Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Совершенствование методов иммунодетекции НВsАg - мутантов вируса гепатита В
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.00.36
Оглавление диссертации Баженов, Алексей Иванович :: 2009 :: Москва
ОГЛАВЛЕНИЕ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1 Общая характеристика ВГВ.
1.1 Молекулярная организация генома ВГВ.
1.2 Белки внешней оболчки ВГВ.
1.3 Строение и свойства «а» - детерминанты ВГВ.
2 Генетическая и серологическая вариабельность ВГВ.
2.1 Генотипы и серотипы ВГВ.
2.2 Природная и индуцированная гетерогенность ВГВ, классификация мутантов ВГВ.
2.3 Мутанты S-гена.
3 Проблема иммунологического, вакцинного и диагностического бегства ВГВ, обусловленного мутациями в S-гене.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
4 Материалы.
4.1 Клинический материал.
4.2 Диагностические тест-системы и контрольные материалы.
4.3 Конъюгаты моноклональных и поликлональных антител.
5 Методы исследования.
5.1 Поиск вариантов HBsAg с атипичными серологическими свойствами.
5.2 Изучение серологических свойств атипчных вариантов HBsAg при помощи панели анти-HBsAg конъюгатов.
5.3 Двойная иммунодиффузия в геле (ДИД).
5.4 Генетические методы.
5.5 Тестирование панели сывороточных образцов, содержащих мутантные вариантны HBsAg.
5.6 Статистические методы.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
6 Алгоритм поиска и серологический анализ HBsAg-вариантных сывороток.
6.1 Теоретическое обоснование и описание алгоритма поиска HBsAg-мутантов у носителей ВГВ.
6.2 Эмпирический подбор величины ИМР.
6.3 Результаты серологического поиска HBsAg-мутантов ВГВ.
6.4 Лабораторно-диагностическая характеристика HBsAg-вариантных сывороток.
6.5 Сравнительный анализ серологических особенностей HBsAg-вариантных сывороток при помощи панели анти-HBsAg конъюгатов.
6.6 Реакция моноклональных aHTH-HBsAg-K0iibi0raT0B со случайно взятыми HBsAg-позитивньгми сывороточными образцами.
7 Генетический анализ HBsAg-вариантных сывороток.
7.1 Анализ нуклеотидной последовательности ДНК изолятов ВГВ, содержащихся в HBsAg-вариантных сыворотках. Выявление мутаций в S-гене.
7.2 Определение генотипов и субтипов ВГВ.
7.3 Сопоставление данных генетического и серологического анализа выявленных HBsAg-мутантов ВГВ.
8 Эпитопное картирование HBsAg мутантного и «дикого» типа методом конкурентного анализа.
9 Серологическое «портретирование» эпитопных модификаций HBsAg по дефектам распознавания нативных и рекомбинантных вариантов HBsAg моноклональными анти-HBsAg конъюгатами
9.1 Серологические «портреты» HBsAg «дикого» типа.
9.2 Серологический портрет нативных HBsAg-мутантов G145R.
9.3 Серологический «портрет» нативных HBsAg- мутантов S143L.
9.4 Серологический «портрет» рекомбинантных пептидов HBsAg-мутантов ВГВ.
9.5 Оценка серологических различий между HBsAg мутантного и «дикого» типа.
10 Взаимодействие различных вариантов HBsAg и анти-HBsAg антител, индуцированных вакцинацией против гепатита В или ВГВ-инфекцией.
10.1 Разработка методики сравнительной оценки способности анти-HBs антител взаимодействовать с различными вариантами HBsAg.
10.2 Применение теста нейтрализации для оценки способности поствакцинальных антител взаимодействовать с различными вариантами HBsAg.
11 Диагностические и эпидемиологические результаты применения алгоритма поиска HBsAg-мутантов.
11.1 Использование контрольной панели сывороточных образцов, содержащих HBsAg мутантов ВГВ, для оценки чувствительности диагностических тест-систем для иммунодетекции HBsAg.
11.2 Создание тест-системы для серологического выявления HBsAg-мутантов, основанной на двух МАТ анти-HBsAg конъюгатах 11F3 и Н2.
11.3 Оценка распространенности серологически значимых мутаций HBsAg в московском регионе.
ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Баженов, Алексей Иванович, автореферат
Актуальность проблемы
Гепатит В до настоящего времени является чрезвычайно актуальной медицинской проблемой в общемировом масштабе. Считается, что до 40% глобальной популяции людей контактировали с ВГВ. Ежегодно фиксируется до 50 миллионов случаев острого гепатита В, а от исходов и осложнений гепатита В (фульминантный гепатит, цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома) умирает до 1 миллиона человек. Около 350 миллионов являются хроническими носителями ВГВ [2, 3, 4, 51, 114].
Важным условием осуществления надлежащего контроля за ВГВинфекцией является постоянное повышение качества иммунодиагностикумов для выявления HBsAg - основного диагностического маркера вируса гепатита В (ВГВ). Тестирование крови на HBsAg позволяет диагностировать различные формы гепатита В, осуществлять контроль за эффективностью проводимой терапии, выявлять случаи скрытого вирусоносительства.
Практически во всех странах мира анализ на HBsAg является обязательным для проверки донорской крови. Наибольшее распространение в рутинной лабораторной практике получило определение HBsAg методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для повышения чувствительности и специфичности выявления HBsAg в конструкции современных ИФА тестсистем широко используются моноклональные антитела. В настоящее время все коммерческие тест-системы, применяемые на территории РФ, выявляют
HBsAg в концентрации не менее 0,1 нг/мл (приказ МЗ РФ №322 от 2002 г.).
