Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Совершенствование гибридомной технологии и создание моноклональных антител для систем иммуноанализа

На правах рукописи

САМОЙЛОВИЧ Марина Платоновна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ГИБРИДОМНОЙ ТЕХНОЛОГИИ И СОЗДАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ СИСТЕМ ИММУНОАНАЛИЗА

14.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Сесь Татьяна Павловна доктор медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович доктор биологических наук, профессор Самойлова Кира Александровна

Ведущая организация:

Государственное Учреждение Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

Защита состоится « . 2006 года в 13 часов на заседании

Диссертационного Совета Д.001.022.01 при Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН

ФАЗСР

.2006 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Моноклональные антитела (МкАт) являются мощным инструментом исследования биологических макромолекул. С их помощью изучают структуру и функции ранее открытых молекул, а также выявляют новые антигенные компоненты клеток и тканей [Barclay et al., 1993]. Анализ экспрессии и регуляции генов, идентифицированных в различных геномных проектах, требует создания тысяч и тысяч новых МкАт [Milstein, 2000]. МкАт позволяют обеспечить высокую специфичность, чувствительность и воспроизводимость приемов иммуноанализа и в то же время - увеличить их разнообразие и адаптировать для решения проблем фундаментального и практического характера [Borrebaeck, 2000]. Поэтому создание МкАт для систем иммуноанализа было и остается актуальной задачей.

Опубликование в 1975 году статьи, в которой было описано слияние нормальных плазмацитов с их опухолевыми аналогами - клетками миеломы и последующий отбор клонов-продуцентов антител [Kohler, Milstein, 1975], открыло эру создания, исследования и использования МкАт. Совокупность приемов получения штаммов-продуцентов МкАт была названа гибридомной технологией. В ее основе лежит синтез ряда достижений клеточной биологии, фундаментальной иммунологии и экспериментальной онкологии.

Перспективность гибридомной технологии для развития методов иммуноанализа была высоко оценена исследователями, и лаборатории многих стран мира занялись ее освоением и адаптацией. Вскоре стало понятно, что на каждом этапе создания гибридом имеются многочисленные технические проблемы и что способ их решения определяет результат в целом. Первая из таких проблем связана с высокой зависимостью миеломных хлеток-партнеров от ростовых факторов эмбриональной сыворотки [Fazekas de Groth, 1980, Foster, 1982]. Создание клеточных линий, менее зависимых от экзогенных ростовых факторов, способных расти и давать жизнеспособные гибриды в средах, не содержащих фетальной сыворотки, представляло актуальную задачу. Вторая проблема состояла в том, что при создании гибридом для иммунизации почти повсеместно использовали мышей BALB/c, от которых происходят миеломные штаммы-партнеры [Kearny, 1979, Peterson, 2005]. Это приводило к сужению спектра эпитопов, распознаваемых полученными МкАт. Представлялось целесообразньм в качестве доноров иммунных лимфоцитов использовать животных иного генотипа с иным репертуаром вырабатываемых антител с тем, чтобы получаемые МкАт по эпитопной специфичности могли дополнять ранее создапные реагенты. Наконец, пассирование гибридом на животных с целью получения больших количеств МкАт остается до сих пор «узким местом» гибридомной технологии [Dewar et al., 2005].

Таким образом, совершенствование ряда ключевых этапов гибридомной технологии представляет собой актуальную задачу.

Анализ литературы показывает, что к числу наиболее надежно работающих и чаще всего используемых вариантов иммуноанализа как в фундаментальных исследованиях, так и в лабораторной диагностике, относятся иммунофлуоресцентные и иммунопероксидазные методы детекции антигенов и антител. Наличие МкАт против молекул-маркеров позволяет с большей гибкостью подходить к разработке и применению систем иммуноанализа, создавать иммунные комплексы сложного состава и использовать их для визуализации или инструментальной регистрации продуктов реакции антиген-антитело [Brandtzaeg et al., 1997].

МкАт служат незаменимыми инструментами в вирусологических исследованиях. Иммунохимические способы диагностики вирусных заболеваний основаны на выявлении вирусных антигенов в клетках и в биологических жидкостях, а также на определении спектра циркулирующих в крови антивирусных антител. Респираторно-синцитиальный (РС) вирус человека вызывает тяжелое заболевание нижних отделов дыхательных путей, особенно опасное для новорожденных и детей 1-го года жизни [Hall, 2001]. Этот вирус характеризуется чрезвычайно нестабильной антигенной структурой - она легко нарушается при выделении, очистке и хранении препаратов вируса. Создание МкАт против антигенов РС-вируса открывает пути совершенствования и стандартизации методов иммунодиагностики этой вирусной инфекции.

При диагностике иммунодефицитов, инфекционных, аллергических, аутоиммунных, лимфопролиферативных заболеваний используют методы иммуноанализа, основанные на выявлении иммуноглобулинов (Ig) человека. В антигенном отношении Ig представляют собой молекулы с высокой степенью гомологии, в то же время они имеют антигенные детерминанты, отличающие Ig отдельных типов, изотипов и субизотипов. Создание высокоспецифичных реагентов, способных дифференцировать и детектировать эти молекулы методами иммуноанализа, отвечает запросам фундаментальной и клинической иммунологии.

Цель работы состояла в совершенствовании ряда приемов гибридомной технологии и в создании МкАт против флуоресцеина, пероксидазы, РС-вируса и Ig человека как антигенов, широко используемых в системах иммуноанализа.

Задачи исследования.

1. Создать штамм культивируемых клеток миеломы мышей, независимый от ростовых

факторов эмбриональной сыворотки, позволяющий получать и поддерживать гибридомы на средах с сывороткой крупного рогатого скота (СКРС).

2. Испытать целесообразность использования при создании гибридом лимфоцитов животных

с репертуаром иммунного ответа, отличным от присущего мышам линии BALB/c.

3. Разработать способы эффективной наработки МкАт пассированием штаммов гибридом на

животных.

4. Получить гибридомы-продуценты МкАт против флуоресцеина и пероксидазы - маркеров

антигенов и антител в системах иммуноанализа, а также исследовать свойства этих МкАт и возможности их применения в иммуноанализе.

5. Создать панель МкАт против антигенов РС-вируса человека и отобрать реагенты,

необходимые для иммунодиагностики РС-вирусной инфекции.

6. Создать гибридомы, продуцирующие МкАт против антигенных маркеров изотипов Ig

(IgA, IgM, IgG, IgE) и субизотипов IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) человека.

7. Изучить иммунохимические характеристики МкАт против Ig человека и свойства

распознаваемых ими антигенных детерминант.

8. Разработать лабораторные варианты систем иммуноанализа для определения концентраций Ig отдельных изотипов и субизотипов.

Работа выполнялась в рамках государственной целевой программы О.Ц.043 и КП НТП стран-членов СЭВ "Биотехнология в медицине" (задание - «Разработка и организация производства диагностических реагентов на основе моноклональных антител»), в соответствии с планом научно-исследовательских работ Центрального научно-исследовательского рентгено-радиологического института (номера государственной регистрации 01.83.0 021559, 01.85.0 025322 и 01.99. 0 04371). Исследования, выполняемые соискателем, были поддержаны грантами РФФИ (00-04-49516 и 02-04-49120). Научная новизна.

Создан новый штамм культивируемых клеток миеломы мышей, независимый от ростовых факторов эмбриональной сыворотки.

Впервые для пассирования гибридом и наработки МкАт in vivo в сингенной системе использовано сублетальное облучение реципиентов.

Впервые получены МкАт против пероксидазы, взаимодействующие со всеми изоформами фермента и не ингибирующие его каталитическую активность.

Среди МкАт против РС-вируса человека впервые описаны реагенты, способные дифференцировать полноценный вирус от вирусных частиц, имеющих структурные дефекты.

Впервые при получении МкАт против изотип-специфичных эпитопов IgG человека исследован профиль их антиген-распознакяцей активности и отобраны реагенты, равномерно связывающие все четыре подкласса IgG.

Получены МкАт против изотипических и субизотипических маркеров Ig человека, не имеющие аналогов по эпитопной специфичности.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Использование мышей линии SJL/J позволяет расширить репертуар эпитопов, распознаваемых МкАт.

2. Сублетальное облучение мышей при пассировании гибридом увеличивает эффективность наработки МкАт.

3. Полноценное использование МкАт в иммуноанализе требует одновременного изучения иммунохимических характеристик самих антител и свойств распознаваемых ими эпитопов.

4. МкАт против флуоресцеина и против пероксидазы позволяют расширить возможности иммуноанализа за счет сочетанного применения антигенов и антител, меченных ферментом, флуорохромом и/или гаптеном.

5. На основе полученных МкАт против классов и подклассов IgG разработаны системы иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющие выявлять и определять концентрации IgA, IgE, IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 и суммарного IgG, как в сыворотке крови, так и в других биологических жидкостях человека.

Практическая значимость результатов работы.

Созданные в работе МкАт против PC-вируса могут быть использованы как для диагностики инфекции, так и для оценки качества вирусных препаратов.

МкАт против IgA, IgE, IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 и суммарного IgG в виде нативных препаратов и в виде конъюгатов с пероксидазой прошли государственные испытания и рекомендованы для практического применения Комитетом по иммунобиологическим препаратам при ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Государственным фармакопейным Комитетом утверждены фармакопейные статьи:

1. «Антитела моноклональные диагностические против легких и тяжелых полипептидных цепей иммуноглобулинов человека» - №42-0190-059300.

2. «Антитела моноклональные диагностические против легких и тяжелых полипептидных цепей иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена» - № 42-0596-636605.

Внедрение результатов исследования.

Прошедшие государственную экспертизу и включенные в фармакопейные статьи антитела применяются в иммунодиагностических тест-системах, выпускаемых НПО «Вектор» (Новосибирск), ООО «ЦКФФ» (Ставрополь). Полученные в работе МкАт используются в научных и диагностических лабораториях ряда учреждений страны, в том числе в: BMA (Санкт-Петербург), ВЦЭРМ МЧС (Санкт-Петербург), НИИ гриппа РАМН (Санкт-Петербург), СПб МАПО, Институте детских инфекций (Санкт-Петербург), СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, ВНЦ МДЛ (Москва), ГУ НИИ вакцин и сывороток (Москва).

Теоретические положения и практические результаты, полученные в настоящей работе, используются при проведении практического курса «Иммунологические методы исследования» на кафедре цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета СПбГУ.

Личный вклад автора в проведение исследования. Данные, представленные в работе, получены лично автором. Автором выполнены все этапы создания гибридом, получения МкАт, изучения их свойств, конструирования систем иммуноанализа, подготовки материалов для публикаций и для проведения государственных испытаний МкАт. При получении МкАт против РС-вируса, диссертантом выполнены этапы иммунизации, разработки системы скрининга, создания гибридомных штаммов, исследования свойств МкАт и распознаваемых ими эпитопов. Получение препаратов РС-вируса, его очистку, электронно-микроскопические исследования, а также работу с материалом от пациентов проводили сотрудники лаборатории иммунодиагностических препаратов НИИ гриппа РАМН, руководимой профессором Сомининон А.А.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на Всесоюзных и международных конференциях и симпозиумах, в том числе: на всесоюзном конгрессе "Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований" (Москва, 1989), на конференциях «Современные достижения медицинской радиологии» и «Новые технологии в радиационной медицине» (С-Пстербург, 1993 и 1995), на 1-ой Национальной конференции Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических иммунологов (РААКИ), (Москва, 1997), на 5-м Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), на Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004), на Всероссийском совещании "Клеточная биология на пороге XXI века" (С-Петербург, 2000), на восьми Всероссийских научных конференциях с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге"( 1996-2005), на XI и ХП-м международных совещаниях по эволюционной физиологии, посвященных памяти академика. Л.А.Орбели (С-Петербург, 2001 и 2006), на международных конференциях по медицинской биотехнологии «Иммунизация и СПИД» и «Биотехнология С-Петербург-94» (С-Петербург, 1991 и 1994). Результаты исследования были доложены и обсуждены на международных симпозиумах: «Регуляция и клиническое значение ^Е» (Москва, 1990), «Множественная миелома. Достижения в биологии и лечении» (Вена, 1996), «Достижения в клинической вирусологии -IV» (Гамбург, 1998), «Эволюция системы иммунитета» (Йена, 1999), на IV международном симпозиуме по клинической иммунологии (Амстердам, 1997), на Х1-м международном конгрессе по иммунологии (Стокгольм, 2001).

Диссертационная работа прошла апробацию на расширенном совместном заседании проблемных комиссий «Медицинская биотехнология» и «Медицинская радиобиология» ФГУ ЦНИРРИ, а также на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН.

Публикации. Результаты работы отражены в 4-х авторских свидетельствах на изобретения, в 23-х статьях и 40 тезисах докладов на международных, всесоюзных и всероссийских конференциях, съездах и симпозиумах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах машинописного текста и состоит из обзора литературы, пяти глав, содержащих изложение и обсуждение результатов исследования, заключения и выводов. Диссертация иллюстрирована 85 рисунками и 48 таблицами. Список цитированной литературы содержит 350 источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа с клеточными культурами. При выпонешш исследования использовали постоянные клеточные линии (мышиную миелому и созданные на ее основе гибридомы), а также переживающие культуры спленоцитов, тимоцитов, перитонеальных макрофагов мышей. Культивирование всех клеток осуществляли в пластиковых культуральных планшетах или во флаконах производства Flow, Costar, Titertek или Nunc. Клетки содержали при 37° С и 100% влажности в атмосфере с 5-7,5% СОг. Базовая культуральная среда содержала 90% DMEM (Sigma или Flow) и 10% инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота (СКРС) производства Киевского мясокомбината, Московского института полиомиелита, или фирмы «Биолот» (Санкт-Петербург). Культуральную среду готовили из сухой смеси (Sigma или Flow) и хранили при 4°С не более 3-5 месяцев.

Концентрацию и размер клеток определяли с помощью кондуктометрического счетчика ЦМК-1. Поврежденные клетки выявляли окрашиванием раствором водного эритрозина (0,002%). Число хромосом подсчитывали на препаратах метафазных пластинок, приготовленных действием гипотонического раствора на обработанные колхицином клетки [Мамаева, 1988]. Препараты окрашивали красителем Гимза. Для криоконсервации клеток использовали среду, состоящую из 45% DMEM, 45% СКРС и 10% ДМСО. Охлажденные до -70°С криопробирки с клетками помещали в жидкий азот (для многолетнего хранения) или в морозильную камеру.

