Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Совершенствование методов контроля качества микробиологической диагностики инфекций, передаваемых преимущественно половым путем

На правах рукописи

КРИВОРУЧКО Александр Борисович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАВАЕМЫХ ПРЕИМУЩЕСТВЕННО ПОЛОВЫМ ПУТЕМ

14 00 46 - клиническая лабораторная диагностика 03 00 07- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003445193

Санкт-Петербург-2008

003445193

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им С М Кирова»

Научные руководители

доктор медицинских наук профессор Сбойчаков Виктор Борисович

доктор медицинских наук Иванов Андрей Михайлович

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук Молчанов Олег Леонидович

доктор медицинских наук профессор Ценева Галина Яковлевна

Ведущая организация

ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «^3» 2008 г в И_часов на заседа-

нии диссертационного совета Д215 002 08 при ГОУ ВПО «Военно-медицинской академии им С М Кирова» (194044, г. Санкт-Петербург, ул Академика Лебедева, д 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия им С М. Кирова»

¡{ш

Автореферат разослан «_/$_» ЦАОА^Х. 2008 г

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА доктор медицинских наук профессор ПАСТУШЕНКОВ Владимир Леонидович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Интерес к методам этиологической лабораторной диагностики инфекций, передаваемых преимущественно половым путем (ИПППП), в последние годы неуклонно возрастает Это связано с их широким распространением, ростом заболеваемости, а также с социальным и экономическим ущербом, которые всегда сопутствуют данной группе инфекционной патологии (Савичева А М, 2004, Дмитриев Г А, 2005, Bonsenko К К. et al, 1999, Majerom В А., 2007)

Микробиологическая диагностика ИПППП, вышедшая в последнее десятилетие на качественно более высокий уровень, позволила перенести основную массу исследований из специализированных научно-исследовательских центров в лаборатории практического здравоохранения (Никулин Н К , 1999, Аковбян В А и др , 2007) Вместе с тем, сложилась парадоксальная ситуация с одной стороны появились перспективные, доступные и воспроизводимые методы, позволяющие подтвердить этиологию заболевания, с другой - возникли трудности с регламентацией проведения исследований и отсутствием способов управления процессом лабораторной диагностики путем выявления и предотвращения возможных ошибок (Меньшиков В В., 2003, Рищук С В , Костючек Д Ф , 2005, Хоровская JIА, 2007).

В дерматовенерологической службе России в силу разнообразия методологических подходов, многочисленности проводимых исследований, различного уровня квалификации исследователей, а также отсутствия необходимого контроля на разных стадиях процесса анализа повышается вероятность получения недостоверных результатов, что негативно отражается на выборе средств и схем лечения ИПППП (Бойцов А Г и др , 2000)

При выборе метода этиологической диагностики урогенитальной инфекции, оптимального для применения в условиях конкретной диагностической лаборатории на первый план выдвигаются проблемы технического и экономического характера, а вопросы организации контроля качества, как правило, считаются второстепенными (Васильев ММ , 1998, Дмитриев Г А , 2003)

Однако в настоящее время систематическая оценка качества выполняемых лабораторных исследований признана неотъемлемой составляющей диагностического процесса (Приказ МЗ РФ №45, 2000, Назаренко Г И, Кишкун А А, 2001, Мошкин А В, Долгов В В , 2004) Для большинства методов, используемых в лабораторной диагностике, требования к аналитическому качеству регламентированы руководящими документами (Гаранина ЕН, 1997, Заикин ЕВ. и др , 2000, Карлищенко А.И , Грашин Р А , 2001, Кишкун А А , 2004)

Несмотря на то, что лаборатории принадлежит одна из ведущих ролей в установлении диагноза ИПППП, обеспечение качества исследований, подразумевающее широкий спектр процедур, начиная с контроля качества.

оборудования и реагентов, ведения внутрилабораторного контроля и заканчивая проверкой клинической значимости результатов анализов на сегодняшний день не осуществляется в полном объеме (Кудрявцева М Б, 2000, Дмитриев Г А, 2005)

В условиях сохранения неблагоприятной эпидемиологической обстановки по заболеваемости ИПППП в Российской Федерации приоритетной задачей является проведение качественной диагностики этих заболеваний, что подразумевает разработку стандартизованной системы контроля качества работы лабораторий, занимающихся диагностикой ИПППП (Фриго НВ и др , 2004)

Существующая на данный момент система мониторинга качества диагностики урогеиитальных инфекций предполагает обязательное участие КДЛ в программах федеральной системы внешней оценки качества (ФСВОК), а также проведение внутрилабораторного контроля (Задесских Н В и др , 2004) Оценка качества диагностики Ш11111 микроскопическим и серологическим методами осуществляется путем применения набора контрольных образцов - панельного тестирования (Нетесова ИГ и др, 2005)

В качестве контрольных образцов для оценки микроскопического метода диагностики ИПППП используются наборы микрофотографий, просматривая которые исследователь должен сделать вывод о наличии или отсутствии в них возбудителя инфекции Результаты данной диагностики сравниваются с заключением экспертной группы (Малахов В Н и др, 2002) Существующие на данный момент контрольные образцы, по мнению многих авторов, обладают рядом недостатков (Зурочка А В , Чукичев А В, 2000, Егорова О В , 2004) Коллекции не включают все описанные морфологические формы возбудителей, не используются все методики окраски, применяющиеся на практике Также недостатком является возможность контроля только метода микроскопии в проходящем свете Отсутствует алгоритм, позволяющий использовать новую микроскопическую технику, обладающую дополнительными средствами визуализации изображения (Колупаев В Е , 2000)

Для контроля бактериологических методов диагностики урогеиитальных инфекций метод панельного тестирования не применяется Основными задачами системы мониторинга качества в этом случае является оценка качества питательных сред, и совершенствование интерпретации полученных исследований Наименее отработаны данные принципы в культуральной диагностике условно-патогенных ИПППП требующих полуколичественного учета (Дмитриев Г А, 2005) Поэтому требуется создание и внедрение в практику правил внутрилабораторного контроля качества бактериологических методов, предполагающих определение количества возбудителя в исследуемой пробе

Контроль качества серологических методов диагностики ИШШП осуществляется посредством использования наборов (панелей) сывороток В настоящее время отсутствуют официально утвержденные панели сывороток для контроля диагностики урогенитальных инфекций Имеющиеся наборы представляют высокотитражные сыворотки с неизвестными критериями подбора, которые не охарактеризованы по наличию антител к наиболее иммуногенным антигенам возбудителя (Фриго Н В и др , 2004)

Все вышеизложенное и предопределило цель и задачи настоящего диссертационного исследования

Цель исследования. Усовершенствовать методы контроля качества микробиологической диагностики инфекций, передаваемых преимущественно половым путем

Задачи исследования.

1 Оценить состояние контроля качества внутрилабораторного этапа микробиологической диагностики ИПППП в современных условиях

2 Оценить возможности стандартизации микроскопической диагностики урогениталыюго трихомониаза и обосновать основные требования к контролю качества

3 Определить возможные источники ошибок при проведении культу-ральной диагностики урогенитального микоплазмоза и обосновать методические подходы к повышению эффективности контроля качества при выявлении Mycoplasma hominis

4 На примере сифилиса обосновать методы контроля качества серологической диагностики ИПППП

5 Обосновать алгоритмы проведения внутрилабораторного контроля качества микробиологической диагностики ИПППП

Научная новизна исследования.

Показаны преимущества микроскопической диагностики трихомониаза с помощью принципиально новых оптических приборов - микровизоров, основанных на получении цифрового микроизображения Впервые предложена серия микропрепаратов, с помощью которых возможно проведение контроля качества микроскопической диагностики трихомониаза с учетом всех, используемых на практике методов, наиболее значимых биологических материалов и атипичных морфологических вариантов возбудителя

Продемонстрирована взаимосвязь между данными культуральной диагностики урогенитального микоплазмоза при использовании жидких и плотных питательных сред Обоснована процедура внутрилабораторной оценки диагностической эффективности питательных сред, повышающая точность выявления этиологически значимых концентраций возбудителя

На примере сифилиса показано, что разработке панелей сывороток для

контроля серологической диагностики, должны предшествовать исследования особенностей образования и динамики специфических антител. Установлено, что контрольные материалы должны быть охарактеризованы по содержанию антител ко всему спектру видоспецифичных микробных антигенов

Практическая значимость.

