Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Дефицит специфического гуморального иммунитета и его диагностика при LeC-позитивном раке молочной железы.

1

На правах рукописи

V?

УДАЛОВА ЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

Дефицит специфического гуморального иммунитета и его диагностика при Ьес-позитивном раке молочной железы

14.01.12- онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

<->□3492519

Москва 2010

003492519

Работа выполнена в лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО Учрежденн Российской академии медицинских наук Российского Онкологического Научног Центра им. H.H. Блохнна РАМН, лаборатории углеводов института биоорганическо! химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Б.В.Пинегин

доктор медицинских наук, профессор ВЛО.Сельчук

Ведущее учреждение: Российский Государственный Медицинский Университет им. Н.И.Пирогова

Защита диссертации состоится 2010 года в ^ часов на заседании

диссертационного совета (Д.001.017.02) . Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

Н.Н.Тупнцын Н.В. Бовин

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н. Блохина РАМН.

Автореферат разослан » 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор I — ^Л Ю.А.Барсуков

Общая характеристика работы.

Актуальность темы

Рак молочной железы (РМЖ) в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных_заболеваний среди женщин в России, а также в странах Европы и Америке занимает первое место. В России в 2007г. его доля составила 20% . Ежегодно в мире выявляют около 1 млн. новых случаев рака молочной железы, и к 2010 году прогнозируется рост заболеваемости до 1,45 млн. Статистические данные последних лет свидетельствуют о том, что во всех экономически развитых странах отмечается неуклонный рост заболеваемости и увеличение смертности от рака этой локализации, а научным исследованиям по данной проблеме отводится одно из ведущих мест в онкологической науке.

Широкое распространение при раке молочной железы получили молекулярно-биологические исследования, направленные на оценку пролиферативной активности опухолевых клеток (Кд-67), экспрессии рецепторов неблагоприятного прогноза, которые могут служить мишенями для таргетной терапии (Нег2/пеи). Исследуются биологические показатели, которые могут иметь диагностическое и прогностическое значение, служить маркерами лекарственной чувствительности и резистентности. Большой раздел молекулярно-биологических работ посвящен иммунологии рака молочной железы.

Иммунологические исследования в области рака молочной железы ведутся по трем основным направлениям: иммунофенотип опухолевых клеток, противоопухолевый иммунитет, иммунологическое стадирование рака молочной железы - оценка микрометастазов и циркулирующих опухолевых клеток. Исследования в области иммунодиагностики опухолей и противоопухолевого иммунитета в самое последнее время получили новое перспективное продолжение. Оказалось, что опухолеассоциированные гликаны опухолевых клеток являются мишенями естественного (врожденного)

противоопухолевого гуморального иммунитета. Естественные антитела способны вызывать гибель опухолевых клеток путем индукции апоптоза или липоптоза.

В крови здоровых лиц и больных раком молочной железы присутствуют антитела к опухолеассоциированным антигенам углеводной природы (ОАА), таким как ТР, Тп, 81аТп, Ьес и некоторым ганглиозидам.

Один из наиболее перспективных, и в то же время недостаточно изученных углеводных ОАА - это дисахарид Ьес. Он является структурным «кором» нескольких хорошо известных онкомаркеров, таких как СА19-9. Кроме того, моноклональные антитела, специфичные к дисахариду Ьес, показали высокую диагностическую ценность для выявления прогностически неблагоприятных групп рака молочной железы ранних стадий. В ходе совместной работы РОНЦ РАМН и ИБХ РАН при сравнении здоровых лиц с больными раком молочной железы по уровню «естественных» антител к Ьес сделан вывод о пониженном содержании антител у больных, что аналогично ситуации с другим типом антител к ОАА - анти-ТР (Томсена-Фриденрайха). При этом осталось невыясненным, является ли понижение уровня антител ответом на появление опухоли, или врожденно низкое содержание антител способствует опухолевому процессу. В связи с этим, представляет несомненный интерес более детальное изучение тонкой специфичности анти-Ьес антител с помощью современных молекулярных подходов, а также выделение этих антител с помощью аффинного сорбента с последующим изучением их диагностических возможностей.

У больных раком молочной железы уровень естественных антител не только к Ьес, но и к некоторым другим изученным углеводным ОАА отличается от такового для нормальных доноров, таких антигенов насчитывается несколько десятков. Вместе с тем, говорить о протективной роли анти-Ьес антител возможно только в тех случаях, когда опухоли (рак молочной железы) являются Ьес-позитивными. Исследование уровней анти-

Ьес в сопоставлении с анализом экспрессии антигена на опухоли до настоящего времени не проводилось и представляет несомненную актуальность.

Цель исследования Изучить уровень антител к Ьес в сыворотке крови больных раком молочной железы во взаимосвязи с экспрессией антигена на первичной опухоли.

Задачи исследования

1. Оценить уровень антител к Ьес в сыворотке крови больных раком молочной железы.

2. Выделить антитела к Ьес из сыворотки крови здоровых доноров и оценить возможности их использования в иммунофенотипировании рака молочной железы.

3. Изучить экспрессию Ьес на клетках рака молочной железы.

4. Сопоставить показатели экспрессии Ьес на опухолевых клетках с уровнями антител к Ьес в сыворотке крови больных раком молочной железы.

5. Оценить клинические и морфологические характеристики рака молочной железы в группах больных, различающихся по экспрессии Ьес и уровню антител к Ьес.

Научная новизна

Впервые показано, что рак молочной железы характеризуется экспрессией гликана Ьес на опухолевых клетках в большинстве случаев - 58% по данным иммуногистохимии и 72% по данным проточной цитометрии. Установлено, что обнаружение антигена в цитоплазме опухолевых клеток во всех случаях происходит при наличии мембранной экспрессии антигена. Концентрация антител к Ьес в сыворотке крови больных раком молочной железы варьируют в широких пределах: практически полное отсутствие

антител (7,4%), низкие уровни (44,4%), умеренные и высокие уровни (48,2%).

С с

Доказано, что концентрация антител к Le в сыворотке крови и экспрессия Le

на опухолевых клетках имеют обратную взаимосвязь. Нарастание уровней

сывороточных антител к Lec сопровождается достоверным снижением

пропорции иммуногистохимически определяемых антиген-позитивных

опухолевых клеток. Показано, что при отсутствии экспрессии гликана Lec на

клетках рака молочной железы метастазы в регионарные лимфатические узлы

наблюдаются достоверно чаще, чем в антиген-позитивной группе (88% и 51%

соответственно, р = 0,05).

Практическая значимость Показана пригодность человеческих поликлональных антител к Le° для диагностики рака методами иммуногистохимии и проточной цитометрии. Иммуногистохимический метод рекомендуется для диагностики Lec-позитивного рака молочной железы.

Анализ группы из 55 больных раком молочной железы показал, что более чем у трети из них повышенная экспрессия антигена на опухолевых клетках сопровождается низким уровнем соответствующих антител в сыворотке крови. Эти результаты дают основание для научно обоснованной разработки адоптивной иммунотерапии рака молочной железы, основаной на применении антител к Lec.

Апробация работы состоялась 29 января 2010 года на совместной научной конференции с участием лаборатории иммунологии гемопоэза, лаборатории клинической иммунологии опухолей, хирургического отделения опухолей молочных желез, хирургического отделения опухолей женской репродуктивной системы, лаборатории клинической биохимии НИИ Клинической онкологии Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН, лаборатории углеводов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 177 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, 4 глав собственных исследований, обсуждения и заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 48 таблицами и 17 рисунками. Указатель литературы содержит 168 источников, из которых 34 отечественных и 134 зарубежных.1

Материалы и методы

Общая характеристика больных и методы исследования

Материалом настоящей работы послужили результаты исследований опухолевого иммунофенотипа у 55 больных раком молочной железы. Установление диагноза рака молочной железы и лечение пациенток проведено в Российском онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина РАМН в 2007-2009 годах. В нашей работе исследовались женщины в возрасте от 25 до 75 лет. Медиана составила 52 года. Наибольшую группу составили больные в возрасте 40-59 лет (64%).

В исследуемой группе больные с I, IIA, IIB и IIIA стадиями были

представлены в примерно равных пропорциях 19,8-22,3% (рисунок 1).

