Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Физико-химические характеристики и биологическая активность водных извлечений и полифенолоксикарбонового комплекса чаги

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ И ПОЛИФЕНОЛОКСИКАРБОНОВОГО КОМПЛЕКСА ЧАГИ

15.00.02- Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

КАЗАНЬ 2004

Работа выполнена на кафедре промышленной биотехнологии Казанского государственного технологического университета

Научный руководитель

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Гамаюрова Валентина Семеновна

доктор фармацевтических наук, профессор Егорова Светлана Николаевна

доктор химических наук, профессор Мукменева Наталия Александровна

Ведущая организация:

Институт органической и физической химии КНЦРАН

Защита состоится 29 декабря 2004 года в 13 часов на заседании диссертационного совета К 212.080.05 при Казанском государственном технологическом университете по адресу: 420029, г. Казань, ул. Сибирский тракт, 12, аудитория Д-414.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Автореферат разослан «Л& ноября 2004 ]

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

В.М. Захаров

йй. 4ЧЯ9 •

общая характеристика работы

Актуальность работы. В последнее время возрос интерес исследователей к природному лекарственному сырью. Одним из источников такого сырья является березовый гриб чага, который применяется в медицине при лечении онкологических и желудочно-кишечных заболеваний. В фармацевтической промышленности на основе водных извлечений из чаги производят бефунгин.

Расширение спектра лекарственных препаратов и БАД на основе чаги приводит к потребности в разработке методов анализа и изучения биологической активности водных извлечений и основного действующего вещества - полифенолоксикарбонового комплекса (ПФК) для подтверждения качества получаемых препаратов. Поскольку препараты на основе чаги используются для лечения рака различной этиологии, эрозивных состояний желудочно-кишечного тракта, относящихся к свободнорадикальным патологиям, изучение антиоксидантной активности водных извлечений и ПФК является актуальным.

Биологическая активность водных извлечений определяется не только антиоксидантной емкостью, но и содержанием в них зольных элементов. Биологическая активность ПФК определяется также содержанием углеводов, представленных полисахаридами, которые, как показано, обладают защитным эффектом при эрозивных состояниях желудочно-кишечного тракта. Поэтому исследование указанных параметров в водных вытяжках и ПФК актуально.

Водные извлечения из чаги представляют собой сложные полидисперсные коллоидные системы, получение которых зависит от условий проведения экстракции. Образование золя водных извлечений чаги оказывает существенное влияние на выход экстрактивных веществ из сырья в раствор, и как следствие, на физико-химические свойства водной вытяжки и на образование пространственной структуры ПФК, что влияет на их биологическую активность. Поэтому комплексное исследование сырья, водных извлечений и ПФК чаги с помощью методов ЯМР-релаксации, ИК-спектроскопии и химического гидролиза актуально.

Фармакопейная статья на лекарственное растительное сырье чаги (ГФ XI) предусматривает его стандартизацию лишь по таким показателям, как сухой остаток, влага, зола, содержание примесей, что не позволяет дать объективную оценку качества сырья по фармакологически активным компонентам. В связи с этим актуальным являются исследования в области поиска новых способов анализа биологически активных веществ, содержащихся в чаге, которые обуславливают их фармакологическое действие.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является комплексное исследование сырья, водных извлечений из чаги и ПФК для создания на их основе БАД, обладающих высокой биологической активностью.

Задачи

1. Провести комплексное исследование сырья чаги, водных вытяжек и ПФК с помощью метода ЯМР-релаксации для определения состояния полимерных структур в составе исследуемых объектов в нативном состоянии.

2. Изучить структуру ПФК в твердом состоянии на молекулярном уровне с помощью метода ИК-спектроскопии.

3. Определить количество свободных и связанных углеводов водных извлечений, полученных различными способами экстракции, и при применении комплексонов для подтверждения структуры получаемого ПФК.

4. Определить антиоксидантную активность водных извлечений и ПФК с целью создания БАД на их основе.

5. Обобщая все известные данные о структуре ПФК и опираясь на полученные нами данные, представить схему строения ПФК.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые: ® показано, что водные извлечения, полученные ремацерацией, обладают

высокой биологической активностью. ® в процессах экстракции чаги применены комплексоны гидроксиэтилендифосфоновая кислота (ОДЭФ) и натриевая соль этилендиамин-КД^,М ',М1 -тетрауксусной кислоты (трилон Б), позволяющие получить ПФК, обладающие высокой антиоксидантной способностью. • показано, что антиоксидантная активность ПФК выше, чем антиоксидантная

активность водных извлечений, из которых он выделен. « предложена схема строения ПФК, обобщающая все известные и полученные нами данные о его структуре. Практическая значимость результатов исследования. Проведенные исследования позволили получить водные извлечения и ПФК, обладающие высокой антиоксидантной активностью, что позволит в дальнейшем получить на их основе новые БАД. Разработан способ количественного определения углеводов водных извлечений и ПФК, который может быть использован в фармацевтической промышленности для определения качества препаратов, основанных на получении водной вытяжки чаги. Проведенные исследования защищены патентом № 2231786.

