Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Состав и физико-химические свойства экстрактов трутовых грибов

На правах рукописи

[ЫИ

НОСОВ АНТОН ИГОРЕВИЧ

СОСТАВ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭКСТРАКТОВ ТРУТОВЫХ ГРИБОВ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

21 МОЯ 2013

Казань - 2013 005539483

005539483

Работа выполнена на кафедре пищевой биотехнологии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет»

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Сысоева Мария Александровна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор,

ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова», профессор кафедры органической химии Каплун Александр Петрович

доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия», профессор кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии Молохова Елена Игоревна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Нижегородская

государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «13» декабря 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 при ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» по адресу: 420015, г.Казань, ул.К.Маркса, 68, зал заседаний Ученого совета (А-330).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского национального исследовательского технологического университета.

Отзывы на автореферат в 2х экземплярах просим направлять по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса 68, КНИТУ, учёному секретарю диссертационного совета Д 212.080.07

Автореферат разослан « ноября 2013 г.

Ученый секретарь ¿¿7

диссертационного совета -- Нугуманова Гульнара Наиловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Трутовики — плоский, ложный и окаймлённый - используются в народной медицине для лечения таких заболеваний, как рак, диабет, гнойная инфекция и т.д. Количество извлекаемых из них водой биологически активных веществ (БАВ) составляет менее 1 %, что очевидно недостаточно для получения на их основе эффективных лекарственных средств. Следует также отметить, что к настоящему времени наиболее полно исследован состав извлекаемых из трутовиков органическими растворителями терпенов, что же касается данных о белках и углеводах, то их в литературе содержится чрезвычайно мало, отсутствуют и сведения о физико-химических свойствах хромогенных комплексов.

Исследование химического состава перечисленных веществ, а также увеличение их концентрации в экстрактах позволит существенно улучшить их биологические свойства, а в дальнейшем разработать на их основе эффективные галеновые лекарственные препараты.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федера11ии в райках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического компчекса России на 2007-2013 годы» по госконтракту № 01201252915 от 28.02.2012 г. тема: "Разработка биологически активных добавок на основе супрамолекулярных бионаносистем". Автор прини-мач активное участие в организаг(ии Всероссийской молодёжной научной школы «Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности» по государственному контракту № 12.741.11.0101 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Цель работы. Разработать способы экстракции трутовиков плоского, ложного и окаймлённого, позволяющие получить с высоким выходом БАВ, исследовать их физико-химические и биологические свойства.

Для достижения цели решались следующие задачи:

- обеспечить максимальный выход хромогенных комплексов, обладающих высокой антиоксидантной активностью (АОА), разработав способы экстракции трутовых грибов;

- применив методы электронной микроскопии, ИК- и электронной спектроскопии, электрофореза, исследовать хромогенные комплексы трутовиков плоского, ложного и окаймлённого с целью отнесения их к меланинам;

- используя кондуктометрический анализ, фотонно-корреляционную спектроскопию (ФКС) и стандартные методики по выявлению устойчивости дисперсных фаз к различным осаждающим агентам, охарактеризовать

коллоидные системы водных экстрактов грибов с точки зрения устойчивости их дисперсных фаз;

- определить содержание фенольных, углеводных соединений и белков в экстрактах, а также входящих в их состав при выделении меланинах и фильтратах;

- установить количественный и качественный состав липофильных веществ, содержащихся в экстрактах трутовых грибов, полученных различными способами экстракции;

- оценить острую токсичность экстрактов трутовиков плоского и окаймлённого как перспективных для разработки галеновых препаратов;

- дать характеристику бактериостатической и фунгистатической активности экстракта трутовика окаймлённого.

Научная новизна работы. Впервые для интенсификации процесса экстракции трутовиков плоского и окаймлённого были использованы щелочные экстрагенты, дробная экстракция (ремацерация), а также мацерация с сверхвысокочастотной (СВЧ) обработкой.

Доказано, что хромогенные комплексы трутовиков плоского, ложного и окаймлённого относятся к меланинам, организованы в виде частиц, диаметр которых составляет 100-200 нм.

Впервые определено, что коллоидная система экстракта трутовика плоского, полученного ремацерацией сырья водой, более агрегативно устойчива, чем коллоидная система экстракта трутовика окаймлённого, полученного тем же способом.

Устойчивость коллоидных систем экстрактов трутовика окаймлённого зависит от: способа её получения - при применении в экстракции СВЧ-обработки устойчивость коллоидных систем повышается; при увеличении рН до 13 спиртовым раствором щёлочи, происходит осаждение её дисперсной фазы.

Определён состав и количество липофильных веществ экстрактов трутовика окаймлённого и показано, что они представлены терпеноидами, циклическими дипептидами, гликолипидами, фосфолипидами.

Практическая ценность работы. Полученные меланины трутовиков плоского и окаймлённого с высоким выходом (12 %) и АО А перспективны для разработки на их основе высокоэффективных антиоксидантов.

Впервые получены экстракты и фильтраты трутовика окаймлённого с высоким содержанием таких БАВ, как углеводы, белки и фенольные соединения с количеством, находящимся на одном уровне с содержанием этих веществ в экстракте чаги.

