Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Хемилюминесцентный анализ реактивности нейтрофилов при гнойной раневой инфекции

минжтерство здравоохранения рсйср I московский нтт-исвдговАШюкий институт

тдции |

эпидемиологии И микробиологии им. Г.Н.гавркчевского ---

На правах рукописи ШЛЯЮВА Ольха Борисовна

ХЕШШМШЮ1ЩШЙ анализ решивносш нейтрошов при гнойной раневой инфекции 14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в Институте хирургии им. А.В.Вшшевского АШ СССР.

Научный руководитель доктор медицинских наук Белоцкий С.М.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Ляшенко В.А., доктор медицинских наук Коркина Л.Г.

Ведущая организация - ордена Трудового фасного Знамени научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи АМН СССР.

Защита диссертации состоится " " 1991 года

на заседании Специализированного совета К CB4.I8.02 в МВИИЭМ им. Г.Н.Габричевского МЗ РСОСР по адресу: 325212, Москва, ул. адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНШЭМ им. Г.Н.Габричевского МЗ РС2СР.

Автореферат разослан " " 1991 года.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

ОЗ.Котелышкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что в последнее время имеются значительные достижения и области антибиотике- и иммунотерапии, лечение больных с гнойной раневой 'инфекцией продолжает оставаться одной из основных проблем хирургии (Кузин М.И., Костю-ченок Б.М., 1990). Ведущая роль в защите от гнойной инфекции принадлежит опсоно-фагсцптарной системе (05С), которая представляет собой функциональное единство клеточных и сывороточных факторов. Будучи филогенетически наиболее древней, 01С обеспечивает сохранность макроорганизма и именно от ее активности во многом зависит течение и исход гнойной инфекции (Маянакий А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Поэтому принципиальное значение тлеет разработка и включение в комплексное иммунологическое обследование этой категории больных новых и высокоинформативных методов оцени? ОЗС. Тяжесть состояния пациентов, полиэтаологичность и быстро ыенянцаяся картина гнойно-септических заболеваний, экстренность принимаемых врачом мер диктуют повышенные требования к лабораторным службам, что обосновывает необходимость внедрения объективных и точных экспресс-методов оценки ОЯС.

Нейтрофил, как часть опсоно-фагоцитарной системы, выступает в качестве первой линия защиты от большинства инфекционных агентов (Адо А.Д., Маянский А.Н., 1983). В настоящее вреда существует довольно много способов определения функциональной активности нейтрофнлов. Например, изучает юс хемотаксис, адгезию к различным поверхностям, фагоцитоз частиц микробного и немикробного проис-ховдения, бактерицидноеть клеток по высеву на агар. Но с помощью фагоцитоза учитываются живые на данный момент тестмикробн, но не учитываются убитые и ранее дезинтегрированные. Прямое определение

1—211/7

бактерицидаости по высеву на агар - это чрезвычайно трудоемкий тест, результаты которого читаются не ранее, чем через 18-24 часа, что ограничивает его применение в клинике для рутинных исследований (Гордиенко С.М., 1984). Кроме того, субъективность в учете результатов этих тестов существенно снижает их информативную ценность и затрудняет сравнение данных, полученных разными авторами. Всех этих недостатков лишен метод хемилшинесцентного анализа (ХП), который можно использовать для регистрации респираторного взрыва нейтрофиов, т.е. совокупного уровня активных радикалов кислорода, являющихся ооновными микробицвдными агентами фагоцитирующей клетки (Зениов Н.К., Куликов В.Ю., 1985). Высокая корреляция ХЛ-свечения с бактерицидным потенциалом нейтрофила (Но-, ran T.D.I982; Solberg с.о., 1982), доступность и простота постановки данного теста, небольшие объемы исследуемого материала и малое время проведения анализа (2-3 часа), строгая объективность получаемых данных и возможность полной автоматизации при постановке реакции и учете результатов - все это делает тест XJL перспективным для массового обследования как больных, так и здоровых лвэдей.

Стимулированная ХЛ позволяет получить кинетическую характеристику процесса взаимодействия клетки и фагоцитируемого объекта. Она дает возможность изучить все фазы непосредственного контакта фагоцита с микробом, начиная от ранних стадий экзоцитоза, т.е. мембранно-рецепторных взаимодействий (прилипание,.прикрепление, интернадизация) и кончая, заключительным эффектом - эндоцитозом (образование фагосомы и цитотоксическое воздействие активных метаболитов кислорода) (Яр'кова Л.Н. и соавт., 1986*, Briheim G. et al., 1984).

Однако в настоящее время имеются лишь единичные работы, где

освещается связь респираторного взрыва фагоцитов, измеренного методом ХЛ, с формами и динамикой развития гнойной инфекции, т.е. отсутствует клинико-биологическая характеристика теста (Разживин А.П., 1987; Уегипё з. «г а1., 1988). Поэтому актуальным является выяснение закономерностей изменения ХЛ-ответа нейтрофилов применительно к данной группе пациентов, разработка соответствуицей тест-системи и оценка ее информативности.