Процедура слияния клеток и получения гибридов базировалась на методике, описанной Гальфре и Мильстейном [Galfre, Milstein, 1982]. Качество всех реагентов, используемых для слияния и последующей метаболической селекции, заранее проверяли в модельных экспериментах. Культуру мышиной миеломы поддерживали в логарифмической фазе роста путем ежедневных рассевов в среде DMEM с 10% СКРС. Сливающим агентом служил 50% ПЭГ (ММ 1000; Loba или Sigma), который готовили на бескальциевом глюкозо-

калий-натриевом растворе. Слияние клеток проводили в суспензии. Затем клетки переносили в селективную ГЛТ- среду, приготовленную на основе DMEM с 20% СКРС добавлением гипоксантина (Ю^М), аминоптерина (4х10"7М) и тимидина (1,6х10"5М), а также пирувата натрия и глютамина. Суспензию распределяли по ячейкам 96-луночных планшетов, содержащих суточную культуру мышиных макрофагов. После 14 суток культуры поддерживали на среде DMEM с СКРС. Культуральную жидкость из ячеек с растущими гибридами отбирали на 10-13, затем на 19-21 и на 28 дни после слияния. Основным приемом тестирования культуральных жидкостей был твердофазный ИФА. Позитивные культуры клонировали 2-4 раза методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на фидерном слое из мышиных перитонеальных макрофагов. Гомогенные гибридомные штаммы наращивали в культуре, собирали надосадочную жидкость для изучения свойств МкАт, часть клеточной популяции замораживали, а часть - прививали сингенным мышам для получения МкАт-содержащей асцитической жидкости.

Методы иммуноанализа. Изотипическую принадлежность МкАт исследовали с помощью наборов антисывороток (Calbiochem и Sigma). Обогащенную Ig фракцию асцитической жидкости получали в результате двукратного осаждения глобулиновой фракции полунасыщенным нейтральным (рН 7) раствором сульфата аммония. Для очистки мышиных IgG применяли аффинную хроматографию на белок G-сефарозе (Pharmacia), IgM выделяли трехкратным осаждением сульфатом аммония при 30% насыщении [Скоупс, 1985]. Концентрацию мышиных Ig определяли методом радиальной иммунодиффузии по Манчини, используя приготовленную для этой цели кроличью антисыворотку против Fab-фрагментов мышиных Ig и высокоочшценные мышиные антитела в качестве калибрующих образцов. Специфическую активность МкАт оценивали методом непрямого твердофазного ИФА. С помощью электрофореза в агарозном геле исследовали белковый состав исходных асцитов, обогащенных Ig препаратов и очищенных фракций Ig.

Методом периодатного окисления конъюгировали Ig с пероксвдазой [Nakane, Pierce, 1966]. Мечение Ig флуоресцеином выполняли по стандартной методике, инкубируя их в карбонатном буферном растворе [Джонсон, 1991].

Основные эксперименты по оценке ответа иммунизированных животных, выявлению культур гибридом-продуцентов антител, исследованию специфичности и иммунохимических свойств МкАт, а также определению областей их применения проводили с помощью различных вариантов ИФА: прямого, непрямого, двухцентрового, конкурентного ингибирования [Кэтти и Райкундалиа, 1991]. Твердой фазой служили 96-луночныс плоскодонные планшеты из полистирола (Labsystems, NUNC, Медполимер) • или из поливинилхлорида (Costar, Flow). Выявляющими реагентами были конъюгаты МкАт, поликлональных антител или антигенов с пероксидазой.

Работа с лабораторными мышами. Все эксперименты на животных выполняли, руководствуясь «Правилами проведения работ с использованием лабораторных животных». Инбредных мьппей BALB/c, SJL/J и гибридов первого поколения F1(SJL/J х BALB/c), разводили в виварии института. Мышей линий С57В1/6 и СВА получали из питомника «Рапполово». Для иммунизации брали самок в возрасте 2-3 месяцев. При первых двух иммунизациях антиген, эмульгированный в полном или в неполном адъюванте Фрейнда (ПАФ или НАФ) вводили внутрикожпо в подушечки стоп задних конечностей. При третьей и последующих инъекциях антиген, раевторенный в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСР) вводили мышам внутрибрюшинно. Кровь получали из ретроорбитального синуса. Для пассирования гибридом мышам-реципиентам за 7-13 дней до прививки внутрибрюшинно вводили 0,5 мл пристана (Sigma). Клетки в количестве 5-10 млн инокулировали в брюшную полость. После образования асцита делали прокол брюшной стенки и собирали оттекающую жидкость.

Графическую и статистическую обработку результатов проводили, определяя средние значения, стандартные отклонения, доверительные интервалы и коэффициенты корреляции, с помощью компьютерной программы «Microsoft Excel».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РАЗВИТИЕ ПРИЕМОВ ГИБРИДОМНОЙ ТЕХНОЛОГИИ

Создание штамма миеломы. независимого от ростовых бакторов эмбриональной сыворотки. Миеломы обладают высокой степенью изменчивости и, как следствие этого, -значительной гетерогенностью. Задача состояла в селекции клеток, отличающихся автономностью роста и не требующих ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Исходной популяцией служила культивируемая линия миеломы X63Ag8.653, полученная из Коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Клетки были адаптированы к росту на среде RPMI или DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки в газовой среде, содержащей 5 % СОг. Культуру клеток в логарифмической фазе роста одномоментно поместили в среду DMEM, содержащую вместо эмбриональной сыворотки 20% СКРС. Это привело к гибели основной популяции клеток в течение первых трех суток, после чего единичные живые клетки перенесли на фидерный слой из перитонеальных макрофагов мышей BALB/c. В течение двух суток погибшие клетки были фагоцитированы макрофагами, а спустя еще три дня была отмечена пролиферация выживших опухолевых клеток. Культивирование продолжали до достижения плотности 800 тыс клеток в 1 мл, после чего рассевали по 200 тыс клеток в 1 мл в среде того же состава на макрофаги. Затем клетки пересевали без фидера до тех пор, пока не отмечалось ухудшения их состояния, после чего выжившие клетки клонировали методом лимитирующих разведений на слое макрофагов.

Клетки из 12 наиболее быстро растущих клонов были объединены, затем их выращивали без фидерного слоя. Клонирование клеток на макрофагах проводили на 9-м, 20-м и 30-м пассажах.

В результате чередования этапов выращивания клеток без фидера и отбора путем клонирования на макрофагах была получена культура, способная на протяжении 55 пассажей (срок наблюдения) расти в среде с 20% СКРС без фидера. После последних двух клонирований в культуральную среду добавляли 8-азагуанин до конечной концентрации 20 мкг/мл с целью элиминации клеток-ревертантов, имеющих активный ген гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы, а затем наращивали массовую культуру. Клетки 87-го пассажа подвергли криоконсервации и депонированию во Всесоюзной Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных ВСКК(П) под индексом 7Д, часть клеточной популяции использовали для изучения свойств клеток и испытания их пригодности в качестве опухолевых партнеров для создания гибридом. Штамм получил название 653А.

В культуре штамм представляет взвесь из одиночных клеток или рыхлых агрегатов, не прилипающих к поверхности культуральных сосудов. Клетки имеют округлую форму, их диаметр - 16-20 мкм. Оптимальная посевная концентрациия - Ю3 кл/мл, время удвоения численности популяции 16 ч. Максимальная плотность культуры с сохранением жизнеспособности клеток - 1,3 х 106 кл/мл. Время субкулътивирования 2-3 дня. Культура содержит меньше поврежденных клеток и эффективнее пролиферирует при повышении концентрации СО2 в среде до 7,5%. При окраске клеток по Гимза выявляется характерное для плазмабластов многолопастное ядро, окруженное базофильной цитоплазмой. Модальное число хромосом, определенное на материале 200 метафазных пластинок, равно 54, в отличие от 58 у исходного клеточного штамма. Выявлены 4 маркерные метацентрические хромосомы, остальные хромосомы - акроцентрические.

В процессе испытаний штамма миеломы выяснилось, что не все образцы СКРС пригодны для культивирования и клонирования гибридом. Использование смесей нескольких серий СКРС позволяло снизить токсическое воздействие отдельных образцов и без длительной адаптации переводить культуру с одной смеси на другую. Среда, кондиционированная миеломными клетками 653А, увеличивала выход гибридов, скорость их роста и эффективность клонирования. Было установлено также, что для выращивания и клонирования гибридов перитонеальные макрофаги обладают безусловными преимуществами перед спленоцитами и тимоцитами. Обычная практика создания гибридом предполагает использование ростовой среды, содержащей коктейль антибиотиков. Присутствие антибиотиков снижало скорость роста и эффективность клонирования миеломы 653А, растущей на среде с СКРС. Поэтому выращивание, селекцию и клонирование

гибридом проводили в средах, не содержащих антибиотиков. Это способствовало раннему выявлению и отбраковке коптамшшрованных культур и препятствовало формированию резистентной к антибиотикам микрофлоры. При выборе способов скрининга гибридом учитывали, что присутствие СКРС в культуральной среде не должно препятствовать обнаружению секретируемых антител и не должно быть причиной ложно-положительных реакций.

Испытания штамма миеломы 653А, проведенные при получении МкАт против эритроцитов барана, продемонстрировали его пригодность для гибридомной технологии.

Выбор линии мышей для иммунизации был основан на опыте изучения иммунологической реактивности животных ряда инбредных линий: BALB/c, AKR, A/Sn, СВА, DBA/2, СЗН/Не, С57В1/6, SJL/J [Климович и др., 1980, Самойлович и Климович, 1982]. Анализ литературы заставил обратить более пристальное внимание на мышей SJL/J. Эти животные в отличие от BALB/c (H2d, Igha) несут комлекс антигенов гистосовместимости H2S и синтезируют IgG аллотипа Ighb. В то же время для мышей SJL/J характерно образование спонтанных опухолей В-кпеточного происхождения и признаки аномально повышенной активности B-клеточного звена иммунной системы [Haran-Ghera, 1967, Мс Intire et al., 1967, Scheid et al., 1980, Kumar, 1983], что сближает их с мышами BALB/c, формирующими плазмацитомы в ответ на введение минерального масла [Potter, 1972]. Это сходство SJL/J с мышами BALB/c давало повод ожидать, что межлинейные гибриды Fl(SJL/JxBALB/c) сохранят склонность к формированию асцитов и поддержанию роста гибридом. Пассирование гибридом на мышах Fl представлялось целесообразным также потому, что эти животные отличаются более крупными размерами и значительно большей жизнеспособностью, чем мыши BALB/c. На основе изложенных аргументов в качестве допоров лимфоцитов были выбраны инбредные мыши SJL/J.

Разработка способа пассирования гибридом на мышах. При использовании обычной схемы подготовки животных к пассированию клеток гибридом образование асцита отмечалось лишь у 60% реципиентов, частота успешных прививок зависела от сезона и значительно снижалась в течение апреля-мая и сентября-октября. После однократного пунктирования брюшной полости у мышей не происходило повторного накопления асцита. Предстояло определить условия, позволяющие воспроизводимо получать большие количества МкАт. Собственный опыт радиобиологических исследований заставил обратиться к радиации как к средству снижения резистентности животных-реципиентов к прививке опухолевых клеток. Сублетальное облучение вызывает стойкую, а по ряду параметров необратимую иммунодепрессию [Самойлович, Климович, 1980-1982]. Мышей-гибридов Fl(SJL/JxBALB/c) спустя 7-10 дней после введения пристана облучали тотально рентгеновскими' лучами в дозах от 4,0 до 5,8 Гр. Облучение реципиентов привело к

синхронному появлению асцита у всех привитых животных, а также способствовало повторному накоплению асцита после пунктирования, что позволило от каждого реципиента получать асцит 2-4 раза. Асциты, взятые в ранние сроки после прививки гибридом, обладали высокой клеточностью и относительно низким содержанием тогда как при 3-4 пунктировании отмечалось снижение количества клеток и рост концентрации Эффективность разработанного приема была подтверждена в опытах по получению МкАт против различных антигенов (табл. 1).

Таблица 1

Сравнение эффективности наработки МкАт при пассировании гибридом на интактных или облученных мышах-гибридах П(8ЛЛхВАЬВ/с)

Пассирование гибридом на реципиентах

Штамм Специфичность интактных облученных

гибридомы МкАт объем количество объем асцита количество

асцита (мл) ^ (мг) (мл) (мг)

Р-2АЗ флуоресцеин 0,4+0,7 0,83+0,94 8,5+1,2 16,2+5,4

ЯЭ-9С5 РС-вирус 1,6+0,9 11,2+7,3 8,1+2,0 64,6+10

ЯБ-вВЮ РС-вирус 0,20+, 15 0,28+0,3 2,6+0,4 3,9+2,7

в-ЗОЗ у-цепь 0,7+0,5 2,66+1,98 5,4+0,7 21,6+5,0

Е-4Р4 б-цепь ^ 1,5+0,4 6,03+,7 9,8+1,4 47,6+9,0

В таблице указаны средние значения и стандартные отклонения при пересчете на одного реципиента. Группы мышей численнностью от 11 до 70 животных.

ПОЛУЧЕНИЕ МКАТ ПРОТИВ АНТИГЕНОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В СИСТЕМАХ ИММУНОАНАЛИЗА Получение и изучение МкАт против пероксидазы и против флуореспеина. Среди ферментов, используемых для ИФА, первое место занимает пероксидаза из корней хрена. Химическое присоединение ферментной метки к антигенам или антителам сопряжено с частичной утратой активности как фермента, так и антител (антигена). Альтернативой химически синтезированных коньюгатов являются иммунные комплексы, состоящие из фермента и направленных против него антител (ПАП-комплекс)[81етЬе^ег е1 а1., 1970]. Антитела, предназначенные для приготовления ПАП-комплекса, должны иметь высокий аффинитет и не ингибировать активность фермента.