Обоснованы предложения по разработке контрольных материалов и к самой процедуре оценки качества микробиологической диагностики ИПППП

Систематизированы и предложены комплексы организационных мер в виде алгоритмов, позволяющих выявлять диагностические ошибки, и проводить целенаправленные действия, сводящие их возникновение к минимуму

Разработанные контрольные материалы, в том числе, для оценки микроскопической и серологической диагностики, могут использоваться в условиях практических лабораторий

Личное участие автора в получении результатов.

Автором научно обоснована методология исследования, проанализированы результаты микроскопических, культуральных и серологических тестов, разработаны контрольные материалы для оценки качества микробиологической диагностики ИПППП, создан алгоритм поиска и устранения внутрилабораторных причин дефектов лабораторной диагностики ИПППП

Автор лично планировал исследования, принимал непосредственное участие в микробиологическом обследовании больных, организовывал и участвовал в проведении всех видов анализа, а также осуществлял контроль качества методов диагностики Автором лично формировалась база данных, проводилась их статистическая обработка и обобщение полученных результатов

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Применение стандартных, всесторонне охарактеризованных контрольных материалов - важное условие эффективной и достоверной микробиологической диагностики ИПППП

2 Разработанные материалы для контроля качества микроскопического, культурального и серологического методов позволяют повысить эффективность и достоверность диагностики ИПППП

Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу кафедры и клиники кожных и венерических болезней, кафедры мик-

робиологии, научно-исследовательского отдела передовых медико-биологических технологий ВМедА им С М Кирова, СПб ГУЗ «КВД №4» и ГУЗ «Областного КВД» (Санкт-Петербург)

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Санкт-Петербургского общества дерматовенерологов им. В М. Тарновского (С -Петербург, 2006, 2008) и Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им И И Мечникова (С -Петербург, 2007), 40-и научно-практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы дерматовенерологии Контроль и профилактика инфекций, передающихся половым путем» (С -Петербург, 2005), научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (С -Петербург, 2006), социальном форуме «Югра - территория здоровья» (Ханты-Мансийск, 2007), 2-ой Российской конференции «Иммунология репродукции теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2007), 1-ой Национальной конференции с международным участием «Нейроинфекции» (Москва, 2007), XI Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С -Петербург, 2007), V Европейском конгрессе по протистологии и XI Европейской конференции по биологии беспозвоночных (С -Петербург, 2007), научно-практической конференции «Актуальные вопросы этиологической диагностики инфекционных заболеваний» (Екатеринбург, 2008)

По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, в том числе 9 - в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 226 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 5 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований), заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и указателя литературы, включающего 258 источников, в том числе 167 отечественных и 91 зарубежных Текст содержит 42 таблицы и 14 рисунков

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В период 2005-2008 гг было выявлено и обследовано 1878 больных с урогенитальными инфекциями (УГИ) Из них у 1528 были диагностированы моноинфекции, а у 350 - смешанные УГИ

С целью уточнения клинико-лабораторных особенностей течения УГИ, дополнительное обследование проводилось совместно со специалистами клиник Военно-медицинской академии им С М Кирова Группы обследуемых формировались из пациентов, которые находились на обследовании и лечении в клиниках ВМедА (в том числе в клиниках кожных и венерических болезней, акушерства и гинекологии), в ОКВГ №442 им Соловьева, 1-ом Военно-морском госпитале, областном КВД и КВД №4 г Санкт-Петербурга

Возраст пациентов составил от 17 до 63 лет Значительная часть больных (84,2%) находилась в возрасте до 40 лег

Частота выделения микроорганизмов в группе пациентов с УГИ представлена в таблице 1 Более чем в 80% случаев нами выявлялись поражения урогенитального тракта (УГТ) в виде моноинфекций Преобладающей моноинфекцией был трихомониаз (33,0%) Другие этиологические агенты инфекций но убыванию выявления располагались в следующей последовательности Candida spp - 18,1%, U urealyticum - 9,7%, M hominis - 8,0%, условно-патогенная микрофлора - 5,6%, С trachomatis - 4,6%, N gonorrhoeae - 1,5%, вирус простого герпеса 1 и 2 типов - 0,6%

Для отработки методических подходов к контролю качества была выбрана группа пациентов с диагнозом трихомониаз (620 больных) и с диагнозом микоплазмоз (151 больной)

Углубленному клинико-лабораторному и иммунологическому обследованию были также подвергнуты 247 больных в различные периоды сифилиса

Сроки наблюдения за больными от начала заболевания до момента последнего исследования составили от 3 месяцев до 12 месяцев (1 год), в среднем 6 месяцев

Диагноз сифилиса у всех больных был установлен на основе анамнеза, эпидемиологического обследования, данных клинического и лабораторного обследования, а также подтвержден положительными реакциями в стандартных серологических тестах (РСК с кардиолипиновым и трепонем-ными антигенами, МРП, РПГА, РИФ-абс и РИТ)

Для исключения ложноположительных реакций в качестве контролей при проведении ИФА использобались 2 пула донорских сывороток крови, состоящие из 120 и 80 образцов Обследованные больные по периодам сифилиса были распределены следующим образом (таблица 2) Максимальное количество больных приходилось на вторичные, а также на ранний скрытый периоды сифилиса Причем во вторичном рецидивном и раннем

скрытом периодах более 60% пациентов женского пола При первичном и вторичном свежем периодах заболевания преобладали мужчины

Таблица 1

Частота выделения микроорганизмов в группе пациентов с УГИ

(п = 1878)

Микроорганизм Моно-инфекция Микст-инфекция

Количество % Количество %

T vaginalis 620 33,0 126 6,7

N gonorrhoeae 29 1,5 1 0,05

С trachomatis 87 4,6 22 1,2

М hominis 151 8,0 34 1,8

U urealyticum 183 9,7 27 1,4

Candida spp 339 18,1 66 3,5

Вирус простого герпеса 1,2 типов 11 0,6 1 0,05

Условно-патогенная микрофлора 108 5,6 73 3,9

ВСЕГО 1528 81,1 350 18,9

В создании контрольных материалов для диагностики сифилиса были использованы сыворотки крови больных сифилисом, полученные в объемах 300-400мл Сыворотки больных были получены из предприятия по производству иммунобиологических препаратов при НИИ эпидемиологии и микробиологии им Пастера (Санкт-Петербург) Диагноз сифилиса у всех пациентов был установлен на основании анамнеза, данных клинического и лабораторного обследования, а также подтвержден положительными реакциями в стандартных серологических тестах Контрольную панель составляли 26 образцов сывороток пациентов, больных сифилисом и 2 образца сыворотки крови здоровых доноров

Для тестирования сывороток, входящих в контрольную панель, использовались следующие лабораторные методы быстрый плазмореагино-вый RPR-тест (Rapid Plasma Reagin test), гемагглютинационные тесты -стандартная РПГА и «Serodia ТР-РА» (Fujirebio, Япония), иммуноблоттинг с использованием тест-систем «recomBlot Treponema IgM» и «recomBlot Treponema IgG» («Microgen», Германия)

Таблица 2

Распределение обследованных больных в зависимости от периода сифилиса

Период заболевания Количество больных %

Мужчины Женщины

Вероятный инкубацион-период 10 4 5,7

Сифилис первичный (серонегативный и серопозитивный) 17 13 12,1

Сифилис вторичный свежий 28 41 27,9

Сифилис вторичный рецидивный 17 55 29,2

Сифилис скрытый ранний 19 35 21,9

Сифилис скрытый поздний 3 5 3,2

ВСЕГО 94 153 100

Для диагностики мочеполового трихомоноза использовались следующие лабораторные методы микроскопия нативного препарата (НП), микроскопия подкрашенного нативного препарата (ПНП), микроскопия фиксированного окрашенного мазка (ФОМ), микроскопия эякулята (МЭ), культуральный метод (КМ), полимеразная цепная реакция (ПЦР), иадму-ноферментный анализ (ИФА)

