Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Совершенствование лабораторной иммунодиагностики ВИЧ-инфекции

На правах рукописи

ТЫРГИНА Татьяна Вячеславовна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

1 7 НОЯ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2011

005000863

Работа выполнена в ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова»

Научные руководители: доктор медицинских наук

Буланьков Юрий Иванович

доктор медицинских наук Максимов Андрей Геннадиевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация: Федерал!,ное государственное учреждение здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова» МЧС России

Защита состоится « 29 » ноября 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.08 при ФГВОУ ВПО Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГВОУ ВПО Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6)

Эмануэль Владимир Леонидович

доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

Автореферат разослан «_» октября 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор Митин Юрий Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Масштабность пандемии ВИЧ/СПИДа, отсутствие средств специфической профилактики, дорогостоящие лабораторная диагностика и лечение дают право отнести проблему ВИЧ/СПИДа к мировым и наиболее важным (Покровский В.И., 2000; Рахманова А.Г. и соавт., 2003, 2011; Белозеров Е.С., Буланьков Ю.И., 2005, 2011; Покровский В.В., 2008; 2010; Eberstadl: N., 2002; Shih T.Y., Chen K.F., 2011). Как отмечают О.П. Щепин и соавт. (2000) первоочередной задачей здравоохранения в условиях рыночной экономики является разработка и внедрение ресурсосберегающих и высокотехнологичных моделей охраны здоровья населения. Оказание медицинской помощи населению стало невозможным без применения новых для здравоохранения технологий - стандартизации медицинских услуг, внедрения формулярной системы, маркетинговых исследований (Вялков AM., 2000; Голиусов А.Т., 2009). Эти программы весьма актуальны в связи с необходимостью обеспечения государственных гарантий по оказанию бесплатной медицинской помощи, обеспечению ее доступности. При стратегическом планировании в здравоохранении в настоящее время одной из основных проблем является определение приоритетов в процессе размещения ограниченных финансовых средств, особенно при обосновании программ комплексных организационных мероприятий по профилактике и лечению инфекционных заболеваний (Беляков H.A., 2011; Рассохин В.В., 2011).

ВИЧ-инфекция является не только медицинской, но и глубоко социальной проблемой. Болезнь поражает, прежде всего, людей репродуктивного и трудоспособного возраста, протекает длительно и остается заболеванием с крайне высокой степенью летальности (ВОЗ, 2007). Она угрожает экономической стабильности многих, в том числе развитых стран, так как с внедрением антиретровирусной терапии продолжительность жизни больных растет, как следствие, кумулятивное число живущих с ВИЧ и нуждающихся в ежедневном дорогостоящем лечении и постоянном лабораторном обследовании увеличивается. Поэтому проблема ВИЧ/СПИДа является одним из постоянно обсуждаемых вопросов на высшем государственном уровне.

До настоящего времени диагностика болезни зачастую представляет определенную трудность. Проблемы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции обусловлены отсутствием абсолютно специфичных тест-систем, высокой стоимостью исследований, недостатками организации их проведения, генетической изменчивостью вируса и схожестью антигенного состава ВИЧ и некоторых структур организма человека (Митин Ю.А., 1997; Покровский В.В. и соавт., 2000, 2010; Буланьков Ю.И. и соавт., 2010; Дементьева Н.Е., Лисицина З.Н. и соавт., 2010, 2011; Jennings С., 2005). В лабораторной службе все большее значение приобретает задача слежения за инфекционным процессом, вызванным самим ВИЧ и своевременного выявления вторичных инфекций, так как пришло

время, когда у десятков тысяч, выявленных на гаже эпидемии - в 2000-2001 гг. - заболевание перейдет из стадии субклинической в стадию предСПИД и СПИД. Это и послужило основанием для выполнения настоящего исследования.

Цель исследования: на основании анализа диагностической эффективности серологического скрининга, референтной и экспертной диагностики, лабораторного мониторинга ВИЧ-инфицированных разработать предложения по совершенствованию лабораторной иммуно- диагностики ВИЧ-инфекции.

Задачи исследования:

1. Провести анализ диагностической эффективности различных иммуноферменгных тест-систем, использованных для серологического скрининга ВИЧ-инфекции.

2. С учетом тенденций распространения и выявления ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге, оценки диагностической и экономической эффективности лабораторных методов ее иммунодиагностики разработать предложения по совершенствованию этиологической диагностики и лабораторного мониторинга ВИЧ-инфицированньгх.

3. Изучить эффективность способа лабораторной оценки активности обратной транскрипгазы (ОТ) ВИЧ в качестве оценочного показателя вирусной нагрузки и эффективности антиретровирусной терапии.

Научная новизна работы

Впервые установлено, что увеличение достоверности этиологической диагностики в Санкт-Петербурге в основном определяется внедрением нового поколения диагностических комбинированных иммуноферментных тест-систем, позволяющих выявлять не только антитела, но и антиген ВИЧ (Аг/Ат). Предложенный показатель прогностичности положительных результатов (ППР) позволил оценить диагностическую эффективность иммуноферментных тест-систем и определить лучшие из использующихся в Санкт-Петербурге, и предложить их для различии этапов диагностики.

Установлено прогностическое значение уровня р24-антигенемии для срока сероконверсии у пациентов с острой ВИЧ-инфекцией.

Предложен новый алгоритм арбитражного этапа исследования образцов крови на ВИЧ с определением р24 и сокращением числа референтных ИФА.

Впервые в стране апробирована и доказаш. диагностическая и экономическая целесообразность внедрения метода определения активности обратной транскриптазы ВИЧ с использованием тест-системы Exavir®load Ver. 3, как маркера активности ретровирусной репликации.

Впервые в Санкт-Петебрбурге проведен анализ затрат на лабораторное сопровождение ВИЧ-инфицированных. Установлено, что важной причиной низкой экономической эффективности диагностики является 4-5-кратное дублирование референтных исследований в расчете на 1 вновь выявленного больного.

Впервые установлена прямая связь низкой экономической эффективности диагностики с несовершенством нормативной базы по обследованию и регистрации ВИЧ-инфицированных, предложено создание регистра больных, который поможет снизить кратность проведения скрининговых и референтных исследований в несколько раз, а также разработан алгоритм анонимного обследования.

Практическая значимость

Дана оценка эффективности лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге. На ее основе разработаны предложения по эффективному использованию диагностических тест-систем на разных этапах экспертизы ВИЧ-инфекции. Предложен новый сокращенный алгоритм референс-диагностики, позволяющий сократить количество исследований, снизить затраты и продолжительность диагностического периода.

Выявленные основные причины диагностических ошибок позволяют предложить эффективные меры для их предотвращения.

Использование критерия прогностичности антигена р24 (выявленной зависимости между уровнем р24-антигенемии и формированием сероконверсии у ВИЧ-инфицированных) может способствовать сокращению количества исследований и сроков постановки диагноза.

При более широком использоваши экспресс-тестов можно рассчитывать на снижение числа диагностических ошибок, сокращение длительности диагностического периода, улучшение результатов лечения ВИЧ-инфицированных в ЛПУ.

Разработка и внедрение регистра ВИЧ-инфицированных с возможностью санкционированного защищенного доступа будут способствовать исключению дублирования исследований у ВИЧ-инфицированных и снижению затрат на диагностику.

Внедрение метода определения активности ОТ ВИЧ, обоснованного в работе, позволит сделать мониторинг эффективности ВААРТ (высокоактивной ангиретровирусной терапии) дешевле и доступнее.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование комбинированных иммуноферментных тест-систем (Аг/Ат), совершенствование системы регистрации больных и создание регистра ВИЧ-инфицированных с возможностью защищенного санкционированного доступа специалистов, более широкое использование в клинических подразделениях бесприборных экспресс-тестов

для выявления маркеров ВИЧ-инфекции будут способствовать сокращению числа ложноположительных и ложноотрицательных результатов лабораторных исследований, сокращению диагностического периода и стоимости диагностики, повышению эффективности лечения ВИЧ-ассоциированных заболеваний.

