Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Состояние местных факторов защиты в первичном очаге при гнойной инфекции

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕЩОВАТЕЛЬСЮ-Е! ИНСТИТУТ ЭПВДШИСИЮПМ И МИКРОБИОЛОГИИ гол. ГЛ. ГАБРИЧЕВСКОГО

На правах рукописи ДОСОВСКАЯ Евгения Семеновна

СОСТОЯНИЕ МЕСТНЫХ ФАКТОРОВ ЗАЩИТИ В ПЕРВИЧНОМ ОЧАГЕ ПРИ ГНОЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

14.00.36 - Аллергология я ищунология

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в Институте хирургии им.А.В.Вишневского

.АМН СССР.

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук Белоцкий С.М. доктор медицинских наук Карлов В.А.

доктор медкцЕкснк наук, профессор В.И.Лнтвжнов доктор медицинских наук А.М.СветухЕг

II ЫОЕШИ ем. Н.И.Лирогова

Защита диссертации состоится "_"_1991 года на заседании Специализированного совета К 084.18.02 в МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского МЗ РСФСР по адресу: 125212,Москва, ул. апмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ №. Г.Н.Габричевского Ш РСФСР.

Автореферат разослан. "_"_1991 года

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук О.В.Котельникова

ЗАК. 231-С Тир. ЮО экз.

'.' ; ОБЩАЯ ХАРЖГЕРИСТИКА РАБОТЫ

(У'Акту&лъпоотъ проблемы. Проблема диагностики и лечения сепси-^';ЯРДЙолкает стоять в центре внимания иммунологов и клиницистов, ктуаганость ее определяется тем, что сепсис нередко осложняет еченке различных заболеваний. Течяйле а исход сепсиса в значитдЕь-оЗ мере определяется успешностью лечения первлчиого очага.

Первичными очагами прв сепсисе является чаще всего гнойниз аны. Сепоис развивается,вероятно, в результате истощения аятиэгд-ежцнозшого иммунитета под воздействием первичного очага. Негсоят-олвруемое повышение числа шкробов в месте вкедрзния инфекция я : относительный дефицит факторов защиты приводи к развитию мест-ого гнойного процесса (первичный очаг)(Коствченск Б.М..Свету ятя ,.М.,1990). Защита от гнойной инфекции слагается из кооперации акторов естественной резистентности и компонентов шмунного ст-;ета. Многообразие нарушений факторов заняты шзываег необходамооть шукологического обследования, включавшего характеристику фагоцитов ( Veldimarsson F.", I9S0).

Интенсивное изучение взаимодействия ыакроорганизма с макро-Фганязиами в первичном очаге началось еще- в 50-60-е года Burks J. £ ,Ш.1еа К К » I95B, Coba Z, , J962) и уке в пос-геднее время ( Hart Т. et al;» I98S).Состояние первичного оча-■а играет определяпщуэ роль в развитии гнойной инфекция.

Оценка состояния первичного очага затрудняется малым числом :олЕчествекшх иетодов.В последнее вреда появилась возможность [рэодоления этих трудностей с помощью метода хемашшнесценциз.В юясве зтой реакции лежит вовлечена- кислорода в образование еы-¡окореактогеншх молекул,нзлучавдих свет ияи шзигаищ: эмиссию гэ другях соединений (Маянский А.Н. .Мзянсетй Д.Н. ,1989).Хевшпшн-гесцевдея нейтрофялоз сочетается с их азтибактеряальяоЗ активнс-¡тьв ( Iilnssa-еатег %-еЪ süV,I9£0, 21пиотаап G. «V, 1983).

П?злв работа. Разработать и охарактеризовать количествен-

- г -

ный метод оценки уровня защитных сил в первичном очаге и установить их связь с течением экспериментальной стафилококковой инфекцией.

Основные задачи исследования:

1. Разработать метод прямой оценки уровня и .динамики факторов защиты в первичном очаге.

2. На модели экспериментальной стафилококковой инфекции у морских свинок установить влияние дозы вводимого антигена на динамику факторов защиты в первичном очаГе.

3. Определить состояние метаболического резерва и дефекта опсонинов в первичном очаге при различном течении экспериментальной гнойной инфекции.

4. Изучить уровень защитной реакции в первичном очаге

у больных с гнойной инфекцией и ее связь с системной реакцией организма.

Научная новизна. Впервые разработан метод, позволяющий оценивать, состояние факторов защиты непосредственно в первичном очаге. Установлено, что для благоприятного течения стафилококковой инфекции на раннем этапе после заражения необходим высоки! уровень функциональной активности фагоцитов в ткани очага и низкий в периферической крови.

Выяснено, что критическим сроком при развитии стафилококковой инфекции являются 3-й сутки после заражения. Если на. этом сроке наблюдается супрессия миграции нейтрофилов в очаг, функциональной активности фагоцитов в очаге и периферической крови, то воспалительный процесс заканчивается летальным исходом.

Установлено, что резерв метаболической активности фагоцитов в первичном очагег зависит от величины микробной нагрузки.

Показано, что массивная кровопотеря вызывает гиперстщу-ляцию нейтрофилов периферической крови и снижает их бактерицидную активность.

Показано, что превышение концентрации микробов в I г та аО

ни очага 10 КОЕ/г больных приводит к подавлению функциональной активности фагоцитов.

Установлено, что процессу заживления соответствует снижение активности фагоцитов в ткани первичного очага, при одновременном возрастании метаболического резерва.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований разработана экспериментальная модель и метод сценки активности фагоцитов непосредственно в ткани очага, что может быть использовано для изучения лечебных препаратов и для выяснения патогенеза инфекции.

Установлено, что активность фагоцитов в ткани очага коррелирует с микробной обсеменеяностью я клеточным составом ткани очага и может слуясить объективным критерием оценки фазы и тяжести течения раневого процесса.

Предложенный метод может быть применен в клинике для оценки эффективности местных и общих лечебных мероприятий, радикальности операций, а также для прогноза осложнений.

Внедрение результатов работы. Метод оценки <,7ункиональной активности фагоцитов непосредственно в первичном очаге внедрен в практику лабораторных исследовании в Институте хирургии им.А.В.Вишневского АМН СССР и в Казанском государственном медицинском институте игл. С.В.Курашова.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсувдены на:

- II Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы теоретической и прикладной инфекционной иммунологии,механизмы проти-

-А -

воинфекционного иммунитета" (Москва,1987);

- К ыежинститутской научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск,1988);

- I Всесоюзном иммунологическом съезде (Москва,1989);

- Всесоюзном симпозиуме "Анаэробная неклостридиальная инфекция в гнойной хирургии" ($ернополь,1989);

- II Всесоюзной конференции "Хирургический сепсис"(Тула, 1989);

- I научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск,1990).

Диссертация апробирована на совместной научной конференции лаборатории микробиологии,иммунологии и клинической фармакологии и отделения ран и раневой инфекции Института хирургии им. А. В. Вишневского АМН СССР 17 апреля 1991 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 листах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 23 отечественных и .132 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 33 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В основу работы положены результаты экспериментальных исследований, проведенных на 1438 морских свинках (самцов) и изучения в клинике результатов обследования 33 больных, находившихся на лечении в отделении ран и раневой инфекции Института хирургии им.А.В.Вишневского АМН СССР.

В основную исследуюмуга группу вошли 4 подгруппы животных массой 300-350 г, зараженных разной дозой микробов: 102 КОЕ/мл (60 шт.),10® КОЕ/мл (160 шт.),Ю9 К0Е/мл(550шт.), 10"^ КОЕ/мл (608 шт.). Контрольную группу животных составили 30 интактных животных, которые служили моделью для определения влияния кровопотери, замещения крови физиологическими растворами, кардою пункции и наркотических препаратов на уровень функциональной активности нейтрофилов периферической крови нивотных.

Исследуемые больные были разделены на четыре группы в зависимости от из клинического состояния: относительно удовлетворительное, средней тяжести, тяжелое и крайне тяжелое.