Микроскопию препаратов проводили в световом микроскопе «Мик-мед-5» (JIOMO, Россия) и микровизоре «|.iVizo-100» (ЛОМО, Россия) Для фазово-контрастной микроскопии, проведения дифференциально-интерференционного контраста (ДИК), микроскопии с дополнительным контрастированием ядра Т vaginalis использовали многофункциональный микроскоп «DMRXA» фирмы «Leica» (Германия)

Для культуральной диагностики трихомониаза использовались коммерческие и модифицированные питательные среды

Для диагностики микоплазмоза использовали жидкую питательную среду для культивирования и идентификации Mycoplasma hominis - «Ми-коплазма-50» производства НИИЭМ им Пастера, тест-систему «Mycoplasma System Plus» фирмы «Liofilchem» (Италия) и плотную питательную среду Хейфлика производства НИЦФ (Россия) Дополнительно для диагностики использовали метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) и ПЦР

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Методические подходы к процедуре контроля качества методов микробиологической диагностики ИПППП

В результате анализа существующих теоретических и практических аспектов контроля качества микробиологических исследований общая схема настоящего диссертационного исследования может быть представлена следующим образом (рисунок 1) В соответствии с дизайном исследования начальный этап работы заключался в изучении известных сведений о современном состоянии контроля качества в клинической лабораторной диагностике, микробиологической диагностики инфекционных заболеваний и, в том числе, ИПППП После завершения данного этапа исследования были охарактеризованы основные причины возникновения внутрита-бораторных ошибок микробиологической диагностики

Поскольку поиск маркеров инфекционных заболевании может быть осуществлен различными методами, в отношении каждого из инфекционных заболеваний возможно одновременное или последовательное использование нескольких методов Одновременно существует понятие об иерархичности методов диагностики, исходя из показателей достоверности, воспроизводимости, методической простоты, экономической рентабельности и быстроты получения результата (Сбойчаков В Б , Максимова Т Г ,2000) Приоритет любому методу микробиологической диагностики может быть отдан только на основании комплексной оценки всех его диагностических свойств. Наличие широкого спектра методов выявления ИПППП определило необходимость оценки их сравнительной эффективности Поэтому в решении задачи многокритериального выбора наиболее эффективного и актуального метода лабораторной диагностики трихомониаза, урогени-тального микоплазмоза и уреаплазмоза, сифилиса, гонореи и хламидиоза, использовались данные экспертных оценок полученных в результате анкетирования 84 врачей бактериологических лабораторий г Санкт-Петербурга, Ленинградской и Свердловской области, участвуюхцих в диагностике ИПППП Оценка критериев эффективности каждого из методов диагностики инфекции проводилась по 9-ти бальной шкале от 1 - минимального удельного веса данного показателя в выборе метода до 9 — максимального

После анализа методов диагностики ИПППП, в том числе при анкетировании специалистов практических лабораторий, были выбраны наиболее актуальные для практического использования Обобщение комплекса сведений о методах позволило определить ведущие из них применительно к каждой из инфекций Это позволило уделить внимание методам с наибольшей диагностической ценностью, не упуская ни одного из них

Рисунок 1

Схема диссертационного исследования

В дальнейшем в качестве объекта для контроля качества диагностики трихомониаза - был выбран метод микроскопии, микоплазмоза - культу-ральный метод, сифилиса - серологический метод Предполагалось, что отработанную систему контроля качества этих методов, в дальнейшем, можно применить для контроля диагностики любой другой патологии

В связи с вышеизложенным, теоретическое и экспериментальное обоснование методов контроля качества микроскопической диагностики проводилось на примере трихомониаза, культуралыюй диагностики на примере урогенитального микоплазмоза, серологической диагностики на примере сифилиса

Оптимизация процедуры контроля качества микроскопической диагностики трихомониаза

Информативность методов диагностики трихомониаза нами оценена в процессе обследования 75 мужчин и 62 женщин

Суммировав полученные результаты сравнительного изучения диагностической эффективности различных методов, мы пришли к следующим выводам А именно

- микроскопия нативного отделяемого из урогенитального тракта у женщин обладает наибольшей чувствительностью (96,2%) и специфичностью (94,4%) Микроскопия отделяемого из уретры у мужчин характеризуется низкой чувствительностью (47,4%) и специфичностью (22,2%)

- культуральный метод диагностики урогенитального трихомониаза у женщин имеет чувствительность 88,7% и специфичность 94,4% У мужчин наибольшей чувствительностью (87,7%) и специфичностью (100%) обладает культуральное исследование

- ПЦР, в случае исследования отделяемого из урогенитального тракта у мужчин и женщин, характеризуется невысокой чувствительностью (63,2% и 86,81%, соответственно) и специфичностью (27,8% и 33,3%, соответственно) и пригодна только в качестве вспомогательного метода диагностики мочеполового трихомониаза.

Полученные результаты подтверждают преимущества классических методов микробиологической диагностики трихомониаза, по сравнению с молекулярно-генетическими методами Условия, определяющие эффективность микроскопической диагностики как при исследовании нативного и фиксированного окрашенного клинического материала, так и при учете результатов культивирования, необходимо рассмотреть отдельно

Обращают внимание различия в диагностической информативности методов при обследовании мужчин и женщин В первую очередь это касается метода микроскопии

В таблицах 3 и 4 представлены данные о морфологической структуре возбудителя, опредетяемого в клиническом материале от мужчин и женщин

Таблица 3

Частота обнаружения различных морфологических форм Т. vaginalis у мужчин (п=271)

Методы исследования Частота обнаружения Т vaginalis (морфологическая форма)

Грушевидная Округлая

п % п %

Световая микроскопия нативного препарата 68 25,1 203 74,9

Световая микроскопия препарата, окрашенного метиленовым синим 57 21,0 0 0

Проведение микроскопической диагностики трихомониаза регламентируется рядом руководящих документов (Приказ МЗ №1570 от 4 декабря 1986 года, Лабораторная диагностика мочеполового трихомониаза в лечебных учреждениях МО РФ, 2001, Протокол ведения больных «Урогениталь-ный трихомониаз», 2005) При этом предполагается, что заключение о присутствии возбудителя может базироваться только на выявлении типичных (грушевидных) морфологических форм трихомонад

Таблица 4

Частота обнаружения различных морфологических форм Т. vaginalis у женщин (п=130)

Методы исследования Частота обнаружения Т vaginalis (морфологическая форма)

Грушевидная Округлая

п % п %

Световая микроскопия нативного препарата 112 86,2 18 13,8

Световая микроскопия препарата, окрашенного метиленовым синим 94 72,3 0 0

На сегодняшний день в литературе и методических рекомендациях отсутствуют четко сформулированное описание цитоморфологических признаков, необходимых для идентификации всех возможных морфологических форм Т vaginalis, различающихся на светооптическом уровне Таким образом, при проведении микроскопической диагностики трихомониаза возникает несколько проблемных вопросов Ряд из них связан с биологиеи и разнообразием морфологических форм трихомонад, а ряд - с ограничением возможности объективизации исследования

В конечном moie складывается парадоксальная ситуация используемые контрольные материалы позволяют дать оценку эффективности только микроскопии (микроскопия фиксированного окрашенного материала), которая на практике имеет минимальное значение, качество микроскопии натив-ного клинического материала и результатов культивирования трихомонад, имеющих наибольшее значение в доказательстве инфекции, в существующих схемах контроля не применяется

Одним из путей стандартизации микроскопической диагностики урогенитального трихомониаза является использование нового поколения микроскопических приборов, основанных на получении оцифрованных изображений (микровизоры), что позволяет повысить эффективность диагностики этого заболевания В результате использования цифровой микроскопической техники были созданы базы микрофотографий, в которых представлены все морфологические формы возбудителя трихомониаза