Установлено, что по острой токсичности экстракты трутовиков плоского и окаймлённого относятся к малотоксичным веществам и в них не об-

наружены токсичные элементы, содержание которых нормируется в биологически активных препаратах, полученных на основе природного сырья.

Бактериостатическая активность экстрактов трутовика окаймлённого находится на одном уровне с «Бефунгином», поэтому они могут быть использованы для создания на их основе высокоэффективных галеновых препаратов, обладающих антибактериальными свойствами.

По способам выделения меланина из трутовиков плоского и окаймлённого получены два патента на изобретение.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследований внедрены на кафедре Пищевой биотехнологии ФГБОУ ВПО «КНИТУ» в учебный процесс студентов, обучающихся по специальности «Биотехнология» по дисциплине «Прикладная биохимия», и магистрантов, обучающихся по направлению «Биотехнология» и дисциплине «Бионанотехноло-гия в фармации».

На защиту выносятся: положения, сформулированные в разделе Научная новизна работы и в выводах.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на: XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград,

2011 г.); V Всероссийской конференции с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2012 г.); II Всероссийской молодёжной научной конференции «Химия и технология новых веществ и материалов» (Сыктывкар, 2012 г.); VII Международной научной конференции «Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация и материалы нового поколения» (Иваново,

2012 г.); XII Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2012 г.); XIII Международной научно-технической интернет-конференции «JIec-2012» (Брянск, 2012 г.); Всероссийской молодежной научной школе «Биоматериалы и нанобиома-териалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности» (Казань, 2012 г.); Всероссийской конференции «Современные проблемы химической науки и образования» (Чебоксары, 2012 г.); 77-ой Всероссийской научной конференции студентов и молодых учёных с международным участием «Молодёжная наука и современность» (Курск, 2012 г.); Всероссийской молодёжной конференции «Химия поверхности и нанотехноло-гия» (Казань, 2012 г.).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 3 статьях в журналах, рекомендованных для размещения материалов диссертации, 11 тезисах докладов на конференциях, 2 патентах на изобретение.

Личный вклад автора. Автор принимал участие в постановке цели и задач исследования, проведении экспериментов, обработке и интерпрета-

ции полученных результатов, формулировке научных выводов, написании и оформлении статей.

ИК-спектры сняты в «Нижегородской государственной медицинской академии» совместно с д.х.н., профессором Мельниковой Н.Б. Бактерио-статическая и фунгистатическая активности определены в «Казанском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии» совместно с Лисовской С.А. В «Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова» проведены оценка токсичности совместно с Ланцевой A.B. и д.б.н., профессором Зобовым В.В., а также хромато-масс-спектрометрический анализ совместно с к.х.н., заведующим лабораторией Ризвановым И.Х. АОА определена в «Казанском (Приволжском) федеральном университете» совместно с к.х.н., старшим преподавателем Зият-диновой Г.К. Электронная микроскопия проведена в «Центральном научно-исследовательском институте геологии нерудных полезных ископаемых» совместно с д.г.-м.н. Гревцевым В.А. Качественный элементный состав определён в «Казанском национальном исследовательском технологическом университете» на оборудовании ЦКП «Наноматериалы и нано-технология» совместно с д.х.н., профессором Юсуповым P.A.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трёх глав, выводов, библиографического списка. В тексте приведены ссылки на 225 литературных источников. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, содержит 36 рисунков, 53 таблицы.

Основное содержание работы

В первой главе представлен обзор литературы. Описан спектр БАВ, синтезируемых трутовыми грибами, показано разнообразие их химической природы и проявляемой ими биологической активности. Проведено сравнение степени изученности БАВ, извлекаемых из трутовых грибов, относящихся к разным классам соединений. Показано, что свойства хромоген-ных комплексов, выделенных из различных грибов, остаются на сегодняшний день мало изученными. Обоснована необходимость увеличения выхода БАВ в экстрактах трутовых грибов, а также исследования их состава и свойств.

Во второй главе изложена экспериментальная часть работы. Представлены разработанные способы экстракции трутовых грибов и стандартные методы анализа получаемых экстрактов. Описаны стандартные и разработанные методики выделения меланина из экстрактов с применением различных осаждающих агентов. Приведены стандартные методики выделения липофильных веществ из экстрактов трутовиков.

АОА меланинов и экстрактов определена кулонометрически с использованием потенциометра П-5827М. Электронные снимки частиц мелани-

нов получены на микроскопе-микроаналнзаторе ЭММА-4. УФ-спектры сняты на спектрофотометре UNICO 2800 UV/VIS. ИК-спектры меланинов получены на ИК-спектрометре Shimadzu. ФКС коллоидных систем экстрактов, фильтратов и растворов меланинов проведена на спектрометре «PhotoCor Complex». Качественный элементный состав экстрактов определён на универсальном рентгенофлуоресцентном спектрометре СУР-02 «Реном ФВ». Хромато-масс-спектрометрический анализ осуществлён на приборе DFS Thermo Electron Corporation. Острая токсичность определена по стандартной методике на белых беспородных мышах обоего пола. Фун-гистатическая и бактериостатическая активности экстрактов оценены по обильности роста тестируемых микроорганизмов.