Увеличение чувствительности тестирования значительно уменьшает вероятность ложноотрицательных результатов в тех случаях, когда концентрация HBsAg в крови опускается ниже порога детекции (фаза серологического окна, состояние реконвалесценции, нахождение HBsAg в составе иммунных комплексов, хроническое вирусоносительство с низким уровнем IiBs-антигенемии [55, 129, 146]). Тем не менее, способность выявлять малые количества HBsAg вируса «дикого» типа не исключает 6 полностью возможность получения ложноотрицательных результатов. Это обусловлено существованием «ускользающих» мутантов ВГВ (escape-mutants), отличительной чертой которых является экспрессия HBsAg с атипичными серологическими свойствами. Данная проблема впервые была обозначена в 90-е годы прошлого века [26]. Именно тогда появились первые сообщения о носителях ВГВ-инфекции с необычными вариантами HBsAg, которые плохо или вовсе не выявлялись существовавшими тестами. Изоляты ВГВ, выделенные из образцов крови этих носителей, оказались мутантами или генетическими вариантами.
В наше время проблема мутантов ВГВ стала еще более актуальной, так как массовая вакцинация и широкое применение химиотерапии способствовали значительному увеличению распространенности мутантных штаммов ВГВ. Согласно математической модели, разработанной на основе данных о том, что современная вакцина, содержащая HBsAg, не защищает от «ускользающих» мутантов ВГВ, уже через 100 лет после начала широкомасштабной вакцинации может произойти полное замещение вируса дикого типа мутантными формами [51, 145]. При этом, согласно литературным данным, «ускользающие» мутанты ВГВ обладают инфекционностью, передаются как горизонтально, так и вертикально, и, наряду с обычными осложнениями (цирроз печени, первичный гепатоцеллюлярный рак) [35, 74, 109], могут вызывать атипичные осложнения ГВ (апластическая анемия, лейкоз т.д.) [6, 10, 18, 27, 116].
Все это определило высокую актуальность работы по выявлению мутантных штаммов ВГВ, изучению их серологических и генетических свойств, накоплению данных об эпидемиологии мутантов ВГВ, оценке их влияния на эффективность вакцинопрофилактики, созданию тест-систем адаптированных к выявлению всех возможных (в том числе мутантных) вариантов HBsAg, а так же диагностикумов, позволяющих проводить дифференцированный скрининг мутантных форм ВГВ.
Цель работы:
Разработать алгоритм серологического поиска HBsAg-мутантов ВГВ, изучить их генетические, серологические свойства, распространенность среди HBsAg-позитивных носителей, создать контрольные панели мутантного HBsAg, при помощи которых оценить способность коммерческих ИФА тест-систем выявлять мутантный HBsAg и протективный потенциал вакцин в отношении HBsAg-мутантов ВГВ.
Задачи исследования:
1. Разработать алгоритм серологического поиска HBsAg-мутантов ВГВ. При помощи разработанного алгоритма провести поиск HBsAg-вариантных сывороток, потенциально содержащих мутанты ВГВ, и дать им развернутую лабораторно-диагностическую характеристику.
2. Используя панели моноклональных анти-HBsAg конъюгатов, провести серологический анализ HBsAg-вариантных сывороток. На основе проведенного анализа сравнить серологические «портреты» обнаруженных вариантов HBsAg и рекомбинантных HBsAg мутантов и ВГВ «дикого» типа.
3. Охарактеризовать генетические свойства изолятов ВГВ, содержащихся в HBsAg-вариантных сыворотках, установив их генотип, субтип и наличие мутаций в S-гене. Сопоставить данные серологического «портретирования» различных вариантов HBsAg с видом и местом мутации в S-гене.
4. Исходя из данных серологического «портретирования» найти моноклональные анти-HBsAg конъюгаты, оппозитные по чувствительности к HBsAg ВГВ «дикого» типа и мутантов, и на основе этих конъюгатов разработать тест для серологического поиска HBsAg-мутантов ВГВ.
5. Создать панель сывороток, содержащих атипичные варианты HBsAg мутантов ВГВ, для осуществления контроля качества их детекции диагностическими тест-системами. Используя панель провести оценку способности наиболее широко распространенных коммерческих тест-систем выявлять мутантные варианты HBsAg.
6. Разработать тест для оценки способности анти-HBsAg антител, индуцированных вакцинацией или ВГВ-инфекцией, взаимодействовать с мутантами ВГВ и оценить эффективность гуморального иммунитета в отношении мутантов ВГВ у лиц, вакцинированных различными вакцинами, и пациентов, переболевших ГВ.
Научная новизна работы
1. С помощью разработанного алгоритма серологического поиска впервые установлен факт циркуляции и определена распространенность мутантов ВГВ G145R и S143L/T143M в популяции HBsAg-позитивных носителей Московского региона. Впервые выявлен мутант G145R редкого субтипа adw3 генотипа D.
2. Впервые разработана методика серологического «портретирования» HBsAg, позволяющая проводить тонкий анализ эпитопных модификаций этого антигена с помощью панели МАТ анти-HBsAg конъюгатов.
3. С помощью серологического «портретирования» впервые были выявлены существенные серологические различия природных и рекомбинантных форм мутантного HBsAg.
4. Впервые показана принципиальная возможность определять вид мутаций в S-гене по серологическим свойствам и создан тест серологического поиска мутантов ВГВ G145R и S143L/T143M.
5. Впервые с помощью разработанной контрольной панели, содержащей мутантные варианты HBsAg, проведена сравнительная характеристика диагностического потенциала коммерческих тест-систем широко распространенных на рынке РФ и определены конструктивные особенности тест-систем, позволяющие эффективно выявлять мутантный HBsAg.