2. Метод определения активности ОТ ВИЧ является эффективным для определения вирусной нагрузки ВИЧ при диспансерном наблюдении за ВИЧ-инфицированными.

Апробация работы

Результаты исследований и основные положения диссертации были представлены и обсуждены на Российско-итальянской конференции «Актуальные вопросы социально значимых вирусных инфекций» (Великий Новгород, 2009), на Северо-Западной научно-практической конференции «ВИЧ-инфекция и иммуносупрессия» (Санкт-Петербург, 2010), на расширенном заседании НИЛ СПИД и инфекционных болезней Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 10 научных работ, в том числе 1 работа в журнале, рекомендованном ВАК.

Реализация и внедрение результатов работы

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность Городской иммунологической лаборатории Клинической инфекционной больницы имени С.П. Боткина г. Санкт-Петербурга, в учебный процесс кафедр инфекционных болезней Волгоградского государственного медицинского университета, института Медицины Ульяновского государственного университета, Уральской государственной медицинской академии, Научно-исследовательской лаборатории СПИД и инфекционных болезней в ВС РФ кафедры инфекционных болезней (с курсом паразитологии и тропических заболеваний), кафедры факультетской терапии ФГВОУ ВПО Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова.

Личный вклад автора

Весь материал, представленный в диссертации, собран автором в Городской иммунологической лаборатории Клинической инфекционной больницы им. С.П. Боткина, НИЛ СПИД и инфекционных болезней в ВС РФ и на кафедре факультетской терапии Военно-медшсинской академии им. С.М. Кирова. Обработка статистических и клинико-лабораторных данных, интерпретация полученных результатов выполнена лично автором.

Теоретические положения, выводы и практические рекомендации, содержащиеся в диссертации, являются результатом самостоятельного исследования. Личный вклад автора в исследование проблемы состоит:

- в постановке и обосновании цели исследования, выборе объекта, определении задач исследования и их решети;

- в выявлении и формулировании закономерностей лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции;

- в разработке и научном обосновании методических основ комплексного мониторинга больных ВИЧ-инфекцией;

- в разработке общих и частных методических принципов оптимизации лабораторной диагностики ВИЧ/СПИД.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 202 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы (137 отечественных и 69 иностранных источников), 7 приложений, иллюстрирована 51 таблицей и 35 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа выполнена в Городской иммунологической лаборатории Клинической инфекционной больницы имени С.П. Боткина Санкт-Петербурга, где ежегодно обследовалось от 18425 до 19498 человек, биологический материал которых направлялся на экспертную диагностику ВИЧ-инфекции; в НИЛ СПИД и инфекционных болезней в ВС РФ кафедры инфекционных болезней, на кафедре факультетской терапии Воешю-медицинской академии им. С М. Кирова.

В анализ вошли данные, полученные за 7 лет (2005-2011 гг.) работы над проблемой лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. Анализ заболеваемости ВИЧ-инфекцией проводился по методике А. А. Дегтярева [1982] по данным отчетов Центра СПИД г. Санкт-Петербурга и Цешра СПИД Ленинградской области. Проявления эпидемического процесса ВИЧ-инфекции оценивались на основании статистических данных о выявляемое™ ВИЧ-инфекции среди жителей г. Санкт-Петербурга.

Диагноз «ВИЧ-инфекция» верифицировался исследованиями ИФА с обнаружением в крови специфических антител к ВИЧ с последующим подтверждением в реакции иммуноблоттинга. Детям, рожденным от ВИЧ-позитивных матерей, диагноз подтверэдался методом ПЦР на ДНК провируса ВИЧ. Основные методы и объем исследований представлены в табл. 1.

Таблица 1

Основные методы и объем исследований

Методы исследований Объем и методики исследования

Анализ историй болезни больных ВИЧ-инфекцией 975 больных ВИЧ-инфекцией, в том числе 822 мужчины (84,3%) и 153 женщины (15,7%); 18 332 исследования

Лабораторные методы диагностики Общешншические Серологические Биохимические Иммунологические

Эпидемиологические Анализ заболеваемости ВИЧ-инфекцией в Санкт-Петербурге

Анализ ежегодных отчетов Центра СПИД г. Санкт-Петербурга и Центра СПИД Ленинградской области 2005-2010 гг. Анализ работы и годовые отчеты экспертной (93 482 исследования) и скрининговьгх (2 616 558 исследований) лабораторий города и Ленинградской области

Статистическая и графическая обработка данных Формирование баз данных, параметрические и непаргииетрические статистические методы

В исследованиях использовали диагностические тест-системы на анги-ВИЧ 1/2 российского и импортного производства Чаще всего использовали диагностическую тест-систему Дженскрин Ультра ВИЧ Аг/Ат (Genscreen ULTRA HIV Ag/Ab) для определения антител к ВИЧ1 и ВИЧ2 и антигена р24 вируса иммунодефицита человека в сыворотке и плазме крови, позволяющую одновременно обнаружить анти-ВИЧ 1 (М и О группы) и анги-ВИЧ 2 антитела и антигены. Второй системой, используемой для подтверждения ВИЧ-инфекции, в лаборатории являлась ARCHINECT IIIV Ag/Ab Combo, предназначенная для одновременного качественного определения антигена р24 и антител к ВИЧ 1 типа и 2 типа (ВИЧ1 и ВИЧ2) в сыворотке или плазме человека методом хемилюминесцентного иммуноанализа на микрочастицах (ХИАМ).

Лабораторное экспертное заключение об инфицированное™ ВИЧ выносили при получении положительного результата исследования методом иммуноблоттинга.

Для оценки иммунного статуса применяли: а) количественное определение Т и В-лимфоцитов и их субпопуляций, коэффициента иммунорегуляции на проточном цигофлюориметре «FACS Calibur» производства США фирмы Becton Dickinson с использованием моноклональных антител CD3/ CD4/ CD5 и СШ/ CD8/ CD45 той же фирмы в пробирках Trucount (одно-платформенная технология) в цельной крови с лизированием без отмывки; б) количественное определение иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG методом Manchini ct al. [1970]; г) определение уровня циркулирующих иммунных комгшексов; д) определение НСТ-теста (реакция восстановления нитросингаго тетразолия).

Впервые в стране мы изучили возможность лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции при использовании метода Exavir®load Ver. 3 (Cavidi Tcch ЛВ, Uppsala, Sweden), позволяющего оценить вирусную нагрузку по степени активности обратной транскрштгазы (ОТ) ВИЧ с использованием стандартного оборудования для ELISA вместе с запускающим оборудованием ExaVir Load. Метод основан на выделении ВИЧ из плазмы пациента с помощью геля (solid matrix), с последующим лизисом материала и сбором лизата, содержащего ОТ. Вирусная ОТ выявлялась методом ИФА с использованием 96-луночного микропланшета. Дно лунок этого микропланшега покрыто шаблонной РНК. Реакционная смесь, содержащая затравку и субстрат ОТ бром-диоксиуридинатрифосфат (BrdUTP), наносилась вместе с лизатами в лунки, где при наличии в лизатах ОТ начинается синтез цепи ДНК. Этот продукт детектировали с помощью щелочной фосфатазы (ЩФ), конъюгарованной с антителами против бром-диоксиуридина (&-BrdU). Количество продукта синтеза измеряли в присутствии хромогенного субстрата ЩФ. Количественную оцежу активности ОТ ВИЧ в образцах производили с использованием вычислительной программы «ExaVir Load Analyzer».

Для подготовки графических изображений и диаграмм использовался ППП Microsoft Excel 10.0. Для оценки лабораторных показателей использовались стандартные методики. При обработке данных использовался ППП Statistica for Windows 5.0. Формирование базы данных и графическая обработка результатов исследований проводились при помощи ПЭВМ Intel Celeron 700.

Основные результаты исследования 1.0ценка эффективности лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции

Данные проведенного анализа показали, что за 5 лет количество скршшнговых исследований в Санкт-Петербурге выросло на 3,9%. Количество анализов крови, направленных на референтное исследование, увеличилось на 11,4%. Рост объемов референс-диагностики в этот период составил 12,6%, что потребовало соответствующего увеличения объемов экспертной диагностики. Достоверно вырос удельный вес подтвержденных анализов с 67,0% в 2005 году до 74,2% в 2009 году.