Третья глава содержит обсуждение полученных результатов.

Физико-химические свойства экстрактов трутовых грибов, полученных ремацерацией водой. Трутовики плоский, ложный и окаймлённый экстрагировали ремацерацией водой по стандартной методике, используемой для получения экстрактов чаги. В таблицах 1 и 2 показано, что в водных экстрактах трутовиков, как и в экстракте чаги, содержатся хромогенные комплексы, углеводы, фенолы, белки и зольные вещества, но содержание этих веществ, за исключением углеводов, в экстрактах трутовиков значительно меньше, чем в экстракте чаги.

Таблица 1 - Физико-химические характеристики экстрактов трутовых гри-

Сырьё трутовики Сухой остаток, г/100 мл Зольность, % от сухих веществ экстракта Выход хромогенного комплекса, % от сырья АОА хромо-генного комплекса, кКл/100 г

чага 1,8860±0,0220 20,69±0,25 9,84±0,14 43,00±1,00

плоский 0,7623±0,0380 16,70±0,72 0,31 ±0,01 20,00±1,00

ложный 0,3837±0,0100 7,69±0,24 0,59±0,03 19,30±0,90

окаймлённый 0,5263±0,0150 8,10±0,32 0,38±0,01 25,00±2,00

Таблица 2 - Содержание фенолов, углеводов, белков и АОА экстрактов трутовых грибов, полученных ремацерацией сырья водой_

Сырьё трутовики Содержание в экстракте АОА экстракта, К л/мл АОА сухого экстракта, кКл/100 г

углеводов, мкг/мл фенолов, мкг/мл белков, мкг/мл

чага 2145±93 178,60±1,70 92,90±3,20 3,10±0,09 23,0±1,0

плоский 3467±130 30,87±1,87 62,50±1,70 0,66±0,03 13,9±0,7

ложный 2474±149 25,80t 1,25 47,34±1,82 0,53±0,03 10,6±0,4

окаймлённый 2321±54 27,20±1,20 27,50±1,00 0,67±0,03 16,0±0,7

Наибольшее количество углеводов можно наблюдать в экстракте трутовика плоского, оно в 1,5 раза превышает содержание углеводов в экс-

7

тракте чаги, благодаря чему экстракт трутовика плоского может быть перспективным объектом для дальнейшего исследования его биологических свойств.

Как показано в таблицах 1 и 2, сухие экстракты трутовиков обладают высокой АОА, но активность самих хромогенных комплексов и экстрактов трутовых грибов ниже, чем у чаги. Низкая АОА экстрактов грибов по сравнению с чагой может объясняться невысоким выходом сухих веществ и хромогенного комплекса в экстрактах.

Среди всех компонентов, выделенных из трутовиков, наибольший интерес представляют хромогенные комплексы. Их природа пока не установлена, но как и меланин чаги, они обладают высокой АОА, их легко выделить снижением рН экстракта до 1-2. Если эти комплексы сходны по химической природе с меланином, то они могут обладать и другими химическими и биологическими свойствами, аналогичными меланину чаги.

Химическая природа и организация хромогенных комплексов трутовых грибов. В данной работе впервые исследованы структурная организация и химическая природа этих объектов в сравнении с меланином чаги. Характерной особенностью меланина чаги является то, что он представляет собой сложноорганизованную частицу. С помощью электронной микроскопии установлено (рисунок 1), что хромогенные комплексы трутовиков также являются частицами, состоят из окрашенного (хромоген) и неокрашенного (белково-полисахаридный матрикс) компонентов и имеют неправильную форму. Их диаметры составляют: у трутовиков плоского -100 нм, окаймлённого - 200 нм и ложного - 170 нм, что в 2 раз меньше, чем у меланина чаги. Методом ФКС также показано, что меланины этих грибов в водном растворе существуют в виде частиц с диаметром 154, 220 и 130 нм, соответственно.

трутовик плоский Рисунок 1

500 нм

трутовик окайм- трутовик чага (литератур-лённый ложный ные данные)

- Снимки хромогенных комплексов трутовых грибов

Для сопоставления химической природы хромогенных комплексов трутовиков плоского, ложного, окаймлённого и меланина чаги они были исследованы с помощью электронной и ИК-спектроскопии. На ИК-спектрах хромогенных комплексов трутовиков присутствуют все характерные для

меланина чаги полосы поглощения, что указывает на сходство их структуры на молекулярном уровне. Наблюдается некоторое перераспределение полос на анализируемых спектрах, например, в области 2900, 1600, 1300 см"1, это может свидетельствовать об отличии в компоновке агрегатов различных соединений в составе частиц меланинов. На спектре меланина чаги, в отличие от спектров трутовых грибов, имеющих интенсивные полосы поглощения только в области 1620 и 1400 см"1, свидетельствующие о присутствии в них карбоксильных групп, участвующих в соле- и комплек-сообразовании, присутствуют дополнительные интенсивные полосы в области 1240 см"1 и 1720 см"1, соответствующие свободным карбоксильным группам, и полоса амид II в области 1504 см"1. Это указывает на его более сложную организацию на молекулярном уровне. Описанные изменения в спектрах могут быть обусловлены различием в организации как хромогена, так и белково-полисахаридного матрикса исследуемых объектов. На электронных спектрах хромогенных комплексов трутовых грибов показан характерный для меланина пик при длине волны 216 нм и плечо при длине волны 262 нм, как и на спектре меланина чаги.

