Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Состояние микросомальной системы печени и антимикробной функции нейтрофильных гранулоцитов при лечении желчного перитонита

На правах рукописи

РЫКУНОВА Валентина Евгеньевна

СОСТОЯНИЕ МИКРОСОМАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ПЕЧЕНИ И АНТИМИКРОБНОЙ ФУНКЦИИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЖЕЛЧНОГО ПЕРИТОНИТА

(экспериментальное исследование)

14.01.17 -хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

13САЯ 2015

Краснодар - 2015 005568944

005568944

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России).

Научный руководитель: заслуженный изобретатель Российской Федерации, лауреат премии Правительства Российской Федерации и РАМН, доктор медицинских наук профессор Петросян Эдуард Арутншович.

Официальные оппоненты:

Байчоров Энвер Хусейиовня, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России, кафедра хирургии и эндохирургии с курсом сосудистой хирургии и ангиологии, заведующий кафедрой;

Белик Борис Михайлович, доктор медицинских наук, доцент, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра общей хирургии, заведующий кафедрой.

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится « 24 » июня 2015 г. в 16-00 часов на заседании диссертационного совета Д208.038.01 на базе ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России (350063, Краснодар, ул. Седина, 4, тел. (861)262-73-75).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на официальном сайте (http://www.ksma.ru ) ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета Д208.38.01 профессор

Гуменюк Сергей Евгеньевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема желчного перитонита (ЖП) имеет особую актуальность на фоне мировой тенденции роста количества больных с желчнокаменной болезнью (Е.И. Вовк, 2011, И.В. Аксенов, 2014) и повреждений внепеченочных желчных протоков (ВЖП) в связи с внедрением в хирургию малоинвазивных технологий (JI.A. Левин, 2009). Согласно современной статистике частота повреждений ВЖП при лапароскопической холецистэкто-мии в период освоения метода и накопления опыта выросло с 0,8 до 3,5% (H.A. Никитин и др., 2011), что приводит к истечению желчи в брюшную полость с развитием желчного перитонита (Б.Р. Исхаков и соавт., 2008; Э.Х. Байчоров и соавт., 2010; С.Е. Broelsch et al., 2008).

Организм человека имеет многокомпонентную защиту, в которую входят: 1 - микросомально-монооксигеназная система (МОС) печени, 2 - иммунная система; 3 - экскреторная система; 4 - барьерная функция ЖКТ (А.И. Арчаков, 1975; Р.В. Петров и др., 1981; В.А. Тутельян, Л.В. Кравченко 1985; H.A. Лопат-кин, Ю.М. Лопухин, 1989).

Одним из направлений лечения острой абдоминальной патологии является модулирование защитно-барьерных систем организма на принципах электрохимического окисления (ЭХО) с применением электролизного раствора гипо-хлорита натрия (ЭРГХН), способного воспроизводить основные физико-химические и структурные основы работы органов функциональной системы детоксикации и иммунитета, осуществляя их конечные интегральные эффекты (антимикробный, биотрансформация ксенобиотиков и токсинов (H.A. Лопат-кин, Ю.М. Лопухин, 1989).

Цель исследования - повысить эффективность лечения экспериментального желчного перитонита (ЭЖП) путем модулирования МОС печени и миело-пероксидазно-пероксид-хлоридной (МПО-Н2О2-СГ) системы нейтрофильных гранулоцитов (НГ).

Задачи исследования:

1. Изучить физико-химические и электрофизиологические свойства ЭРГХН.

2. У животных с ЭЖП провести фармакологическое тестирование антитоксической функции печени на принципах электрохимического окисления.

3. У животных с ЭЖП провести модулирование МОС печени и процессов биотрансформации ксенобиотиков на принципах электрохимического окисления.

4. Изучить интенсивность хемилюминесценции (ХЛ) при модулировании молекулярных механизмов антимикробной функции МПО-Н2О2-СГ системы НГ на принципах электрохимического окисления.

5. Изучить редокс-зависимый механизм МПО-Н2О2-СГ системы НГ на принципах электрохимического окисления.

6. Изучить ростовые характеристики и биосинтез нуклеиновых кислот грамположительной и грамотрицательной микрофлоры на принципах электрохимического окисления.

7. Оцепить состояние МОС печени и процессов биотрансформации ксенобиотиков до и после лечении ЭЖП.

<N /

А

8. Изучить процессы свободнорадикального окисления (СРО) крови до и после лечения ЭЖП.

Новизна исследования. В результате проведенных исследований:

- в опытах in vitro и in vivo показан окислительный и антитоксический эффект ЭРГХН;

- у животных с ЭЖП в ходе фармакологического тестирования продолжительности гексеналового сна выявлен дозозависимый эффект ЭРГХН в виде индукции антитоксической функции печени при использовании 0,03% раствора и ингибирования после применения 0,1% раствора;

- у животных с ЭЖП при модулировании МОС печени и процессов биотрансформации ксенобиотиков обнаружен дозозависимый фсрментиндуциру-гощий эффект ЭРГХН при использовании 0,03% раствора и фермент-ингибирующий после применения 0,1 % раствора;

- при модулировании антимикробной функции МП0-Н202-СГ системы НГ установлен дозозависимый характер интенсивности вспышки XJI в виде ее индукции при использовании I мкМ ЭРГХН и ингибирования после применения 6 мкМ раствора;

- при модулировании редокс-зависимого механизма МПО-Н2ОгСГ системы НГ при ЭЖП путем добавления 6 мкМ ЭРГХН был установлен рост максимальной величины редокс-потенциала в цельной плазме и перитонеальном экссудате, соответственно в 2,16 и в 1,8 раза;

- установлено, что обработка грамположительной микрофлоры ЭРГХН сопровождается увеличением продолжительности лаг-фазы, высокой скоростью роста и повышением содержания ДНК, в то время как при обработке гра-мотрицательной микрофлоры, отмечается только снижение удельной скорости роста с одновременным подавлением активности клеточных дегидрогеназ и обратимым угнетением факторов патогенности;

- при ЭЖП отмечается ингибирование МОС печени и снижение процессов биотрансформации ксснобиотиоков в виде увеличения периода полувыведения антипирина (Т'А АР), объема распределения антипирина (Vd АР) и падения клиренса антипирина (С1 АР).

- установлено, что комплексное применение ЭРГХН и а-токоферол-ацетата при лечении ЭЖП приводит к индукции МОС печени и ранней нормализации показателей биотрансформации ксенобиотиков;

- показано, что ЭЖП сопровождается инициацией процессов ПОЛ с нарушением соотношения неокисленных и окисленных липидов в плазме и эритроцитах крови, коррекция которых после комплексного применения ЭРГХН и «-токоферол-ацетата, приводит к их ранней нормализации.

Научно-практическая значимость. Настоящая работа вносит существенный вклад в развитие знаний о методах индукции и ингибирования МОС печени и МП0-Н202-СГ системы НГ при ЭЖП. Полученные данные демонстрируют неизвестные ранее ферментиндуцирующие и ферментингибирующие свойства ЭРГХН на МОС печени и МП0-Н202-СГ системы НГ при ЭЖП. Повышение антитоксической функции печени при индукции МОС и антимикробной функции МП0-Н202-С1 системы НГ после комплексного применения ЭРГХН и

а-токоферол-ацетата может быть использовано для лечения ЖП. Полученные данные имеют существенное значение для хирургии в реализации новой стратегии диагностики и разработки способов коррекции работы органов функциональной системы детоксикации и неспецифической резистентности организма. Результаты исследования могут служить материалом для изучения механизмов развития синдрома эндогенной интоксикации (СЭИ) и нарушения неспецифической резистентности организма, поиска молекулярных мишеней, подверженных воздействию оксидатнвного стресса (ОС) и оптимизации известных схем лечения ЖП. Практическая значимость полученных результатов состоит в рекомендуемых для внедрения разработанных предложений.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эндогенная интоксикация при ЭЖП находится в тесной взаимосвязи с состоянием МОС печени и процессом биотрансформации ксенобиотиков.

