Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка автоматизированного количественного агглютинационного текста (АКАТ) и его применение для иммунодетекции возбудителей и диагностики инфекций

гг

На правах рукописи

□030542ТЭ

Коноплева Мария Вениаминовна

РАЗРАБОТКА АВТОМАТИЗИРОВАННОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО АГГЛЮТИНАЦИОННОГО ТЕСТА (АКАТ) И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИММУНОДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ И ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

003054279

Работа выполнена в ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва

Научный руководитель:

доктор медицинских наук А.П.Суслов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Е.В. Сидорова доктор биологических наук, Ю.Ф. Горская

Ведущая организация: ФГУН Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии

им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится « 16 » февраля 2007 года в Ц часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.01 в ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н Ф. Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д.18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан « 15 » января 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Е.В. Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Существует множество методов, применяемых для иммунодетекции различных маркеров возбудителей инфекций и иммунодиагностики инфекционных заболеваний. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Методы, основанные на разных принципах, дополняют друг друга в верификации результатов иммуноанализа. Иммунологические методы могут обладать высокой чувствительностью и специфичностью, сравнимой в предельных значениях с молекулярно-биологическими тестами (Регега, 1983; Скворцов, 1971). Метод иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на принципе иммуносорбции, где антитела взаимодействуют с антигеном на твердой фазе, а несвязавшийся избыток реагентов удаляется, обладает высокой чувствительностью и специфичностью, однако этот метод многоэтапный, требует специального оборудования и высокой квалификации персонала. Агглютинационные тесты, основанные на принципе иммунопреципитации (агглютинации), где

взаимодействие антител и антигенов происходит в оптимальном соотношении в растворе с образованием «решетки» из антигенов и антител, удобны и просты в постановке, в принципе могут обладать сравнимой с ИФА чувствительностью, но имеют один существенный недостаток - субъективизм учета результатов (Бобровник, 2003; Schmidt, 2000). В современных условиях, когда требования доказательной медицины направлены на исключение ошибок лабораторного персонала путем автоматизации и даже роботизации диагностических методологий, методы твердофазного иммуноанализа . подверглись более интенсивному развитию, чем агглютинационные тесты, поскольку больше соответствовали предъявляемым требованиям В связи с этим, в ходе непрерывного совершенствования иммунодиагностических методов вообще, для агппотинационных тестов наиболее актуальным становится их объективизация, автоматизация, стандартизация, разработка аналитических количественных характеристик (Schmidt, 2000; Delamaire, 2005).

Попытки автоматизации и даже роботизации агглютинационых тестов предпринимались неоднократно, но только фирме Олимпус (Япония) удалось создать роботизированную систему для учета результатов реакции пассивной гемагглютинации (РИГА) и зарегистрировать ее для применения в лабораторной практике, успешно пройдя испытания в FDA (США) (Larsen, 1995). Система Олимпус применяется для серодиагностики сифилиса и цитомегаловируса, а также при определении групп крови. Остальные, весьма разнообразные по принципу, попытки автоматизации

агглютинационных тестов не получили практического приложения Однако система Олимпус, несмотря на использование очень дорогостоящего оборудования и компьютерного программного обеспечения, не обладает возможностями количественного анализа результатов. Олимпус лишь объективизирует учет результатов РПГА и выражает его в трех вариантах (положительный, отрицательный и неопределенный), а еще в 30-50-е годы прошлого века в классических исследованиях Heidelberger и Kendali, Zinsser, Jones и Pol было доказано, что преципитация и агглютинация, лежащие в основе агглютинационных тестов, являются аналитическими количественными реакциями Метод количественной агглютинации, разработанный в 1929-1935 гг. Heidelberger и Kendall, позволяет осуществить точное аналитическое определение общего весового количества агглютининов в антисыворотках. Реакция количественной аплютинации была использована для исследования антисывороток к бруцеллам, пневмококкам, гемолитическим стрептококкам, стафилококкам, менингококкам, гонококкам, дизентерийным микробам, дрожжам, Н influenzae В и В pertussis, В proteus и Styphosa (Кэбот, 1968) Поэтому становится очевидным, что для того чтобы решать многие научные и иммунодиагностические задачи, используя наряду с иммуносорбентными методами количественные агглютинационкые тесты, необходимо разработать методологию количественной, объективной и автоматизированной оценки результатов этих тестов, удобную для применения не только в научных целях, но и в клинической практике

Агглютинационные методы прямой иммунодетекции возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы широко используются. Эти тесты применяют для обнаружения возбудителей хелико- и кампилобактерной инфекции (Оп, 1996), менингококковой инфекции (Leinonen, 1977), пищевых токсикоинфекций (Notermans, 1991), в том числе холерного токсина и энтеротоксина Ecoli (Ito, 1983), трихомониаза (Adu-Sarcodie, 2004), а также ВИЧ (Gutler, 1996), аденовирусов (Lengyel, 1993), i-ерпесвирусов и ротавирусов (Mazeron, 1993; Sobanski, 2000), и возбудителей других инфекций Кроме того, эти тесты используют для определения групп крови с помощью моноклональных антител (Voak, 1989) В России, согласно приказу МЗ РФ № 64 от 21.02.2000 «Об утверждении номенклатуры клинических лабораторных исследований», для диагностики 85 инфекций, вызываемых вирусами, бактериями, грибами, гельминтами и простейшими, используют 165 агглютинационных тестов, из которых доля РПГА составляет 32% Однако до сих пор агглютинационные тесты используют либо в качественном, либо в полуколичественном варианте (определение титра) с визуальным субъективным способом оценки их результатов (Ellis, 2000, Delamaire, 2005)

Большинство возбудителей инфекций, диагностируемых с помощью агппотинационных тестов, требуют постоянного эпидемиологического надзора и ранней диагностики инфекционных заболеваний. Массовый серологический скрининг населения в России на маркеры сифилиса (около 70 миллионов анализов ежегодно) проводится в подавляющем числе случаев с использованием морально устаревших субъективных методов: реакция Вассермана (РВ), реакция микропреципитации (РМП), реакция иммунофлюоресценции (РИФ), а также РПГА с визуальным учетом результатов. Однако известно, что РПГА - очень удобный простой метод, высокочувствительный и специфичный к Т. pallidum. В настоящее время в условиях перехода на современные методы диагностики сифилиса в России (Приказ МЗ РФ № 87 от 26.03.2001 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса»), этот метод является альтернативой ИФА и может широко применяться как скрининговый или подтверждающий тест. Главный недостаток РПГА - отсутствие объективного автоматизированного учета результатов. А это противоречит основным требованиям, предъявляемым к современным методам иммунодиагностики (Delamaire, 2005).

В настоящее время в России сохраняется опасность эпизоотических вспышек бруцеллеза и туляремии, а также существует возможность осуществления актов биотерроризма, связанных с этими инфекциями. Однако как в России, так и в мире, отсутствуют доступные коммерческие тест-системы для иммунодетекции возбудителей бруцеллеза и туляремии, основанные на современных автоматизированных технологиях. Для решения проблем мониторинга за особо опасными инфекциями агглютинационные тесгы для иммунодетекции возбудителей представлены среди рекомендованных для • полевых исследований диагностикумов как простые, удобные и относительно дешевые тесты (Lefevre, 1993).

Таким образом, разработка автоматизированного количественного агглютинационного теста для иммунодетекции возбудителей и иммунодиагностики инфекций является актуальной проблемой здравоохранения России для скрининга населения, мониторинга животных и окружающей среды в целях биобезопасности, эпидемиологического надзора и диагностики актуальных инфекций.