1 Автор выражает благодарность П.Обуховой и О.Галаниной за помощь в выделении и эпитопной специфичности человеческих антител, Г.Пазаниной и В.Северову (все из ИБХ РАН) за синтез гликанов; А.Филатову (Институт иммунологии РАМН) за биотинилирование антител.

Распределение больных по стадиям заболевания

19,8%

Рисунок 1. Характеристика больных раком молочной железы по стадиям заболевания.

Хирургическому вмешательству различного объема подвергались все больные изучаемой группы. Радикальная резекция выполнена в 17 клинических случаях (30,9%), в остальных - радикальная мастэктомия с сохранением грудных мышц - 36 (65,5%) и радикальная мастэктомия с удалением грудных мышц - 2 (3,6%), рисунок 2.

Распределение больных по типу операций

3,6%

Н Радикальная резекция □ Мастэктомия с сохранением грудных мышц ■ Мастэктомия с удалением грудных мышц

Рисунок 2. Характеристика больных раком молочной железы по типу

оперативного лечения.

Менструальная функция была сохранена у 24 больных (43,6%), в периоде менопаузы - 31 женщина (56,4%), рисунок 3.

Распределение больных по овариально-менструальной функции

■ Менструальная функция сохранена

□ В период менопаузы

Рисунок 3. Характеристика больных раком молочной железы по овариально-менструальной функции.

В правой молочной железе опухоль располагалась у 18 пациенток (32,7%), в левой - у 35 больных (63,7%), в обеих - у 2 (3,6%), рисунок 4.

Сторона поражения

□ Правая молочная железа

К Левая молочная железа

■ Обе молочные железы

Рисунок 4. Распределение больных по локализации опухоли

3,6%

Варианты расположения опухоли в молочной железе представлены на рисунке 5.

Область поражения

5% 4%

И Верхне-наружный квадрант □ Верхне-внутренний квадрант Н Центральный отдел ■ Нижне-наружный квадрант В Нижне-внутренний квадрант

Рисунок 5. Распределение больных по локализации опухоли в молочной

железе.

Данные гистологического исследования хирургически удаленной молочной железы представлены на рисунке 6.

Гистологический тип

□ Инфипьтративный протоковый В Инфильтративный дольковый

Рисунок 6. Гистологическая характеристика опухолей молочных желез

В большинстве клинических случаев - 44 (80,2%) обнаружена II степень злокачественности, реже наблюдалась III степень - у 10 (18%) больных. I степень злокачественности отмечена лишь в 1 (1,8%) случаев, таблица 1.

Таблица 1.

Распределение больных раком молочной железы в зависимости от степени

злокачественности

Степень злокачественности опухоли Количество больных абс. Частота %

I 1 1,8

II 44 80,0

III 10. 18,2

Всего 55 100

Распределение больных в зависимости от рецепторного статуса опухоли

было следующим: у большинства больных опухоли содержали рецепторы

I

эстрогенов и прогестерона (РЭ+РП+) 25 (52,3%). В 13 (29,5%) клинических случаях не обнаружены оба вида рецепторов (РЭ-РП-). Опухоль, положительная по рецепторам эстрогенов и отрицательная по рецепторам прогестерона (РЭ+РП-), обнаружена у 8 (18,2%) больных, рисунок 7.

Эстроген- и прогестеронрецепторный статус

19,1%

□ РЭ+РП+ ЕЭ РЭ-РП- ■ РЭ+РП-

Рисунок 7. Статус рецепторов эстрогенов и прогестерона опухоли

Уровень рецептора Нег2/пеи в первичной опухоли определен также у 47 больных. В 30 (64,4%) случаях опухоль не содержала рецепторов к Нег2/пеи(-), у 10 (21,2%) больных реакция расценена как 1+, у 2 (4,2%) больных - Нег2/пеи(2+), у 5 (10,2%) больных Нег2/пеи(3+), рисунок 8.

Статус Her2/neu

0- 13 1+ □ 2+ ИЗ+

Рисунок 8. Экспрессия рецептора Нег2/пеи при раке молочной железы в анализируемой группе больных.

В работе использованы антитела к антигенам эпителиальных клеток, лейкоцитам и к субпопуляциям лимфоцитов, а также аффинно выделенные из сыворотки крови человека антитела к Lec. Специфичность использованных в работе МКА представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Специфичность использованных МКА \

№ Кластер дифференцировки, название Специфичность

1 KL-I Панцитокератины

2 CD 326 EpCam, BER ЕР4

3 CD45 лейкоциты

4 CD3 Т-клетки

5 CD19 В-клетки

6 Антитела к Lec (пока не кластеризованы) Lec

Примечание: KL-1 J.Brochier (Франция), Ber EP-4, CD326, CD3, CD19 -Becton Dickinson (США). Выделение антител к Lec из сыворотки крови человека подробно описано далее в настоящем разделе. Полиакриламидные конъюгаты углеводов и аффинный сорбент Lec-sepharose получены от фирмы Лектинити (Москва).

Методы исследования.

Определение уровней антител к Lec в сыворотке крови.

Полистирольные иммунопланшеты (MaxiSorp, Nunc, Denmark) сенсибилизировали полиакриламидным гликоконъюгатом, содержащим дисахарид Lec (Lec-PAA, 30 кДа, 20 мол % Lec), и полиакриламидом без углеводного лиганда в качестве отрицательного контроля (РАА), концентрация 10 мкг/мл в натрий-карбонатном буфере (Na2C03/NaHC0> 0.05 М, рН 9.6) в течение ночи (16 часов) при 4°С. Между всеми этапами планшеты промывали четыре раза 0,1 % Твин-20 в фосфатно-солевом буфере (ФСБ: 0.15 М, рН 7.4). Оставшиеся потенциальные места связывания на полистироле блокировали 1 % БСА в ФСБ в течение 40 мин при 37°С. Затем планшеты инкубировали с донорской сывороткой крови в последовательных двукратных разведениях в ФСБ, содержащем 0.3 % БСА, начиная с 1:20 в течение 60 мин при 37°С. Затем в планшеты добавляли меченые пероксидазой хрена антитела козла против IgG, IgM и IgA человека (Southern Biotech, USA) в разведении 1:4000 в ФСБ, содержащем 0.3 % БСА, и инкубировали в течение 60 мин при 37°С. На заключительном этапе планшеты инкубировали с фосфатно-цитратным буфером (0.075 М, рН 5), содержащем 0.04 % о-фенилендиамина и 0.03 % Н202 в течение 20 мин при комнатной температуре. Цветную реакцию останавливали 1 М H2SO4. Оптическую плотность определяли при 492 им на многопараметровом счетчике (Victor2, Perkin Elmer, USA). Каждый эксперимент дублировался.

Выделение естественных анти-Ьес антител из сыворотки крови человека методом аффинной хроматографии.

Сыворотку крови здорового донора II (А) группы (25 мл) инкубировали при 56°С в течение 30 минут для инактивации системы комплемента, охлаждали до комнатной температуры и центрифугировали при 4°С (13 000g). Супернатант разводили 1:1 ФСБ / 0.02 % NaN3 (0.15 М, pH 7.4). Сыворотку наносили на колонку с адсорбентом Lec-sepharose 6 FF (2 мл), уравновешенным ФСБ / 0.02% NaN3, со скоростью потока 80-300 мкл/мин при комнатной температуре. Сыворотку, прошедшую через колонку, собирали для дальнейшего сравнительного анализа с исходной сывороткой методом ИФА. Адсорбент промывали по 15 объёмов колонки сначала ФСБ / 0.02% №N3/ 0.5% Твин-20 под контролем проточного УФ-детектора (Bio-Rad, USA) до исчезновения белков в смыве и затем ФСБ / 0.02 % №N3. Элюцию связавшихся с адсорбентом антител проводили Tris-OH / 0.02 % NaN3 (0.2 М, pH 10.4. Фракции, содержащие антитела, немедленно нейтрализовали буфером Gly-HCl / 0.02% NaN3 (2 М, pH 2.5). Концентрацию антител во фракциях определяли методом поглощения при А, = 280 нм с помощью спекторофотометра. Для расчёта концентрации белка во фракциях принимали следующее соотношение: раствору с концентрацией иммуноглобулинов (для IgG, IgM, IgA) 1 мг/мл соответствует 1.4 оптической единицы.