При создании экспериментальной модели исходили из того, это наиболее приближенной к клинике будет модель с наличием зервичного очага.С этой целью животным вводили в мышцу задней хонзчности взвесь стафилококка ( 0,1 1« в физиологическом растворе Рингера) , что приводило к формированию местного гнойного очага.

Для заражения использовали штамм золотистого стафилококка № 1812, взятый из лаборатории микробиологии, иммунологии I клинической фармакологии Института хирургии им.А.В.Вишнев-зкого АМН СССР. Культуру стафилококка адаптировали к организму лорских свинок путем 10-кратного пассирования.

Методы исследования. Для определения функциональной актив-гасти фагоцитов в первичном очаге использовали метод люминол-зависшой хемилюминесценции.

Для этого у наркотизированного животного удаляли очаг. Зиоптат ткани помещали во флакон, выдержанный на холоду, до-5авляли 2 мл холодного фосфатного буферного раствора, гомо-

генизировали ножницами, затем добавляли 0,25 мл раствора лгаминола (конечная концентрация 2,2x10"%), помещали в чодещую баню при температуре 37° С и измеряли абсолютные значения хемилюмшесценции в лзоминометре каадые 5 минут, учитывая максимальные значения (пик реакции). Измерения проводили на счетчике (люминометре), который включает в себя лампу ФЭУ ЗЭА, усилитель с полосой пропускания 10 МГц и коэффициентом усиления 200.

3 дальнейших исследованиях для определения дефекта гпсокинов или наличия метаболического резерва в тест-систему вводили 0,1 мл аутологичной сыворотки или 1,0 мл золотистого стафилококка в дозе 10® КОЕ/мл на пике хемилшинесценции (максимальных показаниях) или в параллельных опытах.

При определении функциональной активности нейтрофилов в периферической крови у морской свинки был модифицирован метод спонтанной дшинолзависимой хемилшинесценции (Белоц-яий С.М. и соавт., 1986). Путем кардиопункции кровь забирали, в количестве 4-5 мл, смешивали с 0,1 мл гепарина. Затем кровь разводили раствором Рингера в 5 раз и наслаивали на градиент г-лотности фиколла-верогра^ина (1,077 г/см^) в соотношении '1 мл разведенной крови к 3 да градиента. Пробирки центрифугировали 40 минут при 600йг . Полиморфноядерные нектрофилы (ГЫЕ1) концентрировались в интерфазе. Выделенные клетки разво-дпли раствором Хешса до концентрации 1x10 /мл. Чистоту попу ляции контролировали микроскопически. Жизнеспособность определяли по тесту с трипановым синим.

Тест-система состояла из Г мл суспензии ПМН. + I мл фосфатного буферного раствора (спонтанная хемилюминесценция) + 0,1 мл аутологичной сыворотки или I мл суспензии убитого золотистого стафилококка (путем нагревания при 90® С в тече-

нии 5 минут в водяной бане) в концентрации Ю8 КОЕ/мл + 0,1 Ш1 раствора люминола фирмы "Серва" ( конечная концентрация 10"%).

Бактериологический анализ проводили ткани очага на количественное определение степени микробной обсемененности гнойной раны ( концентрациия микроорганизмов в I г ткани раны) проводился согласно методическим рекомендациям,изложенным в руководстве "Бактериологическая .диагностика раневой лнфекции (1984).

Для обработки полученных результатов арименялсиь по.дхода, изложенные в ледуюцих руководствах: Бейли Н. (1962) ,Рунион Н. (1982). Обработку проводили на персональном компьютере " ОНте^-н " с использованием пакета стандартных статисти-зеских программ. Достоверность различий оценивали по критерию Зтъвдента (1 ). В работе обсуждаются только данные с достоверностью не менее ЪЪ% (р£- 0,05).

Результаты работы и их обсуждение. Любая форма стресса сопровождается торможением поглотительной функции ретикулоэндо-гелиальной системы. Поэтому исследование реактивности организма ¡.осле действия различных стрессорннх факторов ватао яря разработке экспериментальной модели. В наши исследованиях Зыло выяснено влияние на уровень выработки метаболитов кислорода нейтрофилами периферической крови следующих стрессорных факторов: кардиопункции, многократного взятия крови из сердца, гаркотических препаратов, замещения крови различными физколо-гаческими растворами.

Так, кардиопункция резко подавляла функциональную актив-юсть нейтрофилов. Если до проведения кардиопункции спонтан-шй ХЯ-ответ составлял 113,9-12,6x10^ имя/сек, то после доведения кардиопункции спонтанная решщия уменьшалась

почти в 2 раза и составляла 68,0+15,7 хЮ3имп/сек (Р 0,05).

При взятии крови из сердца было выснено, что массивная кровопотеря способна сама по себе привести к аутоповреждению макроорганизма, а затем и к дисфункции системы фагоцитов. Так, при исходном уровне спонтанной хемилюминесценции в

О

100,0+8,7 хЮ имп/сек, а стимулированной хемилюминесценции

о

в 338,0+3,0 хЮ'имп/сек, повторное взятие крови приводило к

о

возрастанию уровня спонтанной реакции в 5 раз (580,0+7,0 хЮ

о

имп/сек), а стимулированной только в 2-раза <826,8+1,5 хЮ имп/сек), что говорит о.состоянии гиперстимуляции фагоцитов. При взятии крови во второй раз после исходного взятия происходило снижение активности фагоцитов как по спонтанной, так и по стимулированной реакции ( 22,0+0,22 хЮ3 имп/сек и 81,1+

о

0,12 хЮ имл/сек соответственно). Взятие крови на 5 сутки после исходного исследования приводило к небольшому увеличению хемилшинесцентного ответа по спонтанной хемилюминесценции

о

(45,0+0,8 х10 имп/сек), в то время как по стимулированному хемилюминесцентному (XI) ответу продолжало наблюдаться состоя-

q

ние депрессии фагоцитов ( 60,8+0, 19 хЮ имп/сек).К концу исследования (6 суткам) .¡осле исходного взятия крови спонтанный ХЕ-ответ возрастает до 53,0+0,5 хИ имп/сек, а стимулированный падает до 27,0+0,07 х Ю3 имп/сек.

Эти данные показывают, что наиболее долго страдает реакция полиморфнодцерных нейтрофилов (ПН) на микробы, что может привести в дальнейшем к дисфункции системы фагоцитов. Оптимальным сроком для исходного обследования животных являются 5-6 сутки до проведения экспериментов.

При взятии крови для того.чтобы уменьшить стрессорное влияние кардиопункции и взятия крови были проведены исследования по попытке замещения крови различными растворами. Для

того использовали растворы Рггагера (0,85$),глюкозы (40$) полиглюкина. Все растворы, имеющие температуру 37^ С, вво-или сразу после взятия крови. Повторные исследования проводи-и через 3 часа, на 1-е и 6-е сутки. В результате проведенных зследований было выяснено, что наименее травматичным раство-эм является раствор Рингера, так как .осле введения раствора эовень ХЯ-ответа практически не менялся (контроль - 50,8+ ,2 х103 имп/сек, опыт - 28,6+5,0 хЮ3 имп/сек ), в то время 1К в других случаях мы получили следующие данные: при введе-

о

га раствора 40$ глюкозы- контроль составлял 34,4+4,3 хЮ о/сек, а опыт - 60,7+6,3 хЮ3 имп/сек; при введении раство-i полиглюкина контроль составлял 170+17,5 хЮ3 имп/сек, а гыт - 605,0+57,6 хЮ3 шп/сек.

Итак, при введении раствора полиглюкина и глюкозы проис->дит гиперстимуляция функциональной активности нейтрофилов.