2. Модулирование МОС печени и МП0-Н202-СГ системы НГ при ЭЖП на принципах электрохимического окисления носит дозозависимый характер.

3. Модулирование МОС печени и МП0-Н202-СГ системы НГ при ЭЖП на принципах электрохимического окисления является важным направлением лечения СЭИ и нарушения неспецифической резистентности организма.

4. ЭЖП сопровождается инициацией процессов ПОЛ с нарушением соотношения неокисленных и окисленных липидов в плазме и эритроцитах крови, коррекция которых после комплексного применения ЭРГХН и а-токоферол-ацетата приводит к их ранней нормализации.

Личный вклад автора в исследование заключается в определение основной идеи, в формировании цели и задач исследования, в разработке структуры и последовательности его выполнения, в непосредственном участии на всех этапах работы: создании модели, разработке и патогенетическом обосновании лечения ЭЖП, заборе материала для проведения лабораторных исследований; регистрации и систематизации материала, статистической обработке, анализе и интерпретации полученных результатов, написании научных статей, выступлениях на конференциях, форумах, семинарах и оформлении диссертационной работы.

Сведения о практическом использовании результатов исследования.

Результаты выполненного исследования учитываются при выполнении научно-исследовательских работ на кафедрах госпитальной хирургии, хирургии педиатрического и стоматологического факультетов; общей и клинической патофизиологии, кафедры фундаментальной и клинической биохимии ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России. Результаты исследований внедрены в лечебную работу хирургического отделения №2 МБУЗ «Краснодарская городская клиническая больница скорой медицинской помощи» (350042, г. Краснодар, ул. 40-лет Победы, 14) и хирургического отделения БУЗ МО Динского района «Центральной районной больницы» (353200, Краснодарский край, ст. Динская, Кирпичная улица, 53а).

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым,

Ялта-Гурзуф, 2010); III научно-практической конференции с международным участием «Новые оперативные технологии» (Томск, 2010); XII Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург-Гастро-2010; XVIII ежегодного Международного Санкт-Петербургского нефрологического семинара. - Санкт-Петербург, 2010; VII и XI Всероссийской научно-методической конференции с международным участием «Стандарты и индивидуальные подходы в анестезиологии и реаниматологии» (Геленджик, 2010, 2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 6 в журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание учёных степеней доктора и кандидата наук (см. приложение 2).

Структура и объем работы. Работа изложена на 173 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы характеристики материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и литературного указателя, включающего 396 источника (214 отечественных и 182 иностранных) и приложения. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 27 рисунками-диаграммами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика материала. Работа выполнена на 6 беспородных собаках, 10 кроликах породы Шиншилла и 590 половозрелых белых нелинейных крысах-самцах, массой 160-230 г., возраст которых колебался от 8 месяцев до 1 года. Для достижения основной цели и решения поставленных задач проведены: стендовые опыты; опыты на животных интактной (ИГ) и контрольной группы (КГ) с экспериментальным желчным перитонитом (ЭЖП). В КГ животных с ЭЖП выделялась: группа сравнения (ГС) и основная группа (ОГ). Эксперименты проводились в соответствии с действующими законодательными и нормативными актами, заложенными в Хельсинской Декларации BMA от 1964 года; Рекомендациями комитетов по этике биомедицинских исследований ВОЗ и EF GCP; Федеральным законом «Об обращении лекарственных средств» (№61-ФЗ от 12.04.2010); правилами лабораторной практики (пр. МЗСР №708н от 23.08.2010).

Методика получение гнпохлорита натрия (ГХН) заключается в электролизе 0,9% раствора натрия хлорида (NaCl) на аппарате (ЭДО-4). Постановлением Фармакологического комитета России от 09.10.1992 года №211-2276198809 0,06% ЭРГХН, как лекарственная форма разрешена для внутривенного и наружного применения («Энциклопедия лекарств», 2002).

Методика определения концентрации ГХН заключается в измерении оптической плотности электролизного раствора при длине волны 290 нм на спектрофотометре «Specord» (Германия) с использованием коэффициентов молярной экстинкции (Е29о= 350М "'cm"') при рН=12 (J.C. Morris, 1966).

Физико-химические и электрофизиологичсские методы исследования. Для определения кинетики окисления ксенобиотиков использовалась методика регистрации убыли гипохлорита натрия во времени на автотитраторе ТТТ-2 («Radiometr», Дания). Биоэлектрическую активность головного мозга кроликов изучали на аппарате «Сономед 315 (Россия).

Микробиологическое исследование факторов патогенности проводилось на музейных штаммах Staph, aureus 209Р, Е. coli Kl 2 J53 (р212 HLy+), Ps. aeruginosa 27/99. Дегидрогеназная активность определялась по степени восстановления 2,3,5 — трифенил-тетразолхлорида в водорастворимый формазан по методу В.М. Кушнарева, В.А. Благовещенского (1960). Скорость роста микрофлоры изучалась методом А.И. Коротяева, Т.П. Кроличенко (1976), а биосинтез нуклеиновых кислот по A.C. Спирину (1958). Чувствительность к бактерицидной активности крови изучалась по P.W. Taylor (1983).

Исследование антимикробной функции МПО-Н2О2-СГ системы НГ на принципах электрохимического окисления проводилось путем изучения их жизнеспособности (J. Lindena, Н. Burkhardt, A. Dwender, 1987) и определения оксидантного потенциала (резерва реактивности) способом измерения интенсивности люминолзависимой XJ1 НГ (М.Е. Wilson, М.А. Trush, К. Van Dyke, 1978), стимулированных сульфатом бария (BaS04) (Г.И. Клебанов, И.В. Бабен-кова, Ю.О. Теселкин и др., 1988) на аппарате LKB «Wallac»-1251 (Финляндия) с использованием венозной крови здоровых собак.

Создание модели ЭЖП на крысах проводилось после предварительного создания инфицированного очага деструкции мягких тканей на наружной поверхности тазовой конечности, путем введения 10% раствора хлорида кальция (СаС12) из расчета 2,5 мл/100 г массы тела. Через 48 часов после создания очага деструкции в брюшную полость трехкратно в течение суток, вводилась аптечная желчь для наружного применения из расчета 0,35 мл/100 г массы (Патент РФ №2175784 «Способ моделирования желчного перитонита» / Э.А. Петросян, В.И. Сергиенко, А.Х. Каде и др. от 10.11. 2001, Бюл. №31). Летальность животных фиксировалась через каждые 12 часов после создания модели (Г.А. Бондарев, 1981).

Лечение ЭЖП. У животных КГ проводилась интраоперационная санация (ИС) брюшной полости антисептиком (фурацилин) и внутривенное введение (в/в) в заднюю полую вену 0,9% раствора NaCl из расчета 1,5 мл/100 г массы тела; в ГС — ИС брюшной полости антисептиком, в/в введение в заднюю полую вену 0,9% раствора NaCl из расчета 1,5 мл/100 г массы тела и внутрижелудоч-ное (в/ж) введение 30% а-токоферол-ацетата из расчета 15 мг/100 г массы тела; в ОГ - ИС брюшной полости антисептиком, в/в введение в заднюю полую вену 0,03% ЭРГХН из расчета 1,5 мл/100 г массы тела и в/ж введение 30% а-токоферол-ацетата из расчета 15 мг/100 г массы тела. Создание модели и лечение ЭЖП проводились под наркозом: золетил 0,3 мг в/м и ксиланит 0,8 мг в/м из расчета на 100 г массы тела.