Выявленное снижение доли проб, отправляемых в референс-лабораторию (обобщенные данные по Санкт-Петербургу) с 4,3% в 2006 году до 3,4% в 2009 году (в 1,3 раз), на фоне сохраняющегося числа вновь выявляемых случаев ВИЧ-инфекции, свидетельствует об улучшении качества исследований на скрининговом этапе (табл.2). Принципиально, что за этот период произошел переход скрининговых лабораторий с иммуноферментных тест-систем 2-го поколения на 3-4-е.

Таблица 2

Динамика лабораторных исследований на ВИЧ-инфекцию в Санкт-Петербурге в 2005-2009 годах

Годы 2005 2006 2007 2008 2009

Количество скрининговых исследований 537 697 428 028 533 774 558 034 559 025

Количество вновь выявленных (В/В) ВИЧ-инфицированных 2 966 3 384 4 078 3 439 3 382

Количество сывороток, направленных в референс-лабораторию ю __ £ & 18 425 (4,3%) 19 231 (3,6%) 19 179 (3,4%) 19 501 (3,4%)

Количество сывороток, подтвержденных в референс-лаборатории 11 495 (67,0%) 12 824 (69,6%) 13 862 (72,0%) 14 232 (74,2%) 14 470 (74,2%)

Выполнено скрининговых ИФА на 1 вновь выявленного (В/В) / минимальный % 181.3/ 11.0 126,5/ 15,8 130,9/ 15,2 162,2/ 12,4 165,2/ 12,2

Кратность проведения исследований на 1 серопозитивного В/В 5,78 5,44 4,72 5,58 5,77

Кратность проведения арбитражных исследований на 1 В/В 3,88 3,79 3,42 4,14 4,28

Примечание: *для подтверждения диагноза должно быть проведено не менее 2-х ИФА.

Для оценки эффективности лабораторного аналитического этапа референтной диагностики нами проанализированы результаты работы Городской иммунологической лаборатории за 2005 и 2010 гг. (табл. 3).

Отмечается незначительный рост (с 90,5 до 92,2%) доли подтверждения положительного референтного результата при постановке иммунного блоттинга (ИБ). При этом к 2010 году доля данных ИБ с неопределенным результатом снизилась в 1,2 раза (с 9,4 до 7,7%). Таким образом, отпала необходимость проведения повторного ИБ у 20% обследованных (более 160 человек).

Таблица 3

Эффективность референс-диагностики в Городской иммунологической лаборатории Санкт-Петербурга в 2005 и 2010 г.

Годы Референс-положительных проб

Всего Из них положительных вИБЛ/о Из них неопределенных в ИБ/%

2005 2616 2368/90,5 248/9,5

2010 6312 5821/92,3 491/7,7

По причине недостаточного количества направленного для исследования материала в 2005 и 2010 году однократному референс-исследовашпо с положительным результатом: подверглись 140 и 114 проб соответственно. При сравнении исходов экспертной диагностики в группах с двукратным и однократным обследованием достоверных различий не выявлено. Представленные данные свидетельствуют о том, что получение даже первого положительного результата в референтной лаборатории позволяет в перспективе получить, положительный результат в ИБ у 99,0-99,7%. Следовательно, при обследовании в референтной лаборатории при получении первого положительного результата с высокой; степенью достоверности можно назначать ИБ, не дожидаясь или не проводя повторное референтное исследование методом твердофазного иммуноферментного анализа. Это позволит существенно сократить прямые финансовые затраты на диагностику и длительность диагностического периода без снижения качества диагностики. При этом принятый диагностический алгоритм (рис. 1) будет иметь альтернативный вид (рис.2):

Серологический скрининг (2 ИФА+)

Рис. 1 Принятый алгоритм лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции

Серологический скрининг (2 ИФА+)

Рис. 2 Возможный алгоритм лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции.

Установлена высокая кратность проведения экспертных и референс-исследований в пересчете на одного вновь выявленного больного, что обусловлено дублированием исследований у больных, обследующихся анонимно, скрывающих свой ВИЧ-статус, невысоким качеством дотестового консультировании. Перспективным направлением оптимизации системы диагностики ВИЧ-инфекции может стать создание регистра ВИЧ-инфицированных с защищенным доступом к информации профильных медицинских специалистов.

Для определения прогностичности положительных результатов (ППР) скрининговой

или референтной ИФА-диагностики ВИЧ-инфекции, полученных с использованием

определенной тест-системы, нами изучалось соотношение истинно-положительных

результатов к сумме истинно-положительных и яожноположительных результатов,

истинность или ложность которых была установлена в результате проведения в

последующем экспертной диагностики методом иммунного блота:

ггпг, Истинно - положительные

ППР- —----- ] оо%

Истинно - положительные + ложиопаложительные

Учитывая данный показатель, лучшими тест-системами среди используемых в нашем исследовании для скрининговой диагностики ВИЧ-инфекции оказались: GENSCREEN ULTRA HIV Ag/Ab, Био-Рад, Франция (ППР - 93,7 %), ДС-ИФА-ВИЧ-АГАТ-скрин «Диагностические системы», Россия (ППР — 84,9 %). Наибольшая диагностическая эффективность установлена для иммуноферментных тест-систем, изготовленных на основе смеси гликопротеина gp 160, синтетических пептидов ВИЧ1 и ВИЧ2, воспроизводящих иммунодоминантные эпитопы трансмембранных белков оболочки, и моноклональных антител к антигену ВИЧ р24.

Нами проведен анализ зависимости результатов скрининговой и референтной диагностики от стадии ВИЧ-инфекции в момент постановки лабораторного диагноза пациентам с впервые выявленной ВИЧ-инфекцией. Выявлена тенденция увеличения кратности обследования ВИЧ-инфицированных в стадии 2 ВИЧ-инфекции. Это подтверждает положение о том, что клинические проявления ВИЧ-инфекции в стадии 2А-В обусловлены незавершенностью сероконверсии и низким уровнем специфических анти-ВИЧ Ig.

Нами проанализированы результаты показателей, полученных при обследовании пациентов с изначально отрицательным/неопределенным ИБ, имеющим положительные значения ИФА и антигена р24 в крови. У наблюдаемых больных коэффициент позитивности (КП) р24 вычисляли по формуле: КП = Шоб/""1<и

ОП критически я где: КП - коэффициент позитивности,

ОП образца - значение оптической плотности исследуемого материала,

ОП критическая - стандартный показатель, рассчитывается для каждой ИФА-системы.

Мы взяли для анализа данные 127-ми пациентов, у всех при высоких значениях экстинций р24 был выявлен сомнительный или отрицательный ИБ (острая ВЙЧ-инфекция). В последующем у этих пациентов неоднократно проводились обследования до получения положительного результата в ИБ. При этом уровень р24-антигенемии снижался до отрицательных значений. Как показали расчеты и их анализ, сероконверсия происходила в среднем за 65,2 дня (от 225 до 12 суток). Средняя скорость снижения уровня антигена в сыворотке крови составила 1,4 КП/сут. (от 0,01 КП/сут. до 3,5 КП/сут.). Проведенный статистический анализ позволил выявить устойчивые связи между уровнем антигенемии р24 и сроком наступления сероконверсии (г = -0,87), при этом коэффициент детерминации г2 = 0,76, что указывает на то, что положение не менее 76% точек данной выборки объясняются данной зависимостью.

Дальнейший анализ данных позволил выявить линейную зависимость между уровнем р24 антигенемии и сроком сероконверсии (р<0,001), выраженную формулой:

-1-

1,9059-9.6005037

где: X - срок сероконверсии в неделях, У - уровень р24 антигена (относительный показатель КП у пациентов с отрицательным результатом иммунного блота) [В. Б. Мусатов, 3. Н. Лисицина, Т. В. Тыргина, А. Д. Галачьянц, С. Л. Фирсов, 2010]. Полученные данные позволяют заключить, что уровень р24-антигенемии у пациентов с острой ВИЧ-инфекцией может быть использован для прогноза сроков выявления у них положительного иммунного блота. Применение данной формулы позволит более объективно подходить к назначению повторных арбитражных исследований и сократить их число.