6. Впервые разработан тест, позволяющий оценивать эффективность гуморального иммунитета у вакцинированных и переболевших ГВ в отношении мутантов ВГВ и показано, что у вакцинированных различными вакцинами (Энджерикс, Твинрикс) практически отсутствуют антитела против наиболее известного HBsAg-мутанта ВГВ G145R.
Положения, выносимые на защиту
1. Установлен факт циркуляции G145R, S143L, Т143М HBsAg-мутантов ВГВ среди хронических носителей ВГВ Московского региона, в том числе G145R HBsAg-мутанта с редким для генотипа D субтипом adw3.
2. Разработан подход изучения эпитопных модификаций HBsAg при помощи панели моноклональных анти-HBsAg конъюгатов (серологическое «портретирование»), что позволило определить значительные различия антигенных свойств рекомбинантного и природного HBsAg с заменами в 145 и 143 положениях.
3. При помощи панели сывороточных образцов, содержащих мутантные варианты HBsAg, выявлено значительное снижение чувствительности тест-систем для детекции HBsAg, основанных исключительно на МАТ, в отношении HBsAg с заменами G145R, S143L.
4. Установлено практически полное отсутствие антител, способных взаимодействовать с мутантным HBsAg G145R, у лиц привитых против гепатита В вакцинами Энджерикс и Твинрикс.
Практическая значимость работы
1. Данные, полученные в ходе серологического поиска, явились основанием для разработки комплекса мер, направленных на усиление диагностического и вакцинного надзора за инфекцией, вызванной HBsAg-мутантами ВГВ, который включает: проведение мониторинга за циркуляцией HBsAg-мутантов ВГВ, изучение их серологических и генетических свойств, создание контрольных панелей мутантного HBsAg, разработку тест-систем и вакцин, адаптированных к серологической атипии HBsAg-мутантов ВГВ.
2. Серологическое «портретирование» позволило осуществить развернутую характеристику эпитопных модификаций антигенов, вызванных различными конформационными изменениями, что имеет большое практическое значение при создании вакцин и диагностических тест-систем, разрабатываемых с учетом вариабельности ВГВ.
3. Созданная контрольная панель мутантных вариантов HBsAg позволит оценивать диагностический потенциал тест-систем для выявления HBsAg в отношении мутаных форм ВГВ с заменами G145R и S143L.
4. На основе данных сравнительных испытаний 7 коммерческих ИФА тест-систем по их способности выявлять мутантный HBsAg, выявлена недостаточная чувствительность к HBsAg G145R у 4 и HBsAg S143L у 2 из них. Кроме того, определены конструктивные особенности тест-систем, в наибольшей степени обеспечивающие достижение одинаково высокой чувствительности к HBsAg мутантов и ВГВ «дикого» типа.
5. Данные по изучению эффективности гуморального иммунитета у лиц, вакцинированных против ГВ, позволили сделать вывод о недостаточном профилактическом потенциале этих вакцин в отношении HBsAg-мутантов ВГВ и необходимости создания вакцин нового поколения, учитывающих необходимость защиты от этих мутантов ВГВ.
Внедрение полученных результатов в практику
1. Сывороточные образцы, содержащие HBsAg с мутациями G145R и S143L/T143M, вошли в панель производства ЗАО «Вектор-Бест».
2. Созданная панель апробирована в ГУЗМ НИИ СП им.Н.В.Склифосовского, ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова РАМН.
3. Диагностическая тест-система «Гепастрип-мутант» апробирована в МГС СПИД, ГНЦ РАМН, ГУЗМ НИИ СП им.Н.В.Склифосовского.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение диссертационного исследования на тему "Совершенствование методов иммунодетекции НВsАg - мутантов вируса гепатита В"
ВЫВОДЫ
1. Разработан алгорим серологического поиска HBsAg-мутантов ВГВ, при помощи которого установлен факт циркуляции мутантов ВГВ G145R, S143L, Т143М среди хронических HBsAg-позитивных носителей ВГВ Московского региона. Обнаружен мутант G145R с редким для генотипа D субтипом adw3.
2. Анализ серологических свойств, проведенный методом серологического «портретирования» по дефектам моноклональных анти-HBs антител, позволил установить существенные серологические различия природных и рекомбинантных форм мутантного HBsAg.
3. Показана принципиальная возможность определять вид мутаций G145R, S143L, Т143М по серологическим свойствам HBsAg, что позволило создать тест для серологического поиска этих мутантов ВГВ.
4. С помощью разработанной контрольной панели сывороточных образцов, содержащих мутантные варианты HBsAg, проведена оценка чувствительности выявления HBsAg-мутантов ВГВ G145R, S143L 7 коммерческих ИФА тест-систем разных конструкций и показана низкая чувствительность выявления мутантного HBsAg ИФА тест-систем, основанных исключительно на моноклональных анти-HBs антителах.
5. Разработан тест, позволяющий оценивать эффективность гуморального иммунитета у вакцинированных и переболевших ГВ в отношении мутантов ВГВ. Показано практически полное отсутствие антител к мутантному HBsAg G145R у лиц вакцинированных различными вакцинами против гепатита В и, напротив, наличие
129 существенного количества антител к HBsAg G145R у лиц переболевших гепатитом В.
6. Разработана методология серологического поиска и характеристики HBsAg-мутантов ВГВ по дефектам распознавания HBsAg моноклональными анти-HBsAg антителами, которая позволяет выявлять и описывать антигенные модификации HBsAg, существенно важные для разработки вакцин и диагностических тест-систем нового поколения, учитывающих возможность серологического ускользания ВГВ.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Баженов, Алексей Иванович
1. Л.А.Зильбер, Г.И.Абелев. Вирусология и иммунология рака.// Гос.издательство мед.литературы. М. - 1962. - с.202-203.