При создании МкАт против пероксидазы препарат слабо очищенного фермента (1120,3) вводили мышам трех инбредных линий: ВАЬВ/с, С57В1/6 и БЛЛ. Оценка иммунного ответа выявила безусловные преимущества мышей При скрининге гибридов,

полученных в результате слияния, был применен тест, основанный на способности клеток золотистого стафилококка («Стафилококковый реагент, содержащий белок А», ЛенНИИЭМ им. Л. Пастера) связывать мышиные не нарушая их взаимодействия с антигеном. МкАт из тестируемых культуральных жидкостей взаимодействовали с внесенной в пробу

пероксидазой, что приводило к формированию ПАП-комплекса. Затем ПАП-комплекс фиксировался на клетках стафилококка, благодаря чему микробные клетки приобретали несвойственную им в норме перексидазную активность, которую выявляли с помощью субстрат-хромогенной смеси. Интенсивность окрашивания зависела от концентрации МкАт и прочности связывания с пероксидазой и бактериями. При первичном скрининге было выявлено 17 культур, вырабатывающих антитела искомой специфичности. У ряда клонов было обнаружено падение серологической реакции по мере нарастания числа клеток в культуре. Это было расценено как проявление либо нестабильности гибридом, либо выработки ими МкАт, ингибирующих активность пероксидазы. Для дальнейшей работы была выбрана культура, обозначенная Р-2Н11, размножение которой сопровождалось нарастанием интенсивности серологической реакции. Клетки были клонированы, затем депонированы в ВСКК(П) под индексом 45Д. Кариологический анализ, проведенный на 24 пассаже при массовом культивировании, выявил 59% клеток, несущих 90-92 хромосомы и 12% клеток - полиплоидов. Свойства МкАт исследовали, используя нативную асцитическую жидкость, а также очищенные фракции Ig.

Влияние МкАт на активность пероксидазы определяли, смешивая растворы фермента и антител и добавляя через 2 часа субстрат-хромогенную смесь. Было показано, что МкАт Р-21111 не ингибирует активность фермента и способно формировать ПАП-комплекс с образцами пероксидазы, произведенными разными фирмами (Sigma, Reanal, Биохимреактив и др). Методом аффинной хроматографии на иммобилизованной пероксидазе было установлено, что МкАт Р-2Н11 обладает высоким аффинитетом в отношении фермента. Изменение молярного отношения пероксидазы и МкАт при формировании ПАП-комплекса и последующее изофокусирование позволили заключить, что МкАт Р-2Н11 связывает все изоформы фермента, при этом в иммунном комплексе на одну молекулу антител приходится 3-4 молекулы фермента. Важным преимуществом МкАт Р-2Н11 оказалась его способность формировать ПАП-комплскс на основе МкАт-содержащей асцитической жидкости и слабо очищенной пероксидазы, тогда как для синтеза конъюгатов требуются высокоочшценные препараты антител и фермента. Испытания приготовленного на основе МкАт ПАП-комплекса показали, что его можно рассматривать как стабильный и работоспособный реагент для ИФА, способный дать преимущество как в чувствительности, так и в специфичности тестов по сравнению с конъюгатами, приготовленными методом ковалентного связывания.

Флуоресцеин представляет один из наиболее распространенных флуорохромов. Одновременно он явяляется гаптеном, и это свойство может быть использовано для создания модификаций иммуноанализа с применением антифлуоресцеиновых антител. Свойством флуоресцеина, позволившим широко использовать его в люминесцентной микроскопии и в

других методах иммуноанализа явилась способность его изотиоцианатного производного создавать устойчивые ковалентные связи с белками, нуклеиновыми кислотами и другими биомолекулами. Характеристики модифицированных биополимеров при этом измепяются мало, а степень гаптенизации можно легко контролировать спектрофотометрически. Для создания МкАт против флуоресцеина мышей БЯЛ иммунизировали попеременно препаратами ослиных, кроличьих и бараньих меченных флуоресцеином. Было получено 4 гибридомы, продуцирующие антифлуоресцеиновые антитела. После клонирований эти гибридомы были переведены в массовые культуры и привиты внутрибрюшинно мышам РЦБЛЛ х ВАЬВ/с), получившим за 10 дней до этого инъекцию пристана и облученным в дозе 4,1 Гр. По результатам изучения иммунохимических характеристик полученных МкАт были выбраны два (Р-2АЗ и И- 4С4), отличавшиеся друг от друга аффинитетом связывания с гаптеном. Оба антитела снижали интенсивность флуоресценции флуорохрома. Полное гашение флуоресценции наблюдали при концентрации МкАт Р-2АЗ 0,08 мг/мл (500 нМ), тогда как МкАт Р-4С4 гасили флуоресценцию не более, чем на 50%.

Уточнение специфичности МкАт методом ингибиторного ИФА показало, что ни один из структурных аналогов флуоресцеина (эозин, эритрозин, родамин бО, лиссамин-родамин) не влиял на связывание антител с гаптеном. Таким образом была доказана строгая специфичность этих двух МкАт к молекуле флуоресцеина.

Возможности использования МкАт против флуоресцеина в иммуноанализе были продемонстрированы в нескольких системах. В первой из них антифлуоресцеиновые антитела выполняли функцию «якорных» молекул, обеспечивающих иммобилизацию меченных гаптеном реагентов на твердой фазе (рис. 1).

С-ЗОЗ Р-2АЗ

Шифр адсорбированных на фазе МкАт

Рис. 1. Связывание иммобилизованными на твердой фазе МкАт С-ЗОЗ, меченных пероксидазой антигенов ^01,^ОЗ и 1д04. Сопоставление специфичности связывания МкАт й-ЗЭЗ при адсорбции или иммобилизации посредством «якорного» МкАт Р-2АЗ

МкАт О-ЗЭЗ, направленное против маркерного эпитопа у- цепи, при адсорбции на

твердой фазе преимущественно связывало Это же МкАт, меченное флуоресцеином и

иммобилизованное посредством адсорбированного МкАт Р-2АЗ, равно эффективно извлекало из раствора ígG всех четырех подклассов. Применение антигалтеновых МкАт в качестве «якорных» антител является перспективным способом иммобилизации, особенно для тех реагентов, которые в результате сорбции теряют или изменяют специфичность распознавания антигена.

В двухцентровой системе иммуноанализа антитела против флуоресцеина, конъюгированные с ферментом, служили универсальным выявляющим реагентом. Во всех испытанных вариантах иммуноанализа эффективным было МкАт Р-2АЗ, обладающее более высоким аффинитетом. Некоторые схемы иммуноанализа с применением МкАт против флуоресцеина представлены на рисунке 2.

А

Конъюгат Ф-пероксидаза МкАт-2 против Ф

Меченное Ф МкАт-1 Антиген

пероксидазы

Таким образом, создание МкАт против флуоресцеина и против пероксидазы расширяет возможности конструирования систем иммуноанализа. Для выявления антифлуоресцеиновых МкАт в составе иммунного комплекса можно использовать конъюгат «гаптен-фермент», например, меченную флуоресцеином пероксидазу (рис. 2А), или гаптенизированные антитела против пероксидазы. Сочетание гаптенизированных первых МкАт, мостика из антифлуоресцеиновых антител и ПАП-комплекса приводит к минимальной потере активности антител из-за отсутствия химических реакций присоединения, обеспечивает широкие пределы амплификации сигнала за счет введения нескольких гаптеновых группировок в каждую молекулу ^ (рис. 2Б).

Получение и изучение свойств МкАт против PC-вируса. Создание МкАт против антигенов PC-вируса было продиктовано необходимостью совершенствования методов иммунодиагностики PC-вирусной инфекции. Антигеном для иммунизации служил препарат очищенного PC-вируса (штамм Long), выращенного на бессывороточной среде в роллерной культуре клеток HeLa (сублиния M-HeLa 7886). Дня выявления и изучения антител использовали очищенный PC-вирус, вирус-содержащую культуральвую жидкость, а также культуральную жидкость и лизат незараженных клеток HeLa.

В результате первичного скрининга культуральных жидкостей было обнаружено 39 культур. Для дальнейшей работы было отобрано 5 культур (обозначены RS-8C5, RS-10D8, RS-8B10, RS-9C5, RS-7B3), синтезирующих антитела, которые не реагировали с антигенами клеток HeLa. Эти гибридомы были подвергнуты повторным клонированиям, затем переведены в массовые культуры. Продукты трех клонов (RS-9C5, RS-8B10 и RS-7B3) эффективнее связывались с антигенами очищенного PC-вируса и значительно слабее с вирусом, находящимся в культуральной жидкости, что принципиально отличало их от МкАт RS-10D8 и RS-8C5. Последние два антитела предпочтительно распознавали вирус в составе культуральных жидкостей и значительно слабее — эпитопы очищенного вируса. Препараты очищенного вируса представляют собой цельновирионные суспензии, культуральная жидкость содержит преимущественно свободные субкомпоненты вируса. Эти результаты указывали на разную эпитопную направленность полученных МкАт, что было подтверждено с помощью метода конкурентного ингибирования, в котором наряду с созданными в лаборатории использовали референс-МкАт (92-11С и 131-2А), полученные из CDC (Atlanta, USA) (табл. 2).

Таблица 2

Немечениые МкАт Меченные пероксидазой МкАт

8С5 10D8 7ВЗ 8В10 9С5

8С5

10D8 . ' к * - . ,

7ВЗ

8В10

9С5 ^JiSfJiiAii

92-11

131-2А

Примечание: 1 - отсутствие ингибиции,-2 - ингибирование связывания

1

RISES

На PC-вирусных частицах полученные МкАт выявляют по меньшей мере три топографически удаленных эпитопа. Референс МкАт препятствовали связыванию с антигеном МкАт RS-9C5. Известно, что оба референс препарата распознают эпитопы F-белка, МкАт 131-2А связывает детерминанту, называемую Fla на F- белке штамма РС-вируса

А2 [Anderson et al, 1986]. Вероятно, МкАт RS-9C5 распознает тот же или близкий эпитоп в составе F- белка оболочки вируса. Электрофоретическое разделение и иммуноблотинг вирусных препаратов показал, что МкАт RS-8B10 взаимодействует с антигенной детерминантой в N-белке, входящем в нуклеопротеидный комплекс.

В лабораторной диагностике PC-вирусной инфекции применяют основанные на иммуноанализе тесты: выявление вируса в биологических жидкостях, выявление вируса в клеточных препаратах, полученных путем соскоба со слизистых, и определение антител против вируса в сыворотке крови. Была установлена способность МкАт выявлять антиген в инфицированных клетках и тканях с помощью вариантов непрямой и прямой иммунофлуоресценции. Показано, что использование «коктейлей» из нескольких МкАт (RS-8В10 и RS- 9С5 ) дает выигрыш в чувствительности и специфичности детекции РС-вируса.

Таблица 3

Чувствительность и специфичность методов выявления PC-вируса с помощью МкАт методом непрямой иммунофлуоресценции (%%)

Шифр МкАт Чувствительность Специфичность

RS-10D8 85,7 76

RS-8B10 81 83

RS-9C5 80 66,7

RS-9C5 + RS-8B10 89 90

Возможность детекции вирусных антигенов в жидких средах изучали с помощью двухцентрового иммуноанализа. Использование адсорбированных на твердой фазе МкАт для извлечения антигена из жидкой среды и конъюгатов МкАт или поликлональных антител - в качестве выявляющих реагентов обеспечивало необходимый уровень специфичности и чувствительности детекции РС-вирусного антигена.

РС-вирус чрезвычайно нестабилен и легко разрушается при очистке и хранении. В результате ультрацентрифугирования очищенного РС-вируса через градиент сахарозы (2060%) было выделено три фракции. Первая из них (из зоны 38-40% сахарозы) по данным электронной микроскопии представлена полноценными вирусными частицами, вторая фракция (30-35% сахарозы) содержала неповрежденные поверхностные гликопротеидные компоненты, но была обеднена внутренними структурами, тогда как в третьей фракции (30% сахарозы) присутствовали вирионы, обедненные рибонуклеопротеидом и имеющие дефектные поверхностные структуры. По результатам твердофазного ИФА МкАт RS-8B10 и RS-9C5 равно эффективно взаимодействовали с антигенами из первой фракции (рис. 2). С вирусными частицами из второй фракции МкАт КБ-8В10 связывалось слабее, чем МкАт RS-9С5. Наконец, МкАт RS-8BI0 не реагировало с вирусным материалом из третьей фракции, тогда как МкАт Кв-9С5 проявило слабое связывание.

Рис. 3. Связывание МкАт Я8-8В10 и Я8-9С5 с фракциями вируса, полученными при разделении в градиенте плотности

Таким образом было установлено, что выявление двух эпитопов, распознаваемых МкАт К.3-9С5 и КЭ-вВЮ, позволяет оценивать сохранность антигенной структуры вирусных частиц, что можно использовать для контроля качества препаратов РС-вируса.

Получение и изучение свойств МкАт против 1е человека. На молекулах экспрессированы антигенные детерминанты нескольких категорий. Генетически обусловленные различия в структуре тяжелых и легких цепей определяют существование двух типов, пяти изотипов (классов) четырех субизотипов (подклассов) и двух субизотипов ^А. Задача работы состояла в получении и отборе МкАт против тех эпитопов, которые являются антигенными маркерами изотипов (^А, ^М, ^Е) и субизотипов человека (1$01, ^02, ^ОЗ,

Созданию гибридом, продуцирующих МкАт против ^ человека, предшествовал сбор образцов нормальных и патологических сывороток человека. Коллекцию составили 570 образцов сывороток здоровых доноров, полученных из ОПК Городской больницы № 31 и Института гематологии и трансфузиологии. Второй частью коллекции стали сыворотки пациентов с миеломной болезнью и другими гаммапатиями, поступившие в лабораторию для иммунодиагностических исследований из клиник ЦНИРРИ, Института гематологии и трансфузиологии, Городской больницы №31, СПбГМУ им. ИЛЛавлова и НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова. Часть материала была предоставлена коллегами из Московского НИИЭМ им. Г.Н.Габричевского (профессор Е.В.Чернохвостова), из Института экспериментальной медицины им. М.Планка (профессора Н.Хильшман и В.Завазал), из лаборатории клинической иммунологии и аллергологии Бернского университета (профессор А. Де Век). Эта часть коллекции насчитывает 213 образцов и содержит парапротеины всех типов,

изотипов и субизотипов. В коллекцию также включены препараты Ig и их фрагменов фирмы Calbiochem. Образцы биологических жидкостей здоровых доноров и пациентов были предоставлены профессорами СПбГМУ М.Я.Левиным и А.А.Тотоляном.