I. .

Для двух используемых в референс-лаборатсрии тест-систем был рассчитан' коэффициент позитивности (КП), позволяющий прогнозировать положительный результат в ИБ (такое его наименьшее значение, при котором с вероятностью в 95% можно прогнозировать наличие ВИЧ-инфекции у пациента (положительный ИБ)). Исследовали образцы сыворотки крови 400 человек, получивших положительные результаты ИФА. В подтверждающей лаборатории им было выдано положительное заключение о наличии ВИЧ-инфекции по данным иммунного блота. Наименьшим значением КП, которое определяло наличие ВИЧ-инфекции у пациента с вероятностью 95% и выше при исследовании системой GENSCREEN ULTRA HIV Ag/Ab стал показатель 16,7, для ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo - 139,9.

Стремление исключить диагностические ошибки в связи с важностью диагноза привело к созданию диагностического алгоритма, построенного на многократном дублировании сходных исследований на всех этапах диагностики. По нашим данным, в этой ситуации затраты на получение положительного скринингового результата ИФА в 2,6 раза больше, чем отрицательного, неопределенный результат в 5,6 раз дороже, чем положительный, и в 14,8 раза- чем отрицательный (рис. 3).

Мы провели расчеты экономических затрат на этиологическую диагностику ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге в 2009- 2010 году.

Общие затраты оцениваются в сумму более 32 млн. рублей. Учитывая тот факт, что за этот период вновь выявлено только 2 938 ВИЧ-инфицированных, можно утверждать, что при правильной регистрации пациентов в момент первичной диагностики (регистр) затраты на референсную и экспертную диагностику можно снизить в 5-6 раз, а на скрининг - вдвое. При этом экономия средств на диагностику ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге может составить 50-70%.

Отрицательный Положительный Неопределенный

Рис. 3 Стоимость лабораторного обследования при отрицательном, положительном и неопределенном результате анализа.

Одной из причин поздней диагностики ВИЧ-инфекции явилось отсутствие возможности использования лабораторных экспресс-методов выявления антител (антигенов) ВИЧ в условиях амбулаторного обследования или стационара.

Для проверки диагностической эффективности трех наиболее распространенных экспресс-тестов нами были проанализированы 600 случаев их использования в качестве скрининговых и арбитражных в научно-исследовательской лаборатории СПИД и инфекционных болезней в ВС РФ Военно-медицинской академии им. С М. Кирова за период 2006-2010 гг. (табл. 4).

Таблица 4

Сравнительная эффективность простых быстрых тестов

% совпадений % расхождений % расхождений

Показатели/ Скрининг*(++) Скрининг* (++) Скрининг* (+-)

Экспресс-тесты ** экспресс(+) ** экспресс (-) ** экспресс (+)

Абс./% Абс.Л/о Абс./%

Детермин (п=492) 468/95,1 20/4,1 4/0,8

Джения (п=120) 112/93,3 6/5,0 2/1,7

ИХА( Фактор-Мед (п=398) 378 /95,0 12/3,0 8/2,0

* В качестве скрининговых использовались отечественные тест-системы (анти-ВИЧ 1/2); ** 2х-кратное исследование.

Сравнительные исследования подтвердили высокую диагностическую ценность простых быстрых тестов для выявления антител: к ВИЧ. Несовершенство нормативной базы использования экспресс-тестов ограничивает их использование в лечебно-диагностических

отделениях ЛПУ, что негативно сказывается на лечении все возрастающего числа больных в 4Б-В стадиях заболевания. Этому способствует большая длительность диагностического периода (11-14 дней), обусловленная высокой степенью централизации арбитражного этапа диагностики. Использование быстрых тестов позволит сократить длительность диагностики ВИЧ-инфекции.

2. Анализ лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции у детей

Общее число детей, имевших перинатальный контакт, в Санкт-Петербурге на 01.01.2009 составило 3033 ребенка. Мы проанализировали результаты лабораторного обследования 210 детей (110 мальчиков, 100 девочек) с установленным диагнозом ВИЧ-инфекции. Основным лабораторным методом, подтверждающим ВИЧ-инфекцию, являлся иммунный блоттинг. Было проведено 549 исследований методом ИБ за весь период наблюдения. Применительно к 169-и детям выполнено 516 исследований, что составляет 3,05 исследования ИБ на ребенка, 33 ребенка обследованы однократно. Диагностическая ценность ИБ, как экспертного метода, у детей первого года жизни ограничена, поскольку более чем у 1/з пациентов выявление белков к оболочечным антигенам было различным.

В этой ситуации важное диагностическое значение приобретают методы молекулярно-генетической диагностики ВИЧ-инфекции.

За весь период наблюдения было проведено 328 исследований на ВИЧ методом ПЦР. В 90% случаев исследования проводились в первый год жизни, что свидетельствует о выявлении маркеров ВИЧ-инфекции к этому возрасту у абсолютного большинства из них. И лишь 10% детей нуждались в проведении повторных исследований в более поздние сроки для подтверждения диагноза. Полученные результаты свидетельствуют о том, что повышение уровня этиологической диагностики ВИЧ-инфекции у детей может быть обеспечено только при комплексном использовании серологических и молекулярно-генетических методов диагностики.

3. Совершенствование лабораторного сопровождения диспансерного наблюдения и антиретровирусной терапии больных ВИЧ-инфекцией

Даже в сравнительно короткий срок (2005 - 2009 гг.) значительно возросло число больных в продвинутых стадиях болезни (стадия 4). Только за 7 лет, с 2002 по 2007 гг., показатель удельного веса больных в стадии СПИД вырос в 49 раз. Динамика заболеваемости ВИЧ-инфекцией и увеличение доли пациентов в продвинутых стадиях заболевания требуют увеличения объема исследований и расходов на лабораторное сопровождение диагностики и диспансерное наблюдение за больными, особенно получающими антиретровирусные препараты.

Помимо значительного увеличения затрат на выполнение количественной ПЦР, высокая степень централизации данного вида исследований (1-2 лаборатории в субъекте Федерации) может создать сложности со своевременностью выполнения данных исследований. Нами изучена возможность использования альтернативного ПЦР лабораторного метода мониторинга эффективности ВААРТ с использованием более доступной и менее затратной технологии.

В соответствии с целью исследования мы изучили эффективность метода оценки ферментативной активности обратной транскриптазы ВИЧ (ОТ), являющейся маркером активности ретровирусной репликации, в лабораторном мониторинге больных ВИЧ/СПИД. Для этого использовали тест-набор «ExaVir Load», который предназначен для молекулярно-генетической диагностики с фотометрической (иммуноферментной) количественной оценкой результатов анализа.

Данпым методом был обследован 241 больной ВИЧ-инфекцией.

У 154 пациентов мы провели сопоставление показателей активности ОТ и количества РНК в плазме крови. Установлено, что из 59 больных с положительным тестом на ОТ также положительный тест на РНК был в 97,7% случаев, в то время как при отрицательных результатах ИФА па ОТ тест на РНК был положительным в 43,1% случаев (у 41 из 95 больных). Выявленный факт мы объясняем тем обстоятельством, что тесты имеют разный нижний диапазон чувствительности: OT-lfg/ml (200 коп/мл), ПЦР (РНК)-50 коп/мл.

Следовательно, положительный тест на активность ОТ ВИЧ высокоспецифичен (97,7%), но по чувствительности уступает определению РНК вируса методом ПЦР (табл. 5).

Таблица 5

Соотношение показателей активности ОТ и РНК

Результаты ОТ, абс./% Результаты РНК

Положительные, абс./% Отрицательные, абс./%

Положительные п=59 57/97,7 2/2,3

Отрицательные п= 95 41/43,1 54/56,9

У больных с положительным результатом обследования на ОТ в 7,7% случаях не удалось выявить р24 при наличии РНК ВИЧ (рис. 4).