Цель работы:

Разработать автоматизированный количественный агглютинационный тест (АКАТ) для определения антигенов и антител на модели РПГА и автоматизированную количественную РПГА для иммунодетекции возбудителей бруцеллеза и туляремии, а также для серодиагностики сифилиса.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. На модели РПГА разработать методологию автоматизированного количественного агппотинационного теста (АКАТ), основанную на преобразовании визуального ряда данных реакции агглютинации в шкалу количественных значений, полученную в результате оцифровывания изображений, их компьютерной обработки, введения эталонов и расчета коэффициента регрессии.

2. Разработать аппаратно-программный диагностический комплекс, включающий модифицированный сканер, компьютер, принтер, базовое и специализированное программное обеспечение с базой данных для количественного учета результатов агглютинационных тестов (на модели РПГА), применимый для иммунодетекции возбудителей и диагностики инфекций

3. Разработать вариант РПГА-АКАТ для серодиагностики сифилиса с использованием коммерческих диагностических тест-систем и провести клинические испытания автоматизированного комплекса для серодиагностики сифилиса вариантом РПГА-АКАТ, оценить его преимущества перед обычной методологией

4. Разработать вариант РПГА-АКАТ для определения антигенов бруцелл с использованием моноклональных антител против ЛПС и изучить чувствительность и специфичность РПГА-АКАТ для иммунодетекции ЛПС в клетках различных видов бруцелл по сравнению с иммуноферменишм анализом.

5. Разработать вариант РПГА-АКАТ для определения антигенов К(и1агетк с использованием моноклональных и поликлональных антител против возбудителя туляремии и изучить чувствительность и специфичность РПГА-АКАТ для иммунодетекции ЛПС в клетках различных подвидов возбудителя туляремии в сравнении с иммуноферментным анализом.

Научная новизна работы

- Впервые на модели РПГА разработан автоматизированный количественный агглютинационный тест (АКАТ) для определения антигенов и антител, применимый для различных научных и иммунодиагностических целей, в частности, для иммунодетекции возбудителей и диагностики инфекционных заболеваний С помощью АКАТ решена задача количественной оценки результата реакции агглютинации.

- Впервые создан аппаратно-программный диагностический комплекс (АПК), необходимый для получения оцифрованных изображений микропланшетов с тестами

РПГА, последующего вычисления коэффициента регрессии и классификации полученных изображений по 4-х «крестовой системе». Показана применимость данного АПК для иммунодетекции возбудителей и диагностики инфекций.

- Впервые разработан вариант РПГА-АКАТ, применяемый для выявления анти-трепонемпых антител при серодиагностике сифилиса.

- Впервые для автоматизированного количественного учета результатов РПГА-АКАТ при серодиагностике сифилиса разработана база данных, позволяющая архивировать информацию о пациентах, параметрах тестирования и полученных результатах в виде коэффициентов регрессии, оценки в 4-х «крестовой системе» и диагностического заключения, а также формировать отчеты с протоколами исследований и проводить целенаправленный поиск данных.

- Впервые разработан вариант РПГА-АКАТ с использованием моноклональных антител для определения ЛПС и микробных клеток различных видов бруцелл с чувствительностью 103-104 м к./мл и 0,1-0,2 нг/мл ЛПС, не обладающий перекрестной реакцией с гетерологичными микроорганизмами и по чувствительности превышающий ИФА.

- Впервые разработан вариант РПГА-АКАТ для определения микробных клеток и ЛПС F.tularensis с чувствительностью 103-104 м.к./мл и 0,25 нг/мл ЛПС, не обладающий перекрестной реакцией с гетерологичными микроорганизмами, и сравнимый по чувствительности с ИФА.

- Впервые для агглютинационных тестов для расчета достоверности различия положительных значений реакции в опыте по сравнению с контролем и совершенствования интерпретации результатов введено отсекающее значение (cut-off), основанное на количественной оценке результата реакции (коэффициенте регрессии). Показано применение cut-off для прямой иммунодетекции возбудителей бруцеллеза и туляремии методом РПГА-АКАТ.

Практическая значимость работы

Применение технологии автоматизированного количественного агглютинационного теста (АКАТ) позволяет производителям агглютинационных тест-систем (РПГА, латекс-агглютинации и др.) создать новое поколение простых, быстрых, удобных в постановке диагностических тест-систем с новыми возможностями количественного и объективного учета результатов реакции, а затем широко внедрить их для различных целей иммунодиагностики инфекций.

Разработанный высокочувствительный тест на основе АКАТ для определения антигенов возбудителя бруцеллеза применим для их иммунодетекции в биологических

материалах, а также смывах и пробах из объектов окружающей среды В настоящее время в России отсутствуют коммерческие тест-системы для прямой иммунодетекции возбудителя бруцеллеза и туляремии

Разработанный высокоэффективный аппаратно-программный комплекс (АПК) «Критерий 2» для серодиагностики сифилиса применяется для первичного массового обследования населения и при дальнейшем лечении больных сифилисом и наблюдении за ними. Кроме того, АПК «Критерий 2» применим для выявления маркеров возбудителя сифилиса в ликворе. Применение АПК позволяет организовать работу по серодиагностике сифилиса методом РПГА в соответствии с современными требованиями доказательной медицины, так как оно дает возможность объективно классифицировать изображения не только общепринятой 4-х «крестовой системе», но и по количественному параметру, характеризующему интенсивность реакции (коэффициенту регрессии) Важной частью АПК является База Данных (БД), позволяющая удобно протоколировать процесс постановки РПГА, проводить поиск по пациентам и организациям, а также формировать несколько видов отчетов Применение АПК «Критерий 2» и РПГА-АКАТ в клинической практике позволяет повысить выявляемость анти-трепонемных антител и снизить количество неопределенных результатов. Применение АПК «Критерий 2» в условиях широкомасштабного скрининга позволяет также не только значительно улучшить качество серодиагностики сифилиса, но и экономить реактивы и рабочее время, затрачиваемые на ретестирование

Внедрение полученных результатов в практику

- Зарегистрирован автоматизированный диагностический комплекс для учета результатов РПГА с использованием тест-систсмы «Люис РПГА тест» (№ ФС 02012005/2712-06)

- Диагностический комплекс и методика РПГА-АКАТ используется в лабораторной практике в ведущих центрах дермато-венерологической службы: ГУ ЦНИКВИ, ГУЗ РКВД г Чебоксары, 121 п-ка г Москвы, 1-й КВД г. Москвы, КВД г. Мытищи, КВД г. Сочи, КВД г. Калуги, КВД г. Ханты-Мансийска, КВД г Нижневартовска, КВД г Майкоп, КВД г Тверь, КВД г Кызыл, КВД г Тольятти

Апробация материалов диссертации

Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на конференции молодых специалистов ФГУП «ЦНИИ Автоматики и Гидравлики», Москва, 2004; Объединенном иммунологическом форуме, Екатеринбург, 2004; Научно-практической конференции, посвященной 70-летию дерматовенерологической службы Чувашской

Республики «Актуальные вопросы диагностики, лечение инфекций, передаваемых половым путем, и болезней кожи», Чебоксары, 2004; IX всероссийском съезде дерматовенерологов, Москва, 2005; Конференции «Информационное обеспечение реализации национального проекта «Здоровье», Москва, 2006; X Всероссийской конференции дерматовенерологов «Организация оказания дерматовенерологической помощи в современных условиях», Москва, 2006.

