Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Современные подходы к повышению эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с дисморфизмами ооцитов

На правах рукописи

СЫРКАШЕВА Анастасия Григорьевна

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ПОВЫШЕНИЮ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОГРАММ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ У ПАЦИЕНТОК С ДИСМОРФИЗМАМИ ООЦИТОВ

14.01.01- акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 ОКТ 2015

Москва 2015

005563855

005563855

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук Долгушина Наталия Витальевна

кандидат биологических наук Макарова Наталия Петровна

Официальные оппоненты:

Серебренникова Клара Георгиевна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России, кафедра семейной медицины, профессор

Краснопольская Ксения Владиславовна - доктор медицинских наук, профессор, ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии», отделение репродуктологии, руководитель

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени H.H. Пирогова» Минздрава России

Защита состоится «17» ноября 2015 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.125.01 на базе федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» по адресу 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

http://sciense.ncagp.ru/upfiles/pdf/SyrkashevaAG_diss.pdf

Автореферат разослан «_»_2015 г.

Ученый секретарь ,

диссертационного совета, - ' /

доктор медицинских наук V^// Калинина Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Качество половых клеток в циклах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) является ключевым фактором, определяющим вероятность наступления беременности и рождения здорового ребенка.

Распространенность морфологических аномалий ооцитов (дисморфизмов) в программах ВРТ, по данным различных исследователей, достигает 50% (Setti А., 2011). Дисморфизмы ооцитов стратифицируются на цитоплазматические (ЦД) и экстрацитоплазматические (ЭД). К цитоплазматическим аномалиям относят центральную гранулярность цитоплазмы, появление в цитоплазме аномальных агрегатов гладкого эндоплазматического ретикулума (ГЭР), вакуолей, рефрактерных телец, а также наличие темной цитоплазмы клетки. Данная группа дисморфизмов является признаком цитоплазматической незрелости клетки и может оказывать негативное влияние на оплодотворение ооцита и дальнейшее развитие эмбриона (Ebner Т., 2008; Otsuki J., 2004). К экстрацитоплазматическим аномалиям относят изменение ширины перивителлинового пространства, появление в нем гранулярности, аномалии зоны пеллюцида, а также аномалии строения первого полярного тельца. Вопрос о влиянии данных дисморфизмов на частоту оплодотворения и развитие эмбриона является спорным. Также не определено значение отдельных видов дисморфизмов в нарушении развития эмбриона, и не известны клинические предикторы их развития.

Возможными причинами негативного влияния дисморфизмов ооцитов на исходы программ ВРТ могут быть генетические аномалии в ооцитах с морфологическими изменениями. Уровень анеуплоидии в ооцитах с дисморфизмами выше по сравнению с морфологически нормальными клетками (Schmutzler А., 2014), что увеличивает риск анеуплоидии у эмбрионов (Hassold Т., 2007). Выявление хромосомных аномалий ооцита возможно только при проведении биопсии полярного тельца, которая

является сложной инвазивной процедурой. Поэтому поиск ооцитарных морфологических предикторов анеуплоидии эмбрионов является актуальной проблемой репродуктивной медицины.

Качество митохондриального аппарата ооцитов во многом определяет потенциал развития эмбрионов в программах ВРТ (Santos Т., 2006). Митохондрии ооцитов, содержащие делеции митохондриальной ДНК, могут нарушать функционирование клеток и последующее развитие эмбриона (Morgan С., 2001). Лучшее понимание морфофункционального состояния митохондриального аппарата ооцитов и эмбрионов ранней стадии развития позволит выявить новые предикторы оценки их качества.

Применение преимплантационного генетического скрининга (ПГС) предотвращает перенос эмбрионов (ПЭ) с аномальным числом хромосом, что приводит к увеличению частоты наступления беременности, уменьшению репродуктивных потерь и снижению риска рождения детей с генетической патологией. Тем не менее, имеющиеся в литературе данные о влиянии ПГС на эффективность программ ВРТ в различных группах пациентов являются противоречивыми (Twisk М., 2011). Оценка эффективности, в том числе клинико-экономической эффективности, проведения ПГС в группе пациентов с дисморфизмами ооцитов необходима для выбора правильной тактики их ведения.

Таким образом, проведение исследования, направленного на оценку исходов программ ВРТ и эффективности ПГС у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов, является актуальной задачей современной репродуктологии.

Цель исследования: Повышение эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с дисморфизмами ооцитов на основании морфологической оценки качества ооцитов, изучения числа копий митохондриальной ДНК и клинико-экономического анализа преимплантационного генетического скрининга.

Задачи исследования:

1. Изучить клинико-анамнестические данные и выявить факторы риска развития дисморфизмов ооцитов у пациенток программ ВРТ.

2. Оценить распространенность различных дисморфизмов ооцитов в программах ВРТ.

3. Провести сравнительный анализ результатов программ ВРТ у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов (параметров фолликулогенеза, оогенеза, раннего эмбрионального развития, наступления беременности и репродуктивных потерь в I триместре).

4. Исследовать число копий митохондриальной ДНК (мтДНК) в неоплодотворившихся ооцитах с различными дисморфизмами у пациенток программ ВРТ.

5. Изучить риск развития анеуплоидии хромосом 13, 18, 21, X, Y в ядрах бластомеров у супружеских пар с дисморфизмами ооцитов.