Наркотические вещества неоднозначно воздействуют на шщиональную активность нейтрофилов периферической крови, ¡смотря на увеличение спонтанной хеыилюминесценции (конт-ль составляет 29,4+1,4 хЮ3 имп/сек, о шт - 62,0+6,0 хЮ3 ¡n/сек) наркоз одновременно сильно подавляет реакцию нейтро-

о

лов на инфект ( контроль - 720,0+106,0 хЮ имп/сек, опыт -1,6+26,2 хЮ3 имп/сек). Эта ситуация говорит о возникнове-и дефицита метаболического резерва.

В результате проведенных исследований мы предлагаем едующую Тформу обследования животных при проведении экспери-нтов:

1. Исходное взятие крови и замещение ее равным объемом створа Рингера за 5-6 дней до заражения;

2. Заражение следует проводить через 5 дней после первич-го обследования животных, операция по удалению первичного

очага должна проводиться с применением следующего наркоза: 1,0 мл калипсола на 300 г веса + эфирный наркоз.

Прямое или косвенное нарушение микроциркуляции отягощает течение процесса в первичном очаге.'Процессы,происходящие в первичном очаге инфекции представляют собой сложное взаимоотношение микробных факторов и защитных сил организма. Поэтому мы разработали метод, в котором удалось осуществить определение активности ''акторов иммунной защиты организма непосредственно в зоне очага. Для этого в качестве объекта ийпользовали гомо-генат ткани из очага поражения и способом лкминол-зависимой хемилюминесценции определять содержание метаболитов кислорода. При этом проводилась параллельная оценка микробной обсеме-ненности ткани очага, клеточного состава биоптата.очага с помощью микроскопического подсчета. В результате были выявлены следующие закономерности.

При введении малой заражающей дозы 10® КОЕ/мл активность фагоцитов на первые сутки достигала своего максимального уровня (71,0-9,5 хЮ имп/сек/г). На 3 сутки происходило резкое

о

снижение уровня XI-ответа до 11,0-1,8 хЮ имп/сек/г. Миграция нейтрофилов на раннем этапе после заражения была выражена достоточно сильно (0,245*0.07хЮ3 кл/мкл), но максимальных

о

значений достигала на 3, сутки после заражения (2,0*0,25 хЮ кл/мкл). Максимум микробной обсемененности наблюдался на 3 сутки после заражения ( 1^10,7x0,25). К концу воспалительного -.роцесса происходило снижение функциональной активности ¿агоцитов в ткани очага (5,0*0,3 хЮ3 имп/сек/г) и числа миг-

О

рировавишх нейтрофилов в нем (0,745*0,15 хЮ кл/мкл).

Итак, при данной дозе уже'на ранних этапах после заражения присутствует активация фагоцитов и интенсивная.миграция нейтрофилов в очаг, что благоприятно сказывается на дальней-

шем течении процесса и позволяет купировать очаг местной инфекции.

В случае заражения животных сублетальной дозой микробов (I09 КОЕ/мл) уровень метаболической активности фагоцитов в ткани очага в ранний период после заражения (I сутки) находился на довольно низком уровне и составлял 18,0+2,0хЮ3имп/сек/г при этом миграция нейтрофилов в очаг была выражена слабо (через 3 часа - 0,03+0,01хЮ3 кл/мкл), но уже на I сутки происходило резкое возрастание мигрировавших нейтрофилов в ткани очага (0,73+0,18хЮ3 кл/мкл),микробная обремененность на I сутках была выражена достаточно сильно ( 1* 11,7+0,2). Высокий уровень защитных сил в ткани очага на 6-9 сутки ■ (1584,0+178,5хЮ3 имп/сек/г) коррелировал с увеличением числа

О

мигрировавших нейтрофилов в ткани очага (8,5+0,25x10 кл/мкл) и сопровождался снижением микробной обсемененности ткани очага 10,1+0,1).

Данное состояние защитных сил благоприятно влияет на дальнейшее течении инфекции и может быть связано с ограничением процесса пределами первичного очага. Несмотря на высокую дозу введенного инфекта данная динамика защитных сил является достаточной для сопротивления и ограничения очага местного процесса.

При введении летальной заражающей дозы (10^ КОЕ/мл) низкий уровень респираторного взрыва в начальный период (15,0+0,2хЮ3 имп/сек/г) сочетается, с низкой концентрацией

о

мигрировавших нейтрофилов в ткань очага (0,03+0,01x10 кл/мкл) и высокой микробной обсемененностью ткани очага Q-? 10,5-0,2).. К 6 суткам происходит резкое возрастание хемилкминесцентного ответа, которое достигает максимума на 9 сутки (3550+125x10 имп/сек/г), что сочетается с увеличением миграции нейтрофилов

- 12 -

о

в ткань очага (2,5*0,27x10 кл/мкл).

Итак, при высокой заражающей дозе низкий ответ фагоцитов на раннем этапе после заражения сочетается с низкой концентрацией нейтрофилов и высокой микробной обсемененностью очага. Такая ситуация является неблагоприятной для дальнейшего течения воспалительного процесса.

По литературным данным известно, что нестимулированная реакция фагоцитов периферической крови больных увеличивается пропорционально концентрации микробов в первичном очаге инфекции (Филюкова О.Б..Снастина Т.И.,1987).

При исследовании активности фагоцитов периферической крови при различных заражающих дозах в экспериментах на морских свинках были получены еле,дующие результаты.

о

При введении низкой заражающей дозы (10 КОЕ/мл) уровень активности нейтрофилов периферической крови на раннем этапе (I сутки) был мал (6,8+1,65хМ3 имп/сек).Такой уровень держится до 3 суток.включительно, а к 6 суткам происходит резкое снижение ХЛ-ответа до 1,2+0,1хЮ3 имп/сек. При введениию сублетальной дозы (10%0Е/мл) уровень ХС-огвета на I сутки

п

был выражен досааточно сильно (22,6+0,3x10 имп/сек), но максимальных значений достигал на 3 сутки (40,2+9,5хЮ3имп/сек), а к 6 суткам ..роисходило, как и при малой заражающей дозе, резкое снижение до минимальных значений (2,0+0,4хЮ3имп/сек). При летальной дозе заражения максимум ХЛ-ответа наблюдался на I сутки после заражения (28,6+2,5хЮ3има/сек), затем происходило резкое почти 10-кратное снижение и на 3 сутки достигал своих минимальных значений (2,85+0,4хЮ3имп/сек), к 6 суткам происходило вновь небольшое возрастание ХЛ-ответа до 4,7-0,1хЮ3имп/сек.

Итак, при гиперстимуляции нейтрофилов высокой заражающей

дозой (Ю10 КОЕ/мл) происходит мгновенный выброс большого количества метаболитов кислорода и дальнейшее резкое снижение активности нейтрофилов из-за супрессии их. микробными факторами. Сильная стимуляция нейтрофилов на более подцнем этапе (10%0Е/мл) является благоприятным признаком для дальнейшего течения и исхо-•да воспалительного процесса.

Как было написано выше, при юлой заражающей дозе гибели животных не наблюдалось и образования очага не происходило, что сочеталось с низкой реакцией нейтрофилов в периферической крови и достаточно высокой в первичном очаге. Поэтому мы приняли эту дозу как оптимальную и по отношению к ней рассматривали .две остальные дозы. Шли рассмотрены следующие показатели: уровень функциональной активности фагоцитов в ткани очага, число свободных мигрировавших нейтрофилов в ткань очага, время достижения пика ХЛ-ответа, микробную обсемененносгь ткани очага и уровень функциональной активности нейтрофилов периферической крови (табл.1). Данные значения были получены утем деления значений при 10%0Е/ мл и Ю1 ^КОЕ/мл заражающих дозах на значения, полученные при введении дозы Ю8 КОЕ/мл.

