Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Оптимизация промышленного производства анти-А и анти-В моноклональных антител для определения групп крови человека системы АВ0

ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК.

На правах рукописи

Проскурина Наталья Владимировна.

ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОМЫШЛЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА АНТИ-А И АНТИ-В МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП . КРОВИ ЧЕЛОВЕКА СИСТЕМЫ ABO.

(14.00.29 - гематология и переливание крови)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук.

Москва-1994 г.

Рабата выполнена в Гематологическом научном центре РАМН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Е.И. Дерюгина.

Официальные оппоненты :

доктор медицинских наук, профессор Т.И. Булычева доктор биологических наук, профессор Е.В. Сидорова. Ведущее учреждение - Онкологический научный центр РАМН.

Зашита диссертации состоится " " _ 1994 г. в_час.

на заседании диссертационного совета Д 001.45.02 в Гематологическом научном центре РАМН ( 125167 Москва, Новозыковский проезд, 4а). ,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра.

Автореферат разослан " " -_1934 г.

Учёный секретарь докторского сопел, кандидат биологических наук

БД. Реук

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы, Моноклональные реагенты для определения групп крови должны производиться ежегодно десятками тонн. Крупномасштабное культивирование гибридом с целью промышленного получении моноклональных антител (МКА) in vitro в России не рентабельно, так как наращивание клеток и дальнейшее приготовление реагентоп (концентрирование супернагантов, очистка иммуноглобулинов и др.) требуют импортных сред, реактивов, дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Поэтому в настоящее время основным способом производства анти-А и анти-В МКА для определения групп крови человека системы ABO является получение их в мышах-продуцентах. Поскольку нельзя прямо использовать исследовательскую схему получении аснигной жидкости от небольшого количества мышей в крупномасштабном производстве, требуются дополнительные исследования по оптимизации получения МКА в больших (промышленных) объемах.

Из-за ограничений, вызванных коммерческими интересами разработчиков, технологические разработки в этой области становятся производственными секретами или патентуются. Поэтому в отечественной и зарубежной литературе не встречается данных о крупномасштабном получения МКА in vivo.

Целью работы явилась оптимизация промышленного производства моноклональных антител для типирования антигенов эритроцитов человека системы ABO при одновременном сокращении материальных затрат. В задачи исследования входило:

1) Оптимизировать условия культивирования анти-А и анти-В гибридом, предназначенных для инокуляции мышам.

2) Подобрать резервный генотип мышей в качестве реципиентов гибридомных клеток.

3) Подобрать эффективный, дешёвый отечественный аналог импортного препарата пристана. для кондиционирования мышей перед . введением гибридомных клеток.

4) Установить оптимальную дозу и срок введения кондиционера.

5) Определить оптимальную дозу облучения для лучшего приживления гибридомных клеток.

6) Установить оптимальную дозу клеток, предназначенную для индукции

*

асцитной опухоли у мышей.

Научная новизна. Получение МКА in vivo в условиях крупномасштабного производства осуществлено при помощи оптимизации и удешевлении схемы крупномасштабного производства анти-А и анти-В МКА для типирования групп крови человека системы ABO. Сделанные рекомендации имеют универсальное значение и целесообразны для производства в крупных масштабах и других МКА мышиного происхождения.

Практическая значимость работы и внедрение в практику. Внедрение полученных результатов в практику осуществлено следующими путями:

1. Разработанная технология крупномасштабного получения МКА в виде асцитной жидкости мышей внедрена с 1991 г. на предприятии, производящем анти-А и анти-В реагенты: ТОО "Гематолог".

2. Основные результаты исследований опубликованы в периодической печати и доложены на научных конференциях, посвященных проблемам получения МКА в биотехнологии.

Осгютые положения, выносимые на защиту. 1. Использование дешёвых отечественных сывороток, снижение концентрации дорогостоящих импортных ингредиентов питательной среды и замена их отечественными аналогами, оптимизация режима смены питательной среды при пассировании гибридом значительно удешевляет и упрощает процедуру наращивания in vitro клеток анти-А и апти-В гибридом.

. Генотип мышей (Balb\c х CS7Bl\6)Fj может быть использован дли олучения МКА к группослецифическнм антигенам эритроцитов человека исгемы ABO.

i. Предложены новые кондиционеры отечественного производства гексадекап i перфгордекалин, взамен традиционно применяемого пристана, а также :очетание пристана и вазелинового масла в соотношении 1:1. I. Установлена оптимальная доза облучения мышей-гибрилов для улучшения приживления гибридомных клеток.

5. Оптимизирован процесс размораживания криоконсервированных клеток гибридом и установлена минимальная доза клеток, достаточная для индукции опухолей.

6. Предложен новый метод сбора асцитной жидкости, значительно увеличивающий выход МКА.