6. Оценить клинико-экономическую эффективность преимплантационного генетического скрининга в исходах программ ВРТ у пациенток с дисморфизмами ооцитов.

Научная новизна

В ходе проведения исследования были получены следующие новые знания:

• Оценено влияние различных видов дисморфизмов ооцитов на параметры раннего эмбрионального развития и исходы программ ВРТ у супружеских пар с бесплодием с расчетом отношения шансов наступления беременности в зависимости от вида дисморфизмов ооцитов.

• Изучено влияние различных способов стимуляции суперовуляции и клинико-анамнестических факторов на риск развития различных дисморфизмов ооцитов в программах ВРТ с созданием моделей прогноза развития дисморфизмов ооцитов в зависимости от выявленных факторов риска.

• Исследовано число митохондрий путем оценки числа копий мтДНК в ооцитах с различными видами морфологических изменений.

• Определена степень риска анеуплоидии в ядрах бластомеров в зависимости от наличия и вида дисморфизмов ооцитов.

• Изучена эффективность, в том числе клинико-экономическая эффективность, преимплантационного генетического скрининга в реализации программ ВРТ у пациентов с различными видами дисморфизмов ооцитов у женщин.

Практическая значимость

В результате проведенного исследования была обоснована значимость морфологической оценки качества ооцитов у пациенток программ ВРТ и выделены группы риска пациенток с наличием ооцитов с различными видами морфологических изменений.

Были созданы модели прогноза развития дисморфизмов ооцитов на основании выявленных клинико-анамнестических и ятрогенных факторов риска, которые могут быть использованы в качестве прогностических критериев эффективности программ ВРТ у супружеских пар с бесплодием.

Был проведен анализ затраты - эффективность преимплантационного генетического скрининга методом FISH у супружеских пар с различными видами дисморфизмами ооцитов, что послужило обоснованием его применения в изучаемой группе пациентов с учетом клинической и экономической составляющих.

Положения, выносимые на защиту

1. Морфологические изменения ооцитов, особенно цитоплазматические дисморфизмы, увеличивают риск неудачных исходов программ ВРТ. Значимыми клинико-лабораторными факторами риска развития дисморфизмов ооцитов являются возраст пациентки, уровень антимюллерового гормона и уровень свободного тироксина. Значимым ятрогенным фактором риска является применение агонистов гонадотропин

рилизинг-гормона в качестве триггера овуляции или в протоколах стимуляции суперовуляции.

2. Возможными причинами неэффективности программ ВРТ у пациентов с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов могут быть хромосомные или метаболические нарушения в половых клетках. Ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имеют более низкое число копий мтДНК по сравнению с морфологически нормальными ооцитами, а получение и перенос эмбрионов с различными видами анеуплоидий, полученных при их оплодотворении, осуществляется в 3,6 раз чаще.

3. Проведение преимплантационного генетического скрининга методом FISH неэффективно у пациентов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов, а в группе пациентов с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов увеличивает эффективность программ ВРТ в 1,4 раза, что объясняется переносом в полость матки эуплоидных по 13, 18, 21, X и Y хромосомам эмбрионов. Клинико-экономическая эффективность преимплантационного генетического скрининга методом FISH в лечении бесплодия у супружеских пар с цитоплазматическими дисморфизмами у женщин может быть достигнута путем повышения эффективности лечения бесплодия в программах ВРТ на 19% и снижения стоимости ПГС на 33%.

Личный вклад автора Автор участвовал в выборе темы научной работы, разработке цели и задач исследования, в проведении и интерпретации результатов морфологического исследования качества ооцитов, молекулярно-цитогенетических исследований, в обобщении и статистической обработке полученных данных. Автором лично осуществлялось обследование и ведение супружеских пар на всех этапах лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО/ПЭ).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 - «акушерство и гинекология». Результаты

проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии.

Апробация результатов Основные положения работы представлены и доложены на XV Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2014), VII регионарном форуме «Мать и дитя» (Геленджик, 2014), XXIV Международной конференции РАРЧ (Москва, 2014), XXI Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая помощь: от менархе до менопаузы» (Москва, 2015). Работа доложена на заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России 1 июня 2015 г.

Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены в практическую деятельность отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия и лаборатории репродуктивной генетики ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из которых 6 входят в перечень рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 164 страницах и состоит из оглавления, введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 32 таблицами. Библиографический указатель включает 13 работ на русском языке и 155 работ на английском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Набор пациентов, включенных в исследование, выполнялся на базе отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия и лаборатории репродуктивной генетики ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России в период с октября 2013 г. по декабрь 2014 г.

В проспективное когортное исследование были включены 343 супружеские пары, которые были стратифицированы в зависимости от морфологии полученных ооцитов: группа 1а (п=139) - пары с ЦД ооцитов; группа 16 (п=97) - пары с ЭД ооцитов; группа 2 (п=107) - пары с морфологически нормальными ооцитами. Для оценки уровня анеуплоидии в эмбрионах, полученных при оплодотворении ооцитов с различными морфологическими аномалиями, а также для клинико-экономического анализа эффективности ПГС в исходах программ ВРТ у пациенток были отобраны 84 супружеские пары, прошедшие программы ЭКО/ПГС. Пациентки, прошедшие ПГС, были также разделены на 3 группы в зависимости от морфологии полученных ооцитов: группа 1а (п=28) - пары с ЦЦ ооцитов; группа 16 (п=28) - пары с ЭД ооцитов; группа 2 (п=28) - пары с морфологически нормальными ооцитами.