На раннем этапе после заражения практически все показатели находились на одинаковом уровне. Начиная с первых суток происходил разрыв между дозами. Возрастала активность фагоцитов в ткани очага и увеличивалось число свободных мигрировавших нейтрофилов в очаге при сублетальной дозе. На 3 сутки происходило резкое повышение функциональной активности фагоцитов в ткани очага, периферической крови и усиление миграции нейтрофилов в очаг при сублетальной дозе. При летальной дозе все перечисленные показатели были на порядок меньше,чем при сублетальной дозе. На 6 сутки роисходило увеличение функциональной активности фагоцитов очага при обеих дозах. Цри летальной дозе наблюдался

Таблица I.

Отношение показателей при летальной (Ю1^ КОЕ/мл) и сублетальной(10® КОЕ/мя) заражающих дозах к показателям, полученным при введении малой заражающей дозы (10%0Е) при внутримышечном

заражении животных золотистым стафилококком

Показатель ¡'Зара- ! 3 часа ! I сутки ¡//.3 .сутм/'" 6 сутки ! 9 сутки !жающая ! ! ! /п/П/П/\ ! ! доза ! ! !//////////! !

Уровень функциональной ТПЮ п „ „„ активности фагоцитов ±и и,оо и, изо в ткани очага ~ ~ о 72 0 3 Щъ^/А-Ы____ Ш5'°У/1 6,6 78,4

Число свободных мигриро- тп10 п т Пд вавших нейтрофилов в ------^^------- ткань очага 109 0Д2 (ШйЛьЛ-- ---- ^%/4,75^! 3,3 4,75

Время достижения пика Ю10 1,2 0,89 хешлюминесцентного ----------------- отчета 109 1>н 0>? 1,23 [ 1,23 0,39 I 1,0 ! 0,9 2,15

Микробная обсемененность Ю1® 1,41 ткани очага - * --------------- Ю9- 1,2 1,09 ]_ 4,0 1,09 | 1.7

Уровень функциональной 10"^ 4 2 активности нейтрофилов -------------'---- периферической крови Ж. _ 3,9_______ ////6,45,//\ 1,7

увеличение миграции нейтрофилов в очаг, но клегки не в состоянии справиться с большой дозой микробов и поэтому микробная обсеме-ненность очага не уменьшается, а превышает микробную обсеменен-ность при сублетальной дозе в 2,5 раз. На 9 сутки происходит активизация фагоцитов в очаге при обеих дозах, но при летальной дозе это не играет уже решающего значения.

Итак, решающим для дальнейшего течения воспалительного процесса являются 3 сутки после заражения. Если на этом этапе присутствует глубокая супрессия фагоцитарной системы по трем показателям ( числу нейтрофилов,мигрировавших в очаг, уровню функциональной активности фагоцитов в очаге и периферической крови) то исход воспалительного процесса становится неблагополучным (летальная доза).Если на этом, сроке эти показатели выражены достаточно сильно, то воспалительный процесс заканчивается разрешением (сублетальная доза).

Размножение микробов в первичном очаге вне зависимости от интенсивности процесса в нем может качественно изменить взаимодействие возбудителей с опсонофагоцитарной системой.Функция опсоно-фагоцитарной системы имеет решающее значение в защите от гнойной инфекции.Прикрепление опсонизированного микроба к фагоциту осуществляется преимущественно через рецепторы для Iр® , I в М и комплемента.Часть микробов погибает уже в процессе этого связывания за счет выделения бактерицидных продуктов в окружающую среду(Белоцкий С.М.,Карлов В.А.,1985). В роли опсонинов выступают естественные антитела,которые преимущественно вырабатываются при гнойной инфекции. Дефект опсонинов может коррелировать с развитием гнойных осложнений (leinsteln r.J.et 1976), но он же играет наибольшую роль, когда имеется и дефект фагоцитарной активности нейтрофилов ( Alexander J.w., 1979).

Для определения наличия дефекта или резерва опсонинов или

метаболической активности фагоцитов в тест-систему на пике реакции добавляли аутогенную сыворотку или взвесь микробов (см. Материалы и метода). Результат определяли по отношению Опыта (после добавления реагента) к контролю ( до добавления реагентов).

Шло выяснено,что малая заражавдая доза (10® КОЕ/мя) не вызывает высокого ответа ШН на микробы(на всех этапах после заражения ри этой дозе уровень резерва метаболической активности держался на одинаковом уровне - около 1,15). В данном случае высокий резерв метаболической активности не нужен. При сублетальной заражающей дозе (Ю9 КОЕ/мл) в начальный период после заражения увеличения резерва и он составлял 1,21*0,35, но уже к 3 суткам происходило резкое возрастание метаболического резерва до максимального уровня (2,82+0,71). К 6 суткам происходило снижение резерва до исходного уровня (1,14*0,85).При введении летальной заражающей дозы (Ю1® КОЕ/мл) уже на I сутки наблюдался высокий уровень метаболического резерва (2,7-5-0,19), но затем из-за прессинга высокой заражающей дозы в очаге происходило рез-уменьшение метаболического резерва до его полного истощения к 6 суткам (0,954-0,07).

Таким образом, наличие метаболического резерва на раннем этапе после заралсения (Ю^^ОЕ/мл) не способно привести к благополучному исходу, а наличие метаболического резерва на 3 сутки после заражения приводит к благоприятно^ исходу воспалительного процесса.

о

Дефицит опсонинов при введении малой заражающей дозы (10 КОЕ/мл) наблюдался только на позднем этапе после заражения (1,44-0,4).При сублетальной дозе заражения на 6 сутки происходит ■ истощение резерва опсонинов, в то время как на раннем этапе (I сутки) наблюдался достаточно выраженный резерв опсонинов

(2,24 по сравнению с 1,25 соответственно). При летальной дозе уже на I сутки выражена недостаточность опсонинов в очаге (О,85-Ю,21) и лишь к 6 суткам появляется небольшой резерв (0,97+0,12).

Итак.увеличение резерва опсонинов в ткани первичного очага на раннем этайе после заражения при сублетальной дозе благоприятно сказывается на дальнейшем течении воспалительного процесса. И наоборот, дефицит опсонинов в ткани очага на первые сутки после заражения при летальной дозе коррелирует с летальностью животных.

Для оценки информативности данного метода он был применен в клинической практике. При этом обследовались больные с гнойными ранами и острыми гнойными заболеваниями, пострадавшие во время землятрясения в Армении в декабре 1988 г. Среди больных у 9 .диагностировали местные поражения, у 22 - течение заболевания осложнялось гнойно-резорбтивнос лихорадкой, а у 2 развилась клиническая картина хирургического сепсиса.

Инфекционный процесс является одним из факторов, осложняющих течение заболеваний, возникающих после травм.Поскольку основные возбудители раневой инфекции - это в основном представители условно-патогенной микрофлоры, то в процессе эволюции выработались определенные количественные соотношения между этими микробами и макроорганизмом.

При исследовании гомогената ткани очага больных были получены следующие результаты. Цри минимальной концентрации микробов (Ю%0Е/г) в ткани очага уровень ХЛ-ответа находился на минимальных значениях (2,37-0,34хЮ3 имп/сек/г) Реакция ткани очага увеличивалась с возрастанием микробной обсемененности ткани очага и при числе микробов в I г ткани 10® КОЕ/г реакция фагоцитов достигала своего максимума (73,45-23,42 хЮ3 имп/сек/г). При

дальнейшем возрастании микробной обсемененности ткани очага до 10^-10^ КОЕ/г происходило резкое снижение уровня ХЛ-ответа почти в 3 раза до 28,5+9,1хЮ3 имп/сек/г.

Следовательно, слишком высокая обсемененность ткани очага ■ подавляет респираторный взрыв в ткани и/или быстро связывает реактивные метаболиты кислорода.

При выяснении соотношени между локальной и системной реакциями фагоцитов было выяснено следующее. Все полученные результаты были поделены на 2 группы, кавдая группа была разделена на две подгруппы в зависимости от уровня ХЛ-ответа в ткани очага. Группы различались межцу собой по уровню микробной обсемененности очага.