Специфичность выделенных антител анализировали методом ИФА, используя полиакриламидные гликоконъюгаты. Антитела хранили при +4°С в течение недели, или замораживали при -20°С на длительное хранение.

После элюции антител колонку промывали дистиллированной водой (5 объёмов колонки), затем адсорбент регенерировали 0.1 Н NaOH (5 объёмов колонки) и опять промывали дистиллированной водой (5 объёмов колонки).

Биотинилирование антител.

Готовили раствор аффинно выделенного иммуноглобулина (4 мг/мл) в 100 шМ карбонатном буфере (pH = 8,4). Растворяли 10 мг биотин-N-гидроксисукцинимидного эфира в диметилсульфоксиде. Добавляли к раствору антител раствор биотинового реагента из расчета 80 мкг биотина на 1 мг белка

и инкубировали при комнатной температуре в течение 4 часов. Несвязавшийся биотин отделяли гель-фильтрацией на колонке PD-10, уравновешенной PBS.

Илшуногистохимическое исследование было проведено по стандартной методике (Tupitsyn N.N., Kadagidze Z.G. et al., 1995) на криостатных срезах опухолей с использованием мышиных моноклональных антител к общелейкоцитарному антигену CD45 и панцитокератинам KL-1, а также человеческих антител к Lec, меченых биотином. Перед нанесением человеческих антител неспецифическое связывание блокировали неиммунной кроличьей сывороткой (DakoCytomation, Denmark). Проявление мышиных антител осуществляли с помощью FITC-меченой антисыворотки против иммуноглобулинов мыши (BDB, USA). Проявление взаимодействия человеческих анти-Ьес антител с опухолевыми клетками осуществляли с помощью F1TC- или фикоэритрин (РЕ)-меченого стрептавидина.

Методом трехцветной проточной цитометрии на приборе FACScan оценена мембранная экспрессия Lec на опухолевых клетках и на интратуморальных лимфоцитах. Из фрагмента хирургически удаленной опухоли получали суспензию опухолевых клеток и интратуморальных лимфоцитов с использованием аппарата Medimashin (BDB, USA). Клетки окрашивали флуоресцентно мечеными антителами к общелейкоцитарному антигену CD45-PE/Cy5, общеэпителиальному антигену НЕА-125 или ЕрСАМ-1-РЕ и антителами к Lec. Проявление связывания человеческих антител осуществляли с помощью стрептавидин-FITC. Субпопуляции интратуморальных Т- и B-лимфоцитов, связывающих anti-Lec, изучали с помощью напрямую меченых флуорохромами антител CD3-PE/Cy5 и CD19-PE.

Иммуногистохимическое обнаружение экспрессии антигенов на опухолевых и иммунокомпетентных клетках с помощью МКА.

Непрямая реакция поверхностной иммунофлуоресценции (РИФ) на криостатных срезах.

Замороженные срезы (толщина 4-6 мкм) помещали по три среза на поверхность обезжиренных предметных стекол. Срезы фиксировали в ацетоне при комнатной температуре в течение 4 секунд. Перед окраской антителами срезы фиксировали в течение 10 минут в ацетоне при 4°С. Последующие этапы реакции проводили при комнатной температуре во влажной камере. Инкубировали срезы 10 минут в среде 199, рН 7,2-7,4. МКА наносили на 30 минут. Отмывали в среде 199 10 минут. Наносили FITC-меченые F(ab)2-фрагменты антисыворотки против иммуноглобулинов мыши на 30 минут. Отмывали в среде 199 10 минут. Клетки консервировали 50% глицерином на физиологическом растворе. Срезы накрывали покровным стеклом, и характеризовали антигенположительные клетки и структуры. Специфические реакции учитывали на микроскопе Axioplan-2 (Германия).

Прямая реакция иммунофлуоресценции на криостатных срезах.

Срезы опухолей молочных желез фиксировали в ацетоне, как описано выше. Отмывали в среде 199 в течение 10 минут. Затем наносили FITC-меченые антисыворотки или моноклональные антитела и инкубировали 30 минут. Отмывали в среде 199 в течение 10 минут. Клетки консервировали 50% глицерином на физиологическом растворе и учитывали специфическое свечение на люминисцентном микроскопе.

После реакции иммунофлуоресценции препараты просматривали на люминесцентном микроскопе Axioplan 2 (Германия) при увеличении объектива х40, окуляра хЮ.

Учет реакций.

Иммунофенотипирование опухолевых клеток.

При иммунофенотипировании опухолевых клеток результаты реакций учитывали полуколичественным методом, предложенным- Hammerling et al. (1987). Выделяли три типа взаимодействия антител с опухолевыми клетками:

Отрицательная реакция (-): менее 10% антигенположительных опухолевых клеток.

Мозаичная реакция (+/-): антиген присутствовал на части (от 10% до 80%) опухолевых клеток.

Мономорфная реакция (+): антиген экспрессируется большинством (более 80%) опухолевых клеток.

Статистическая обработка результатов исследования.

Для статистической обработки данных использовался пакет программ SPSS, версия 13. С применением теста Колмогорова-Смирнова проверялась гипотеза о принадлежности выборок к нормальным совокупностям. В случае значимого подтверждения этой гипотезы использовались: тест Стьюдента (при сравнении двух выборок) или дисперсионный анализ (при сравнении большего числа выборок). В противном случае применялись непараметрические тесты: Манна-Уитни (две выборки) или Краскела-Уоллеса (больше двух выборок). Для установления связи между двумя дискретными величинами, в зависимости от их типа и получаемых таблиц сопряженности использовались точный тест Фишера или тест X2 по Пирсону. Для количественной оценки связи между двумя случайными величинами, в зависимости от их типа и нормальности распределения, использовались коэффициенты корреляции по Пирсону или Спирману.

Результаты исследования и обсуждение.

Мы изучили возможность иммуноаффинного выделения антител к Lec из донорской крови, для этого был проведен скрининг сывороток крови здоровых женщин с целью определения уровней антител к Le°.

Из сыворотки крови здоровой женщины-донора с высокими титрами антител к Lec, выделили эти антитела методом аффинной хроматографии.

На рисунке 9 представлена концентрация антител в сыворотке до и после аффинной хроматографии. Антитела элюировали с колонки и метили биотином.

■ РАА

0.01 0.02 0.03 0.04 0.05

1/х, где х - разведение сыворотки

0.00 0.01 0.02 О.Ю 0.04 0.05

1/х, где х - разведение сыворотки

А т Б

Рисунок 9. Выделение поликлональных антител для исследования экспрессии Ьес , А - исходная концентрация антител к Ьес в сыворотке донора. Б - концентрация антител после аффинной хроматографии.

Важно отметить, что, несмотря на различный уровень антител у разных доноров, «спектр» эпитопной специфичности, определенный с помощью ИФА и набора из десяти РАА-гликоконъюгатов (в этот набор вошли родственные Ьес олигосахариды), был практически идентичным у всех проверенных доноров. Поэтому, гистохимический реагент на основе поликлональных антител, выделенный из крови человека, можно считать моноспецифическим, и в дальнейшем надежно воспроизводить.

Определение антител к Ьес в сыворотке крови больных проводили методом ИФА. Экспрессия Ьес на клетках рака молочной железы нами изучена двумя методами - иммунофлуоресцентным окрашиванием свежезамороженных срезов опухолевой ткани и методом трехцветной проточной цитометрии. Антиген обнаружен в 70% случаев рака молочной железы (35 из 50 случаев).

Для оценки возможности изучения экспрессии Ьес на опухолевых клетках нами был использован Ьес-позитивный рак молочной железы. Экспрессия гликана на опухолевых клетках была доказана с использованием

моноклональных антител Ы1-ВС1Ш-С7 (любезно предоставлены Р.Яуе, Норвегия).

При использовании иммуногистохимического метода положительная реакция отмечена в 18 из 31 случая рака молочной железы (58%). Нами были выделены три группы больных: с отсутствием экспрессии Ьес на опухолевых клетках (42%), с мозаичной экспрессией Ьес (19,3%), и с мономорфной экспрессией Ьес (38,7%). В антиген-положительных случаях цитоплазматическая реакция была отчетливой, а однозначно высказаться об экспрессии антигена на мембране опухолевых клеток не представлялось возможным.