Апробация диссертации состоялась 23 декабря 1993 г. та заседании проблемной комиссии по экспериментальной гематологии и биотехнологии в ГНЦ РАМН. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции по современным направлениям создания медицинских диагносхикумов (Москва, 1990) и Международной конференции по медицинской биотехнологии, иммунизации и СПИДу (Ленинград, 1991). Публикации. По теме дисеертаци опубликовано 8 работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения и выводов. Библиография включает 146 вазваний. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 3 рисунками.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории физиологии кроветворения (зав.- проф. ИЛ.Чертков) Гематологического научного центра РАМН. В работе использованы данные, полученные совместно с Дерюгиной Е.И., Леменёвой Л.Н., Чертковым ИЛ., Кульманом РЛ., Ивановым В.Н., что

отражено в соавторстве печатных работ. Автор выражает искреннюю благодарность всем участникам данной работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использованы около 70 тыс. мышеи обоего пола линий BALB\c, гибриды первого поколения (BALB\c х WR)F¡ - (CWRFj) , (BALB\c х DBA2)Fj - (CD2F)j, в возрасте 15-20 недель и весом 18-20 гр, полученных в Центральном питомнике РАМН.

Культивирование гибридомных. клеток.

Наращивание гибридомных клеток проводили в полной питательной среде DM ЕМ с добавлением 20 мМ HEPES-буфера, 4 мМ L-глугамина, 1 мМ пирувата. натрия (Flow, Великобритания), SxlO'^M 2-меркаптоэтанола (Serva. Германия), 10 % оленьей сыворотки ("Тундра", Россия) или свиной сыворотки ("Вектор", Россия), 100 еа\мл пенициллина и 50 мкг\мл стрептомицина (Минмедбиопром). Гибрвдомные клетки культивировали при 37°С в Т-25 матрасах (Flow, Великобритания или Falcon, США) в объёме 10 мл\матрас. Начальная концентрация клеток при пассировании составляла 0,3-0,4 х 106 /мл. Пассирование клеток осуществляли каждые 3-4 дня при достижении концентрации 0,8-1,6 х 10^ клеток/мл. При пассаже клетки центрифугировали при 800 об/мин в течение 10 мин и ресуспешшровали в свежей полной питательной среде. Определение жизнеспособности клеток производили по исключению красителя, смешивая клеточную суспензию в соотношении 1:1 с 0,2 % раствором трипанового синего. Эффективность культивирования гибридомных клеток в питательных средах разного состава оценивали по жизнеспособности и времени удвоения (Td) культуры, которое вычисляли исходя из клеточной плотности культуры непосредственно перед пассированием. Исследования проводили в течение пяти пассажей. В работе использовали гибрндомные клеточные линии А-86/44, А-86/3 и А-27, секрегирующие анти-А антитела и В-85/1, В-85/2, секрегарующие анти-В

антитела. Гибрнломы получены путем слияния клеток млеломы P3-X63-А&8.653, и спленоцитов мышей линии Balb/c, иммунизированных эритроцитами человека групп крови А (II) или В (III), соответственно. Миелома P3-X63-Ag8,653 использована также и при получении других гибридом, секретируюсцих антитела к антигенам эритроцитов человека: Н-86/44, Н-86/50, N-4.

Крипконсервирование и размораживание клеток.

Клетки криоконсервировали в концентрации 20-40х10^\мл в среде, содержащей 40% эмбриональной телячьей или свиной сыворотки и 10% диметилсульфоксцда (ДМСО) в качестве криопротектора. Размораживание проводили при температуре 37-40°С, затем клеточную суспензию переносили в пробирки и прибавляли 10-кратный объём среды, содержащей 10% сыворотки. Клетки однократно отмывали центрифугированием при 1000 об\мин в теченне 3-5 мин и ресуспендировали в среде в необходимой концентрации.

Реагенты для кондиционирования мышей.

За 7 суток до инокуляции клеток ги брило мы (кроме опытов по изучению оптимального времени кондиционирования) мышам вводили внутрибрюшинно и объеме 0,25 мл/мышь следующие реагенты или их смеси: "Span-80", Serva; Tween-80", Feruk; пристан, Sigma; перфтордекалин, вазелиновое масло, смесь пристала и вазелинового масла 1:1, и ряд предельных углеводородов Новочеркасского завода синтетических продуктов: декан, гексадекан, додекан, гептан. Обычно (за исключением тех опытов, где специально изучали действие различных кондиционеров) мышей кондиционировали смесью лристана и вазелинового масла в соотношении 1:1 в объёме 0,25 мл\мышь.

Обл)>ченис животных.

Облучение мышей осуществляли с помощью l^Cs источника ИПК при мощности дозы 18-20 рад/мин. В опытах по изучению влияния доз облучения на показатели развития асиитной опухоли применяли дозы 250, 400 и 600 рад.

Получение асцитной жидкости.

Для получения асцитной жидкости облучённым мышам внутрпбрюшннно вводили гибридомные клетки в объёме 0,5 мл в количество 0,5-2 х клеток\мышь через 2-14 дней после внутрибрюшшшого введения кондиционеров.Через 12-20 дней после введения гибридомных клеток, при максимальном объеме асцитной опухоли, мышей забивали путем цервикплыюй дислокации, вскрывали брюшную полость и извлекали асцитпую жидкость в раствор гепарина (500 ед/мл физиологического раствора). После центрифугирования асцитной жидкости при 6000 о6\мин в течение 5 мин собирали надосадочную жидкость, добавляли 0,1 % азида натрии и замораживали при -20°С.

Серологическая характеристика групп (¡специфических МКЛ.