Оптимизация процедуры контроля качества культуральнон диагностики микоплазмоза

Для оценки диагностической эффективности питательных сред для культивирования урогенитальных микоплазм нами использовались ряд отечественных и зарубежных препаратов В большинстве своем применялись жидкие питательные среды, как наиболее распространенные на практике В качестве методов сравнения использовались ПИФ и ПНР

С учетом того, что возбудители урогенитального микоплазмоза, по мнению большинства ученых, относятся к условно-патогенным микроорганизмам, для оценки их этиологической значимости требуется количественное определение возбудителя в исследуемом материале (Раковская ИВ, Вульфович ЮВ, 1995, Семенов НВ и др, 2001, Дмитриев ГА, 2003, Gil-Juarez С et al, 1996, Baseman J В et al, 2004)

Анализ рекомендаций, содержащихся в инструкциях к основным отечественным и ведущим зарубежным тест-системам, позволяет прогнозировать нестандартизованность процедуры идентификации миконлазм, которая используется на практике

Определение этиологически значимой концентрации микоплазм в материале из урогенитального тракта (УГТ) определила необходимость проведения дальнейшего исследования С использованием жидких питатель-

ных сред были обследованы 874 пациента с подозрением на УГИ Из них в 79 случаях была выявлены М hominis в виде моноинфекции (34 - мужчины, 45 - женщины) Результаты микробиологической диагностики других УГИ (гонорея, хламидиоз, трихомониаз, неспецифические поражения УГТ, кандидоз) были отрицательными У всех обследованных выявлялись клинические проявления со стороны УГТ воспалительного характера, что позволяло говорить об этиологической роли микоплазм без анализа их количества в исследуемом материале Одновременно анализ результатов определения титра возбудителя показал, что в значительном числе проб его концентрация не превышает этиологически значимых значений (в соответствии с инструкциями) В то же время, при обследовании 60 лиц с неподтвержденным диагнозом УГИ в 22,7-23,7% случаев были выявлены концентрации микоплазм, способные вызвать развитие воспалительных процессов На наш взгляд, причиной данных противоречий является методика стандартного культуралыюго исследования, которая отличается низкой достоверностью В соответствии с данной методикой производится однократное разведение материала (1 100), засеянного в жидкую питательную среду, и при изменении цвета индикатора делается вывод о содержании микоплазм в концентрации 104 ЦОЕ и более

Надо отметить, что в инструкциях, в соответствии с которыми производится оценка результатов исследования, практически отсутствуют ссылки на литературные источники, определяющие порядок проведения культивирования микоплазм и не вполне ясна их обоснованность

Дальнейшие исследования были посвящены определению соотношения цветообразующих единиц (ЦОЕ) на жидких питательных средах и ко-лониеобразующих единиц (КОЕ) на плотных средах, являющихся информативными критериями оценки количества микроорганизмов в биолошче-ском материале.

Была разработана схема опыта по количественному выделению микоплазм на жидких и плотных питательных средах При этом определяли пороговые концентрации микоплазм, при которых еще происходило изменение цвета жидкой питательной среды при десятикратных разведениях исследуемого материала (т е определение титра) Результаты посева из пробирки с пороговой концентрацией микоплазм на плотную питательную среду и подсчет выросших колоний, позволяли определить соотношения ЦОЕ и КОЕ В качестве материала для исследования были использованы клинические изоляты М hominis выросшие на жидкой питательной среде «Микоплазма-50» (НИИЭМ им Пастера, Россия) Специфичность роста была подтверждена путем пересева материала на кровяной агар, плотную среду «Хейфлика» (НИЦФ) и исследования методом ПИФ

Оценку соответствия цветообразующих единиц колониеобразующим производили путем последовательного титрования исследуемого материала до концентрации Ю"10 Для выявления соответствия цветообразующих

единиц колониеобразующим из исходной пробирки осуществляли высев материала на чашки Петри, содержащие плотную питательную среду «Хейфлика» (НИЦФ) В каждой серии разведений клинического материала определяли последнюю и предпоследнюю изменившую цвет индикатора пробирку с жидкои питательной средой Для этих двух разведений производился учет колониеобразующих единиц Для этого производился просмотр чашек и подсчет типичных колонии микоплазм в виде «яичницы глазуньи», который начинали выполнять после 3 суток инкубации, окончательно учитывая их общее количество на 10 сутки На основании полученных данных формировали таблицы соответствия с использованием методик определения ЦОЕ и КОЕ Результаты культивирования представлены в таблице 5

Таблица 5

Результаты определения соотношения ЦОЕ и КОЕ

Титр в соответствии с результатом культивирования на жидкой питательной среде Количество проб в которых был обнаружен возбудитель в соответствующих титрах Количество колоний формирующихся на плотной среде Хейфлика в пересчете на 1 мл материала Соотношение ЦОЕ/КОЕ

<104 16 50-100 <104/<102

>104 12 200-300 >104/ >102 и<103

В результате проведенного эксперимента было установлено, что ми-коплазмы в концентрации 102 КОЕ и более способны изменить цвет жидкой питательной среды, а регламентированное методикой разведение в 10 раз позволяет определить концентрацию до 103 микробных клеток, что не соответствует общепринятому патогенному титру М hominis 104 Таким образом, возникают предпосылки для гипердиагностики урогенитального микоплазмоза, и необоснованного лечения

В рамках раздела «обеспечение качества культуральной диагностики микоплазмоза» проведена оценка существующих методических подходов к полуколичественнои интерпретации результатов

Поскольку в нашем исследовании было установлено несоответствие данных результатов диагностики микоплазмоза с использованием жидких питательных сред истинному содержанию микроорганизмов в материале

из УГТ, был сделан вывод о низкой эффективности определения количества М hominis

Недостатки такого рода можно избежать, перейдя от качественного определения возбудителя (<10^) к полуколичественному Было проведено изучение тест системы «Mycoplasma System Plus» (Liofilchem Diagnostics Италия) которая предназначена для полуколичесгвенного определения концентрации микоплазм и уреаплазм Набор позволяет выявлять в исследуемой пробе следующие концентрации возбудителя от 102 до 104, от 104 до 105, более 105 Доказано, что расширение спектра выявляемых концентраций, позволит избежать ошибок диагностики микоплазмоза

Таким образом, установлено улучшение качества диагностики уроге-нитального микоплазмоза с переходом на полуколичественную схему его диагностики

Оптимизация процедуры контроля качества серологической диагностики сифилиса

С целью исследования структуры и динамики иммунного ответа при сифилисе, направленного к основным антигенам возбудителя и представленного сывороточными антителами основных классов и подклассов, нами были обследованы 247 больных в различные периоды заболевания (14 - с вероятным инкубационным периодом, 30 - больных первичным сифилисом, 69 - вторичным свежим, 72 - вторичным рецидивным, 54 - ранним скрытым, 8 - поздним скрытым) В сыворотке крови каждого больного были исследованы антитела классов IgG, IgM, IgA и подклассов IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, специфичные антигенам 15, 17, 41 и 47 кД В ходе исследования мы предполагали выявить наиболее информативные ИФА-показатели

Наиболее часто в сыворотках крови больных сифилисом выявлялись антитела классов G и М, причем преобладающими фракциями IgG-иммуноглобулинов были IgGl и IgG3 При работе с антигеном 41 кД доля IgG3-положительных проб была особенно значима, а для антигенов 17 и 47 кД характерно сравнительно более частое обнаружение IgG4 подкласса иммуноглобулинов Анализ уровней антител IgGl подкласса, позволяет говорить о достоверном их повышении при увеличении сроков заболевания