Апробация диссертации состоялась 25 октября 2006 года на совместной научной конференции отдела иммунологии, отдела природноочаговых инфекций, отдела генетики и молекулярной биологии бактерий, отдела медицинской микробиологии и отдела эпидемиологии ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н Ф. Гамалеи РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 179 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 191 работу отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 42 рисунками и 28 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использованы различные виды и штаммы Brucella и Francisella (и их . ЛПС), а также гетерологичные микроорганизмы, любезно предоставленные лабораториями бруцеллеза и туляремии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (см. табл. 3 и 4). ЛПС B.abortus 99 был получен из антигенного комплекса Буавена мягким щелочным гидролизом с последующим спиртовым осаждением и препаративной гель-хроматографии на колонках с сефадексом G-100, по методике, разработанной в лаборатории бруцеллеза ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН (Вершилова ПЛ., 1968). ЛПС F.tularensis был получен методом трихролуксусной (Boivin, 1933) и фенольной экстракции (Westphal, 1965).

В работе также использовали лошадиную сыворотку диагностическую сухую туляремийную для РА (реакции агглютинации) (производство Иркутского ПЧИ) и специфичные к ЛПС Ftularensis моноклональные антитела (мАТ) FBI 1 (класс IgG2a), любезно предоставленные Хлебниковым B.C. (Хлебников, 1993).

Разработку методологии АКАТ проводили с использованием сывороток больных различными формами сифилиса с верифицированным диагнозом, а также сывороток здоровых доноров. Сыворотки были получены из различных КВД и станций переливаний крови г. Москвы. В большинстве случаев для работы использовали свежие сыворотки без специальной обработки, либо сыворотки аликвотированные и хранившиеся при температуре -20 °С. В работе применяли тест-систему для серодиагностики сифилиса «Люис РГ1ГА тест» (производство ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС», г Москва).

Для разработки аппаратно-программного комплекса (АПК) для количественного учета результатов РПГА и методологии АКАТ были использованы следующие компоненты: модифицированный сканер, оборудованный специальным осветительным устройством и рамкой работы с 96-луночными планшетами, компьютер в базовой комплектации (системный блок, монитор, клавиатура, манипулятор «мышь»), системное программное обеспечение - Windows ХР; специальное программное обеспечение -программа анализа изображений РПГА «Критерий 2»; принтер.

Программное обеспечение и АПК «Критерий 2» разрабатывали совместно с ЗАО «ТОКАД» и ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС». В ходе разработки АПК «Критерий 2» и методологии АКАТ экспериментальные данные, полученные при тестировании методом РПГА с визуальным учета результатов, подразделялись на разные классы изображений РПГА ("±", "1+", "2+", "3+" и "4+") С другой стороны эти же данные использовались для получения эталонных графиков распределения яркости по окружностям для каждого класса изображений (по методике ГОСТ 8 207-76 «Прямые измерения с многократными наблюдениями»). Задача классификации результатов РПГА по 4-х «крестовой системе» в компьютерной программе была сведена к классификации изображений с минимальным отклонением (дисперсией) графика распределения яркости в изображении теста РПГА в лунке планшета по отношению к эталонным графикам разных классов Для количественной оценки изображений РПГА, отражающей интенсивность взаимодействия антиген-антитело, был использован коэффициент регрессии (КР), вычисляемый для каждого класса специально обученной нейронной сетью. Обучение этой нейронной сети проводили исходя из выбранного для данного класса диапазона значений коэффициента регрессии и значений дисперсий графика распределения яркости в изображении теста РПГА в сравнении с эталонными графиками двух соседних классов

Данный подход был реализован для разработки РПГА-АКАТ, выявляющего анти-трепонемные антитела при серодиагностике сифилиса с помощью тест-системы «Люис РПГА тест» Первичные данные по сравнению визуального и автоматизированного учета результатов РПГА были получены при скринипговом обследовании на сифилис,

и

проведенном среди 26000 доноров крови с использованием тест-системы «Люис РПГА тест» и АПК «Критерий 2» в Централизованной серологической лаборатории ГУЗ «РКВД» г. Чебоксары (гл. врач - Чернова Т.А.). При получении положительных результатов диагноз сифилиса подтверждался с помощью РИФабс и РПР.

Для разработки тестов на выявление ЛПС бруцелл были получены мАТ Вг4 и Вг8 (класс IgG2a). Для этого мышей Balb/c иммунизировали внутрибрюшинно ЛПС В abortus 99 и дезинтегратом биомассы бруцелл в неполном адьюванте Фрейнда (НАФ). Слияние спленоцитов иммунизированных мышей с клетками мышиной миеломы SP2/0 и получение гибридом проводили по общепринятой методике (КбЫег и Milstein, 1975). мАТ Вг4 были использованы в ИФА для сорбции на твердой фазе, а мАТ Вг8 применяли в двух тестах: для ИФА в виде пероксидазного конъюгата (Tijssen, 1984) и для РПГА-АКАТ при сепсибилизации бараньих эритроцитов. Для разработки тестов на выявление ЛПС F.tularensis использовали как моноклональные, так и поликлональные антитела. мАТ FB11 были использованы в ИФА в качестве пероксидазного конъюгата (Tijssen, 1984), а также для сорбции на твердой фазе в первом варианте. Во втором варианте для сорбции па твердой фазе использовали аффинно-очищенные на протеин G сефарозе лошадиные аягитуляремийные антитела. Эти же антитела использовали в РПГА-АКАТ для сенсибилизации эритроцитов барана. В ходе разработки тестов кроме специфических иммунореагентов были подобраны буферные системы и оптимизированы условия постановки реакций. При проведении сравнительных испытаний разработанных тестов ИФА и РПГА-АКАТ серийные разведения бактериальных антигенов готовили на оптимальном для каждого теста разводящем буфере.

Статистическую обработку результатов и вариационный анализ проводили с помощью программ «Statistica 6.0» и «Exel». Достоверность полученных результатов определяли с помощью t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Общая характеристика разработанной программы анализа изображений РПГА «Критерий 2»

Разработанное специальное программное обеспечение «Критерий 2» обладает следующими характеристиками. Общий интерфейс программы (Рис. 1) был поделен на четыре главных смысловых поля: увеличенное изображение выбранной лунки; градуировочная шкала, отражающая зрительное восприятие оператора в 4-х «крестовой системе»; результаты, полученные методом компьютерной обработки; архив планшетов.

а ¡з м к а а

65(4*)

43*1 »1Ц>1 т>'| рл)Ч лр,|

"* ИГН яи-| ЧЛ НО.] Ы1»> ИО>» Ми-1 им Ы>1 «1й-| *

" ч>г| "«■'•1 уа'4 чм м|г>1 чп#»| ям чем и

"!'•> "1>1 »41-1 ?*>-! Ч&У>ЧН »14 Ирч <Ц)>| ~ ж>.| Щ1-1Ш1-1 «М №14 (511-1 МЫ «41-1 мрч

~ МК1 11;?.» «ц-1 <*Г'! 44(1') »1(1-1 «СЫ «-.(■.| |

Ш > 'И- !

т--- # :

ль-:' . ;

»я ста«

О Н 3+ 4+

• ••«И

Рис. 1. Общий вид интерфейса программы компьютерной обработки результатов РПГА с помощью ЛПК «Критерий 2».

Программа обеспечивавI оитамальйое <жая,1лракани.е и первичную обработку оцифрованного изображения планшета с получением увеличенного изображения каждой лунки планшета. Затем полученные отдельное изображений пупок подвергаются вторичной обработке, которая заключается в определении центра изображения реакции РПГА, с последующим построением колец относительно найденного центры и расчета средних значений яркости по кольцам с фильтрацией помех. Кроме определения значений яркости проводится компьютерная оценка еще по 37 значимым параметрам. Полученные данные используются далее для вычисления коэффициента регрессии.

Значения коэффициента регрессии (КР) для изображений РПГА вычисляются на основании сравнения величии дисперсий разностей средних значений яркости по кольцам, полученным и экспериментальных кривых изображений реакций РПГА, с Эталонными кривыми распределения яркости (Рис, 2).