Преимуществом метода «ExaVir Load» является то, что частота выявления ОТ не зависит от абсолютного содержания CD4+ лимфоцитов (табл. 6).

7,7

Рис. 4 Данные тестирования больных ВИЧ-инфекцией на р24 при положительных результатах анализа на ОТ (%).

Таблица 6

Частота выявления ОТ у больных с различным уровнем С04+клеток в периферической крови

Уровень CD4+KJiexoK Число больных Частота выявления ОТ, %

>500 в 1 мкл 4.3 62,8

499-350 56 66,1

<349 в 1 мкл 84 59,1

Анализ показал, что эффективная аншретровирусная терапия снижает частоту выявления активности ОТ ВИЧ (рис. 5).

Так, при обследовании 79 больных до лечения ОТ выявлена в 77,2% случаев, на фоне проводимой терапии из 148 больных - лишь у 14,8%. Таким образом, определение активности ОТ у больных ВИЧ-инфекцией является показателем, адекватно отражающим степень репликативной активности ВИЧ и может рассматриваться в качестве альтернативы ПЦР при мониторинге эффективности антиретровирусной терапии и диспансерном наблюдении за больными.

Использование методики определения уровня активности ОТ ВИЧ с иммуноферментной визуализацией результата позволяет значительно сократить расходы на диспансерное наблюдение за ВИЧ-инфицированными и увеличить доступность объективного лабораторного мониторинга эффективности APT.

Рис. 5 Показатели частоты выявления ОТ у больных ВИЧ-инфекцией до лечения и на

фоне АРВТ.

Суммарные результаты финансовых затрат на лабораторный мониторинг ВИЧ-инфицированных в Санкт-Петербурге за год могут быть рассчитаны (табл. 7) и составляют 323-330 млн. рублей в год.

Таблица 7

Заграты на лабораторный мониторинг ВИЧ-инфицированных за год (в ценах 2010 г.)

Наименование Количество диспансерных пациентов Стоимость (руб.)

2009 г. 2010 г. 2009 г. 2010 г.

Постановка на диспансерный учет 3430 2938 17829140 15271724

Стоимость диспансерного обследования без ВААРТ 17500 18140 196560 000 203748480

Стоимость диспансерного обследования на ВААРТ 4500 4612* 108787500 111495100

Всего 323176640 330515304

Примечание: *Расчет произведен на 5433 начавших и 4612 продолжающих ВААРТ пациентов.

При условии соответствия кратности обследования перечисленных в таблице 7 категорий стандартам оказания медицинской помощи «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным болезнью, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ)», приказ Минздравсоцразвития России № 474 от 09. 07. 2007г, требуемый объем годового финансирования лабораторного обследования ВИЧ-инфицированных составит 323 млн. руб.

Представленный анализ свидетельствует о том, что в условиях развившейся эпидемии основные экономические затраты приходятся на лабораторное сопровождение диспансерного наблюдения за ВИЧ-инфицированными и определяются

высокотехнологичными исследованиями для выявления уровня вирусемии, как основного фактора оценки показаний к назначению APT и ее эффективности. До 60% затрат связано с молекулярно-генегическими исследованиями. Таким образом, при объявленной стоимости 1 анализа на определение активности ОТ ВИЧ в пределах 15-20$ (400-550 рублей), что в 6-7 раз ниже, чем при использовании сертифицированных тест-систем фирмы Roshe (Франция), использование апробированного нами метода определения активности ОТ ВИЧ способно значительно снизить финансовую нагрузку на бюджет, расширить возможности доступа к исследованиям, повысить эффективность лечения.

ВЫВОДЫ

1. Увеличение объема лабораторных исследований в Санкт-Петербурге за последние 5 лет произошло на фоне внедрения комбинированных (Аг/Ат) иммуноферментных тест-систем 4-го поколения, имеющих высокую чувствительность и специфичность, что способствовало достоверному сокращению доли ложноположительных и ложноотрицательных проб. Наибольшая диагностическая эффективность установлена для иммуноферментных тест-систем, изготовленных на основе смеси гликопротеина gpl60, синтетических пептидов ВИЧ1 и ВИЧ2, воспроизводящих иммунодоминантные этггопы белков оболочки, и моноклональиых антител к антигену ВИЧ р24.

2. Высокая частота повторных исследований в арбитражных лабораториях (до 5,8 на 1 вновь выявленного ВИЧ-инфицированного в год) значительно увеличивает финансовые расходы на этиологическую диагностику ВИЧ-инфекции.

3. Использование комбинированных тест-систем 4-го поколения (Аг/Ат) позволяет сократить число референс-исследований и при получении первого положительного результата референс-ИФА проводить экспертное исследование методом ИБ.

4. Использование при диагностике острой ВИЧ-инфекции критерия прошостичности, рассчитанного на основании уровня антигена ВИЧ р24, позволяет прогнозировать срок сероконверсии и сократить число арбитражных исследований.

5. Использование простых быстрых тестов в клинических подразделениях у больных с симптомами СПИД-ассоциированных заболеваний позволяет сократить длительность диагностики ВИЧ-инфекции и своевременно начать специфическое лечение.

6. Сочетанное использование серологических и молекулярно-генетических методов диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных ВИЧ-инфшшрованиыми матерями, позволяет сократить длительность диагностического периода до 1 года у 90% инфицированных.

7. Способ оценки вирусной нагрузки ВИЧ методом определения активности ОТ ВИЧ с использованием тест-системы Exavir®load Ver. 3 с иммуноферментной визуализацией эффективен, высокоспецифичен, позволяет достичь высокой степени совпадения результатов с результатми ПЦР (97,7%) при более высокой чувствительности ПЦР и низкой себестоимости определения активности ОТ ВИЧ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью повышения эффективности серологического скрининга целесообразно использовать иммуноферментные тест-системы на основе смеси гликопротеина gpl60, синтетических пептидов ВИЧ1 и ВИЧ2, воспроизводящих иммунодоминанпше эшггопы белков оболочки, и моноклональных антител к р24; синтетических пептидов в сочетании с рекомбинантными белками и трансмембранным белком gp3 6 ВНЧ2.

2. При получении отрицательного (неопределенного) результата ИБ рекомендуется использовать определение уровня антигена ВИЧ р24 и предложенного критерия прогностичности.

3. С целью выявления серологических маркеров ВИЧ-инфекции у больных с симптомами СПИД-ассоциированных заболеваний рекомендуется использовать бесприборные простые быстрые тесты.

4. С целью сокращения кратности проведения исследований и финансовых затрат на этиологическую диагностику ВИЧ-инфекции разработать положения и внедрить регистр ВИЧ-инфицированных с возможностью санкционированного защищенного доступа специалистов.

5. Экспертное исследование ИФА-положительных образцов, полученных при анонимном скрининге, рекомендуется проводить после консультирования и отказа пациентов от анонимности.