2. Львов Д.К. Вирусные гепатиты.// Вестник Рос.АМН. 1996 г. - №6. - с. 25-31
3. Онищенко Г.Г., Дементьева Л.А. Распространение вирусных гепатитов как угроза национальной безопасности.// Журнал микробиологии и иммунобиологии. 2003. - №4. - с.93-99
4. Шахгильдян И.В., Ясинский А.А., Михайлов М.И., Ершова О.Н. и др. Хронические гепатиты в Россиской федерации.// Эпидемиология и инфекционные болезни. №6. - 2008. - с.3-9
5. Alexopoulou A., Baltayiannis G., Jammeh S., Waters J., Dourakis S. P., Karayiannis P. Hepatitis В surface with Multiple Mutations in the a determinant in a agammaglobulinemic patient // J. of Clin. Microbiol. -2004. Vol. 2. - P. 2861-2865
6. Alhababi F., Sallman T.A., Tong C.Y. The significance of only in the clinical virology laboratory // J. Clin. Virol. 2003. - Vol. 27 - P. 162-169.
7. Arauz-Ruiz P., Norder H., Visona K.A., Magnius L.O. Genotype F prevails in HBV infected patients of Hispanic origin in Central America and may carry the precore stop mutant // J. Med. Virol. 1997. - Vol. 51. - P. 305312.
8. Avellon A., Echevarria J.M. Frequency of hepatitis В virus 'a' determinant variants in unselected Spanish chronic carriers.// J. Med. Virol. 2006. -Vol.78 (1). -P.24-36.
9. Awerkiew S., Daumer M., Reiser M., Wend U.C., Pflster H., Kaiser R., Willems W.R., Gerlich W.H. Reactivation of an occult hepatitis В virus escape mutant in an anti-HBs positive, anti-HBc negative lymphoma patient // 2007. - Vol. 38, N 1. - P. 83-86
10. Bancroft W. H., Mundon F. K., Russell P. K. Detection of additional antigenic determinants of hepatitis В antigen // J. Immunol. 1972. - Vol. 109.-P. 842-848.
11. Barthpomeusz A., Locarinini S. Hepatitis В virus mutants and fulminant hepatitis B: fitness plus phenotypes // Hepatology 2001. - Vol. 34. - P. 432-435.
12. Ben-Porath E., Wands J.R., Marciniak R.A. et al. Structural analysis of hepatitis В surface antigen by monoclonal antibodies.// J. Clin. Invest. -1985.-Vol.76 (4).-P. 133 8-1347.
13. Blum H.E. Variants of hepatitis В, С and D viruses: molecular biology and clinical significance // Digestion 1995. - Vol. 56. - P. 85-95.
14. Bruce S.A., Murray K. Mutations of some critical amino acid residues in the hepatitis В virus surface antigen // J. Med. Virol. 1995. - Vol. 46. - P. 157-161.
15. Bruss V., Ganem D. The role of envelope proteins in hepatitis В virus assembly// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88. - P. 1059-1063.
16. Cabrerizo M., Bartolom J., Caramelo C., Barril G., Carreno V. Molecular analysis of hepatitis В virus DNA in serum and peripheral blood mononuclear cells from hepatitis В surface antigen-negative cases // Hepatology. 2000. - Vol. 32 - P. 116-123.
17. Carman W., Thomas H., Domingo E. Viral genetic variation: hepatitis В virus as a clinical example // Lancet 1993. - Vol. 341 - P. 349-353.
18. Carman W.F. Infections associated with medical intervention: hepatitis viruses and HGV // Br. Med. Bull. 1998. - Vol. 54. - P. 731-748.
19. Carman W.F. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis В virus // J. Viral. Hepatitis. - 1997. - Vol. 4. - P. 11-20.
20. Carman W.F., Jacyna M.R., Hadziyannis S., Karayiannis P., McGarvey M.J., Makris A., Thomas H.C. Mutation preventing formation of hepatitis В e antigen in patients with chronic hepatitis В infection // Lancet 1989. Vol. 2(8663).-P. 588-591.
21. Carman W.F., Mimms L.T. Pre-S/S gene variants of hepatitis В virus. In: Rizzetto M, Purcell RH, Gerin JL, Verme G, editors // Viral hepatitis and liver disease // Turin: Edizioni Minerva Medica. 1997. - P. 108-115.
22. Carman W.F., Trautwein C., van Deursen F.J., et al. Hepatitis В virus envelope variation after transplantation with and without hepatitis В immune globulin prophylaxis // Hepatology. 1996. - Vol. 24 - P. 489-493.
23. Carman W.F., Van Deursen F.J., Mimms L.T. et al. The prevalence of surface antigen variants of hepatitis В virus in Papua New Guinea, South Africa, and Sardinia.// Hepatology. 1997. - Vol.26 (6). - P. 1658-1666.
24. Carman W.F., Zanetti A.R., Karayiannis P., Waters J., Manzillo G., Tanzi E., Zuckerman A.J., Thomas H.C. Vaccine induced escape mutant of hepatitis В virus // Lancet. - 1990. - Vol. 336. - P. 325-329.
25. Carmann W.F., Korula J., Wallace L., MacPhee R., Mimms L., Decker R. Fulminant reactivation of hepatitis В due to envelope protein mutant that escaped detection by monoclonal HBsAg ELISA // Lancet. 1995. - Vol.• 345.-P. 1406-1407.
26. Chen H.B., Fang D.X., Li F.Q., Jing H.Y., Tan W.G., Li S.Q. A novel hepatitis В virus mutant with A-to-G at nt551 in the surface antigen gene // World J. Gastroenterol. 2003. - Vol. 9. - P. 304-308.
