти-Le0 антител концентрация иммуноглобулинов была достоверно более высокой. Сочетание этих двух признаков убедительно говорит о том, что высокое связывание Lec отнюдь не является неспецифическим признаком, отражающим общее повышение сывороточных Ig, напротив, можно допустить, что гуморальная