Макроскопическое исследование органов брюшной полости проводилось традиционным визуально-пальпаторным методом.

Исследование редокс-зависнмого механизма МП0-Н202-СГ системы НГ при ЭЖП на принципах электрохимического окисления. Для решения вопроса об эффективности использования ЭРГХН проведены опыты по определению окислительно-восстановительного (редокс) потенциала (Eh), как неорганических (0,9% раствор натрия хлорида), так и биологических сред (цельная плазма и перитонеальный экссудат) животных с ЭЖП на автоматическом комплексе «Najada» (Чехословакия) с использованием платинового электрода и каломельного электрода сравнения.

Исследование антитоксической функции печепи при ЭЖП на принципах электрохимического окисления проводилось на 95 белых крысах-самцах, массой 160-210 г, которые были разбиты на 4 группы: в 1-ю ИГ вошли 10 животных. У оставшихся 85 животных создавали модель ЖП. В течение суток после создания ЖП погибло 19 крыс (22,3%). Из 66 выживших животных с ЖП, 10 крыс вошли во 2-ю КГ. Остальные 56 крыс были разделены на 4 ОГ по 14 животных в каждой, где проводили модулирование МОС печени, путем вну-трибрюшинного (в/б) введения, соответственно 0,01%, 0,03%, 0,06% и 0,1% ЭРГХН. Все растворы вводились из расчета 2,5 мл/100 г массы тела. Через 3 часа в/б вводился гексенал в дозе 800 мг/100 г массы тела (Д.Г. Розин, 1964). У каждого животного фиксировалось время засыпания (период от введения гексенала до момента потери «righting reflex», т.е. рефлекса сохранения правильного положения тела на четырех лапах) и собственно продолжительность гексеналового сна (период между моментом потери и первыми попытками восстановления «righting reflex») (N. Stata, 1978). Результат выражался в минутах. После восстановления «righting reflex» животных путем декапитации под эфирным наркозом выводили из опыта, вскрывали брюшную полость и проводили забор крови (МУ 1.2.2745-10).

Исследование МОС печени и процессов биотрансформации ксенобиотиков при ЭЖП на принципах электрохимического окисления проводилось на 260 белых крысах, массой 185-230 г, которые были разбиты на 4 группы: в 1-ю ИГ вошли 10 животных. У оставшихся 250 крыс создавали модель ЖП. В течение суток после создания ЖП погибло 60 крыс (24%). Из 190 выживших животных с ЖП 10 крыс вошли во 2-ю КГ. Оставшиеся 180 крыс были разделены на 4 ОГ по 45 животных в каждой, где проводили модулирование МОС печени путем в/б введения, соответственно 0,01%, 0,03%, 0,06% и 0,1% ЭРГХН. Все растворы вводились из расчета 2,5 мл/100 г массы тела. Путем декапитации под эфирным наркозом из эксперимента выводили не менее 10 животных, вскрывали брюшную полость, проводили забор крови и извлекали печень (МУ 1.2.2745-10). Печень промывали охлажденным 1,15% раствором хлорида калия (КС1), взвешивали, после чего готовили гомогенат в гомогенизаторе Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком. Среда для гомогенизации содержала 0,15 М раствор КС1 в 0,05М Трис-HCl буфере (рН 7,4) (А.И. Арчаков, 1975, И.И. Карузина и др., 1977). Процедуры выполняли при температуре 0 - +4°С. В гомогенатах печени крыс определяли содержание цитохрома Р450 (CYP450), а именно из подсемейства цитохрома Р2В2 (CYP2B2) и мембраносвязанный ци-тохром Ь5(СУРЬ5) по методу Т. Omura, R. Sato (1964) на спектрофотометре «Specord» (Германия). Состояние МОС печени оценивали по показателям скорости N-деметилирования антипирина (АР) и n-гидроксилирования анилина (AN) (И.И. Карузина, А.И. Арчаков, 1977), отражающих суммарную активность МОС печени (J.E. Sharer, S.A. Wrighton, 1996; Е. Tanaka, D. Breimer, 1997). Фракцию микросом печени излучали методом дифференциального центрифугирования по двухступенчатой схеме (А.И. Арчаков, 1975, И.И. Карузина, А.И. Арчаков, 1977). В полученной фракции определяли белок по О. Lowry (1951).

Исследование МОС печени и процессов биотрансформации ксенобиотиков при лечении ЭЖП проводилось на 260 белых крысах, массой 160-225 г, ко-

торые были разбиты на 4 группы: в 1-ю ИГ вошли 10 животных. У оставшихся 250 крыс создавали модель ЖП. В течение суток погибало 60 крыс (24%) с ЖП. Из 190 выживших животных 10 крыс вошли во 2-ю КГ. Оставшиеся 180 крыс с ЖП были распределены в 3-ю ГС и 4-ю ОГ по 90 животных в каждой, которым проводили лечение. Путем декапитадии под эфирным наркозом из эксперимента выводили не менее 10 животных, вскрывали брюшную полость, проводили забор крови и извлекали печень. Биохимическую активность МОС печени изучали по вышепредставленной методике. Биотрансформацию ксенобиотиков в печени определяли по концентрации АР (C.B. Неделькина и соавт, 1977; D. Davidsson, 1956), рассчитывая период полувыведения АР (Т'Л АР), клиренс АР (Cl АР) и объем распределения АР (Vd АР) (А.П. Викторов, А.Т. Рыбак, 1990). Исследования проводились до, после создания модели ЖП, на 1, 3 и 7 сутки.

Гематологические исследования проводились на планшетном анализаторе Stat Fax 4200 (США).

Исследование процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) проводилось по методике О.В. Мошинской, М.Ю. Аношиной, М.Н. Пясецкой (1999).

Исследование содержания малонового диальдегида (МДА) проводилось по методике, описанной в справочнике (B.C. Камышников, 2002).

Исследование индекса окисленности липидов (ИО) проводилось отношением спектра поглощения веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) при длине волны 232 нм к спектру их поглощения при длине волны 215 нм.

Статистические исследования выполнены с помощью пакета прикладных программ "Microsoft Exel" и "Statistica 6,0" для "Windows" (StatSofl.Inc). Оценка достоверности различий для нормально распределенных признаков проводилась с использованием t-критерия Стьюдента (В. Госсета). Данные в тексте и таблицах представлены в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего М±т. Для всех проведенных анализов различия считались достоверными при двустороннем уровне значимости р<0,05. При построении кривых использовалась методика сглаживания.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общеизвестно, что ЖП приводит к развитию системного воспаления (A.A. Боташев, 2013; O.A. Терещенко, 2014), ведущую роль в котором играет СЭИ, сопровождающийся избыточной генерацией провоспалительных цитокинов, способных угнетать МОС печени и МП0-Н202-СГ системы НГ. Возможность индуцировать процессы биотрансформации ксенобиотиков и антимикробную функцию НГ является актуальной проблемой современной хирургии.