Мы оценили взаимосвязь между экспрессией Ьес и уровнями лимфоидной инфильтрации опухоли.

При отсутствии Ьес на опухолевых клетках, а также при его мозаичной экспрессии, слабый, умеренный и выраженный типы инфильтрации опухоли лимфоцитами наблюдались с одинаковой частотой (33%). При мономорфном окрашивании опухолевой ткани антителами к Ьес преобладала незначительная инфильтрация опухоли лимфоцитами (50%). Достоверной взаимосвязи между этими признаками не выявлено, р=0,87.

Так как основной целью работы явилось изучение сывороточных антител к Ьес у больных раком молочной железы, а эти антитела могут

взаимодействовать с опухолевыми клетками только при условии экспрессии

С с

Ье на мембране, то установление именно мембранной экспрессии Ье имело

принципиальное значение. Оценка мембранной экспрессии антигена на

опухолевых клетках была проведена методом многоцветной проточной

цитометрии, поскольку иммуногистохимический метод не позволял сделать

однозначное заключение относительно мембранной экспрессии Ьес в случаях

наличия антигена в цитоплазме опухолевых клеток. Исследование проведено у

29 больных раком молочной железы на материале хирургически удаленной

опухоли.

При выявлении опухолевых клеток в проточно-цитометрических экспериментах нами отдано предпочтение оценке мембранной экспрессии

ЕрСАМ, а не панцитокератинам, которые использовались в , иммуногистохимических исследованиях. Подобный выбор обусловлен тем, что ЕрСАМ экспрессирован на мембране клеток, и для его выявления не требуется разрушения клеточной мембраны. При такой постановке реакции антитела к Ьес не попадают в цитоплазму клеток, а выявляют только мембранный антиген, что и явилось основной целью нашего исследования.

На рисунке 10 представлены принцип метода и мономорфная экспрессия Ьес на опухолевых клетках.

А. Б. В.

Рисунок 10. Выявление мембранной экспрессии Ьес на клетках рака молочной железы методом многоцветной проточной цитометрии. А — гейт лимфоцитов (ось Х- СВ45, ось У - ББС). Б - гейт опухолевых клеток (ось X— СИ45, ось У - СВ32б). В - антиген Ьес мономорфно экспрессирован на опухолевых клетках и отсутствует на лимфоцитах (ось X - окрашивание антисывороткой кЬес, ось У - экспрессия СЭ45).

При оценке мембранной экспрессии Ьес на клетках рака молочной железы методом многоцветной проточной цитометрии, которая была выполнена у 29 больных, у большинства больных - 21 (72,4%) мембранная экспрессия Ьес присутствовала на опухолевых клетках, а у 8 (27,6%) -

20

отсутствовала. Преобладала мономорфная экспрессия антигена (13 случаев), реже отмечен мозаичный тип реакции (8 наблюдений). К случаям с мономорфной экспрессией мы относили таковые при наличии антигена на 70100% клеток, отсутствие антигена констатировали при обнаружении менее 20% 1^ес-позитивных клеток, во всех остальных случаях экспрессия считалась мозаичной. У 8 больных с отсутствием экспрессия Ьес, среднее количество антиген-позитивных клеток составило 5,0% ±2,2%, диапазон от 0% до 15%, также у 8 больных наблюдалась экспрессия Ьес на значительной пропорции клеток, среднее значение - 57,3%±3,9%, диапазон от 38% до 68%, у 13 больных наблюдалась мономорфная экспрессия Ьес, среднее значение 87,5 %±2,2%, диапазон от 73% до 100%.

Выявление в сыворотке крови человека антител к Ьес было выполнено методом ИФА. Нами были выделены три уровня концентрации антител:

1. 0,1< ОБ < 0,2 - низкий (фоновый уровень),

2. 0,3<СЮ<0,5-средний,

3. 0,6 < СЮ < 1,3 — высокий уровень.

У 4 пациентов (7,4%) в сыворотке крови антитела к Ьес отсутствовали , у 24 пациентов (44,4%) пациентов наблюдался средний уровень и у 26 пациентов (48,2%) наблюдался высокий уровень . Раздельно изучили взаимосвязь уровней антител к Ьес с экспрессией Ьес на опухоли, определяемой иммуногистохимически и методом проточной цитометрии.

Установлено существование достоверной взаимосвязи между уровнями антител в крови и экспрессией Ьес на опухолевых клетках (иммуногистохимический метод, р = 0,015). По мере нарастания уровня антител к в сыворотке крови (низкий-средний-высокий), частота

мономорфной экспрессии гликана на опухоли снижалась: 100% - 54% - 19% соответственно, а пропорция отрицательных случаев, напротив, повышалась (рисунок 11). Независимым параметром является уровень антител.

ИМономорфная " реакция

□ Отрицательная реакция

низким среднии высоким Уровень антител к 1_ес

Рисунок 11. Взаимосвязь между уровнем антител к Ьес в сыворотке крови и пропорцией Ьес-позитивных опухолевых клеток, выявляемых иммуногистохимически.

Сопоставление средних уровней антител в зависимости от экспрессии Le '

с '

на опухолевых клетках показало, что при мономорфной экспрессии Le на опухолевых клетках средние уровни антител (OD) достоверно более низкие,) чем при полном или частичном отсутствии антигена на опухоли (р = 0,018),I таблица 3. 1

Таблица 31

Взаимосвязь между уровнем антител в сыворотке крови больных раком

молочной железы и экспрессией Lec на опухолевых клетках ¡

(иммуногистохимия)

Группы Экспрессия Lec на опухоли (иммуногистохимия) Уровень антител к Lec в сыворотке крови

1 Отрицательная (п=13) 0,72±0,08

2 Мозаичная (п=6) 0,7±0,13

3 Мономорфная (п=12) 0,46±0,06

Экспрессия Lec на опухоли, выявляемая проточно-цитометрическим методом, не была достоверно взаимосвязана (р=0,927) с уровнями

сывороточных антител к Ьес (рисунок 12), что, по-видимому, обусловлено большей чувствительностью метода проточной цитометрии в сравнении с иммуногистохимией. Это подтверждено при одновременном использовании двух методов: при отрицательной или слабой экспрессии Ьес в иммуногистохимии (13% случаев) проточно-цитометрически антитела обнаружены на мембране опухолевых клеток.

В Мономорфная реакция

□ Отрицательная реакция

низкий средний высокий Уровень антител к 1_ес

Рисунок 12. Связь между уровнями антител в сыворотке крови и экспрессией Ьес на опухолевых клетках, выявляемой методом проточной цитометрии.

При изучении взаимосвязи экспрессии Ье на опухолевых клетках и уровней антител к Ьес в сыворотке крови пациенток нами были выделены четыре группы больных. Первая группа - экспрессия Ьес на опухолевых клетках и наличие антител к Ьес в сыворотке крови - к ней относятся 17 больных (34%), вторая группа - отсутствие экспрессии Ьес на опухолевых клетках и низкие уровни антител к Ьес в сыворотке крови - 6 больных (12%), третья группа - отсутствие Ьес на опухолевых клетках и наличие антител к Ьес в сыворотке крови больных - 9 (18%). Эти исследования позволяют выделить наиболее важную для нас четвертую группу пациенток - с экспрессией Ьес на

опухолевых клетках и низким уровнем антител к Ьес в сыворотке крови (частота по данным иммуногистохимии была примерно одинаковой - 35-36%), рисунок 13. В данной группе целесообразно, на наш взгляд, изучение возможностей адоптивной терапии для восполнения дефицита антител к Ьес, что может быть действенным в профилактике развития отдаленных метастазов у больных.

Распределение по группам Распределение по группам

во всем исследовании при иммуногистохимии

0 I группа ■ II фуппа □ III группа В IV группа 0 | группа ■ II группа О III группа Н IV группа

Рисунок 13. Распределение больных с различной экспрессией Ьес на

£

опухолевых клетках в сопоставлении с уровнями антител к Ье .

Нами была изучена взаимосвязь экспрессии Ьес на опухолевых клетках с морфологическими и клиническими характеристиками опухоли.