27. Chiang P.W., Jeng K.S., Ни C.P., Chang C.M. Characterization of a cis element required for packaging and replication of the human hepatitis В virus//Virology 1992.-Vol. 186.-P. 701-711.
28. Chuang W.L., Omata M., Ehata Т., Yokosuka O., Ohto M. Concentrating missense mutations in core gene of hepatitis В virus. Evidence for adaptive mutation in chronic hepatitis В virus infection // Dig. Dis. Sci. 1993. -Vol. 38-P. 594-600.
29. Coleman P.F., Chen Y.C., Muchahwar I.K. Immunoassay detection of hepatitis В surface antigen mutants. J. Med. Virol. 1999. - Vol. 59. - P. 19-24.
30. Coleman PF. Detecting hepatitis В surface antigen mutants.// Emerg. Infect. Dis. 2006. - Feb. - Vol. 12(2). - P. 198-203.
31. Coleman PF. Surveillance for hepatitis В surface antigen mutants.// J. Med. Virol. 2006. Vol.78. -P.56-58
32. Courouce A. M., Holland P. V., Muller J. Y. et al. HBs antigen subtypes // Bibl. Hematol. 1976. - Vol. 42. - P. 1.
33. Courouce A. M., Lemaire J. K., Roux J. F. New hepatitis В surface antigen subtypes inside the ad category // Vox Sang. 1978. - Vol. 35. - P. 304308.
34. Courouce-Pauty A.M., Plancon A., Soulier J.R. Distribution of HBsAg subtypes in the world // Vox Sang 1983. - Vol. 44. - P. 197-211.
35. Dane D.S., Cameron C.H., Briggs N.M. Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis // Lancet 1970. - Vol. 1-P. 695-708.
36. Desombere I. Human immune response to envelope proteins of the hepatitis В virus. Doctorate thesis, Department of Clinical Chemistry, Microbiology and Immunology // Ghent University, Ghent, 1998.
37. Domingo E., Sabo D., Taniguchi Т., Weissmann C. Nucleotide sequence heterogeneity of an RNA phage population // Cell 1978. - Vol. 13. -P.735-744.
38. Feitelson M., Lega L., Guo J., et al. Pathogenesis of posttransfusion viral hepatitis in children with b-thalassemia // Hepatology 1994. Vol. 19 -P.558-568.
39. Feitelson M.A. Biology of disease. Biology of hepatitis В virus variants // Lab. Invest. 1994. Vol. 71. - P. 324-349.
40. Francois G., Kew M., Van Damme P. et al. Mutant hepatitis В viruses: a matter of academic interest only or a problem with far-reaching implications?// Vaccine. -2001. Vol.19 (28-29). -P.3799-3815.
41. Fung, S. K., and A. S. F. Lok. Hepatitis В virus genotypes: do they play a role in the outcome of HBV infection? Hepatology 2004; 40:790-792.134
42. Gerlich WH. Diagnostic problems caused by HBsAg mutants-a consensus report of an expert meeting.// Intervirology. 2004. - Vol.47(6). -P.310-313.
43. Gerna G., Fiori G. P., Cattaneo E. et al Distribution of HBsAg subtypes in a sample of acute viral hepatitis В in Northern Italy // Minerva Med. 1976. -Vol. 9.-P. 1494-1499.
44. Gibb R., Nimmo G.R., O'Loughlin P. et al. Detection of HBsAg mutants in a population with a low prevalence of hepatitis В virus infection.// J. Med. Virol. 2007. - Vol.79 (4). - P.351-355.
45. Goldstein ST, Zhou F, Hadler SC, Bell BP, Mast EE, Margolis HS.// A mathematical model to estimate global hepatitis В disease burden and vaccination impact. Int J Epidemiol. - 2005. - Vol. 34. - P. 1329-1335.
46. Grethe S., Monazahian M., Bohme I., Thonssen R. Characterization of unusual escape variants of hepatitis В virus isolated from a hepatitis В surface antigen-negative subject // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 76927696.
47. Gunther S., Fischer L., Pult I., Sterneck M., Will H. Naturally occurring variants of hepatitis В virus // Adv. Virus. Res. 1999. Vol. 52. - P. 125137.
48. Harrison T.J., Hopes E.A., Oon C.J., Zanetti A.R., Zuckerman A.J. Independent emergence of a vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus//J. Hepatol.-1991.-Vol. 13.-P. 105-107.
49. Heermann K.H., Goldmann U., Schwartz W., Seyffarth Т., Baumgarten H., Gerlich W.II. Large surface proteins of hepatitis В virus containing the pre-S sequence// J. Virol 1984. - V. 52 - P. 396-402.
50. Hilleman M.R. Vaccine perspectives from the vantage of hepatitis В // Vaccine Research 1992. - Vol. 1. - P. 1-15.
51. Hsu H.Y., Chang M.H., Ni Y-H, Lin H.H., Wang S.M., Chen D.S. Surface gene mutants of hepatitis В virus in infants who develop acute or chronic infections despite immunoprophylaxis // Hepatology 1997. - Vol. 26. - P. 786-791.
52. Huang J., Liang T.J. A novel hepatitis В virus (HBV) genetic element with Rev response element-like properties that is essential for expression of HBV gene products // Mol. Cell. Biol. 1993. - Vol. 13 - P. 7476-7486.
53. Huang X., Lu D., Ji G. et al. Hepatitis В virus (HBV) vaccine-induced escape mutants of HBV S gene among children from Qidong area, China.// Virus. Res. 2004. - Vol.99 (1). - P.63-68.
54. Ijaz S., Ferns R.B., Tedder R.S. A 'first loop' linear epitope accessible on native hepatitis В surface antigen that persists in the face of 'second loop1 immune escape.// J. Gen. Virol.- 2003. Vol.84. - P.269-275.