В ходе модулирования антитоксической функции печени у животных КГ с ЭЖП наблюдался достоверный рост продолжительности гексеналового сна на 30,2% относительно животных ИГ (р<0,01), что свидетельствует об угнетении МОС печени. После в/б введения 0,03% ЭРГХН, продолжительность гексеналового сна уже не отличается от животных ИГ (pi>0,05). Несколько иная картина наблюдалась при введении 0,06% ЭРГХН, сопровождающаяся уже достоверным увеличением продолжительности гексеналового сна на 11,3% относительно животных ИГ (pi<0,05) (табл. 1). При увеличении вводимой кон-

центрации до 0,1% раствора у животных наблюдался рост продолжительности гексеналового сна на 41% относительно животных ИГ (р!<0,001) и на 12,6% относительно животных КГ (р,<0,05) (табл. 1). В то же время, снижение вводимой концентрации до 0,01% раствора, сопровождалось достоверным снижением продолжительности гексеналового сна на 9,8% (р<0,05) относительно животных КГ, но при этом длительность гексеналового сна, по-прежнему, превышала на 17,5% время у животных ИГ (р<0,05) (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительная оценка продолжительности гексеналового сна при ЭЖП _на введение ЭРГХН (мин), (М±ш)_

Исследуемые группы Исследуемые средства Продолжительность гексеналового сна

ИГ, (п=10) - 36,1±0,9

КГ, (п=10) 0,9% раствор КаС1 47,0±0,6, р1<0,05

ОГ№1, (п=10) 0,01% ЭРГХН 42,4±1,0, Р1>0,05; р2<0,05

ОГ№2, (п=10) 0,03% ЭРГХН 37,4±1,8, р1>0,05; р2<0,05

ОГ №3, (п=10) 0,06% ЭРГХН 40,7±1,5,р1<0,05;р9<0,05

ОГ №4, (п=10) 0,1% ЭРГХН 52,9±1,1,р|<0,05;р2.>0,05

Примечание: р,<0,05 - достоверность отличий относительно показателей животных ИГ;

рг<0,05 - достоверность отличий относительно показателей животных КГ.

Таким образом, при фармакологическом тестировании у животных с ЭЖП обнаружен дозозависимый эффект продолжительности гексеналового сна на введение ЭРГХН, который заключается в индукции МОС печени при использовании 0,03% раствора и ее ингибировании 0,1% раствором.

При модулировании МОС печени и процессов биотрансформации ксенобиотиков на принципах электрохимического окисления у животных КГ с ЭЖП наблюдалось достоверное снижение уровня микросомального белка на 10,9% (р,<0,05) и ингибирование активности СУР450 на 11,4% (р<0,05) (табл. 2).

Таблица 2

Сравнительная оценка функциональной активности МОС печени при ЭЖП ___ на введение ЭРГХН, (М±ш)_

Исследуемые группы Исследуемые средства Белок микросомальный, мг/орган СУР450, нмоль/мг белка СУРЬ5, нмоль/мг белка

ИГ, (п=10) - 56,2±1,3 0,816±0,04 0,604±0,05

КГ, (п=10) 0,9% р-р ЫаС1 50,1±1,0,р1>0,05 0,723±0,08, р,<0,05 0,558±0,07, Р1>0,05

ОГ №1, (п-10) 0,01% ЭРГХН 52,6±1,2 Р1>0,05; р2>0,05 0,747±0,17 Р1>0,05; р2>0,05 0,564±0,05 Р1>0,05; р2>0,05

ОГ №2, (п=10) 0,03% ЭРГХН 60,8±1,3 р,>0,05; р2<0,05 0,768±0,06 р,>0,05; Р2<0,05 0,580±0,09 рг>0,05; р2>0,05

ОГ №3, (п=10) 0,06% ЭРГХН 54,4±!,1 Р1>0,05; р2>0,05 0,736±0,07 Р1>0,05; р2>0,05 0,567±0,10 Р1>0,05; р2>0,05

ОГ №4, (п=10) 0,1% ЭРГХН 48,6±0,8 р,<0,05; р2>0,05 0,665±0,13 р,<0,05; р2<0,05 0,539±0,06 Р1<0,05; р2>0,05

Примечание: р|<0,05 - достоверность отличий относительно показателей животных ИГ;

р2<0,05 - достоверность отличий относительно показателей животных КГ. После в/б введения 0,03% ЭРГХН наблюдался рост уровня микросомального белка (р2<0,05) и СУР450 относительно животных КГ (р2<0,05) (табл. 2). В свою

очередь при введении при введении животным 0,1% ЭРГХН наблюдалось снижение уровня микросомального белка, содержания СУР450 и СУРЬ5, относительно животных ИГ (р1<0,05) (табл. 2), которое может быть результатом его прямого действия на активные центры гемопротеида с образованием ферментсубстратных комплексов. Снижение вводимой концентрации ЭРГХН до 0,01% и повышение до 0,06% не вызывало достоверных изменений изучаемых показателей (р|>0,05).

Таким образом, индукция МОС печени при ЭЖП на введение 0,03% ЭРГХН является адаптивным ответом организма, формирование которого может быть обусловлено двумя причинами: с одной стороны, опосредованным механизмом нейрогуморальной регуляции, поскольку активность СУР450 зависит от участия стероидных гормонов в их регуляции, а с другой стороны, метаболической утилизацией гормонов и синтезом некоторых из них, при участии СУР450.

При исследовании процессов метаболизма в печени у животных КГ с ЭЖП отмечалось достоверное снижение скорости биотрансформации АЫ на 21,4% (Р1<0,05) и незначимое снижение скорости биотрансформации АР (р!>0,05) (табл. 3), что свидетельствует об ингибировании процессов биотрансформации ксенобиотиков.

После введения 0,03% ЭРГХН у животных наблюдалось повышение активности п-гидроксилазы АЫ на 20,5% (р2<0,05) и ]\Г-деметилазы АР на 9,5% (р2<0,05) относительно животных КГ, что указывает на индукцию процессов метаболизма ксенобиотиков в печени (табл. 3). Введение животным 0,01% раствора не вызывало достоверных изменений в скорости биотрансформации ксенобиотиков (р>0,05) (табл. 3), в то время как введение 0,06% раствора сопровождалось достоверной индукцией скорости п-гидрооксилирования АЫ и И-деметилирования АР, относительно животных КГ (р2<0,05), которые однако оставались достоверно незначимыми относительно животных ИГ (р1>0,05) (табл. 3). В свою очередь введение 0,1% ЭРГХН приводило к достоверному ин-гибированию гидроксилазной активности на 25% (р<0,05) и деметилазной на 8,1% (р<0,05), относительно животных ИГ (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительная оценка процессов биотрансформации ксенобиотиков в печени _|_при ЭЖП на введение ЭРГХН, (М±т)_

Исследуемые группы Исследуемые средства Скорость п-гидроксилиро-вания АЫ (нмоль/мг-мин) Скорость К-деметилиро-вания АР (нмоль/мгмин)

ИГ, (п=10) - 0,56±0,02 1,46±0,03

КГ, (п=10) 0,9% р-р ИаС! 0,44±0,01, р|<0,05 1,37±0,02, р|>0,05

ОГ№1, (п=10) 0,01% ЭРГХН 0,48±0,03 р,>0,05; р2>0,05 1,40±0,05 Р1>0,05; р2>0,05

ОГ №2, (в=10) 0,03% ЭРГХН 0,53±0,03 Р1>0,05; р2<0,05 1,50±0,03 Р1>0,05; Р2<0,05

ОГ №3, (п=10) 0,06% ЭРГХН 0,50±0,03 Р1>0,05; р2<0,05 1,42±0,02 Р1>0,05; р2<0,05

ОГ №4, (п=10) 0,1% ЭРГХН 0,42±0,033 Р1<0,05; р2>0,05 1,33±0,03 Р1<0,05; Р2>0,05

Примечание: р|<0,05 - достоверность отличий относительно показателей ИГ;

рг<0,05 - достоверность отличий относительно показателей КГ.

Таким образом, при ЭЖП происходит ингибирование антитоксической функции печени. При модулировании процессов биотрансформации ксенобиотиков в печени у животных с ЭЖП обнаружен дозозависимый эффект ЭРГХН -ферментиндуцирующий при использовании 0,03% раствора и ферментингиби-рующий - при применении 0,1% раствора.

Прежде чем приступить к модулированию антимикробной функции МПО-НгОг-С! системы НГ предварительно проведена сравнительная оценка жизнеспособности нейтрофилов при инкубации с различными концентрациями ЭРГХН.