•'•4 |]------

V !_... „„.,

*т<1 '<Г1

Рис. 2. Классификация изображений РПГА и эталонные кривые, используемые при расчетах для разных классов изображений.

Получаемое значение КР для изображений тестов РИГА отражает интенсивность взаимодействия антигеи-антитело в реакции РПГА и имеет следующие диапазоны количественною выражения; "О" - Соответствует отрицательному результату; от I по 20 -соответствует реакции на "±"; от 21 до 40 - реакция на"1+", от 41 до 60 - реакция на "2+", от 61 до 80 реакция на '3+", от 81 до 100 - реакция на "4+".

Таким образом, при таком расчете едва различимые, визуально незрачйтельные изменения оцифрованных изображений приводятся в точное соответствие со строго определенным значением К11. На рис. 3 приведен пример такого ряда визуально едва различимых Преобразований в пределах класса 4 (-, которые получили конкретное количественное выражений в виде ряда определенных значений [<!'.

54 93 95 97

Рис. 3, Количественная оценка изображений РПГА с интенсивностью реакции 41 методом РПГА-АКАТ. Значения коэффициента регрессии приводятся пол соответствующим изображением.

Этот принцип преобразования незначительных визуальных изображений РПГА в количественные щжазатели КР и даг в основу аналитического количественного варианта РПГА (РПГА-АКАТ).

Результаты компьютер!гой обработки изображений РИГА п %-л у ночном планшете программа «Критерии 2» представляет в виде суммарной таблицы значений КР. 11ри этом для удобства ориентации оператора рядом ео значениям« КР представлены значения по традиционной 4-х «крестовой шкале» (в скобках). Результаты РПГА для удобства окрашены в разные цвета, при этом красный цвет соответствует наиболее выраженной положительной реакции класса изображений 4+, а зеленый цвет ■ отрицательной реакции, относящейся к классу 0.

Программа позволяет сразу же распечатать результаты планшета с проведенной РПГА, а также вноси I ь данные в базу данных (БД). Быстрая распечатка результатов РПГА, без использования базы данных, по удобству и качеству соответствует аналогичному отчету в виде распечатки данных при постановке ИФА. Кроме того, имеется возможность распечатывать увеличенное изображение всего планшета с соответствующими значениями КР и класса изображения «в крестах». При использовании БД можно получить еще 4 вида детализированных отчетов с результатами тестирования.

Также при использовании БД можно проводить поиск по различным запросам и применять это для эпидемиологических и клинических исследований.

Система объективного и количественного учета результатов РПГА методом РПГА-АКАТпри выявлении антитрепонемных антител

Для оценки объективности и воспроизводимости результатов РПГА с использованием АПК «Критерий 2» и тест-системы «Люис РПГА тест» проводили тестирование референсной положительной контрольной сыворотки К+ (из набора «Люис РПГА тест») в дублированных постановках в течение нескольких дней. Наличие точных количественных данных в виде КР для оценки интенсивности РПГА позволило с помощью матемагических методов охарактеризовать понятие «воспроизводимость тестирования» применительно к РПГА: определить среднестатистическое значение КР, характерное для данной сыворотки в соответствующем разведении и оценить степень разброса. Полученные данные в графическом виде представлены на рис. 4.

Титр

Рис. 4. Среднестатистическая кривая титрования контрольной положительной сыворотки из набора «Люис РПГА тест» и средняя ошибка (среднеквадратическое, или стандартное, отклонение о).

Полученные нами экспериментальные данные показывают, что методология АКАТ не только применима для определения антител, но и открывает перспективу проведения виутрилабораторного контроля качества диагностики в серологических лабораториях медицинских учреждений или при внешнем контроле качества работы этих лабораторий.

Разработанная методология дает возможность оценивать работу оператора и находить совершаемые им систематические (или случайные) ошибки. Данные таблицы 1, где представлены сравнительные данные математической обработки результатов титрования К+, выполненного двумя операторами, впервые демонстрируют возможное гь объективной оценки работы лаборанта при постановке РПГА.

Таблица 1 Применение методологии АКАТ для сравнения работы операторов при постановке РПГА.

Титр К+ Оператор 1 Оператор 2

КРср Стандарт, отклонение Коэфф. вариации,% КРср Стандарт, отклонение Коэфф вариации,%

80 96,50 1,31 1,36 96,50 0,58 0,60

160 94,63 0,92 0,97 95,50 0,58 0,60

320 83,13 2,47 2,98 80,75 3,40 4,21

640 66,13 5,11 7,73 65,00 6,06 9,32

1280 47,00 6,35 13,50 42,50 3,79 8,91

2560 26,75 9,74 36,40 20,50 7,42 36,18

5120 7,75 9,22 119,01 0,25 0,50 200,00

Сравнительные исследования визуального автоматизированного учета результатов в условиях лабораторной клинической диагностики проводились в ГУ РКВД г. Чебоксары при скрининге 26000 донорских сывороток на сифилис. При визуальном учете результатов РПГА было получено 156 сомнительных результата и 4 положительных, в то время как при автоматизированном учете - 13 сомнительных результатов и 7 положительных. Сыворотки с сомнительным результатом были протестированы повторно после абсорбции их контрольными эритроцитами. В результаге этой процедуры количество сомнительных результатов при визуальном учете сократилось со 156 до 14, а при автоматическом учете - с 13 до 6 Все сомнительные сыворотки были отрицательны при тестировании методами РПР и РИФабс Четыре положительные сыворотки, выявленные при визуальном учете результатов РПГА, подтвердились при тестировании методами РПР и РИФабс. Из семи положительных сывороток, выявленных при помощи комплекса «Критерий 2» только четыре были положительны в РПР, однако все семь подтвердились методом РИФабс. Таким образом, результаты сравнительного анализа показали, что оператор подходит к оценке результатов субъективно, так как при визуальном учете получено 156 сомнительных результатов, в то время как при помощи РПГА-АКАТ было получено всего лишь 13 сомнительных результатов Полученные отрицательные результаты методами РПР и РИФабс, при дополнительном исследовании этих сывороток с сомнительным результатом подтверждают правильнос1ь оценки «Критерием 2».

Таким образом, автоматический учет результатов РПГА, в сравнении с визуальным их учетом, позволил более чем на порядок (примерно в 12 раз) снизить число потенциально ложно-положительных результатов при первичным скрининге. Следовательно, применение АПК «Критерий 2» существенно увеличило специфичность РПГА при массовом скрининге Кроме того, автоматический учет результатов с помощью

«Критерия 2» позволил существенно (в 1,75 раза) увеличить чувствительность РПГА при скрининге донорских сывороток.

РПГА-АКАТ для определения антигенов бруцелл и ее сравнение с ИФА

Основные результаты разработки РПГ А-АКАТ с использованием коммерческой тест-системы для детекции анти-трепонемных антител «Люис РПГА тест», были далее использованы при создании РПГ А-АКАТ для выявления антигенов бруцелл.

Тесты РПГА-АКАТ и ИФА были разработаны с использованием в качестве выявляющих антител (конъюгат в ИФА и сенсибилизирующие антитела в РПГА) мАТ Вг8. Это позволило провести корректную сравнительную оценку чувствительности и специфичности двух методов (см. табл. 2), поскольку иммунологическая специфичность и аффинитет при распознавании ЛПС бруцелл были обеспечены одними и теми же мАТ.