Результаты работы используются в учебном процессе КГТУ при изучении дисциплины «Прикладная биохимия», в курсовом и дипломном проектировании.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: - на I форуме молодых ученых и специалистов Республики Татарстан (Казань, 2001); - на II Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Казань, 2002); - на 7-ой Пущинской школе - конференции молодых ученых

«БИОЛОГИЯ-НАУКА XXI» (Пущино, 2003 г.); - на 8-ой Путинской школе -конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ-НАУКА XXI» (Пущино, 2004 г.); -на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань 2003); -на III Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Саратов, 2004); - на III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2004). Результаты работы также ежегодно докладывались и обсуждались на отчетных научно-технических конференциях КГТУ в 2001 - 2004 гг. и межрегиональных конференциях молодых ученых «Пищевые технологии» (Казань, 2001 - 2004 гг.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, в том числе 3 статьи, получен I патент.

Положения, выносимые на защиту.

• Результаты комплексного исследования сырья чаги, водных вытяжек и ПФК в нативном состоянии и на молекулярном уровне с целью определения их структурной организации в растворе и твердом состоянии.

® Определение антиоксидантной активности водных извлечений, получаемых различными способами экстракции.

о Результаты поиска водных извлечений и ПФК, обладающих высокой биологической активностью при применении в экстракции комплексонов.

• Модель структурной организации полимеров в составе ПФК на основе литературных данных и результатов проведенных физико-химических исследований.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах и состоит из введения, трех глав (литературный обзор, экспериментальная часть, обсуждение результатов), выводов, списка использованной литературы из 134 наименований, приложения. Работа иллюстрирована 21 рисунком и содержит 32 таблицы.

В первой главе обобщены данные литературы об исследовании химического состава водных извлечений чаги и ПФК, выделенного из них. Описаны способы использования трутового гриба чаги в народной и официальной медицине. Обоснована перспектива изучения полисахаридов в этих объектах.

Во второй главе описаны объекты и методы исследования, перечислены способы выделения биологически активных соединений.

В третьей главе обсуждены полученные результаты, приведена модель строения ПФК.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Влияние способа экстракции на физико-химические, антиоксидантные свойства водных извлечений и ПФК чаги

Влияние процесса экстрагирования на формирование коллоидной системы (золя) водных извлечений чаги и на ПФК, выделяемые из них, было изучено с применением трех способов экстракции на примере двух партий сырья.

Проведен анализ физико-химических свойств водных извлечений чаги, которые представлены в таблице 1. Показано, что при смене способа экстракции в ряду - ремацерация (РЕМ), реперколяция (РЕП), механическое перемешивание (МП) снижается выход ПФК, сухой остаток и содержание углеводов. В водном извлечении, полученном ремацерацией, наблюдается наименьшая зольность, что повлияет на их биологическую значимость.

Таблица 1 - Физико-химические показатели и антиоксндантиая активность водных извлечений чаги, полученных разными способами экстракции __

Фирма -поставщик сырья Способ экстракции Содержание в водной вытяжке

Сухой остаток Зольность Выход ПФК Концентрация углеводов Сугл Антиокси-дантная емкость

г г % % % кКл/ЮОг

АПЕКС РЕМ 1.78 0.46 25.84 12.90 4.52 13.88

РЕП 1.54 0.79 51.29 8.90 2.00 9.74

МП 1.36 0.58 42.65 7.00 1.77 Не определялась

КРАСНОГОРСК РЕМ 2.66 0.64 24.06 11.80 3.62 28.08

РЕП 1.79 0.71 39.66 9.80 3.00 24.22

МП 1.45 0.47 32.41 6.80 2.40 39.68

Анализ углеводной компоненты водных вытяжек из сырья различных партий показал, что содержание углеводов, представленных полисахаридами, также зависит от способа получения вытяжки. Их максимальное содержание наблюдается в вытяжках, полученных ремацерацией. Установлено, что при выделении ПФК из водных вытяжек подкислением среды до рН 2.0-2.5 основная часть углеводов переходит в его состав вне зависимости от примененного способа экстракции.

Оценка антиоксидантной емкости водных извлечений показала, что они имеют различную антиоксидантную активность. Максимальное значение антиоксидантной активности определено для водного извлечения, полученного

при механическом перемешивании. Поскольку содержание ПФК в нем низкое, то можно предположить, что антиоксидантную активность в этом случае обуславливается низкомолекулярными соединениями (фенолы, флавоноиды и др.). Водные извлечения, полученные ремацерацией, обладают высокой антиоксидантной активностью, за счет большого содержания ПФК, переходящего в раствор во время экстракции.

Для характеристики структуры ПФК в водном извлечении и в высушенном состоянии применен метод ЯМР-релаксации. Оценка состояния полимерных структур в водном извлечении чаги показала, что каждый из применяемых способов приводит к формированию индивидуальной коллоидной системы с соответствующими значениями параметров релаксации. Показано, что структурно-конформационный состав ПФК коллоидной системы водной вытяжки, полученной ремацерацией, представляет собой среднее значение структурно-конформационных особенностей полимерных компонент двух других систем.

Методом ЯМР-релаксации исследованы также ПФК в твердом состоянии. Как и в водной среде, параметры релаксации ПФК, полученных с применением ремацерации, представляют собой некую среднюю величину по сравнению с аналогичными параметрами ПФК, полученных двумя другими методами.

Водное извлечение, полученное ремацерацией, характеризуется относительной гидрофильностью и одновременно максимально плотной и однородной упаковкой индивидуальных полимерных цепей в ПФК. Это может быть связано с большим вкладом однородных высокомолекулярных линейных фрагментов в полимерную структуру полифенола, а также подразумевает возможность формирования значительного числа кристаллоподобных фрагментов (углеводные, белковые и другие компоненты) в составе ПФК. Сделан вывод о том, что образуемая в составе водного извлечения макромолекулярная структура ПФК обусловлена его состоянием в растворе.