6. Рекомендовать метод определения активности ОТ ВИЧ с использованием тест-системы Exavir®load Ver. 3 с иммуноферментной визуализацией в качестве допустимой альтернативы ПЦР при диспансерном наблюдении за ВИЧ-инфицированными.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мусатов В. Б. Уровень р24-антигенемии как предиктор ранней сероконверсии при острой ВИЧ-инфекции/ В. Б. Мусатов, 3. Н. Лисицина, Т. В. Тыргина, А. Д. Галачышц // Альманах Инфекционные болезни. - СПб., 2009. - С. 134-137

2. Ковелеиов А. Ю. Экономические и клинические аспекты ВИЧ-инфекции / А. Ю. Ковеленов, И. М. Улюкин, Т. В. Тыргина, Т. А. Сташискис // Медлайн-Экспресс. - 2009. - №6. - С. 8-10

3. Буланьков Ю. И. Патология органов дыхания у больных ВИЧ-инфекцией / Ю. И. Буланьков, Т. В. Тыргина, И. В. Макарова // Медлайн-Экспресс. -2009. - №2-3. - С. 35-37

4. Тыргина Т. В. Особенности лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции у детей / Т. В. Тыргина, 3. Н. Лисицина// Медлайн-Экспресс. -2009. -№6. -С.3-35

5 Мусатов В. Б. Диагностическая значимость определения р24 ВИЧ в верификации острой стадии ВИЧ-инфекции / В. Б. Мусатов, 3. Н. Лисицина, Т. В. Тыргина, А. Д. Галачьянц, С. Л. Фирсов /' ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. - 2010. -Т.2, Jfel. - С. 46-50

6. Якубенко А. Л. Характеристика случаев поздно выявленной ВИЧ-инфекции в г.Санкт-Петербурге в 2008г / А. Л. Якубенко, В. Б. Мусатов, Т. В. Тыргина // Тезисы конференции Северо-Балитйского конгресса по инфекционным болезням. - 2009. - С. 84

7. Мусатов В. Б. Определение уровеня р24-аш-игенемии как предиктора ранней сероконверсии при острой ВИЧ-инфекции / В. Б. Мусатов, 3. Н. Лисицина, Т. В. Тыргина, А. Д Галачьянц // Тезисы конференции Северо-Балигйского конгресса по инфекционным болезням. - 2009. - С. 50

8. Буланьков Ю. И. Ошибки лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции / Ю. И. Буланьков, Т. В. Тыргина // Медлайн-Экспресс. - 2010. -№2-3. - С. 17-21

9. Мусатов В. Б. Поздно выявленные случаи ВИЧ-инфекции среди госпитализированных пациентов / В. Б. Мусатов, А Л. Якубенко, Т. В. Тыргина // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. -2010. -Т.2, №3. - С. 88-90

10. Лисицина 3. II. Стандарты лабораторных исследований и рассмотрение затрат по выявлению в контролю за ВИЧ / 3. Н. Лисицина, Л. И. Крутицкая, П. Е. Дементьева, Т. В. Тыргина, М. А. Денисова // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. - 2010. - Т.2, №4. - С. 79-85

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Аг/Ат- антиген-антитело

ВААРТ (APT) - высокоактивная антиретровирусная терапия

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИБ - иммунный блоттинг

ИФА - иммуноферментный анализ

ОТ - обратная транскриптаза

ПЦР - полимеразная цепная реакция (ПЦР)

РНК - рибонуклеиновая кислота

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

TMP - трансмембранный белок

ЩФ - щелочная фосфатаза

ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ, ТИФА BrdU - бром-диоксиуридин Ig - иммуноглобулин

Формат 60x84/16 Заказ №716

Подписано в печать 25.10.11

Обьем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Типография BMA, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6.

АКТУАЛЬНОСТЬ. До настоящего времени открытие вируса иммунодефицита человека вызывает обширный общественный резонанс. Прямым следствием является небывало высокое финансирование разработок, направленных на диагностику, лечение больных, профилактику ВИЧ/СПИД, а также фундаментальных исследований. В середине 80-х годов в них включились и выдающиеся ученые с мировым именем, и молодые специалисты многих стран. В результате очень скоро о ВИЧ стало известно значительно больше, чем о некоторых других, давно описанных инфекциях. Например, база данных Национальной медицинской библиотеки США на начало 2000 года содержала информацию о 48 703 публикациях, касающихся ВИЧ (о вирусе гриппа - в два раза меньше) [Ваг11ей I., Вопо Ь., 2008].

Хотя пандемия ВИЧ/СПИД продолжается три десятилетия и на борьбу с ней ежегодно расходуются триллионы долларов США, она регистрируется во всех странах мира.

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) в качестве руководящего и координирующего органа в области международного здравоохранения в рамках системы ООН возглавляет глобальные ответные меры сектора здравоохранения на ВИЧ/СПИД. Генеральный директор ВОЗ 1 декабря 2010 года, во Всемирный день борьбы со СПИДом, отметил, что эпидемию СПИДа удалось остановить. За последние 10 лет число новых ВИЧ-инфекций снизилось почти на 20%. Число смертей, связанных со СПИДом, уменьшилось почти на 20% за последние 5 лет, а общее число людей, живущих с ВИЧ, стабилизировалось [Ьйр/МЬол^./Ыу. ги., 2011]. Вместе с тем он отметил, что к концу 2009 года в мире проживало 33,3 млн. больных ВИЧ-инфекцией, в том числе 15,9 млн. женщин, 2,5 млн. детей, за год вновь заразилось 2,6 млн. человек, умерло 1,8 млн. больных, остались сиротами 16.6 млн. детей. Каждый день в мире семь тысяч человек заражаются ВИЧ.

ВИЧ-инфекция является не только медицинской, но и глубоко социальной проблемой. Болезнь поражает, прежде всего, людей репродуктивного и трудоспособного возраста, протекает длительно и остается заболеванием со 100% летальностью [ВОЗ, 2007]. Она угрожает экономической стабильности многих, в том числе развитых стран, так как с внедрением антиретровирусной терапии продолжительность жизни больных растет, как следствие, кумулятивное число живущих с ВИЧ и нуждающихся в ежедневном дорогостоящем лечении и постоянном лабораторном обследовании увеличивается. Поэтому проблема ВИЧ/СПИДа является одним из постоянно обсуждаемых вопросов на высшем государственном уровне, на совещаниях стран «восьмерки».

Масштабность пандемии ВИЧ/СПИДа, отсутствие средств специфической профилактики, дорогостоящие лабораторная диагностика и лечение дают право отнести проблему ВИЧ/СПИДа к мировым и наиболее важным [Покровский В.И., 2000; Рахманова А.Г. и соавт., 2003; Покровский В.В., 2008; Белозеров Е.С., Буланьков Ю.И., 2005; Белозеров Е.С. и соавт., 2011; Eberstadt N., 2002]. Особенно экономические проблемы касаются развивающихся стран. Так, в лучшем случае, лишь каждый десятый житель Африки и каждый седьмой житель Азии из числа больных получают необходимое лечение, и это при том, что истинное число больных значительно выше официально регистрируемых [Покровский В.В., 2004; Каллингс Л., 2003; ООН, 2005; Розенталь В.В., 2010].

Эпидемии ВИЧ-инфекции присущи характеристики как кратковременной чрезвычайной ситуации, так и долгосрочного кризиса развития. Поэтому необходимы новые и смешанные формы ответной деятельности [ЮНЭЙДС, 2004, 2008].

До 1996 года Россия относилась к государствам с низким уровнем распространения ВИЧ-инфекции. В период с 1987 по 1996 год отмечались сравнительно низкие показатели заболеваемости. Новый этап эпидемии ВИЧ-инфекции начался в 1996 году и связан он был с проникновением вируса иммунодефицита в среду потребителей внутривенных наркотиков (ПИН), причем наркомания приобрела черты эпидемии [Покровский В. В. и др., 1998; Leinikki Р., 1997]. Как отмечает Г.Г. Онищенко [2003], в России на начало 2002 года на диспансерном учете состояло 317 тыс. человек, это в 5 раз больше, чем в 1995 году, а количество страдающих наркоманией женщин с 1991 г. увеличилось в 8,2 раза. По данным координаторов проекта «снижение вреда» D. Burrows et al. [1999] в России к концу века насчитывалось более 1 млн. человек, употребляющих наркотики внутривенно. По более поздним оценкам специалистов Госсанэпиднадзора РФ эта цифра возросла и превысила 3 млн. человек [Онищенко Г.Г., 2003]. Преимущественно это лица молодого возраста, около 70% из них являются жителями крупных городов.

В общей структуре ВИЧ-инфицированных преобладают мужчины (78% среди взрослых), преимущественно призывного возраста, что снижает оборонный потенциал страны. Так, среди больных, состоявших на учете в 2003 году, 80% инфицированных ВИЧ - молодежь в возрасте 15-19 лет, из которых 76% заразились инъекционным путем [Покровский В.В., 2008; Жолобов В.Е., 2009]. По данным Г.Г. Онищенко [2008], за последние 10 лет российская армия недосчиталась в своих рядах около 3 сухопутных дивизий, к 2005 году свыше 18 тыс. подростков призывного возраста не были мобилизованы в армию, так как страдали ВИЧ.