Авидность антител определяли в реакции аггглютинаиии на плоскости, для чего смешивали 100 мкл антител с 10 мкл взнеси эритроцитов. Реакцию агглютинации оценивали по времени появления первых агглютинатов, времени наступления чёткой реакции агглютинации и времени появления крупных агглютинатов. Титр антител в реакции агглютинации на плоскости определяли как последнее двойное разведение антител в 0,3 М соленом растворе, вызывающее появление крупных агглютинатов не позднее 30 сск. после смешивания антител и эритроцитов. Титр антител в реакции агглютинации и солевом растворе определяли в 96-ичеечных круглодонных платах как последнее двойное разведение в 0,15 М растворе хлористого натрия, вызывающее положительную реакцию агглютинации. Для этого к 50 мкл/ячейку антител прибавляли 50 мкл двухпроцентной суспензии эритроцитов. Плату инкубировали в течение 45-60 мин при комнатной температуре.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ОПТИМИЗАЦИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНТИ-А И ЛНТИ-В ГИБРИДОМ

IN VITUO.

Оптилшзация состава полной питательной среды. Крупномасштабное получение МКА in vivo начинается с наращивания гибридомных клеток in vitro для последующего введения их мышам-реципиентам. Для снижения затрат средств, связанных с наращиванием гибридомных клеток, заменяли дорогостоющую оленью сыворотку более дешёвой свиной (табл. 1).

Таблица 1. Бремя удвоения л жизнеспособность гибридом при культивировании па различных сыворотках._

Сыворотка Гибридома Л-86/3 Гибридома В-85/2

Время удвоения (ч) Жизнеспособ кость клеток (% ) Время удвоения (ч) Жизнеспособ ностг, клеток (%)

свиная 43,8 ± 6,1* 76,6 ± 1,9 63,6 ±15,1 80,8 ± 3,3

свиная термоинакти внрованная 53,8 ± 12,9 74,6 ± 6,7 38,8 ± 5,3 82,4 ± 6,1

оленья 40,8 ± 6,5 77.6 ± 5.5 37,9 ± 7,7 87,5 ± 3,1

* В таблице 1 и последующих приведены значения средних арифметических (М) и средних квадратичных ошибок (т).

Как видно из табл., при культивировании клеток А-86/3 и В-85/1 на питательных средах, содержащих 10% свиной сыворотки, свиной термоинактивированной или оленьей, время удвоения и жизнеспособность клеток существенно не различались, что позволяет использовать при производстве гибридомных клеток дешевую свиную сыворотку.

Снижение концентрации ингредиентов питательной среды.

Снижение концентрации некоторых дорогостоящих импортных ингредиентов питательной среды не вызывает заметных различий в показателях времени удвоения и жизнеспособности клеток среди всех изученных вариантов (табл. 2). Аналогичные данные получены и для гибридомы В-85/2.

Использование среды упрощенного состава, содержащей половинную концентрацию НЕРЕБ-буфера и Ь-глутамина без пирувата натрия приводит к удешевлению процесса наращивания гибридомных клеток. Таблица 2. Время удвоения и жизнеспособность гибридом при

культивировании на питательных средах различного состава.

Вариант состава питательной среды Гибридома А-86/3 Гибридома В-85/2

Время удвоения (ч) Жизнеспособ ность клеток (Я) Время удвоения (ч) Жизнеспособ ность клеток (%)

Стандартная полная питательная среда 57,8+20,7 74,6±2,7 43,7±3,9 73,3±0,5

10 мМ гепес-буфера 47,8±3,9 74,5±4,1

2 мМ Ь-глута-мина 60,2± 14,4 75,214,4

10 мМ гепес-буфера,2 мМ Ь-глутамина 47,9+5,5 77,5±3,0

без пирувата натрия 75,2+36,5 78,3±3,2

10 мМ гепес-буфера, 2 мМ Ь-глутами-на, без пирува- та натрия 59,7±15,4 73,6±7,8 47,0+7,1 70,9±1,5

Замена импортных компонентов питательной среды отечественными

аналогами.

К снижению себестоимости наращивания гибридомных клеток приводит также замена дорогостоящих импортных компонентов среды отечественными аналогами. Изучены показатели роста гибридом А-86/44, А-86/3, В-85/2 и Глф-1 при замене обычно используемого L-глутамина фирмы " Flow" на отечественный аналог производства Института полиомиелит и вирусных энцефалитов. Сравнение времени удвоения и жизнеспособности клеток в обоих вариантах показало, что такая замена вполне возможна. Замена импортных антибиотиков отечественными аналогами не изменяет

Определение оптимального режима смены питательной среды при пассировании гибридомных клеток.

К экономии средств приводит и уменьшение объёма заменяемой среды при лассировг.нии гибридомных клеток. Достаточно заменять лишь 50 % питательной среды через каждые 3 дня, чтобы получать результаты, не отличающееся от вариантов опыта, гае среду заменяли да 100%, 50% или 75 %■ Таким образом, крупномасштабное культивирование гибридом для промышленного получения МКА можно осуществлять, использу» питательную среду следующего состава: ДМЕМ, обогащенная 10 % свиной сыворотки, 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 100 ед\мл пенициллина и 50 мкг\мл стрептомицина или гентамицина любой, приведённой фирмы-производителя. Смену этой среды при пассажах возможно производить не более, чем на 50 %.