Оценивались морфологические характеристики опухоли и ее рецепторный статус, в том числе: гистологический тип опухоли, степень злокачественности, размер рТ, рецепторы эстрогенов, прогестерона, Нег2/пеи. В числе клинических характеристик опухоли были изучены: возраст больных, менструальная функция, критерии Т, N. М по классификации "ШМ, локализация опухолевого процесса в молочной железе, характер выполненного оперативного лечения.

Существенной связи между экспрессией Ьес на опухолевых клетках с большинством клинических признаков мы не наблюдали. Вместе с тем, достоверная связь экспрессии Ьес на опухолевых клетках отмечена с такой

важнейшей характеристикой опухолевого процесса, как поражение регионарных лимфатических узлов. В случаях отсутствия Ьес на опухолевых клетках, достоверно чаще выявлялись метастазы в регионарные лимфатические узлы (рисунок 14).

р = 0,05

Экспрессия Ье

Рисунок 18. Связь экспрессии Ье с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы При использовании иммуногистохимического метода, экспрессия Ьес достоверно чаще отмечена при инфильтративном дольковом раке, рисунок 15.

5

О О

о а с о

га н о ь и га У

Инфильративный Инфильративный дольковый рак протоковый рак

Рисунок 15. Частота экспрессии Ьес (иммуногистохимический метод) при гистологических вариантах рака молочной железы.

Сопоставление уровней антител к Ьес проведено с теми же клиническими и морфологическими характеристиками, что и для экспрессии гликана на опухоли.

Из числа проанализированных признаков только возраст больных был связан с уровнями антител к Ьес в сыворотке крови. При практически полном отсутствии антител средний возраст больных был достоверно более высоким. Возможно, именно с этим связано то, что при отсутствии антител все больные были в менопаузе. Однако эти признаки достоверно не взаимосвязаны, рисунок 16.

0,047

40

п £

низким средним высокий Уровень антител к ЬеС

100

100

Р = 0,17

низким средним высоким Уровень антител к 1_еС

Рисунок 16. Связь уровня антител к Ьес с возрастом больных и их менструальной функцией.

Таким образом, экспрессия Ье наблюдается на опухолевых клетках у большинства больных раком молочной железы и повышается по мере снижения уровня антител к Ьес. Анализ взаимосвязи между этими признаками позволяет выделить группу пациентов (35% больных раком молочной железы)

с низким уровнем антител в сыворотке крови и экспрессией Ьес на опухоли. На наш взгляд эти больные могут быть кандидатами для адоптивной иммунотерапии специфическими антителами к Ьес.

ВЫВОДЫ

с

1. Рак молочной железы характеризуется экспрессией гликана Ье на опухолевых клетках: 58% случаев по данным иммуногистохимии, и 72% - по данным проточной цитометрии.

2. Антиген Ьес присутствует как в цитоплазме опухолевых клеток, так и в составе клеточной мембраны.

3. Уровень сывороточных антител к Ьсс достоверно обратно пропорционален доле антиген-позитивных опухолевых клеток, выявленных иммуногистохимически, р = 0,015. Независимым параметром является уровень антител.

4. Антиген Ьес иммуногистохимически обнаруживается на опухолевых клетках достоверно чаще при инфильтративном дольковом раке (80,0%) в сравнении с инфильтративным протоковым раком (53,8%), р = 0,043.

5. При отсутствии экспрессии гликана Ьес на клетках рака молочной железы метастазы в регионарные лимфатические узлы наблюдаются достоверно чаще, чем в антиген-позитивной группе (88% и 51% соответственно, р = 0,05).

6. Уровень антител к Ьес в сыворотке крови больных раком молочной железы не взаимосвязан с морфологическими и клиническими характеристиками опухолевого процесса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Я.А.Удалова, Н.В.Бовин, П.Обухова Н.В Шилова, А.М.Ковригина, В.В.Тимошенко, О.Е.Галанина, З.Г.Кадагидзе, В.П.Летягин, Н.Н.Тупицын. Мембранная экспрессия Lec на клетках рака молочной железы. Опухоли женской репродуктивной системы 2009, №3-4, с.43-48.

2. N.Tupitsyn, N.Bovin, Ya.Udalova. Relationship of tumor Lewis С expression and serum anti- Lewis С in breast cancer patients. AFC 1 ESCCA 2009, POS-CF-13,p.79

3. Y.Udalova, N.Bovin, O.Galanina, Z.Kadagidze, N.Tupitsyn. Tumor Lewis С expression and serum antibodies to Lewis С in breast cancer patients. ICACT 21-st International congress on anti-cancer treatment. Paris, France, Palais des Congres, 1а-5л February 2010, CF-13, p. 193-194

4. Y.A. Udalova, N.N. Tupitsyn, N.V. Bovin, Z.G. Kadagidze, O.E. Galanina, N.B. Borovkova, V.V. Podolsky, S.A. Shinkarev, N.A. Gadetskaya, V.P. Letyagin, A.A. Subbotina. Tumor-associated glycan Lewis С in breast cancer. Haematopoiesis Immunology, 2009, Vol.6, №2, P.45-54.

Подписано в печать 8.02.2010. Формат 60X84/16. Бумага офисная «Зуе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 119. Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Рак молочной железы (РМЖ) в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных заболеваний среди женщин в России, а также в странах Европы и Америке занимает первое место. В России в 2007г. его доля составила 20% (Давыдов М.И., Аксель Е.М. 2009). Ежегодно в мире выявляют около 1 млн. новых случаев рака молочной железы, и к 2010 году ученые прогнозируют рост заболеваемости до 1,45 млн. (Parkin D., Pisani P., 1999). Статистические данные последних лет свидетельствуют о том, что во всех экономически развитых странах отмечается неуклонный рост заболеваемости и увеличение смертности от рака этой локализации, а научным исследованиям по данной проблеме отводится одно из ведущих мест в онкологической науке.

Широкое распространение при раке молочной железы получили молекулярно-биологические исследования, направленные на оценку пролиферативной активности опухолевых клеток (Ki-67), экспрессии рецепторов неблагоприятного прогноза, которые могут служить мишенями для таргетной терапии (Her2/neu). Исследуются биологические показатели, которые могут иметь диагностическое и прогностическое значение, служить маркерами лекарственной чувствительности и резистентности. Большой раздел молекулярно-биологических работ посвящен иммунологии рака молочной железы.

Иммунологические исследования в области рака молочной железы ведутся по трем основным направлениям: иммунофенотип опухолевых клеток, противоопухолевый иммунитет, иммунологическое стадирование рака молочной железы - оценка микрометастазов и циркулирующих опухолевых клеток (Н.Н.Тупицын, 2005; Артамонова Е.В. и соавт., 2005; Бжадуг О.Б. и соавт., 2008; Крохина О.В. и соавт., 2008). Эти исследования в последние годы стали одним из приоритетных направлений в структуре научных изысканий.

Исследования в области иммунодиагностики опухолей и противоопухолевого иммунитета в самое последнее время получили новое интересное и перспективное продолжение. Оказалось, что опухолеассоциированные (часто их называют «опухолеспецифическими») гликаны опухолевых клеток являются мишенями естественного (врожденного) противоопухолевого гуморального иммунитета. Естественные антитела способны вызывать гибель опухолевых клеток путем индукции апоптоза или липоптоза.

В крови здоровых лиц и больных раком молочной железы присутствуют антитела к опухолеассоциированным антигенам углеводной природы (ОАА), таким как TF, Tn, SiaTn, Le° и некоторым ганглиозидам.

Один из наиболее перспективных, и в то же время недостаточно л изученных углеводных ОАА - это дисахарид Le . Он является структурным «кором» нескольких хорошо известных онкомаркеров, таких как СА19-9. Кроме того, моноклональные антитела, специфичные к дисахариду Le , показали высокую диагностическую ценность для выявления прогностически неблагоприятных групп рака молочной железы ранних стадий (Шинкарев С.А., 2004). В ходе совместной работы РОНЦ РАМН и ИБХ РАН при сравнении здоровых лиц с больными раком молочной железы по уровню «естественных» антител к Lec (Тупицын Н.Н., и соавт., 2009) сделан вывод о пониженном содержании антител у больных, что аналогично ситуации с другим типом антител к ОАА - анти-TF (Томсена-Фриденрайха). При этом осталось невыясненным, является ли понижение уровня антител ответом на появление опухоли, или врожденно низкое содержание антител способствует опухолевому процессу. В связи с этим, представляет несомненный интерес более детальное изучение тонкой специфичности анти-Le антител с помощью современных молекулярных подходов, а также выделение этих антител с помощью аффинного сорбента с последующим изучением их диагностических возможностей.