Наблюдаемая корреляция релаксационных параметров водных вытяжек и ПФК, выделенных из соответствующих водных вытяжек показывает, что мы имеем дело с изменением конформационноЙ структуры полимеров, а не с особенностями механизмов релаксации, обусловленных присутствием жидкофазной компоненты в коллоидных системах.

Для подтверждения данных полученных с помощью метода ЯМР-релаксации проведен химический гидролиз, определяющий скорость деградации ПФК. Разрушение полифенолов анализировали по ходу гидролиза, определяя содержание углеводов в гидролизатах с помощью фенолсернокислотного метода.

Разработан простой способ щелочного гидролиза ПФК, позволяющий разрушить его наиболее полно и при этом проанализировать ход гидролиза.

Подобраны температурные условия, концентрация щелочи и время гидролиза, а также периодичность отбора проб.

Таблица 2 - Содержание связанных углеводов ПФК*

Способ экстракции Суммарное содержание углеводов

Гидролиз ПФК Суммарное содержание связанных углеводов ПФК

1 максимум 2 максимум

% % %

РЕМ 8.90 12.72 21.62

РЕП 6.38 10.00 16.38

МП 5.00 5.36 10.05

* данные эксперименты проведены на сырье фирмы - поставщика АПЕКС

По ходу проведения гидролиза наблюдалось постепенное выделение углеводов из матрицы трехмерного сетчатого полимера ПФК, которые по-разному интегрированы в нем (таблица 2). Общее содержание углеводов в ПФК, полученных разными способами экстракции, различно, что еще раз указывает на различия в их строении.

Для исследования строения ПФК по функциональному составу на молекулярном уровне применен метод ИК-спектроскопии.

Рисунок 1 -ИК спектры поглощения полифенолов чаги, полученных с использованием разных способов экстракции

1. Комплекс, выделенный из водной вытяжки, полученной реперколяцией

2. Комплекс, выделенный из водной вытяжки, полученной ремацерацней

Полифенол, выделенный из водной вытяжки, полученной ремацерацией, имеет большее количество карбоксилат-ионов по сравнению с ПФК,

выделенным из вытяжки, полученной реперколяцией. Об этом свидетельствует повышение интенсивности полос поглощения 1400 и 1620 см"1 в спектре 2, по сравнению со спектром 1, представленные на рисунке 1.

Проведенное исследование показало, что в зависимости от способа экстракции происходит различное формирование, как частиц золя водных извлечений чаги, так и ПФК выделенных из них. Методами ЯМР-релаксации и ИК-спектроскопии, исследованием углеводной компоненты показано, что ПФК, выделенные из водных вытяжек, полученных реперколяцией и при перемешивании, имеют более плотную структуру, более конденсированы, чем ПФК, выделенные из водной вытяжки, полученной ремацерацией. Различная структурная организация отражается на физико-химических свойствах и антиоксидантной активности водных извлечений. Определен оптимальный способ проведения экстракции чаги - ремацерация, поскольку ПФК, полученные этим способом менее конденсированы, водные вытяжки имеют высокое содержание углеводов и ПФК, низкую зольность, и достаточно высокую антиоксидантную активность.

2. Исследование сырья, полученных из него водных извлечений н ПФК

чаги

Проведено комплексное исследование сырья чаги. Объектом исследования служили восемь партий сырья чаги, приобретенных в аптечной сети разных поставщиков. Сырье, водные извлечения из него, получаемые с помощью ремацерации, и выделенные из них ПФК, исследованы методами ЯМР-релаксации, ИК-спектроскопии, определена антиоксидантная активность.

Физико-химические показатели водных извлечений приведены в таблице 3.

Для более полной характеристики сырья и ПФК, выделенных из соответствующих партий, проведено исследование молекулярной подвижности шести партий сырья с помощью метода ЯМР-релаксации (таблица 4).

Согласно релаксационным характеристикам, исследованные образцы сырья по молекулярной подвижности имеют двухкомпонентную структуру. Обе компоненты соответствуют жесткоцепным полимерным формам, однако имеют существенные различия. Длинная компонента отвечает за состояние более аморфной и менее упорядоченной протонсодержащей структурной компоненты. Короткая - характеризует состояние более упорядоченной или кристаллической компоненты.

Качественно аналогичная картина наблюдается и у шести образцов соответствующих ПФК.

Таблица 3 - Физико-химические характеристики водных извлечений чаги, полученных ремацерацией из сырья разных поставщиков_

