Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Состояние локального иммунитета при первичной открытоугольной и закрытоугольной глаукоме и иммунологическая оценка эффективности терапии

На правах рукописи

Кириенко Андрей Владимирович

СОСТОЯНИЕ ЛОКАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ И ЗАКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ

14.03.09 — клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Маркелова Елена Владимировна Официальные оппоненты:

Назаров Петр Григорьевич, доктор медицинских наук, профессор заведующий лабораторией общей иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН

Иванушко Людмила Александровна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.П. Сомова» СО РАМН.

Ведущая организация

ГБОУ ВПО «Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. М.И. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Москва.

Защита диссертации состоится «03» июня 2014 года в 12.00 часов на заседании диссертационного совета ДКМ 208.007.02 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ по адресу: 690002, г. Владивосток, проспект Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автореферат разослан «_»_2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., доцент

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Глаукома является одной из наиболее актуальных медико-социальных проблем, что обусловлено значительным ее распространением, трудностями ранней диагностики и неблагоприятностью прогноза. В настоящее время в мире более 105 млн. больных глаукомой (Медведев И.Б. с соавт., 2011; С2ш£1еу Н., 2011). По мнению Е.А. Егорова с соавт. (2008), в России на диспансерном учете состоят более миллиона человек, и такое же число людей не знают о своей болезни. Профилактика слепоты от глаукомы зависит от ее ранней диагностики и своевременной патогенетической терапии. Однако, достижения специалистов в ранней диагностике и лечении заболевания не всегда дают стойкий результат по сохранению функции органа зрения в отдаленные сроки наблюдения. В связи с этим не теряет своей актуальности детальное изучение механизмов патогенеза этого заболевания. Несмотря на большое количество научных публикаций, посвященных изучению патогенеза глаукомы, до настоящего времени до конца не выяснена роль иммунных механизмов в развитии первичных открытоугольной и закрытоугольной глауком. Нет сравнительных исследований результатов по оценке состояния системного и локального цитокинового профиля во взаимосвязи с локальными показателями, отражающими состояние межклеточной эндопротеазы и ее ингибиторов. Единичные исследования по иммунологической оценке эффективности лазерных операций при ПОУГ и ПЗУГ. Решению этих вопросов посвящена настоящая работа. Цель работы: выявить особенности локальной цитокиновой регуляции при разных формах глаукомы и разработать иммунологические критерии эффективности патогенетической терапии. Задачи исследования:

1. Определить содержание цитокинов в слезной жидкости и сыворотке крови (1Ь-1Р, IL-6.IL- 2, 1Ь-17, 1Шу, 1Ь-10, 1Ь-4, TGF.pi, ТОР-Р2) у пациентов с ПОУГ в зависимости от стадии болезни.

2. Исследовать уровень провоспалительных (1Ь-1р, 1L-6.IL- 2, зи1Е-2, \L-\1, 1ГЫу) и противовоспалительных (^-10, ТОР-р1, ТСР-Р2) цитокинов в слезной жидкости и в сыворотке крови пациентов с ПЗУГ разных стадий.

о

3. Оценить уровень белков (ММР-9, Т1МР I, комплексы ММР-9/ Т1МР I и ММР-9/Т1МР II), характеризующих состояние межклеточного матрикса, в слезной жидкости пациентов с ПОУГ и ПЗУГ разных стадий.

4. Изучить характер взаимосвязей локального цитокинового профиля с матриксной металлопротеиназой 9 типа (ММР-9), ее тканевым ингибитором I типа (Т1МР I), их соотношением и комплексами ММР-9/ Т1МР I м ММР-9/Т1МР II.

5. Провести анализ иммунологической эффективности методов патогенетической терапии глауком.

Научная новизна: впервые проведено комплексное исследование локальных цитокиновых и биохимических показателей, дана оценка их взаимосвязи. Выявленные нарушения локальной иммунорегуляции у пациентов с глаукомой расширили представления об особенностях иммунопатогенеза разных форм и стадий заболевания, механизмах формирования глаукомной оптической нейропатиии. Изучение локального статуса цитокинов при ПОУГ позволило определить его провоспалительный профиль с переключением типов иммунного ответа с ТЬ 17 и ТЬ 2 у пациентов с I стадией на ТЬ 1 при II стадии ПОУГ и ТЬ 2 с одновременной гиперпродукцией 1Ь-1р, 1Ь-6 и ТСрр2 У пациентов с III стадией ПОУГ. Выявлен смешанный ТЬ 1/ТЬ 2 тип иммунного ответа на уровне органа-мишени при ПЗУГ I и II стадии, а при III стадии — его поляризация в сторону ТЬ 1 типа. Определены дополнительные дифференциально-диагностические критерии стадий ПОУГ и ПЗУГ по уровню 1Ь-17, 1Ь-2, ТОРР, и ТОРр2- Впервые дана иммунологическая оценка эффективности консервативной терапии и малоинвазивных оперативных вмешательств при данной патологии.

Практическая значимость: разработан новый метод ранней диагностики ПОУГ и дополнительные иммуно-биохимические критерии тяжести ПОУГ и ПЗУГ. Определены наиболее информативные маркеры прогнозирования течения болезни при разных формах глаукомы. Выявлены иммунологические критерии эффективности лазерной трабекулопластики при ПОУГ и лазерной иридэктомии при ПЗУГ.