Проведённое исследование подтверждает, что хромогенные комплексы трутовиков плоского, ложного и окаймлённого по своей химической природе сходны с меланином чаги и также, как и меланин чаги, сформированы в виде сложноорганизованных частиц.

Выбор способа экстракции трутовых грибов для увеличения выхода и АОА меланинов. Выход меланинов, полученных ремацерацией трутовых грибов водой, оказывается в 10 раз меньше, чем при получении меланина чаги. Для интенсификации этого процесса была проведена экстракция грибов при повышенной температуре кипячением при 95 °С. Это позволило повысить выход меланинов до 0,7-1,5 %, однако их АОА были в 2 раза ниже по сравнению с меланинами, выделенными из экстрактов, полученных ремацерацией. Поэтому для дальнейшей интенсификации процесса экстракции трутовых грибов в качестве контроля использовали показатели экстрактов и меланинов, полученных ремацерацией. Подбор способов экстракции проведён для трутовиков плоского и окаймлённого, т.к. получаемые из них экстракты и меланины обладают большей АОА, чем у трутовика ложного.

Экстракция трутовиков >гчоского и окаймлённого мацерацией н ремацерацией растворами гидроксида натрия. В качестве экстрагента использовали раствор гидроксида натрия с концентрацией 0,4 г/л. Данная концентрация приведена в литературе для экстракции растительного сырья [Пат. 2179978 Российская Федерация, МПК С 07 I 21/00, С 07 I 71/00, С 07 I 73/00. Способ выделения сапонинов / В.Ф. Селеменев [и др.]; заявитель и патентообладатель Воронежский государственный университет.

№ 2000129545/04; заявл. 24.11.00; опубл. 27.02.02]. При смене экстрагента и применении ремацерации наблюдается увеличение выхода и АОА меланинов на 10-50 % по сравнению с ремацерацией водой, как показано в таблице 3. На следующем этапе интенсификации процесса проведено варьирование гидромодуля (1:6 или 1:4) на первой и второй стадиях ремацерации, продолжительности второй стадии экстракции (1 или 2 ч). При экстрагировании трутовика плоского дополнительно варьировали концентрацию гидроксида натрия в экстрагенте (0,4 и 4 г/л), как в [Бакулин, A.B. Физико-химические характеристики хитозан-меланиновых комплексов / A.B. Бакулин, В.П. Курченко, Н.В. Сушинская, И.И. Азарко, В.П. Варламов // Труды Белорусского государственного университета - 2006. - Т. 4. - № 2. -С. 290-297]. Оптимальные режимы ремацерации приведены в таблице 3. Экстрагирование трутовика окаймлённого раствором гидроксида натрия (0,4 г/л) в течение 3 ч с гидромодулем 1:10 позволило получить меланин с АОА 44 кКл/100 г, что в 2 раза выше, чем при экстракции гриба водой (контроль) или раствором гидроксида натрия в течение 10 ч. Ремацерацией трутовика плоского раствором гидроксида натрия (4 r/ii) в течение 3 ч с гидромодулем 1:12 получен меланин, АОА которого (33-40 кКл/100 г) находится на одном уровне с контролем, а выход меланина (5-6 %) превосходит контроль в 10 раз. Т.о., подбор условий проведения ремацерации грибов с применением растворов гидроксида натрия позволил получить: меланин трутовика окаймлённого, АОА которого в 2 раза выше, и меланин трутовика плоского, выход и АОА которого в 20 и 2 раз выше, чем при экстрагировании этих грибов ремацерацией водой.

Таблица 3 - Выход и АОА меланинов трутовых грибов, полученных ремацерацией сырья растворами гидроксида натрия __

Вид трутовика Способ экстракции Выход меланина, % от сырья АОА меланина, кКл/100 г

гидромодуль продолжительность. ч

окаймлённый контроль - ремацерация сырья водой, 10ч 0,38±0,01 25,00±2,00

плоский 0,31 ±0,01 20,00±1,00

ремацерация сырья раствором NaOH 0.4 г/л

окаймлённый 1:10 10 0,52±0,03 28,40±1,70

плоский 0,48±0,03 35,50±1,70

окаймлённый 1:10 3 0,52±0,01 44,00±1,60

плоский 1:12 3 0,77±0,01 19,09±0,89

ремацерация сырья раствором NaOH 4 г/л

плоский 1:10 3 4,82±0,22 33,00±2,00

плоский 1:12 2 5,69±0,14 37,00±2.00

плоский 1:12 3 6.28±0.25 40.00±2.00

Экстракция трутовика окаймлённого мацера1\ией с СВЧ-обработкой. Для интенсификации экстракции использован способ, включающий СВЧ-обработку с дальнейшим настаиванием при температуре 70 °С. Проведён подбор мощности СВЧ-обработки, способа выделения меланина из экстракта изменением рН, экстрагента (вода или растворы NaOH с концентрацией 2, 4, 10 г/л). Оптимальные значения выхода и АОА меланина достигнуты при проведении СВЧ-обработки мощностью 180 Вт, экстрагировании раствором NaOH (4 г/л) и выделении меланина раствором хлористоводородной кислоты. Как показано в таблице 4, при этих условиях экстракции получен меланин, выход и АОА которого соответственно в 30 и 2,5 раза выше, по сравнению с ремацерацией гриба водой.