В группе с низкой микробной обсемененностью очага (1в2,5+ 0,05) низкий уровень ХЛ-ответа очага (2,5+0,2хЮ4 имп/сек/г) сочетался с низкой реакцией нейтрофилов периферической крови

о

(2,1+0,15x10 имп/сек/г). Вероятно, что быстрая инактивация микробов и их токсинов интенсивной защитной реакцией в первичном очаге снижает выход этих микробных факторов в кровоток, в результате чего стимуляция нейтрофилов в периферической крови отсутствует.

В группе с высокой микробной обсемененностью ткани очага ( 1<г 6,6+0,05) наблюдали .два типа реакции, фагоцитов на инфект. Так, при низком ХЛ-огвете ткани очага (4,7+0,45x10^ имп/сек/г) выработка метаболитов кислорода в периферической крови также

о

выражена достаточно слабо (3,2+0,4x10 имп/сек). При возрастании уровня респираторного взрыва в ткани очага до 95,0+12,5хЮ4 имп/сек/г ХЛ-ответ в периферической крови также возрастает и достигает 4,9+0,32х103и,ш/'сек. Такую реакцию нейтрофилов в пери ферической крови можно объяснить выходом микробных и немикробны факторов в циркуляцию я гиперстимуляцией фагоцитов периферичес-

кой крови. В данной' ситуации в периферической крови и в очаге у больных происходило ухудшение состояния, что в дальнейшем приво-дилок к неблагоприятному исходу воспалительного процесса.

Итак, малая микробная обсемененность ткани очага ведет к усиленной инактивации микробов и их токсинов, что снижает выход этих продуктов в кровоток и предупреждает гиперактивацию нейтро-филов в циркуляции. При высокой микробной обсемененности происходит увеличение выработки метаболитов кислорода как в ткани раны, так и в циркуляции. В результе чего местные факторы защиты не в состоянии осуществить барьерную функцию и сдержать выход микробных продуктов из раны.

Нами проведен ретроспективный анализ зависимости уровня ХЛ-ответа ткани очага от степени заживления раны. Так, при типе цитограммы дегенеративно-воспалительном или воспалительном, что наблюдалось на I фазе течения раневого процесса, уровень выработки метаболитов кислорода был достаточно высок и достигал 3,4*0,6x10^ имп/сек/г,микробная обсемененность ткани раны на

О

этом эта е также достигала высоких значений (3-4x10 м.тел/1000 клеток). При уменьшении микробной обсемененности ткани раны до Б.ЗхЮ-1 м.тел/ЮООкл. происходило снижение выработки метаболитов кислорода фагоцитами (0,9*0,1хЮ4 имп/сек/г). Во II фазе течения воспалительного процесса - фазе регенерации - тип цитограммы был регенераторно-воспалительным или регенераторным,уровень ХЛ-ответа достигал минимальных значений (0,23*0,1x10^ имп/сек/г), что сочеталось с цитологической картиной ткани раны. На этом этапе происходила смена клеток в ткани раны и на смену нейтрофи-лам,моноцитам и эозинофилам приходили макрофаги,»полибласты, и клетки эндотелия. Микробная обсемененность снижалась в 300 раз по сравнению с исходными данными.

Итак, уровень респираторного взрыва в ткани раны является

объективным критерием отражающим флау течения воспалительного процесса,коррелирующим с показателями цнтощрамда и уровней микроб ной обсеменеиности ткани разы. Црн определении метаболического резерва в ткани раны на разных этапах воспалительного процесса било выяснено, что резерв метаболической активности и опсонинов присутствует в тканях раны с малой микробной обсеменениостъю. То есть интенсивность локального 11-ответа увеличивается по мере

I

возрастания концентрации микробов в ткани раны и снижается по мере заживления р&нн.

Таким образом,данный метод определения выработки метаболитов кислорода в сарвичном очаге может быть применен как в постановке различных экспериментов для изучения патогенеза гнойной инфекции, так и в клинической практике для оценки эффекта местного и общего лечения, прогноза осложнений и радикальности операций.

вывода !

1. Вперше разработан метод быстрого определения состояния факторов местной защиты путем измерения уровня респираторного взрыва фагоцитов в гомогевате ткани первичного очага.

2. Разработана и внедрена в практику модель обследования ля- ! вотшх, позволяющая избегать влаяжя стрессорных факторов на функ-пзгсзальЕув активность нейтрофзлов периферической крови и тем саздм устаковать истинные эначеиая.

3. Установлено,что миграция нейтрофжлов в ткань очага,уровень функциональной активности фагоцитов в ткани очага и периферической кровв зависят от дозы вводимого антигена в могут быть использовали как прогзостЕческге критерии в оценке исхода раневого процесса.

4. Резерв метаболической активности первичного очага занисит от интенсивности миграции кеЁтрофклов а от величины микробной нагрузки ;по мера разрешения воспалительного процесса этот резерв увеличивается.При высокой степени обсеменеиности первичного очага наблюдается дефект опсоников.

5. I больных с гнойной хирургической инфекцией динамика местного. ХЛ-ответа коррелирует с течением заболевания,интенсивность местного ХЛ-ответа йшкается по мере затавления ракы.

- 21 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИИ* ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Хемнлшинесценция иейтрофнлов человека под действием "услов-нопатогенных микробов /С. М. Белоцкий, О. Б. Фнлпкова, С. Б. Пашутин к др. //Кури.микроб.,эпидем. и имчунобиол..-1986.-ЯЗ.-С.89-92.

2.Днковскшя Е.С.,Белоцкий С.М..Актжвность РЭС h факторов защиты в первичном очаге при экспержмгнгалтиой стафилококковой инфекции/Актуальные вопроси теоретической в прикладной ннфекцяошгсй иммунологии,механизмы прогивоинфекционного ницуяатета:Тезисы II Всесоюзной конференция.-Саратов.-1987.-С.41-42.

3. Лгадаголзависимая хемнлшннесценция первичного очага при различных заражающих дозах Stephllococcua аигеия /С.М.Белоцкжй, Е.С.Дпсовская.В.Г.Петухов/Дурн.микроб. .зпнден. и иммунобиол.-1987. -№3.-С.53-55.

4. Диковская Е.С. .Белоцкий С.М. Лшинолзавнсиыая хемнлшетгес-ценция селезенки при экспериментальной стафилококковой инфекции// Дурп.микроб. .эпддеи. и им«(унобиол.-1988.-№5.-<3.119.

5.Диковская Е.С..Белоцкий С.Ы. Сравнительная характеристика фагоцитов в селезенке .периферической крови и первичном очаге при экспериментальной стафилококковой нжфехцни по тесту хйшлхшнес-ценции//Факторы клеточного н гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях :Тезнсн докладов к II ыежннститутской научной конференции.-Челябинск.-IS88. -С.35-36.

6. Характеристика первичного очага при гнойной нв$екцга/Е. С. Диковская, Т.Н. Лукоянова, Л. О. Шкроб и др.//Тезисы I Всесоюзного ншу-нологического съе зда.-Сочи.-1989.-T.I.-С.213.

7.Общий и местный нмцунитет у больных с анаэробной неклострн-диальной инфекцией мягких тканей/Е.В. I^ny,Е.С.Диковская,0. Б.Фжлю-кова и др.//Анаэробная неклостридиальмш инфекция в гнойной хирургии ¡Тезисы Всесоюзного симпозиума.-Тернополь.-1989.-С.15-Г7.

8.Диковская Е.С. Уровень метаболического резерва и сывороточных факторов в ткани первичного очага/Днрургический сепсис:Тезисы докладов II Всесоюзной конференции.-Т^ла.-1989.-С. 21.

9.Активность фагоцитов в тканях гнойных ран у больных гнойной хирургической инфекцией/Б.В. 1^цу,Е.С.Диковская,В.А.Карлов,С.М.Бе-лоцкий//Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях:Тезисы XI Всесоюзной научной конференции.-Челябинск.-1990.-С.39.