Критериями включения в исследование были нормальный кариотип обоих супругов, отсутствие противопоказаний к ВРТ, нормальная или субфертильная сперма у мужчины, подписанное информированное согласие на участие в исследовании. Критериями исключения были любые состояния и осложнения, требующие отмены ПЭ в изучаемом цикле.

Стимуляцию функции яичников проводили по протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона (ант-ГнРГ), «длинному» протоколу с агонистами гонадотропин-рилизинг гормона (а-ГнРГ), а также в естественном цикле. В каждой группе производилась оценка параметров оогенеза, эмбриогенеза, частоты наступления беременности и живорождения.

Все зрелые ооциты подвергались оплодотворению методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ). Морфологическую оценку ооцитов осуществлял эмбриолог во время проведения процедуры ИКСИ с помощью инвертированного микроскопа Nikon Eclipse ТЕЗ 00 (общее увеличение 400х). Ооциты, не оплодотворившиеся после проведения оплодотворения методом ИКСИ, отбирали для исследования числа копий мтДНК. Для подсчёта копий мтДНК проводили ПЦР в реальном времени с использованием праймеров и зонда к митохондриальному гену, кодирующему аминокислотную

последовательность фермента субъединицы 1 ЫАОНдсгидрогеназы.

ПГС проводился на 3-й день культивирования эмбрионов методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и включал биопсию бластомера и молекулярно-цитогенетическое исследование ядер. Изучению подвергались 13, 18, 21, а также X и Y хромосомы. Культивирование и перенос эмбрионов, ведение посттрансферного периода и диагностика беременности осуществлялись по стандартизированным методикам.

Статистическая обработка данных выполнялась с помощью пакета статистических программ STATISTICA 10 (США), «SAS V8» (США) и «SPSS Statistics VI7» (США).

Результаты собственных исследований и их обсуждение В результате 343 циклов ЭКО+ИКСИ было получено 1793 зрелых ооцитов (688 в группе 1а, 476 в группе 16, 629 в группе 2). Среди ооцитов с ЦД (п=688) преобладали ооциты с центральной гранулярностью (45,1%) и ооциты с агрегатами ГЭР (22,5%). Среди ооцитов с ЭД (п=476) превалировали ооциты с дебрисом (39,7%) и расширением периветиллинового пространства (25,6%).

22,5%

11,0%

Центральная гранулярность 0 Вакуоли ЕЭ Агрегаты ГЭР ЕВ Рефрактерные тельца Н Темная цитоплазма

I -Я&Я^ 39 7%

10,1% _

О Расширенное перивителлиновое пространство □ Дебрис в перивителлиновом пространстве д Снижение тургора

В Аномалии строения первого полярного тельца Ы Деформация зоны пеллюцида Я Утолщение зоны пеллюцида

13,0%

12,2%

45,1%

10,5% 1,1%

Рисунок 1. Структура дисморфизмов ооцитов у обследуемых пациенток (А — цитоплазматические, Б — экстрацитоплазматические).

При оценке клинико-анамнестических и ятрогенных факторов риска развития дисморфизмов ооцитов было выявлено, что пациентки с дисморфизмами ооцитов были старше (р<0,0001), имели больший индекс массы тела (ИМТ) (р=0,0302), более низкий уровень антимюллерового гормона (АМГ) (р=0,0041) и свободного тироксина (Т4СВ) (р=0,0138) (Таблица 1).

Таблица 1

Клинико-анамнестические и ятрогенные факторы риска развития _ дисморфизмов ооцитов в циклах ЭКО___

Показатели Группа 1а (п=139) Группа 16 (п=97) Группа 2 (п=107) р-уровень

Возраст, лет* 35,4±5,6 33,8±4,5 31,8±4,7 <0,0001

<38 лет 96 (69,1%) 78 (80,4%) 98(91,6%)

>38 лет 43 (30,9%) 19(19,6%) 9 (8,4%)

ИМТ* 24,1±4,5 23,2±3,9 22,6±3,6 0,0302

<26 96 (69,1%) 84 (86,6%) 90(84,1%)

>26 43 (30,9%) 13 (13,4%) 17(15,9%)

Уровень АМГ* 2,33±2,1 2,37±2,6 3,66±3,3 0,0041

Уровень Т4СВ* 13,9±3,2 14,3±2,8 15,0±2,4 0,0138

Протокол с а-ГнРГ 7(5,1%) 9 (9,3%) 4 (3,8%) 0,0004

Протокол с ант-ГнРГ 126 (90,6%) 82 (84,5%) 100 (93,4%) 0,1387

ЭКО в естественном цикле 6 (4,3%) 6 (6,2%) 3 (2,8%) 0,0834

* Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение

Частота назначения различных протоколов стимуляции суперовуляции не отличалась значимо в группах сравнения, однако доля протоколов с а-ГнРГ была выше в группе с ЭД ооцитов (р=0,0004). Другие клинико-анамнестические и лабораторные параметры не отличались между группами пациенток.