ОПТИМИЗАЦИЯ ПОЛУЧЕНИЯ IN VIVO МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГРУППОСПЕЦИФИЧЕСКИМ АНТИГЕНАМ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА СИСТЕМЫ ABO ПУТЕМ ПОДБОРА ЖИВОТНЫХ И ВОЗДЕЙСТВИЯ НА МЫШЕЙ-РЕЦИПИЕНТОВ ГИБРИДОМ. Получение МКА in vivo заключается в следующем : кондиционирование мышей - реципиентов гибридомных клеток, облучение мышей, инокуляция мышам гибридомных клеток, получение асцита. Поэтому выход МКА может зависеть от многих факторов. Влияние генотипа и пола мышей-реципиентов на объём асорттй жидкости и титр в ней антител. Промышленное производство in vivo МКА к группоагсыифическим антигенам эритроцитов человека системы ABO требует мнопа тысяч мышей. Как известно, основная масса мышиных гибридом культивируется ка мышах генотипа Balb/c, но, к сожалению, эти мыши очень чувствительны к условиям содержания и не всегда хорошо выживают в условиях обычных вивариев после кондиционирования и инокуляции клеток. Мыши-«5брнаы, полученные в

результате скрещивания мышей генотипа Balb/c с мышами других генотипов, менее чувствительны к внешним возлействиям и не отторгают инокулированные гибркяомные клетки. Поэтому для расширения спектра используемых генотипов мышей-реципиентов анти-А и . анти-В гибридом изучали возможность использования мышей гибридов, полученных от скрещивания самок Balb/c с самцами генотипов AKR или C57BI6. Мышей кондиционировали смесью пристава и вазелинового масла в соотношении 1:1 в дозе 0,25 мл/мышь за 7 дней до инокуляции клеток. Гибридомные клетки вводили в дозе 1-2 хЮб ю\/ мышь, предварительно облучив мышей в дозе 250400 рад. При отборе генотипа мышей сравнивали значения параметров роста гибридомных клеток и продукцию ими МКА в мышах Balb/c и гибридах обычно используемых генотипов CD2Fi, CWRF] с предложенными нами гибридами (Balb/c х AKR)F]-(CAKF]) и (Balb/c х C57BI/6)Fi-(CB6Fi). Как видно из табл. 3, основные показатели развития анти-А и анти-В гибридом -время роста, объём асцигной жидкости и титр в ней антител - совпадали во всех изученных вариантах. Пропорция мышей с развившейся асцитной опухолью колебалась от 72 % до 94 %. Полученные положительные результаты позволяют рекомендовать впервые использованные нами генотипы мышей САКР] и CB6F) для получения анти-А и анти-В МКА. Предпочтительнее использовать при крупномасштабном производстве МКА мышей генотипа CB6F], поскольку у мышей генотипа CAKFj часто наблюдается патология лёгких. Однако это не мешает использовать мышей этого генотипа для получения небольших объёмов асцита.

Таким образом, изученные генотипы мышей-реципиентов гибридом не оказывают тормозящего влияния на рост гибридомных клеток in vivo. В 1срулномасштабпом производстве МКА важно использовать ка-с самок, так и егмиоз мышей-реципиентов гибридом. При изучении зависимости роста анти-А.гнбридомы А-86/3 и анти-В гибридомы В-85/2 от пола мышей генотипов CD2F], CWRFj, CAKFj, CB6F], Balb/c показано, что пол мышей всех

Таблица 3. Характеристика роста гибридомных клеточных линий в форме асцитной опухоли у мышей разных генотипов. ,

Генотип мышей Гибридо Число Число Мыши с Время Объём ас- Титр МКА в

ма опы- мышей асцитом, % рост? цитной асцитной жидкости

тов в опухоли жидкости

) опыте (дни) * (мл)

от мы- от М±ш •• М±т

шей в выжив

опыте ших

(ВАЬВ\с х АКЮИ! А-86\3 2 49 71,6 100 13,7±1,5 2,9±0,7 • 1400 (1200:1600)

В-85\2 2 30 77,8 • 100 14,9±и 2,6 ±0,3 5800 (3200:6400)

(ВАЬВ\с х ОВА2)Р| А-86\3 8 190 82,2 93,3 13,0±1,2 3,0±0,5 2000 (1200:3200)

В-85\2 8 171 88,3 98,8 14,3±1,1 2,8±0,3 4000 (2400:6400)

ВАЬВ\с А-86\3 2 280 83,3 90,0 13,2± 1,2 3,3±0,2 2400 (1200:3200)

В-85\2 2 70 94,2 98,4. 13_,6±0 3,3±0 6400 (3200:12800)

"(ВАЬВ\схС57В16)Р1 А-86\3 2 37 93,6 100 . 13,1±1,3 3,3±0,2 1600 (1200:1600)

В-85\2- 2 34 87,1 95,0 13,7±1,5 2,1 ±0,4 3600 (1600:6400)

(ВАЬВ\с х \VRJFi А-86\3 7 186 78,7 ' 87,0 15,0±2,5 3,3±0,б 3000 (1600:6400)

В-85\2 7 146 91,4 93,2 13,1±0,9 3,1±0,4 3800 (2400:6400)

* Мышей забивали при максимальном объёме асцитной опухоли.

Приведены значения средних арифметических (М) и средних квадратичных ошибок (ш).

• Указаны средние значения и разброс.