10. Wound tissue respiratory buret and local microbial inflan-mation/i l£Belotsky, К V. Ouzu, Y. «. Karlov et al. //inflamrtio«;-199&-Y. 16. -P. 663-663.

Актуальность вопроса. Проблема диагностики и лечения сепсиса продолжает стоять в центре витания иммунологов и клиницистов. Актуальность ее определяется тем, что сепсис нередко осложняет течение различных заболевании. Хирургический сепсис, возникающий в настоящее время при гнойных осложнениях травм острых и хронических гнойных хирургических заболеваниях и вслед-ствиии нагноения чистых операционных ран изучен и освещен слабо. Течение и исход сепсиса в значительной мере определяются успешностью лечения первисного очага.

Первичными гнойными очагами при сепсисе чаще всего являются гнойные хирургические инфекции или гнойные раны. Сепсис развивается, вероятно, в результате истощения антиинфекционного иммунитета под воздействием первичного очага. Неконтролируемое повышение числа микробов в месте внедрения инфекции и относительный дефицит факторов защиты вначале приводят к развитию местного гнойного процесса ( первичный гнойный очаг ) (Костюченок Б.М., Светухин A.M.,1990). Если в результате мобилизации факторов иммунной защиты или адекватного лечения эта ситуация, не изменяется, размножение микробов в очаге ведет к повреждению клеток и тканей организма и системы, в результате чего развивается вторичный иммунодефицит (Костюченок Б.М., Светухин A.M.,1990). Многообразие нарушений факторов защиты вызывает необходимость иммунологического обследования, включающего характеристику фагоцитов ( Valdimarsson Hs? 1980). Защита от гнойной инфекции слагается из кооперации факторов естественной резистентности и компонентов иммунного ответа. При изучении экспериментальных моделей гнойной инфекции, видно, что ее развитие вызывает, .„рондо всего, реакцию факторов иммунной защиты непосредственно в первичном очаге (Krizeck t.j.,

Robson M.C., 197 5,Thomspn P. et al.,1986).

Интенсивное изучение взаимодействия макроорганизма с микроорганизмами в первичном очаге началось еще в 50-60-е годы Burke J.F.,Miles A.A., 1958;Cohn Z.,1962; Kapral F.A. 1959.,

Agarwal D.S.,1967) И уже В последнее время, (van Dissel J.Т.,1986, Hart р.н. etal.1986).

Состояние первичного очага, особенно в первые часы после заражения, играет определяющую роль в развитии гнойной инфекции. Первичный очаг является источником распространения микробов и токсинов. Поэтому все мероприятия при лечении гнойной инфекции сводятся либо к устранению очага, либо к обезвреживанию микробных продуктов. Поэтому оценка состояния защитных сил в очаге может, в известной мере, определять лечебную тактику.

Состояние первичного очага можно оценивать по уровню микробной обсемененности ткани, по морфологической характеристике ткани очага, а также по функциональным свойствам нейтрофилов в ткани очага ( Hart Р.Н. et al.,1986.) )•

Оценка состояния очага затрудняется малым числом количественных методов. В последнее время появилась возможность преодоления этих трудностей с помощью метода хемилюминесценции. В основе этой реакции лежит вовлечение кислорода в образование высоко-реактогенных молекул, излучающих свет или вызывающих его эмиссию из других соединений ( Маянский А.Н.,Маянский Д.Н.,1989). Данная реакция измерения коррелирует с бактерицицностыо нейтро-|ила на s.aureus . Хемижмтесцещия нейтрофилов сочетается С ИХ антибактериальной активностью (zimmerman G.А.,1983; Lineawear W.et al., 1980 )•

Цель работы. Разработать и охарактеризовать количественный метод оценки уровня защитных сил в первичном очаге и установить их связь с течением экспериментальной стафилококковой инфекцией.

- 6

Задачи исследования.

1. Разработать метод прямой оценки уровня и динамики факторов защиты в первичном очаге.

2. На модели экспериментальной стафилококковой инфекции у морских свинок установить влияние дозы вводимого антигена на динамику факторов защиты в первичном очаге.

3. Определить состояние метаболического резерва и дефекта опсонинов в первичном очаге при различном течении экспериментальной гнойной инфекции.

4. Изучить уровень защитной реакции в первичном очаге у больных с гнойной инфекцией и ее связь с системной реакцией организма.

Научная новизна. Впервые разработан метод, позволяющий оценивать состояние факторов защиты непосредственно в первичном очаге. Установлено, что для благоприятного течения стафилококковой инфекции на раннем этапе после заражения необходим высокий уровень функциональной активности фагоцитов в ткани очага и низкий в периферической крови.

Выяснено, что критическим сроком при развитии стафилококковой инфекции являются 3-й сутки после заражения. Если на этом сроке наблюдается супрессия миграции нейтрофилов в очаг, функциональной активности фагоцитов в очаге и периферической крови, то воспалительный процесс заканчивается летальным исходом.

Установлено, что резерв метаболической активности фагоцитов в первичном очаге зависит от величины микробной нагрузки.

Показано, что массивная- кровопотеря вызывает гиперстимуляцию нейтрофилов периферической крови и снижает их бактерицидную активность.

Показано, что превышение концентрации микробов в I г ткани очага I08 КОЕ/г больных приводит к подавления функциональной

- 7 активности фагоцитов.

Установлено, что процессу заживления соответствует снижение активности фагоцитов в ткани первичного очага, при одновременном возрастании метаболического резерва.

Практическая значимость.

В результате проведенных исследований разработана экспериментальная модель и метод оценки активности фагоцитов непосредственно в ткани очага, что может быть использовано для изучения лечебных препаратов и для выяснения патогенеза инфекции.

Установлено,что активность фагоцитов в ткани очага коррелирует с микробной обсемененностью и клеточным составом ткани очага и может служить объективным критерием оценки фазы и тяжести течения раневого процесса.

Предложенный метод может быть применен в клинике для. оценки эффективности местных ж общих лечебных мероприятий, радикальности операций, а также для прогноза осложнений.

- 8

выводы

1. Впервые разработан метод быстрого определения состояния факторов местной защиты путем измерения уровня респираторного взрыва фагоцитов в гомогенате ткани первичного очага.

2. Разработана и внедрена в практику модель обследования животных, позволяющая избежать влияния стрессорных факторов на функциональную активность нейтрофилов периферической крови и тем самым установить истинные значения.

3. Установлено, что миграция нейтрофилов в ткань очага, уровень функциональной активности фагоцитов в ткани очага и периферической крови зависят от дозы вводимого антигена и могут быть использованы как прогностические критерии в оценке исхода раневого процесса.

4. Резерв метаболической активности первичного очага зависит от интенсивности миграции нейтрофилов и от величины микробной нагрузки; по мере разрешения воспалительного процесса этот резерв увеличивается. При высокой степени обсемененности первичного очага наблюдается дефект опсонинов.

5. У больных с гнойной хирургической инфекцией .динамика местного ХЛ-ответа коррелирует с течением заболевания, интенсивность местного ХЛ-ответа снижается по мере заживления раны.

- 132

- 12 X -ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гнойная хирургическая инфекция, в частности, стафилококковая, сопровождается развитием вторичных иммунодейицитов. Травма, операция или внедрение возбудителя в организм в обход местных факторов защиты приводит в первые часы к относительному дефициту этих факторов, что создает благоприятные условия для размножения микроба. Его токсины, повреждая окружающие ткани подавляют резистентность организма, в результате чего образуется местное воспаление, которое при определенных условиях может перейти в генерализованный процесс.

Для. оценки состояния первичного очага при гнойных инфекциях используют различные методы. Степень тяжести заболевания оценивают прежде всего клинически, а также по некоторым лабораторным данным, из которых наиболее часто применяют способ определения концентрации микроба в I г ткани очага. Существует способ оценки тяжести гнойной инфекции по определению уровня обсемененности первичного очага, который заключается в том, что на операции берут участок гнойной раны, гомогенизируют его и высевают на специальные питательные среды ( Robson м., Krizek Т., 1973).