Все образцы коллекции охарактеризованы иммунохимически. М-компонент выявляли с помощью электрофореза в агарозном геле. Для типирования парапротеинов использовали встречную иммунодиффузию по Оухтерлони и прямой твердофазный ИФА. Ряд препаратов Ig человека был получен в лаборатории путем выделения и очистки из нормальных или патологических сывороток. При этом референс-образцы позволяли идентифицировать выделяемые вещества и контролировать их качество. Поликлональный IgM выделяли из донорской сыворотки гель-фильтрацией на сефакриле S-300, а затем аффинной хроматографией на белок А-сефарозе. Суммарную фракцию поликлонального IgG человека выделяли из пула донорских сывороток с помощью ионообменой хроматографии на DEAE-Сефацеле (Pharmacia). Поликлональные IgG отдельных подклассов изолировали из суммарной фракции IgG с помощью многоэтапной аффинной хроматографии на белок А-сефарозе в сочетании с очисткой на иммуносорбентах, приготовленных на основе МкАт, Степень чистоты оценивали с помощью ИФА. Содержание примесей в очищенных препаратах IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4 составляло соответственно 5%, 3%, 2% и 7%. Паралротеины выделяли путем повторных осаждений раствором сульфата аммония (от 50% до 30% насыщения). Затем в зависимости от изотипа Ig использовали либо аффинную хроматографию на белок А-сефарозе, либо иммунноаффинное выделение с помощью иммобилизованных на бромциан- сефарозе МкАт. Для определения состава полученных препаратов Ig и легких цепей, использовали коммерческие антисыворотки против классов Ig человека и против легких цепей к и 7,-типа (Pharmacia и Производства ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН), а также полученные в лаборатории МкАт.

При создании гибридом-продуцентов МкАт против изотипичсски.х маркеров Ig использовали схему иммунизации, представленную в таблице 4. При скрининге гибридом и селекции МкАт против маркеров Ig человека следовали единому алгоритму, основные элементы которого представлены в таблице 5.

Таблица 4

Схемы иммунизации и выход гибридом при получении МкАт прошв против изотопических

маркеров 1ей, ^А, ^М, ^Е

Параметры Антигены

1йА 1йМ 1йС. 1ЕЕ

Иммуноген ^М1 ДО1 №-к2

Доза антигена при I иммунизации 50 мкг 50 мкг 50 мкг 40 мкг

Адъювант при I иммунизации ПАФ ПАФ ПАФ ПАФ

Интервал между I и II введением АГ 14 дней 10 дней 4 мес 3 нед

Адъювант для II иммунизации НАФ ПАФ НАФ НАФ

Доза АГ для бустеров 10 мкг 10 мкг 10 мкг 10 мкг

Длительность цикла иммунизации 1,5 мес 1,5 мес 5 мес 1,5 мес

Количество специфичных гибридом 19 4 56 9

Примечания: 1 - поликлональный 2 - моноклональный ^

Таблица 5

Этапы и методы исследования и отбора гибридом при получении МкАт против изотопических и субизотипических маркеров ^ человека

Этап исследования | Метод исследования

Получение МкАт п ротив маркеров 1к

Певичный скрининг гибридомных надосадков на искомом антигене Непрямой ИФА на адсорбированном искомом антигене

Исключение гибридом, синтезирующих антитела против к- и против Х- цепей 1° Непрямой ИФА на адсорбированных поликлональных альтернативных ^

Выявление и исключение МкАт против комбинационных эпитопов ИФА на адсорбированном парапротеине к- типа и парапротеине Я-типа

Выявление МкАт против аллотипических или аллотип-зависимых детерминант Пассивная гсмагглютинация и торможение гемагглютинации

Выявление и отбор МкАт против консервативных эпитопов ИФА на панели из индивидуальных миеломных 1я к- типа и А.-типа

Изучение свойств МкАт и исследование распознаваемых ими эпитопов

Исследование специфичности и активности меченных ферментом МкАт Прямой ИФА на адсорбированном антигене

Исследование активности и специфичности иммобилизованных МкАт Прямой ИФА с антигенами, меченными ферментом

Исследование локализации и свойств распознаваемых эпитопов Непрямой ИФА на адсорбированных фрагментах и на восстановленных ДГТ Ингибирование немеченными МкАт связывания меченых МкАт с антигеном.

Выявление МкАт, распознающих эпитопы на нативных молекулах 1ц Ингибирование растворенными ^ связывания меченых МкАт с адсорбированными 1с

Подбор комплементарных МкАт для двухцентрового ИФА Выявление антигена с помощью пар адсорбированных и меченых МкАт

Далее приведены результаты некоторых этапов выполненного исследования. При получении МкАт против ^Е человека в первичном скрининге было выявлено 12 культур, секретирующих ^ искомой специфичности. Антитела из трех культур реагировали не только

с 1ёЕ, но также с и с 1)>А, что было следствием распознавания ими антигенов к- легких цепей. Из 9 остальных антител 5 реагировали со всеми образцами миеломных ^Е, независимо от типа входящей в состав молекулы легкой цепи, и были направлены к консервативному маркерному эпитопу (табл. б). Четыре реагента распознавали детерминанты только на двух миеломных образцах, на одном - содержащем к- цепь, и на одном, имеющем Х- цепь. Отсутствие связывания этих МкАт с двумя ^Е-парапротеинами могло указывать на вариабельность структуры распознаваемого эпитопа.

Аналогичные исследования и селекция были проведены при создании МкАт против изотопических маркеров остальных ^ человека.

Таблица 6

Связывание МкАт с миеломными ^Е-парапротеинами к- и X -типов

Шифры МкАт Иммобилизованные миеломные 1сЕ

Цк) Уи(к) Р8(Х.)

Е-504 + + + +

Е-5В9 + + + +

Е-1Е10 ' + + + +

Е-4Р1 + + + +

Е-4Р4 + + + +

Е-1С1 + - + -

Е-4С9 + - + -

Е-4Р2 + - + -

Е-4Р12 + - + -

Знаки "+" и "-" обозначают соответственно наличие или отсутствие связывания МкАт

При получении МкАт против изотипов, имеющих несколько субизотипов, в описанный алгоритм исследования включали дополнительные этапы. При отборе МкАт, специфичных к маркерам у-цегш, был проведен скрининг на адсорбированных поликлональных ^01, ^02, ^вЗ или что позволило выделить две группы реагентов. Одну из них составляли МкАт, предпочтительно связывавшие два-три подкласса (рис. 4А). МкАт второй группы одинаково эффективно взаимодействовали с всех четырех подклассов и были отобраны для продолжения работы (рис. 4Б). Сохранение способности распознавать эпитопы, экспрессированные на всех субизотипов, оценивали в

дальнейшем на всех этапах иммунохимической характеристики этих антител. Аналогичные исследования выполнены при создании МкАт против ^А.

Рис. 4. Связывание МкАт против ^О с поликлональными ^01, ^02, ¡£03 и

Таким образом в результате ступенчатого отбора была получена панель из 21 МкАт против изотипических маркеров ^ человека (табл.7).

Таблица 7

МкАт против изотипических маркеров человека

Специфичность Шифры МкАт

а- цепь А-ЗВ7, А-1Н9, А-1(Ю11, А-ЗЕЗ, А-ЗП11, А-1Н7, А-1В12

ц-цепь М-2В9, М-2А6, М-1С1, М-1Е6

у-цепь в-5А9, 0-406, С-5ЕЗ, О-ЗЭЗ, 0-5Р2

в- цепь Е-504, Е-5В9, Е-1Е10, Е-4Р1, Е-4Р4

Получение МкАт против субизотипических маркеров 1£0 человека потребовало усложнения схем иммунизации, тогда как система тестирования и отбора МкАт была аналогичной той, которую использовали при получении МкАт против изотипических маркеров ^ (табл. 8).

При создании МкАт против и против ^йЗ результативными оказались первые же опыты по гибридизации. При получении МкАт против ^04 реагенты, полностью отвечающие критериям специфичности, были получены лишь после второго тура гибридизации. Решающим фактором стал выбор способа иммунизации. Во втором цикле получения гибридом мышам наряду с иммуногеном ввели ранее полученные МкАт изотипа специфичные к иммунодоминантному к-зависимому эпитопу молекулы ^04 (С4-1Н2). Такой прием, как известно, приводит к супрессии первичного антительного ответа в отношении того эпитопа, к которому направлено антитело, но не распространяется на другие эпитопы антигена.

Таблица 8

Схемы иммунизации и выход гибридом при получении МкАт против субизотипических

маркеров человека

Подкласс ДО Вид иммунизации Выход

пассивная активная гиб ридом

иммуноген срок (мес) всего клоны

ДО1 Не применялась ДО1-кДО1->„ в ПАФ 1 74 С1-2С11

ДО2-1,11,111' Не применялась ДО2-кДО2-Х. в ПАФ 7-14 138 в2-ЗЕ9 в2-2Н6

ДО2-IV, V Не применялась ДО2-кДО2-Я. на АЦ 1,52,5 159 0

ДО2-VI, VII МкАт против Поли- дог3 на БСА или ГЦ 1,5 302 0

ДО2-VIII Поли- антитела против ДОЛ, ДОЗ и 1йв4 Поли- денатурированный ^02" на ЛПС 1 75 в2-2А8 С2-ЗС7 С2-9П0

ДОЗ Не применялась ДОЗ-кДОЗ-Х в ПАФ 5 56 03-5012 СЗ-1С11

ДО4-I Не применялась ДО4-к в ПАФ 2,5 44 04-1Н2

ДО4-II МкАт С4-1Н2 ДО4-к+ДО4-Х в ПАФ 4 54 в4-5С7 04-406

Примечания:

1- римскими цифрами указаны номера экспериментов по гибридизации;

2- указано общее количество культур, продуцирующих антитела против включая распознающие класс-специфичные и подкласс-рестриктированные эпитопы, а также шифры клонов гибридом-продуцентов подкласс-специфичных МкАт;

3- поли - означает поликлоналъный

4- поликлональный денатурировали нагреванием при 63°С в течение 60 мин

Значительно больше трудностей возникло при получении МкАт против маркеров При иммунизации мышей, также как и в случае с наиболее иммуногенными оказались комбинационные эпитопы, зависящие от присутствия в молекуле легкой к-цепи. Не дали желаемого результата ни длинные циклы антигенной стимуляции, ни применение различных носителей, ни иммунизация парапротеинами. Использование денатурированного нагреванием поликлонального конъюгированного с ЛПС, при сочетании активной

иммунизации с введением поликлональных ^в-антител против ^СЗ, и

применение короткой схемы иммунизации позволили получить три гибридомных клона-продуцента МкАт против 1§С2 (С2-2А8, в2-ЗС7 и О2-9Н0). Трудно определить, какой из факторов в конечном итоге был решающим в достижении успеха. Вероятно, значение имели тепловая денатурация молекулы и ингибиция иммунодоминантных антигенных детерминант с помощью поликлональных антител класса ^О, полученных против смеси ^вЗ и

^04. Выход гибридов в слияниях был высоким, многие ячейки содержали по нескольку

гибридов, синтезирующих антитела разной специфичности. Для того, чтобы не пропустить искомые культуры при скрининге, использовали ингибиторный вариант ИФА. Культуральные жидкости инкубировали с раствором, содержащим смесь ^ОЗ, 1^04, а затем переносили в ячейки с адсорбированным ^02.

Для выявления реагентов, направленных против консервативных антигенных детерминант подклассов исследовали связывание МкАт с индивидуальными

миеломными парапротеинами, адсорбированными на пластик (табл. 9).

Таблица 9

Связывание МкАт против подклассов с миеломными парапротеинами

Шифры МкАт Подклассы и количество образцов парапротеинов Специфичность МкАт

1801 ДО2 ДОЗ ДО4

01-2С11 56(56)' 0(13) 0(9) 0(8) Т-1

02-2А8 0(26) 9(9) 0(3) 0(8) У-2

С2-ЗС7 0(26) 13(13) 0(3) 0(8) У-2

С2-9Р10 0(26) 13(13) 0(3) 0(8) У-2

С2-ЗЕ9 0(8) 4(7) 0(6) 0(4) У-2

02-2Н6 0(8) 4(7) 0(6) 0(4) У-2

03-5012 1(26) 0(8) 9(11) 0(8) у-з

03-1С11 1(26) 0(8) 9(11) 0(8) у-з

С4-5С7 1(9) 0(9) 0(9) 14(14) У-4

04-406 0(8) 1(9) 0(9) 14(14) у-4

С4-1Н2 0(11) ЮЗ) 0(9) 4(9) у-4

Примечание:

1-указано количество образцов парапротеинов, связывающих МкАт, в скобках-количество исследованных образцов.

МкАт С1-2С11, идентифицированное при первичном скрининге как специфичное к а также три МкАт против 1я02 (С2-2А8, 02-ЗС7, О2-9Р10) реагировали со всеми включенными в панель образцами. МкАт С2-ЗЕ9, 02-2П6 и С4-1Н2 распознавали только некоторые парапротеины одного субкласса и, как оказалось, были направлены против комбинационных детерминант. Несколько антител (03-5012, 04-5С7) связывали наряду с антигеном-мишенью тот или иной миеломный белок, относящийся к альтернативному подклассу. Можно думать, что это обусловлено мутационной изменчивостью миеломных белков и вследствие этого - аномальной экспрессией некоторых эпитопов [Андреева, Чернохвостова, 1985].

В результате многоступенчатого отбора по ряду критериев было изолировано восемь клонов-продуцентов МкАт против субизотипических маркеров ^О человека (табл. 10).