После выделения меланина из экстракта остаётся фильтрат, который обычно не используется. Установлено, что фильтрат, полученный после мацерации с СВЧ-обработкой гриба раствором гидроксида натрия (10 г/л), содержит углеводы, фенолы и белки в количестве 1613 мкг/мл, 170 мкг/мл и 809 мкг/мл, соответственно, что в 5-10 раз превышает содержание этих компонентов в экстрактах и фильтратах, полученных экстракцией гриба водой, и является перспективным объектом для дальнейшего выделения из него и использования БАВ.

Таблица 4 — Выход и АОА меланинов трутовика окаймлённого, полученных мацерацией с СВЧ-обработкой (180 Вт) при оптимальных условиях

(экстрагент - раствор гидроксида нат рия с концентрацией 4 г/л)

Продолжительность мацерации, ч Выход меланина. % от сырья АОА меланина, кКл/100 г

контроль - ремацерация водой (10 ч) 0.38±0,01 25,00±2,00

0 9,55±0,45 65,00±3.00

0.5 И,97±0,50 60,00±4,00

3,0 11,53±0,22 61.00±4.00

Результатом работ по интенсификации экстракции трутовых грибов являются разработанные способы экстракции, защищенные патентами, позволившие увеличить выход меланина в 20 раз и его АОА в 2 раза по сравнению с ремацерацией водой. Фильтрат после выделения меланина из экстракта трутовика окаймлённого, полученного мацерацией с СВЧ-обработкой раствором гидроксида натрия с концентрацией 10 г/л, может быть использован в целях дальнейшего выделения из него и использования БАВ - углеводов, белков и фенольных веществ.

Исследование физико-химических свойств меланинов и коллоидных систем экстрактов трутовых грибов, полученных разными способами. Исследованы агрегативная устойчивость коллоидных систем экстрактов, состав и электрофоретическая подвижность меланинов трутовых грибов. Устойчивость коллоидных систем экстрактов оценивали по наличию в них

критических концентраций (С«р), свидетельствующих о переходном состоянии в исследуемой коллоидной системе, происходящих в ней процессах агрегации и дезагрегации дисперсной фазы. Показано, что экстракт трутовика плоского, полученный ремацерацией, имеет наиболее устойчивую коллоидную систему, поскольку в ней не выявлены СКр- Для коллоидных систем экстрактов трутовика окаймлённого, полученных ремацерацией и мацерацией с СВЧ-обработкой, показано существование трех и двух С«р. Установлено, что коллоидные системы этих экстрактов отличаются процессами, происходящими в них вблизи СКр (рисунок 2). Так, при уменьшении концентрации дисперсной фазы в первом экстракте преобладают процессы агрегации частиц, а во втором - процессы дезагрегации. Это может свидетельствовать о различии в структурной организации дисперсных фаз этих экстрактов. Вероятно, с этим связано меньшее количество СКр и более высокая устойчивость дисперсной фазы в экстракте трутовика окаймлённого, полученного мацерацией с СВЧ-обработкой, по сравнению с экстрактом, полученным ремацерацией.

а ¡3

&

%

О .

О

59

Л_{¡а3 ) -

_Концентрапия сухих веществ, г'200мл

ремацерация СВЧ - экстракция

Способ экстракции

Рисунок 2 - Размеры (эффективные радиусы) частиц дисперсной фазы экстрактов трутовика окаймлённого при разных концентрациях сухих веществ

в экстрактах

Исследована устойчивость коллоидных систем экстрактов трутовиков плоского, ложного и окаймлённого в отношении различных осаждающих агентов, результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5 — Выход меланинов, выделенных из экстрактов трутовых грибов зазными осаждающими агентами

Трутовики Выход меланина, выделенного с помощью

НС1. %' СС13СООН, % СаСЬ, % 1 % раствор КОП, %

плоский 0.31 ±0.01 0.61 ±0.04 0,73±0,03 н/о2

ложный 0,59±0,03 0,56±0,01 1.11 ±0.05 н/о

окаймлённый 0,38±0,01 0,29±0,01 1,02±0,07 1,56±0,05

Примечание: - от сырья; - не определяли

Установлено, что наименее агрегативно устойчивы коллоидные системы экстрактов грибов, полученных ремацерацией водой, в отношении раствора хлорида кальция и щелочей, что, по-видимому, связано с изменением заряда частиц меланинов.

Эти показатели имеют прикладное значение, поскольку влияют на устойчивость коллоидных систем экстрактов при хранении.