Основные результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедр офтальмологии и оториноларингологии, физиологии человека, клинической

лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии «Тихоокеанского государственного медицинского университета», в работу «Приморского центра лазерной коррекции зрения и офтальмологии», Офтальмологическое отделение Краевого Диагностического центра (г. Владивосток), Хабаровский филиал ФГБУ «МНТК «Микрохирургии глаза».

Апробация материалов диссертации: материалы диссертации доложены и обсуждены на научных форумах международного, Российского регионального и местного уровня: заседании Европейского общества рефракционных и катарактальных хирургов (ЕБСЯЙ) (Амстердам, 2013); XII международном конгрессе «Современные проблемы иммунопатологии, аллергологии и иммунофармакологии (Москва, 2013), Межрегиональном форуме «Клиническая иммунология и аллергология — междисциплинарные проблемы» (Казань, 2012); 12-ой Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 2011).

Материалы диссертации легли в основу: Методических рекомендаций «Оценка состояния локальных факторов врожденного иммунитета для определения стадии и дифференциальной диагностики глауком», утвержденных Департаментом здравоохранения Приморского края и ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России, внедренных в практику работы офтальмологической службы Приморского и Хабаровского края и учебный процесс кафедр офтальмологии и оториноларингологии, физиологии человека и клинической лабораторной диагностики, общей и клинической иммунологии ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, включенных в «перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук», утвержденных ВАК.

Структура и объем диссертации: материал диссертации изложен на 139 страницах текста, проиллюстрирован 34 таблицами и 6 рисунками. Диссертация состоит из

введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 3 глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций практическому здравоохранению и списка использованной литературы, содержащего 293 источника (их них - 105 источников отечественных и 188 - зарубежных авторов). На защиту выносятся следующие положения:

1. У пациентов с ПОУГ и ПЗУГ зарегистрированы различия системного и локального цитокинового профиля, зависящие от стадии болезни. Иммуновоспалительный компонент вносит существенный вклад в патогенез первичных открытоугольных глауком и при III стадии первичной закрытоугольной глаукомы.

2. Степень нарушений в системе металлопротеиназы-9 и ее тканевых ингибиторов более выражена при ПОУГ и сопряжена с тяжестью заболевания как при открытоугольной, так и при закрытоугольной глаукомах, что свидетельствует о существенной роли нарушений межклеточного матрикса в патогенезе глауком.

3. Критерием иммунологической эффективности при комплексной терапии с применением лазерных технологий при ПОУГ I и II стадии является нормализация IL-17, а при ПЗУГ I и II стадии — снижение уровня srIL-2. При III стадии глауком малоинвазивная операция не оказывает влияние на системные и локальные нарушения цитокинового профиля и биохимические изменения.

Личный вклад автора в проведенное исследование: состоит в непосредственном участии в планировании исследования, формировании групп пациентов, включенных в исследование, сборе материала, клиническом осмотре, лечении пациентов с глаукомой, участие (70%) в выполнении лабораторных исследований, проведении аналитического обзора отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, интерпретации, анализе и статистической обработке полученных результатов исследования.

Материалы и методы

Обследование пациентов и забор исследуемого материала проводился

в Приморском центре лазерной коррекции зрения и офтальмохирургии (г. Владивосток), во взрослом отделении микрохирургии глаза ГБУЗ «Краевая

клиническая больница № 2» в течение 2010-2012 г.г. Все пациенты были информированы о целях и задачах работы, получено их согласие на проведение необходимых диагностических мероприятий (протокол № 3 дело № 11 заседания независимого междисциплинарного комитета ГОУ ВПО ВГМУ Минздрава России от 27.12.2010 г.).

Основные иммунологические исследования выполнены на базе научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России под руководством заведующей кафедрой физиологии человека доктора медицинских наук, профессора Е.В. Маркеловой, а также в лаборатории химии неинфекционного иммунитета ФГБУН Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г. Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН (зав. отделом - доктор химических наук, профессор П.А. Лукьянов). Для выполнения поставленных задач проведено комплексное клиническое, биохимическое, инструментальное и иммунологическое исследование. Всего обследовано 210 человек. Всем пациентам проводили комплекс методов офтальмологического исследования: визометрия, биомикроскопия, авторефрактометрия, офтальмоскопия, тонометрия, периметрия, оптическая когерентная томография, ультразвуковое исследование глаз, электрофизиологическое исследование глаз. Остроту зрения определяли с помощью проектора знаков СР-30 фирмы "SHIN NIPPON" (Япония) по общепринятой методике. Биомикроскопию переднего отрезка глаза проводили при помощи щелевой лампы SM-2N фирмы "Takagi" (Япония). Гониоскопию — трехзеркальной линзой Гольдмана. Офтальмоскопию осуществляли бинокулярным офтальмоскопом фирмы "Neitz" (Япония). Исследование поля зрения осуществляли на сферопериметре АР-5000С "Kowa" (Япония). Внутриглазное давление измеряли тонометром А.И. Маклакова. Оптическая когерентная томография зрительного нерва осуществлялась на установке Cirrus HD-ОСТ фирмы "Carl Zeiss" (Германия). Диагноз первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ) и первичной закрытоугольной глаукомы (ПЗУГ) был выставлен на основании клинических и инструментальных данных, согласно требованиям Российского национального руководства по глаукоме (Егоров Е.А. с соавт., 2008). По результатам исследований у 133 пациентов выявлена первичная открытоугольная глаукома I-III стадий, из них в

возрасте до 59 лет - 32 (24%) человека, старше 60 лет - 101 (76%) человек. Распределение обследованных с ПОУГ и ПЗУГ по стадиям представлено в таблице 1.