В ходе исследования самая низкая жизнеспособность НГ равная 62,264,4% получена при инкубации с 6 мкМ ЭРГХН, а самая высокая - 88,5-89,3% при инкубации с 0,5 мкМ раствором (табл. 4).

Таблица 4

Сравнительная оценка жизнеспособности НГ при инкубации с ЭРГХН, (%), (М±т)

Исследуемые группы Исследуемые средства Жизнеспособность НГ

ИГ, (п=10) Раствор Хенкса + НГ 94,4-96,6%

КГ, (п=10) 0,9% раствор КаС1 + ИГ 93,1-94,4%

ОГ№1, (п=Ю) 0,5 мкМ ЭРГХН + НГ 88,5-89,3%

ОГ №2, (п=10) 1 мкМ ЭРГХН + НГ 85,7-86,6%

ОГ №3, (п=10) 3 мкМ ЭРГХН + НГ 77,6-79,5%, р<0,05

ОГ №4, (п=10) 6 мкМ ЭРГХН + НГ 62,3-64,4%, р<0,01

Примечание; р<0,05 - достоверность отличий относительно показателей ИГ.

Полученные результаты позволили для модулирования антимикробной функции МП0-Н202-СГ системы НГ изучить их оксидантный потенциал путем измерения интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ).

Так, внесение в суспензию нейтрофилов Ва8С>4 не привело к значимому изменению кинетики люминолзависимой ХЛ (р>0,05) (рис. 1-2), относительно нейтрофилов находящихся в растворе Хенкса (X) (рис. 1-1), что может свидетельствовать о сохранности баланса между про- и антиоксидантными системами в клетках.

Рис. 1. Сравнительная оценка кинетики люминолзависимой ХЛ НГ под действием ЭРГХН. По оси абсцисс - время (мин); по оси ординат - интенсивность ХЛ (1мВ). 1 -Х+НГ + Ьт; 2-Х + НГ + 1^т + Ва804; 3 - X + НГ + Ш+ Ва504 + 1 мкМ ЭРГХН-4 - X + НГ + Ьш + Ва304 + 6 мкМ ЭРГХН; 5 - X + НГ + Ьт + Ва304 + 3 мкМ ЭРГХН.'

В ходе модулирования антимикробной функции МПО-Н2О2-СГ системы НГ на принципах ЭХО выявлен дозозавнсимый характер вспышки интенсивности ХЛ. Так, при инкубации НГ с 1 мкМ ЭРГХН, отмечалась максимальной интенсивности вспышка ХЛ, которая к 18 мин достигала 138±14,9 мВ (рис. 1-3) против 24,8±2,6 мВ в клетках стимулированных Ва8С>4 (р<0,001) (рис. 1-2), что является проявлением активности молекулярных механизмов антимикробной функции МПО-Н2О2-СГ системы НГ и возникшего дисбаланса между про- и антиоксидантными системами в клетках. Инкубация НГ с 3 мкМ ЭРГХН, характеризовалась менее выраженной вспышкой ХЛ, равной 71,3±8,0 мВ (рис. 15), что соответствует только 51,6% амплитуды ХЛ НГ полученной при инкубации с 1 мкМ ЭРГХН (р<0,01). И, наконец, при инкубации НГ с 6 мкМ ЭРГХН наблюдалась самая низкая вспышка ХЛ, равная 48,7±6,6 мВ (рис. 1-4), которая соответствовала только 35,3% амплитуды ХЛ НГ полученной при инкубации с 1 мкМ ЭРГХН (р<0,05), свидетельствуя тем самым об изменении оксидантного потенциала в сторону истощения АОС клеток. Подобная трактовка находит подтверждение и в наибольшей гибели НГ при инкубации с 6 мкМ ЭРГХН (табл. 4). На основании вышеизложенного можно предположить, что ХЛ НГ при инкубации с ЭРГХН, во-первых, связана с образованием гидроксильного радикала, который является результатом взаимодействия в организме НС10 с ионами переменной валентности, а во-вторых, результатом окисления люмино-ла хлораминовыми производными биогенных соединений, образуемых при активации НГ.

Таким образом, проведя осмысление полученных результатов можно предположить, что в момент поглощения НГ лиганда Ва804, запускается процесс активации СРО и подготовка выброса во внеклеточное пространство ЫЕТв, что подтверждается отсутствием достоверно значимой вспышки ХЛ. В то же время, при инкубации стимулированных НГ с разными концентрациями ЭРГХН, регистрируется дозозависимая реакция ХЛ ответа, когда низкие концентрации ЭРГХН индуцируют процессы пероксидации с выбросом во внеклеточное пространство ЫЕТб, тесно ассоциированную с протеазами и антимикробными пептидами цито-плазматических гранул МП0-Н202-СГ системы НГ. Подтверждением представленного механизма является регистрация вспышки с максимальной интенсивностью ХЛ при инкубации стимулированных НГ 1 мкМ ЭРГХН и наоборот, ингибирование ХЛ при инкубации НГ с 6 мкМ ЭРГХН, усиление процессов СРО и истощение АОС с образованием вторичных продуктов интоксикации, по мере накопления которых увеличивается гибель нейтрофилов.

Одной из актуальных проблем медицины является идентификация редокс-зависимых механизмов воспаления, течение и исход которого во многом зависит от оценки выраженности окислительной модификации макромолекул регулятор-ных систем организма нейтрофильными гранулоцитами (А.Н. Маянский, 2007).

Для модулирования редокс-зависимого механизма МПО-Н2О2-СГ системы НГ был изучен окислительно-восстановительный потенциал цельной плазмы и перитонеального экссудата животных с ЭЖП. Так, при добавлении 6 мкМ ЭРГХН в исследуемые среды, наблюдался рост максимальной величины редокс-потенциала в цельной плазме и перитонеалыюм экссудате, соответственно в 2,16 и в 1,8 раза (табл. 5).

Сравнительная оценка ЕЬ биологических сред животных с ЭЖП после обработки ЭРГХН, (М±ш)

Таблица 5

Исследуемые Среды

0,9% раствор NaCI

Плазма

Перитонеальный экссудат

Исходная величина Eh среды, мВ

+420,0±26,0

+215,0±14,0

+270,0±16,0

Концентрация ЭРГХН, мкМ

Максимальная величина Eh среды, мВ

+950,0±49,0 р<0,001

+465,0*26,0 р>0,001

+495,0±19,0 р<0,001

Абсолютная величина Eh среды, мВ

+530,0±28,0 р<0,001

+250,0±8,0 р<0,001

+225,0±17,0 р<0,001

Примечание: р<0,05 - достоверность отличий относительно Е11 в 0,9% растворе 1ЧаС1.

Полученные данные является результатом изменения физико-химических свойств цельной плазмы и перитонеального экссудата при ЭЖП, когда при добавлении ЭРГХН наблюдается рост положительных зарядов, приводящий к повышению окислительно-восстановительного потенциала и резистентности организма относительно возбудителей хирургической инфекции, препятствуя тем самым их проникновению и размножению в тканях.

Таким образом, замена отрицательных зарядов на положительные после применения ЭРГХН, является патогенетически оправданным способом борьбы с хирургической инфекцией. Представленная методология модулирования редокс-зависимого механизма МП0-Н202-СГ системой НГ на принципах ЭХО при ЭЖП может стать основой для создания селективных технологий управления нейтрофилами при острой абдоминальной патологией, нацеленных на оптимизацию функционирования эффекторных клеток и ограничению аутотоксических эффектов, приводящих к чрезмерно быстрой апоптотической элиминации.

На основании полученных результатов были изучены ростовые характеристики и биосинтез нуклеиновых кислот грамположительной и грамотрицатель-ной микрофлоры на принципах электрохимического окисления (рис. 2).