Исследовано изменение состава меланинов при использовании для их выделения различных осаждающих агентов. Из рисунка 3 следует, что выбор способа выделения меланина из экстракта трутовика окаймлённого позволяет получить меланин с большим содержанием в нём белков (при выделении меланина раствором трихлоруксусной кислоты) или углеводов (при выделении меланина спиртовым раствором гидроксида калия), что может сказаться на проявлении ими физико-химических и биологических свойств.

О содержание в экстракте 2500 п

э осадилось

30 -|

□ содержание в фильтрате 30 т

фенолы

белки

выделение меланина раствором три-хлоруксусной кислоты

□ содержание в фильтрате

40

углеводы

фенолы

белки

выделение меланина спиртовым раство-_ром КОН (0,5 %)_

Рисунок 3 - Количество углеводов, белков и фенолов, перешедших в фильтрат трутовика окаймлённого и соосадившихся вместе с меланином, после его выделения разными способами

Исследована электрофоретическая подвижность меланинов трутовых грибов методом горизонтального электрофореза. Показано, что меланины трутовиков плоского и окаймлённого содержат фракции хромогенов, подвижные как в сторону катода, так и в сторону анода. Однако в составе меланина трутовика окаймлённого содержится больше фракций, подвижных в сторону анода; а хромогены трутовика плоского характеризуются большей интенсивностью окраски и подвижностью. Различия электрофорети-ческой подвижности фракций хромогенов грибов подтверждают то, что меланины трутовиков плоского и окаймлённого, хотя и схожи по природе, но различаются по способу организации компонентов, составляющих их частицу, и по свойствам входящих в их состав веществ.

Т.о., экстракты и меланины трутовых грибов, полученные разными способами, различаются по своим физико-химическим свойствам (агрегатив-

ной устойчивости, составу и электрофоретической подвижности), что может сказаться и на проявляемых ими биологических свойствах.

Исследование состава липофильных веществ экстрактов трутовых грибов. Известно, что в плодовых телах трутовиков плоского и окаймлённого содержатся биологически активные липофильные вещества в количестве до 4 % от массы гриба, но при этом не установлено, переходят ли эти соединения в водные экстракты [Yoshikawa, К. Lanostane triterpenoids and triterpene glycosides from the fruit body of Fomitopsis pinicola and their inhibitory activity against COX-1 and COX-2 / K. Yoshikawa, M. Inoue, Y. Matsu-moto, C. Sakakibara, H. Miyataka, H. Matsumoto, S. Arihara // Journal of natural products. - 2005. - Vol. 68. - P. 69-73.].

Впервые из водных экстрактов трутовиков плоского и окаймлённого была выделена липофильная компонента в количестве 0,5 % и 2 % от сухих веществ экстракта соответственно. В её составе с помощью тонкослойной хроматографии и качественных реакций были обнаружены соединения, отнесённые к терпеноидам (и иридоидам в частности), гликолипидам и фос-фолипидам. Исследовано содержание липофильных веществ в экстрактах трутовика окаймлённого, полученных четырьмя способами и характеризующихся разным содержанием меланина. Как видно из таблицы 6, содержание липофильной компоненты в экстрактах коррелирует с содержанием в них меланина. Состав липофильных соединений, выделенных из разных экстрактов этого гриба, исследован методом хромато-масс-спектрометрического анализа. Как показано в таблице 6, наибольшее количество липофильных БАВ идентифицировано в экстракте, полученном ре-мацерацией водой в течение 10 ч, и в экстракте, полученном ремацерацией раствором гидроксида натрия в течение 3 ч.

Таблица 6 - Содержание и состав липофильных компонентов экстрактов трутовика окаймлённого_

Способ получения экстракта Выход меланина, °Л от сырья Содержание липофильной компоненты, % от сухого остатка Количество обнаруженных соединений' Идентифицированные БАВ2

ремацерация 10 ч, экстрагент вода 0,38±0,01 2,11±0,12 12 ЦЛП, ЦЛФ, цфп,о

ремацерация 10 ч, экстрагент NaOH 0,52±0,03 3,31±0,22 5 ЦЛП, Л

ремацерация 3 ч, экстрагент NaOH 0,60±0,03 7,20±0,52 19 ЦЛП, ЦФП, С

мацерация 0,5 ч с СВЧ-обработкой, экстрагент NaOH 11,97±0,50 23,93±1,05 10 С

Примечание: - определено методом хромато-масс-спектрометрического анализа " - структуры и названия БАВ приведены на рисунке 4

гА> о _ O^RJ VJ^^IAO спфэ о

:уд = 13,05 мин. m/z = 154 tv„= 18.32 мин. m/z = 91 tv„ = 18,65 мин, m/z = 91

цикло(лейцилпролил) (ЦЛП) цикло(лейцилфенилаланил) (ЦЛФ) цикло(фенилаланилпролил) (ЦФП)

к>

tva = 22,95 мин tyj, = 4,06 мин, m/z = 68 tva = 24,22 мин. m/z = 129

олеамид (О) лимонен (J1) сквален (С)

Рисунок 4 — Структуры веществ, приведённых в таблице 6

Применённый метод выделения липофильной компоненты позволил впервые показать наличие в экстрактах трутовика окаймлённого циклических дипептидов, сквалена, олеамида, лимонена. Их приблизительное содержание составляет около 1,07, 0,26, 0,03 и 0,36 % от сухих веществ экстрактов, соответственно. Среди них особый интерес представляют циклические дипептиды, для которых характерны противовирусные, антибиотические и противоопухолевые свойства.