№ Фирма - поставщик Содержание в водной вытяжке

сырья Сухой Зольность Выход Концентрация

остаток ПФК углеводов, Счта

г г % % %

1 ТХФП 1.94 0.55 28.35 14.63 2.28

2 ТЕХМЕДСЕРВИС 1.52 0.65 42.76 9.75 1.84

3 АДОНИС 2.38 1.37 57.56 20.89 2.84

ФАРОС 2.12 1.17 55.19 13.75 2.70

5 БАШКИРСКОЕ 1.27 0.65 51.18 10.50 2.30

б АРНИКА 1.60 0.44 27.50 11.39 1.86

7 КРАСНОГОРСК 2.66 0.64 24.06 11.80 3.62

S АПЕКС 1.78 0.46 25.84 12.90 4.52

Таблица 4 - Параметры ЯМР-релаксации сырья и ПФК, выделенного из него

№ Фирма - поставщик сырья Длинная компонента ССИ Короткая компонента ССИ

Т2Ь мкс Р[ Т22, мкс Р2

Сырье - чага

1 ТХФП 92 31 18.5 69

2 ТЕХМЕДСЕРВИС 91.5 34 17 66

3 АДОНИС 96 35 19.5 65

4 ФАРОС 85 32 18 68

5 БАШКИРСКОЕ 79 37 18 63

6 АРНИКА 87 35 18 65

ПФК

1 ТХФП 71 42 20.5 58

2 ТЕХМЕДСЕРВИС 72 46 19 54

3 АДОНИС 73.5 42 22 58

4 ФАРОС 69 41 20 59

5 БАШКИРСКОЕ 73 45 19 55

6 АРНИКА 56 33 20 67

Необходимо отметить, что обе жесткоцепные полимерные формы присутствуют как в сырье, так и в ПФК. Наблюдается возрастание более жестких, в том числе кристаллических участков, в ПФК по сравнению с сырьем. Возможно, это связано с изменением упаковки компонентов в ПФК, в

различном соотношении переходящих из сырья во время экстракции и при формировании коллоидной системы водного извлечения, или, например, с переходом полисахаридов в их состав при выделении из водной вытяжки.

На основании полученных результатов трудно приписать короткую и длинную компоненты к конкретному типу структурных фрагментов полимера в сырье и ПФК, поскольку эти полимеры в целом по-разному организованы в сырье, водной вытяжке и ПФК.

Антиоксидантная активность водных извлечений, полученных из пяти разных партий сырья чаги, и ПФК, выделенных из них, приведена в таблице 5. Четыре партии сырья (2-5) имеют близкие значения антиоксидантной активности водных извлечений. Анализ физико-химических характеристик водных извлечений, приведенных в таблице 3, позволяет отметить, что корреляции антиоксидантной активности с приведенными параметрами не наблюдается.

Таблица 5 - Антиоксидантная активность и разница в населенности длинной компоненты чаги ЛР водных извлечений и ПФК полученных ремацерацией из сырья разных поставщиков__

№ Фирма - поставщик сырья Антиоксидантная емкость водных вытяжек Антиоксидантная емкость водных растворов ПФК АР (Р|ПФК- Р|СЫрм)

кКл/ЮОг кКл/ЮОг %

1 АПЕКС 13.88 19.72 -

2 АРНИКА 28.35 29.22 -2

3 КРАСНОГОРСК 28.08 Не растворился -

4 ТЕХМЕДСЕРВИС 29.40 38.66 12

5 БАШКИРСКОЕ 29.61 37.24 8

Антиоксидантную активность ПФК исследовали в водном растворе, то есть растворяли выделенный из водной вытяжки и высушенный на воздухе ПФК. В целом, антиоксидантная активность ПФК имеет тенденцию к увеличению по сравнению с антиоксидантной активности водных извлечений. По-видимому, это связано с иной стабилизацией ПФК и его пространственной структуры в воде по сравнению с водным извлечением чаги.

Антиоксидантная активность водных растворов ПФК коррелирует с данными ЯМР-релаксации (ДР). Из данных таблицы 5 видно, что решающее значение для проявления свойств ПФК, в том числе антиоксидантной активности, имеют конформационные особенности твердых образцов ПФК.

Для исследования ПФК, полученных из пяти партий сырья чаги, на молекулярном уровне применен метод ИК-спектроскопии.

В зависимости от взятого на экстракцию сырья количество карбоксильных групп в ПФК по сравнению со связанным карбоксилом увеличивается в ПФК, выделяемых из водных извлечений, полученных ремацерацией в ряду: ПФК (АПЕКС) < ПФК (АРНИКА) < ПФК (КРАСНОГОРСК) = ПФК (ТЕХМЕДСЕРВИС) = ПФК (БАШКИРСКОЕ). Такие изменения в спектрах свидетельствуют о различной молекулярной структуре ПФК, полученных ремацерацией из различного сырья.

Аналогичные изменения происходят и при рассмотрении спектров ПФК, полученных реперколяцией, из сырья разных партий.

1. ПФК, выделенный из водной вытяжки, полученной из сырья АПЕКС

2. ПФК, выделенный из водной вытяжки, полученной из сырья АРНИКА

3. ПФК, выделенный из водной вытяжки, полученной из сырья КРАСНОГОРСК

4. ПФК, выделенный из водной вытяжки, полученной из сырья ТЕХМЕДСЕРВИС

5. ПФК, выделенный из водной вытяжки, полученной из сырья БАШКИРСКОЕ

В заключение можно сказать, что в целом, состав полимерных компонентов у всех видов сырья в основном одинаков, но каждое сырье отличается по степени доступности компонентов. Проведенный анализ сырья чаги показывает, что ЯМР релаксационный метод позволяет более полно охарактеризовать этот объект. С помощью этого метода анализа показано, что состав ПФК определяет его свойства в сухом состоянии, а его конформационная структура определяет те же свойства ПФК в водной среде. Установлена корреляция между конформацией ПФК и его антиоксидантной активностью.

900 М00 1300 1500 1700 1900 *,см''

Рисунок 2 - ИК спектры поглощения полифенолов чаги

3. Влияние использования в экстракции комплексонов на Формирование золя водных вытяжек и ПФК чаги

Влияние изменения среды экстракции исследовано при введении комплексонов, широко применяемых в фармацевтической промышленности: гидроксиэтилендифосфоновой кислоты (ОДЭФ) и натриевой соли этилендиамин-^Н'Ы'^'-тетрауксусной кислоты (трилон Б), в процесс ремацерации.