Симптоматику ВИЧ-инфекции в стадии развернутой клиники в основном определяют вторичные инфекции, наслоившиеся на иммуносупрессированный фон - супер- (основная группа) или ко- (гепатит С) - инфекции. В эту группу входят наиболее распространенные в популяции здорового населения конкретной географической зоны условнопатогенные (оппортунистические) микроорганизмы: герпесвирусная группа (простой и опоясывающий герпес, цитомегаловирусная инфекция, саркома Капоши и лимфома Беркитта), микозы (преимущественно кандидоз, пневмоцистоз, криптококкоз), микобактериозы (туберкулез, атипический микобактериоз), протозойные инфекции (токсоплазмоз, криптококкоз) [Лысенко А .Я. и соавт., 1996; Покровский В.В. и соавт., 2000; Рахманова А.Г., 2000; Карабеков А.Ж., 2000; Ерохин В.В., 2005; Белозеров Е.С. и соавт., 2009; Рассохин В.В., Степанова Е.В., 2010]. Но все большую роль начинают играть в исходах СПИДа классические инфекции - вирусные гепатиты В и С, туберкулез [Алшинбаева Г.У., 2003; Белозеров Е.С., Буланьков Ю.И., 2000, 2005; Беделл Р., 2004; Griffith D., 2007]. Значительную роль в клинике СПИДа приобрели злокачественные опухоли, обусловленные группой онковирусов (вирус папилломы человека, Эпштейна-Барр вирус, герпесвирус 8-го типа). Поэтому в лабораторной службе все большую значимость приобретает задача слежения за инфекционным процессом, вызванным самим ВИЧ и своевременного выявления вторичных инфекций, так как пришло время, когда у десятков тысяч, выявленных на пике эпидемии - в 2000-2001 гг. -заболевание перейдет из стадии субклинической в стадию предСПИД и СПИД.

О.П. Щепин и соавт. [2000] отмечают, что первоочередной задачей здравоохранения в условиях рыночной экономики является разработка и внедрение ресурсосберегающих и высокотехнологичных моделей охраны здоровья населения. Оказание медицинской помощи населению стало невозможным без применения новых для здравоохранения технологий -стандартизации медицинских услуг, внедрения формулярной системы, маркетинговых исследований [Лазарева Е.В., 1999; Вялков А.И., 2000; Голиусов А.Т., 2009]. Эти программы весьма актуальны в связи с необходимостью обеспечения государственных гарантий по оказанию бесплатной медицинской помощи, обеспечению ее доступности. При стратегическом планировании в здравоохранении в настоящее время одной г из основных проблем является определение приоритетов в процессе размещения ограниченных финансовых средств, особенно при обосновании программ комплексных организационных мероприятий по профилактике и лечению инфекционных заболеваний.

Практически сразу после первых сообщений о ВИЧ появилась информация о его чрезвычайно высокой изменчивости. Скорость генерации ошибок у ревертазы ВИЧ настолько высока, что в природе, по-видимому, нет двух абсолютно идентичных геномов ВИЧ. Более того, изменчивость в самой вариабельной части генома, кодирующей гликопротеин оболочки вирусной частицы, даже у одного больного часто составляет 15%, а различия между вирусами, выделенными в разных странах, достигают подчас 40-50%. Сегодня в международной базе данных есть информация о геномах более чем 25 тысяч вариантов ВИЧ-1, обнаруженных в различных регионах земного шара. Сравнение их позволяет выделить три группы вирусов: "М" (от английского «major», больший) включает подавляющее большинство известных ныне изолятов ВИЧ-1, «N» и «О» объединяют пока относительно небольшое число вариантов ВИЧ-1, выявленных, в основном, в Западной Африке. Вирусы группы «М», в свою очередь можно подразделить на субтипы, обозначаемые буквами английского алфавита, от «А» до «К» [Calugi G., 2006].

Чрезвычайный интерес представляет тот факт, что в разных странах мира доминируют отличающиеся субтипы. В государствах Центральной и Западной Африки можно обнаружить все субтипы ВИЧ-1, однако доминируют вирусы субтипов А и С - самые распространенные в мире. В странах Западной Европы, Северной Америки, а также в Австралии, Японии наиболее распространены вирусы В. В Африке, напротив, они встречаются относительно редко, и их появление там связано с вторичным заносом из других стран.

Несмотря на крайне высокую изменяемость вируса (до 1% изменений в геноме за год), ни один из вариантов ВИЧ не переходит границ своего субтипа. Иными словами, если пациент был инфицирован вирусом субтипа А, то какие бы изменения его генома ни происходили в дальнейшем, он никогда не станет вирусом субтипа В. Очевидно, это отражает определенные закономерности эволюции ВИЧ.

За сравнительно короткое для истории медицины время, прошедшее с июня 1981 г., когда специалисты CDC (центр контроля заболеваемости, США) обратили особое внимание на сведения о 5 больных с пневмоцистной пневмонией и кандидозом, был выполнен беспрецедентно большой объем научных исследований по проблеме лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции, предложены эффективные тест-системы. Однако до настоящего времени диагностика болезни зачастую представляет определенную трудность. Связано это с тем обстоятельством, что ВИЧ/СПИД является болезнью со 100%-ной летальностью, а общество настороженно относится к ВИЧ-инфицированным, установление такого серьезного диагноза налагает особую ответственность на врачей за психоэмоциональное состояние, социальную адаптацию, а порой и за жизнь больного.

Проблема лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции усугубляется несовершенством диагностических тест-систем, обусловленным с одной стороны технологическими трудностями, с другой - высокой генетической изменчивостью вируса и схожестью антигенного состава ВИЧ и некоторых структур организма человека [Митин Ю.А., 1997; Покровский В.В. и соавт., 2000; Буланьков Ю.И. и соавт., 2010; Дементьева Н.Е. и соавт., 2010; Jennings С., 2005].

Все вышеперечисленное послужило основанием для выполнения настоящего исследования.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: на основании анализа диагностической эффективности серологического скрининга, референтной и экспертной диагностики, лабораторного мониторинга ВИЧ-инфицированных разработать предложения по совершенствованию лабораторной иммунодиагностики ВИЧ-инфекции.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Провести анализ диагностической эффективности различных иммуноферментных тест-систем, использованных для серологического скрининга ВИЧ-инфекции.

2. С учетом тенденций распространения и выявления ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге, оценки диагностической и экономической эффективности лабораторных методов ее иммунодиагностики разработать предложения по совершенствованию этиологической диагностики и лабораторного мониторинга ВИЧ-инфицированных.

3. Изучить эффективность способа лабораторной оценки активности обратной транскриптазы (ОТ) ВИЧ в качестве оценочного показателя вирусной нагрузки и эффективности антиретровирусной терапии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые установлено, что увеличение достоверности этиологической диагностики в Санкт-Петербурге в основном определяется внедрением нового поколения диагностических комбинированных иммуноферментных тест-систем, позволяющих выявлять не только антитела, но и антиген (Аг/Ат). Предложенный показатель прогностичности положительных результатов (illIP) позволил оценить диагностическую эффективность иммуноферментных тест-систем и определить лучшие из использующихся в Санкт-Петербурге, и предложить их для различных этапов диагностики.

Установлено прогностическое значение уровня р24-антигенемии для срока сероконверсии у пациентов с острой ВИЧ-инфекцией.

Предложен новый алгоритм арбитражного этапа исследования образцов крови на ВИЧ с определением р24 и сокращением числа референтных ИФА.

Впервые в стране апробирована и доказана диагностическая и экономическая целесообразность внедрения метода определения активности обратной транскриптазы ВИЧ с использованием тест-системы Exavir®load Ver. 3, как маркера активности ретровирусной репликации.

Впервые в Санкт-Петебрбурге проведен анализ затрат на лабораторное сопровождение ВИЧ-инфицированных. Установлено, что важной причиной низкой экономической эффективности диагностики является 4-5-кратное дублирование референтных исследований в расчете на 1 вновь выявленного больного.