Таблица 1.

Распределение обследованных с ПОУГ и ПЗУГ по стадиям болезни

Больные с глаукомой чел./глаз I стадия II стадия III стадия

чел глаз чел глаз чел глаз

ПОУГ абс 39 66 56 64 38 71

п=133/201 % 29,3 52,8 42,1 31,8 28,6 35,4

ПЗУГ абс 13 21 8 16 6 12

п=27/49 % 48,2 42 29,6 32,7 22,2 24,5

В обе группы пациентов с ПОУГ и ПЗУГ включены лица с миопией разной степени, гипертонической болезнью 1-П стадии (ГБ), сахарным диабетом II типа (СД) в стадии компенсации. Средний возраст обследованных составил 65,81±1,25 года. Преобладали женщины - 95 (57,9%), количество мужчин составило 65 человек (42,1%). Контрольную группу составили 50 добровольцев без заболеваний органов зрения, возраст которых был 53,45±2,35 года, из них 30 (60%) - женщин и 20 (40%) -мужчин. Пациенты с IV (терминальной стадией) не были включены в настоящее исследование.

По лечению пациенты с ПОУГ были распределены на 2 группы:

- 79 (59,4 %) человек получали только медикаментозное лечение, из них число пациентов с первой стадией составило 7 человек (8,9%), со второй - 40 (50,6%), с третьей - 32 (40,55%). 26 человек (32,91%) с III стадией ПОУГ были направлены на хирургическое лечение, минуя лазерное. Лечение пациентов с ПОУГ 1-П стадией начиналось с назначения простагландинов (Ксалатан) и Бета-адреноблокаторов (Тимолол, Бетоптик). Пациентам III стадии назначались препараты Ксалаком, Дорзопт плюс. В ходе данной медикаментозной терапии ВГД удавалось держать на уровне 19-21 мм рт. ст. у 53 пациентов;

- 54 (40,6 %) пациентам с ПОУГ проводилась лазерная трабекулопластика и

медикаментозная терапия, из них с первой стадией ПОУГ было 32 (59,2%) человека,

второй - 16 (29,6%) человек и 6 (11,2%) человек с третьей стадией болезни.

Пациентам выполнялась лазерная трабекулопластика, в ходе которой наносились

коагуляты равномерно в передней или средней трети трабекулы на протяжении 1208

180-270-300 градусов окружности трабекулы (исключая верхний сектор) за 13 сеанса. Манипуляция выполнялась под местной анестезией путем закапывания капель Инокаина 0,4%.

Всем обследованным пациентам с ПЗУГ проводилась лазерная иридэктомия в комбинации с консервативным лечением. Суть операции заключалась в формировании небольшого отверстия в периферическом отделе радужки в зоне от 10 до 2 часов с целью предупреждения светорассеяния после операции. Лазерная иридэктомия, проводимая с помощью Nd:YAG - лазера с длиной волны 1064 нм, позволила выровнять давление между двумя камерами (передней и задней), восстановить равновесие и уплотнить радужку, что облегчило транспорт водянистой влаги.

В качестве биологических материалов для иммунологических исследований использовалась сыворотка венозной крови и слезная жидкость. Забор венозной крови пациентов проводился из локтевой вены в утренние часы, натощак, с соблюдением правил асептики и антисептики. В сыворотке крови определяли содержание цитокинов (IL-6, IL-ip, IL-2, SrIL-2, IFN-y, IL-17, IL-10, IL-4, TGF-(3b TGF-p2). Забор слезной жидкости проводился после раздражения парами аммиака, из внутреннего угла глаза и использовался для исследования цитокинов (IL-ip, IL-6, IL-2, srIL-2, IL-17, IFN-y, IL-10, IL-4, TGF-Pi, TGF-Рг), матриксной металлопротеиназы-9 секреторного типа человека (ММР-9) и ее комплекса с тканевым ингибитором I и II типов (MMP9/TIMP1 и MMP9/TIMP2) и тканевого ингибитора металлоротеиназ I типа (TIMP1). Определение цитокинов и белков, отражающих состояние внеклеточного матрикса, проводили методом твердофазного ИФА с применением реактивов «R&D Diagnostics Inc.» (USA), согласно прилагаемым инструкциям.

Обработка всех цифровых данных проводилась методами описательной статистики (Гланц С., 1999) с использованием программ Statistica 6.0 и SPSS. V 16. Были выполнены: проверка нормальности распределения количественных признаков с использованием W-критерия Шапиро-Уилка, оценка значимости различий между двумя выборочными средними по критерию Стьюдента или Манна-Уитни-Вилкоксона, оценка связей между показателями по коэффициенту корреляции Спирмена или критерия у?, анализ степени чувствительности и специфичности

9

изменения выбранных параметров определяли методом линейной регрессии с построением ЯОС-кривых в программе Мес1Са1с. Уровень доверительной вероятности был задан равным 95%. Результаты исследований и их обсуждение

При оценке показателей системного цитокинового профиля в общей группе обследованных пациентов с глаукомой была установлена гиперцитокинемия, в основном, провоспалительных медиаторов - выявлено увеличение в 5-6 раз 1Ь-1|3, 1Ь-6 и 1Ь-17. Меньше нарастало содержание ТОрРг, 1Ь-2 (в 1,3-1,5 раза). Количественные значения 1Ь-10 и ТОР(31 не отличались от контрольных

величин, а уровень 1Ь-4 и зк!Ь-2 статистически значимо снижался (рис. 1).