При проведении многофакторного анализа для оценки шансов развития дисморфизмов ооцитов значимыми факторами риска ЦД явились возраст женщин и уровень Т4СВ. Значимыми факторами риска ЭД явились уровень АМГ и применение а-ГнРГ. Скорректированное отношение шансов (ОШкор) развития ЦД ооцитов при возрасте пациентки более 38 лет и уровне Т4СВ менее 13 пмоль/л составило 5,6 (95% ДИ=2,7; 11,9). ОШкор развития ЭД ооцитов при уровне АМГ менее 2,2 нг/мл и применении а-ГнРГ составило 2,2 (95% ДИ=1,2; 4,2). На основании выявленных предикторов были получены следующие формулы прогноза развития ЦД (Формула 1) и ЭД ооцитов (Формула 2).

Ехр [-2,35+0,14*Возраст-0,15 *Т4СВ]

Р(ЦД)= (------------------------------------------------)*100%

1+Ехр [-2,35+0,14*Возраст-0,15 *Т4СВ]

Р (ЦД) - вероятность развития цитоплазматических дисморфизмов в ооцитах, Ехр -экспонента, возраст - возраст женщины в годах, Т4СВ - уровень свободного тироксина в пмоль/л

Формула 1. Вероятность получения ооцитов с цитоплазматическими нарушениями у пациенток программ ВРТ.

Ехр[-2,61+0,79*(АМГ<2,2)+0,99*(а-ГнРГ+)]

Р(ЭД)=(----------------------------------------------------------------)*100%

1 +Ехр [-2,61 +0,79*(АМГ<2,2)+0,99*(а-ГнРГ+)]

Р(ЭД) - вероятность развития экстрацитоплазматических дисморфизмов в ооцитах, Ехр -экспонента, АМГ <2,2 - включается в формулу при условии, что АМГ<2,2 нг/мл, а-ГнРГ+ -включается в формулу при условии использования а-ГнРГ в качестве триггеров овуляции или в протоколе стимуляции овуляции

Формула 2. Вероятность получения ооцитов с экстрацитоплазматическими нарушениями у пациенток программ ВРТ.

Частота оплодотворения ооцитов существенно различалась между группами и была минимальной при наличии ЦД (р=0,0280). Среди ооцитов с ЦЦ наименьшую частоту оплодотворения имели ооциты с темной цитоплазмой (77,8%) и вакуолями (80,8%), среди ооцитов с ЭД - ооциты со снижением тургора цитоплазмы (81,3%) и аномалиями строения первого полярного тельца (80,0%). При морфологической оценке качества эмбрионов было выявлено, что наибольшее число эмбрионов класса А и В было получено у женщин с морфологически нормальными ооцитами, а максимальное число эмбрионов класса С и остановившихся в развитии - у пациенток с ЦД ооцитов.

Частота биохимической беременности в группе 1а составила 27,3% (38 женщин), в группе 16 - 39,2% (38 женщин), а в группе контроля - 57,0% (61 женщина) (р<0,0001). Клиническая беременность наступила у 34 женщин группы 1а (24,6%), у 38 женщин в группе 16 (39,2%) и у 60 женщин в группе контроля (56,1%) (р<0,0001). На наступление беременности помимо наличия дисморфизмов ооцитов влияли возраст пациенток, количество циклов ЭКО в анамнезе, а также число полученных зрелых ооцитов. ОШкор наступления беременности при наличии ЭД составило 1,42 (95% ДИ 1,07; 1,89), при наличии ЦД - 3,69 (95% ДИ 2,12; 6,14).

Частота самопроизвольных прерываний беременностей была выше у пациенток с дисморфизмами ооцитов. Было диагностировано 35 потерь беременности в сроке до 10 недель гестации: 11 в группе 1а (32,4%), 11 - в группе 16 (29,0%), 13 - в группе 2 (21,7%) (р=0,4554). В группе 1а было проведено 1 прерывание беременности во II триместре гестации в связи с наличием у плода синдрома Дауна по результатам амниоцентеза и генетического исследования околоплодных вод.

В результате у женщин с дисморфизмами ооцитов отмечалось статистически значимо меньшее число живорождений по сравнению с контрольной группой. Частота живорождений в группе 1а составила 15,8% (22 из 139), в группе 16 - 27,8% (27 из 97), в группе 2 - 43,9% (47 из 107)

(р<0,0001). Все дети родились живыми, у одной из пациенток группы 1а был рожден ребенок с синдромом Дауна.

60% 57,0%56,1%

Группа 1а Группа 16 Группа 2

■ Частота наст упления биохимической беременности Б Частота наступления клинической беременности э Частота живорождения

Рисунок 2. Исходы программ ВРТ у пациенток, включенных в исследование.

Для исследования числа копий мтДНК были отобраны 343 ооцита, не оплодотворившихся после проведения ИКСИ. Критерием отбора ооцитов для исследования было отсутствие в цитоплазме пронуклеусов через 18-20 часов после оплодотворения, а также отсутствие дробления через 40 часов после оплодотворения. Все ооциты были разделены на 3 группы: группа 1а (п=126)

- ооциты с ЦД, группа 16 (п=108) - ооциты с ЭД, группа 2 (п=109) -морфологически нормальные ооциты. Число мтДНК всех изученных ооцитов находилось в диапазоне от 5440 до 9~800'000 копий. Медиана распределения составила 2*000*000 с интерквартильным размахом от 813'000 до З'ЗОО'ООО копий. В группе с ЦД число копий мтДНК было минимальным и составило ГЗОО'ООО (263-500 - 2,325,000). В группах с ЭД и морфологически нормальными ооцитами число копий мтДНК составило 2'000'000 (Г350'000

- 4450-000) и 2-500-000 (Г400'000 - 4'000'000) соответственно (р<0,0001) (Рисунок 3).