изученных генотипов не влиял на рост гибридомы В-85/2. Что касается гибридомы А -16/3, то она одинаково хорошо росла у самцов и самок только генотипов CAKFj, CB6F\, Balb/c. При росте airm-A гибридомы в мышах генотипа CB6r¡ наблюдалась иная картина : объём асцита у самок был достоверно мевьше (р<0,02), чем у самцов: 2,0±0,4 и 4,7±0,4 мл, соответственно. Однако время роста опухоли и титр МКА в асците был одинаковым у самцов и самок этого генотипа. У самцов генотипа CWRF] опухоль, индуцированная гибридомой А-86/3, росла почти в 2 раза медленнее, чем у самок: время роста соответственно 23,1 ±7,1 и 14,3+2,5 дня. Остальные показатели была сходными.

Полученные результаты позволяют утверждать, что при переходе к крупномасштабному получению МКА необходимо учитывать зависимость роста асцитной опухоли, индуцированной конкретной гибридомой, от пола мышей используемых генотипов.

Оптимизации метода кондиционирования мьшей-реципиещпов гибридом.

При крупномасштабном производстве МКА встал вопрос о поиске дешёвого отечественного аналога пристала для кондиционирования мышей перед введением гибридомных клеток. Кроме пристана можно вводить и вазелиновое масло, но из-за высокой вязкости введение его большому количеству мыей становится очень трудоёмким. Поэтому в ряде опытов для кондиционирования мышей мы применяли как отдельно присган и вазелиновое мало, так и их смесь в соотношении 1 : .1 в объёме 0,25 мл/мышь. Обнаружено, но как одно вазелиновое масло, так и смесь его с пристаном могут успешно применяться для подготовки мышей-гибридов, поскольку приводят к одвзакзвым с пристаном результатам : нет различий в количестве животных с развившейся асцитной опухолью, времени роста опухоли, её объёме и титре МКА в асцитной жидкости. В поисках адекватной замены обычно используемого импортного пристана с тест-гибридомой В-85/1 были апробированы новые, ранее не употреблявшиеся для кондиционирования

мышей реагенты или их смеси : "Span-80" (Serva), "Tween-80" (Feruk). и ряд предельных углеводородов Новочеркасского завода синтетических продуктов . декан, гексадекан, додекан, гептан (табл.4). В качестве контроля использовали прислан и смесь присгана и вазелинового масла. Оказалось, что наилучшие результаты даёт препарат гексадекан. Хотя титр МКА в зенитной жидкости был мало связан с видом и концентрацией кондиционера, объём асцита после кондиционирования гексадеканом достоверно превышал объёмы асцита в контроле. Получив хорошие результаты с использованием гексадекана при наращивании гибридомы В-85/1, мы провели опыты по сравнительному изучению действия присгана и гексадекана на развитие ряда других гибридом : В-85/2, А-86/44, 2-0-44, 2-0-50, N-4, А-27. Контролем служили некондиционированные мыши (табл. 5). Кондиционирование мышей гексадеканом перед введением всех изученных гибридом привело к существенному увеличению объёма зсцитиой жидкости. Из данных табл. следует, что гексадекан по всем основным показателям развитая гибридом по крайней мере не уступает традиционно употребляемому пристану. Следует отметить ещё одно преимущество гексадекана : при хранении в холодильнике он собирается в виде бляшки на поверхности асцита и легко может быть удалён, что существенно облегчает процедуру очистки асцита. Кроме того, известно, что пристан'является канцерогеном, тогда как подобных сведений о гексадскане в имеющейся литературе не обнаружено.

В отдельных опытах было испытано действие перфтердекзлина - реагента из класса перфторорганических соединений (табл. б). Хотя показатели развития асцитных опухолей несколько ниже, чем при использовании присгана, полученные результаты говорят о возможности применения перфтордекалина в качестве кондиционера мышей при получении МКА. Немаловажным преимуществом перфтордекалина является и то, что он в отличие от присгана, не канцерогенен, не токсичен, не обладает мутагенной активностью и работа с ним безопасна.

Таблица 4. Влияние различных кондиционеров на развитие асцнпюм опухоли, индуцированной шбрнломой В-85\1.

N 011. Кондиционер Чнс ЛО мы шей Число мышей) выживших поело кои* дициони-рования, % Число мышей с асцитом, % Время развития асцитной опухоли, дни М im Объем асцитной жидкости, мл/мышь М ±ш Титр МКА в пештюй жидкости (обрпгмоо разведение)

от вое- от ДЙН- вмжив-ных ших

1 смесь прпстпиа и вазелинового масла1:1 12 100 83,3 100 16,5± 1,5 3,5±1,5 6400

5,5% р-р слана в ваз.м 12 100 83,3 100 14,0±1,0 7,9±1,6 6400

15% р-р слана в ваз. м. 12 66,7 66,7 100 16,5±1,5 3,5±1,5 12800

15% р-р твнна в ваз. м. 12 91.7 91,7 100 14,5±0,5 4,7±0,8 6400

15% р-р слана в гексадекапе. 12 100 100 100 14,0±1,0 7,8±0,3* 6400

вазелиновое масло 12 91,7 91,7 100 14,5±1,0 4.9±1,2 6400

гекспдекан 12 100 100 100 13,5±0,5 8,0±1,0* 12800

2 прнстан 15 93,3 86,7 100 15,5±0,5 4,1±0,4 12800

смесь пристана и вазелинового масла 1:1 15 100 86,7 100 14,5±0,5 4,2±0,4 25600

декан 15 60,0 60,0 100 15,5±0,5 5,2±0,6 6400

гептан 15 33,3 26,7 100 15,0± 1,0 8,0±2,0 6400

додекан 15 80,0 66,7 100 15,3±0,9 5,6±0,7 12800

гекса декан 15 93,3 93,3 100 14,5±0,5 7,5±0 12800

* Р для различия с контролем (пр»стан)< 0,01

Таблица 5. Влияние вида кондиционирования на развитие асцитных опухолей, индуцированных шестью различными гибридомами