Ш 11.-10 аш тбяр1 ЕВВШ 11-4

11-6 »—1 11.-17

|РМу Ь Т6|=|!2 )Ш8МЙ&*1

-4 -2 0 2 4 6 8 10

Рис. 1. Схематическое изображение дисбаланса содержания цитокинов в сыворотке крови у пациентов с глаукомой относительно границы контроля ( | ).

Не было установлено статистически значимых различий содержания исследованных провоспалительных и большинства противовоспалительных цитокинов в зависимости от пола и возраста пациентов. Исключение составили ТОР(32 и 1Ь-4. Уровень ТОрр2 в сыворотке крови мужчин был достоверно выше, чем у женщин (300 (240,22; 330,0) пг/мл против 240,90 (192,40; 268,60) пг/мл, р<0,05). При этом уровень ТОрр2 был выше контрольных значений как у мужчин, так и у женщин. Низкая концентрация 1Ь-4 определена только у пациентов пожилого возраста, независимо от пола.

При анализе цитокинового профиля сыворотки крови у пациентов с ПОУГ и ПЗУГ разных стадий выявлены существенные различия, позволяющие считать ПОУГ заболеванием, характеризующимся развитием системной воспалительной

реакции, что подтверждает сосудистую и метаболическую теории патогенеза ПОУГ. Установлено, что уже при начальной стадии ПОУГ в крови возрастало содержание 1Ь-6 и, особенно, 1Ь-17, определялся дефицит противовоспалительных медиаторов -1Ь-4, ТСРР[ и При второй стадии ПОУГ уровень провоспалительных

цитокинов увеличивался в несколько раз. У пациентов этой группы определена гиперцитокинемия 1Ь-17, 1Ь-2, 1Ь-1Р; возрастал уровень 1Ь-6, 1РЫу, ТОрр2. При сохранении низких значений 1Ь-4 определен дефицит 1Ь-10. В III стадии ПОУГ эти закономерности сохранялись, за исключением нарастания в сыворотке зк1Ь-2 и относительного увеличения (по сравнению со II стадией) 1Ь-10.

При анализе цитокинового профиля сыворотки крови пациентов с I стадией ПЗУГ — большинство исследованных цитокинов не отличалось от референсных величин, за исключением низкого уровня 8я1Г-2. При сравнительной оценке с аналогичными показателями у пациентов с ПОУГ зафиксировано статистически значимое различие в содержании 1Ь-17 в сыворотке крови (х2=4,86 против р<0,05 2-ой степени свободы), что позволяет считать уровень 1Ь-17, превышающий 30,00 пг/мл, дополнительным дифференциально-диагностическим признаком I стадии ПОУГ.

У пациентов с II стадией ПЗУГ цитокиновый профиль сыворотки крови также мало отличался от референсных величин. У них определено умеренное увеличение 1Ь-17 по сравнению с контролем, но значения 1Ь-17 были в среднем в 2 раза ниже, чем у пациентов с ПОУГ. Концентрация 1Ь-17 превышающая 60,00 пг/мл определена как стабильный признак развитой стадии ПОУГ (х2=5,84 при р<0,01; 1-ой степени свободы). При III стадии ПЗУГ выявлен целый ряд изменений в цитокиновом профиле: повышение содержания 1Ь-6, 1Ь-17, 1Ь-10, ТСРР] и снижение количества ТвРРг по сравнению с группой контроля.

Для более полного представления о цитокиновом профиле сыворотки крови у пациентов с глаукомой нами был рассчитан их удельный вес (рис. 2).

Оценка удельного веса основных про- и противовоспалительных цитокинов наглядно демонстрирует увеличение доли в сыворотке крови провоспалительных цитокинов и дефицита противовоспалительных 1Ь-4,1Ь-10 при ПОУГ.

0% «•:<•:<•:• ,SSSÄKSS..............,.............Ä¥:¥:¥S ,i:W:¥Ä

контроль глаукома ПОУГ ПЗУГ

S IL-lß IL-6 В IL-2 • IL 17 Ш IFNy S? IL-10 И IL-4

Рис. 2. Удельный вес основных про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови пациентов с разньми клинико-лабораторными проявлениями глаукомы

При ПЗУГ удельный вес провоспалительных цитокинов повышался незначительно, за исключением уровня IL-17 и IL-6. Доля противовоспалительных медиаторов (IL-4 и IL-10), напротив, была достоверно выше, чем при ПОУГ, но снижалась по отношению к контролю.

Оценка удельного веса цитокинов в профиле сыворотки крови как пациентов с ПОУГ, так и ПЗУГ свидетельствует о значительной роли IL-17 в патогенезе глаукомы, что подтверждает мнение ряда авторов (Черных В.В. с соавт., 2001; Sun D., 2008 и др.) и может косвенно свидетельствовать о значении аутоиммунных механизмов при глаукомах.

Расчет коэффициента, отражающего поляризацию иммунного ответа, позволил сделать заключение, что при ПОУГ регистрируется Th I тип иммунного ответа, а при ПЗУГ- смешанный Thl/Th2 тип (10,00±0,20 против 1,5±0,04 при ПЗУГ и 1,35±0,02 у здоровых).