Исследование биологических свойств и безопасности экстрактов трутовых грибов. Для подтверждения антибиотических свойств экстракта трутовика окаймлённого, в котором были обнаружены циклические дипептиды, определены его бактериостатическая активность в отношении культур Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и фунгистатическая активность в отношении дрожжей Candida albicans, грибов Trichoderma viride, Aspergillus flavus. Показано, что экстракт при концентрации сухих веществ 6,25 мг/мл подавляет рост золотистого стафилококка до 50 %. Для установления безопасности экстрактов трутовых грибов с целью создания на их основе лекарственных средств были определены их острая токсичность и качественный элементный состав. В трутовиках плоском, ложном, окаймлённом и экстрактах из них не обнаружены токсичные элементы, содержание которых нормируется в биологически активных препаратах, полученных на основе природного сырья. Исследование острой токсичности показало, что экстрактам трутовиков плоского и окаймлённого, полученным ремацерацией раствором гидроксида натрия (4 г/л), соответствуют значения LD50 более 10000 мг/кг. Т.о., исследуемые экстракты относятся к IV классу опасности (малоопасные вещества) и менее токсичны, чем галеновый препарат «Бефунгин» (LDS0 = 6500 мкг/кг)

15

[Лазовская, A.B. О токсичности чаги / A.B. Лазовская // Чага и её лечебное применение при раке IV стадии: сб. науч. тр. Л.: Медгиз, 1959. С. 96-102].

Анализ полученных результатов показал, что меланины трутовиков плоского и окаймлённого, полученные мацерацией с СВЧ-обработкой и ремацерацией раствором гидроксида натрия, могут быть рекомендованы для разработки на их основе галеновых препаратов, обладающих высокими антиоксидантными свойствами. Экстракт трутовика окаймлённого, полученный ремацерацией с раствором гидроксида натрия, может быть рекомендован для разработки на его основе биологически активных препаратов, оказывающих бактериостатическое действие.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы получения меланинов трутовиков плоского и окаймлённого с высокими значениями выхода и АОА. Оптимальные способы экстракции: для трутовика плоского - ремацерация раствором гидроксида натрия (4 г/л) в течение 3 ч, выход меланина составляет 6 %, АОА — 40 кКл/100 г; для трутовика окаймлённого - мацерация с СВЧ-обработкой раствором гидроксида натрия (4 г/л), выход меланина составляет 12 %, АОА - 60 кКл/100 г.

2. С помощью электронной спектроскопии, ИК-спектроскопии, электронной микроскопии и ФКС хромогенные комплексы трутовиков плоского, ложного и окаймлённого отнесены к меланинам, которые сформированы в виде сложноорганизованных частиц. Методом горизонтального электрофореза установлено, что меланины трутовиков плоского и окаймлённого не однородны по составу, как и меланин чаги.

3. Показано, что дисперсные фазы экстрактов трутовиков плоского, ложного и окаймлённого отличаются по устойчивости к различным осаждающим агентам и наименее устойчивы к действию хлорида кальция и растворам щелочей. Исследование агрегативной устойчивости коллоидных систем экстрактов по определению критических концентраций позволило установить, что коллоидная система экстракта трутовика плоского более агрегативно устойчива, чем коллоидные системы экстрактов трутовика окаймлённого.

4. Установлено, что максимальное количество БАВ, представленных углеводами (1613 мкг/мл), фенольными веществами (117 мкг/мл) и белками (809 мкг/мл), содержится в фильтрате, полученном мацерацией с СВЧ-обработкой раствором гидроксида натрия с концентрацией 10 г/л, что в 510 раз выше, чем в экстрактах, полученных экстракцией этого гриба водой.

5. Впервые установлено, что в водных экстрактах трутовиков плоского и окаймлённого содержится липофильная компонента в количестве 0,59 % и 2,29 % от их сухих веществ. В экстрактах трутовика окаймлённого мето-

дом хромато-масс-спектрометрического анализа впервые обнаружены ли-пофильные БАВ - сквален (около 0,26 %), олеамид (около 0,03 %), лимонен (около 0,36 %) и циклические дипептиды (около 1,07 %).

6. Впервые с помощью рентгенофлуоресцентного анализа доказано, что в экстрактах трутовиков плоского, ложного и окаймлённого не содержатся токсичные элементы. Экстракты трутовиков плоского и окаймлённого относятся к IV классу опасности по величине Экстракт трутовика окаймлённого проявляет бактериостатическую активность в отношении золотистого стафилококка при концентрации сухих веществ 6,5 мг/мл.

Публикации в изданиях, рекомендованных для размещения материалов диссертаций

1. Сысоева, М.А. Получение водных экстрактов трутовых грибов / М.А. Сысоева. А.И. Носов // Бутлеровские сообщения. - 2012. - Т. 30. № 4. - С. 147-152.