Таблица 2. Сравнение чувствительности и специфичности РПГА-АКАТ и ИФА для детекции бруцелл

Виды Штаммы Минимальное выявляемое кол-во, тыс.м.к /мл

РПГА-АКАТ ИФА

В abortus 19, 99, 544, 104M, 340, 343, 344 9,8 -19,5 19,5-78

345 156-312 50000-100000

82 (R-форма) 39-78 78

B.melitensis 16M 156-312 25000-100000

705, 706 9,8 - 78 78

B-115 (R-форма) Полевые Отр. 39-312 Отр. 625 - 5000

В suis 1330,65/686 39 19,5-156

40 78 312000

66 (Tomsen) 5000-10000 100000

В neatomae 66/2 78 39-78

В canis K-01- R, RM 6/66 (R-формы) Отр. Отр.

Y.enterocolitica 0.9, StyphimuriumSF1167, E coli 0.157, E.coli K-12 JM83, F.tularensis Отр. Отр.

ЛПС B. abortus 0,1 - 0,2 нг/мл 0,125 нг/мл

Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о высокой специфичности разработанных тестов ИФА и РПГА-АКАТ, которые выявляли штаммы всех видов бруцелл и не реагировали с представителями бактерий, перекрестно-реагирующих с бруцеллами (Y.enterocolitica 0.9, E.coh К-12 JM 83, E.coli 0:157, Styphimurium SF1167, F.tularensis) Особенно важно отметить отсутствие перекрестной реакции с Y.enterocolitica 0.9, так как выраженное сходство между О-цепями ЛПС бактерий рода Brucella и К enterocolitica 0.9 (Gerbier, 1997) обусловливает подавляющее число ложно-положительных реакций при серодиагностике бруцеллеза Наибольшая чувствительность (9,8 - З9х103 мк/мл) РПГА-АКАТ была зарегистрирована для

референтных штаммов вида В abortus (9,8 - З9х103 мк/мл), В suis (39 - 78*103 мк/мл) и В melitensis 706 (3 биовар, 9,8 - З9х103 мк/мл). В среднем, штаммы В abortus, В melitensis, В suis и B.neatomae определялись в концентрации 103 - 104 м к./мл. При этом штаммы бруцелл, находящиеся в стабильной R-форме (например, Beams, В melitensis В-115), не давали реакции в ИФА и РПГА, а диссоциированные варианты (S-R) штаммов (B.abortus 82 и др.) снижали порог чувствительности данных тестов. Снижение чувствительности для полевых штаммов В melitensis (см. №15 и №16) и B.melitensis 16М, видимо, связано с их диссоциацией в R-форму. Характерно, что в отношении иммуподетекции штаммов бруцелл чувствительность РПГА-АКАТ в большинстве случаев была заметно выше чувствительности ИФА Чувствительность и специфичность тестов ИФА и РПГА-АКАТ для иммунодетекции бруцелл не менялись при тестировании образцов внешней среды и смешанных бактериальных культур Кроме того, было установлено, что чувствительность ИФА при иммунодетекции бруцелл в молоке с 0,5% и 3,0% жирности даже повышалась.

Введение автоматической оценки и работа с количественным вариантом РПГА для выявления антигенов бруцелл позволило продемонстрировать воспроизводимость тестирования в строго количественном и графическом варианте, а также вычислить средние значения реакции (в ед.КР), определить стандартное отклонение, коэффициент вариации и достоверность получаемых при тестировании результатов РПГА-АКАТ Все это позволило ввести понятие «отсекающего значения (cut-off)» для тестирования (см рис. 5).

Рис 5. Воспроизводимость количественных результатов, полученных с помощью РПГА-АКАТ для выявления антигенов бруцелл и значение cut-off (пунктирная линия, отличие от контроля р < 0,02).

Введение строго количественного значения cut-off для РПГА позволило сделать этот ранее субъективный и полуколичественный метод сравнимым с ИФА, который в свое время также прошел путь от субъективного и полуколичественного учета результатов к

объективному и количественному. В нашем исследовании для иммунодетекции ЛПС и клеток бруцелл было показано, что достоверные результаты (р<0,02) получались при Cut-off = КРк-(ср) + 6, где КРк-(ср) - среднее значение коэффициентов регрессии для РПГА с отрицательным контрольным образцом. Введение адекватного отсекающего значения в РПГА, так же как в ИФА, дает возможность не только достоверно оценивать получаемые результаты, но и повысить чувствительность метода.

Усредненная кривая титрования в РПГА-АКАТ определенного бактериального штамма может послужить характеристикой данного штамма в дальнейших исследованиях, направленных на его идентификацию при проведении научных, эпидемиологических или клинических исследованиях.

Сравнение полученных нами результатов с литературными данными (см. рис. 6) также показало, что впервые методология РПГА-АКАТ позволила получить результаты РПГА, превышающие по чувствительности результаты ИФА.

С«бс?мины* ж

lu J.V» XV

I I I

{

«mmprnip»-^ * , ИФА. РИФ

4 ГПГЛ.

лпс, 0,01 0,1 1 10 100

*Чг ' ' I -I-

H""»™I"4W< . РНАт. ГАГА

L < *"Г*

Собственны! ИЕСЛ. РПГА - АЯАТ

L И*А 4 i .

Рис. 6. Сравнение разработанных РПГА-АКАТ и ИФА для выявления антигенов бруцелл между собой и с литературными данными. Обозначения: ПЦР - полимеразная цепная реакция, ИРМА - иммунорадиометрический анализ, ФИАВР -иммунофлюоресцснтный анализ с временным разрешением; ИФА -иммуноферментный анализ; РИФ - реакция иммунофлюоресценции; РПГА -реакция пассивной гемагглютинации; РНАт - реакция нейтрализации антител, РАГА - реакция агрегат-гемагглютинации.

РПГА-АКАТ для определения антигенов F.tularensis и ее сравнение с ИФА

Основные методологические подходы, реализованные при разработке РПГА-АКАТ для выявления антигенов бруцелл, были применены и для F.tularensis. Для этого было разработаны варианты ИФА и РПГА-АКАТ на основе моноклональных и поликлональных антител. В результате анализа сочетания специфических иммунореагентов была выбрана конструкция, в которой мАТ FB11 были использованы как в виде конъюгата, так и для

сорбции на твердой фазе. В этом варианте ИФА была получена наибольшая чувствительность, которая соответствовала чувствительности подобного теста в ранее опубликованных работах (Мещерякова, 1988) и для штамма РлгЛагетгз 15НИИЭГ составила 3 х 104—2,5 х 105 м.к./мл (по микробным клеткам) и 2,5 нг/мл (по ЛПС). В РПГА-АКАТ, напротив, использование поликлональных антител, а не мАТ, позволило достичь максимально высокой чувствительности, превышающей чувствительность ИФА на порядок (см. табл. 3).

Таблица 3. Чувствительность и специфичность РПГА-АКАТ для детекции F.tularensis

Вид и подвид бактерий Штамм Мин детектируемое кол-во

тыс.м.к./мл КОЕ/мл

holurcliLU 5301,67/70, 17-Б, 268 (атт.) 6-10 29-120

•5 mechasatica Kosho, 543, 55 10-50 62-265

к g СЗ tularensis Schu, В399А Cole 6-50 40 - 295

Вакцинный 15НИИГ 2 2-3

а £ Авирулентный Авирулентный 21/400 503-а 1000000 100000 Н/д Н/д

novicida Utah 112, F6168 Отр Отр

F philomiragia F9693 Отр. Отр

В abortus 19 и 544, Bmelitensis 16М, В suis 1330, Отр. Отр

Y enterocolitica 0:9, Styphimurium SF1167, Е coli 0.157, Е.

coli К-12 JM83, L monocytogenes 7973

ЛПС F tularensis 15 НИИЭГ 0,1-0,25 нг/мл

Как видно из таблицы 3, РПГА-АКАТ был полностью специфичен для возбудителя туляремии Гетерологичные микроорганизмы, а также близкородственные штаммы Ftularensis subsp novicida и вид Fphilomiragia не обнаруживались Характерно, что РПГА-АКАТ выявлял также два авирулентных штамма Ftularensis, с крайне низким уровнем экспрессии ЛПС. Чувствительность тестирования по ОСО мутности ГИСК колебалась для туляремийных штаммов в пределах 103-104 м.к./мл. По количеству кояониеобразующих единиц чувствительность РПГА-АКАТ колебалась в диапазоне 103 -105 т к./мл Чувствительность РПГА-АКАТ для вирулентного штамма F tularensis 503/874 и для вакцинного штамма F tularensis ¡5/10 НИИЭГ составила 3-6*103 т к /мл и 1,5-3><103 т к /мл, соответственно. Чувствительность метода для ЛПС составила 0,1-0,25 нг/мл.