: И 5 : ¡3.»

/' -

N

/

30 61) 9<j 120 J 50

Рис. 2. Кривая скорости роста и содержания нуклеиновых кислот микрофлоры Staph aureus 209Р (а) и Е. coli Kl2 (б) после обработки ЭРГХН. По оси абсцисс - возраст культур (мин) по оси ординат - lg числа клеток, ДНК, РНК. 1 - контрольная микрофлора; 2 - микрофлора обработанная ЭРГХН.

В ходе исследования установлено, что клетки Staph, aureus 209Р подвергнутые обработке ЭРГХН, имеют более продолжительную лаг-фазу и высокую скорость роста - 0,4 ч против 0,78 ч в контроле (р<0,05) (рис. 2, а). Одновременно наблюдалось достоверное повышение в клетках содержания ДНК (р<0,05), без изменения содержания РНК (р>0,05) (рис. 2, а). В свою очередь клетки Е. coli К12, подвергнутые обработке ЭРГХН по продолжительности лаг-фазы не отличались от контрольных (р>0,05), но имели более низкую удельную скорость роста, равную 0,32 ч против 0,46 ч в контроле (р<0,05) (рис, 2, б), В то же время содержание ДНК и РНК в клетках оставалось без изменений (р>0,05) (рис. 2, б).

Полученные результаты открывают новые возможности для разработки патогенетически обоснованных методов коррекции клеточных механизмов естественной резистентности организма.

В ходе исследования состояния микросомально-монооксигеназной системы печени у животных КГ наблюдалось достоверное снижение содержания CYP450 до 0,723±0,03 нмоль/мг белка против 0,816± 0,04 нмоль/мг белка у животных ИГ (р<0,01) (рис. 3, а). На 1-е сутки лечения в ГС отмечалось дальнейшее его падение до 0,604±0,04 нмоль/мг белка относительно животных КГ (р<0,01), которое приходило к исходному уровню на 7-е сутки (рис. 3, а). В ОГ, наоборот, начиная с 1-х суток, наблюдалось достоверное повышение его содержания относительно животных ГС (р<0,05), которое приходило к исходным значениям на 3-й сутки (р>0,05), а на 7-е сутки уже превышало уровень животных ИГ (р<0,05) (рис. 3, а).

а б

Рис. 3. Сравнительная динамика уровня CYP450 (а) и Т'/2 АР (б) при лечении ЭЖП.

При исследовании процессов биотрансформации ксенобиотиков в печени у животных с ЭЖП в КГ отмечалось увеличение на 45,4% Т'/2 АР (р<0,01) (рис. 3, б) и на 23% Vd АР (р<0,05) (рис. 4, б), соответственно и падение на 17,5% С1 АР относительно животных ИГ (р<0,05) (рис. 4, а). На 1-е сутки лечения Т'/г АР в ГС достигал своего максимального уровня - 24,5±2,5 ч против 18,5±1,8 ч в КГ (р<0,05) (рис. 3, б), в то время как С1 АР (рис. 4, а) и Vd АР достоверно снижались (р<0,05) (рис. 4, б). На 7-е сутки к исходным величинам приходил только Vd АР (р>0,05) (рис. 4, б), в то время, как показатели Т'/2 АР и С1 АР, по-прежнему, оставались достоверно значимыми относительно животных ИГ (р<0,05) (рис. 3, б и 4, а). В ОГ с 1-х суток лечения происходило снижение Т'/г АР (рис. 3, б) и Vd АР (рис. 4, б) с одновременным повышением С1 АР относительно животных ГС, которые уже на 3-й сутки приходили к исходным значениям (р>0,05) (рис. 3, б и 4, а).

сутки

Рис. 4. Сравнительная динамика уровня CI АР (а) и Vd АР (б) при лечении ЭЖП.

Полученные результаты указывают на ингибирующий эффект процессов пе-роксидации лнпидов на печеночный метаболизм у животных КГ и индуцирующую роль комплексного применения ЭРГХН и а-токоферол-ацетата на него. Однако очевидно, что комплекс факторов, определяющих снижение процессов биотрансформации ксенобиотиков при ЭЖП, является более сложным и включает наряду с окислительным стрессом, эндотоксикоз и сепсис, а предлагаемый способ лечения СЭИ при ЭЖП в ОГ, является более эффективным, способствуя индукции процессов биотрансформации ксенобиотиков в печени.

Известно, что острая абдоминальная патология сопровождается инициацией процессов СРО и снижением резерва АОС крови (B.C. Савельев В А Петухов, 2008).

В ходе исследования процессов СРО при ЭЖП у животных КГ наблюдалось достоверное повышение в плазме концентрации первичных продуктов ПОЛ: уровень изолированных двойных связей (ИДС) достигал 5.8±0,38 отн. ед. против 1,88±0,39 отн. ед. у животных ИГ (р<0,001) (рис. 5, а), а диеновых ко-ньюгатов (ДК) - 4,28±0,17 отн. ед. против 1,19±0,14 отн. ед. (р<0,001), соответственно (рис. 5, б).

а б Рис. 5. Сравнительная динамика уровня ИДС (а) и ДК (б) плазмы при лечении ЭЖП.

На 1 -е сугки лечения в ГС отмечалась разнонаправленная динамика показателей первичных продуктов. Так, уровень ИДС снижался относительно животных КГ (р<0,05) (рис. 5, а), в то время как уровень ДК достигал максимальных значении, составляя 4,89±0,15 отн. ед. против 4,28±0,17 отн. ед. (р<0,05) (рис. 5, б). В последующие сроки отмечалось снижение уровня изучаемых показателей,' который, однако, и на 7-е сутки оставался достоверно значимым относительно животных ИГ (р<0,05) (рис. 5, а-б). В ОГ динамика изучаемых показателей носила однонаправленный характер (рис. 5, а-б). На 1-е сутки лечения отмечалось достоверное падение ИДС и ДК относительно животных КГ (р<0,01), которые на 7-е сутки приходили к исходным значениям (р>0,05).

Общеизвестно, что дальнейшее окисление первичных продуктов приводит к образованию вторичных продуктов ПОЛ.__

2,4 1.8 1.2 0,6 0,0

ж

2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 0,0

А

I 1- №

1

I

I ГС гтп ог ■

7 сутки

чйг]

рта кг |

i гс гтп ог -

сутки

Рис. 6. Сравнительная динамика уровня ТК (а) и ОДК (б) плазмы при лечении ЭЖП.

Так, у животных КГ с ЭЖП наблюдалось повышение в плазме уровня трие-новых коньюгатов (ТК) до 0,98±0,20 отн. ед. против 0,57±0,15 отн. ед. относительно животных ИГ (р<0,01), оксодиеновых коньюгатов (ОДК) до 1,24±0,12 отн. ед. против 0,91±0,08 отн. ед. (р<0,05) и малонового диальдегида (МДА) до 6,52±0,72 нмоль/мл против 5,05±0,58 нмоль/мл (р<0,05), соответственно (рис. 6, а-б и 7, а), что является результатом ускоренного распада полиненасыщенных жирных кислот и нарушения выведения первичных продуктов ПОЛ из организма.