Таблица 10

МкАт, специфичные к субизотипическим маркерам молекул ГцС человека

№№ Шифры МкАт Специфичность

1 01-2С11 у 1 -цепь

2 02-9Р1 у2-цспь

3 в2-2А8 у2-цепь

4 в2-ЗС7 у2-цепь

5 СЗ-1С11 уЗ-цепь

6 03-5012 уЗ-цепь

7 04-406 у4-цепь

8 02-5С7 у4-цепь

Для изучения свойств МкАт против были приготовлены конъюгаты МкАт с пероксидазой. Исследова1ше активности и специфичности этих реагентов показало, что все МкАт, кроме одного (С>2-2А8), сохранили после присоединения ферментной метки специфичность связывания с антигеном.

Специфичность и активность МкАт, иммобилизованных на твердой фазе, изучали с помощью меченных пероксидазой антигенов. При исследовании свойств МкАт против изотипических маркеров у-цепей наряду с оценкой взаимодействия с поликлональным меченым определяли также распознавание ими отдельных подклассов (рис. 5). Выяснилось, что после адсорбции некоторые МкАт изменили способность связывать антиген: различия касались как количества антигена, так и его состава. Антитела 0-5ЕЗ, О-5Г2 и С-5А9, адсорбированные на пластик, связывали молекулы ^О всех четырех субизотипов, тогда как МкАт О-ЗШ изменило профиль реактивности и приобрело свойство извлекать из раствора исключительно молекулы одного подкласса -Иммобилизованное МкАт в^Шб практически не связывало молекулы растворенного

Все полученные МкАт против маркеров субизотипов сохраняли антиген-распознающую активность и специфичность после иммобилизации на твердой фазе.

Исследование эпитопной направленности МкАт, а также свойств распознаваемых ими эпитопов проводили с помощью нескольких методов иммуноанализа. Антитела, распознающие конформационно-устойчивые детерминанты нативных молекул выявляли по результатам ингибирования растворами ^ связывания меченых МкАт с молекулами адсорбированных гомологичных

5ЕЗ 5Я2 5А9 406 ЗОЗ

Шифры иммобилизованных МкАт

Рис. 5. Связывание иммобилизованными на твердой фазе МкАт против изотипических маркеров ^О, меченных пероксидазой молекул ^01,^ОЗ и 1ё04

Для локализации антигенных детерминант изучали связывание МкАт с адсорбированными на твердой фазе пептическими или рекомбинантными фрагментами Взаимное расположение эпитопов на молекулах антигенов оценивали в тесте конкурентного ингибирования, при котором меченые МкАт реагировали с иммобилизованным на твердой фазе гомологичным антигеном в присутствии немеченных МкАт. Дополнительную информацию получали, используя восстановление ^ дитиотреитолом (ДТТ) с последующим алкилированием, что позволяло оценить роль дисульфидных связей в поддержании структуры эпитопов.

Отбор антител, распознающих эпитопы нативных антигенов, показал, что все МкАт против маркеров а-цепей, против е-цепей, одно антитело против ц- (М-2В9) и четыре реагента против у- цепи, а также МкАт против подклассов ^01, ^вЗ и эффективно связывали растворенные молекулы соответствующих

При исследовании МкАт против маркеров проявились особенности экспрессии распознаваемых эпитопов на нативных молекулах. МкАт 02-ЗС7 и 02-9РЮ связывали эпитопы поликлонального ^02, однако обнаружили гетерогенность взаимодействия с индивидуальными ^02-паралротеинами. Исследование нативных и конформационно измененных парапротеинов, а также молекул ^С2т(п) и ^С2т(п-) позволило заключить, что рассматриваемые эпитопы (или, скорее, эпитоп) являются субизотипичсскими маркерами, которые по разному экспрессированы на аллельных вариантах 1^2 человека. На 1£С2т(п) эпитоп экспрессирован постоянно, вне зависимости от конформации молекулы. На нативных молекулах 1£02т(п-) он скрыт и обнаруживается только после изменений конформации, которые могут быть вызваны адсорбцией молекул или иными воздействиями.

Реагенты, связывающие конформационно-изменчивые детерминанты, были обнаружены также среди МкАт против маркеров 1цМ (М-2А6, М-1С1, М-1Е6) и (С-4Г)6).

На молекулах сывороточного ^А МкАт выявляют 7 отдельных эпитопов, два из которых (А-1(Ю11 и А-ЗВ7) не модифицируются при восстановлении дисульфидных связей.

Среди четырех МкАт против ^М три (М-2А6, М-1С1, М-1Е6) специфичны к одному и тому же или к нескольким топографически близким эпитопам, а одно антитело (М-2В9) распознает удаленный от них эпитоп. Эти эпитопы локализованы в СЗ или С4 доменах ц-цепи и резистентны к действию ДТТ.

Среди МкАт против маркеров ^О три реагента (О-ЗОЗ, С-5А9 и 0-4Г)6) связывали взаимно удаленные эпитопы в Рс-фрагменте, тогда как МкАт С-5Р2 и С-5ЕЗ распознавали два сближенных эпитопа в области шарнира.

Приемы исследования взаимного расположения эпитопов, распознаваемых МкАт против субизотипов имели свои особенности. Локализация маркерного эпитопа ^01 в Рс-фрагменте у1-цепи была установлена непрямым ИФА на пептических фрагментах поликлонального ^О. Поскольку 1(*Сг2, ^вЗ и в чистом виде в количествах,

достаточных для приготовления пептических фрагментов, были недоступны, исследование эпитопов названных субизотипов проводили методом конкурентного ингибирования на адсорбированных поликлональных антигенах. При этом панель немеченых МкАт была дополнена референс-препаратами с известной эпитопной специфичностью. Для примера на рисунке приведены результаты исследования эпитопной специфичности МкАт против (рис. 6). Два антитела против маркеров (С2-ЗС7 и 02-9Р10) проявили одинаковые свойства: они обладали способностью полностью ингибироватъ друг друга при связывании с адсорбированным антигеном. Взаимодействие с блокировали МкАт С-5ЕЗ, С-5Р2 и й-5А9. Референс МкАт НР-6014, специфичное к эпитопу в РаЬ-фрагменте ^Ст2, включающему треонин в положении 214, не ингибировало связывания исследуемых МкАт. Референс- МкАт НР-6200, распознающее эпитоп в области шарнира молекулы частично ингибировало распознавание исследуемых МкАт. Наконец, референс МкАт НР-6008, связывающее эпитоп в Рс-фрагменте, включающий участок с аминокислотным остатком 309, а также МкАт НР-6009, распознающее другой эпитоп в Рс- фрагменте, не интерферировали с МкАт 02-ЗС7 и 02-9РЮ. Таким образом, МкАт С2-ЗС7 и О2-9И0 распознают один и тот же или два топографически близких эпитопа в Рс-фрагменте молекулы антигена и не совпадают по эпитопной специфичности ни с одним из референс-препаратов.

Рис. 6. Ингибирование немечеными МкАт связывания меченных пероксидазой МкАт против маркеров у2 с адсорбированным поликлонапьным 1£С2. По оси X — шифры немеченых ингибирующих МкАт, по оси У - шифры меченных пероксидазой МкАт против маркеров ^02, по оси '/. - индекс ингибиции, %%.

Аналогичным образом были изучены эпитопы, распознаваемые остальными субизотип-специфичными МкАт, что помогло построить схему их взаимного расположения (рис. 7). Результаты позволили заключить, что распознаваемые эпитопы не совпадают с детерминантами, связывающими референс-реагенты (обозначены курсивом), а полученные МкАт не имеют аналогов по эпитопной специфичности.

Специфичность Фрагмент молекулы lg

МкАт РаЬ | шарнир | 17с | ррс

ДО

ДО1 ДО2

ДОЗ

ДО4

С-5ЕЗ С-5Г2 в-5А9 в-40б О-ЗОЗ

СЫОСИ

НР-6014 НР-6200 С2-ЗС7 С2-9К10 НР-6008 НР-6009

СЗ-5С12 СЗ-1С11

НР-6013 НР-6011 С4-5С7

НР-6023 С4-406

Рис. 7. Схема расположения на молекулах ^С эпитопов, распознаваемых МкАт

Данные о локализации эпитопов на молекулах представленные на рисунке 8, были получены с помощью непрямого ИФА на рекомбинантных пептидах, воспроизводящих фрагменты первичной структуры е-цепн, а также с помощью ингибиторного анализа на адсорбированном миеломном с использованием референс-МкАт (обозначены

курсивом).

Рис. 8. Схема доменной локализации эпитопов, распознаваемых МкАт на молекуле ^Е

Полученные МкАт против ^Е распознавали четыре антигенных участка, один из которых был идентичен иммунодоминантному эпитопу, связывающему референс-препарат 1Т. Остальные МкАт не совпадали по эпитопной специфичности с использованными референс-реагентами.

Таким образом, в полученной панели МкАт против изотопических и субизотипических маркеров ^ человека обнаружены реагенты, не имеющие аналогов по эпитопной специфичности среди известных референс-препаратов.

Конструирование тест-систем детекции и определения концентраций 1а человека. При конструировании систем иммуноанализа, предназначенных для детекции за основу бьи приют двухцентровый ИФА, позволяю1ций обеспечивать сочетание максимальной специфичности и высокой чувствительности. Принцип двухцентрового анализа состоит в использовании минимум двух реагентов, направленных к разным эпитопам одного антигена. Одно МкАт иммобилизовано на твердой фазе и извлекает антиген из раствора, а второе несет ферментную метку и служит для выявления антигена, связавшегося в иммунный комплекс. При выборе пар реагентов учитывали, что одно из МкАт должно сохранять специфическую активность после иммобилизации, а второе МкАт - после мечения ферментом. Выявление комплементарной пары МкАт сопровождалось оценкой специфичности полученной системы иммуноанализа, для чего наряду с искомым ^ в исследуемую панель антигенов включали и другие Наряду с МкАт, направленными против изотопических или субизотипических

Се2

С£3 Се4

4Р12

5Б4 1Т

маркерных антигенов, в исследование были также включены МкАт против к- и против X-легких цепей 1§.

Для создания двухцентровой системы выявления ^А в качестве антигена использовали препарат сывороточного мономерного ^Л и полимерные молекулы з^А. Наиболее эффективная детекция антигена отмечена при адсорбции на фазе МкАт А-ЗВ7 или А-1(Ю11 и выявлении меченым анти-изотипическим МкАт А-1Н9 или смесью МкАт против легких цепей Наличие секреторного компонента не препятствовало выявлению IgA с помощью отобранных пар МкАт. Таким образом, для создания двухцентрового метода анализа ^А оказались пригодными пары МкАт, направленные к взаимно удаленным эпитопам молекулы антигена.

Детекцию IgM обеспечивали адсорбированное МкАт М-2В9 и конъюгат МкАт против легких цепей ^ или меченое одноименное антитело. Возможность определения ^М с помощью одного антитела - МкАт М-2В9, выступающего в роли "якорного" и выявляющего реагента, явилась следствием пентамерной структуры молекулы антигена.

При подборе пар МкАт против изотип-специфичных маркеров у- цепей оценивали сначала способность выявлять поликлональный ^О, затем порознь - ^вЗ и 1ув4

(рис.9).

МКАТ МЕЧЕНЫЕ МКАТ

на „ твердой фазе

5ЕЗ 5И2 5А9 406 ЗБЗ

5ЕЗ 5И2 5А9 4Б6 ЗРЗ

Рис. 9. Выявление четырех подклассов с помощью МкАт против маркеров ^О. Столбцами на каждой гистограмме изображены результаты выявления ^вЗ и

(по оси абсцисс слева направо) с помощью одного из сочетаний меченых и иммобилизованных МкАт

Выяснилось, что топографическая удаленность распознаваемых парой МкАт эпитопов не является достаточным критерием для построения на их основе двухцентровой системы ИФА, что связано, вероятно, с конформационной лабильностью молекул и особенностями экспрессии отдельных эпитопов после взаимодействия с антителами. Равноэффективную

детекцию всех четырех подклассов обеспечивали только два комплементарных

сочетания МкАт: немеченое 0-5Р2 или 0-5ЕЗ и конъюгат О-ЗБЗ (рис. 10).

3

2,5 2

§ 1,5 1

0,5 0

Рис. 10. Выявление 1цв четырех подклассов методом двухцентрового иммуноанализа с помощью МкАт против маркеров у-цепей: адсорбированного МкАт 0-5ЕЗ и меченого С-ЗБЗ

Для детекции ^О одного из подкласов в присутствии остальных 1%, на твердой фазе иммобилизовали МкАт, специфичные к маркерам ^01,1ц02, ^ОЗ или Для выявления антигенов, связанных в иммунном комплексе, испытывали либо меченные ферментом одноименные МкАт, либо МкАт против изотопических маркеров либо смесь МкАт против легких цепей 12. Было выяснено, что на молекулах связанных в иммунный

комплекс с адсорбированным МкАт 01-2С11, изменяется экспрессия эпитопов, распознаваемых МкАт против легких цепей, в первую очередь это касается эпитопа ?.-цепи. Таким образом, для детекции ^01 комплементарную пару составляли МкАт 01-2С11 и меченое МкАт против изотипического маркера С-5А9. Выявление ^ОЗ и ^04 с помощью иммобилизованных на твердой фазе МкАт против маркеров субизотипов оказалось возможным при использовании меченых МкАт против легких цепей, или против маркеров (С-5А9 для и О-ЗОЗ для 1сОЗ). Результаты подбора пар для детекции ^04

заслуживают особого внимания, поскольку одновременное использование МкАт С4-5С7 против маркера у4 в качестве "якорного" реагента и в форме конъюгата позволяло эффективно выявлять антиген. Очевидно, на нативной молекуле парные эпитопы,

связывающие МкАт 04-5С7, пространственно удалены друг от друга. Аналогичные МкАт ранее не были описаны.

Детекцию 1ёС2 обеспечивала пара, включавшая иммобилизованное МкАт С2-ЗС7 и меченое МкАт б-ЗОЗ. Особенности экспрессии на нативных молекулах 1у02т(п-)

— '1 1 -0-1^1 -0-^2

3,3 16 80 400 2000 10000 Концентрация нг/мл

антигенного маркера, распознаваемого МкАт С2-ЗС7, заставили провести дополнительные исследования. Было установлено, что кратковременная инкубация образцов моноклопальных или поликлональных ^02 в подкисленной среде (рН 2) с последующей нейтрализацией раствора позволили добиться полного выявления антигена во всех образцах, содержащих 1«02т(п-), 1£С2т(п) или оба эти варианта, о чем судили при сопоставлении с данными, полученными с помощью референс МкАт 02-6014.