55. Ireland J.H., O'Donnell В., Basuni A.A. et al. Reactivity of 13 in vitro expressed hepatitis В surface antigen variants in 7 commercial diagnostic assays.// Hepatology. 2000. Vol.31 (5) - P.l 176-1182.
56. Kane M.A. Global control of hepatitis В through universal infant immunization. In: Ellis RW, editor. // Hepatitis В Vaccines in Clinical Practice. New York: Markel Dekker. 1993. - P. 309-322.
57. Kao J.H., Chen P.J., Lai M.Y., Chen D.S. Hepatitis В genotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis В // Gastroenterology 2000. - Vol. 118. - P. 554-559.
58. Kaplan P., Greenman R., Gerin J., Purcell R., Robinson W. DNA polymerase associated with human hepatitis В antigen. // J. Virol. 1973. Vol. - 12. P. 995-1005.
59. Karelin VP, Babaeva EE, Budnitskaia PZ, Zhdanov VMM Isolation of hepatitis В (HBSAg) from donor blood plasma. Vopr Virusol. - 1978.-Sep-Oct. - Vol. 5. - P.576-583.
60. Kato H., Orito E., Gish R., Bzowej N., Newsom M., Sugauchi F., Suzuki S., Ueda R., Miyakawa Y., Mizokami M. Hepatitis В e antigen in sera from individuals infected with hepatitis В vims genotype G // Hepatology 2002. - Vol. 35. - P. 922-929.
61. Kidd-Ljunggren K., Miyakawa Y., Kidd A.H.// Genetic variability in hepatitis В vimses. J. General Virology. - 2002. - 83. - P. 1267-1280.
62. Koyanagi Т., Nakamuta M., Sakai H. et al. Analysis of HBs antigen negative variant of hepatitis В virus: unique substitutions, Glul29 to Asp and Glyl45 to Ala in the surface antigen gene.// Med. Sci. Monit. 2000. Vol.6 (6). -P.1165-1169.
63. Koziel M.J. Immunology of viral hepatitis // Am. J. Med. 1996. - Vol. 100.-P. 98-109.
64. Kremsdorf D., Garreau F., Capel F., Petit M.A., Brechot C. In vivo selection of hepatitis В virus mutant with abnormal viral protein expression // J. Gen. Virol. 1996. - Vol. 77. - P. 929-939.
65. Krugman S., Stevens C.E. Hepatitis В vaccine. In: Plotkin SA, Mortimer EA, editors // Vaccines. Philadelphia. - Saunders. - 1994. - P. 419^137.
66. Lada O., Benhamou Y., Poynard Т., Thibault V. Coexistence of hepatitis В surface antigen (HBs Ag) and anti-HBs antibodies in chronic hepatitis В virus carriers: influence of "a" determinant variants.// J. Virol. 2006. -Vol.80 (6). - P.2968-2975.
67. Le Bouver G. L. The heterogeneity of Australian antigen // J. Infect. Dis. -1971. Vol. 123 - P. 224-229.
68. Le Seyec J., Chouteau P., Cannie I., Guguen-Guillouzo C., Gripon P. Role of the pre-S2 domain of the large envelope protein in hepatitis В virus assembly and infectivity // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 5573-5578.
69. Lee K.M., Kim Y.S., Ко Y.Y., Yoo B.M., Lee K.J., Kim J.H., Hahm K.B., Cho S.W. Emergence of vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus with multiple surface gene mutations in a Korean child // J. Korean Med. Sci. 2001. - Vol. 16. - P. 359-362.
70. Lee WM. Hepatitis В virus infection // N. Engl. J. Med. 1997. - Vol. 337 -P. 1733-1745.
71. Levicnic-Stezinar S. Hepatitis В surface antigen escape mutant in a first time blood donor potentially missed by a routine screening assay // Clin. Lab. -2004.-Vol. 50.-P. 49-51.
72. Lindh M., Andersson A.S., Gusdal A. Genotypes, nt 1858 variants, and geographic origin of hepatitis В virus-large-scale analysis using a new genotyping method // J. Infect. Dis. 1997. - Vol. 175. - P.1285-1293.
73. Loffler-Mary H., Dumortier J., Klentsch-Zimmer C., Prange R. Hepatitis В virus assembly is sensitive to changes in the cytosolic S loop of the envelope proteins // Virology 2000. - Vol. 270 - P. 358-362.
74. Louisirirotchanakul S., Kanoksinsombat C., Theamboonlert A. et al. Mutation of the "a" determinant of HBsAg with discordant HBsAg diagnostic kits.// Viral. Immunol. 2004. - Vol.17. - P.440-444.
75. Mathet V.L., Feld M., Espinola L. et al. Hepatitis В virus S gene mutants in a patient with chronic active hepatitis with circulating Anti-HBs antibodies.// J. Med. Virol. -2003. Vol.69 (1). - P. 18-26.
76. Mesenas S.J., Chow W.C., Zhao Y. et al. Wild-type and 'a' epitope variants in chronic hepatitis В virus carriers positive for hepatitis В surface antigen and antibody.// J. Gastroenterol. Hepatol. 2002. - Vol.17 (2) - P.148-155.
77. Mimms L. Hepatitis В virus escape mutants: "pushing the envelope" of chronic hepatitis В virus infection // Hepatology 1995. Vol. 21. - P. 884887.
78. Mizokami M., Nakano Т., Orito E., Tanak Y., Sakugawa H., Mukaide M., Robertson B.H. Hepatitis В virus genotype assignemnt using restriction fragment length polymor phism patterns. FEBS // Lett. 1999. - Vol. 450. -P. 66-71.