Известен способ определения, степени тяжести гнойной инфекции, который заключается в том, что из гнойной раны берут участок пораженной ткани, делают из него окрашенные препараты и под микроскопом оценивают относительное число лейкоцитов как факторов иммунной защиты ( Burke J.F.,Miles а.а.,1958).Недостатком этого способа является невысокая, точность определения, основанного на относительном числе лейкоцитов, что само по себе неоднозначно характеризует состояние иммунных сил организма больного,и, кроме того, сложность и продолжительность исследования - более 48 часов.

В немногих работах изучали изначальную активность поли-морфноядерных нейтрофилов, выделенных из очага микробного воспаления ( Klempner М., Gallin J., 1978, Skau Т. et al., 1986, Kopaniak M.H.Movat H., 1983,Zimmerli W. et al., 1982, Hart P.H. et al., 1986).

Однако исследование изолированных полиморфноядерных нейтрофилов не дает полного представления об уровне локальных факторов защиты. Во-первых, активные полиморфноядерные нейтро-филы прочно прикрепляются к окружающим тканям (это является одним из признаков их активации) и их вообще трудно изолировать. Тем более это относится к клеточному составу первичного очага в решающем периоде, то есть тогда,когда закладываются предпосылки для исхода инфекционного процесса. Во-вторых, антибактериальными свойствами обладают непрофессиональные фагоциты (фибробласты,клетки эндотелия). Здесь, также, трудно учесть активность опсонинов в очаге. И,наконец, не было проведено сопоставления реакции в первичном очаге с таковой в ретикулоэцдо-телиальной системе и в периферической крови, то есть отсутствовала общая, характеристика процесса.

В разработанном нами методе удалось осуществить определение активности Факторов иммунной защиты организма непосредственно в зоне очага. Для. этого в качестве объекта исследования, использовали гомогенат ткани из очага поражения и в нем способом люминол-зависимой хемилюминесценции количественно определяли содержание метаболитов кислорода.

При использовании в нашей работе этого теста непосредственно в первичном очаге, удалось выяснить уровень функциональной активности нейтрофилов при различных дозах микробов на разных этапах заболевания.

Механизм спонтанной хешлюминесценции фагоцитов отражает суммарную активность кислородных и других радикалов, люминол-зависимая хемилзоминесценция формируется в системе миелоперокси-дазы, а люцигенин-зависимая - супероксидного аниона. В основе реактивной хемилюминесценции лежит прямое или опосредованное вовлечение кислорода в образование высокореактогенных молекул, излучающих свет либо вызывающих его эмиссию из .других соединений (Маянский А.Н., Маянский Д. Н. ,1989). Данная, реакция измерения. уровня, респираторного взрыва хорошо коррелирует с бактерицид-НОСТЬЮ нейтрофила. на s. aureus ( Ewetz L. et al., 1981). Хешлюминесценция нейтрофилов обычно сочетается с их антибактериальной активностью ( Weich W.D., 1980, Johansen K.S. et al. , 1983). Подавление или усиление респираторного взрыва и бактери-ЦИДНОСТИ ПРОИСХОДИТ синхронно ( Horan Т. et al., 1982). Эти данные говорят о тесной связи между бактерицидноетью фагоцитов и их респираторным взрывом (хемилюминесценцией). При высокой концентрацией микробов в первичном очаге инфекции наблюдается гиперактивация фагоцитов сначала в самом очаге, а затем и за его пределами. Нередко при генерализованной гнойной инфекции вследствии этого возникает повреждение тканей и органов агрессивными метаболитами фагоцитов ( Burleson r.l., 1973). При этом могут развиваться поражения сосудов,почек,печени,наблюдаться острый респираторный дистресс.

Кроме использования в нашей работе теста хемилюминесценции проводились исследования по морфологической оценки миграции нейтрофилов в первичный очаг.

На разработанной нами модели экспериментальной стафилококковой инфекции у морских свинок можно проследить влияние величины заражающей дозы на динамику выработки метаболитов кислорода фагоцитами в первичном очаге и периферической крови, интенсивность генерализации и исход инфекции.

При разработке модели было изучено влияние интенсивности генерализации на уровень активности фагоцитов в первичном очаге, периферической крови, миграции нейтрофилов и числом микробов в ткани очага.

При введении малой заражающей дозы микроба (10® КОЕ/мл), в первичном очаге на I сутки наблюдается высокий уровень защитных сил организма, низкой миграцией нейтрофилов в очаг и среднем уровнем микробной обсемененности очага. Данное состояние защитных сил организма благоприятно влияет на дальнейшее течение инфекции и может быть связано с ограничением процесса пределами первичного очага.

При заражении животных сублетальной дозой (I09 КОЕ/мл) происходит повышение функциональной активности фагоцитов в первичном очаге на 3-6 сутки после заражения с адекватной реакцией нейтрофилов в периферической крови, увеличении миграции нейтрофилов в очаг и наличием максимума микробной обсемененности очага. На последующих сроках (9 сутки)наблюдается, снижение функциональной активности фагоцитов в ткани очага и нейтрофилов периферической крови. На этом сроке миграция нейтрофилов в очаг достигает пика, что коррелирует с отменой их рефрактер-ности и благополучным исходом. Данное течение, вероятно, соответствует клинической картине местной инфекции. тп

При заражении животных летальной дозой (10 КОЕ/мл) на ранних этапах после заражения наблюдается подавления, функциональной активности фагоцитов в ткани первичного очага,увеличение активности нейтрофилов в циркуляции, наступает рефрактерность в нейтрофилах,мигрировавших в очаг и увеличение числа микробов ране. Подавление функциональной активности на этом этапе после заражения сочетается с дальнейшей гибелью животных.

По данным литературы данное состояние факторов защиты у морских свинок соответствует таковому у больных, неподдающихся лечению (Карлов В.А., Белоцкий С.М.,1983).

Если принять сублетальную дозу (I09 КОЕ/мл) как дозу благоприятного течения инспекции и сравнить с показателями при этой дозой данные, полученные при заражении летальной дозой тп

10 КОЕ/мл) можно получить следующие результаты.

На I сутки при летальной дозе наблюдается стимуляция функциональной активности фагоцитов в циркуляции токсинами микробов, вышедших из первичного очага. На 3 сутки происходит отмена стимуляции фагоцитов в циркуляции и увеличение их супрессии. К концу воспалительного процесса (6 сутки) супрессия снимается, что связано с невозможностью фагоцитов очага реагировать на микроб сильнее и задержать выход микробных токсинов в периферическую кровь. Данное снятие супрессии становится бесполезным, так как именно на этом этапе происходит максимальная гибель животных.

Итак, для, получения благоприятного течения, экспериментальной стафилококковой инфекции необходам определенный уровень и динамика респираторного взрыва, в основном, в ткани первичного очага.

Высокая метаболическая активность нейтрофилов может неблагоприятно влиять на инфекционный процесс (Борткевич Д.Г. с соавт.,1987), что сочетается с результатами полученными в наших исследованиях (XII-ответ в первичном очаге на 6-9 сутки при летальной дозе микробов).

Исходя их наших данных состояние защитных факторов на 3 сутки после заражения является определяющим для. дальнейшего исхода инфекционного процесса. Если на эти сутки происходит снижение миграции нейтрофилов в очаг, уменьшение функциональной активности фагоцитов в ткани первичного очага и периферической крови, то дальнейшее течение воспалительного процесса, как правило, неблагоприятно и заканчивается в 70% случаев летальным исходом. При анализе результатов, полученных при исследовании селезенки были получены аналогичные данные.