Подбор пар МкАт для детекции 1&Е проводили, испытывая все сочетания меченых и адсорбированных МкАт, а также меченые МкАт против легких цепей ^ в качестве выявляющих реагентов. Два сочетапия МкАт (адсорбированное МкАт Е-5154 и меченое МкАт Е-4Р4 или конъюгат МкАт против легких цепей 1$) явились наиболее эффективными при детекции антигена в препарате очищенного миеломного 1£Е. Однако при замене этого препарата ^Е на образцы сывороток крови проявилась неспецифичность детекции антигена, если выявляющим реагентом служил конъюгат МкАт против легких цепей Эффект был связан с рядом факторов, таких как низкая концентрация ^Е (в 100 000 раз ниже, чем концентрация ^О), небольшие коэффициенты разведения образцов при исследовании, а также наличие антииммуноглобулиновых антител в сыворотках. Полную специфичность теста обеспечивала пара МкАт Е-5ЕМ и Е-4Р4 против эпитопов, локализованных в разных доменах е-цепи.

Таблица 11

Комплементарные сочетапия МкАт, отобранные для создания двухцентровых систем ИФА

Выявляемый ^ Шифр иммобилизованных МкАт Шифр меченых МкАт

^А или йТцА А-ЗВ7 или А-10011 А-1Н9

1ЕМ М-2В9 М-2В9

до в-5ЕЗ О-ЗОЗ

ДО1 С2-ЗС7 0-303К>-5А9

ДО2 СЗ-1СП

ДОЗ 03-5012

ДО4 С4-5С7

№ Е-5Р4 Е-4Р4

Результаты подбора комплементарных сочетаний МкАт (табл. 11) позволили разработать лабораторные образцы двухцентровых иммунометрических систем для детекции ^ в различных биологических жидкостях. В ходе их создания были выполнены эксперименты по подбору материала твердой фазы, состава растворов для иммобилизации каждого МкАт, режимов инкубаций. Специальное внимание было уделено калибрующим образцам. Затем проводили контроль сохранности всех компонентов систем при длительном хранении. В результате этих исследований были построены калибровочные графики и

определены параметры иммунометрических систем анализа, которые послужили прототипами тест-систем, предназначенных для практического применения.

Результаты, полученные при исследовании изотипов ^ в сыворотках здоровых доноров с помощью разработанных систем, сравнивали с данными, полученными при использовании коммерческих аналогов. Отсутствие коммерческих систем-аналогов для детекции ^02, ^ОЗ и ^04 привело к необходимости сравнивать измеренные

концентрации (табл. 12) с опубликованными данными, полученными в зарубежных лабораториях с помощью нескольких методов иммуноанализа. Результаты проведенных исследований показали пригодность разработанных на основе МкАт систем для детекции и определения концентрации перечисленных

Таблица 12

Концентрации Тщв!, 1ёС2, ^СЗ и 1я04 в сыворотках крови здоровых доноров, определенные с помощью двухцентрового ИФА на основе МкАт

Показатели 1ёв2 ДОЗ ДО4

Среднее значение концентрации (мг/ мл) 7,19 3,51 0,94 0,53

Минимальное значение (мг/ мл ) 2,75 0,15 0,02 0,04

Максимальное значепие (мг/ мл ) 17,5 21,0 2,0 1,8

Стандартное отклонение 2,22 2,087 0,36 0,28

Концентрация lg и их состав в экстраваскулярных жидкостях и в секретах отличается от соответствующих показателей в сыворотке крови. Возможность использования разработанных двухцентровых систем для определения концентраций ^ в биологических жидостях изучали на образцах слюны. Образцы слюны от людей, не имеющих патологии ротовой полости и лор-органов, замораживали при -20°С, после оттаивания центрифугировали и отбирали надосадок. Готовили раззедения образцов и в каждом из пих исследовали содержание ^О, 1§А, ^М, а также подклассов ^О. Все показатели, определенные при исследовании в ИФА, были пересчитаны на 1 мг белка (табл. 13 и 14).

Таблица 13

Концентрации ^ в слюне здоровых доноров

Показатели ДО 18М 1ёА

Среднее значение (мкг/ мг белка) 2,7 1,4 37,9

Минимальное значение (мкг/ мг белка) 0,63 0,18 16,8

Максимальное значение (мкг/ мг белка) 8,8 3,69 73,75

Стандартное отклонение 2,4 1,06 16,26

Концентрации подклассов IgG в слюне здоровых доноров

33

Таблица 14

Показатели IpGl IgG2 IgG3 IgG4

Среднее значение (мкг/ мг белка) 1,04 0,57 0,15 0,29

Медиана 0,79 0,38 0 0,21

Минимальное значение (мкг/ мг белка) 0,03 0 0 0,02

Максимальное значение (мкг/ мг белка) 2,55 2,12 1,24 1,28

Стандартное отклонение 0,8 0,67 0,29 0,29

При определении концентрации ^Е были получены значения оптической плотности, не отличавшиеся от фоновых, при этом было показано, что полученный результат не являлся следствием особенностей метода исследования.

Исследование ^А в слюне заслуживало особого внимания, поскольку он содержится в значительно более высоких концентрациях, чем остальные кроме того в секретах он входит в состав молекулярного комплекса, содержащего .Г-цепь и Б С. Сопоставление результатов определения концентрации ^А в слюне с помощью калибрующих образцов, содержащих сывороточный IgA и приведены на рисунке 11.

зооо

2500

»2? <

1500

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 концентрация IgA по slgA (мкг/мл)

Рис. 11. Концентрации IgA, определенные в образцах слюны с помощью калибраторов на основе сывороточного или slgA

При определении IgA в слюне по калибратору сывороточного 1йА все значения были выше в 2 раза, чем при использовании в качестве калибрующего образца б^А. Различия показателей при использовании двух калибрующих препаратов обнаружены при исследовании всех жидкостей, которые содержат в^А. В зависимости от соотношения молекул IgA разной степени полимерности различия могут быть больше или меньше, чем в приведенном примере. В итоге были сформулированы параметры проведения

иммуноанализа для определения ^ в слюне здоровых доноров с помощью двухцентрового ИФА.

Накопленный опыт позволил перейти к испытанию разработанных систем иммуноанализа для детекции в других биологических жидкостях (табл. 15). Результаты проведенных исследований свидетельствовали о пригодности полученных МкАт и созданных на их основе двухцентровых иммунометрических систем для определения концентраций человека в сыворотке крови, а также в других биологических жидкостях.

Таблица 15

Динамический диапазон двухцентровых систем иммуноанализа на основе МкАт и средние значения концентраций в некоторых биологических жидкостях (мкг/мл)

Динамический Средние значения концентраций ^ (мкг/мл)

диапазон кровь слюна ликвор моча

IgA 0,02 - 3,0 2 650 104 1,5 2,9

IgM 0,01-2,0 1 500 4 0,5 0,02

IgE 0,0002-0,1 0,12 0,00025 - --

IgG 0,05 - 10,0 13 000 9 — 0,6

IgGl 0,09-5,8 8 500 1,0 18 —

IgG2 0,1-3,5 4 000 0,57 5 --

IgG3 0,05-0,9 750 0,15 1,0 -

IgG4 0,02 - 0,4 600 0,29 0,5 -

Примечание: знаком "-" обозначено отсутствие данных

Настоящее исследование было начато в 1983 году, спустя 8 лет после опубликования статьи с описанием метода получения гибридом [КоЫег, М^ет, 1975]. Анализ современного состояния гибридомной технологии позволил заключить, что выбранные в начале работы направления совершенствования гибридомной технологии оказались в русле ряда тенденций развития этой области в течение двух последних десятилетий.

ВЫВОДЫ

1. Получен штамм культивируемых клеток миеломы мышей, независимый от ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Штамм позволил создавать и культивировать гибридомы на средах с сывороткой крупного рогатого скота.

2. Использование при создании гибридом в качестве доноров иммунных лимфоцитов мышей линии БЛУД расширило репертуар антигенных детерминант, распознаваемых моноклональными антителами на молекулах антигенов.

3. Пассировние гибридом па сублетально облученных сингенных мышах-гибридах Р1(8ЛЛхВА1ЛЗ/с) позволило синхронизировать накопление гибридомных асцитов и увеличить количество антител, получаемых от каждого реципиента.

4. Созданы гибридомные штаммы, продуцирующие моноклональные антитела против маркерных молекул - флуоресцеина и пероксидазы. Антитела против флуоресцеина распознают как свободный гаптен, так и гаптенизированные молекулы белков. Антитела против пероксидазы взаимодействуют с широким спектром изоформ фермента и не ингибируют его каталитическую активность. Применение моноклональных антител против маркерных молекул расширяет возможности иммуноанализа.

5. Получена панель моноклональных антител против респираторно-синцитиального вируса человека, которые позволяют:

- детектировать вирусные антигены в инфицированных тканях и жидкостях;

- оценивать качество препаратов вируса при его культивировании, очистке и хранении.

6. Созданы гибридомы-продуценты моноклональных антител, которые распознают антигенные маркеры основных изотипов 1ц человека (^А, 1цЕ) и субизотипов ^О (^01, ^02, ^03, ^04). Исследованы иммунохимические характеристики этих антител и свойства распознаваемых ими эпитопов.

7. Разработаны тест-системы, предназначенные для детекции и определения концентраций отдельных изотипов ^ и субизотипов ^О человека в сыворотке крови и в других биологических жидкостях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Авторские свидетельства

1. Климович В.Б., Самойлович М.П., Грязева И.В., Денисова Г.Н., Сирота Н.С. Штамм культивируемых клеток животных Mus musculus L„ используемый для получения гибридом. Автор, свидетельство N131982. Приоритет изобретения 1986.

2. Климович В.Б., Самойлович М.П., Пашкова С.Ф., Сирота U.C., Денисова Г.Н., Желудов

B.И. Штамм культивируемых клеток животных вида Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к пероксидазе хрена. Автор, свидетельство N1433977. Приоритет изобретения 1987.

3. Климович В.Б., Самойлович М.П., Гервазиева В.Б., Крутецкая И.Ю., Овсянникова И.Г., Пашкова С.Ф., Полищук Т.Б. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., - продуцент моноклональных антител против Ig Е человека. Автор, свидетельство N 1776691. Приоритет изобретения 1991.

4. Климович В.Б., Самойлович М.П., Гервазиева В.Б., Крутецкая И.Ю., Овсянникова И.Г., Пашкова С.Ф., Полищук Т.Б. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L- продуцент моноклональных антител к IgE человека. Автор, свидетельство N1752763. Приоритет изобретения 1990.

Статьи в реферируемых научных журналах и сборниках

1. Климович В.Б., Самойлович М.П. Культивирование клеток плазмацитом человека.// Цитология.-1985.-№11.-С. 1215-1227.

2. Самойлович М.П., Грязева И.В., Денисова Г.Н., Казакевич М.Ц., Сирота Н.С., Пашкова

C.Ф., Климович В.Б. Получение гибридом на средах с сывороткой крупного рогатого скота. //"Моноклональные антитела в микробиологии и вирусологии" Труды ЦНИИВС им. И.И.Мечникова,- М,- 1985. - С. 121 -129.

3. Климович В.Б., Пашкова С.Ф., Самойлович М.П., Сирота Н.С., Грязева И.В., Денисова Г.Н., Желудов В.И., Закревская А.В. Моноклональные антитела против пероксидазы хренагсвойства иприменение в иммуноферментном анализе.// Сборник "Твердофазный иммуноферментный анализ." Инст. им. Л.Пастера., Л.,-1988.- Т.64, -С.90-94.

4. Неворотин А.И., Самойлович М.П., Пашкова С.Ф., Зельцер ГЛ., Климович В.Б., Скупченко В.Б. Определение оптимальных условий иммунопероксидазной цитохимии на субмикроскопическом уровне. // Цитология, -1991.- Т. 33,- С. 27-30.

5. Samoilovich М.Р., Klimovich V.B., Gervazieva V.B., Ovsjannikova I.G., Pashkova S.F., Polyschuk T.B. A new family of monoclonal antibodies against human IgE. // Allergy & Clinical Immunology News,- 1992,- V. 4, - P. 21-25.

6. Zavazal V., Krauz V., Hilschmann N., Samoilovich M.P., Klimovich V.B., Gervazieva V.B., Paskova S.F. Imunologicka charakteristika myelomoveho IgE VL monoklonalnimi protilatkami. //Forum Immunologie,-1994,- V. 2,- P. 111 -114.

7. Самойлович М.П., Сухубаевская Л.П., Климович В.Б., Соминина А.А. Получение моноклональных антител к респираторно-синцитиальному вирусу человека. // Вестник РАМН, -1994. -Т.9, -С. 18-21.

8. Klimovich A.V., Klimovich V.B., Samoilovich М.Р., Afanasiev B.V. Immunoglobulin E levels in allogenic BMT. //"Gene Technology, Stem Cell and Leukemia Research." Ed. A.R.Zander et al., NATO ASI Sériés, Subseriaes H "Cell Biology", Springer-Verlag, -1995. -V. 94, -P. 513517.

9. Руденко И.Я., Самойлович М.П., Климович В.Б., Денисова Г.Н., Волчков В.А. Оценка радиобиологических свойств культивируемых клеток гибридомы. //Сборник "Новые технологии в радиационной медицине", С.-Петербург, -1995. - С. 239-241.

10. Соминина А.А., Сухубаевская Л.П., Самойлович М.П., Климович В.Б., Монаенков А.О., Амосова И.В., Маркина И.А., Бубнова С .Д., Зибина Э.А., Острова И.В. Характеристика моноклональных антител к респираторно-синцитиальному вирусу в иммуноферментных и иммунофлуоресцентных реакциях. //Вестник РАМН, -1995.-№9.- С. 49-54.

11. Самойлович М.П., Климович В.Б., Пашкова С.Ф. Профили антиген-связывающей активности моноклональных антител к IgG человека. // Иммунология, -1996. -№ 2,- С. 38-43.

12. Климович В.Б., Самойлович М.П., Крутецкая И.Ю., Грязева И.В., Шмидт E.H., Котова Т.С. Получение и иммунохимическая характеристика моноклональных антител против IgM человека. // Биотехнология, -1997.- №4. - С. 40-46.