В ходе проводимого лечения на 1 -е сутки в ГС отмечалась однонаправленная динамика повышения вторичных продуктов ПОЛ относительно животных КГ (р<0,05—0,01). При этом своих максимальных значений достигали только показатели ОДК (рис. 6, б), в то время как показатели ТК и МДА достигали их только на 3-й сутки (рис. 6, а и 7, а). Необходимо также отметить, что изучаемые показатели в ГС вплоть до 7-х суток оставались достоверно высокими относительно животных ИГ (р<0,05—0,001) (рис. 6, а-б и 7, а). В ОГ на 1-е сутки также отмечалось достоверное повышение уровня ТК и ОДК относительно животных КГ (р<0,05-0,01), то время, как показатели МДА имели лишь тенденцию к росту (р>0,05) (рис. 6, а-б и 7, а). Из рассматриваемых показателей максимальное значение на 1 -е сутки достигали только ТК и ОДК (р<0,01-0,05) (рис. 7, а-б), в то время как МДА приходил к данным величинам только на 3-й сутки (р<0,05) (рис. 7, а). Необходимо также отметить, что показатели ТК и ОДК приходили к исходным величинам на 7-е сутки (р>0,05) (рис. 6, а-б), в то время, как уровень МДА на 7-е сутки оставался еще достоверно значимым (р<0,05) (рис. 7, а)._

12,0 9,0 6,0

я

1 II_ 1 л

КГ

i ¡3^3 кг

ЕЙ0

сутки

!

кг

[щкякг I

■ ГГ ПГ -

Ей

а б

Рис. 7. Сравнительная динамика уровня МДА (а) и ЩО (б) плазмы при лечении ЭЖП.

Подобная тенденция отмечалась и при исследовании уровня шиффовых оснований (ШО), являющихся конечными продуктами ПОЛ.

Так, у животных КГ с ЭЖП отмечалось повышение уровня ШО в плазме до 0,74±0,08 отн. ед. против 0,33±0,06 отн. ед. у животных ИГ (р<0,001), который продолжал увеличиваться, достигая своих максимальных значений на 1-е сутки (рис. 7, б). В последующие сроки наблюдалось снижение уровня ШО, который в ГС и на 7-е сутки оставался достоверно значимым относительно животных ИГ (р<0,01), в то время как в ОГ он уже не отличался от исходных величин (р>0,05) (рис. 7, б).

Таким образом, при ЭЖП наблюдается рост первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ в плазме. При этом у животных ГС имело место более интенсивное течение процессов СРО с нарушением выведения гидрофобных токсинов, в то время как в ОГ изучаемые показатели на 7-е сутки достигали своих исходных значений, что объясняется окислением ЭРГХН гидрофобных токсинов с восстановлением транспортно-сорбционных функций эритроцитов.

Общепризнано, что мембрана эритроцитов отражает структурно-функциональные характеристики других клеточных мембран.

При исследовании процессов СРО у животных КГ с ЭЖП наблюдался максимальный рост уровня первичных продуктов ПОЛ эритроцитов: ИДС достигал 7,86±0,33 отн. ед. против 3,48±0,34 отн. ед. у животных ИГ (р<0,001) (рис. 8, а), а ДК - 7,11±0,50 отн. ед. против 2,95±0,40 отн. ед. (р<0,001) (рис. 8, б), соответственно. При этом в КГ рост первичных продуктов ПОЛ эритроцитов был ниже, чем в плазме (рис. 5). После проведенного лечения как в ГС так и в ОГ, наблюдалось снижение уровня ИДС и ДК эритроцитов, которое в ГС, так и не приходило к исходным значениям (рис. 8, а-б), в то время как в ОГ уровень ИДС не отличался от животных ИГ на 7-е сутки (р>0,05) (рис. 8, а), а ДК на 3-й сутки (р>0,05) (рис. 8, б). Поскольку процессы ПОЛ протекают на мембранах эритроцитов, АОС которых нарушена на фоне эндогенной интоксикации, можно полагать, что более интенсивный рост первичных продуктов происходит в клетках с поврежденным структурно-функциональным состоянием клеточной стенки и там, где используется менее эффективная терапия.

гЕЗ

а б

Рис. 8. Сравнительная динамика уровня ИДС (а) и ДК (б) эритроцитов при лечении ЭЖП.

Если увеличение концентрации первичных продуктов в клетках можно отнести в разряд реакции адаптации, то образование большого количества вторичных продуктов, является показателем активности процессов СРО (М.Я. Малахова, 2000).

Так, у животных КГ отмечался рост уровня ТК до 4,3±0,48 отн. ед. против 1,86±0,13 отн. ед. у животных ИГ (р<0,001), ОДК до 2,19±0,12 отн. ед. против 0,91±0,08 отн. ед. (р<0,001) и МДА до 15,0±1,62 нмоль/мл против 11,84±1,0

нмоль/мл (р<0,001), соответственно (рис. 9, а-б и 10, а), что свидетельствует об развитии СЭИ.

Рис. 9. Сравнительная динамика уровня ТК (а) и ОКД (б) эритроцитов при лечении ЭЖП.

При этом менее интенсивный рост вторичных продуктов ПОЛ эритроцитов относительно первичных продуктов в плазме у животных КГ можно объяснить большей устойчивостью АОС эритроцитов, способной ингибировать процессы СРО на уровне первичных продуктов.

На 1-е сутки лечения в исследуемых группах отмечалось снижение уровня ТК и ОДК эритроцитов относительно животных КГ (р<0,001), который, однако вплоть до 7-х суток оставался достоверно высоким относительно животных ИГ (р<0,05) (рис. 9, а-б). Подобное нельзя сказать о МДА, уровень которого продолжал повышаться, достигая максимальных значений на 3-й сутки (р<0,001) (рис. 10, а), так и не вернувшись к исходным значениям на 7-е сутки (р<0,01) (рис. 10, а). Похожая динамика отмечалась и в ОГ с той лишь разницей, что она носила менее выраженный характер. Так, уровень ТК и ОКД эритроцитов приходил к исходным значениям на 3-й сутки (р>0,05) (рис. 9, а-б), а МДА только на 7-е сутки (р>0,05) (рис. 10, а).

30.0 25.0 20.0 (5.0 10.0 5.0

Ж

кг

I ест кг "

-иг|

Рис. 10. Сравнительная динамика уровня МДА (а) и ШО (б) эритроцитов при лечении ЭЖП.

Качественно иная динамика наблюдалась при исследовании показателей ШО эритроцитов, когда у животных КГ с ЭЖП наблюдалось максимальное повышение их уровня до 6,95±0,20 отн. ед. против 2,46±0,22 отн. ед. у животных ИГ (р<0,001) (рис. 10, б). После проведенного лечения, как в ГС, так и в ОГ отмечалось достоверное снижение уровня ШО относительно животных КГ (р<0,05), который так и не приходил к исходным значениям на 7-е сутки наблюдения (р<0,05) (рис. 10, б).

Таким образом, ЭЖП сопровождается развитием СЭИ, ростом первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ как в плазме, так и в эритроцитах, что свидетельствует в пользу усиления процессов СРО и ослабления АОС крови. При

этом тенденция смещения равновесия в сторону СРО связана с повреждением в большей степени липидов и жирных кислот плазмы, и в меньшей - белково-липидных комплексов эритроцитов. Комплексное применение ЭРГХН и а-токоферол-ацетата в большинстве случаев приводит к прерыванию процессов СРО, нормализации соотношения неокисленных и окисленных липидов в плазме и эритроцитах.

Таким образом, повышение эффективности комплексного лечения ЭЖП в основной группе объясняется как прямым, так и опосредованным действием ЭРГХН, направленным на окисление токсинов, индукцию МОС печени и достижение антимикробного эффекта, а также антиоксидантным действием а-токоферол-ацетата, направленным на ингибирование процессов СРО за счет взаимодействия с металлами переменной валентности. Все это позволяет говорить о таргетном механизме действия предложенного способа лечения, основанном на принципах целевого воздействия на фундаментальные молекулярные механизмы, лежащие в основе того или иного заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В качестве маркеров для мониторинга эффективности детоксикационной и противовоспалительной терапии при ЖП целесообразно исследовать:

- микросомально-монооксигеназную систему печени;

- процессы биотрансформации ксенобиотиков в печени;

- содержание первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ крови.