Введение комплексонов осуществлялось двумя способами: 1) предварительное замачивание сырья в водном растворе комплексона с последующей экстракцией водой; 2) проведение экстракции водным раствором комплексона.

Оценка полученных результатов проводилась по содержанию ПФК, как основного действующего вещества, в водной вытяжке. Подобраны оптимальные время замачивания сырья в растворах комплексонов - один час, и концентрация комплексонов 0.03 г/л.

Определена антиоксидантная активность водных извлечений и ПФК, выделенных из них, полученных с использованием комплексонов, на протяжении всей экстракции, данные представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Антиоксидантная активность водных извлечений чаги, и ПФК, выделенных из них, полученных ремацерацией с применением комплексонов*

Антиоксидантная емкость Антиоксидантная емкость

№ Комплсксон водных вытяжек водных растворов ПФК

кКл/ЮОг кКл/ЮОг

1 контроль 13.88 19.72

2 Трилон Б 6.77 28.8

3 ОДЭФ 7.27 62.03

* данные эксперименты проведены на сырье фирмы - поставщика АПЕКС

Антиоксидантная активность водной вытяжки практически вдвое выше, чем антиоксидантная активность вытяжек, полученных с применением комплексонов. Антиоксидантная активность ПФК, выделенных из вытяжек с применением комплексонов, наоборот, выше, чем антиоксидантная активность в контроле.

Антиоксидантная активность ПФК в ряду вода —» трилон Б —► ОДЭФ возрастает.

Сравнение антиоксидантной активности водных извлечений с их физико-химическими показателями, приведенными в таблице 7, показало, что применение комплексонов даже на стадии замачивания приводит к изменению физико-химических параметров водной вытяжки, что свидетельствуют о взаимодействии комплексонов с сырьем уже при его набухании. Наблюдается различное взаимодействие комплексонов с сырьем, и формирование другого состава водной среды, и как следствие, формирование различных коллоидных систем водных извлечений чаги.

При проведении экстракции с применением комплексонов можно предположить два различных механизма взаимодействия комплексонов с сырьем и формирования золя водного извлечения, и как следствие, формирование структуры ПФК.

Таблица 7 - Физико-химические показатели водных извлечений чаги, полученных с применением комплексонов

№ Содержание в водной вытяжке

Условия Комп- Сухой Зольность Выход Концентрация

экстракции лексен остаток ПФК углеводов, Сугл

г г % % %

1 контроль* - 1.74 0.41 23.56 13.00 2.33

2 замачивание Трилон Б 1.77 0.38 21.46 13.60 2.17

3 замачивание ОДЭФ 1.85 0.39 21.08 13.20 1.55

4 контроль** - 1.78 0.46 25.84 12.90 2.40

5 РЕМ Трилон Б 1.97 0.55 27.91 16.30 3.04

5 РЕМ ОДЭФ 1.61 0.44 27.32 14.80 2.38

* - проведение ремацерации водой с предварительным замачиванием сырья в воде; **

проведение ремацерации водой

При проведении экстракции чаги с применением комплексонов ОДЭФ и трилона Б, независимо от механизма комплексообразования, на стадии замачивания и на протяжении всей экстракции изменяется выход биологически активных веществ (ПФК и углеводов), по сравнению с водным извлечением.

Различия в структурной организации вытяжек и выделенных из них ПФК, при применении комплексонов в составе экстрагента, исследовали с помощью методов ЯМР-релаксации и ИК-спектроскопии.

Метод ЯМР-релаксации показал, что времена релаксации водных извлечений падают с уменьшением температуры (с 70 до 20°С), а также в зависимости от природы комплексонов, в следующей последовательности:

контроль (вода) —> ОДЭФ —* трилон Б. В том же порядке наблюдается рост жесткости цепи и (или) молекулярной массы образующегося в водном извлечении ПФК.

При переходе от водных извлечений к ПФК в твердом состоянии, во всех исследуемых объектах, времена релаксации закономерно падают.

Таблица 8 - Зависимость структурной однородности компонентов А ПФК в водной вытяжке и твердом состоянии*_

№ Комплексен д=т,/т2

20°С 70°С

Водная вытяжка

1 Контроль 1.16 1.55

2 Трилон Б 1.03 1.43

3 ОДЭФ 1.06 1.45

ПФК

1 Контроль 27.00 25.50

2 Трилон Б 19.40 17.00

3 ОДЭФ 37.00 31.00

♦водные вытяжки и ПФК, получены ремацерацией без замачивания С учетом релаксационных характеристик ПФК в водных извлечениях предположено, что основной вклад в отмеченные закономерности вносят значительно большие размеры, связность и жесткость полимерной цепи, формирующейся в присутствии трилона Б. Если представить модель структуры ПФК в виде пористой среды, то в присутствии трилона Б формируется пористый кластер максимальных размеров с более широким, чем у остальных ПФК, распределением размеров капилляров и пор, функциональных групп или иных активных центров, по геометрическим параметрам и энергетическим характеристикам рабочей поверхности.

Судя по данным метода ЯМР-релаксации, наибольшей биологической активностью должен обладать ПФК, полученный с применением трилона Б, так как он обладает наибольшим объемом и наиболее доступными активными центрами. Однако данные антиоксидантной активности показывают наибольшую антиоксидантную емкость полифенолов, получаемых с введением в экстракцию ОДЭФ (таблица 6).