По литературным данным известно, что нестимулированная реакция фагоцитов периферической крови больных увеличивается пропорционально концентрации микробов в первичном очаге инфекции (Филюкова О.Б.,Снастина Т.И.,1987). Это указывает на то, что нейтрщфилы в циркуляции подвергаются стимуляции первичного ючага, что снижает их бактерицидный потенциал при последующем контакте с микробами. Антибактериальная активность нейтрофилов периферической крови может быть снижена более,чем у половины больных С гнойной инфекцией ( Solbeg C.D. et а 11976).Считают, что снижение бактерицидности относится к незрелым или"токсичес-ким" нейтрофилам ( Мс Call С.е.,Caves J., 1970, Helium К.В., soiberg с.о., 1977). В дальнейшем выяснилось, что дефект нейтрофилов не связан с их незрелостью ( Basse c.f., 1984) или связан, но очень незначительно, особенно в циркуляции ( Glasser L., Fiederlin R., 1987). РеСПИраТОрНЫЙ ВЗрыВ Не зависит ОТ наличия юных или токсических нейтрофилов ( Bass d.a., 1986). Вероятно, что наличие токсических нейтрофилов при сепсисе вызвано, скорее активацией клеток, чем их незрелостью (мс Call С.Е. et al., 19691969).

По нашим данным по исследованию респираторного взрыва в первичном очаге и периферической крови получилось, что при высокой микробной обсемененности первичного очага наблюдается выход микробных токсинов в кровь, что приводит к гиперстимуляции нейтрофилов периферической крови. В этом случае фагоциты ткани раны не могут осуществлять свою барьерную роль, что приводит в дальнейшем к неблагоприятному исходу воспалительного процесса. В случае невысокой концентрации микробов в первичном очаге и соответственно адекватной реакции фагоцитов первичного очага, фагоциты в состоянии сдержать выход микробных токсинов, что приводит к снижению респираторного взрыва в периферической крови и дальнейшему благоприятному исходу заболевания.

Макроорганизм обладает многокомпонентной системой защиты от возбудителей гнойной инфекции. Поэтому, обычно их опасность появляется вследствии бездеятельности фагоцитов из-за какой-либо причины. Первое место среди этих причин занимает операция.

В процессе работы над отработкой модели экспериментальной инфекции у животных нами было выяснено, что"чистая" операция может вызвать гиперстимуляцию в циркуляции, а также снизить их бактерицидный потенциал.

Размножение микробов в первичном очаге вне зависимости от интенсивности процесса в нем может качественно изменить взаимодействие возбудителя с опсонофагоцитарной системой. В первую очередь это зависит от свойств микроба и от его антифагоцитарных свойств. Эти свойства могут обеспечить увеличение жизни микроба внутри фагоцита, причем у патогенных микроорганизмов продолжительность жизини внутри фагоцита в 2-4 раза больше,чем у непатогенных микробов. Особенно это выражено у клинических

ИЗОДЯТОВ ( Wood W.B. et al . , I960, Rogers D.,

Rowley d., 1966). Превалирование микробного фактора над уровнем защиты имеют качественную сторону. Истощение опсонофагоцитарной системы приобретают специфичность - аутоштаммы возбудителей избирательно становятся более резистентными к антибактериальному действию нейтрофилов первичного очага (Сарки-COB Д.С. С соавт.,1983, Hart P.H. et al., 1986), что затем распространяется и на циркулирующие нейтрофилы (Рубенович Г.Л. с соавт., 1982). Наши данные свидетельствуют ,что функциональная активность нейтрофилов первичного очага зависит от концентрации микробов в нем. Концентрация микробов, превышающая 10° КОЕ/г подавляет респираторный взрыв фагоцитов первичного очага и ведет к быстрому связыванию реактивных метаболитов кислорода. При увеличении микробной обсемененности очага больше 10^ КОЕ/г происходит возрастание выработки метаболитов кислорода в монокультуре и в ассоциациях почти в 10 раз.

С первых минут в ране развивается воспаление, направленное на защиту от микробов и на удаление нежизнеспособных тканей. Основными клетками очага воспаление являются нейтрофилы и моноциты/макрофаги (Маянский А.Н.,Маянский Д.Н.,1983,3емск0в В., 1984, Щрейдлин И,С.,1984). Именно они в первые дни препятствуют развитию генерализованного инфекционного процесса. Состояние гранулоцитов при травме оказывает существенное влияние на течение травматического процесса. Функциональную активность фагоцитов в репаративных стадиях в наших исследованиях определяли также по уровню ХЛ-ответа. В результате было выяснено, что на ранних этапах регенерации фагоциты обладают наибольшей активностью, в дальнейшем их функциональная активность падает. На поздних этапах происходило увеличение роли макрофагов в процессе очищения раны от микробов, что совпадало с регенерацией ткани и заживлением раны.

Функция опсоно-фагоцитарной системы имеет решающее значение в защите от гнойной инфекции. Прикрепление опсонизирован-ного микроба к фагоциту осуществляется преимущественно через рецепторы для I g g, I g M и комплемента. Часть микробов погибает уже в процессе этого связывания за счет выделения бактерицидных продуктов в окружающую среду. Опсонизация во многом определяет исход взаимодействия микробов с фагоцитами, особено потому, что в роли опсонинов выступают естественные антитела, которые преимущественно вырабатываются цри гнойной инфекции (Белоцкий С.М.,Карлов В.А.,1985). Качество опсонизации влияет на качество фагоцитоза . Особенно неблагоприятны ситуации, когда недостаток опсонинов сочетается с патологией самих фагоцитов. Опсонический дефект очень трудно устранить, даже за счет большого числа фагоцитов (Маянский А.Н., Маянский Д.Н.,1989). Дефект опсонинов может коррелировать с развитием гнойных осложнений ( weinstein R.J.,Young L.sI976), HO OH Же Играет Наибольшую роль, когда имеется и дефект фагоцитарной активности нейтрофилов ( Alexander J.W., 1979).

В наших исследованиях было выяснено, что малая заражающая доза введенного микроба вызывает адекватную реакцию полиморфно-ядерных нейтрофилов на микробы. При этом обнаруживается равновесие между активностью полиморфноядерных нейтрофилов и микробами и, поэтому метаболический резерв не нужен. При сублетальной дозе (10^ КОЕ/мл) заражения наблюдалось полное истощение резерва, несмотря на интенсивную миграцию полиморфноядерных нейтрофилов (ГШ) на ранних сроках после заражения. При введе

-г г> нии летальной дозы заражения (10 КОЕ/мл) резерв присутствует на I сутки после введения микробной взвеси, но затем из-за прессинга, большого числа микробов в очаге, происходит резкое снижение резерва, вплоть до его полного истощения к 6 суткам (массовая гибель животных происходит также в это время). При наличии сниженного резерва в центре очага, на периферии его присутствует резерв системы фагоцитов,в которых микробный прессинг выражен довольно слабо, Резерв метаболической активности фагоцитов первичного очага зависит от интенсивности миграции и от величины микробной нагрузки. По мере разрешения инфекционного процесса этот резерв возрастает. Дефицит опсонинов выражен преимущественно в начальном этапе после заражения

- 130

I сутки) при летальной дозе, а при сублетальной - происходит обратный эффект, что благоприятно сказывается на состоянии животных.

При использовании метода хемилзоминесценции для оценки уровня опсонинов и метаболического резерва самих нейтрофилов, мы наблюдали локальное отсутствие дефекта опсонинов в ткане раны. При этом в нормальной ткани ( то есть ткани, взятой в процессе операции из визуально интактных участков) наблюдался метаболический резерв фагоцитов. По мере очищения раны от микробов и в процессе заживления, резерв ткани очага возрастает. Таким образом, интенсивность локального ХЛ-ответа возрастает по мере увеличения концентрации микробов и снижается по мере заживления раны. При заживлении возрастает доля, макрофагальной реакции и появляется метаболический резерв. Аналогичные данные были получены нами при экспериментальных исследованиях. При высокой степени заражения присутствовал дефект опсонинов и был снижен метаболический резерв фагоцитов, в то время как, при малой заражающей дозе на ранних этапах, резерв метаболической активности фагоцитов и опсонинов присутствовал.

- 131