3 1 2

Группы пациенток: 1 - группа 1а, 2 - группа 16, 3 - группа 2

Рисунок 3. Число копий мтДНК в ооцитах с ЦД (1), ЭД (2) и с отсутствием

дисморфизмов (3).

Среди ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами наименьшее число копий мтДНК наблюдалось в ооцитах с аномальными агрегатами ГЭР, центральной гранулярностью и вакуолями (Таблица 2).

Таблица 2

Число копий мтДНК в ооцитах с различными цитоплазматическими ___дисморфизмами_

рГруппа п Среднее значение Стандартно отклонение Медиана Интерквартильный размах Минимум-максимум

Центральная дгранулярность Г737'341 Г795'534 Г200'000 229'000-2'300'000 7'970-7'600'000

1Вакуоли з 1'778'790 2'188'078 1 '400'000 284'000-2'150'000 Ю'400-9' ЮО'ООО

.^Аномальные агрегаты ГЭР Г235'126 1'775'019 505'000 105'000-1'600'000 5'440-8'000'000

Рефрактерные ^тельца 2'704'500 2'219'409 2'350'000 ГбОО'ООО-З'ЗОО'ООО 212'000-9'800'00(

р=0,0137, тест Крускапа-Уаллиса

Для оценки уровня анеуплоидии в эмбрионах, полученных при оплодотворении ооцитов с различными морфологическими аномалиями, в исследование были включены 84 пациентки, прошедшие молекулярно-

цитогенетическое исследование эмбрионов. В общей сложности ПГС был проведен для 368 эмбрионов (98 эмбрионов в группе 1а, 126 эмбрионов в группе 16 и 144 в группе 2). Максимальное число анеуплоидных эмбрионов было получено в группе 1а - 67 (68,4%), затем в группе 16 - 49 (38,9%) и в группе 2 - 45 (31,3%) (р<0,0001).

Для анализа факторов, способных оказать влияние на развитие анеуплоидии в эмбрионах, было проведено сравнение группы анеуплоидных эмбрионов (группа А, п= 161) с эуплоидными эмбрионами (группа Б, п=207). Группы значимо различались по возрасту, ИМТ и уровню АМГ пациенток, от которых были получены эмбрионы. В группе анеуплоидных эмбрионов отмечалась большая доля курящих женщин, а также женщин, перенесших хламидийную инфекцию и ИППП в анамнезе. Суммарная доза гонадотропинов была выше в группе анеуплоидных эмбрионов (Таблица 3).

Таблица 3

Характеристики групп анеуплоидных (группа А) и _эуплоидных эмбрионов (группа Б)__

Показатели Группа А (п=161) Группа Б (п=207) р**-уровень

Возраст, лет* 36,0±6,3 33,2±6,3 <0,0001

ИМТ, кг/м'* 22,8±2,9 21,9±2,8 0,0060

АМГ, нг/мл* 2,7±1,7 3,9±3,2 0,0003

Курение, % 17(10,6%) 4(1,9%) 0,0004

Хламидийная инфекция в анамнезе, % 30(18,6%) 19(9,2%) 0,0080

ИППП, % 76 (47,2%) 61 (29,5%) 0,0004

Суммарная доза гонадотропинов, МЕ* 2311,6±1047,2 1978,7±869,9 0,0009

Оплодотворение субфертильной спермой, 128 (79,5%) 161 (77,8%) 0,6892

*данные представлены как средние ± стандартное отклонение; ** х -тест для сравнения категориальных данных, 1-тест для сравнения непрерывных данных

ОШкор получения анеуплоидных эмбрионов при наличии ЭД по сравнению с нормальными ооцитами составило 1,3 (95% ДИ=0,7; 2,1), при наличии ЦД - 3,6 (95% ДИ=1,8; 7,2). Максимальная доля анеуплоидных эмбрионов наблюдалась у эмбрионов, полученных из ооцитов с темной цитоплазмой (73,1%), центральной гранулярностью (66,7%) и агрегатами ГЭР (65,2%) (Таблица 4). Наиболее частыми типами анеуплоидий являлись

полисомии хромосом. При этом распространенность всех видов полисомии была значительно выше у пациенток с ЦЦ ооцитов.

Таблица 4

Доля анеуплоидных эмбрионов, полученных из ооцитов с различными видами дисморфизмов по сравнению с морфологически нормальными ___ооцитами _

Вид дисморфизмов ооцитов Анеуплоидные эмбрионы Эуплоидные эмбрионы р*-уровень

Ооциты с центральной гранулярностью, п=36 24 (66,7%) 12 (33,3%) <0,0001

Ооциты с вакуолями, п=4 4(100%) 0 0,0040

Ооциты с агрегатами ГЭР, п=23 15(65,2%) 8 (34,8%) 0,0016

Ооциты с рефрактерными тельцами, п=9 5 (55,6%) 4 (44,4%) 0,1315

Ооциты с темной цитоплазмой, п=26 19(73,1%) 7 (26,9%) <0,0001

Ооциты с дебрисом в перивителлиновом пространстве, п=59 27 (45,8%) 32 (54,2%) 0,0497