Проведенные нами исследования позволили установить, что для иммунодетекции ЛПС и клеток F tularensis разработанным нами РПГА-АКАТ при Cut-off = КРк-(ср) + 7, где КРк-(ср > - среднее значение коэффициентов регрессии для РПГА-АКАТ с отрицательным контрольным образцом, были получены достоверные результаты (р<0,01). Пример статистической оценки результатов определения антигенов F tularensis и применения cutoff приведен на рис. 7.

Воспроизводимость титрования клеток F tutarenste 13Л0

Квицентрамк« u»toi F Maramtta пробе ты&м к.'мл

Усредненная кривая титрования клеток F tularemia 19(10

SO0 250 125 02,5 3t,2 19,6 7 в Камц|к<рацка нити FJvJmmta • проба, niLiuJMi

Рис. 7. Воспроизводимость количественных результатов, полученных с помощью РПГА-АКАТ для выявления антигенов Ftularensis и значение cut-off (пунктирная линия, отличие от контроля р < 0,01).

Сравнение полученных нами результатов с данными литературы (см. рис. 8) показало, что в отношении детекции антигенов Ftularensis методология РПГА-АКАТ впервые позволила получить результаты, превышающие по чувствительности результаты ИФА.

10° 1U"

. 1 пи)

Собственные а«л. -

РПГА - ДКАТ-4

ИФА

Данные питераття»!

собственные ж

РПГА - АКАТ

РПГА

Рис. 8. Сравнение разработанных РПГА-АКАТ и ИФА для выявления антигенов F Гы/я/тго между собой и с литературными данными.

ВЫВОДЫ

1. Впервые на модели РПГА разработана методология автоматизированного количественного агтлютинационного теста (АКАТ), применимая для различных научных и иммуподиагностических целей, в частности, для иммунодетекции возбудителей и диагностики инфекций Методология основана на количественной оценке результата реакции агглютинации путем компьютерной обработки

оцифрованного изображения реакции в 96-луночном планшете, вычислении зависимого от интенсивности реакции коэффициента регрессии, а также на введении отсекающего значения (cut-off).

2. Впервые разработан аппаратно-программный комплекс (АПК «Критерий 2»), включающий модифицированный сканер, компьютер, принтер, базовое и специализированное программное обеспечение с базой данных для количественного учета результатов агглютинационных тестов (на модели РПГА), применимый для иммуподетекции возбудителей и диагностики инфекций.

3. Разработан вариант РПГА-АКАТ для определения анти-трепонемных антител в сыворотке крови человека. Проведены клинические испытания АПК «Критерий 2» и РПГА в формате АКАТ для серодиагностики сифилиса с помощью тест-системы «Люис РПГА тест» на 26000 сывороток. Продемонстрировано повышение чувствительности (на 43%) и специфичности (в 12 раз) РПГА-АКАТ по сравнению с РПГА с визуальным учетом данных.

4. Разработан РПГА-АКАТ на основе моноклональных антител для определения антигенов бруцелл со 100% специфичностью и чувствительностью 104 м к/мл для бактериальных клеток и 0,1-0,2 нг/мл для ЛПС. В прямых экспериментах по сравнению РПГА-АКАТ и ИФА показана более высокая чувствительность РПГА-АКАТ для бактериальных клеток и одинаковая чувствительность для ЛПС.

5. Разработан РПГА-АКАТ на основе поликлональных антител против ЛПС Ftularensis со 100% специфичностью и чувствительностью 103 - 105 т.к./мл для бактериальных клеток и 0,25 нг/мл для ЛПС Продемонстрирована большая чувствительность РПГА-АКАТ по сравнению с ИФА.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Денисов И.А., Даниленко В.В, Иванова М.В. Автоматический диагностический комплекс анализа изображений тестов РПГА // Тез. докл. на конференции молодых специалистов ФГУП «ЦНИИ Автоматики и Гидравлики» - Вопросы оборонной техники - 2004. - с.9, № 226. - с.39-40

2. Суслов А.П., Теслер М.Э., Волков Д.А., Даниленко В В , Денисов И.А, Коноплева М.В , Матяш Е.В., Поварнина П.Ю., Нестеренко В Г. Автоматическая система учета реакции пассивной гемагглютинации «Критерий-2» // Тез докл. объединенного иммунол. форума. - Russian Journal of Immunology. - 2004. - т.9, np.l. - с. 359.

3. Суслов А.П., Теслер М.Э., Волков Д.А., Даниленко В.В., Денисов И.А., Коноплева М.В., Матяш Е.В., Поварнина П.Ю., Нестеренко В.Г. Объективизация и автоматизация учетов результатов РПГА: новые возможности классического метода // Тез. докл. юбил. научн.-практ конф. посвященной 70-летию дерматовенерологической службы Чувашской Республики «Актуальные вопросы диагностики, лечения инфекций, передаваемых половым путем и болезни кожи» -Чебоксары, 2004. - с. 10-11.

4 Суслов А.П., Чернова Т.А., Прокопьева А.Е., Теслер М Э, Волков Д А., Даниленко В В., Денисов И.А., Коноплева М.В, Нестеренко В.Г. Объективизация и автоматизация учетов результатов РПГА: новые возможности классического метода // Тез. IX всероссийского съезда дерматовенерологов, - М., 2005. - с.50-51.

5. Теслер М.Э., Нестеренко В.Г., Суслов А.П., Волков Д.А., Даниленко В.В., Денисов И.А., Бушмин В.В., Коноплева М.В. Автоматизированный комплекс анализа изображений реакции пассивной гемагглютинации при использовании «Люис РПГА теста» для диагностики сифилиса (Критерий 2) // Матер, конф. «Информационное обеспечение реализации национального проекта «Здоровье»». -Врач и информационные технологии - 2006 г. - №4. - с.94-95.

6 Коноплева М.В., Даниленко В.В., Чернова Т.А, Денисов И А., Прокопьева А.Е , Гордеева Г.В , Бушмин В.В , Волков Д.А., Теслер М.Э , Нестеренко В.Г., Суслов А.П. Аппаратно-программный комплекс для серодиагностики сифилиса методом РПГА: «Критерий 2» // Клиническая дерматология и венерология. - 2006. - №4. - с. 16-20

7. Коноплева М.В , Суслов А.П., Теслер М.Э., Волков Д.А., Даниленко В В., Денисов И А., Нестеренко В Г. Применение аппаратно-программного комплекса (АПК) «КРИТЕРИЙ 2» для контроля качества серодиагностики сифилиса методом РПГА. // Тез. X Всероссийской конференции дерматовенерологов «Организация оказания дерматовенерологической помощи в современных условиях». - М., 2006. - с. 77.

8. Фельдшерова A.A., Эльгорт Д.А., Копоплева М.В, Хац Ю.С., Третьяков О Ю . Кулаков Ю К., Толмачева Т.А., Желудков М М, Суслов А П Высокочувствительная иммуноферментная тест-система на основе моноклональных антител для выявления антигенов бруцелл. // ЖМЭИ. - 2007. -№1 -с 52-57

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www.stprint.ru e-mail: 2akaz@stprint.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать12.01.2007 г.