79. Moerman В., Moons V., Sommer H., Schitt Y., Stetter M. Evaluation of sensitivity for wild type and mutant forms of hepatitis В surface antigen four commercial HBsAg assays // Clin. Lab. 2004. - Vol. 50. - P. 159-162.
80. Moriya Т., Kuramoto I.K., Yoshizawa H., Holland P.V. Distribution of hepatitis В virus genotypes among American blood donors determined with preS2 epitope linked immunosorbent assay kit // J. Clin. Microbiol. 2002. -Vol. 40.-P. 877-880.
81. Naito H., Hayashi S., Abe K. Rapid and specific genotyping system for hepatitis В virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 362-364.
82. Ni F., Fang D.X., Gan R., Li Z., Duan S., Xu Z. A new immune escape mutant of hepatitis В virus with an Asp to Ala substitution in aal44 of the envelope major protein // Res. Virol. 1995. - Vol. 146. - P. 397-407.
83. Norder H., Courouce A.M., Magnius L.O. Molecular basis of hepatitis В virus serotype variations within the four major subtypes.// J. Gen. Virol. -1992.-Vol. 73.-P. 3141-3145.
84. Nowak M.A., Bonhoffer S., Hill A.M., Boahme R., Thomas H.C., McDade H. Viral dynamics in hepatitis В virus infection.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. - Vol. 93. - P. 4398-4402.
85. Okamoto PI., Tsuda F., Sakugawa H., Sastroewignjo R.I., Imai M., Miyakawa Y., Mayumi M. Typing of hepatitis В virus homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes.// J. Den. Virol. 1988. - Vol. 69. - P. 2575-2578.
86. Oon C.J., Chen W.N., Goo K.S., Goh K.T. Intra-familial evidence of horizontal transmission of hepatitis В virus surface antigen mutant G145R.// J. Infect. 2000. - Vol. 41. - P. 260-264.
87. Oon C.J., Lim G.K., Zhao Y. Significance of the minor i and t determinants of hepatitis В virus in hepatocellular carcinoma.// J. Gastroenterol Hepatol. -1998. Dec. - Vol. 13(12). - P.1237-1240
88. Osiowy C. Sensitive detection of HBsAg mutants by a gap ligase chain reaction assay.// J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol.40 (7). - P.2566-2571.
89. Ou J.H., Rutter W.J. Regulation of secretion of the hepatitis В virus major surface antigen by the preS-1 protein.// J. Virol. 1987. - Vol. 61. - P. 782786.
90. Park W, Keeffe EB. Diagnosis and treatment of chronic hepatitis В.// Minerva Gastroenterol. Dietol. 2004. - Dec. -Vol.50(4). - P.289-303.
91. Pawlotsky J.M.// The concept of hepatitis В virus mutant escape. J Clin Virol. -2005.- Vol. 34. - Suppl 1.-P.125-129
92. Perillo R.P. Factors influencing response to interferon in chronic hepatitis B: implications for Asian and Western populations.// Hepatology 1990. -Vol. 12-P. 1433-1435.
93. Pugh J.C., Bassendine M.F. Molecular biology of hepadnavirus replication. // Br. Med. Bull. 1990. - Vol. 46 - P. 329-353.
94. Roohi A., Yazdani Y., Khoshnoodi J. et al. Differential reactivity of mouse monoclonal anti-HBs antibodies with recombinant mutant HBs antigens.// World J. Gastroenterol. 2006. - Vol.12 (33). - P.5368-5374.
95. Roznovsky L., Harrison T.J., Fang Z.L., Ling R., Lochman I., Orsagova I., Pliskova L. Unusual hepatitis В surface antigen variation in a child immunized against hepatitis В // J. Med. Virol. 2000. Vol. 61. - P. 11-14.
96. Sambrook J., Fritch E. F., Maniatis T.// Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition 1989. - CSH Laboratory press.
97. Schaefer L.V., Maldonado M., Bastidas-Ramirez B.E., Norder H., Panduro A. Genotypes and S-variability of Mexican hepatitis В virus strains // J. Med. Virol. 2002. - Vol. 68. - P. 24-32.
98. Schaefer S., Glebe D., Wend U.C., Oyunbileg J., Gerlich W.H. Uneversal primers for real-time amplification of DNA from all know Orthohepadnavirus species // J. Clin. Virol. 2003. - Vol. 27. - P. 30-37.
99. Schafer S., Tolle Т., Lottmann S., Gerlich W. H. Animal models and experimental systems in hepatitis В virus research // Imperial College Press, London, United Kingdom. 1998.
100. Scheiblauer H., Soboll H., Nick S. Evaluation of 17 CE-marked HBsAg assays with respect to clinical sensitivity, analytical sensitivity, and hepatitis В virus mutant detection.// J. Med. Virol. 2006. - Vol.78 - P.66-70.
101. Schories M., Peters Т., Rasenack J. Isolation, characterization and biological significance of hepatitis В virus mutants from serum of a patient with immunologically negative HBV infection. // J. Hepatol. 2000. Vol. 33. - P. 799-811.
102. Seeger C., Mason W. S. Hepatitis В virus biology. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. - Vol. 64. - P. 51-68.
103. Shiels M.T., Taswell H.F, Czaja A.J., Nelson C., Swenke P. Frequency and significance of concurrent hepatitis В surface antigen and antibody in acute and chronic hepatitis B. // Gastreoenterology. 1987. Vol. 93. - P. 675-680.
104. Sterneck M., Gunter S., Gerlach J., Naoumov N.V., Santantonio Т., Fisher L., et al. Hepatitis В virus sequence change evolving in liver transplant recipients with fulminant hepatitis. // J. Hepatol. 1997. - Vol. 26. - P. 754-764
105. Stirk H.J., Thornton J.M., Howard C.R. A topological model for hepatitis В surface antigen. // Intervirology 1992. - Vol. 33. - P. 148-158.