Ооциты с расширенным перивителлиновым пространством, п=38 15(39,5%) 33 (60,5%) 0,3374

Ооциты с утолщением п=29 7(24,1%) 22 (75,9%) 0,4460

Нормальные ооциты,п=144 45 (31,25%) 99 (68,75%) референс

* хг-тест

Перенос эмбрионов был произведен в 100% случаев в группе 2, в 92,9% в группе 16 и лишь в 50% случаев в группе 1а вследствие выявления хромосомных аномалий у эмбрионов или гибели эмбрионов на этапе проведения ПГС (р<0,0001). Клиническая беременность была диагностирована в 3 случаях в группе 1а (10,7%), в 9 случаях в группе 16 (32,1%) и в 8 случаях в группе 2 (28,6%) (р=0,1307). В расчете на цикл ПЭ частота наступления беременности была сопоставима в группах сравнения и составила 21,0% в группе 1а, 34,6% в группе 16 и 28,6% в группе 2 (р>0,05). В группе 16 было диагностировано 5 потерь беременности (55,6% от общего числа беременностей в данной группе), в группе 2 было диагностировано 4 потери беременности (50% от общего числа беременностей в данной группе) (р=0,0732). В группе 1а все беременности пролонгировались и закончились родами. Всего в группе 1а беременность закончилась родами у 2 женщин, в группе 16 - у 4 женщин, в группе 2 - у 4 женщин (р=0,2534). Все дети родились живыми, без генетической патологии и видимых пороков развития.

Для оценки клинико-экономической эффективности ПГС в исходах программ ВРТ у пациенток с различными дисморфизмами ооцитов была создана модель принятия решений (TreeAge Pro Inc), в которой было проведено сравнение 2-х стратегий: рутинного ЭКО и ЭКО с ПГС методом FISH у бесплодных пар с дисморфизмами ооцитов для определения минимальной стоимости одного живорождения на одного пациента, проходящего вышеуказанное лечение бесплодия. В модель включались пары с наличием эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки. Допущением модели была возможность применения одного цикла ЭКО со свежими эмбрионами без криоконсервации эмбрионов. Данные по вероятности наступления беременности, самопроизвольного выкидыша, риска анеуплоидии по данным биохимического скрининга, частоте амниоцентеза и прерывания беременности во 2-м триместре в группах ЭКО и ЭКО/ПГС у пар с различными видами дисморфизмами ооцитов были получены из результатов собственных наблюдений. В анализ были включены только прямые затраты на проведение ЭКО и ЭКО/ПГС. Под затратами понималась непосредственная стоимость медицинских услуг, а также стоимость койко-дней при проведении различных лечебных процедур в условиях стационара. Стоимость ЭКО в свежем цикле рассчитывалось как норматив финансовых затрат на 1 случай применения процедуры за счет средств обязательного медицинского страхования (ОМС) в 2014 году. Стоимость всех остальных процедур рассчитывалась по прайсу ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.

Для пар с ЭД ооцитов вероятность иметь здорового ребенка при применении одного цикла ЭКО составила 28% по сравнению с 15% при применении одного цикла ЭКО/ПГС, а вероятность родить ребенка с анеуплоидией составила 0% в циклах ЭКО и 0% в циклах ЭКО/ПГС. Средняя стоимость лечения методом ЭКО для пар с ЭД ооцитов составила 116 983 руб. по сравнению со 193 451 руб. при лечении методом ЭКО/ПГС. При этом средняя стоимость лечения методом ЭКО в расчете на одного здорового

ребенка составила 420 802 руб., при лечении методом ЭКО/ПГС - 1 256 175 руб. В этой группе пациентов стоимость лечения бесплодия методом ЭКО или ЭКО/ПГС в расчете на рождение одного здорового ребенка отличалась на 66,5%.

Для пар с ЦД ооцитов вероятность иметь здорового ребенка при применении одного цикла ЭКО составила 15% по сравнению с 21% при применении одного цикла ЭКО/ПГС, а вероятность родить ребенка с анеуплоидией составила 1,4% в циклах ЭКО и 0% в циклах ЭКО/ПГС (Рисунок 4).

■ — точка принятия решения; • - точка вероятности; M - конечная точка

Екрсмсаисгь rpœançvtia

ЗлсркиЯремнх

0.9М

»

-:( Ira ЪП?

I 0.2+4

O.Wö

< |г-»:-;сс ск "|

\

||»я»оо !».?■ -0150 |

|i:V.4VA' иУ' ■0®

|Ш»0& КОР -ОКО [

|т»ж о»,?-оаг 1

Бмтадьи

цхсрыые DPT

цпссаямге

дя:иф$<Ш)ии

fttjni*

|п«<< c i; 1 5tp<iitiuxn

—с] miKsoe •;«.?-с-ото I

W

0.756

фпжяцкгтп иппй Здсрокйрсосаж

—.] |liV«Siï. hï-?4"H

ШПОН

I-:- i | КИМ ГО 1« |

Сысф.чс£с.зиьа

-С] o-.-y.--M |

( |i>rs60 |

Bcpucuuxib

v-iSCC 0№F*e«C

Рисунок 4. Дерево решений для модели эффективности ЭКО по сравнению с ЭКО/ПГС у пар с ЦД у женщин.