13. Климович В,Б., Самойлович М.П., Крутецкая И.Ю., Пашкова С.Ф. Моноклональные антитела против подклассов IgG человека. Эпитопная специфичность и применение в иммуноанализе. // Иммунология, -1998. -№3. - С. 30-32.

14. Самойлович М.П., Крутецкая И.Ю., Климович В.Б., Шмидт E.H., Пашкова С.Ф., Котова Т.С. Моноклональные антитела против подклассов IgG человека. Получение и определение специфичности. // Иммунология, -1998. -№3.- С. 27-30.

15. Турилова В.И., Смирнова Т.Д., Самойлович М.П., Сухих Т.Р. Функциональная морфология ядрышкообразующих районов хромосом и ядрышек в клетках линий множественной миеломы человека. Сообщение 1. // Цитология, -1998. -Т.40. - С. 536-547.

16. Климович В.Б., Самойлович М.П., Грязева И.В., Крутецкая И.Ю., Пашкова С.Ф., Руденко И.Я. Моноклональные антитела на основе репертуара иммунного ответа мышей линии SJL/J. // Медицинская иммунология, - 1999. - Т.1. -№ 1-2. - С. 47-58.

17. Турилова В.И., Смирнова Т.Д., Самойлович М.П., Сухих Т.Р. Функциональная морфология ядрышкообразующих районов хромосом и ядрышек в клетках линий множественной миеломы человека. Сообщение 2. II Цитология, -1999. - Т.41, -С. 857-863.

18. Кривицкая В.З., Сироткин А.К., Самойлович М.П., Соминина A.A. Разработка новых подходов к стандартизации иммуноферментных тест-систем детекции антител к респираторно-синцитиальному вирусу с использованием электронной микроскопии и моноклональных антител. // Вопросы вирусологии, -1999. -№ 6.- С. 279-284.

19. Самойлович М.П., Кузнецов С.Г., Павлова М.С., Климович В.Б. Моноклональные антитела против антигенов Hydra vulgaris и Hydra oligactis. // Журнал эволюционной биохимии и физиологии, -2001 - Т. 37. - С. 262- 269.

20. Тотолян A.A., Самойлович М.П., Алешина Л.А., Бацдуева И.А., Тепляков Б.Г., Евтушенко П.В. Программа внешнего контроля качества определения общего иммуноглобулина Е. // Клиническая и лабораторнаая диагностика, - 2002. - № 3. - С. 3 стр перед стр. 29.

21. Самойлович М.П., Бегас О.С., Князев H.A., Кузенкова A.B., Климович В.Б. Антигены кишечнополостных и иглокожих, выявляемые моноклональными антителами.// Журнал эволюционной биохимии и физиологии, -2004 - Т. 40. - С. 284- 286.

22. Близнкжов О.П., Козмин А.Н., Тищенко Е.В., Самойлович М.П., Климович В.Б. Легкие цепи иммуноглобулинов человека образуют фибриллы амилоида и гранулярные агрегаты в растворе. // Биохимия, -2005. - Т. 70.- С. 556-567.

23. Климович В.Б., Самойлович М.П. IgA и его рецепторы. // Медицинская иммунология, -2006. - Т.8. - С. 483-500.

Отпечатано ООО "АБЕВЕГА", 197183, Санкт-Петербург, ул. Савушкина, д. 12, тел.: 496-09-94

Типаж 120 экз.

Актуальность проблемы. Моноклональные антитела (МкАт) являются мощным инструментом исследования биологических макромолекул. С их помощью 1иучакн струкгуру и функции ранее открытых молекул, а также выявляют новые ашшенные компоненты клеток и тканей [72]. Анализ экспрессии и регуляции генов, идентифицированных в раличных геномных проектах, требует создания тысяч и тысяч новых МкАт [238]. МкАт позволяют обеспечить высокую специфичность, чувствительность и воспроизводимость приемов иммуноанализа и в то же время -увеличить их разнообразие и адаптировать для решения проблем фундаментального и практического характера [91]. Поэтому создание МкАт для систем иммуноаналиш было и остается актуальной задачей.

Опубликование в 1975 году статьи, в которой было описано слияние нормальных плазмацитов с их опухолевыми аналогами - клетками миеломы и последующий отбор клонов-продуцентов антител [200], открыло эру создания, исследования и исполыования МкАт. Совокупность приемов получения штаммов-продуцентов МкАт была патана гибридомной технологией. В ее основе лежит синтез ряда достижений клеточной биологии, фундаментальной иммунологии и экспериментальной онколо! ии.

Перспективность гибридомной технологии для развития методов иммуноанализа была высоко оценена исследователями, и лаборатории многих стран мира занялись ее освоением и адаптацией. Вскоре стало понятно, что на каждом этапе создания гибридом имеются многочисленные технические проблемы и что способ их решения определяв! результат в целом. Первая из таких проблем связана с высокой зависимостью миеломных клеток-партнеров от ростовых факторов эмбриональной сыворотки [124, 130]. Создание клеточных линий, менее зависимых от экзогенных ростовых факторов, способных расти и давать жизнеспособные гибриды в средах, не содержащих фетальной сыворотки, представляло актуальную задачу. Вторая проблема состояла в том, что при создании 1ибридом для иммунизации почти повсеместно использовали мышей BALB/c, от которых происходят миеломные штаммы-партнеры [185, 257]. Это приводило к сужению спек фа эпитопов, распознаваемых полученными МкАт. Представлялось целесообразным в качестве доноров иммунных лимфоцитов использовать животных иного генотипа с иным репертуаром вырабатываемых антител с тем, чтобы получаемые МкАт по эпитопной специфичности могли дополнять ранее созданные реагенты. Наконец, пассирование гибридом на животных с целью получения больших количеств МкАт остается до сих пор «узким местом» гибридомной технологии [118].

Таким образом, совершенствование ряда ключевых этапов гибридомной технологии представляет собой актуальную задачу.

Анализ литературы показывает, что иммунофлуоресцентные и иммунопероксидазные методы детекции антигенов и антител относятся к числу наиболее надежно работающих и чаще всего используемых вариантов иммуноанали ул как в фундаментальных исследованиях, так и в лабораторной диа1ностике. Наличие Мк/\л против молекул - маркеров позволяет с большей гибкостью подходить к разработке и применению систем иммуноанализа, создавать иммунные комплексы сложного состава и использовать их для визуализации или инструментальной регистрации продуктов реакции ангшен-антитело [94].

МкАт служат незаменимыми инструментами в вирусологических исследованиях. Иммунохимические способы диагностики вирусных заболеваний основаны на выявлении вирусных антигенов в клетках и в биологических жидкостях, а также на определении спектра циркулирующих в крови антивирусных антител. Респираторно-синцитиальный (РС) вирус человека вызывает тяжелое заболевание нижних отделов дыхательных путей, особенно опасное для новорожденных и детей 1-ю года жизни [151]. Энл вирус характеризуется чрезвычайно нестабильной антигенной структурой - она ле1ко нарушается при выделении, очистке и хранении препаратов вируса. Создание МкАт против антигенов РС вируса открывает пути совершенствования и стандаргишции методов иммунодиагностики этой вирусной инфекции.

При диагностике иммунодефицитов, инфекционных, аллергических, аутоиммунных, лимфопролиферативных заболеваний используют методы иммуноанализа, основанные на выявлении иммуноглобулинов человека. В антигенном отношении 1ц представляют собой молекулы с высокой степенью гомологии, в то же время они имеют антигенные детерминанты, отличающие отдельных типов, изотииов и субизогипов. Создание высокоспецифичных реагентов, способных дифференцировать и детектировать эти молекулы методами иммуноанализа, отвечает запросам фундаментальной и клинической иммунологии.

Цель работы состояла в совершенствовании ряда приемов гибридомной технологии и в создании МкАт против флуоресцеина, нероксидазы, РС вируса и человека как анти! енов, широко используемых в системах иммуноанализа.

Задачи исследования.

1. Создать штамм культивируемых клеток миеломы мышей, независимый от ростовых факторов эмбриональной сыворотки, позволяющий получать и поддерживать гибридомы на средах с сывороткой крупного рогатого скота (СКРС).

2. Испытать целесообразность использования при создании гибридом лимфоцитов животных с репертуаром иммунного ответа, отличным от присущею мышам линии ВАЬВ/с.

3. Рафаботать способы эффеюгивной наработки МкАт пассированием штаммов гибридом на животных.

4. Получить гибридомы-продуценты МкАт против флуоресцеина и пероксиданл -маркеров антигенов и антител в системах иммуноанализа. Исследовать свойсша МкАт и возможности их применения в иммуноанализе.

5. Создать панель МкАт против антигенов РС вируса человека и отобрать реагенты, необходимые для иммунодиагностики РС вирусной инфекции. 6 Создать гибридомы, продуцирующие МкАт против антигенных маркеров иютипов (IgA, IgM, IgG, IgE) и субизотипов IgG (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) человека.

7. Изучить иммунохимические характеристики МкАт против Ig человека и свойства распознаваемых ими антигенных детерминант.

8. Разработать лабораторные варианты систем иммуноанализа для определения концентраций Ig отдельных изотипов и субизотипов.

Работа выполнялась в рамках государственной целевой программы 0.1Д.043 и КП НГП стран-членов СЭВ "Биотехнология в медицине" (задание - «Разработка и организация производства диагностических реагентов на основе моноклональпыч антител»), в соответствии с планом научно-исследовательских работ Центральною научно-исследовательского рентгено-радиологического института (номера государственной регистрации 01.83.0 021559, 01.85.0 025322 и 01.99. 0 04371). Исследования, выполняемые соискателем, были поддержаны грантами РФФИ (00-0449516 и 02-04-49120). Научная новизна.

Создан новый штамм культивируемых клеток миеломы мышей, независимый oí ростовых факторов эмбриональной сыворотки.

Впервые для пассирования гибридом и наработки МкАт in vivo в сингенной системе использовано сублетальное облучение реципиентов.

Впервые получены МкАт против пероксидазы, взаимодействующие со всеми изоформами фермента и не ингибирующие его каталитическую активность.

Среди МкАт против РС вируса человека впервые описаны реагенты, способные дифференцировать полноценный вирус от вирусных частиц, имеющих структурные дефекты.

Впервые при получении МкАт против изотип-сиецифичных эпитопов IgG человека исследован профиль их антиген-распознающей активности и отобраны реагешы, равномерно связывающие все четыре подкласса.

Получены МкАт против изотипических и субизотипических маркеров Ig человека, не имеющие аналоюв по эпитопной специфичности.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Использование мышей линии SJL/J позволяет расширить репертуар эпитопов, распознаваемых МкАт.

2. Сублетальное облучение мышей при пассировании гибридом увеличивает эффективность наработки МкАт.

3. Полноценное использование МкАт в иммуноанализе требует одновременного изучения иммунохимических характеристик самих антител и свойств распознаваемых ими эпитопов.

4. МкАт против флуоресцеина и против пероксидазы позволяют расширить возможности иммуноанализа за счет сочетанного применения антшенов и антител, меченных ферментом, флуорохромом и/или гаптеном.

5. На основе полученных МкАт против классов и подклассов IgG разрабоганы системы ИФА, позволяющие выявлять и определять концентрации IgA, IgE, IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 и суммарною IgG, как в сыворотке крови, так и в других биологических жидкостях человека.

Практическая значимость результатов работы.

Созданные в работе МкАт против PC вируса могут быть использованы как для диагностики инфекции, так и для оценки качества вирусных препаратов.

МкАт против IgA, IgE, IgM, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 и суммарного IgG в виде нативных препаратов и в виде конъюгатов с пероксидазой прошли государственные испытания и рекомендованы для практического применения Комитетом по иммунобиологическим препаратам при ГИСК им. JI.A. Тарасевича.

Государственным фармакопейным Комитетом утверждены фармакопейные статьи:

1. «Антитела моноклональные диагностические против легких и тяжелых полипептидных цепей иммуноглобулинов человека» - №42-0190-059300.

2. «Антитела моноклональные диагностические против легких и тяжелых полипептидных цепей иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена» - № 42-0596-636605.

Внедрение результатов исследования.

Прошедшие государственную экспертизу и включенные в фармакопейные статьи антитела применяются в иммунодиагносгических тест-системах, выпускаемых НПО «Вектор» (Новосибирск), ООО «ЦКФФ» (Ставрополь). Полученные в работе МкАг используются в научных и диагностических лабораториях ряда учреждений страны, в том числе в: BMA (Санкт-Петербург), ВЦЭРМ МЧС (Санкт-Петербург), НИИ гриппа РАМН (Санкт-Петербург), СПб МАПО, Институте детских инфекций (Санкт-Петерб>р1), СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, ВНЦ МДЛ (Москва), ГУ НИИ вакцин и сывороток (Москва).

Теоретические положения и практические результаты, полученные в настоящей работе, используются при проведении практическою курса «Иммунологические методы исследования» на кафедре цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета СПбГУ.

Личный вклад автора в проведение исследования. Данные, представленные в работе, получены лично автором. Автором выполнены все этапы создания 1ибридом, получения МкАт, изучения их свойств, конструирования систем иммуноанали ja, подютовки материалов для публикаций и для проведения государственных испытаний МкАт. При получении МкАт против PC вируса, диссертантом выполнены этапы иммунизации, разработки системы скрининга, создания гибридомных штаммов, исследования свойств МкАт и распознаваемых ими эпитопов. Получение препаратов РС-вируса, ею очистку, электронно-микроскопические исследования, а также работу с материалом от пациентов проводили сотрудники лаборатории иммунодиагностических препаратов НИИ гриппа РАМН, руководимой профессором Сомининой A.A.