Отдельно проведена сравнительная оценка концентраций трансформирующих

ростовых факторов (TGFßi и TGFß2) в сыворотке крови больных с ПОУГ и ПЗУГ и

установлен разнонаправленный характер их изменений. Выявлено, что при II и III

стадиях ПЗУГ уровень TGFß! существенно выше, чем у пациентов с ПОУГ, тогда

содержание TGFß2, напротив, значимо повышено у пациентов с ПОУГ. Это

подтверждает патогенетическую роль TGFß2 при первичной открытоугольной

глаукоме (Fuchshoter R., Tamm E.D., 2012), вероятно, стимулированный им фиброз

вносит вклад в нарушение оттока внутриглазной жидкости и повышение ВГД. Наши

12

исследования подтвердили данные ряда авторов (Schlozer-Schreharot U. et al, 2001, Inatami M. et al., 2001). В то же время не зафиксировано увеличения в крови TGFßi при ПОУГ, а при I и III стадиях было определено снижение его уровня по сравнению с контрольной группой. Эти результаты согласуются с данными, полученными Д.А. Рукиной (2012). Не до конца понятен механизм этих различий, но полученные результаты позволяют разработать дополнительный дифференциально диагностический признак ПОУГ II-III стадий: увеличение TGFß2 в сыворотке крови выше 205 пг/мл сопряжено с ПОУГ II стадии (х2 =4,26, р<0,05 при 2 ст. свободы) и ПОУГ III стадии tf =5,86, р<0,01 при 2 ст. свободы).

Как известно, оценка локального уровня цитокинов, продуцируемых в органе-мишени, позволяет более точно выявить изменения, происходящие в органе зрения, в том числе при глаукоме. Результаты проведенных нами исследований констатируют гиперцитокинемию большинства протестированных медиаторов в общей когорте пациентов, за исключением - IL-10, TGFß] (рис. 3).

TGFß2 «Ж»

TGFßl

IL-4 IFNy 11-17 sftlL-2 И-2 IL-б

-

IL-10

-2 0 2 4 6 8

Рис. 3. Схематическое изображение дисбаланса содержания цитокинов в слезной жидкости у пациентов с глаукомой относительно границы контроля ( | ).

Наиболее нарастал уровень 1Ь-17 (в 7 раз), 1Ь-2 (в 6 раз), 1Ь-1(3 (в 5 раз), несколько меньше увеличивалось содержание №N7 и 1Ь-4 (в 2 раза), бк1Г-2 (в 1,6 раза), ТОР {32 (в 1,5 раза). Концентрация 1Ь-10 в среднем была в пределах референсных величин, а содержание ТвР Р1 снижалось. Не установлено существенных различий уровня исследованных цитокинов от возраста и половой принадлежности пациентов, за исключением значений ШЫу, концентрация которого

13

в слезной жидкости у женщин была выше, чем у мужчин (р<0,05). Это подтверждает мнение ряда авторов об увеличении продукции 1РЫу у женщин (Илловайская И.А. с соавт., 2011; Красницкая А.С., 2013).

Определение удельного веса основных про- и противовоспалительных цитокинов в слезной жидкости при ПОУГ и ПЗУГ позволило констатировать наличие существенных отличий в их локальном профиле цитокинов (рис. 4): у пациентов с ПОУГ преобладала доля 1Ь-17, а при ПЗУГ - 1Ь-2.

100% -9094 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20%

10% ■...........

0% --,

I

011-1(3 011.-6 0И-2 ВИ-17 0 В 11.-10 0И-4

Рис. 4. Удельный вес основных про- и противовоспалительных цитокинов в слезной жидкости пациентов с разными клинико-лабораторными проявлениями глауком

Анализ локального содержания цитокинов в зависимости от стадии процесса позволил выявить целый ряд закономерностей, которые в целом свидетельствуют о разных патогенетических механизмах ПОУГ и ПЗУГ. У пациентов с ПОУГ уже на ранней стадии зарегистрирована гиперпродукция 1Ь-17 и 1Ь-10, умеренное увеличение 1Ь-1[3, ТОрРг, зк!Ь-2 на фоне дефицита ЦТЧГу и снижения Тврр^ Расчет соотношения 1ЕЫу к 1Ь-4 позволил определить, что у этой категории пациентов превалирует ТЪ 2 тип иммунного ответа на фоне гиперактивации ТЬ 17 типа. Увеличение концентрации 1Ь-17 в слезной жидкости более 27,0 пг/мл сопряжено с I стадией ПОУГ (%2=8,64 при 2 степени свободы, р<0,05).

Для анализа качества представленной модели для использования 1Ь-17 в качестве дополнительного критерия ранней стадии ПОУГ диагностики было проведено исследование с использованием логистической регрессии 1 и ЯОС-анализа. При выполнении бинарного логистического регрессионного анализа

пошагово были исключены предикторы отрицательно классифицированных примеров. В окончательной модели регрессии сохранилось независимое влияние уровня 1Ы7 при ранней диагностике ПОУГ.

При построении КОС - кривой для 1Ь-17 у пациентов с ПОУГ площадь под кривой составила 0,90. Оценка КОС - кривой свидетельствовала о высокой прогностической значимости составленной модели.