Актуальность проблемы

Существует множество методов, применяемых для иммунодетекции различных маркеров возбудителей инфекций и иммунодиагностики инфекционных заболеваний. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Методы, основанные на разных принципах, дополняют друг друга в верификации результатов иммуноанализа. Иммунологические методы могут обладать высокой чувствительностью и специфичностью, сравнимой в предельных значениях с молекулярно-биологическими тестами [23, 135]. Метод иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на принципе иммуносорбции, где антитела взаимодействуют с антигеном на твердой фазе, а несвязавшийся избыток реагентов удаляется, обладает высокой чувствительностью и специфичностью, однако этот метод многоэтапный, требует специального оборудования и высокой квалификации персонала. Агглютинационные тесты, основанные на принципе иммунопреципитации (агглютинации), где взаимодействие антител и антигенов происходит в оптимальном соотношении в растворе с образованием «решетки» из антигенов и антител, удобны и просты в постановке, в принципе могут обладать сравнимой с ИФА чувствительностью, но имеют один существенный недостаток субъективизм учета результатов [38, 160]. В современных условиях, когда требования доказательной медицины направлены на исключение ошибок лабораторного персонала путем автоматизации и даже роботизации диагностических методологий, методы твердофазного иммуноанализа подверглись более интенсивному развитию, чем агглютинационные тесты, поскольку больше соответствовали предъявляемым требованиям. В связи с этим, в ходе непрерывного совершенствования иммунодиагностических методов вообще, для агглютинационных тестов наиболее актуальным становится их объективизация, автоматизация, стандартизация, разработка аналитических количественных характеристик [54, 160]. 6

Попытки автоматизации и даже роботизации агглютинационых тестов предпринимались неоднократно, но только фирме Olympus (Япония) удалось создать роботизированную систему для учета результатов реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) и зарегистрировать ее для применения в лабораторной практике, успешно пройдя испытания в FDA (США) [100]. Система Olympus применяется для серодиагностики сифилиса и цитомегаловируса, а также при определении групп крови. Остальные, весьма разнообразные по принципу, попытки автоматизации агглютинационных тестов не получили практического приложения. Однако система Olympus, несмотря на использование очень дорогостоящего оборудования и компьютерного программного обеспечения, не обладает возможностями количественного анализа результатов. Olympus лишь объективизирует учет результатов РПГА и выражает его в трех вариантах (положительный, отрицательный и неопределенный), а еще в 30-50-е годы прошлого века в классических исследованиях Heidelberger и Kendall, Zinsser, Jones и Pol было доказано, что преципитация и агглютинация, лежащие в основе агглютинационных тестов, являются аналитическими количественными реакциями. Метод количественной агглютинации, разработанный в 19291935 гг. Heidelberger и Kendall, позволяет осуществить точное аналитическое определение общего весового количества агглютининов в антисыворотках. Реакция количественной агглютинации была использована для исследования антисывороток к бруцеллам, пневмококкам, гемолитическим стрептококкам, стафилококкам, менингококкам, гонококкам, дизентерийным микробам, дрожжам, H.influenzae В и B.pertussis, B.proteus и S.typhosa [11]. Поэтому становится очевидным, что для того чтобы решать многие научные и иммунодиагностические задачи, используя наряду с иммуносорбентными методами количественные агглютинационные тесты, необходимо разработать методологию количественной, объективной и автоматизированной оценки результатов этих тестов, удобную для применения не только в научных целях, но и в клинической практике. 7

Агглютинационные методы прямой иммунодетекции возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы широко используются. Эти тесты применяют для обнаружения возбудителей хелико-и кампилобактерной инфекции [130], менингококковой инфекции [104], пищевых токсикоинфекций [124], в том числе холерного токсина и энтеротоксина Е.соИ [89], трихомониаза [29], а также ВИЧ [77], аденовирусов [105], герпесвирусов и ротавирусов [114, 167], и возбудителей других инфекций. Кроме того, эти тесты используют для определения групп крови с помощью моноклональных антител [177]. В России, согласно приказу МЗ РФ № 64 от 21.02.2000 «Об утверждении номенклатуры клинических лабораторных исследований», для диагностики 85 инфекций, вызываемых вирусами, бактериями, грибами, гельминтами и простейшими, используют 165 агглютинационных тестов, из которых доля РПГА составляет 32%. Однако до сих пор агглютинационные тесты используют либо в качественном, либо в полуколичественном варианте (определение титра) с визуальным субъективным способом оценки их результатов [54, 63].

Большинство возбудителей инфекций, диагностируемых с помощью агглютинационных тестов, требуют постоянного эпидемиологического надзора и ранней диагностики инфекционных заболеваний. Массовый серологический скрининг населения в России на маркеры сифилиса (около 70 миллионов анализов ежегодно) проводится в подавляющем числе случаев с использованием морально устаревших субъективных методов: реакция Вассермана (РВ), реакция микропреципитации (РМП), реакция иммунофлюоресценции (РИФ), а также РПГА с визуальным учетом результатов. Однако известно, что РПГА - очень удобный простой метод, высокочувствительный и специфичный к Т.раШйит. В настоящее время в условиях перехода на современные методы диагностики сифилиса в России (Приказ МЗ РФ № 87 от 26.03.2001 «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса»), этот метод является альтернативой ИФА и может широко применяться как скрининговый или подтверждающий тест. Главный 8 недостаток РПГА - отсутствие объективного автоматизированного учета результатов. А это противоречит основным требованиям, предъявляемым к современным методам иммунодиагностики [54].

В настоящее время в России сохраняется опасность эпизоотических вспышек бруцеллеза и туляремии, а также существует возможность осуществления актов биотерроризма, связанных с этими инфекциями. Однако как в России, так и в мире, отсутствуют доступные коммерческие тест-системы для иммунодетекции возбудителей бруцеллеза и туляремии, основанные на современных автоматизированных технологиях. Для решения проблем мониторинга за особо опасными инфекциями агглютинационные тесты для иммунодетекции возбудителей представлены среди рекомендованных для полевых исследований диагностикумов как простые, удобные и относительно дешевые тесты [103].

Таким образом, разработка автоматизированного количественного агглютинационного теста для иммунодетекции возбудителей и иммунодиагностики инфекций является актуальной проблемой здравоохранения России для скрининга населения, мониторинга животных и окружающей среды в целях биобезопасности, эпидемиологического надзора и диагностики актуальных инфекций.

Цель работы:

Разработать автоматизированный количественный агглютинационный тест (АКАТ) для определения антигенов и антител на модели РПГА и автоматизированную количественную РПГА для иммунодетекции возбудителей бруцеллеза и туляремии, а также для серодиагностики сифилиса.

Задачи исследования:

1. На модели РПГА разработать методологию автоматизированного количественного агглютинационного теста (АКАТ), основанную на преобразовании визуального ряда данных реакции агглютинации в шкалу количественных значений, полученную в результате оцифровывания изображений, их компьютерной обработки, введения эталонов и расчета коэффициента регрессии.

2. Разработать аппаратно-программный диагностический комплекс, включающий модифицированный сканер, компьютер, принтер, базовое и специализированное программное обеспечение с базой данных для количественного учета результатов агглютинационных тестов (на модели РПГА), применимый для иммунодетекции возбудителей и диагностики инфекций.

3. Разработать вариант РПГА-АКАТ для серодиагностики сифилиса с использованием коммерческих диагностических тест-систем и провести клинические испытания автоматизированного комплекса для серодиагностики сифилиса вариантом РПГА-АКАТ, оценить его преимущества перед обычной методологией.