2. Для диагностики оксидантного потенциала нейтрофильных гранулоци-тов крови при желчном перитоните целесообразно исследовать:

- люминолзависимую ХЛ нейтрофильных гранулоцитов крови.

3. Для индуцирования антитоксической функции микросомально-монооксигеназной системы печени и антимикробной функции миелоперокси-дазно-пероскид-хлоридной системы нейтрофильных гранулоцитов при желчном перитоните целесообразно использовать непрямое электрохимическое окисление крови 0,03% электролизным раствором гипохлорита натрия.

4. Для достижения антиоксидантного эффекта при желчном перитоните необходимо использовать 30% масляный раствор а-токоферол ацетата.

ВЫВОДЫ

1. В опытах in vitro и in vivo показан окислительный и антитоксический эффект ЭРГХН.

2. В ходе фармакологического тестирования продолжительности гексе-налового сна у животных с ЭЖП обнаружен дозозависимый эффект ЭРГХН в виде индукции антитоксической функции печени при использовании его 0,03% раствора и ингибирование при применении 0,1% раствора.

3. При ЭЖП выявлен дозозависимый ферментиндуцирующий эффект ЭРГХН на МОС печени и процессы биотрансформации ксенобиотиков при использовании 0,03% раствора и ферментингибирующий при применении 0,1% раствора.

4. При модулировании антимикробной функции МП0-Н202-СГ системы НГ обнаружен дозозависимый характер интенсивности вспышки люминолзави-симой хемилюминесценции в виде ее индукции при использовании 1 мкМ ЭРГХН и ингибирование при применении 6 мкМ раствора.

5. При модулировании редокс-зависимого механизма МП0-Н202-СГ системы НГ у животных с ЭЖП после добавления 6 мкМ ЭРГХН отмечен рост максимальной величины редокс-потенциала как в цельной плазме, так и в пери-тонеальном экссудате в 2,16 и в 1,8 раза, соответственно.

6. Обработка ЭРГХН грамположительной микрофлоры приводит к увеличению продолжительности лаг-фазы, высокой удельной скорости роста и повышению содержания ДНК в клетках, в то время как со стороны грамотрнцательной микрофлоры наблюдается только снижение удельной скорости роста с одновременным подавлением активности клеточных дегидроге-наз и обратимым угнетением факторов патогенности.

7. При ЭЖП отмечается ингибирование МОС печени и снижение процессов биотрансформации ксенобиотиоков в виде увеличения Т'/2 АР, Vd АР и падения С1 АР. Комплексное применение ЭРГХН и а-токоферол-ацетата приводит к индукции МОС печени с ранней нормализацией показателей биотрансформации ксенобиотиков.

8. ЭЖП сопровождается инициацией процессов ПОЛ с нарушением соотношения неокисленных и окисленных липидов в плазме и эритроцитах крови. Комплексное применение ЭРГХН и а-токоферол-ацетата приводит к их ранней нормализации.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

*1. Боташев, A.A. Состояние мембран эритроцитов при экспериментальном желчном перитоните / A.A. Боташев, O.A. Терещенко, В.В. Иванов, В.Е. Рыкунова // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. -№ 3-4 (117-118). - С. 36-39.

*2. Терещенко, O.A. Метаболические нарушения при экспериментальном желчном перитоните / O.A. Терещенко, A.A. Боташев, А.М. Лайпанов, В.Е. Рыкунова // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. -№ 3-4 (117-118). - С. 178-183.

*3. Терещенко, O.A. Нарушение функциональной системы детоксикации при экспериментальном желчном перитоните / O.A. Терещенко, A.A. Боташев, Э.А. Петросян,

B.Е. Рыкунова//Вопросы реконструкпгеной и пластической хирургии. - 2010. - 3 -

C. 85-86.

*4. Боташев, A.A. Оценка состояния системной воспалительной реакции при желчном перитоните / A.A. Боташев, O.A. Терещенко, Ю.В. Помещик, В.Е. Рыкунова // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - № 9 (123). - С. 39-42.

*5. Терещенко, O.A. Влияние натрия гипохлорита на состояние системной воспалительной реакции и гормональный обмен при лечении желчного перитонита / O.A. Терещенко, A.A. Боташев, Ю.В. Помещик, В.Е. Рыкунова // Кубанский научный медицинский вестник. - 2010. - № 9 (123). - С. 149-153.

6. Петросян, Э.А. Оценка роли оксида азота в нарушении некоторых компонентов гомеостаза при желчном перитоните / Э.А. Петросян, O.A. Терещенко, A.A. Боташев, В.Е. Рыкунова // Труды XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». -Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2010. - Т. 1. - С. 164-165.

7. Петросян, Э.А. Роль оксида азота в формировании метаболических нарушений при экспериментальном желчном перитоните / Э.А. Петросян, O.A. Терещенко, A.A. Боташев, В.Е. Рыкунова // Сб. тр. XVIII ежегодного Санкт-Петербургского нефрологического семинара. - Санкт-Петербург, 2010. - С. 38-41.

8. Рыкунова, В.Е. Острая воспалительная реакция и цитохром Р-450 зависимый метаболизм печени у животных с экспериментальным желчным перитонитом / В.Е. Рыкунова, Э.А Петросян // Вестник интенсивной терапии. - 2014. -№ 5. - С. 49-51.

9. Рыкунова, В.Е. Модулирование микросомально-монооксигеназной системы печени при экспериментальном желчном перитоните, осложненного абдоминальным сепсисом / В.Е. Рыкунова, Э.А. Петросян // Вестник интенсивной терапии. - 2014. -№5.-С. 100-102.

*10. Рыкунова, В.Е. Роль микросомально-монооксигеназной сисгемы печени и непрямого электрохимического окисления крови в механизме формирования синдрома эндогенной интоксикации у животных с экспериментальным желчным перитонитом / В.Е. Рыкунова, O.A. Терещенко, Э.А. Петросян // «Всстник экспериментальной к клинической хирургии». - 2014. - № 2. - С. 109-114.

* - журнал включен в Перечень российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АОС - антиоксидантная система

АФК - активные формы кислорода

ГС - группа сравнения

ДК — диеновые коныогаты

ЖП - желчный перитонит

ИГ - интактная группа

ИДС - изолированные двойные связи

КГ - контрольная группа

МДА - малоновый диальдегид

МОС - микросомально-монооксигеназная система

МПО-Н2О2-СГ- миелопероксидазно-пероксид-хлоридная система

НГ - пейгрофильный гранулоцит

ОГ - основная группа

ОДК - оксидиеновые коньюгаты

ОС - оксидативный стресс

СРО - свободнорадикапьное окисление

СЭИ - синдром эндогенной интоксикации

ТК — триеновые коныогаты

ХЛ - хсмилюминесценция

1ИО - шиффовы основания

ЭЖП - экспериментальный желчный перитонит

ЭРГХН — электролизный раствор гипохлорита натрия

AN - анилин

АР - антипирин

Eh - окислительно-восстановительный потенциал или редокс потенциал

Cl АР - клиренс антипирина

CYPb5 - цитохром Ь5

CYP450 - цитохром Р450

НСЮ — хлорноватистая кислота

Н2О2 - пероксид водорода или перекись водорода

NETs - нейтрофильные внеклеточные ловушки

T'A АР - период полувыведения антипирина

Vd АР - объем распределения антипирина

Рыкунова Валентина Евгеньевна

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 22.04.2015. Печать трафаретная. Формат 60x84 '/¡б. Усл. печ.л. 1.0. Тираж 100 экз. Заказ № 1357

Ошечатано в ООО «Издательский Дом - Юг» 350072, г. Краснодар, ул. Московская 2, корп. «В», оф. В-Тел.+7(918) 41-50-571 olforaenko@yandex.ru http://id-yug.com