2. Сысоева, М.А. Содержание макро- и микроэлементов в макромицетах, растущих в Республике Татарстан / М.А. Сысоева, Е.В. Сысоева, А.И. Носов, А.З. Фа-тыхова // Вестник Казанского технологического университета. — 2013. — Т. 16. №7.-С. 192-195.

3. Носова, А.И. Исследование физико-химических свойств хромогенных комплексов трутовиков плоского и окаймлённого / А.И. Носов. М.А. Сысоева. В.Д. Гревцев, Ф.Г. Халитов // Химия растительного сырья. - 2013. - № 3. - С. 195-200.

Патенты на изобретения

4. Пат. 2489159 Российская Федерация МПК8 А 61 К 36/06, В 01 О 11/02. Способ получения хромогенного комплекса трутовика окаймлённого / М.А. Сысоева. А.И. Носов, Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников; заявитель и патентообладатель: ФГБОУ ВПО «КНИТУ». -№ 2012110640/15; заявл. 20.03.2012. опубл. 10.08.2013, Бюл. № 22. - 7 с.

5. Пат. 2491082 Российская Федерация МПК8 А 61 К 36/06, В 01 И 11/02. Способ получения хромогенного комплекса трутовика плоского / М.А. Сысоева, А.И. Носов, Г.К. Зиятдинова. Г.К. Будников: заявитель и патентообладатель: ФГБОУ ВПО «КНИТУ». - № 2012126289/15; заявл. 22.06.2012. опубл. 27.08.2013. Бюл. № 24. - 6 с.

Тезисы докладов

6. Носов, А.И. Выбор способа экстракции трутовых грибов / А.И. Носов. М.А. Сысоева, Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников // V Всероссийская конференция с международным участием «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья»: сб. тезисов. - Барнаул, 2012. — С. 474.

7. Сысоева, М.А. Изучение хромогенных комплексов трутовых грибов с помощью электрофореза / М.А. Сысоева, А.И. Носов, Е.В. Павлова // II Всероссийская молодёжная научная конференция «Химия и технология новых веществ и материалов»: сб. тезисов. — Сыктывкар. 2012. - С. 48.

8. Сысоева, М.А. Антиоксидантная активность разрабатываемых препаратов из трутовых грибов / М.А. Сысоева, А.И. Носов, Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников // VII Международная научная конференция «Кинетика и механизм кристаллизации.

Кристаллизация и материалы нового поколения»: сб. тезисов. — Иваново, 2012. —

9. Павлова, Е.В. Изучение меланинов трутовых грибов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле / Е.В. Павлова, М.А. Сысоева, А.И. Носов // XII Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии»: сб. тезисов. - Казань, 2012. - С. 140.

10. Носов, А.И. Липофильные соединения водных экстрактов трутовика окаймлённого / А.И. Носов, М.А. Сысоева // XII Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии»: сб. тезисов. - Казань, 2012. -

11. Хабибрахманова, В.Р. Роль базидиомицетов в биоценозе леса и биологически активные вещества, продуцируемые ими / В.Р. Хабибрахманова, М.А. Сысоева, С.А. Никитина, А.И. Носов // XIII Международная научно-техническая Интернет-конференция «Лес-2012»: сб. тезисов. - Брянск, 2012. - С. 165-167.

12. Носов, А.И. Современные методы исследования меланинов трутовиков плоского, ложного и окаймлённого / А.И. Носов, М.А. Сысоева // Всероссийская молодежная научная школа «Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности»: сб. тезисов. - Казань, 2012. - С. 17.

13. Носов, А.И. Анализ антиоксидантной активности водных экстрактов трутовых грибов / А.И. Носов, М.А. Сысоева, С.А. Никитина, В.Р. Хабибрахманова, Г.К. Будников, Г.К. Зиятдинова // Всероссийская конференция «Современные проблемы химической науки и образования»: сб. тезисов. — Чебоксары, 2012. — С. 172-173.

14. Носов, А.И. Исследование экстракции биологически активных веществ из ба-зидиальных грибов / А.И. Носов, М.А. Сыосева // XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии: сб. тезисов. - Волгоград, 2011 - С. 149.

15. Носов, А.И. Липидный состав водных экстрактов трутовиков плоского и окаймлённого / А.И. Носов, М.А. Сысоева // 77-ая Всероссийская научная конференция студентов и молодых учёных с международным участием: «Молодёжная наука и современность»: сб. тезисов. - Курск, 2012. — С. 51.

16. Сысоева, М.А. Исследование меланинов трутовых грибов методом ИК-спектроскопии / М.А. Сысоева, А.И. Носов // Всероссийская молодёжная конференция «Химия поверхности и нанотехнология»: сб. тезисов. - Казань, 2012. -

С. 238.

С. 139.

С. 124.

Соискатель:

А.И. Носов

Формат 60*84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ.л.1,0. Усл.печл 0,93. Уч.-изд.л. 1,0. Тираж 11 Оэкз. Типография ЗАО «Компания Интайп», 420111, Казань, ул.Профсоюзная,д.26