Отмечается также повышение доли IgGl-положительных проб при обследовании больных с большими сроками заболевания (с 38,4-76,9% при первичном сифилисе до 100% при раннем скрытом и вторичном рецидивном периоде) Анализ частоты выявления IgG3 антител позволил определить большую вероятность их обнаружения во вторичный период сифилиса, что указывает на взаимосвязь данного показателя с остротой инфекционного процесса Максимальная частота обнаружения IgG4-ariTmea характерна для раннего скрытого и вторичного рецидивного сифилиса Успеш-

ность противотрепонемной терапии определяется по снижению уровня антител, к антигену 41 кД, уровень которых снижается значительно быстрее по сравнению с антигенами 15, 17 и 47 кД После лечения антитела IgG3 и IgM, специфичные трепонемным антигенам, элиминируются в течении трех месяцев Позитивность результатов ИФА с трепонемными липопро-теинам в более поздние сроки обусловлена антителами IgGl подкласса

Таким образом, полученные данные подтверждают сведения о разнообразии результатов серологической диагностики, как при естественном течении сифилиса, так и при проведении эффективной терапии Все это указывает на необходимость создания контрольного набора сывороток с нормированным содержанием антител класса G, представленных различными субизотипами, а также класса М к антигенам pi 5, р17, р41 и р47 Treponema pallidum, максимально отображающего особенности гуморального ответа при сифилисе

Тестированные с помощью ИФА образцы из состава контрольной панели сывороток крови распределились следующим образом 19 положительных сывороток с высоким содержанием антител к трепонемным антигенам молекулярной массы 15 кД, 17 кД, 41 кД и 47 кД, 5 сывороток с низким содержание антител, которые можно охарактеризовать как слабоположительные и 2 отрицательные сыворотки, использованные для расчета коэффициента позитивности При титровании имеющихся сывороток были получены образцы, в которых определялись антитела к одному или двум трепонемным антигенам

Использование предлагаемой контрольной панели сывороток позволит выполнять контрольные мероприятия на различных этапах подготовки и проведения лабораторного анализа

На этапе создания тест системы производитель сможет обеспечить дифференцированный контроль достаточной нагрузки планшетов антигенами и эквивалентности соотношения антител в конъюгате

Полученный набор аттестованных сифилитических сывороток, можно также рекомендовать для всесторонней оценки качества всех методов серологической диагностики сифилиса, применяемых в практических лабораториях

Потребитель перед использованием тест системы сможет проверить или подтвердить (при наличии соответствующей информации) ее антигенный состав и, в зависимости от этого дифференцированно подходить к интерпретации результатов исследования Проверка показателей чувствительности и специфичности новых серий тест-систем для диагностики сифилиса может быть выполнена силами лаборатории При регулярном ведении внутрилабораторного контроля качества методов серологической диагностики сифилиса референс-панель может быть использована для оценки внутрисерийной воспроизводимости измерений - способности да-

вать устойчиво стабильный результат при многократном тестировании одного и того же образца

При помощи авторской панели сывороток была проведена оценка эффективности скринингового агглютинационного метода серологической диагностики сифилиса на примере ТРРА и диагностического метода на примере иммуноблоттингового исследования с использованием тест-сисгем «recomBlot Treponema IgM» и «recomBlot Treponema IgG»

Набор «Serodia ТР-РА» предназначен для исследования сыворотки или плазмы крови человека в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений с целью выявления специфических антител к возбудителю сифилиса (скрининг населения или в качестве подтверждающей реакции) Для оценки чувствительности диагностического набора были использованы 24 положительные сыворотки тест-панели Специфичность диагнос гического набора «Serodia ТР-РА» оценивалась с использованием следующих групп сывороток крови от здоровых доноров (10 проб), больных лептоспирозом (8 проб), больных иксодовым клещевым боррелиозом (9 проб), больных инфекционным мононуклеозом (2 пробы) и лиц с неспецифическими положительными результатами в тестах с кар-диолипиновым антигеном (5 проб) Для суммарной оценки диагностической эффективности набора «Serodia ТР-РА» использовали общепринятую четырехпольные таблицы сопряженности Исходя из данных таблицы рассчитывались чувствительность и специфичность При сравнении частотных величин пользовались биноминальным тестом и точным методом Фишера для четырехпольных таблиц Результаты исследований представлены в таблице 6

Высокие итоговые показатели чувствительности (98,5-100%) и специфичности (98,5-100%) диагностического набора «Serodia ТР-РА» позволяют рассматривать возможность его использования, как для скрининга, так и для подтверждения диагноза

Таблица 6

Результаты расчета диагностической эффективное ги набора «Serodia ТР-РА»

В результате тестирования в ТР-РА признаны Фактически являются

Больными (п=24) Здоровыми (п=34)

Больными 24 0

Здоровыми 0 34

Одним из современных методов серодиагностики сифилиса является метод иммуноблотинга (Western blot), предполагающий выявление антител сразу к нескольким иммунодетерминантам возбудителя, созданных генно-инженерными методами В литературе присутствуют данные о применении Western blot за рубежом (Meyer MP et al, 1994, George R et al, 1998, Backhouse J L , Nesteroff S 1, 2001), в которых упоминается о его высокой чувствительности, специфичности и возможности применения как рефе-ренс-метода в серодиагностике сифилиса

Отечественные работы по результатам использования этого метода для дианюстийи сифилиса отсутствуют, что делает невозможным его широкое применение Поэтому с целью оценки диагностических возможностей метода иммуноблоттинга для серодиагностики сифилиса, разработки показаний к его применению, а также контроля метода при помощи авторской панели сывороток были исследованы коммерческие наборы «recom-Blot Treponema IgM» и «recomBlot Treponema IgG» фирмы «Microgen» (Германия)

Диагностическая возможность метода по выявлению специфических IgG была исследована на основании тестирования 14 сывороток крови больных с подозрением на сифилитическую инфекцию, которые были протестированы при помощи RPR-теста и ТРРА, согласно общепринятым методикам

По результатам исследования тест-систему «recomBlot Tieponema IgG» можно охарактеризовать как простую в применении, содержащую компоненты реакций, способствующие четкой визуализации результатов, и имеющую простые критерии их интерпретации Проведенное исследование показало, что использование этой тест-системы позволяет более чем в 6 раз уменьшить количество неопределенных результатов получаемых с помощью трепонемных (ТРРА) и нетрепонемных (RPR) тестов Раздельное выявление антител к основным трепонемным антигенам и четкая схема интерпретации получаемых результатов, позволяют снизить количество ложноположительных ответов, получаемых в трепонемных тестах выявляющих антитела к «суммарному» антигену возбудителя (РПГА, ИФА) Все это позволяет рассматривать тест-систему «recomBlot Treponema IgG» как перспективную для подтверждения наличия иммуноглобулинов G против Tieponema pallidum в образцах сыворотки или плазмы крови человека

Способность выявлять IgM была оценена по результатам тестирования 26 образцов авторской панели сывороток Анализ полученных данных позволяет выявить расхождение результатов тестировании некоторых сывороток панели методом ИФА и при использовании «recomBlot Treponema IgM» Наиболее частым различием (в 8 образцах из 26) является выявление положительных результатов в ИФА и отсутствие реакций с этими антигенами при постановке иммунного блотта Более высокую чувствительность ИФА можно объяснить суммарно большей сорбционной поверхно-

стыо твердой фазы (лунки иммунологического планшета), вступающей в иммунохимическую реакцию и, как следствие, наличием большего количества сайтов связывания специфических антител

Анализируя полученные экспериментальные данные можно сделать заключение о перспективности использования иммуноблоттингового исследования для серодиагностики сифилиса Метод обладает рядом преимуществ перед выполняемым в большинстве учреждений, рутинным ИФА Спектр диагностических возможностей лаборатории использующей в своей практике метод раздельного выявления антител к основным антигенам Т pallidum может быть существенно расширен Можно предположить, что в скором времени данный трепонечный тест будет принят в качестве рутинного метода диагностики сифилитической инфекции Это, в свою очередь, потребует разработки дополнительных контрольных материалов, охарактеризованных по наличию антител к наиболее иммуноген-ным трепонемным антигенам Используя авторскую контрольную панель сывороток с нормированным содержанием иммуноглобулинов класса М и подклассов иммуноглобулинов G, направленных к антигенам 15кД, 17кД, 41кД и 47кД возбудителя сифилиса, возможно проведение всех этапов контроля процесса производства и использования тест-систем данного типа