При II стадии ПОУГ отмечено увеличение локального уровня ТЬ 1 маркерного цитокина — 1НЫу, повышение содержания 1Ь-1р, 1Ь-2 и его растворимого рецептора. Сохраняется увеличение ТврРг и 1Ь-17, но значения последнего достоверно ниже, чем при I стадии болезни. Выявлен пониженный уровень ТСР[3] (не отличающийся от I стадии ПОУГ), определен дефицит 1Ь-10. Проводя комплексную оценку локального уровня цитокинов при II стадии ПОУГ, выявлен ТЬ 1 тип ответа с угнетением противовоспалительной активности клеток врожденного иммунитета.

В III стадии ПОУГ зафиксировано локальное нарастание 1Ь-1р и 1Ь-6 и повышенный уровень (не отличающийся от II стадии) 1Ь-17 и №N7. Выявлено относительное снижение (до референсных величин) локальной концентрации 1Ь-2 и его растворимого рецептора, что может свидетельствовать об истощении их продукции или повышенном образовании соответствующих комплексов.

Оценка противовоспалительных медиаторов у пациентов с III стадией ПОУГ показала изменение баланса в сторону усиления продукции и секреции большинства из них: в 4 раза увеличился уровень 11.-4, статистически значимо (по сравнению с контролем и I стадией ПОУГ) нарастало содержание ТОрРг, концентрация 1Ь-10 умеренно повышалась (по сравнению со II стадией ПОУГ). Отличительным признаком ПОУГ III стадии был локальный дефицит ТОРР]. Увеличение 1РЫу и 1Ь-4 с превалированием уровня последнего характеризует ТЬ 2 тип иммунного ответа при ПОУГ III стадии.

В нашем исследовании была поставлена задача проанализировать локальный уровень ММР-9, ее тканевого ингибитора I типа и комплексов ММР-9 с тканевым ингибитором I и II типа, а также рассчитать коэффициент соотношения ММР-9 к Т1МР-1 у пациентов с первичной открытоугольной и первичной закрытоугольной глаукомой.

В общей когорте пациентов с глаукомой выявлено статистически значимое увеличение ММР-9, ММР-9/Т1МР-1, ММР-9/Т1МР-Н при низких значениях Т1МР-1. Определено, что у женщин с глаукомой в слезной жидкости значимо повышено содержание ММР-9 и ее комплекса Т1МР-1 (р<0,01), тогда как количество комплексов ММР-9/Т1МР-П как у женщин, так и у мужчин было повышенным, но не зависело от пола. Не установлено половых различий уровня Т1МР-1 в слезной жидкости обследованных пациентов.

Сравнительный анализ локального уровня ММР-9, ее комплексов с Т1МР-1 и Т1МР-Н, а также отдельно тканевого ингибитора I типа у пациентов с ПОУГ и ПЗУГ позволил констатировать, что более выраженные нарушения в системе белков, регулирующих состояние внеклеточного матрикса, отмечены при ПОУГ (рис. 6). У этой категории пациентов существенные сдвиги зарегистрированы уже при I (начальной) стадии. Повышение ММР-9 в слезной жидкости более 90,0 нг/мл можно рассматривать как дополнительный критерий диагностики ПОУГ (ч2=17,36; р<0,00001, 2 ст. свободы), ее содержание повышено в 2,5-3 раза по сравнению с контролем и в 2-2,5 раза по сравнению с пациентами с ПЗУГ.

В более продвинутых стадиях как ПОУГ, так и ПЗУГ локальный уровень ММР-9 статистически значимо нарастал (р<0,05), но при II стадии у пациентов с ПОУГ значения желатиназы В в среднем в 2 раза были выше, чем у лиц с ПЗУГ (рис. 6). Только при III стадии глаукомы в обеих группах локальное содержание ММР-9 было существенно повышенным как по сравнению с более ранними стадиями болезни, так, особенно, по отношению к контролю (в 8-10 раз).

ИОС-анализ позволил установить, что для показателя ММР-9 более 90 нг/мл интервал А11С составил 0,79, что позволяет характеризовать представленную модель, как высоко прогностичную.

Проведя корреляционный анализ уровня цитокинов в слезной жидкости и белков, отражающих состояние межклеточного матрикса, установлены как общие закономерности в группах пациентов с ПОУГ и ПЗУГ, так и различия.

1 1 1 а "

I

1 •

1

шм

ПОУГ I стадия

ПЗУГ I стадия

М1

1МР-9/Т1МР-1 1ИМР-9/Т1МР-«М-9:Т1МР-Т1МР-ММР-9

-6

•1 4 9

ПОУГ II стадия

/пмм )/пмр-1 тми

14

5 Ю 15 20 25 30 ПОУГ III стадия

МММ/ПММ1 Ч/ПММ

ММР-

ММ-1

пмм

10 и 1-3

ПЗУГ II стадия

; 10 !5 20 25 ПЗУГ III стадия

Рис.6. Схематическое изображение дисбаланса содержания белков, регулирующих состояние межклеточного матрикса в слезной жидкости у пациентов с глаукомой относительно границы контроля ( | ).

Установлено, что при ПОУГ стимулируют выработку ММР-9 целый ряд провоспалительных цитокинов (IL-Iß, IL-17) и TGFß2 независимо от стадии. В развитой стадии ПОУГ стимулирующий эффект оказывают IL-2, его растворимый рецептор и IFNy, а при III стадии ПОУГ усиливает продукцию ММР-9 как про-, так и противовоспалительные цитокины, особенно TGFß2.