Цель работу, разработать способ оценки функциональной ак- . тивности нейтрофилов человека методом лшинолзависимой хемилюми-несценции и использовать его дая мониторинга опсоно-фагоцигарной системы больных с гнойной раневой инфекцией и дая прогноза течения заболевания.

Задачи исследования:

1. Используя клетки здоровых доноров, выяснить методические особенности реакции XI в ответ на различные убикзнтарные микроорганизмы и разработать оптимальную тест-систему для оценки кис-лородозависимого метаболизма нейтрофилов.по уровню ХЛ.

2. Определить клиническую значимость этих показателей применительно к гнойной раневой инфекции.

3. Использовать тест-систему для характеристики функционального состояния 08С больных с местной и генерализованной формами гнойной раневой инфекции, для оценки эффективности проводимого лечения и для прогноза дальнейшего течения заболевания.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ хеми-лшинесценции нейтрофилов периферической крови здоровых лэдей в ответ на ряд микроорганизмов - возбудителей гнойной инфекции. Показано, что профиль ХЯ-реакции однозначно определяется видовой принадлежностью стимулятора. Изучено влияние штаммовых различий-золотистого стафилококка на его способность генерировать ХЛ-ответ.

Обнаружено, что наряду с общими закономерностями, обусловленными свойствами штаммов s.aureus i, высота ХЛ-ответа зависит также от индивидуальных особенностей клеток донора. Впервые изучено влияние первичного гнойного очага инфекции на состояние опсоно-фагоцитарной системы, измеренное в тесте лшинол зависимой хеми-лшинесцешши. Доказано, что уровень ХЛ-ответа нейтрофклов периферической крови прямо коррелирует со степенью микробной обееме-ненности гнойного очага.

практическая ценность. В ходе исследования разработан способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека при помощи лкминолзависимой ХЛ. Создана оптимальная тест-система, поз-волялцая в короткий срок дать характеристику ОФЗ больных с гнойной ракевой инфекцией и выявить источник нарушений ее работы: дисфункцию клеток или дефицит опсонинов. Выведенные параметры реакции ХЛ в норме и при различных формах гнойной инфекции; определена их клиническая значимость. Проанализирована связь.между ХЛ свечением нейтрофнлов больных и а) характером оперативного вмешательства, б) шмунокорригвдгпцей терапией препаратом лейкин-ферон. Для постановки рутинного теста XI обосновано применение препарата "Стафилококковый реагент, содержащий белок А, сухой" в качестве.стандартного стимулятора.

Предложенный способ внедрен в практику лабораторных исследований в Институте хирургии игл. А.В.Вишевского АМБ СССР, в Институте общей реаниматологии AMI СССР, в Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболоткогс АН УССР,

Основные полоиеккя. выпосимне на защиту;

I. 7 больных с гнойной раневой инфекцией наблюдается стимуляция респираторного взрыва нейтрофилов периферической крови, определяемая в тесте XI. С помощью разработанной тест-системы реак-

ции лзсминол зависимой хешшшнеоденции можно выявить степень и источник нарушений работы 0$С.

2. По мере увеличения концентрации мищюбов в первичном гнойном очаге нарастает стимуляция нейтрофалов> периферической крови, что сопровождается снижением их бактерицидного потенциала.

3. Хирургическое вмешательство на первичном очаге, а также иммунокоррекция препаратом лейкинферон, нормализует состояние 00С, измеренное в тесте ХЛ.

4. При гнойной раневой инфекции обнаруживается тесная корреляция показателей ХЛ нейтрофилов периферической крови с клинической и бактериологической картиной заболевания, что позволяет использовать разработанную тест-систему в качестве критерия эффективности лечебных мероприятий и для прогноза дальнейшего течения заболевания.

Дпробзщя •работы. Диссертация апробирована на совместной научной конференции Лаборатории микробиологии о группами иммунологии и клинической фармакологии и отделения ран и раневой инфекции Института хирургии им. А.В.Вишневского МИ СССР 28 февраля 1990 г. и на заседании подсекции Ученого, совета "Общая и прикладная иммунология" МНЮШ им. Г.Н.Габричевского МЗ РС2СР 15 тая 1990 г.

Материалы диссертация доложены на Всесоюзной конференции "Теоретические цроблеш эпидемиологии и иммунологии на современном этапе" (Нальчик, 1986), П Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы теоретической и прикладной иммунологии: механизмы цроти-воинфекционното иммунитета" (Саратов, 1987), X региональном симпозиуме социалистических стран по интерферону - "Интерферон-88" (Юрмала, 1988), П Всесоюзной конференции "Хирургический сепсис" •. (Тула, 1989), Всесоюзной конференции по сепсису "Актуальные воп-

2-211/У

5

росы сепсилогии" (Тбилиси, 1990), конференции молодых ученых йв-отитута хирургии им. А.В.Вшневского АМН СССР (Москва, 1990), конференции по применению интерферона - "Интерферон-90" (Ленинград, 1990), заседании Всесоюзного научного 'общества иммунологов (22,01.90), заседании Общества хирургов г. Москвы и Московской области (05.04.90);

Публикации. По теме диссертации опубликовано II печатных работ; список приведен в конце автореферата.