Гибри-дома Число опытов Кондиционирование Число мышей в оп. Число мышей с асцитом, % Время развития асимтной опухоли, дни М± ш Объем асцитной жидкости, мл/мышь М ±ш Титр МКА в асцитной жидкости (обратное разведение)

от от введен выжив ных шнх

В-35/2 5 гексадекан 89 95,5 100 14,2±0,3 б,5±0,5* 9600(6400-12800)

пристан 87 53,1 100 14,Я±0,5 3,9±0,3 9600(6400-12800)

контроль 43 76,7 86,8 29,2±1,4 4,3±0,3 8000(6400-12800)

А-86\44 5 гексадекан 80 75,0 80,0 22,б±4,4 б,0±0,6* 800(200-1600)

пристан 84 75,0 96,9 20,9±2,9 4,2±0,3 1200(400:3200)*

контроль 50 28,0 28,6 30,414,9 4,1±0,6 500(150:1600)

2-0-44 2 гексадекан 30 86,6 100 22,9+ 2,3 5,3±0,3 37800(25600:50000)

пристан 30 90,0 100 25,3± 2,4 4,6±0,4 62800(25600:100000)

контроль 20 45,0 45 32,9±4,4 5,6+1,2 31400(12800:50000)

2-0-50 - 1 гексадекан 20 95,0 100 17,4±б,2 8,б±0,5* 25600

пристан • 20 95,0 100 24,1±4,9 5,7±1.1 25600

контроль 10 80,0 80 20,4±4,7 4,8±0,б ■ 51200

N-4 2 гекспдсш! 30 36,6 1С0 10,5±1,2 5,5±0,3 1920002800:25600)

пристан....... 30 80,0 100 Ш,б±0,8 4,5±0,4 12800

контроль т— >6,0 1114 14,1 ±0,9 МШ? 17600(^600:25600)

А-27 1 гексадекан 6 100 100 20±3,6 5,5±1,8 128000

контроль 6 83,3 83.3 18,6±2,7 4,2±0,6 128000

* Р для различия с контролем (нрисган)< 0,01

Определение оптимальной дозы кондиционера.

Изучена эффективность различных кондиционеров: пристала, вазелинового масла, их смеси и гексадекана в дозах 0,1, 0,25, 0,5 и 1,0 мл. Снижение дозы кошпшионера до 0,1 мл приводило к уменьшению объёма асцита или доли мышей с развившейся опухолью. Увеличение дозы до 0,5 мл повышало загрязнение асцита кондиционером, что усложняло процесс очистки асцита. Оптимальной дозой при кондиционировании мышей приставом, вазелиноьым маслом, их смесью 1:1 и гексадеканом является дозе 0,25 мл.

Определение оптимального срока введения кондиционера.

Поскольку каждый день содержания и кормления животных увеличивает себестоимость реагентов, приготовленных на основе асцитной жидкости мышей, определяли оптимальный промежуток времени от введения кондиционера до инокуляции клеток гибридом А-86/44 и В-85/1. Сокращение срока кондиционирования до двух дней привело к некоторому увеличению времени роста опухоли. Кондиционирование за 7 и 14 дней не отразилось на параметрах роста асцитной опухоли, поэтому при получении асцита от крупных партий мышей экономически оправдан срок введения кондиционера за 7 дней. Аналогичные опыты были проведены с новым кондиционером гексадеканом. Различия в показателях развития асцитной опухоли после кондиционирования в различные сроки не выходят за пределы доверительного интервала. Оптимальным сроком кондиционирования мышей гексадеканом также следует принять 7 дней.

Выбор оптимальной дозы облучения.

Для определения оптимальной дозы облучения были использованы мыши трёх генотипов : CWRFj, CD2Fj и CB6Fi- Облучение в дозе 250, 400 и 600 рад не влияло на показатели развития асцитной опухоли. Но облучение в дозе 250 рад приводило к снижению количествам мышей с развившейся асцитной опухолью до 30 %. Повышение дозы облучения до 600 рад в ряде опытов способствовало развитию опухоли с хорошими показателями, а иногда

Таблица 6. Влияние вида кондиционирования на развитие асцитных опухолей, индуцированных тремя гибридомами.