ВЫВОДЫ

1 Современное состояние контроля качества внутрилабораторного этапа микробиологической диагностики ИПППП характеризуется отсутствием общепринятой стандартизации основных этапов и методов, в том числе микроскопического, культурального и серологического

2 Одним из путей стандартизации микроскопической диагностики урогенитального трихомониаза является использование нового поколения микроскопических приборов, основанных на получении оцифрованных изображений (микровизоры) Контрольные материалы для оценки качества микроскопической диагностики трихомониаза должны представлять все морфологические формы возбудителя

3 Одним из источников ошибок при количественной оценке результатов культивирования М hominis является несоответствие между реальным содержанием возбудителя в исследуемом материале и рекомендациями по интерпретации этих данных, использующимися на практике Адекватная оценка этиологически значимых концентраций возбудителя возможна только при предварительной внутрилабораторной характеристике ростовых свойств питательных сред с использованием типовых штаммов мик-poopi анизмов

4 Инфекционно-иммунологическими особенностями сифилиса является отличие спектра и антигенной направленности антител в зависимости от длительности заболевания и этапа специфического лечения Панели сывороток, для контроля качества серологической диагностики сифилиса, должны быть охарактеризованы по содержанию и уровням антител к антигенам 15, 17,41 и 47 кД

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Для контроля качества микроскопической диагностики трихомониа-за целесообразно использовать базы цифровых микрофотографий, содержащих изображения всех возможных морфологических форм Т vaginalis

2 Культуральной диагностике урогенитального микоплазмоза должно предшествовать внутрилабораторное определение ростовых свойств питательных сред с использованием типовых охарактеризованных штаммов М hominis

3 Для культуральной диагностики с определением диагностически информативного количества возбудителя необходимо использовать схемы посева, предполагающие исследование не менее трех последовательных разведений биологического материала

4 Оценка качества серологической диагностики сифилиса должна проводиться наборами контрольных сывороток, в которых определены уровни подклассов иммуноглобулина G и иммуноглобулинов класса М специфичных трепонемным антигенам с молекулярной массой 15, 17, 41 и 47 кД

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ IIO ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Иванов А М Способы повышения чувствительности детекции IgM -антител к возбудителям инфекционных заболеваний / А М Иванов, Н В Фриго, М В Сердюцкая, Е В Ходосевич, С В Ротанов, Т В Гупалова, И Н Теличко А Б Криворучко // Труды Всерос. науч конференции «Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций» - СПб, ВМедА, 2005 -С 162-163

2 Иванов А М Использование наноалмазов в конструировании тестов для диагностики сифилиса / А М. Иванов, И В Шугалей, В В Тофтунова, А Б Криворучко, А Г Мешандин // Материалы Рос науч -практ конф , посвящ 110-летию кафедры инфекционных болезней ВМедА им СМ Кирова «Инфекционные болезни проблемы здравоохранения и военной медицины» - СПб, ВМедА, 2006 -С 133

3 Гаврилова О В Ультраструктурные особенности различных морфо-типов влагалищных трихомонад / О В Гаврилова, А М Иванов, Н В Раз-

дольская, И Н Теличко, Р А Раводин, Е В Ходосевич, А Б Криворучко // Материалы Рос иауч -практ коиф , посвящ 110-летию кафедры инфекционных болезней ВМедА им С М Кирова «Инфекционные болезни проблемы здравоохранения и военной медицины» - СПб, ВМедА, 2006 - С 71-72

4 Змеева Т А Влияние лекарственного препарата ЭСЕНЦИАЛЕ на результаты нетрепонемного теста для диагностики сифилиса /ТА Змеева, А Б Криворучко // Материалы итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов I факультета - СПб , ВМедА, 2006 -С 84

5 Теличко И Н Цитоморфологические особенности Т vaginalis / И Н Теличко, А М Иванов, А Б Криворучко, О В Гаврилова, Е В Ходосевич // Материалы IV науч -практ конф памяти проф А Л Машкилейсона - М,

2006 -С 143-144

6 Теличко И Н Использование иммуноферментного анализа в диагностике мочеполового трихомониаза / И Н Теличко, А М Иванов, А Б Криворучко, О В Гаврилова, Е В Ходосевич // Материалы IV науч -практ конф памяти проф АЛ Машкилейсона -М,2006 -С 145-146

7 Теличко И Н Современные диагностические аспекты мочеполового трихомониаза / И Н Теличко, Р А Раводин, А М Иванов, IIВ Раздоль-ская, А Б Криворучко // Вестник Российской Военно-медицинскои академии - 2006 - №2 - С. 60-63

8 Теличко И Н Современный взгляд на микроскопический метод диагностики мочеполового трихомониаза / И Н Теличко, А М Иванов, Н В Раздольская, А Б Криворучко // Клинич дерматология и венерология -

2007 - №2 - С 28-32

9 Иванов А М Сравнительная характеристика питательных сред для культивирования Т vaginalis / А М Иванов, Н В Раздольская, И Н Теличко, В Н Вербов, А Б Криворучко // Материалы IX съезда ВНПОЭМП «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения РФ» -ТЗ -М, Санэпидмедиа, 2007 - С 36-37

10 Иванов AM Дифференциальная диагностика серорезистентно-сти при сифилисе у беременных / А М Иванов, М В Сердюцкая, А Б Криворучко, Н В Раздольская // Материалы IX съезда ВНПОЭМП «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения РФ» -ТЗ -М , Санэпидмедиа,2007 -С37-38

11 Теличко ИН Клинико-микробиологические особенности трихомониаза в современных условиях / И Н Теличко, А М Иванов, Н В Раздольская, А Б Криворучко // Материалы науч -практ конф «Актуальные вопросы диагностики и терапии трудноизлечимых заболеваний кожи» -СПб, 2007 - С 81-82

12 Иванов AM Серологическая диагностика нейросифилиса / AM Иванов, М В Сердюцкая, И Н Теличко, А Б Криворучко, Ф А Овсянни-

ков // Аннотированные доклады 1-ой национальной конференции с международным участием «Нейроинфекции», М , 2007 - С 50-53

13 Теличко ИН Микробиологическая характеристика хронического трихомониаза в современных условиях / И Н Теличко, А М Иванов, Н В Раздольская, Е В Ходосевич, А Б Криворучко, Д В Заславский // Вестник Российской Военно-медицинской академии -2007 - №1, Приложение Ч 1 -С 453

14 Теличко ИН Способ определения чувствительности Т vaginalis к метронидазолу / И Н Теличко, А М Иванов, Н В Раздольская, А Б Криворучко, Д В Заславский // Вестник Российской Военно-медицинской академии -2007 -№1,ПриложениеЧ 1 -С 454

15 Сердюцкая М В Проблемы интерпретации результатов серологического тестирования на сифилис / М В Сердюцкая, А М Иванов, А Б Криворучко, Ф А Овсянников // Вестник Российской Военно-медицинской академии -2007 — № 1, Приложение Ч 1 - С 455

16 Криворучко А Б Современные подходы к разработке контрольных материалов для диагностики сифилиса методом иммуноферментного анализа / А Б Криворучко, М В Сердюцкая, А М Иванов, Ф А Овсянников // Вестник Российской Военно-медицинской академии - 2007 - №1, Приложение Ч 1 - С 456

17 Раздольская HB Изучение ультраструктурной организации вирулентных форм Trichomonas vaginalis I HB Раздольская, OB Гаврилова, И Н Теличко, А М Иванов, А Б Криворучко // Рос биомед журн Medline ru (www medline ru) -2007 -T8,№7 -C 283-291