' Дбъем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 91 отечественный и 166 иностранных источников. Работа изложена на 116 листах машинописного текста и содержит 10 рисунков и 17 таблиц.

. СОДЕРШИЕ РАБОТЫ

Материалы ц .методы исследования. Работа выполнена в лаборатории микробиологии о группами иммунологии и клинической фармакологии Института хирургии, им. А..В.Вишневского АМН СССР.

Материал исследования. В ходе работы было проведено в общей сложности около 700 анализов К реакции нейтрофидов периферической крови в различных вариантах ее постановки. Обследовано 65 здоровых доноров и 132 больных о различными формами гнойного процесса: лостинъекционные абсцессы, флегмоны, карбункулы, фурункулы, гнойные лактационные маститы, обширные гнойные раны мягких тканей конечностей и туловища. Из тих 70 пациентов были с местной формой, а 62 - о генерализованной формой, гнойной инфекции. Возраст больных колебался от 14 до 71 года.

Методы исследование« Нейтрофюш и лимфоциты фракционировали на холоду на градиенте плотности фихолла-верографана ( 0 » 1,077

г/ом3). Выделенные клетки взвешивали в растворе Хенкса в концентрации - нейтрофилы 1хЮ6/ш1, а лимфоциты - 2хЮ®/мл. Чистоту популяции контролировали микроскопически опаской по Романовско-му-Гимзе. Жизнеспособность определяли по тесту с трипановда синим - не менее 96$.

Регистрацию ХЯ-ответа нейхрофдлоз проводили на установке, собранной из промышленных, серийных блоков (ртлс. I).

Тест-система состояла из: I мл суспензии нейтрофилов + 0,1 мл раствора лшинола (в конечной концентрации 1СГ® М) + 0,1 мл аутологичной сьторотки (или пула донорских сывороток группы 1фови AB) + I мл суспензии стимулятора заданной концентрации (или фосфатного буферного раствора - в контроле). Реакцию ставили в стеклянных оиликонизированных флаконах, которые термостатировали в водяной бане при температуре 37°С. Все используемые растворы и посуда предварительно подвергались тедаовой адаптации; исследования проводились в затемненном помещении. Измерения начинали через 10-15 минут после внесения всех ингредиентов и продолжали в течение 50-90 минут с пятиминутным интервалом. Пробы ставили в дашликатах и фиксировали по три последовательных измерения на каждом времени счета. Определяли абсолютные, значения пиков ХЛ свечения нес табулированных (БС-конгрсль) и с.ткмулированных (СТ-опыт) нейтрофилов в импульсах в секунду и время их наступления. Для оценки .резервных возможностей рассчитывали относительную величину (в условных единицах) индекса стимуляции:

. из .пикет-пик,не явДя пик Ш

В качестве стимуляторов в реакции ХЛ били испытаны: а) клинические изоляты, выделенные в лаборатории микробиологии от больных отделения ран и раневой инфекции Института хирургии им. A.B.

Рис.1.

схемА УСТАНОВКИ

Вишневского АМН СССР: Escherichia coll - 7550; Peeudomonas aeruginosa - 1905; Proteus mirabilis - 5047; Candida ep. -6016; Staphylococcus epldermidia - 5030; Staphylococcus aureus - 5061, 5055, 7510, 1890; б) музейный штамм Staphylococcus aureus cowan - I, полученный из лаборатории стафилококковых инфекций НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи АМН СССР. Для исследований использовали как живую, так и инактивироваыную культуру золотистого стафилококка.

Опсонизадаш стимулятора проводили в термостате при температуре 37°С в течение получаса при медленном перемешивании (4 оборота в минуту). Для опсонязации брали свежую аутологкчную или свежезамороженную донорскую сыворотку (ipynnn 1фови АВ - пул не менее, чем от 10 здоровых доноров; хранили при -70°С).

Количественное определение степени микробной обевмененноети гнойной раны (концентрация микроорганизмов в.1 г ткани раны), проводилось согласно методическим рекомендациям, изложенным в руко- ' водстве "Бактериологическая диагностика раневой инфекции" (1984).

' Определение абсолютного и относительного содержания субпопуляций лимфоцитов периферической крови проводили методом розетко-сбразованкя ног ielnburg P.O. et el., 1977 - Т-активные лимфоциты; iu D.T.Y., Gale к.Г., 1977 - Т-лимфоциты с рецепторам ДЛЯ ЭриТрОЦИТОВ кролика; Forbes I.J., Zaleweki P.S., 1976 - Б-лимфециты с рецепторами для эритроцитов мыши; Teodoressu м. et. al.f 1977 - лимфоцитов с рецепторами для стафилококков.

При математической обработке результатов применялись подходы, изложенные в следующих руководствах: Ашарин И.П., Воробьев А.А. (1962), Бейли Н. (1962), Рунион Н. (1982). Обработку проводили на персональном компьютере фирмы " Olivetti " с использованием пакета стандартных статистических программ. Различия счлта-

■Ч-211/У

9

ли достоверными при Р < 0,05.