4. Разработать вариант РПГА-АКАТ для определения антигенов бруцелл с использованием моноклональных антител против ЛПС и изучить чувствительность и специфичность РПГА-АКАТ для иммунодетекции ЛПС в клетках различных видов бруцелл по сравнению с иммуноферментным анализом.

5. Разработать вариант РПГА-АКАТ для определения антигенов РЛиЬгегшв с использованием моноклональных и поликлональных антител против возбудителя туляремии и изучить чувствительность и специфичность РПГА-АКАТ для иммунодетекции ЛПС в клетках различных подвидов возбудителя туляремии в сравнении с иммуноферментным анализом.

Научная новизна

1. Впервые на модели РПГА разработан автоматизированный количественный агглютинационный тест (АКАТ) для определения антигенов и антител, применимый для различных научных и иммунодиагностических целей, в частности, для иммунодетекции возбудителей и диагностики инфекционных заболеваний. С помощью АКАТ решена задача количественной оценки результата реакции агглютинации.

2. Впервые создан аппаратно-программный диагностический комплекс (АПК), необходимый для получения оцифрованных изображений микропланшетов с тестами РПГА, последующего вычисления коэффициента регрессии и классификации полученных изображений по 4-х «крестовой системе». Показана применимость данного АПК для иммунодетекции возбудителей и диагностики инфекций.

3. Впервые разработан вариант РПГА-АКАТ, применяемый для выявления анти-трепонемных антител при серодиагностике сифилиса.

4. Впервые для автоматизированного количественного учета результатов РПГА-АКАТ при серодиагностике сифилиса разработана база данных, позволяющая архивировать информацию о пациентах, параметрах тестирования и полученных результатах в виде коэффициентов регрессии, оценки в 4-х «крестовой системе» и диагностического заключения, а также формировать отчеты с протоколами исследований и проводить целенаправленный поиск данных.

5. Впервые разработан вариант РПГА-АКАТ с использованием моноклональных антител для определения ЛПС и микробных клеток различных видов бруцелл с чувствительностью 103-104 м.к./мл и 0,1-0,2 нг/мл ЛПС, не обладающий перекрестной реакцией с гетерологичными микроорганизмами и по чувствительности превышающий ИФА.

6. Впервые разработан вариант РПГА-АКАТ для определения микробных клеток и ЛПС с чувствительностью 103-104 м.к./мл и 0,25 нг/мл ЛПС, не обладающий перекрестной реакцией с гетерологичными микроорганизмами, и сравнимый по чувствительности с ИФА.

7. Впервые для агглютинационных тестов для расчета достоверности различия положительных значений реакции в опыте по сравнению с

11 контролем и совершенствования интерпретации результатов введено отсекающее значение (cut-off), основанное на количественной оценке результата реакции (коэффициенте регрессии). Показано применение cut-off для прямой иммунодетекции возбудителей бруцеллеза и туляремии методом РПГА-АКАТ.

Научно-практическая значимость

1. Применение технологии автоматизированного количественного агглютинационного теста (АКАТ) позволяет производителям агглютинационных тест-систем (РПГА, латекс-агглютинации и др.) создать новое поколение простых, быстрых, удобных в постановке диагностических тест-систем с новыми возможностями количественного и объективного учета результатов реакции, а затем широко внедрить их для различных целей иммунодиагностики инфекций.

2. Разработанный высокочувствительный тест на основе АКАТ для определения антигенов возбудителя бруцеллеза применим для их иммунодетекции в биологических материалах, а также смывах и пробах из объектов окружающей среды. В настоящее время в России отсутствуют коммерческие тест-системы для прямой иммунодетекции возбудителя бруцеллеза и туляремии.

3. Разработанный высокоэффективный аппаратно-программный комплекс (АПК) «Критерий 2» для серодиагностики сифилиса применяется для первичного массового обследования населения и при дальнейшем лечении больных сифилисом и наблюдении за ними. Кроме того, АПК «Критерий 2» применим для выявления маркеров возбудителя сифилиса в ликворе. Применение АПК позволяет организовать работу по серодиагностике сифилиса методом РПГА в соответствии с современными требованиями доказательной медицины, так как оно дает возможность объективно классифицировать изображения, как по привычной для дерматовенерологов 4-х «крестовой системе», так и по количественному параметру, характеризующему интенсивность реакции (коэффициенту регрессии). Важной частью АПК является База Данных (БД), позволяющая удобно протоколировать процесс постановки РПГА, проводить поиск по пациентам и организациям, а также формировать несколько видов отчетов. Применение АПК «Критерий 2» и РПГА-АКАТ в клинической практике позволяет повысить выявляемость анти-трепонемных антител и снизить количество неопределенных результатов. Применение АПК «Критерий 2» в условиях широкомасштабного скрининга позволяет также не только значительно улучшить качество серодиагностики сифилиса, но и экономить реактивы и рабочее время, затрачиваемые на ретестирование.

Внедрение полученных результатов в практику

1. Зарегистрирован автоматизированный диагностический комплекс для учета результатов РПГА с использованием тест-системы «Люис РПГА тест» (№ ФС 02012005/2712-06).

2. Диагностический комплекс и методика РПГА-АКАТ используется в лабораторной практике в ведущих центрах дермато-венерологической службы: ГУ ЦНИКВИ, ГУЗ РКВД г. Чебоксары, 121 п-ка г. Москвы, 1-й КВД г. Москвы, КВД г. Мытищи, КВД г. Сочи, КВД г. Калуги, КВД г. Ханты-Мансийска, КВД г. Нижневартовска, КВД г. Майкоп, КВД г. Тверь, КВД г. Кызыл, КВД г.Тольятти.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Впервые на модели РПГА разработана методология автоматизированного количественного агглютинационного теста (АКАТ), применимая для различных научных и иммунодиагностических целей, в частности, для иммунодетекции возбудителей и диагностики инфекций. Методология основана на количественной оценке результата реакции агглютинации путем компьютерной обработки оцифрованного изображения реакции в 96-луночном планшете, вычислении зависимого от интенсивности реакции коэффициента регрессии, а также на введении отсекающего значения (cut-off).

2. Впервые разработан аппаратно-программный комплекс (АПК «Критерий 2»), включающий модифицированный сканер, компьютер, принтер, базовое и специализированное программное обеспечение с базой данных для количественного учета результатов агглютинационных тестов (на модели РПГА), применимый для иммунодетекции возбудителей и диагностики инфекций.

3. Разработан вариант РПГА-АКАТ для определения анти-трепонемных антител в сыворотке крови человека. Проведены клинические испытания АПК «Критерий 2» и РПГА в формате АКАТ для серодиагностики сифилиса с помощью тест-системы «Люис РПГА тест» на 26000 сывороток. Продемонстрировано повышение чувствительности (на 43%) и специфичности (в 12 раз) РПГА-АКАТ по сравнению с РПГА с визуальным учетом данных.

4. Разработан РПГА-АКАТ на основе моноклональных антител для определения антигенов бруцелл со 100% специфичностью и чувствительностью 104 м.к./мл для бактериальных клеток и 0,1-0,2 нг/мл для ЛПС. В прямых экспериментах по сравнению РПГА-АКАТ и ИФА показана более высокая чувствительность РПГА-АКАТ для бактериальных клеток и одинаковая чувствительность для ЛПС.

157

5. Разработан РПГА-АКАТ на основе поликлональных антител против ЛПС Рли1агет1з со 100% специфичностью и чувствительностью 103 -105 т.к./мл для бактериальных клеток и 0,25 нг/мл для ЛПС. Продемонстрирована большая чувствительность РПГА-АКАТ по сравнению с ИФА.