Тканевой ингибитор металлопротеиназ на I стадии ПОУГ стимулируется IFNy и TGFßi, тогда как IL-17 и IL-10 угнетают его продукцию. При II стадии ПОУГ прямая корреляция с TIMP I выявлена для IL-10, тогда как TGFß2 угнетает продукцию TIMP I. При III стадии ПОУГ взаимосвязи изменялись: определена прямая корреляция IL-6 с TIMP I, и обратная с большинством исследованных медиаторов, за исключением IL-2, srIL-2, IL-10.

При ПОУГ I стадии образование комплексов MMP-9/TIMP I и MMP-9/TIMP II в разной степени стимулировали IL-lß, IL-17, IL-10, TGFß2 и srIL-2. При II стадии ПОУГ их продукцию дополнительно стимулируют IL-2 и IFNy, при III стадии ПОУГ - IL-6 и IL-4, тогда как IL-2 и srIL-2 утрачивают этот эффект.

При всех стадиях ПОУГ угнетающее действие на образование комплексов ММР-9 и его ингибиторов I и II типа оказывают TGFß2, а при II стадии этот эффект имеет IL-10.

При ПЗУГ выявлены иные закономерности. При ранней стадии ПЗУГ статистически достоверных корреляций локального уровня цитокинов и исследованных белков, регулирующих состояние внеклеточного матрикса, не выявлено, за исключением прямой корреляции srIL-2 с коэффициентом соотношения ММР-9 и TIMP I и комплексов MMP-9/TIMP I и MMP-/TIMP II.

При II и III стадиях ПЗУГ количество корреляций и их направление существенно меняется. Образование ММР-9 во II-III стадиях ПЗУГ стимулируют IL-lß, IL-2, srIL-2 и TGFß2, дополнительно при II стадии - IL-17, а при III стадии -IFNy. Угнетают выработку ММР-9 TGFß2 при всех стадиях ПЗУГ. При II и III стадиях ПЗУГ выработку TIMP усиливает IL-17.

Образование комплексов MMP-9/TIMP I и MMP-9/TIMP II прямо коррелирует с IL-lß, IL-2, srIL-2 у пациентов со II и III стадиями ПЗУГ. Но IFNy на II стадии также усиливает их продукцию, а на III стадии связь становится недостоверной. IL-17

также на II стадии стимулирует образование ММР-9/Т1МР I; а в третьей стадии направление связи меняется на противоположное. Тврр! усиливает выработку комплексов металлопротеиназы 9 с ее ингибиторами только на III стадии ПЗУГ. Достоверная обратная корреляция выявлена между ТОрр2 и комплексами ММР-9/Т1МР I и ММР-9/Т1МРII на II стадии ПЗУГ.

Иммунологическая оценка эффективности схем терапии при ПОУГ позволила выявить существенное влияние комбинированной терапии (медикаментозная и лазерная трабекулопластика) на локальный уровень про- и противовоспалительных цитокинов и белков, влияющих на состояние межклеточного матрикса при ПОУГ I и II стадии.

При III стадии ПОУГ зарегистрировано снижение 1Ь-1р и ММР-9, однако, их содержание оставалось выше нормальных величин. Отмечено снижение 1Ь-6, 1Ь-17 и 1Р1Чу до уровня контроля.

При I стадии ПЗУГ установлено повышение локального уровня 8я1Ь-2 до контрольных значений. Содержание 1Ь-1Р, 1Ь-6, 1Г-2, 1Ь-17 и 1Г'Ыу осталось в пределах нормы. При II стадии ПЗУГ на фоне терапии снижались до контрольных значений содержание 1Ь-1Р, 1Ь-17. Уровни 1Ь-2 и бк1Ь-2 также снизились, но не достигали показателей контроля. При III стадии ПЗУГ концентрация провоспалительных цитокинов осталась без изменений.

Оценка содержания противовоспалительных цитокинов 1Ь-10, 1Ь-4, ТСРР1 и Тврр2 при ПЗУГ всех 3 стадий на фоне лечения не выявила значимых изменений.

Уровень ММР-9/Т1МР-1 при I стадии ПЗУГ нормализовался. Содержание ММР-9/Т1МР-Н снизилось, но оставалось выше референсных величин. При II стадии ПЗУГ на фоне лечения отмечалось снижение уровня ММР-9, ММР-9/Т1МР-1 и ММР-9/Т1МР-Н, но их концентрация не достигала уровня контроля. При ПЗУГ III стадии снижалось только содержание ММР-9, но оставалось выше (р<0,001) контрольных значений.

Комплексная оценка исследованных цитокиновых показателей и белков, отражающих состояние внеклеточного матрикса, при комплексной терапии с использованием лазерных технологий позволяет считать наиболее значимым иммунологическим маркером ее эффективности снижение уровня 1Ь-17 при ПОУГ,

тогда как при ПЗУГ таким показателем можно считать ^11^-2 (нормализацию его

показателей).

Проведенные исследования позволили сделать следующие выводы.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что сывороточный и, особенно, локальный цитокиновый профиль при ПОУГ характеризовался гиперпродукцией провоспалительных цитокинов с увеличением удельного веса 1Ь-17 на I и II стадии и ТОрРг- на III стадии ПОУГ.