Результаты работы и их обсуждение. В качестве объекта изучения были выбраны нейтрофилы периферической крови, как наиболее доступные и быстро реагирущие на любые нарушения гомеостаза фагоциты и как клетки, играющие основную роль в защите организма от гнойной инфекции. Дяя отработки тест-системы реакции хегяош-минесценции прежде всего были изучены нейтрофилы здоровых доноров - интактныа и стимулированные различными условнопатогеяными микроорганизмами, как опсонизированнымн, так и без опсонизации.

Самый мощный респираторный взрыв всегда наблюдался в ответ на золотистый стафилококк Скак по шису реакции, так и по свето-сумме), а самый слабый - в ответ на протей Стабл; I). Остальные убиквитарные микробы занимали промежуточное положение по своей способности генерировать выработку нейтрофилами активных форм кислорода. Таким образом было показано, что профиль XI реагирования нейтрофилов на разные микробные стимуляторы одинаков для .. всех доноров, и, следовательно, определяется исключительно видовой принадлежностью стимулятора.

Таблица I

XI нейтрофилов здоровых доноров в ответ на различные микробные отимуляторы

Пик ХЛ (хЮ^имц/сек) Светосумма за ЭОмин(сд^)

Стимулятор

Доноры

I I П ) Ш | I } П | Ш

Б. аихаив Е. оо11

Р.а.егад1поаа Р.а1гаЫ11в

Сап<11<1а ар. Б.ер1(1егт1с11в

14,72 П-,83 23,88 37,37 52,37 86,12

14,30 10,12 21,84 35,5 22,12 57,93

9,64 10,10 18,59 24,9 28,75 54,25

К,44 8,60 II,09 28,0 19,2 26,0

. 7,46 4,3 10,64 22,0 12,12 24,87

6,29 5,34 8,04 6,62 13,0 13,12

ю

Из воет испытанных возбудителей золотистый стафилококк вызывал максимальный ХП-ответ нейтрофилов. Кроме того, по данным многих авторов этот инфекционный агент продолжает доминировать в микробном пейзаже больных с гнойно-септическими заболеваниями как в монокультуре, так и в ассоциациях (Стручков В.И. и соавт., 1984; Яфаеэ Р.Х. и соавт., 1985; Брусина Е.Б. и соавт., 1987). Поэтому именно s.aureus и был выбран в качестве стимулятора для стандартной тест-системы в реакции XI.

Известно, что характер в зашло действия инфекта с факторами . защиты определяется не только видовыми, но и штаммовымя особенностями микроорганизма. Четыре клинических изолята (5055, 5061, 7510, 1890) и один музейный штамм ( Cawan - I) s.aureus сравнили между собой по их способности генерировать респираторный взрыв нейгрофиов десяти здоровых доноров. Было показано, что у низкореагкрукщих доноров (доноры I, Ш, У) разница между стимули-рувдей активностью отдельных штаммов золотистого стафилококка не" регистрируется. В то же время у доноров со средним уровнем ХЛ-. ответа (доноры У1, УШ) и у высокореагирушцих (доноры П, IУ, УП, IX, X) зафиксированы.достоверные различия мекду штаммами (Р < 0,05). Таким образом, чем меньше в целом реактивность клеток донора, тем более монотонный наблюдается ответ, и, напротив, чем она выше, тем более.дифференцирована ХИ-реакция на отдельные штаммы стафилококка.

Штаммы s.aureus отличались по своей стимулирующей активности закономерно: так самым сильнодействущим оказался клинический иэолят S.aureus _ 75Ю; штамм Cowan - I занимал второе место, а самым слабым эффектом обладал изолят s.aureus 1890. Каждый штамм занимал определенное'положение по своей сти-мулируидей активности, причем все различия были достоверны по

критерию Фридмана (Р < 0,00007).

Необходимым условием для .полноценной реализации нейтрофилом своего функционального потенциала по отношению к объекту фагоцитоза является опсонизация последнего сывороточными факторами. ХЛ клеток в ответ на опсонизированные микробные стимуляторы всегда была значительно выше, а пик реакции наступал в 1,5-3 раза раньше, чем на неоасокизировакние. Это свидетельствует о замедленном взаимодействии нейтрофила с возбудителем при опсошш-неопосредоваяном контакте с ним. Наиболее чувствительным, к опсо-низиругацему воздействию сыворотки оказался эпидермалышй стафилококк, так как пик ХЯ-ответа на этот стимулятор без опсокизации бш существенно снижен - на 77,7 + 3,38$.