У больных раком молочной железы уровень естественных антител не л только к Le , но и к некоторым другим изученным углеводным ОАА отличается от такового для нормальных доноров, таких антигенов насчитывается несколько десятков (Huflejt М. et al., 2009). Вместе с тем, говорить о протективной роли анти-Le0 антител возможно только в тех случаях, когда опухоли (рак молочной железы) являются Le -позитивными. Исследование уровней анти-Le в сопоставлении с анализом экспрессии антигена на опухоли до настоящего времени не проводилось и представляет несомненную актуальность.

Цель исследования

Изучить уровень антител к Le в сыворотке крови больных раком молочной железы во взаимосвязи с экспрессией антигена на первичной опухоли.

Задачи исследования

1. Оценить уровень антител к Le в сыворотке крови больных раком молочной железы.

2. Выделить антитела к Lec из сыворотки крови здоровых доноров с помощью аффинной хроматографии, оценить возможности использования этих антител в иммунофенотипировании рака молочной железы. л

3. Оценить экспрессию Le на клетках рака молочной железы методами иммуногистохимии и проточной цитометрии.

4. Сопоставить показатели экспрессии Lec на опухолевых клетках с уровнями антител к Lec в сыворотке крови больных раком молочной железы.

5. Оценить клинические и морфологические характеристики рака молочной железы в группах больных, различающихся по экспрессии Lec и уровню антител к Lec.

Научная новизна

Впервые показано, что рак молочной железы характеризуется л экспрессией гликана Le на опухолевых клетках в большинстве случаев — 58% по данным иммуногистохимии и 72% по данным проточной цитометрии. Установлено, что обнаружение антигена в цитоплазме опухолевых клеток во всех случаях происходит при наличии мембранной экспрессии антигена. Концентрация антител к Lec в сыворотке крови больных раком молочной железы варьируют в широких пределах: практически полное отсутствие антител (7,4%), низкие уровни (44,4%), умеренные и высокие уровни (48,2%). Доказано, что концентрация антител к Lec в сыворотке крови и экспрессия Lec на опухолевых клетках имеют обратную взаимосвязь. Нарастание уровней сывороточных антител к Le сопровождается достоверным снижением пропорции иммуногистохимически определяемых антиген-позитивных опухолевых клеток. Показано, что при отсутствии экспрессии гликана Lec на клетках рака молочной железы метастазы в регионарные лимфатические узлы наблюдаются достоверно чаще, чем в антиген-позитивной группе (88% и 51% соответственно, р = 0,05).

Практическая значимость

Показана пригодность человеческих поликлональных антител к Le для диагностики рака методами иммуногистохимии и проточной цитометрии. Иммуногисгохимический метод рекомендуется для диагностики Ьес-позитивного рака молочной железы.

Анализ группы из 55 больных раком молочной железы показал, что более чем у трети из них повышенная экспрессия антигена на опухолевых клетках сопровождается низким уровнем соответствующих антител в сыворотке крови. Эти результаты дают основание для научно обоснованной разработки адоптивной иммунотерапии рака молочной железы, основаной на применении антител к Le .

ВЫВОДЫ

1. Рак молочной железы характеризуется экспрессией гликана Le на опухолевых клетках: 58% случаев по данным иммуногистохимии и

72% - по данным проточной цитометрии.

2. Антиген Le присутствует как в цитоплазме опухолевых клеток, так и в составе клеточной мембраны.

3. Уровень сывороточных антител к Le достоверно обратно пропорционален доле антиген-позитивных опухолевых клеток, выявленных иммуногистохимически, р = 0,015. Независимым параметром является уровень антител.

4. Антиген Lec иммуногистохимически обнаруживается на опухолевых клетках достоверно чаще при инфильтративном дольковом раке (80,0%) в сравнении с инфильтративным протоковым раком (53,8%), р = 0,043.

5. При отсутствии экспрессии гликана Le на клетках рака молочной железы метастазы в регионарные лимфатические узлы наблюдаются достоверно чаще, чем в антиген-позитивной группе (88% и 51% соответственно, р = 0,05).

6. Уровень антител к Lec в сыворотке крови больных раком молочной железы не взаимосвязан с морфологическими и клиническими характеристиками опухолевого процесса.

ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования в области иммунологии рака - это поистине кладезь дерзких идей, надежд, казалось бы, близкой победы иммунологии над раком и горьких разочарований с отсутствием какой бы то ни было перспективы в обозримом будущем.

Последние годы вновь вселяют в нас надежду, и мы готовы с новой силой и вдохновением проверить очередную идею, и, кажется, вновь природа слегка приоткрыла завесу таинственности, и близится понимание того, как же организм осуществляет противоопухолевый надзор.

Ветер надежды подул со стороны гуморального иммунитета. И, как бы оправданием перед ним за долгие годы забвения, звучат названия статей в зарубежных научных журналах: «естественные IgM антитела . от отверженных до парвеню», «сиротские молекулы в иммунном надзоре», «игнорируемые средства самозащиты в иммунном надзоре», «лучшие средства противоракового иммунного надзора - воскрешение человеческих моноклональных IgM антител» (Vollmers Н.Р. & Brandlein S., 2006; Brandlein S. & Vollmers H.P., 2004).

Дело в том, что в последние годы доказана способность естественных моноклональных IgM-антител, направленных к углеводным опухолеспецифическим антигенам, убивать раковые клетки путем индукции апоптоза или липоптоза. Таким образом, открываются перспективы разработки новых методов иммунотерапии рака, основанные на коррекции дефицита гуморального иммунитета с учетом профиля экспрессии опухоле-специфических гликанов на злокачественных клетках.

Именно базисным принципам этого перспективного направления исследований посвящена данная диссертационная работа. Мы поставили перед собой задачу охарактеризовать экспрессию опухолеассоциированного гликана Lec на опухолевых клетках и оценить уровни естественных антител к нему в сыворотке крови больных раком молочной железы.

Естественные антитела - это одна из систем врожденного иммунитета.

Эти антитела обычно являются 10-тивалентными пентамерами IgM-класса. Они способны реагировать со всеми (или с большинством) патогенов, с которыми данный вид встречался в ходе эволюции и, следовательно, индивид имеет высокую вероятность встречи. Так осуществляется феномен эволюционной иммунологической памяти. Уровни естественных IgM антител не возрастают при иммунизации. Они продуцируются особой субпопуляцией В-лимфоцитов (В 1-клетками), экспрессирующими на мембране молекулу CD5. Данный тип клеток у взрослых составляет примерно 10% от числа В-лимфоцитов, а у новорожденных и плода является доминирующим. Как правило, естественные IgM антитела направлены к углеводным детерминантам.

Наиболее типичный и всем хорошо известный пример естественных антител - агглютинины - антитела к антигенам групп крови А и В, различающимся всего по одному сахару.

Это обычные антитела, субъединицы которых, как и все иммуноглобулины, кодируются тремя (VJC — легкие цепи) или четырьмя (VDJC - тяжелые цепи) генными сегментами.

Разумеется, набор специфичностей естественных IgM антител значительно уже (точного количества рецепторов никто не знает, менее 100 ООО), чем таковой для обычных иммуноглобулинов, так как в этом случае используется ограниченный репертуар VH и VL-генов иммуноглобулинов. ? Чрезвычайно сложно было доказать, что именно естественные IgM антитела способны уничтожать опухолевые клетки. Для этого потребовались 1 знания не только молекул-мишеней, но и особенностей генетического наследования, клеток-продуцентов и т.д. Поэтому условно можно выделить 2

1 j этапа в развитии данного вопроса. Ранние исследования доказали роль сывороточных факторов, антител, антител IgM-класса. Но точные доказательства были получены с использованием триомной гибридомной технологии для получения человеческих IgM антител против антигенов раковых клеток. Моноклональные антитела IgM класса в этом случае получают путем слияния клеток селезенки больных раком желудка с человеческой миеломой. Получено уже множество антител, которые реагируют с опухолеспецифическими антигенами (терминология авторов) и не реагируют с нормальными тканями (Brandlein S., Pohle Т. et al.2003). Следует признать, однако, что ряд описанных авторами антигенов являются онкофетальными. Пионерами в данной области являются немецкие исследователи из Вюрцбурга.