2. При ПЗУГ I стадии локальный и системный профиль цитокинов на I стадии практически не отличался от референсных величин. При II стадии локально повышался удельный вес 1Ь-2 и а в сыворотке крови - ТОрРь Для III стадии ПЗУГ характерно локальное увеличение ТСРР1 и ПТЧу, а в сыворотке крови - ТОРР^

3. У пациентов с глаукомой выявлены нарушения в системе металлопротеиназы-9 и ее тканевых ингибиторов I и II типа, характеризующиеся локальной гиперпродукцией ММР-9 и образованием ее комплексов с Т1МР-1 и Т1МР-П при недостатке свободного тканевого ингибитора I типа. При ПЗУГ определено одновременное повышение уровня комплексов ММР-9/Т1МР-1 и ММР-9/Т1МР-П за счет увеличения ММР-9 и ее тканевых ингибиторов.

4. Корреляции ММР-9 и ее комплексов с цитокинами подтверждают роль гиперцитокинемии в повреждении межклеточного матрикса при всех стадиях ПОУГ и II и III стадиях ПЗУГ.

5. Применение лазерной трабекулопластики обеспечило восстановление локального цитокинового статуса при I и II стадии ПОУГ. При III стадии влияние комбинированной терапии на системные и локальные иммуно-биохимические нарушения минимальны.

6. При ПЗУГ применение лазерной иридэктомии не оказывало влияния на состояние цитокинового статуса и системы ММР-9 при I стадии. При II стадии ПЗУГ на фоне терапии отмечено восстановление уровня 1Ь-1р, 1Ь-17,1Ь-2 и

2, снижение ММР-9 и ее комплексов с Т1МР-1 и Т1МР-Н (р<0,05). При ПЗУГ III стадии умеренно снижалось количество ММР-9, уровень про- и противовоспалительных цитокинов не изменялся.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЕ

1. Для неинвазивной диагностики ранней (I) стадии ПОУГ использовать определение в слезной жидкости IL-17 и ММР-9:

- повышение уровня IL-17 более 27 пг/мл (13,20; 158,20);

- повышение уровня ММР-9 более 90 нг/мл (88,90; 146,30).

2. Дополнительным дифференциально-диагностическими критериями III стадии ПЗУГ являются высокий уровень комплексов MMP-9/TIMP-I (>380,0 пг/мл) и MMP-9/TIMP-II (>90 пг/мл) в слезной жидкости.

3. Применение малоинвазивных операций (лазерных) целесообразно при ПОУГ I и II стадии.

При ПОУГ использовать операцию трабекулопластики (иммунологические критерием ее эффективности является нормализация уровня IL-17). При ПЗУГ применять операцию лазерной иридэктомии (иммунологическим критерием эффективности является нормализация уровня srIL-2).

Литература

1. Кириенко A.B., Рукина Д.А. Значение матриксной металлопротеиназы в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы // Тихоокеанский медицинский журнал. — 2012. —№3. — С.41-43.

2. Кириенко A.B., Маркелова Е.В. Состояние межклеточного матрикса у пациентов с глаукомой // Современные проблемы науки и образования. -2013. - № 6; URL:http://www.science-edication.ru /113-11261 (дата обращения: 24.12.2013).

3. Характеристика системы цитокинов и ее роль в патогенезе первичных глауком / Кириенко A.B., Маркелова Е.В., Чнкаловец И.В., Догадова Л.ПЛ Фундаментальные исследования. - 2014. - №2. - С. 100-107.

4. Кириенко A.B., Зимина И.Н. К проблеме использования лазерного лечения глаукомы // Междунар. журн. по иммунореабилитации. - 2010. - №4. - С. 63.

5. Кириенко A.B. Локальный цитокиновый профиль пациентов с разными стадиями первичной открытоугольной глаукомы // Российский аллергологический журнал. - 2012. - №5, вып. 1. - С. 108-109.

6. Кириенко A.B., Маркелова Е.В. Оценка локального уровня цитокинов у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой // Вестник уральской медицинской академической науки. — 2012. -№4(41). - С. 121.

7. Кириенко A.B., Рукина A.B., Догадова Л.П. К вопросу о патогенетической роли трансформирующих ростовых факторов при глаукоме // Российский аллергологический жупнал. —2013. - №2, ч.2 - С.134-135.

8. Kirienco А.V., Markelova E.V. Changes in cytokine system of lacrimal fluid in case of glaucoma // The XXXI Congress of the ESCRS, Amsterdam, 5-9 oct. 2013. http: // escrs.org/amsterdam2013/programme/posters-details.asp?id=19514.

9. Кириенко A.B., Маркелова E.B., Догадова Л.П. Оценка состояния локальных факторов врожденного иммунитета для определения стадии и дифференциальной диагностики глауком (метод, рекомендации). - Владивосток : ООО «Литера V», 2013.-18 с.

Список сокращений

ИФА — иммуноферментный анализ

ОСТ - оптическая когерентная томография

ПЗУГ — первичная закрытоугольная глаукома

ПОУГ - первичная открытоугольная глаукома

IFN - интерферон

IL — интерлейкин

ММР — матриксные металлопротеиназы

srIL-2 — растворимые рецепторы интерлейкина-2

TGF - трансформирующий фактор роста

Thl - Т-лимфоциты - хелперы 1 типа

Th2 - Т-лимфоциты - хелперы 2 типа

TIMP - тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ

Кириенко Андрей Владимирович

СОСТОЯНИЕ ЛОКАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ИЗАКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 31.03.2014. Формат 60x84/16. Бумага писчая. Уч.- изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №343 Отпечатано в типограф™ ИПК МГУ им. адм. Г.И. Невельского 690059 г. Владивосток, ул. Верхнепортовая, 50а