Очевидно, что для того, чтобы получить in vitro солее достоверную картину состояния опсоно-фагоцитарной системы, максимально приближенную к таковой in vivo , целесообразнее всего использовать стимул адекватный для фагоцитов больного, то есть, аутологичный штамм возбудителя. Однако, бактериологический анализ бывает готов лишь через.несколько дней после взятия материала. Поэтому для экспресс ХЛ-реакции особенно при массовых обследованиях при постановке нагрузочного теста использовали эталонный музейный штамм S.aureus Cowan _ I,

С целью выяснения оптимального соотношения микроб - фагоцит в тест-системе реакции ХЯ были испытаны 4 соотношения: 200:1, 100:1, 50:1, 10:1. Показано, что большая конденсация стимулятора (соотношение 200:1) сглаживает индивидуальные особенности ней-трофилов и подавляет их ХЛ-огаег.из-за.выраженной антигенной перегрузки. Низкие соотношения (50:1, 10:1), напротив, не создают достаточной напряженности фагоцитарного стимула, позволяющей выявить нарушения микробицидного потенциала клеток (хотя при этом

лучше всего были заметны индивидуальное отличия их реактивности). Поэтому за оптимальное было принято соотношение 100:1, которое использовалось затем во всех последующих исследованиях.

Разработанная тест-система реакции XI была испробована для оценки функционального состояния ОСС сначала здоровых доноров (для определения нормативных показателей), а затем больных с локальной и генерализованной формами гнойной инфекции. По пину реакции определяли абсолютное значение нестимулированного ХЛ-ответа нейтрофялов (НС в имп/сек) и индекс стимуляции (ИС в условных единицах) - относительный показатель, характеризующий функциональный резерв их кислородозависимой баксерицидности.

У больных, по сравнению с ^донорами, обнаруживается резкий . всплекс НС респираторного взрыва нейтрофилсв, причем степень нарушения данного показателя коррелирует с формой заболевания и . тяжестью состояния пациентов. При благоприятной динамике гнойного процесса и переходе от тяжелого состояния к удовлетворительному наблвдалась оптимизация НС ХЛ-ответа, хотя он даже перед выпиской из стационара не достигал нормы (Р < 0,05). При неблагоприятном течении нарушение этого параметра усугублялось, увеличиваясь в-терминальном состоянии вплоть до 5,07 + 0,75x10^ имп/сек. Все это свидетельствует о том, что у больных с генерализованной гнойной инфекцией налицо выраженная гиперсткдуляция нейтрофилов периферической крови, которая способна вызвать множество дополнительных осложнений. Повреждающее действие гилерактиэироваиннх фагоцитов на различные ткани и органы описано рядом авторов как в клинике, так и в,эксперименте (Аджимолаев Т.А., 1986; Holman J.в., Saba Т.U., 1986; blaster S. et al., 1987).

Диаметрально противоположным образом изменялся индекс стимуляции. У больных о местной формой гнойной инфекции функпиональ-

вый резерв нейтрофилов не страдал - ИЗ у них был даже несколько выше, чем у здоровых доноров (15,05 + 1,8 против 13,0 + 1,5 усл. ед.), что следует расценивать как защитно-приспособительную реакцию 08С макроорганизма на внедрение инфекционного агента. У больных с генерализованным цроцессо.ч отмечалось существенное снижение Ж (до 10,6 +1,3 усл.ед.), который затем частично восстанавливался у больных с благоприятным исходом гнойной инфекции, и, напротив, падал ниже критического уровня у погибших больных (вплоть до 3,88 + 1,0 усл.ед.). Последнее говорит об истощении эффекторного потенциала нейтрофилов на фоне их метаболической, гиперреактивносги. Поэтому в смысле дальнейшего прогноза течения раневой инфекции неблагоприятным является снижение ИС нейтрофилов менее 4 усл.ед. и увеличение пика Ш ХЛ-ответа свыше 2.8Х103 имп/сек.

В литературе имеются отдельные сообщения, в которых авторы обнаруживают высокую степень корреляции между содержанием специфических опсонинов в сыворотке больных с бактериальными инфекциями и опсонизвдтавш эффектом сыворотки (по отношению к соответствующему возбудителю), измеренному в тесте ХЛ (Ьейшапп т., Зо1Ьег£ С.о., 1980; Апйегвсг. в.с. et е1., 1980). Эти данные свидетельствует о том, что существует принципиальная возможность использовать метод лшинолзависимой хемилшинесцеяции для косвенной оценки сывороточных факторов. С целью определения совокупной, опсонизируыцей активности сыворотки больных.с гнойной раневой инфекцией регистрировали ХИ-ответ нейтрофилов, которые стимулировали золотистым стафилококком, опсонизировакным: а) аутологичной сывороткой, б) пулом донорских.сывороток (группы крови АВ), и сравнивали полученные ИС (табл. 2)

Таблица 2

Влияние опсонинов на функциональный резерв нейтрофилов больных с гнойной инфекцией, измеренный в тесте ХЛ

I Число больных с гнойной инфекцией

Индекс стуляции ! ' | Генерализованная форма

Местная форма}'----—->-

| Всего Из них погибло

Ж аутол. < ИС дон. 9й 16а,в 7а

ИС аутол. - Ж дон. 20б еб 3

ИС аутол. > ЙС дон. 8 7* оа

Итого: 37б'в 31б'в 10

Примечание, Буквами отечет значения, между которыми были достоверные различии по }фитерию X2: а - Р < 0,05; б,в - Р < 0,02.