106. Stuyver L., De Gendt S., Van Geyt C., Zoulim F., Fried M., Schinazi R.F., et al. A new genotype of hepatitis В virus: complete genome and phylogenetic relatedness. // J. Gen. Virol. 2000. - Vol. 81. - P. 67-74.
107. Summers J., O'Connell A., Millman I. Genome of hepatitis В virus: restriction enzyme cleavage and structure of DNA extracted from Dane particles // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. - Vol. 72. - P. 4597-4601.
108. Tabor E. Infections by hepatitis В surface antigen gene mutants in Europe and North America // J. Med. Virol. 2006. - Vol. 78. - Suppl. 1. P. 43-47.
109. Tijssen P., Kurstak E.// Highly efficient and simple methods for the preparation of peroxidase and active peroxidase-antibody conjugates enzyme immunoassays. Anal Biochem. -1984. - Feb. -136(2). -P.451-457.
110. Tiollais P., Charnay P., Vyas G.N. Biology of hepatitis В virus // Science -1981. Vol. 213. - P. 406^111.
111. Ueda K., Tsurimoto Т., Matsubara K. Three envelope proteins of hepatitis В virus; large S, middle S, and major S proteins needed for the formation of Dane particles // J. Virol. 1991. - Vol. 65. - P. 3521-3529.
112. Verheyen A. Influence of age, weight, length, BMI, gender, smoking behaviour, and type of vaccine on the immune response of HB vaccines // Antwerpen: University of Antwerpen, Department of Epidemiology and Social Medicine. 1998. - In Dutch.
113. Viral Hepatitis Prevention Board. VHPB consensus statement on HBV mutants and variants // Viral. Hepatitis. 1999. - Fact Sheet. -Vol. 4. - P.I— 2.
114. Wands J. R., Wong M. A., Shoorye J. et al. Hepatitis В viral antigenic structure: signature analysis by monoclonal radioimmunoassays // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - Vol. 81. - P. 2237-2241.
115. Waters J.A., Kennedy M., Voet P. et al. Loss of the common "A" determinant of hepatitis В surface antigen by a vaccine-induced escape mutant.// J. Clin. Invest. 1992. - Vol.90 (6). - P.2543-2547.
116. Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis В virus: clinical and diagnostic impact // J. Clin. Virol. 2005. Vol. 32. - P. 102-112.
117. Weber B. The diagnostic and clinical impact of the genetic variability of the S (surface) gene of hepatitis В virus // J. Lab. Med. 2004. - Vol. 28-1 - P. 56-69.
118. Weber B. The isolated anti-HBc reactivity: new developments // J. Lab. Med. 2002. - Vol. 26. - P. 451-458.
119. Weber В., Dengler Т., Berger A. et al. Evaluation of two new automated assays for hepatitis В virus surface antigen (HBsAg) detection: IMMULITE HBsAg and IMMULITE 2000 HBsAg.// J. Clin. Microbiol. 2003. - V.41 (1). -P.135-143.
120. Weber В., Melchior W., Gehrke R., Berger A., Rabenau H.F. Hepatitis В virus (HBV) markers in isolated anti-HBc positive individuals // J. Med. Virol. 2001. - Vol. 64. - P. 312-319.
121. Weber В., Van der Taelem-Brule N., Berger A. et. al. Evaluation of a new automated assay for hepatitis В surface antigen (HBsAg) detection VIDAS HBsAg Ultra.// J. Virol. Methods. 2006. Vol.135 (1). - P.109-117.
122. Weinberger K.M., Zoulek G., Bauer Т., Bohm S., Jilg W. A novel deletion mutant of hepatitis В virus surface antigen // J. Med. Virol. 1999. - Vol. 58. - P. 105-110.
123. Weiss J., Wu H., Farenkopf В., Schultz Т., Song G., Shah S., et al. Realtime TaqMan PCR detection and quantitation of HBV genotypes A-G with the use of an enternal quantitation standart. // J. Clin. Virol. 2000, - Vol. 30.-P. 86-93.
124. Wilson J.N., Nokes D.J., Carman W.F. The predicted pattern of emergence of vaccine-resistant hepatitis B: a cause for concern?// Vaccine. -1999. -Vol.17.-P.973-978.
125. Yao J.D., Beld M.G., Oon L.L., et al. Multicenter evaluation of the VERSANT hepatitis В virus DNA 3.0 assay // J. Clinic. Microbiol. 2004. -Vol. 42.-P. 800-806.
126. Zanetti A.R., Tanzi E., Manzillo G., Maio G., Sbreglia C., Caporaso N., Thomas H., Zuckerman A.J. Hepatitis В variant in Europe // Lancet. 1988. -Vol. 2.-P. 1132-1133.
127. Zoulim F, Jeantet D, Chemin I, Mandrand B, Tran A, Merle P, Trepo C, Kay A. Cloning and expression of surface antigens from occult chronic hepatitis147
128. В virus infections and their recognition by commercial detection assays.// J. Med. Virol. 2004. - Aug. - Vol.73(4). - P.508-515.
129. Zuckerman A.J., Harrison T.J., Oon C.J. Mutations in S region of hepatitis virus. // Lancet -1994. Vol. 343. - P. 737-738.
130. Zuckerman A.J., Zuckerman J.N. Molecular epidemiology of hepatitis В virus mutant. // J. Med. Virol. 1999. - Vol. 58. - P. 193-195.
131. Zuckerman J.N., Zuckerman A.J. Mutations of the surface protein of hepatitis В virus.// Antiviral Res. 2003. - Vol.60 (2). - P.75-78.