Это можно объяснить тем, что исследование полифенолов чаги методом ЯМР-релаксации проводилось в твердом состоянии, в то время как антиоксидантная активность определялась в растворе (дистиллированная вода). В данном случае образуется по-другому сформированный аквакомплекс полифенола чаги с иным структурным расположением функциональных групп, входящих в ПФК, которые обуславливают его антиоксидантную способность.

Данные ИК-спектроскопии (рисунок 3) показали, что при применении комплексонов происходит перераспределение интенсивности поглощения при 1400 см'1 и 1620 см'1 в область поглощения карбоксильных групп 1240 см"1 и 1720 см'1 (от спектра 1 к спектру 5). Несмотря на различный механизм взаимодействия комплексонов с зольными элементами водной вытяжки, процесс комплексообразования приводит к освобождению карбоксильных групп полифенолов по сравнению с контролем.

Рисунок 3 - ИК-спектры поглощения полифенолов чаги, полученных с применением комплексонов

1. ПФК, выделенный из водной вытяжки, полученной ремацерацией

2. ПФК, выделенный ш водной вытяжки, полученной ремацерацией с предварительным замачиванием сырья с трилоном Б в концентрации 0.0 3 г/л

3. ПФК, выделенный из водной вытяжки, полученной ремацерацией с предварительным замачиванием сырья с ОДЭФ в концентрации 0.03 г/л

4. ПФК, выделенный из вытяжки, полученной ремацерацией с применением трилона Б в концентрации 0.03 г/л

5. ПФК, выделенный из вытяжки, полученной ремацерацией с применением ОДЭФ в концентрации 0.03 г/л

На основании полученных результатов предположены возможные варианты участия комплексонов в экстракции в зависимости от физико-химических свойств получаемых вытяжек чаги.

В результате проведенного исследования установлено, что использование комплексонов при экстракции чаги позволяют получить ПФК с высокими АОА свойствами. Можно рекомендовать создание БАД на их основе в сухом таблетированном виде.

4. Обобщение полученных результатов для построения модели ПФК

Предложена гипотетическая схема строения молекулы ПФК обобщающая все известные и полученные нами данные о его структуре.

Рисунок 4 - Структура ПФК

Автор выражает благодарность научному консультанту к.х.н., доценту Сысоевой М.А., принимавшему участие в постановке задач работы, в выполнении экспериментов и обсуждении их результатов.

ВЫВОДЫ ПО РАБОТЕ

1. Установлено, что водные извлечения, получаемые ремацерацией, имеют высокое содержание углеводов, низкую зольность и высокую антиоксидантную активность, что характеризует их высокую биологическую активность по сравнению с извлечениями, полученными другими способами экстракции.

2. Проведенный комплексный анализ сырья, водных извлечений чаги и ПФК с помощью метода ЯМР-релаксации может быть использован для характеристики сырья и лекарственных препаратов на его основе.

3. С помощью метода ЯМР-релаксации установлено, что в целом, состав полимерных компонентов у всех видов сырья в основном одинаков, но каждое сырье отличается по степени доступности компонентов.

4. На основании данных, полученных с помощью ЯМР-релаксации, установлено, что состав ПФК определяет его свойства в сухом состоянии, а его конформационная структура определяет те же свойства ПФК в водной среде. Установлена корреляция между конформацией ПФК и его антиоксидантной активностью.

5. Разработан простой способ количественного определения углеводов, входящих в состав ПФК.

6. На основании высокой антиоксидантной активности ПФК, полученных из водных извлечений чаги с применением комплексонов, можно рекомендовать создание БАД на их основе в сухом таблетированном виде

7. Методом ИК - спектроскопии показано, что смена способа экстракции и введение в экстрагент комплексонов и гидроокиси натрия в низких концентрациях приводит к изменению соотношения карбоксильных групп и карбоксилат-ионов в его составе.

8. Предложена гипотетическая схема строения молекулы ПФК обобщающая все известные и полученные в работе данные о его структуре.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В РАБОТАХ:

1. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Шестакова J1.M., Гамаюрова B.C. Изучение углеводного состава водных извлечений из чаги. // В матер, науч. сессии. -Казань: КГТУ, 2001.- С. 70.

2. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Шестакова JI.M., Гамаюрова B.C. Исследование углеводного состава водных вытяжек чаги. // В матер, второй межрегиональной конференции молодых ученых "Пищевые технологии". -Казань: КГТУ, 2001.-С.42.

3. Кузнецова О.Ю., Боцманова O.E., Кудашкин A.A., Сысоева М.А., Шестакова JT.M., Гамаюрова B.C. Изменение углеводного состава водных вытяжек чаги при смене ее получения. И В матер. I Форума молодых ученых и специалистов Республики Татарстан, - Казань: Мастер Лайн. 2001. - С.39.

4. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C. Определение свободных и связанных углеводов в водных вытяжках чаги, полученных различными способами. // В матер, науч. сессии. - Казань: ЮНГУ, 2002.- С. 77.

5. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C. Углеводы растительного сырья - чаги. // В матер, межрегиональной конференции молодых ученых "Пищевые технологии". - Казань: КГТУ, 2002. - С.63.

6. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C. Способы получения водных вытяжек чаги. // В матер. II Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ». - Казань: 2002. - С. 131.