Оказалось, что среди больных с локальной гнойной инфекцией число лиц с повышенной активностью опсонинов, когда ИЗ аутол.> ИС дон. такое же как и среди пациентов .с генерализованной формой заболевания и ^оставляет 22%, Очевидно, что в данном случае усиление опсонических свойств сыворотки за счет мобилизации как специфических (иммуноглобулины), так и неспецифических (система комплемента, С-реактивный белок, катионные белки и пр.) факторов, представляет собой адекватный ответ, направленный на элиминацию возбудителя. В результате функциональный резерв нейтрофилов в системе с аутологичной сывороткой оказывается выше, чем в системе с донорской, что является благоприятным прогностическим признаком..

Больных с нормальным уровнем опсонинов, когда ИЗ аутол. » ИС дон. было больше в группе с местной инфекцией, а с дефицитом

- в группе с генерализованной инфекцией (ИС аутол. < Ж! дон.) (в обоих случаях Р < 0,02). Степень недостаточности опсонизиру-вщих компонентов сыворотки также сильнее выражена у больных с генерализацией процесса: у них КС аутол. < ИС дон. в среднем на 55,0 + 7,6$ против 37,0 + 3,3% у "местных" больных (Р < 0,05). Этот показатель может служить неблагоприятным прогностическим признаком, так как среди больных, у которых при поступлении в стационар регистрировали повышенное содержание опсонинов не погиб ни.один человек, а цри их дефиците умерло 7 из 16 пациентов (Р< 0,05).

Таким образом, постановка комплексного геста НС и СГ Ш нейтрофилов (с использованием в качестве стимулятора s.aureus Cowan - I, а дая его опсонизацшг аутологичной или донорской сыворотки) позволяет дать быструю и объективную оценку состояния 02С и определить источник нарушений ее работы - дефицит опсонинов или дисфункцию самих клеток.

Известно, что ведущую роль в патогенезе раневой инфекции играет первичный очаг. Поэтому представляло интерес изучить влияние степени бактериальной обсемененности гнойного очага на состояние 05G больного, измеренное в тесте ХЛ. Для этого провели сравнительный анализ результатов количественных посевов из раны с результатами исследований НС и СТ ХЛ-свечент нейтрофилов больных, сделанных.з день посева. Из полученных при.этом данных (рис. 2) видно, что НС ХЛ-ответ клеток неуклонно возрастает пс мере увеличены! степени, микробного загрязнения раны с 1,55 +

О т О

0,31x10 имп/сек при концентрации =? 10 <. 10 КОЕ на I г вплоть до 6,79 + 0,79хЮ3 имп/сек при концентрации » 1С9 КОЕ на I г ткани раны (Р < 0,001). Это свидетельствует о прогрессирующей лтперактдващга нейтрофгоюв периферической крови, вызванной ре-

социац.

Рис.2. Зависимость ХЛ-ответа нейтрофилоз периферической крови от микробной обсеменённости гнойного очага. По оси ординат: сплошная линия - НС ХЯ-отиет х х1Сгямп/сея; Дунктирная линия - КС усл. ед; столбиками обозначено число компонентов микробных ассоциаций; вертикальными штрихами указаны значент ошибок средней ((ч):по оси абсцисс отложена концен-трацля микробов - КОЕ на I г ткани.

зорбцией производных очага - микробных токсинов в продуктов распада тканей.

Индекс стимуляции, который отражает антибактериальные свойства нейтрофкяов, имеет несколько иную дшамику. Сначала, при низких концентрациях мюфобов в ране, он, до сравнению со здоровыми донорами, даже увеличивается с 13,0 + 1,5 до 19,6В + 2,5 усл.ед. (Р < 0,05), что может быть объяснено мобилизацией резервных возможностей клеток. Но затем, по мере нарастания микробного загрязнения гнойного очага, наблщаегся постепенное истощение метаболического потенциала нейтрофилов.

Особенно резкий перелом в значениях нагрузочного теста наступает тогда, когда концентрация становится выше I05 KDE на I г ткани. При этом Ж падает сразу более, чем в 2 раза (Р < 0,02), что отражает функциональную неполноценность системы фагоцитов, не способных противостоять сверхпороговой концентрации инфекта. Интересно, что в ходе многолетних исследований именно концентрация 10 КОЕ на I г ткани бьиа принята различными авторами за ту "максимально переносимую", критическую концентрацию возбудителя в очаге инфекции, которая еще соответствует адаптивным физиологическим возможностям организма и за пределами которой неизбежно наступает генерализация процесса (Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1981; Krizek K.J., Robson U.C., 1975).

Из всего вышеизложенного следует, что первоочередная задача врача, в процессе лечения больных с гнойной хирургической инфекцией, состоит в том, чтобы любым доступным способом добиться снижения количества микробов в ране. Самым эффективным средством в этом смысле является хщ>ургическая обработка. Поэтому в ходе ис-следовашк необходимо было выяснить как влияет операция на XJÎ- ' отпет нейгрофялов, который с этой целью анализировали до операции,

через 1-2 дня и через 5-7 дней после операции. Для сопоставлении брали "чистые" операции сравнимой травматичноети по поводу грыжесечения, которые имели гладкий послеоперационный период.