Гпбри-дома Кондиционирование Число опытов Число мышей в опыте Число мышей с асцитом, % Время развития асцитной опухоли, дни М ±т Объем асцитной жидкости, мл/мышь М± т Т!ггр МКА в асцитной жидкости (обратное разведение)

от от введен выжив ных ших

В-85/1 гексадекан 2 30 100 100 15,5±0,7 4,б±0,5 6400

пристан 23 100 100 16,4+0,9 3,9+0,2 9600(6400-12800)

ПФД 27 79,1 100 • 17,7±2,0 3,410,4. 6400

контроль 15 60,0 63,0 30,4±1,1 3,6±0,2 9600(6400-12800)

А-86\44 гексадекан 1 15 93,3 100 1б,2±1,8 6,0+2,1 800

пристан ' 15 80,0 100 13,5+3,9 4,9±0,8 800

ПФД 15 • 80,0 92,3 19,2+2,9 4,8+1,5 - 1200

контроль 10 0 0 0 0 - . .0 .

2-0-44 гексадекан 1 10 86,7 100 20,5± 1,6 4,9+0,2 25600

пристан 15 93,3 100 22,9± 1,5 5,2±1,0 . 25600

ПФД 15 53,3 100 23,8+1,5 5,4+0,8 25600

контроль 10 • 10 10 22,0±0 7,5±0 12800

приводило к повышенной гибели животных - до 51 %. Оптимальной оказалась доза облучения 400 рад, при которой во всех опытах выживало наибольшее количество животных и у наибольшей доли мышей развивалась асцитпая опухоль с хорошими показателями. В дальнейшем для подавления гибридной резистентности мышей в крупномасштабном производстве МКА применяли дозу облучения в 400 рад.

УВЕЛИЧЕНИЕ ПРОДУКЦИИ МКА К ГРУППОСПЕЦИФИЧЕСКИМ АНТИГЕНАМ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА СИСТЕМЫ ABO ЗА СЧЕТ ОПТИМИЗАЦИИ ДОЗЫ ГИБРИДОМНЫХ КЛЕТОК, УСЛОВИЙ РАЗМОРАЖИВАНИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ КЛЕТОК И СПОСОБА СБОРА АСЦИТНОЙ ЖИДКОСТИ.

Определение оптимальной дозы меток. Нарашивание клеток in vitro для последующего введения мышам составляет значительную часть себестоимости МКА, поэтому важно определить наименьшую дозу клеток, вызывающую развитие асцитной опухоли с наилучшими показателями у максимальной доли мышей. Были изучены дозы от 0,5 х 10б до 2,0 х 10^ клеток гибридом А-86/3 при введении мышам генотипа CWRFj и гибридомы В-85/1 мышам Balb/c. В эксперименте на небольшом количестве животных при введении доз клеток 0,5; 1,0; 1,5 х 10б\мышь не наблюдалось различий ни в количестве мышей с развившейся опухолью, ни во времени её роста, ни в выходе МКА. При получении МКА в крупных масштабах, когда процесс введения клеток значительно удлиняется, введение 0,5 х 10^ клеток\мышь вызывает более медленное, по сравнению с большими дозами, формирование асцитной опухоли. Наилучшие результаты были получены при введении 1,5-2,0 х Юб клеток\мышь. Однако, исходя из того, что гибридомные клетки являются одним из самых дорогостоящих компонентов промышленного получения МКА, более рентабельной является

доза в 1 х 10<> клеток\ммшь, несмотря на увеличение времени роста опухоли в среднем на трое суток. При введении 1 х 10б клеток\мышь и крупномасштабном призводстве с использованием мышей генотипа CD2F| получены практически одинаковые результаты развития асцита у 1733 самцов в сравнении с 3841 самками. Следовательно, при получении МКА в крупных масштабах оптимальной дозой клеток для индукции асцитной опухоли как у самцов, так и у самок является 1x1клеток\мышь.

Оптимизация процесса массового размораживания гибридомных клеток.

Криоконсервироваиные гнбридомные клетки, предназначенные для индукции асцитной опухоли у мышей, после размораживания обычно отмывают от (ДМСО). Для исключения такой трудоёмкой операции, как отмывание, при крупномасштабном производстве МКА изучали жизнеспособность клеток после пребывания их в течение 5, 30, 60 и 120 мин на льду в среде, содержащей после размораживания 1 % ДМСО. В качестве контроля использовали клетки, отмытые от ДМСО. Жизнеспособность клеток в суспензии практически не изменялась в течение часа после размораживания в отмытых от ДМСО и неотмытых образцах. Введение неотмытых клеток не отразилось на росте гибридом А-86/44 и 13-85/1. Следовательно, отмывание гибридомных клеток от ДМСО не является обязательной процедурой при их размораживании.

В поисках возможности увеличения жизнеспособности клеток после размораживания предположили, что увеличение концентрации фосфатно-солевого буфера (PBS) может способствовать лучшему размораживанию клеток. Изучено несколько вариантов замораживания и размораживания клеток. Наибольшее количество живых клеток было получено при замораживании по обычной методике и размораживании в гипертонической среде с PBS. Размороженные различными способами клетки затем вводили мышам по 1,0 х 1О6 клеток/мышь. Наилучшие показатели развития асцитной опухоли были

получены при введении клеток после замораживания их по стандартной методике и размораживания в гипертонической среде с PBS.