18 Razdolskaya N Peculiarity of the clinical isolates of Trichomonas vaginalis / N Razdolskaya, O Gavrilova, A Ivanov, I Telichko, A Krivoruchko // Protistology An International Journal -2007 -Vol5,№l -P 66

19 Теличко ИН Перспективы серологической диагностики трихомоноза / И Н Теличко, А М Иванов, Н В Раздольская, А Б Криворучко // Лабораторная диагностика Terra Medica -2007 -№3 - С 18-21

20 Криворучко А Б Методические подходы к созданию системы контроля качества микробиологической диагностики ИППП / А Б Криворучко, А М Иванов, В Б Сбойчаков // Материалы межрегиональной науч -практ конф IV Кирилло-Мефодиевские чтения «Проблемы науки и практики» - Луга, 2007 - Ч 1 - С 250-253

21 Раздольская HB Значение микроскопического и культуралыюго методов в диагностике трихомоноза / HB Раздольская, ИН Теличко, А М Иванов, А Б. Криворучко // Материалы юбил. Рос науч. конф с международным участием, посвящ 175-летию со дня рождения С П Боткина - СПб, ВМедА, 2007 - С 283

22 Криворучко А Б Методологические подходы к созданию системы контроля качества микробиологических исследований / А Б Криворучко, М В Сердюцкая, Ф А Овсянников, Н В Раздольская, А М Иванов // Ма-

териалы юбил Рос науч конф с международным участием, носвящ 175-летию со дня рождения С П Боткина - СПб, ВМедА, 2007 - С 288-289

23 Сердюцкая MB Микробиологические аспекты профилактики врожденного сифилиса / MB Сердюцкая, AM Иванов, А Б Криворучко, Ф А Овсянников, Т В Гупалова // Материалы юбил Рос науч конф с международным участием, посвящ 175-летию со дня рождения С П Боткина - СПб, ВМедА, 2007 - С 351

24 Раздольская Н В Новый подход к повышению информативности серологической диагностики трихомоноза / Н В Раздольская, И Н Теличко, AM Иванов, А Б Криворучко // Вестник Российской Военно-медицинской академии -2008 -№2,ПриложениеЧ 1 -С 190

25 Криворучко А Б Особенности формирования контрольной панели сывороток для диагностики сифилиса методом ИФА / А Б Криворучко, М В Сердюцкая, А М Иванов, Ф А Овсянников, В Б Сбойчаков, В Н Вербов // Вестник Российской Военно-медицинскои академии - 2008 -№2, Приложение Ч 1 -С 191

26 Раздольская Н В Особенности ультраструктурной организации вирулентных форм Trichomonas vaginalis / Н В Раздольская, О В Гаврилова, А М Иванов, И Н Теличко, А Б Криворучко, В А Андреев // Труды научно-исследовательского центра Военно-медицинской академии им СМ Кирова Актуальные вопросы профилактической медицины - СПб, ВМедА, 2008 -вып II - С 71-81

27 Раздольская Н В Патогенность Trichomonas vaginalis в экспериментах m vitro / Н В Раздольская, JIФ Литвинчук, А М Иванов, А Б Криворучко, О В Гаврилова, И Н Теличко, В Н Теличко // Материалы международной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ им Пастера и 120-летию Парижского института Пастера - СПб, НИИЭМ, 2008 - С 68

Формат 60x84 '/16 Заказ № 569_

Подписано в печать 08 07 08

Объем I пл_Тираж 100 экз

Типография ВМедА, 194044, СПб , ул Академика Лебедева, б

Актуальность проблемы. Интерес к методам этиологической лабораторной диагностики инфекций, передаваемых преимущественно половым путем (ИГШ1Ш), в последние годы неуклонно возрастает. Это связано с широким распространением, ростом заболеваемости, а также с социальным и экономическим ущербом, которые всегда сопутствуют данной группе инфекционной патологии (Савичева A.M., 2004; Дмитриев Г.А., 2005; Иванов A.M., 2005; Borïsenko К.К. et al., 1999; Majeroni B.A., 2007).

Микробиологическая диагностика И111ШП вышедшая в последнее десятилетие на качественно более высокий уровень, позволила перенести основную массу исследований из специализированных научно-исследовательских центров в лаборатории практического здравоохранения (Никулин Н.К., 1999; Аковбян В.А. и др., 2007). Вместе с тем, сложилась парадоксальная ситуация: с одной стороны появились перспективные, доступные и воспроизводимые методы, позволяющие подтвердить этиологию заболевания, с другой — возникли трудности с регламентацией проведения исследований и отсутствием способов управления процессом лабораторной диагностики путем выявления и предотвращения возможных ошибок (Меньшиков В.В., 2003; Рищук C.B., Костючек Д.Ф., 2005; Хоровская J1.A., 2007).

В дерматовенерологической службе России в силу разноплановости методологических подходов, разнообразия проводимых исследований, различного уровня квалификации исследователей, отсутствия необходимого контроля на разных стадиях процесса анализа высока вероятность получения недостоверных результатов, что негативно отражается на выборе средств и схем лечения ИШ11111 (Бойцов А.Г. и др., 2000).

При выборе метода этиологической диагностики урогенитальной инфекции, оптимального для применения в условиях конкретной диагностической лаборатории на первый план выдвигаются проблемы технического и экономического характера, а вопросы организации контроля качества, как правило, считаются второстепенными (Васильев М.М., 1998; Дмитриев Г.А., 2003).

Однако в настоящее время систематическая оценка качества выполняемых лабораторных исследований признана неотъемлемой составляющей диагностического процесса (Приказ МЗ РФ №45, 2000; Назаренко Г.И., Кишкун А.А, 2001; Мош-кин A.B., Долгов В.В., 2004, Manual of Clinical Microbiology, 7 ed., 1999). Для большинства методов, используемых в лабораторной диагностике, требования к аналитическому качеству регламентированы руководящими документами (Гаранина E.H., 1997; Заикин Е.В. и др., 2000; Карпищенко А.И., Грашин P.A., 2001; Кишкун A.A., 2004).

Несмотря на то, что лаборатории принадлежит одна из ведущих ролей в установлении диагноза ИПППП, обеспечение качества исследований, подразумевающее широкий спектр процедур, начиная с контроля качества оборудования и реагентов, ведения внутрилабораторного контроля и заканчивая проверкой клинической значимости результатов анализов на сегодняшний день, не осуществляется в полном объеме (Кудрявцева М.Б., 2000; Дмитриев Г.А., 2005).

В условиях сохранения неблагоприятной эпидемиологической обстановки по заболеваемости ИПППП в Российской Федерации приоритетной задачей является проведение качественной диагностики этих заболеваний, что подразумевает разработку стандартизованной системы контроля качества работы лабораторий, занимающихся диагностикой ИПППП (Фриго Н.В. и др., 2004).

Существующая на данный момент система мониторинга качества диагностики урогенитальных инфекций предполагает обязательное участие КДЛ в программах федеральной системе внешней оценки качества ФСВОК, а также проведение внутрилабораторного контроля (Залесских Н.В., и др., 2004). Оценка качества диагностики ИПППП микроскопическим и серологическим методами осуществляется путем применения набора контрольных образцов - панельного тестирования.

В качестве контрольных образцов для оценки микроскопического метода диагностики ИПППП используются наборы микрофотографий, просматривая которые микроскопист должен сделать вывод о наличии или отсутствии в них возбудителя инфекции. Результаты данной диагностики сравниваются с заключением экспертной группы (Малахов В.Н., и др., 2002). Существующие на данный момент контрольные образцы, по мнению многих авторов, обладают рядом недостатков (Зурочка A.B., Чукичев A.B., 2000; Егорова О.В., 2004). Коллекции не включают все описанные морфологические формы возбудителей, не используются все методики окраски, применяющиеся на практике. Также недостатком является возможность контроля только метода микроскопии в проходящем свете. Отсутствует алгоритм позволяющий использовать новую микроскопическую технику, обладающую дополнительными средствами визуализации изображения, в качестве средства для улучшения и контроля качества микроскопической диагностики И11111111 (Колупаев В.Е., 2000).