7. Патент на изобретение № 2231786

8. Кузнецова О.Ю., Зарипова Д.И., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C. Применение комплексонов в получении диффузионных соков чаги. // В матер, науч. сессии. -Казань: КГТУ, 2003. - С. 78.

9. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C. Получение водных вытяжек чаги с применением комплексонов. // В матер. 7-й Пущинской школы -конференции молодых ученых. - Пущино, 2003. - С. 111-112.

10. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А. Коллоидная система водных вытяжек чаги. // В матер, межрегиональной конференции молодых ученых "Пищевые технологии". - Казань: КГТУ, 2003. - С.90-91.

11. Мартьянова Т.А., Тагирова P.M., Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А. Выделение и идентификация полисахаридов водной вытяжки чаги. // В матер, межрегиональной конференции молодых ученых "Пищевые технологии". -Казань: КГТУ, 2003. - С.92-93.

12. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C., Халитов Ф.Г. Роль зольных элементов в формировании коллоидных растворов водных вытяжек Inonotus obliquus. // В матер. XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, Т.З секция «Биомолекулярная химия и биотехнология» - Казань. 2003. - С.257.

13. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование физико-химических свойств полифенолов чаги. // В матер. XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, Т.З секция «Биомолекулярная химия и биотехнология» - Казань. 2003. - С.ЗОЗ.

14. Кузнецова О.Ю., Кудашкин A.A., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C. Влияние полярности растворителя на выход БАВ чаги. // В матер, науч. сессии. - Казань: КГТУ, 2004. - С. 100.

15. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C. Анализ биологии и биохимии трутового гриба Inonotus obliquus // В матер, науч. сессии. - Казань: КГТУ, 2004. - С. 101.

2007-4 14389

16. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C., Хал Исследование золя водных извлечений чаги. 1. Изменение изучаемой системы при введении комплексонов. // Башкирский химический журнал, 2004. т. 11. -№2.-С. 62-65.

17. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова B.C., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование золя водных извлечений чаги. П. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами. // Вестник Казанского технологического университета (Ki ТУ), 2003. -№2. - С. 172-179.

18. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C. Биологические и биохимические аспекты изучения трутового гриба чаги. // В матер. 8-й Пущинской школы - конференции молодых ученых. - Пущино, 2004. - С.267.

19. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C. Халитов Ф.Г., Будников Г.К., Зиятдинова Г.К. Анализ растительного сырья - чаги. // В матер, межрегиональной конференции молодых ученых "Пищевые технологии". -Казань: КГТУ, 2004. -т.2, С.3-5.

20. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C., Будников Г.К., Зиятдинова Г.К. Антиоксидангная активность водных извлечений и полифенолов чаги. // В матер. Ш Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ». - Саратов: 2004. -С. 149-151.

21. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова B.C. Сравнительный анализ содержания углеводной компоненты водных извлечений трутового гриба Inonotus obliquus. // В матер. Ш Всероссийской школы-конференции «Химия и биохимия углеводов». - Саратов, 2004. - С.41.

22. М.А. Сысоева, О.Ю. Кузнецова, B.C. Гамаюрова, П.П. Суханов, Г.К. Зиятдинова, Г.К Будников Исследование золя вводных извлечений чаги Ш. Влияние состава сырья на выход экстрактивных веществ водных извлечений чаги // Химия растительного сырья, 2004. - №4. - С. 15-21.

Соискатель ^ О.Ю. Кузнецова

Лицензия ЦЦ № 7-0157 от 21.05.2001г.

Подписано в печать 23.11.2004. Формат 60x841/16. Тираж 100 экз. Бумага офсетная. Объем 1,0 пл. Заказ № 11/260. Печать ризографическая.

Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО "ДИАЛОГ-КОМПЫОТЕРС" Казань, Космонавтов, 41, офис 3. Тел. 95-10-19 'Г

19 ДЕК 2004

Актуальность работы. В последнее время возрос интерес исследователей к природному лекарственному сырью. Одним из источников такого сырья является березовый гриб чага, который применяется в медицине при лечении онкологических и желудочно-кишечных заболеваний. В фармацевтической промышленности на основе водных извлечений из чаги производят бефунгин.

Расширение спектра лекарственных препаратов и БАД на основе чаги приводит к потребности в разработке методов анализа и изучения биологической активности водных извлечений и основного действующего вещества - полифенолоксикарбонового комплекса (ПФК) для подтверждения качества получаемых препаратов. Поскольку препараты на основе чаги используются для лечения рака различной этиологии, эрозивных состояний желудочно-кишечного тракта, относящихся к свободнорадикальным патологиям, изучение антиоксидантной активности водных извлечений и ПФК является актуальным.

Биологическая активность водных извлечений определяется не только антиоксидантной емкостью, но и содержанием в них зольных элементов. Биологическая активность ПФК определяется также содержанием углеводов, представленных полисахаридами, которые, как показано, обладают защитным эффектом при эрозивных состояниях желудочно-кишечного тракта. Поэтому исследование указанных параметров в водных вытяжках и ПФК актуально.

Водные извлечения из чаги представляют собой сложные полидисперсные коллоидные системы, получение которых зависит от условий проведения экстракции. Образование золя водных извлечений чаги оказывает существенное влияние на выход экстрактивных веществ из сырья в раствор, и как следствие, на физико-химические свойства водной вытяжки и на образование пространственной структуры ПФК, что влияет на их биологическую активность. Поэтому комплексное исследование сырья, водных извлечений и ПФК чаги с помощью методов ЯМР-релаксации, ИК-спектроскопии и химического гидролиза актуально.