Доказательствами принадлежности к естественным антителам является использование ими ограниченного репертуара VH-областей генов Ig, характерного для естественных IgM антител, продуцируемых CD5+ В-клетками, а также практически полное отсутствие соматических гипермутаций. Продукция этих антител осуществляется CD5+ В-лимфоцитами селезенки. Все естественные моноклональные антитела к опухолеспецифичным гликанам индуцировали апоптоз опухолевых клеток, причем в ходе исследований была установлена новая опухолеспецифичная форма апоптоза - липоптоз (Pohle Т. et al., 2004). Это клеточная смерть, обусловленная накоплением липидов в цитоплазме опухолевых клеток под действием моноклональных IgM антител.

Все известные на сегодняшний день естественные моноклональные антитела реагировали с углеводной порцией гликопротеинов, подчас хорошо известных, таких как фактор, ускоряющий свертывание и препятствующий комплемент-зависимому лизису клеток DAF-CD55, рецептор для фактора роста фибробластов CFR, белок теплового шока GRP78. Однако еще раз подчеркнем, что углеводная детерминанта, распознаваемая IgM антителами, в нормальных тканях не встречалась. Справедливости ради следует отметить, что точная специфичность антител, т.е. те сахара, которые ими определяются, в работах не была установлена. Спектр реактивности - от узкого (например, только рак желудка) до широкого, включая рак толстой кишки, молочной железы и т.д.

Используя для гибридизации клетки селезенки здоровых лиц, также возможно получение опухолеспецифических естественных IgM антител. То есть, клетки-продуценты естественных противоопухолевых антител присутствуют и у здоровых лиц, а не только у онкологических больных.

Работы по изучению опухолеспецифичных гликанов раковых клеток и антител к ним проводятся и в России - институте биоорганической химии РАН и Онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина РАМН. Предметом совместных исследований ИБХ и РОНЦ является в первую с очередь опухолеспецифичный гликан Le . С середины 90-х годов использовались моноклональные антитела LU-BCRU-G7 IgM класса, предоставленные P.Rye (Норвегия). Антитела распознавали углеводную детерминанту в составе высокомолекулярного гликопротеина 230 кДа, выделенного из клеток рака молочной железы.

В 1995 году профессором Н.В.Бовиным и сотрудницей его лаборатории Екатериной Власовой была установлена точная специфичность антител G7 - дисахарид галактозил бета1-3 N-ацетил гликозамин. Другие названия этого дисахарида - антиген Льюис С или изолактозамин. Это углеводная структура в составе ряда муцинов, в том числе, и MUC-1. Детерминанта Gaipi-3GlcNAc является концевым сахаром MUC-1 женского молока. Данная структура не обнаруживается в молочной железе в норме, она отсутствует при доброкачественных пролиферативных процессах и выявляется только при раке молочной железы.

В широком смысле дисахарид галактозид (31-3 N-ацетилгликозамин является предшественником 1-го типа антигена Н — основной структурной единицы групп крови АВО и Льюис а, Ь. По данным P. Rye & R.A.Walker (1993) при ранних стадиях (N0) рака молочной железы обнаружение антигена ассоциируется с достоверным ухудшением показателей безрецидивной выживаемости. Появление антигена на клетках рака молочной железы ранних стадий является достаточно частым и ассоциируется с более агрессивным течением этих опухолей.

Этот факт был подтвержден в работе С.А.Шинкарева (2003 г) на материале 89 случаев рака молочной железы ранних стадий pTi.2NoM0. Частота экспрессии Le у этих больных составила 57%. Антиген почти вдвое чаще обнаруживался при опухолях более крупного размера (более 3 см). Уникальной особенностью Le - позитивного рака молочной железы явился тропизм к ткани легкого в случаях гематогенных метастазов. Отмечено ухудшение прогноза в Le - позитивной группе больных раком молочной железы, которое носило достоверный характер при III степени злокачественности, умеренной и выраженной лимфоидной инфильтрации опухоли.

Таким образом, экспрессия анализируемого дисахарида ассоциируется с признаками менее благоприятного прогноза при раке молочной железы ранних стадий (pTi.2N0M0). Одной из причин неблагоприятного прогноза опухолей в случаях экспрессии углеводных опухоле-ассоциированных антигенов, широко обсуждаемых в литературе (помимо биологических свойств самих раковых клеток), является отсутствие или низкие показатели врожденного гуморального ответа, способного элиминировать трансформированные клетки. Доказать протективную роль естественных IgM антител в отношении возникновения или контроля роста опухолей чрезвычайно сложно. В крови здоровых лиц и больных раком молочной железы присутствуют антитела к опухолессоциированным антигенам углеводной природы (ОАА), таким как TF, Tn, SiaTn, Lec и некоторым ганглиозидам.

Одна из точек зрения состоит в том, что имеет место некий специфический иммунодефицит в естественных IgM антителах. В этом случае, как и вообще при В-клеточных иммунодефицитах, в группе риска возникновения опухоли уровни соответствующих специфических антител должны быть низкими.

На сегодняшний день отсутствуют стандартизованные подходы для определения концентрации антител к моно- и олигосахаридам в сыворотке крови человека. Подобный метод был разработан и апробирован в лаборатории профессора Н.В.Бовина. Проведено сравнение уровней анти-Le у больных операбельным раком молочной железы при диагностике и в донорской группе. Эти исследования показали, что достоверно (р = 0,001) л» более высокие уровни антител к Le присутствуют у здоровых женщин в сравнении с больными раком молочной железы (Тупицын Н.Н. и соавт., 2009). Сделан вывод о пониженном содержании антител у больных, что аналогично ситуации с другим типом антител к ОАА - анти-TF (Томсена-Фриденрайха).

Однако у некоторых женщин донорской группы концентрации анти-Le были очень низкими. Эти данные не исключают возможностей формирования группы риска заболевания раком молочной железы (или точнее - Льюис С-позитивным, прогностически неблагоприятным раком молочной железы).

Существует и другая возможная причина, объясняющая более низкие уровни антител у больных раком - это истощение сывороточного пула естественных антител за счет их сорбции на опухолевой ткани. В этом случае при нарастании опухолевой массы уровни антител будут снижаться, а в ремиссии, в послеоперационном периоде, напротив, повышаться.

Косвенным отражением опухолевой массы при раке молочной железы является концентрация маркера СА 15.3 в сыворотке крови больных. СА15.3 - это молекула MUC-1. У 111 больных раком молочной железы на различных этапах диагностики и лечения параллельно изучены маркер СА15.3 и антитела к одной из углеводных детерминант молекулы MUC-1 дисахариду Lec. Два этих показателя находились в отрицательной корреляционной связи. При разделении больных на группы с повышенными и нормальными уровнями СА15.3, и с высокими и низкими уровнями антител, два анализируемых признака были достоверно сопряженными: у больных с высокими тирами антител были, как правило, низкие уровни маркера и, наоборот, при высоких уровнях антител повышение маркера было лишь в 12% случаев, в 3 раза реже, чем в группе с низкими значениями OD (р = 0,034).