Оказалось, что у дадавлящего большинства (8Э%) большое о "чистыми" операциями происходит увеличение респираторного взрыва нейтрофилов периферической крови, что можно расценить как возмущающее действие стрессорного фактора на ОЗС. Несколько шая картина ваблвдается у больных с заболеваниями гнойной этиологии. Так, если хирургическая обработка произведена радикально, то при местной и при генерализованной формах гнойной инфекции показатели Ш Зй-ответа клеток снижаются (в 68% и в 10СЙ случаев соответственно), т.е. отменяется их гшерактквация. Ю, напротив, повышается у 65$ пациентов с локальным и у 100$ с генерализованным процессом. Это свидетельствует о патогенетической направленности полного удаления гнойного очага и патологически измененных тканей, причем чем больше степень нарушений, тем сильнее выронен эффект. Этого нельзя сказать о тех случаях, когда бшга выполнена нерадикальная операция. 7 достоверно меньшего .числа таких больных (по сравнению с оперированными радикально) регистрируется, положительная динамика ХЛ-ответа (Р < 0,05), которая носит непродолжительный характер. Полученные данные объясняются тем, что при нерадикальной хирургической обработке продолжается активная резорбция метаболитов лишь частично удаленного гнойного очага через обширную ранезую поверхность.

Разработанная тест-система реакции XI была затем использована для оценки эффективности иммунотерапии, которую проводили препаратом лейкинферон производства НИШ юл. Н.Ф.Гамалеи АШ СССР. В литературе имеются лишь отдельные работы, посвященные применению интерферона при заболеваниях гнойной этнологии (Ара-

пова A.B. и соавт., 1988; Зуева B.C. и соавт., ISd8; Мошич П.С.,-Таршюкая О Л., 1988). Несмотря на малочисленность подобных сообщений их результаты дакт основание полагать, что препараты интерферона могут быть успешно использованы в клинике гнойной инфекции, в частности, для восстановления нарушенных фагоцитарных реакций.

Иммунотерапия лейккнфероном проведай больным отделения ран и раневой инфекции Института хирургии им. А.В.Вилшевского на фоне стандартного комплексного лечения. Кроме показателей XI анализировали также содержание активных Т-лимфоцитов (Т-акт), Т-чЧим-фоцитов с рецепторами для эритроцитов кролика, В~лимфоцитов с рецепторами для эритроцитов шеш, лимфоцитов .с рецепторами для стафилококка, а также общее количество лейкоцитов и температуру

тела. Из всех исследуемых показателей иммунокоррекция лейкинфе-,

на

роном оказывала оптимизирующее влияние': а) ХЛ-ответ нейтрофалов, б) содержание Т-акт, в) лейкоцитоз, г) сроки нормализации температуры тела. У больных с генерализованной гнойной инфекцией эф-, фект от применения лейкинферона был вьфажен сильнее, чем в группе больных с местной формой гнойной инфекции. Так, в процессе интерфероиотерапии НС ХЛ~ответ у больных, находящихся в тяжелом состоянии, падал с 4,47 + 0,71 до 2,01 + 0.29XI03 имц/сек (Р< 0,С5), а КС увеличивался с 13,27 + 3,08 до 17,9 + 2,38 усл.ед. Одновременно иабладался рост содержания-Т-акт лимфоцитов с , 26,34 + 1,9$ до 32,52 + 1,955 (Р < 0,05), а лейкоцитоз, напротив,, снижался с 10,1 + 0,8 до 6,7 + 0,68хЮ^/л. Срок нормализации температуры тала у больных леченных лейкинфероном также был существенно ниже, чем у больных без иммунотерапии и составлял 15,66 + 3,27 суток против 25,87 + 2,45 суток в контроле (Р с 0,05). По-луенные результата дают основание утверждать, что лабораторными

показаниями к иммунокоррекцяк лейкинфероном являются избыточный респираторный взрыв нейтрофияов и истощение их резервных возможностей (измеренное в тесте ИЗ и СТ XI), а также сочэтшше этях нарушений с низким содержанием Т-акг лимфоцитов. Применение де£-хииферона (как и любом иммупоыодулятора) обязательно требует регулярного иммунологического обследования с целью оценки эффективности проводимой иммунотерапии.

В заклаченяе можно сказать, что разработан и внедрен в лабораторную практику эффективный способ оценки функционального состояния как клеточного, так и сывороточного компонента 01С ирг. помощи лшинолзависимой ХЛ. Он позволяет выявить недостатсчнос-Ь опсониноэ, определить антибактериальный потенциал нейтрофилов, судить об их аутоповреадаицем эффекте, что может быть использовано для мониторинга за состоянием 05С при проведении различных хирургических и терапевтических лечебных мероприятий.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что динамика и интенсивность ХЯ-ответа нйВ-трофшюв определяются видовыми особенностями микробного стимулятора, соотношением микроб: фагоцит к наличием в тест-систетлс ол-оонинов.