Впервые установлена прямая связь низкой экономической эффективности диагностики с несовершенством нормативной базы по обследованию и регистрации ВИЧ-инфицированных, предложено создание регистра больных, который поможет снизить кратность проведения скрининговых и референтных исследований в несколько раз, а также разработан алгоритм анонимного обследования.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Проведена оценка эффективности лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге. На ее основе разработаны предложения по эффективному использованию диагностических тест-систем на разных этапах экспертизы ВИЧ-инфкции. Предложен новый сокращенный алгоритм референс-диагностики, позволяющий сократить количество исследований, снизить затраты и продолжительность диагностического периода.

Выявленные основные причины диагностических ошибок позволяют предложить эффективные меры для их предотвращения.

Использование критерия прогностичности антигена р24 (выявленной зависимости между уровнем р24 антигенемии и формированием сероконверсии у ВИЧ-инфицированных) может способствовать сокращению количества исследований и сроков постановки диагноза.

При более широком использовании экспресс-тестов можно рассчитывать на снижение числа диагностических ошибок, сокращение длительности диагностического периода, улучшение результатов лечения ВИЧ-инфицированных в ЛПУ.

Разработка и внедрение регистра ВИЧ-инфицированных с возможностью санкционированного защищенного доступа будут способствовать исключению дублирования исследований у ВИЧ-инфицированных и снижению затрат на диагностику.

Внедрение метода определения активности ОТ ВИЧ, предложенное в работе, позволит сделать мониторинг эффективности ВААРТ значительно дешевле и доступнее.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД

Весь материал, представленный в диссертации, собран автором совместно с сотрудниками Городской иммунологической лаборатории Клинической инфекционной больницы им. С.П. Боткина, НИЛ СПИД и инфекционных болезней в ВС РФ и кафедры факультетской терапии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Обработка статистических и клинико-лабораторных данных, интерпретация полученных результатов выполнена лично автором.

Теоретические положения, выводы и практические рекомендации, содержащиеся в диссертации, являются результатом самостоятельного исследования. Личный вклад автора в исследование проблемы состоит: в постановке и обосновании цели исследования, выборе объекта, определении задач исследования и их решении; в выявлении и формулировании закономерностей лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции; в разработке и научном обосновании методических основ комплексного мониторинга за больными ВИЧ-инфекцией; в разработке общих и частных методических принципов оптимизации лабораторной диагностики ВИЧ/СПИД.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Использование комбинированных иммуноферментных тест-систем (Аг/Ат), совершенствование системы регистрации больных и создание регистра ВИЧ-инфицированных с возможностью защищенного санкционированного доступа специалистов, более широкое использование в клинических подразделениях бесприборных экспресс-тестов для выявления маркеров ВИЧ-инфекции будут способствовать сокращению числа ложноположительных и ложноотрицательных результатов лабораторных исследований, сокращению диагностического периода и стоимости диагностики, повышению эффективности лечения ВИЧ-ассоциированных заболеваний.

2. Метод определения активности ОТ ВИЧ может эффективно использоваться для определения вирусной нагрузки ВИЧ при диспансерном наблюдении за ВИЧ-инфицированными.

РЕАЛИЗАЦИЯ И ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность Городской иммунологической лаборатории Клинической инфекционной больницы имени С.П. Боткина г. Санкт-Петербурга, в учебный процесс кафедр инфекционных болезней Волгоградского государственного медицинского университета, института Медицины Ульяновского государственного университета, Уральской государственной медицинской академии, Научно-исследовательской лаборатории СПИД и инфекционных болезней в ВС РФ кафедры инфекционных болезней (с курсом паразитологии и тропических заболеваний) ФГВОУ ВПО Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова.

АПРОБАЦИЯ И ПУБЛИКАЦИИ МАТЕРИАЛОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты исследований и основные положения диссертации были представлены и обсуждены на Российско-итальянской конференции «Актуальные вопросы социально значимых вирусных инфекций» (Великий Новгород, 2009), на Северо-Западной научно-практической конференции «ВИЧ-инфекция и иммуносупрессия» (Санкт-Петербург, 2010), на межкафедральном заседании НИЛ СПИД и инфекционных болезней Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова (Санкт-Петербург, 2011).

По теме диссертационного исследования опубликовано 10 научных работ, в том числе 1 работа в журнале, рекомендованном ВАК.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 202 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы (137 отечественных и 69 иностранных источников), 7 приложений, иллюстрирована 51 таблицей и 35 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Увеличение объема лабораторных исследований в Санкт-Петербурге за последние 5 лет произошло на фоне внедрения комбинированных (Аг/Ат) иммуноферментных тест-систем 4-го поколения, имеющих высокую чувствительность и специфичность, что способствовало достоверному сокращению доли ложноположительных и ложноотрицательных проб. Наибольшая диагностическая эффективность установлена для иммуноферментных тест-систем, изготовленных на основе смеси гликопротеина gpl60, синтетических пептидов ВИЧ1 и ВИЧ2, воспроизводящих иммунодоминантные эпитопы белков оболочки, и моноклональных антител к антигену ВИЧ р24.

2. Высокая частота повторных исследований в арбитражных лабораториях (до 5,8 на 1 вновь выявленного ВИЧ-инфицированного в год) значительно увеличивает расходы на этиологическую диагностику ВИЧ-инфекции.

3. Использование комбинированных тест-систем 4-го поколения (Аг/Ат) позволяет сократить число референс-исследований и при получении первого положительного результата референе-ИФА проводить экспертное исследование методом ИБ.

4. Использование при диагностике острой ВИЧ-инфекции критерия прогностичности, рассчитанного на основании уровня антигена ВИЧ р24, позволяет прогнозировать срок сероконверсии и сократить число арбитражных исследований.

5. Использование простых быстрых тестов в клинических подразделениях у больных с симптомами СПИД-ассоциированных заболеваний позволяет сократить длительность диагностики ВИЧ-инфекции и своевременно начать специфическое лечение.

6. Сочетанное использование серологических и молекулярно-генетических методов диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных ВИЧ-инфицированными матерями, позволяет сократить длительность диагностического периода до 1 года у 90% инфицированных.

7. Способ оценки вирусной нагрузки ВИЧ методом определения активности ОТ ВИЧ с использованием тест-системы Exavir®load Ver. 3 с иммуноферментной визуализацией эффективен, высокоспецифичен, позволяет достичь высокой степени совпадения результатов с результатми ПЦР (97,7%) при более высокой чувствительности ПЦР и низкой себестоимости определения активности ОТ ВИЧ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью повышения эффективности серологического скрининга целесообразно использовать иммуноферментные тест-системы на основе смеси гликопротеина gplóO, синтетических пептидов ВИЧ1 и ВИЧ2, воспроизводящих иммунодоминантные эпитопы белков оболочки, и моноклональных антител к р24; синтетических пептидов в сочетании с рекомбинантными белками и трансмембранным белком gp36 ВИЧ2.

2. При получении отрицательного (неопределенного) результата ИБ рекомендуется использовать определение уровня антигена ВИЧ р24 и предложенного критерия прогностичности.

3. С целью выявления серологических маркеров ВИЧ-инфекции у больных с симптомами СПИД-ассоциированных заболеваний рекомендуется использовать бесприборные простые быстрые тесты.

4. С целью сокращения кратности проведения исследований и финансовых затрат на этиологическую диагностику ВИЧ-инфекции разработать положения и внедрить регистр ВИЧ-инфицированных с возможностью санкционированного защищенного доступа специалистов.

5. Экспертное исследование ИФА-положительных образцов, полученных при анонимном скрининге, рекомендуется проводить после консультирования и отказа пациентов от анонимности.

6. Рекомендовать метод определения активности ОТ ВИЧ с использованием тест-системы Exavir®load Ver. 3 с иммуноферментной визуализацией в качестве допустимой альтернативы ПЦР при диспансерном наблюдении за ВИЧ-инфицированными.