Контроль качества серологических методов диагностики ИПППП осуществляется посредством использования наборов (панелей) сывороток. В настоящее время отсутствуют официально утвержденные панели сывороток для контроля диагностики урогенитальных инфекций. Имеющиеся наборы представляют высокотит-ражные сыворотки с неизвестными критериями подбора, которые не охарактеризованы по наличию антител к наиболее иммуногенным антигенам возбудителя (Фри-го Н.В., и др., 2004).

Для контроля бактериологических методов диагностики урогенитальных инфекций метод панельного тестирования не применяется. Основными задачами системы мониторинга качества в этом случае является оценка качества питательных сред, и совершенствование интерпретации полученных исследований. Наименее отработаны данные принципы в культуральной диагностике условно-патогенных ИПППП требующих полуколичественного учета (Дмитриев Г.А., 2005). Поэтому требуется создание и внедрение в практику правил внутрилабораторного контроля качества бактериологических методов, предполагающих определение количества возбудителя в исследуемой пробе.

В этой связи возникает настоятельная необходимость совершенствования и внедрения в практику методов контроля качества ИПППП.

Все вышеизложенное и предопределило цель и задачи настоящего диссертационного исследования.

Цель работы: усовершенствовать методы контроля качества микробиологической диагностики инфекций, передаваемых преимущественно половым путем.

Задачи исследования.

1. Оценить состояние контроля качества внутрилабораторного этапа микробиологической диагностики ИПППП в современных условиях.

2. Оценить возможности стандартизации микроскопической диагностики уро-генитального трихомониаза и обосновать основные требования к контролю качества.

3. Определить возможные источники ошибок при проведении культуральной диагностики урогенитального микоплазмоза и обосновать методические подходы к повышению эффективности контроля качества при выявлении Mycoplasma hominis.

4. На примере сифилиса обосновать методы контроля качества серологической диагностики ИПППП.

5. Обосновать алгоритмы проведения внутрилабораторного контроля качества микробиологической диагностики ИПППП.

Научная новизна исследования.

Показаны преимущества микроскопической диагностики трихомониаза с помощью принципиально новых оптических приборов - микровизоров, основанных на получении цифрового микроизображения. Впервые предложена серия микропрепаратов, с помощью которых возможно проведение контроля качества микроскопической диагностики трихомониаза с учетом всех, используемых на практике методов, наиболее значимых биологических материалов и атипичных морфологических вариантов возбудителя.

Продемонстрирована взаимосвязь между данными культуральной диагностики урогенитального микоплазмоза при использовании жидких и плотных питательных сред. Обоснована процедура внутрилабораторной оценки диагностической эффективности питательных сред, повышающая точность выявления этиологически значимых концентраций возбудителя.

На примере сифилиса показано, что разработке панелей сывороток, для контроля серологической диагностики, должны предшествовать исследования особенностей образования и динамики специфических антител. Установлено, что контрольные материалы должны быть охарактеризованы по содержанию антител ко всему спектру видоспецифичных микробных антигенов.

Практическая значимость.

Обоснованы предложения по разработке контрольных материалов и к самой процедуре оценки качества микробиологической диагностики ИПППП.

Систематизированы и предложены комплексы организационных мер в виде алгоритмов, позволяющих выявлять диагностические ошибки, и проводить целенаправленные действия, сводящие их возникновение к минимуму.

Разработанные контрольные материалы, в том числе, для оценки микроскопической и серологической диагностики, могут использоваться в условиях практических лабораторий.

Личное участие автора в получении результатов. Автором научно обоснована методология исследования, проанализированы результаты микроскопических, культуральных и серологических тестов, разработаны контрольные материалы для оценки качества микробиологической диагностики ИПППП, создан алгоритм поиска и устранения внутрилабораторных причин дефектов лабораторной диагностики

Автор лично планировал исследования, принимал непосредственное участие в микробиологическом обследовании больных, организовывал и участвовал в проведении всех видов анализа, а также осуществлял контроль качества методов диагностики. Автором лично формировалась база данных, проводилась их статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Применение стандартных, всесторонне охарактеризованных контрольных материалов - важное условие эффективной и достоверной микробиологической диагностики ИПППП.

2. Разработанные материалы для контроля качества микроскопического, куль-турального и серологического методов позволяют повысить эффективность и достоверность диагностики ИПППП.

Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научную, учебную и лечебно-диагностическую работу кафедры и клиники кожных и венерических болезней, кафедры микробиологии, научно-исследовательского отдела передовых медико-биологических технологий ВМедА им. С.М. Кирова, СПб ГУЗ «КВД №4» и ГУЗ «Областного КВД» (С.-Петербург).

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Санкт-Петербургского общества дерматовенерологов им. В.М. Тарновского (С.-Петербург, 2006, 2008) и Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им И.И. Мечникова (С.-Петербург, 2007); 40-й научно-практической конференции дерматовенерологов и врачей смежных специальностей Санкт-Петербурга «Актуальные проблемы дерматовенерологии. Контроль и профилактика инфекций, передающихся половым путем» (С.Петербург, 2005); научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (С.-Петербург, 2006); социальном форуме «Югра - территория здоровья» (Ханты-Мансийск, 2007); 2-ой Российской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2007); 1-ой Национальной конференции с международным участием «Нейроинфекции» (Москва, 2007); XI Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С.-Петербург, 2007); V Европейском конгрессе по протистологии и XI Европейской конференции по биологии беспозвоночных (С.-Петербург, 2007); научно-практической конференции «Актуальные вопросы этиологической диагностики инфекционных заболеваний» (Екатеринбург, 2008).

По материалам исследования опубликовано 27 печатных работ, из которых 9 в реферируемых журналах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 226 страницах компьютерного набора, состоит из введения, 5 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований), заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и указателя литературы, включающего 258 источников, в том числе 167 отечественных и 91 зарубежных. Текст содержит 42 таблицы и 14 рисунков.

ВЫВОДЫ

1. Современное состояние контроля качества внутрилабораторного этапа микробиологической диагностики ИПППП характеризуется отсутствием общепринятой стандартизации основных этапов и методов, в том числе микроскопического, культурального и серологического.

2. Одним из путей стандартизации микроскопической диагностики урогени-тального трихомониаза является использование нового поколения микроскопических приборов, основанных на получении оцифрованных изображений (микровизо-ры). Контрольные материалы для оценки качества микроскопической диагностики трихомониаза должны представлять все морфологические формы возбудителя.

3. Одним из источников ошибок при количественной оценке результатов культивирования М. hominis является несоответствие между реальным содержанием возбудителя в исследуемом материале и рекомендациями по интерпретации этих данных, использующимися на практике. Адекватная оценка этиологически значимых концентраций возбудителя возможна только при предварительной внутрила-бораторной характеристике ростовых свойств питательных сред с использованием типовых штаммов микроорганизмов.

4. Инфекционно-иммунологическими особенностями сифилиса является отличие спектра и антигенной направленности антител в зависимости от длительности заболевания и этапа специфического лечения. Панели сывороток, для контроля качества серологической диагностики сифилиса, должны быть охарактеризованы по содержанию и уровням антител к антигенам 15, 17, 41 и 47 кД.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для контроля качества микроскопической диагностики трихомониаза целесообразно использовать базы цифровых микрофотографий, содержащих изображения всех возможных морфологических форм Т. vaginalis.

2. Культуральной диагностике урогенитального микоплазмоза должно предшествовать внутрилабораторное определение ростовых свойств питательных сред с использованием типовых охарактеризованных штаммов М. hominis.

3. Для культуральной диагностики с определением диагностически информативного количества возбудителя необходимо использовать схемы посева, предполагающие исследование не менее трех последовательных разведений биологического материала.

4. Оценка качества серологической диагностики сифилиса должна проводиться наборами контрольных сывороток, в которых определены уровни подклассов иммуноглобулина G и иммуноглобулинов класса М специфичных трепонем-ным антигенам с молекулярной массой 15, 17, 41 и 47 кД.