2. В ходе исследования определены пороговые уровни Х1--отве~ та нейтрофшгов для большое о гнойной раневой инфекцией, позеоля-щяо дать прогноз дальнейшего течения заболевшей.

3. Показано, что с помощью разработанного способа можно ич~ явить дефицит опсонизируюцик факторов, используя для опсснзгашш стимулятора параллельно сыворотку большого и пул донореиж ссироток группы крови АВ.

4. Установлено, что изменение концентрации микробов в раяе

прямо пропорционально нестимулированному ХЯ-ответу и обратно пропорционально индексу стимуляции. При превышении критического уровня микробной обселенё'кности наблюдается резкая гнперактива-цея нейтрофилов периферической крови с одновременным подавлением ех функционального резерва.

5. 7 больных с гнойной раневой инфекцией Х1-ответ нейтрофи-лов периферической крови является отражением их стимуляции продуктами первичного очага. Радикальная операция по удалению первичного очага и ш.аунохсорригирутацая терапия препаратом лейкиифе-рон оптимизируют состояние опсоно-фагоцитарной системы; проведе-ш:е перадикаиьной оперяцп даёт лишь кратковременный эффект.

6. Разработан и внедрён в практику лабораторных исследований способ оценки функциональной активности нейтрофилов с помощью да-югаолзависимой XI, который можно использовать для мониторинга за состоянием опсоно-фагоцитарной системы как здоровых лиц, так и больных с гнойной инфекцией.

СПИСОК РАБОТ, ОПУЕЮШЗАННШС ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Повышение активности факторов защиты у больных с гнойной хирургической инфекцией при применении препаратов интерферона /

B.А.Карлов, С.М.Белоцкий, О.Б.Силюкова и др. // Антибиотики и медицинская биотехнология,- 1985.- МО.- С.770-773.

2. Хемилшинесценция нейтрофилов человека под действием условно патогенных микробов / С.М.Еелоцкий, О.Б.Филзжова, С.Б.Пащутин к др. // Дурн, микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-1986.- И3.- С. 89-92.

3. Регуляция факторов защиты от убиквигарньгх микробов /

C.М.Белоцкий, Т.К.Снастина, О.Б.Филюкова, Е.С.Диковская // Теоретические проблемы эпидемиологии и иммунология на современном этапе Тезисы докладов Всесоюзной конференции.- Нальчик.- 1986.- С.112-П:

4. Стимуляция респираторного взрыва нейтрофгаов здоровых людей различными концентрациями золотистого стафилококка./ О.Е.Фшго-ко~а, Т.И.Сластина, С.!,5.Белоцкий к др.// Еурн. микробиология, эпи-домкологие и иммунобиологии- 1987.- №3.- С. 58-60.

5. Филюкова О.Б., Снастина Т. И. Состояние респираторного взрыва нейтрофилов в норме и при гнойной инфекции // Актуальные вопросы теоретической и прикладной иммунологии; механизмы цротяво-инфекциояного иммунитета: Тезисы докладов II Всесоюзной конференции.- Саратов.- ISS7.- C.I09-II0.

6. Микробный фактор в хеыилямпнесценции нейтрофилов периферической крови больных с гнойной"хирургической инфекцией // С.М.Белоцкий, Т.И.Снасмна, О.В.Фашкова, А.А.Звягин // Дури. миирсЗио-логии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 1988.- КЗ.- С. 37-90.

7. Дейкинферон для инъекций при местной и генерализованной гнойной инфекции / С.М.Белоцкий, Т.И.Снастша, О.Б.Фшшкова, В.А. Карлов // Интерферсн-88: Тезисы докладов X регионального симпозиума социалистических стран по интерферону.- Юрмала.- 1938.- С. 17.

8. Принципы комплексной иммунокоррекцш тяжёлой гнойной инфекции / В.А.Карлов, С.М.Белоцкий, Е.В.Х^цу, О.Б.йтжова и др. // Хирургический сепсис: Тезисы докладов II Всесоюзной конференции.-Тула.- 1989.- С. 122-124.

9. Вшерстюцуляция фагоцитов как одна из причин вторичного иммунодефицита / С.М.Белоцкий, В.А.Карлов, О.Б.Фкдшова // Тезисы докладов I Всесоюзного иммунологического съезда.- Сочи.-1989.-С.172..

10. Клшшко-лабораторный эф$еки лейкинферона при гнойной инфекции / С.М.Белоцкий, В.А.Карлов, O.E.Милюкова и др.// Ангабио-тики и химиотерапия.- 1990.- ¡В.- С. 3S-38.

11. Wound tissue respiratory burat and local microbial inf-lsmaatioa / S.iî.Belotsicy, E.V.Ouzu, V.A.Karlov et al.,// Inflammation.- 1990,- V. 16,- p. 663-668.

Подл, в иеч. от 25.12.90г. Формат изд. 60x84 1/16 Обьем изд.-1,Еп.л. Зак. 211/у Тир.100

ШГЛечатник" Мосгорпечать. Н.Краснохолмская д. 5