Фармакопейная статья на лекарственное растительное сырье чаги (ГФ XI) предусматривает его стандартизацию лишь по таким показателям, как сухой остаток, влага, зола, содержание примесей, что не позволяет дать объективную оценку качества сырья по фармакологически активным компонентам. В связи с этим актуальным являются исследования в области поиска новых способов анализа биологически активных веществ, содержащихся в чаге, которые обуславливают их фармакологическое действие.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является комплексное исследование сырья, водных извлечений из чаги и ПФК для создания на их основе БАД, обладающих высокой биологической активностью. Задачи

1. Провести комплексное исследование сырья чаги, водных вытяжек и ПФК с помощью метода ЯМР-релаксации для определения состояния полимерных структур в составе исследуемых объектов в нативном состоянии.

2. Изучить структуру ПФК в твердом состоянии на молекулярном уровне с помощью метода ИК-спектроскопии.

3. Определить количество свободных и связанных углеводов водных извлечений, полученных различными способами экстракции, и при применении комплексонов для подтверждения структуры получаемого ПФК.

4. Определить антиоксидантную активность водных извлечений и ПФК с целью создания БАД на их основе.

5. Обобщая все известные данные о структуре ПФК, и опираясь на полученные нами данные, представить схему строения ПФК.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые:

• показано, что водные извлечения, полученные ремацерацией, обладают высокой биологической активностью.

• в процессах экстракции чаги применены комплексоны гидроксиэтилендифосфоновая кислота (ОДЭФ) и натриевая соль этилендиамин-Ы^Д^Д^-тетрауксусной кислоты (трилон Б), позволяющие получить ПФК, обладающие высокой антиоксидантной способностью.

• показано, что антиоксидантная активность ПФК выше, чем антиоксидантная активность водных извлечений, из которых он выделен.

• предложена схема строения ПФК, обобщающая все известные и полученные нами данные о его структуре.

Практическая значимость результатов исследования. Проведенные исследования позволили получить водные извлечения и ПФК, обладающие высокой антиоксидантной активностью, что позволит в дальнейшем получить на их основе новые БАД. Разработан способ количественного определения углеводов водных извлечений и ПФК, который может быть использован в фармацевтической промышленности для определения качества препаратов, основанных на получении водной вытяжки чаги. Проведенные исследования защищены патентом РФ № 2231786.

Результаты работы используются в учебном процессе КГТУ при изучении дисциплины «Прикладная биохимия», в курсовом и дипломном проектировании.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: - на I форуме молодых ученых и специалистов Республики Татарстан (Казань,

2001); - на II Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Казань, 2002); - на 7-ой Пущинской школе -конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ-НАУКА XXI» (Пущино,

2003 г.); - на 8-ой Пущинской школе - конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ-НАУКА XXI» (Пущино, 2004 г.); - на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань 2003); -на III Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Саратов, 2004); - на III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2004). Результаты работы также ежегодно докладывались и обсуждались на отчетных научно-технических конференциях КГТУ в 2001 - 2004 гг. и межрегиональных конференциях молодых ученых «Пищевые технологии» (Казань, 2001

2004 гг.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, в том числе 3 статьи, получен 1 патент РФ.

Положения, выносимые на защиту.

• Результаты комплексного исследования сырья чаги, водных вытяжек и ПФК в нативном состоянии и на молекулярном уровне с целью определения их структурной организации в растворе и твердом состоянии.

• Определение антиоксидантной активности водных извлечений, получаемых различными способами экстракции.

• Результаты поиска водных извлечений и ПФК, обладающих высокой биологической активностью при применении в экстракции комплексонов.

• Модель структурной организации полимеров в составе ПФК на основе литературных данных и результатов проведенных физико-химических исследований.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 158 страницах и состоит из введения, трех глав (литературный обзор,

ВЫВОДЫ ПО РАБОТЕ

1. Установлено, что водные извлечения, получаемые ремацерацией, имеют высокое содержание углеводов, низкую зольность и высокую антиоксидантную активность, что характеризует их высокую биологическую активность по сравнению с извлечениями, полученными другими способами экстракции.

2. Проведенный комплексный анализ сырья, водных извлечений чаги и ПФК с помощью метода ЯМР-релаксации может быть использован для характеристики сырья и лекарственных препаратов на его основе.

3. С помощью метода ЯМР-релаксации установлено, что в целом, состав полимерных компонентов у всех видов сырья в основном одинаков, но каждое сырье отличается по степени доступности компонентов.

4. На основании данных, полученных с помощью ЯМР-релаксации, установлено, что состав ПФК определяет его свойства в сухом состоянии, а его конформационная структура определяет те же свойства ПФК в водной среде. Установлена корреляция между конформацией ПФК и его антиоксидантной активностью.

5. Разработан простой способ количественного определения углеводов, входящих в состав ПФК.

6. На основании высокой антиоксидантной активности ПФК, полученных из водных извлечений чаги с применением комплексонов, можно рекомендовать создание БАД на их основе в сухом таблетированном виде

7. Методом ИК - спектроскопии показано, что смена способа экстракции и введение в экстрагент комплексонов и гидроокиси натрия в низких концентрациях приводит к изменению соотношения карбоксильных групп и карбоксилат-ионов в его составе. 8. Предложена гипотетическая схема строения молекулы ПФК обобщающая все известные и полученные в работе данные о его структуре.