Апробация работы Материалы работы были представлены на Всесоюзных и международных конференциях и симпозиумах, в том числе: на всесоюзном конгрессе "Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований" (Москва, 1989), на конференциях «Современные достижения медицинской радиологии» и «Новые технологии в радиационной медицине» (С-Г1етербург, 1993 и 1995), на 1-ой Национальной конференции Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических иммунологов (РААКИ), (Москва, 1997), на 5-м Конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммуггологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), на Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004), на Всероссийском совещании "Клеточная биология на пороге XXI века" (С-Петербург, 2000), на восьми Всероссийских научных конференциях с международным участием "Дни иммуггологии в Сатгкт-Г1етербурге"( 1996-2005), на XI и XII-м международных совещаниях по эволюционной физиологии, посвященных памяти академика. Л.А.Орбели (С-Петербург 2001 и 2006), на международных конференциях по медицинской биотехнологии «Иммунизация и СПИД» и «Биотехнология С-Петербург-94» (С-Петербург, 1991 и 1994). Результаты исследования были доложены и обсуждены на международных симпозиумах: «Регуляция и клиническое значение IgE» (Москва, 1990), «Множественная миелома. Достижения в биологии и лечении» (Вена, 1996), «Достижения в клинической вирусологии -IV» (Гамбург, 1998), «Эволюция системы иммунитет» (Йена, 1999), на IV международном симпозиуме по клинической иммунологии (Амстердам, 1997), на XI-м международном конгрессе но иммунологии (Стокгольм, 2001).

Диссертационная работа прошла апробацию на расширенном совместном заседании проблемных комиссий «Медицинская биотехнология» и «Медицинская радиобиология» ФГУ ЦНИРРИ, а также на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН.

Публикации. Результаты работы отражены в 4-х авторских свидетельствах на изобретения, в 23-х статьях и 40 тезисах докладов на Международных, Всесоюзных и Всероссийских конференциях, съездах и симпозиумах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 237 страницах машинописного текста и состоит из обзора литературы, пяти глав, содержащих изложение и обсуждение результатов исследования, заключения и выводов. Диссертация иллюстрирована 85 рисунками и 48 таблицами. Список цитированной литературы содержит 350 источников.

Заключение.

Тенденции развития гибридомной технологии и создания моноклональных антител для имммуноанализа

В 2000 году иммунологическое сообщество отметило 25-летие со дня опубликования статьи, содержавшей описание метода получения гибридом-продуцентов антител заданной специфичности [200, 238]. Настоящее исследование было начато в 1983 году, спустя 8 лет после рождения гибридомной технологии. В приведенном в 1-й главе очерке гибридомной технологии изложены те сведения, которые послужили основой при планировании работы. Современное состояние исследований в обласш получения МкАт для иммуноанализа, некоторые тенденции развития и проблемы этого направления иммунологии заслуживают внимания.

Базовый протокол создания МкАт, разработанный на основе опыта mhoihx лабораторий в 80-е годы, в настоящее время остается наиболее широко применимым. Мышиные 1ибридомы получают на основе линий миелом NSO, NSI, X63Ag8.653 и SP-2/0-Agl4, зависимых от ростовых факторов эмбриональной сыворотки. Получение клеток-наргнеров для слияния, менее зависимых от экзогенных ростовых факторов, на протяжении всех лет оставалось задачей, решение которой искали с помощью разных методических подходов. Один из таких подходов основан на наблюдении тою, что культуральные среды, кондиционированные клетками, секретирующими IL-6, способны увеличивать выход гибридом-продуцентов МкАт. Для создания нового штамма миеломы -Sp2/mIL-6 в клетки линии SP-2/O с помощью ретровируса были введены юны, обеспечившие постоянную экспрессию мышиного IL-6 [158]. Слияние клеток Sp2/mlL-6 с иммунными В-лимфоцитами позволило увеличить как выход Ig-секрегирующих гибридов, так и количество гибридом, продуцирующих МкАг искомой специфичности. По ростовым характеристикам, стабильности и продуктивности гибридомы, полученные на основе клеток Sp2/mIL-6, не уступали гибридомам, полученным на основе исходно! о штамма. Другой экспериментальный подход состоял во введении в миеломные, а также в гибридомные клетки экзогенных генов Вс1-2, регулирующих апоптоз. Это способствовало снижению клеточной гибели в условиях разреженной культуры, дефицита питательных веществ или увеличения кислотности среды [107, 292]. Эти данные моиш бы указывать путь создания линий миелом, менее зависимых от экзоюнных ростовых факторов, однако, они не нашли подтверждения в ряде независимых исследований [87]. Работы по модификации миеломных мышиных клеток продолжаются по сей день.

Для получения иммунных лимфоцитов в большинстве работ так же, как и в 80-е годы, используют мышей линии BALB/c [258]. Инбредные мыши других генотипов служат донорами лимфоцитов в редких случаях, при решении специфических задач. Так, например, для изучения репертуара антител при аутоиммунных заболеваниях получали гибридомы из лимфоцитов мышей MRL/1, NZB и BXSB [346]. Авторов другою исследования трудности получения каталитических МкАт, обладающих эстера зной активностью, заставили обратить внимаггие на мышей линии MRL/MpJ-lpr/lpr, имеющих дефект Fas-rcna. При иммунизации этих мышей было получено в 8 раз больше гибридом, продуцирующих искомые МкАт, чем при иммунизации мышей BALB/c [307]. Высказано предположение, что мыши линии MRL/MpJ-lpr/lpr могут оказаться полезными для создания других МкАт, особенно против слабоиммунн о генных антигенов [258]. Создается впечатление, что повсеместная практика использования мышей BALB/c тормозит реализацию возможностей гибридомной технологии, особенно при создании реагентов для эпитопного картирования биологических молекул.

Наиболее существенные изменения за последние годы произошли в подходах к иммунизации доноров иммунных лимфоцитов [285]. Исследования, направленные на получение МкАт против высокогомологичных молекул или против минорных компонентов антигенных смесей, сформировали стратегию, которая получила название вычитателыгой иммунизации (subtractive immunization), суть которой состоит в создании неоотвечаемости к нежелательным антигенным детерминантам [96, 227, 293, 343]. Вариант вычитателыгой иммунизации, основанный на связывании рецепторов В-лимфоцитов IgG-антителами против иммунодоминантных эпитопов, общих для гомологичных молекул, был использован в настоящей работе при получении МкАг против маркеров IgG4 и IgG2. Другой вариант вычитательной иммунизации сосюит во введении антигена животным, у которых в отношении иммунодоминантных молекул индуцирована высокодозная толерантность [211]. Эффективным способом индукции иммуносупрессии является элиминация антиген-специфичных В- и Т- лимфоцитов с помощью циклофосфамида [294, 326]. Действие циклофосфамида на антшелообразование было описано почти потвека назад [288], однако, его широкое использование при получении МкАт является достижением последнего времени.

Дшгьнейшее развитие гибридомной технологии связано с применением методов генной инженерии. Исследования, проводимые на трансгенных мышах, открывают возможности манипуляции регуляторньтми генами у иммунизируемых животных. 1ак, гранстенные мыши BALB/c, имеющие увеличенную дозу гена Вс1-2, при создании МкАт против галактоз ид азы, оказались более эффективными донорами специфических силеноцитов, чем мыши BALB/c дикого типа [196]. Эти результаты указывали на то, что манипулирование 1енами, отвечающими за апоптоз, может увеличивагь эффективность созданияiибридом.

Для получения МкАт против молекул с известной первичной структурой в качестве иммуногена вместо природных молекул все шире стали использовать сишетические пептиды [254, 285]. Применение такого приема позволило с большей эффективностью получать МкАт против определенных антшенных участков интересующих молекул. В то же время реа1енты, полученные в результате иммунизации синтешческими пептидами, далеко не всегда способны распознавать нативные молекулы, чго, вероятно, связано с различиями в конформации синтетического пептида и той же последовательности аминокислот в составе нативной молекулы.

Другим источником иммунотена стали рекомбинантные пептиды, эксирессированные в бактериях, дрожжах или клетках насекомых. Создание рекомбинантных антигенов стало возможным благодаря использованию методов генной инженерии и требует знания нуклеотидной последовательности антигена или ею фрагментов [90, 319]. Применение рекомбинантных молекул при создании гибридом наиболее целесообразно при работе с клеточными антигенами, когда скрининг можно проводить с помощью цитофлуоримегрии, клеточного ИФА или других аналогичных приемов, исключающих выявление антител против компонентов тех клеток, в которых проходила экспрессия антигенных фрагментов.

Принципиальным изменением в процедуре подготовки доноров иммунных лимфоцитов стало использование ДНК-иммунизации [106, 184, 213, 311] Вместо введения эмульгированных в адъювантах белковых молекул, животным инъецируют ДНК, кодирующую интересующий фрагмент антигена. ДНК обесггечивает экспрессию искомого аггтигена, на который организм формирует иммунный огвет. Проведены исследования количества специфических гибридом, а также эпитопной специфичности и свойств МкАт, получаемых при иммунизации белковыми молекулами или соответствующей ДНК-иммунизации [184]. Гак введение мышам вместо простато-специфическою антигена (PSA) плазмиды, экспрессирующей полномерную кДНК этою белка, привело к появлению в крови животных антител, титр которых был достоверно ниже, чем при иммунизации белком [213]. Очевидно, в процессе иммунизации участвуют аутологичные белки трансформированных клеток, что может активировать супрессорные механизмы [277]. Соответственно, выход гибридом был также ниже. Существенно, чго МкАт, полученные при гибридизации спленоцитов мышей, инъецированных кДНК, не отличались ни по эпитопной специфичности, ни по изотопам, ни по аффинитету от МкАт, синтезируемых гибридомами, созданными в результате белковой иммунизации. ДНК-иммунизация стала методом выбора при получении МкАт против клеточно-ассоциированных антигенов, которые трудно выделять в чистом виде [106]. Таким образом, ДНК-иммунизация может быть эффективно использована для получения МкАг в тех ситуациях, когда белок оказывается малодоступным.

В отличие от этапа иммунизации, этап подютовки клеток к слиянию и сама процедура слияния за истекшие 30 лет не претерпели значительных изменений. Сгоит отметить более широкое использование клеточных сортеров для предварительной селекции B-лимфоцитов, несущих АГ-специфные рецепторы. Сочетание генно-инженерных приемов с использованием клеточных сортеров рекомендуется в качесгве экономичной и эффективной технологии получения МкАт против белков - продуктов новых генов, для которых известна только нуклеотидная последовательность [90]. Слияние миеломных клеток с иммунными лимфоцитами проводят как правило в присутствии ПЭГ, правда все более широко применяется метод электрослияния [350].

Системы скрининга гибридом так же как и в прошлые десятилетия опираются преимущественно на варианты иммуноферментного анализа. В зависимости от природы анти1 ена и целей создания Мк А г используют твердофазный ИФА в планшетном варианте, или «дот»-анализ, антитела против клеточных антигенов выявляют в ИФА на иммобилизованных на планшетах клетках, или на проточных анализаторах, применяя флуоресцирующие метки. Новой по формату исполнения и чрезвычайно экономичной в отношении времени и реагентов стала техника с применением микрочипов. Основным ограничением в ее распространениии пока является отсутствие соответствующей дорог остоягцей аппаратуры.

Клонирование с помощью лимитирующих разведений остается основным методом отбора и размножения клеток-продуцентов МкАт. При этом фидерные клетки, которыми обычно служили первичные культуры мышиных перитонеальных макрофагов, все чаще заменяют на бесклеточные добавки, содержащие один или несколько цитокинов. Источником цитокинов могут служить как надосадки постоянных клеточных линий макрофагальной природы, так и очищенные рекомбинантные белки. Описаны некоторые модификации, основанные на создании специальной аппаратуры, позволяющей упростит г. процедуру клонирования [340].

Все годы существования гибридомной технологии процессу наработки МкАт уделялось немало внимания, однако, особую остроту проблема приобрела после 1999 года, когда решением Европейского комитета по этике были введены значительные ограничения на работу с лабораторными животными [118]. Переход на производство

МкАт in vitro потребовал кропотливых испытаний и исследований [252, 174, 320]. Было необходимо сопоставить параметры роста, продуктивность, стабильность гибридом и свойства МкАт, получаемых в биореакторах с реагентами, получаемыми при пассировании опухолей на мышах. Проведены эксперименты по оптимизации состава ростовых сред, возможности замены сыворотки. В итоге были созданы ферментеры разного объема, основанные на разных принципах, позволяющие нарабатывать от соген миллиграммов до сотен граммов МкАт. Поскольку каждый штамм гибридомы представляет собой индивидуальную линию опухолевых клеток, имеющую свой, отличный от остальных гибридом, генотип, для них харктерен чрезвычайно широкий спектр ростовых характеристик. Многие гибридомные штаммы с успехом были адаптированы к поддержанию в условиях массовых культур в ферментерах. Часть гибридомных штаммов не удается адаптировать к росту in vitro несмотря на оптимизацию всех условий культивирования Именно для таких штаммов сохраняется необходимость пассирования на животных. При этом эффективность прививок опухолевых клеток, количество асцита, получаемого от одного животного и концентрация Ig в нем являются важнейшими показателями, а сгратетия состоит в максимальном снижении числа животных, необходимых для наработки нужного количества МкАт [118].

Принципиально новым подходом к получению моноклональных реагнегов явилось создание методами генной инженерии фрагмнентов Ig, включающих антшен-распознающий участок. Разработка таких реагентов в первую очередь диктуется интересами фармацевтических компаний, поскольку на их основе создают препараты для иммунотерапии [142]. В то же время рекомбинантные фрагменты антител полезны для исследования функций клеточных рецепторов и других биологических молекул, а также могут применяться в иммуноанализе. Первыми шагами на пути создания технологии, позже получившей название "phage display technology" (технология экспонирования на фаговых частицах), было формирование библиотек генов, кодирующих вариабельные участки молекул антител, а гакже использование полимеразной цепной реакции (PCR) для и\ амплификации [167]. В 1990 году было показано, что фрагменты антител могут бьпь экспонированы на поверхности фатов, если ген, кодирующий участок антигела, присоединен к гену, кодирующему один из поверхностных белков фага. Экспрессия генов фага в клетках E.coli, последущий скрининг и селекция фаговых частиц, несущих "фаговые антитела", затем повторные циклы заражения бактериальных клеток и селекции позволили производить фрагменты антител искомой специфичности.

Таким образом, краткий обзор современного состояния гибридомной технологии, направленной на создание моноклональных реагентов для иммуноанали за, показывает, что выбранные в начале настоящей работы направления совершенствования се, оказались в русле ряда тенденций развития эгой области в течение двух последних десятилетий.