Средняя стоимость лечения методом ЭКО составила 116 065 руб. по сравнению со 190 278 руб. при лечении методом ЭКО/ПГС. При этом средняя стоимость лечения методом ЭКО для рождения одного здорового ребенка составила 733 766 руб., при лечении методом ЭКО/ПГС - 889 149

руб. В этой группе пациентов стоимость лечения бесплодия методом ЭКО или ЭКО/ПГС в расчете на рождение одного здорового ребенка отличалась на 13%. При проведении анализа чувствительности для модели с ЦЦ ооцитов было выявлено, что модель была чувствительна к изменению вероятности наступления беременности и рождения эуплоидного ребенка при применении ЭКО/ПГС и стоимости ЭКО/ПГС. Порогом отсечки была частота наступления беременности в циклах ЭКО/ПГС 26,1% и стоимость ЭКО/ПГС 126 238 руб. Таким образом, ЭКО/ПГС стала бы доминирующей стратегией, если бы вероятность наступления беременности возросла до 26,1% по сравнению с исходной вероятностью 21,4%, а стоимость ее снизилась до 126 238 руб. по сравнению с исходными 188 909 руб.

На основании полученных данных был разработан алгоритм по ведению пациенток с риском получения ооцитов с морфологическими аномалиями (Рисунок 5).

Рисунок 5. Алгоритм ведения пациенток с бесплодием и дисморфизмами ооцитов в программах ВРТ

ВЫВОДЫ

1. Эффективность программ ВРТ у пар с дисморфизмами ооцитов, особенно с цитоплазматическими дисморфизмами, ниже по сравнению с парами с морфологически нормальными ооцитами. У пациентов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами беременность наступает в 1,4 раза реже, а живорождение - в 2 раза реже, чем у пациентов без дисморфизмов ооцитов. У пациентов с цитоплазматическими дисморфизмами беременность наступает в 3,7 раз реже, а живорождение - в 4,2 раза реже, чем у пациентов без дисморфизмов ооцитов.

2. Факторами риска развития дисморфизмов ооцитов у пациентов ВРТ являются старший возраст пациенток, низкий уровень антимюллерова гормона и свободного тироксина, а также применение агонистов гонадотропин рилизинг-гормона в качестве триггера овуляции или в протоколах стимуляции суперовуляции. Различные гинекологические заболевания (эндометриоз, синдром поликистозных яичников, воспалительные заболевания органов малого таза) не оказывают значимого влияния на развитие дисморфизмов ооцитов.

3. Ооциты с цитоплазматическими дисморфизмами имеют более низкое число копий мтДНК по сравнению с ооцитами с экстрацитоплазматическими дисморфизмами или морфологически нормальными ооцитами. Снижение числа и, как следствие, функции митохондрий является одной из возможных причин низкой эффективности программ ВРТ у данной категории пациенток.

4. Дисморфизмы ооцитов, в первую очередь цитоплазматические дисморфизмы, оказывает существенное влияние на развитие хромосомной патологии эмбрионов в программах ВРТ: анеуплоидии 13, 18, 21, X и У хромосом выявляются у 38,9% эмбрионов, полученных из ооцитов с экстрацитоплазматическими дисморфизмами, и у 68,4% эмбрионов, полученных из ооцитов с патологией цитоплазмы. Оплодотворение ооцитов с цитоплазматическими дисморфизмами увеличивает риск получения

анеуплоидных эмбрионов в 3,6 раза. Наиболее частыми видами хромосомной патологии эмбрионов при этом являются различные полисомии хромосом.

5. При применении программ ВРТ у пациенток с экстрацитоплазматическими дисморфизмами ооцитов проведение преимплантационного генетического скрининга методом FISH не увеличивает эффективность программ ВРТ (наступление беременности, живорождения). При применении программ ВРТ у пациенток с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов проведение преимплантационного генетического скрининга методом FISH увеличивает эффективность программ ВРТ (живорождения - в 1,4 раза) за счет переноса в полость матки эуплоидных по 5-хромосомам эмбрионов, что свидетельствует о клинической обоснованности применения ПГС для лечения бесплодия и профилактики хромосомной патологии плода в данной группе пациентов.

6. Клиническая эффективность преимплантационного генетического скрининга методом FISH у пар с цитоплазматическими дисморфизмами у женщин не сочетается с его клинико-экономической эффективностью, которая может быть достигнута путем повышения эффективности лечения бесплодия в программах ВРТ на 19% и снижения стоимости ПГС на 33%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Всем пациенткам программ ВРТ следует проводить тщательную морфологическую оценку ооцитов на предмет выявления различных дисморфизмов. Выявление патологии цитоплазмы ооцита является плохим прогностическим фактором в плане его оплодотворения и дальнейшего развития эмбриона.

2. При получении ооцитов с агрегатами гладкого эндоплазматического ретикулума в циклах ВРТ следует отказаться от их оплодотворения вследствие низкой вероятности дальнейшего развития эмбрионов (минимальное число копий мтДНК) и высокого риска получения анеуплоидных эмбрионов (65,2%).

3. Пациенткам с риском развития дисморфизмов ооцитов требуется комплексный подход в коррекции соматических заболеваний и метаболических нарушений, а также дифференцированный подход в выборе подходящего протокола стимуляции суперовуляции. Для расчета индивидуального риска получения ооцитов с различными дисморфизмами в программах ВРТ могут быть использованы разработанные математические модели, включающие оценку клинико-лабораторных и ятрогенных факторов.