Концентрация антител была достоверно ниже у больных с высокими уровнями маркера в сыворотке. Отмечены достоверно более высокие значения анти-Ьес в группе больных с нормальным содержанием СА 15.3, в сравнении с группой больных, у которых уровни маркера были повышены, р = 0,004 (Тупицын Н.Н. и соавт., 2009). Эти данные хорошо соотносятся с данными литературы, в которых показаны реципрокные взаимоотношения между концентрацией MUC-1 и антител к нему. Сходную динамику демонстрируют антитела к углеводным эпитопам MUC1: TF, Тп и aGal (Kurtenkov 2005, 2007). л

Да, у больных раком молочной железы уровни антител к Le ниже, чем у здоровых женщин и находятся в реципрокных взаимоотношениях с концентрацией маркера СА 15.3. Однако, для подтверждения того, что это именно естественные антитела, необходимо доказать наличие специфического В-клеточного рецептора на В1-клетках, то есть на CD5-позитивных В-лимфоцитах. Для проверки этой гипотезы в лаборатории профессора Бовина были синтезированы конъюгаты дисахарида с полиакриламидом, меченными флуоресцеин-изотиоцитанатом (FITC). В качестве контроля неспецифического связывания использовали меченый лактозамин. Эти реактивы использовали для изучения специфичных лимфоцитов у больных раком молочной железы. Разумеется, эти эксперименты чрезвычайно сложны, так как требуют изучения минорных субпопуляций В-лимфоцитов в тройной флуоресцентной метке. Использование FITC-меченого дисахарида позволило выявить субпопуляции п лимфоцитов, экспрессирующих В-клеточный рецептор, специфичный к Le , у 67% больных раком молочной железы. Субпопуляция В-лимфоцитов, связывающих дисахарид, является минорной (в районе процента) и включает значительную пропорцию С05-позитивных клеток, то есть относится к клеткам-продуцентам естественных антител. л

Следует отметить, что связывание FITC-конъюгата Le CD5 лимфоцитами крови и обратные взаимоотношения между концентрацией MUC-1 и анти-Le у больных раком молочной железы установлены российскими учеными впервые и в зарубежной и отечественной литературе не описаны. Они дают дополнительную информацию к пониманию продукции естественных антител В-клетками и дальнейшему изучению диагностической роли aHTH-Lec антител.

В литературе обсуждается возможность использования естественных антител как разновидности адоптивной терапии при эпителиальных опухолях. Ранние исследования базировались на использовании сывороток и препаратов иммуноглобулинов, обогащенных естественными антителами, причем точная специфичность антител (углеводная детерминанта) не была установлена. В Германии проведена II фаза клинических испытаний естественных человеческих моноклональных антител IgM класса SC-1 у 20 больных низкодифференцированной аденокарциномой желудка в качестве неоадъювантной терапии (Vollmers et al., 2007). Показана их эффективность (сокращение размера опухоли, индукция апоптоза) и отсутствие токсичности (отсутствие повреждающего влияния на нормальные ткани и на клетки иммунной системы).

Разумеется, использование естественных антител, реагирующих в 100% случаев того или иного вида опухоли (например, SC-1 при аденокарциноме желудка) не требует прескрининга опухолей на предмет экспрессии антигена.

Иная ситуация с антителами к Le , которые определяют антиген не во всех случаях рака молочной железы. В этих случаях необходимо исследовать как сывороточные уровни антител, так и экспрессию антигена на опухоли. При высоких титрах антител использование анти-Le в качестве адоптивной иммунотерапии, вряд ли показано. У больных с отсутствием сывороточных антител возможны 2 ситуации - опухоль антиген-негативна, опухоль антиген-позитивна. Именно в последнем случае целесообразно использование антител. По этой причине совершенно необходимо проводить скрининг опухолей на предмет мембранной экспрессии Lec.

Этому направлению работы была посвящена настоящая диссертация. Мы сочли, что наиболее точное представление о взаимодействии антител к Lec с данным гликаном на опухолевых клетках может быть получено при использовании человеческих антител. По этой причине из сыворотки крови здоровой женщины-донора с высокими титрами антител к Lec, эти антитела были выделены методом аффинной хроматографии, помечены биотином и использованы для оценки экспрессии антигена на клетках рака молочной железы методами проточной цитометрии и иммуногистохимии. Получены р биотинилированные поликлональные антитела человека, специфичные к Le . Реагент характеризовался как моноспецифичный к Le при реакции с серией РАА-гликоконъюгатов. Взаимодействие человеческих антител к Le с клетками Lec-no3HTiiBHoro рака молочной железы полностью отменялось предварительной обработкой опухоли мышиными моноклональными антителами к

Le LU-BCRU-G7. Доказана пригодность поликлональныех р человеческих антител для диагностики Le -позитивного рака молочной железы методами иммуногистохимии и проточной цитометрии.

Как и предполагалось, антиген отсутствует на лимфоцитах (тройная флуоресцентная метка) и экспрессирован в значительной части случаев рака молочной железы. Минорная популяция лимфоцитов, связывающих антитела, оказалась интратуморальными В-клетками. Это вполне объяснимо, так как антиген секретируется и связывается за счет специфического рецептора В-лимфоцитов. Экспрессия Lec подтверждена и на криосрезах опухолевой ткани. Таким образом, открывается реальная возможность иммунотераппи рака молочной железы естественными антителами на основании титров сывороточных антител и экспрессии антигена на опухолевых клетках.

С использованием данных поликлональных моноспецифических антител нами установлено, что рак молочной железы характеризуется экспрессией гликана Le на опухолевых клетках: 58% по данным иммуногистохимии, и 72% по данным проточной цитометрии. Важно то, что антиген обнаруживается иммуногистохимически в цитоплазме опухолевых клеток только при наличии его мембранной экспрессии. Мембранная экспрессия антигена свидетельствует о возможности его использования в качестве мишени иммунотерапии.

Экспрессия Le на клетках рака молочной была взаимосвязана с некоторыми морфологическими и клиническими параметрами. Обнаружение л антигена Le на опухолевых клетках методом иммуногистохимии достоверно чаще наблюдалось при инфильтративном дольковом раке в сравнении с инфильтративным протоковым раком - 80,0% и 53,8% соответственно, р = л

0,043. При отсутствии экспрессии гликана Le на клетках рака молочной железы метастазы в регионарные лимфатические узлы выявлялись достоверно чаще, чем в антиген-позитивной группе (88% и 51% соответственно, р = 0,05).

Уровни антител к Lec в сыворотке крови больных раком молочной железы не имеют достоверной взаимосвязи с морфологическими и клиническими характеристиками опухолевого процесса. Нами впервые показано, что уровень сывороточных антител к Lec достоверно обратно пропорционален доле антиген-позитивных опухолевых клеток, выявленных иммуногистохимически, р = 0,007. Независимым параметром является уровень антител. Иными словами, наличие у больного низких концентраций антител к Lec является фактором, предрасполагающим к росту Lec-позитивного рака молочной железы.

И всё же, судя по данным литературы, собственному опыту, исходя из особенностей и титров естественных IgM антител, наибольшее применение они могут найти в качестве адъювантной терапии в лечении микрометастазов, являющихся главной причиной развития отдаленных метастазов и смерти больных раком молочной железы. Вообще говоря, получить экспериментальное доказательство влияния естественных антител на циркулирующие и диссеминированные раковые клетки достаточно сложно. Весьма убедительные данные были получены в 2005 году Illert и соавторами. Авторы вводили естественные человеческие моноклональные антитела IgM класса SC-1 мышам nude с метастазирующей аденокарциномой желудка, а в группе сравнения антитела не вводили. Эти антитела направлены к углеводной детерминанте клеток рака желудка, индуцируют апоптоз опухолевых клеток. Спустя неделю после введения антител оценивали частоту обнаружения диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге и крови методом RT-PCR. Отмечено достоверное снижение частоты обнаружения диссеминированных клеток у животных, которым вводили антитела (р = 0,0011).

Работа по изучению диссеминированных опухолевых клеток свидетельствует о высокой частоте поражения костного мозга при-эпителиальных опухолях даже на ранних стадиях, например, при раке молочной железы - примерно 30% (Крохина О.В. и соавт., 2008; Alpers I., Brandt В., 2008). Несомненно, эта группа больных представляется наиболее перспективной для разработки методов адоптивной терапии, основанных на применении естественных антител к изолактозамину с учетом экспрессии данного антигена на опухоли и титров естественных антител в сыворотке крови.

Таким образом, представленные нами данные с учетом большой литературы, накопленной в последние годы по этому вопросу, можно отнести к числу перспективных направлений исследований в области естественного гуморального иммунитета в онкологии на основе точного соотнесения антительной специфичности с профилем антигенной экспрессии опухолевых клеток и иммунологического стадирования для профилактики метастазов.