С целыо дальнейшей оптимизации процесса размораживания криоконсервированных клеток гибридом А-86/3 и В-85/1 объем гипертонической среды с PBS, добавляемой к клеточной суспензии при размораживании, уменьшили вдвое. По обычной методике к суспензии клеток добавляют 10-кратный объём среды. При последующем введении мышам клетки анти-А и анти-В гибридом, размороженные в разном объёме срсды с повышенной концентрацией PBS, индуцировали образование опухолей со сходными показателями роста. Полученные результаты свидетельствуют, что уменьшение объёма среды в два раза не влияет на жизнеспособность размороженных клеток. Предложенная методика размораживании криоконсервированных клеток имеет ряд преимуществ по сравнению с ранч" используемой стандартной : экономятся среда и сыворотка, используемые при размораживании клеток, упрощается технология введения клеток, так как исключается операция отмывания клеток от ДМСО.

Оптимизация процесса массового получаши аецшпной жидкости.

Для достижения максимума получения МКА применяли две операции : 1-вскрытие у мышей помимо брюшной, ещё и (рудной полости и полости сердим для получения крови, в которой титр антител, как правило, не уступает титру в асцитной жидкости; 2 - прополаскивание вскрытых полостей раствором хлорида натрия в концентрации 0,3 М. Эта процедура позволяет увеличить выход МКА для гибридомы А-86/44 примерно на 60 %, а для гибридомы В-85/1 - на 160 %. .

ВЫВОДЫ

1. Оптимизирован и значительно удешевлён процесс наращивания в системе in vitro клеток гибридом, предназначенных для индукции асцитной опухоли у мышей, за счёт использования более дешёвых отечественных сывороток, снижения концентрации дорогостоящих импортных ингредиентов питательной среды и замены их отечественными аналогами, а также модификации режима смены питательной среды при пассировании гибридомных клеток.

2. Показана возможность использования мышей генотипа (BALB\c х C57BL\6)Fj для получения моноклоиальных антител к группоспецифическим антигенам эритроцитов человека системы ABO.

3. Предложено сочетанное введение известных кондиционеров пристана и вазелинового масла в соотношении 1:1, а также раздельное применение двух новых эффективных реагентов отечественного производства - гексадекана и перфтордекалина для кондиционирования мышей при крупномасштабном получении асцита, содержащего моноклонапьные антитела.

4. Определена оптимальная доза гексадекана и смеси пристана и вазелинового масла для кондиционирования мышей - 0,25 мл\мышь. При этом минимальный и достаточный срок кондиционирования составляет 7 дней.

5. Установлена оптимальная доза облучения мышей-гибридов для подавления гибридной резистентности-4С0рад.

6. Установлено минимальное, достаточное для индукции асшгтной опухоли, количество клеток гибридомы.

7. Оптимизированы условия размораживания криоконсервировакньгх клеток гибридом.

8. Разработан метод забора асцитной жидкости и других компонентов, значительно увеличивающий выход моноклональных антител.

9. Оптимизация промышленного получения анти-А и анти-В моноклональных антител существенно облегчает их производство и снижает стоимость антител.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Оптимизация условий крупномасштабною получения моноклональных антител к группоспецифическим антигенам эритроцитов человека. Проскурина Н.В., Леменева Л.Н., Дерюгина Е.И., Чертков ИЛ. // Современные направления создания медицинских диагностикумов (матер, конф.).- Москва. -1990,- с. 37.

2. Minimal essential requirements for high-yield monoclonal antibody production in ascites. N.V. Proskurina, LN. Lemeneva, E.I. Deiyigina, I.L. Chertkov. // International conference on medical biotechnology, immunization and AIDS. -Leningrad. - 1991.- p. 2-2.

3. Оптимизация условий крупномасштабного получения монослональных антител для определения группы крови. Проскурина Н.В., Леменева Л.Н., Дерюгина Е.И., Чертков ИЛ. // Биотехнология. - 1990. - N 6. - с. 70-73.

4. Влияние способа подготовки и пола мышей на получение моноклональных антител для определения i^ynn крови человека. Проскурина Н.В., Леменева Л.Н., Дерюгина Е.И., Чертков ИЛ. Иванов В.Н. // Биотехнология. - 1992. - N 2. - с. 71-74.

5. Оптимизация условий культивирован« гибридом, секретирующих анти-А и анти-В моноклоналъные антитела для типирования групп крови человека систем АВО.

Проскурина Н.В., Леменева Л.Н., Дерюгина Е.И., Чертков ИЛ. // Биотехнология. - 1992. - N 3. - с. 59-60.

6. Влияние пола мышей WRxBalb/c и DBA/2xBalb/c на получение моноклональных антител. Проскурина Н.В., Леменева Л.Н., Дерюгина Е.И., Чертков ИЛ. Иванов В.Н. // Актуальные вопросы использования лабораторных жвотных в медико-биологических исследованиях (матер, конф.). - Черновцы. - 1992. - TI. - с. 114-115.

7. Влияние различных видов кондиционирования реципиентов на развитие асиитных опухолей, индуцированных гибридомными клетками. Проскурина Н.В., Кульман РА., Дерюгина Е.И., Иванов В.Н. // Биотехнология. - 1993. - N 4. - с. 45-47.

8. Штамм гибридных . культивируемых клеток животных Mus muskulus, продуцирующий моноклональные антитела к группоспецифическому антигену N системы MNSs эритроцитов человека. Дерюгина Е.И., Белкина Е.В., Леменёва Л.Н., Оловникова Н.И., Проскурина Н.В., Удапов ГА., Чертков ИЛ. //Авторское свидетельство N 1717147 от 8 ноября 1991 г.