4. Пациентки с морфологическими аномалиями ооцитов, в первую очередь с цитоплазматическими дисморфизмами, представляют группу риска по выявлению различных анеуплоидий у эмбрионов в программах ВРТ. Данной категории пациенток необходимо рекомендовать дополнительное медико-генетическое консультирование с целью решения вопроса о целесообразности проведения молекулярно-цитогенетического анализа эмбрионов.

5. Клинико-экономическая эффективность преимплантационного генетического скрининга методом FISH в группе пар с цитоплазматическими дисморфизмами ооцитов у женщин может быть достигнута снижением его стоимости. Полученная вследствие снижения стоимости экономическая выгода назначения данного метода позволит внедрить его в группах пациенток высокого риска по рождению детей с генетической патологией.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние уровня анеуплоидии хромосом в сперматозоидах на развитии анеуплоидии эмбрионов и исходы программ вспомогательных репродкутивных технологий / С. А. Сокур, Н. В. Долгушина, Ж. И. Глинкина, А. Г. Горшкова (Сыркашева), Е. А. Калинина // Гинекология. - 2013. - № 6. -С. 38-41.

2. Преимплантационный генетический скрининг у супружеских пар с патозооспермией у мужчин: анализ затраты-эффективность. / Н. В.

Долгушина, С. А. Сокур, А. Г. Горшкова (Сыркашева), JI. Н. Спорышева, Е. А. Калинина// Акушерство и гинекология. - 2014. - № 4. - С. 51-61.

3. Дисморфизмы ооцитов в циклах вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы) // А. Г. Горшкова (Сыркашева), Н. П. Макарова, Н. В. Долгушина // Акушерство и гинекология. - 2014. - № 6. - С. 27-32.

4. Механизм формирования агрегатов гладкого эндоплазматического ретикулума в цитоплазме ооцитов в циклах вспомогательных репродуктивных технологий и его клиническое значение/ Е. В. Ковальская, Н. П. Макарова, А. Г. Сыркашева, Н. В. Долгушина, Л. Ф. Курило // Цитология. - 2015. - № 2. - С. 129-134.

5. Факторы риска развития дисморфизмов ооцитов в программах вспомогательных репродуктивных технологий / А. Г. Горшкова (Сыркашева), Н. В. Долгушина, Н. П. Макарова, Е. В. Ковальская, Е. А. Калинина// Акушерство и гинекология. -2015. - № 5. - С. 66-73.

6. Oocytes with deformation of the oolemma in the ivf cycle: case report / N. P. Makarova, E. V. Kulakova., E. V. Kovalskaya., A. G. Gorshkova., N. V. Dolgushina., E. A. Kalinina // Ovarian Club IV, Paris, November 15-16, 2014, Group A.

7. Влияние морфологии ооцитов на эмбриологические характеристики программ интрацитоплазматической инъекции сперматозоида / А. Г. Горшкова (Сыркашева), Н. П. Макарова, Е. В. Ковальская, Н. В. Долгушина // Мать и дитя: материалы XV Всероссийского научного форума. - Москва, 2014. - С. 465-466.

8. Реализация программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с агрегатами гладкого эндоплазматического ретикулума в цитоплазме ооцитов / А. Г. Горшкова (Сыркашева), Н. П. Макарова, Е. В. Ковальская, Н. В. Долгушина // Мать и дитя: материалы XV Всероссийского научного форума. - Москва, 2014. - С. 466467.

9. Влияние дисморфизмов ооцитов на исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий / Н. П. Макарова, Е. В. Петрова, А. Г. Горшкова (Сыркашева), Н. В. Долгушина // Мать и дитя: материалы VII регионального научного форума. - Геленджик, 2014. - С. 244245.

10. Преимплантационная генетическая диагностика у пациенток с дисморфизмами ооцитов / Н. П. Макарова, Е. В. Петрова, А. Г. Горшкова (Сыркашева), Н. В. Долгушина, Е. А. Калинина // Репродуктивные технологии сегодня и завтра: материалы XXIV Международной конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека. - Ярославль, 2014. - С. 8990.

11. Факторы риска развития экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов в программах вспомогательных репродуктивных технологий / А. Г. Сыркашева, Н. В. Долгушина, Н. П. Макарова, Е. В. Ковальская // Материалы IX Международного конгресса по репродуктивной медицине - Москва, 2015 - С. 143-144.

12. Применение преимплантационного генетического скрининга у пациенток с дисморфизмам ооцитов / А. Г. Сыркашева, Н. В. Долгушина, Н. П. Макарова, Е. В. Ковальская // Материалы IX Международного конгресса по репродуктивной медицине - Москва, 2015 - С. 197-198.

13. Факторы риска развития цитоплазматических дисморфизмов ооцитов в программах вспомогательных репродуктивных технологий / А. Г. Сыркашева, Н. В. Долгушина, Н. П. Макарова, Е. В. Ковальская // Материалы XXI Всероссийского конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая помощь: от менархе до менопаузы» — Москва, 2015-С. 155-156.

14. Исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с дисморфизмами ооцитов / А. Г. Сыркашева, Н. В. Долгушина, Н. П. Макарова, Е. В. Ковальская, М. А. Агаршева // Акушерство и гинекология.- 2015,- №7,- С,- 56-62.

Подписано в печать 14.08.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 46220-15-КЦ Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39