Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование химического состава и стандартизация сырья лиственничной губки

На правах рукописи

СЮ34887В7

ЦУКАНОВА ПОЛИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ СЫРЬЯ ЛИСТВЕННИЧНОЙ ГУБКИ

1 Ч ЛЛ ЛО_ ЛП1 ГЛ1 ТйППГГТОЛТЯО /Т ХГТХ1ЖТ ЯП Лппчог>лгилИ1Я

I-З.ч/ч/.^/л.— ллт*1л, «jju.fsmu.iwji п\_>^гьа

АВТОРЕФЕРАТ

1 МЕН 2009

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ПЯТИГОРСК 2009

003488767

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор фармацевтических наук, профессор

Беликов Владимир Георгиевич ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор фармацевтических наук, профессор

ирПт.<П!.!ТСУГ\ Ран*»ргт<20 А ттр^поипшчпми

кандидат фармацевтических наук, доцент Бочкарева Инна Ивановна ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГОУ ВПО Самарский государственный

медицинский университет Росздрава.

часов на заседании

_ оо

Защита состоится «ДЦ» 0^-^0^0^2009 г в _

Диссертационного совета д 208.069.01 при ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава» (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава». Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, д.ф.н., профессор

Е.В. Компапцеза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Природные биологически активные вещества играют важную роль в современной медицине, благодаря ряду преимуществ перед синтетическими. Как правило, они действуют мягче, проявляют меньше побочных действий. В последние годы наряду с растительными объектами ученые многих стран обратили внимание на грибы. К числу таких объектов относится лиственничная губка, которая является дереворазрушающим базидиомицетом. Лиственничная губка (трутовик лекарственный - Fomitopsis officinalis Will, Laricis fungus), находит широкое применение в народной медицине многих стран. Водные настои используют при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, нарушении обмена веществ, при тромбозах, заболеваниях эндокринной системы. Выявлено также применение вытяжек из лиственничной губки в качестве противовоспалительного, кровоостанавливающего, гипогликемического и желчегонного средства. В научной литературе приводятся данные об иммуностимулирующем действии лиственничной губки, о применении её в качестве средства улучшающего деятельность кроветворной системы, а также как метаболического средства при злокачественных заболеваниях. По данным других ученых экстракт из лиственничной губки возможно использовать при некоторых вирусных заболеваниях и туберкулезе. Можно предположить, что фармакологическое действие лиственничной губки объясняется содержанием большого количества биологически активных веществ. В лиственничной губке обнаружены агарициновая кислота, тритерпены, аминокислоты, органические кислоты, смолистые вещества и др.

Все вышесказанное позволяет сделать выводы, что лиственничная губка является ценным природным сырьем.

Однако для его внедрения в медицинскую практику необходимо решить многие вопросы. Прежде всего, следует определить основные группы биологически активных веществ, по которым возможно проведение стандартизации как самого сырья, так и полученных из него суммарных фитопрепаратов. Необходимо оценить методом скрининга наиболее ценные аспекты фармакологического действия.

3

Решение указанных вопросов позволит дать конкретные рекомендации по исследованию и использованию лиственничной губки. Поэтому изучение химического состава и стандартизация сырья лиственничной губки является актуальной задачей фармацевтической науки и практики.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение химического состава лиственничной губки, идентификация и количественное определение основных групп БАВ, содержащихся в плодовом теле лиственничной губки, и их предварительные фармакологические исследования. Основные задачи исследования:

1. Изучить химический состав плодового тела лиственничной губки: выделить и идентифицировать основные группы биологически активных веществ, содержащиеся в лиственничной губке.

2. Разработать методы выделения, идентификации и количественного определения агарициновой кислоты, содержащейся в лиственничной губке.

3. Провести фармакологические и микробиологические испытания агарициновой кислоты и суммарного спиртового извлечения из лиственничной губки.

Научная новизна.

Проведено исследование химического состава лиственничной губки.

Установлено, что плодовое тело лиственничной губки содернагг смолистые

вещества (48,5%), в том числе высшие жирные кислоты: пальмитиновая (8,8 %),

олеиновая (0,1%), линолевая (5,2%), линоленовая (20,3%), арахидоновая (8,7 %),

бегеновая (6,3 %); агарициновую кислоту (9,5%); полисахариды (7%), в том числе

пектины (18%) и гемицеллюлозу (14%) и глюкозамин (2,8%).

Показано, что лиственничная губка может быть новым источником

агарициновой кислоты. Разработан метод выделения агарициновой кислоты из

лиственничной губки. Химическая структура выделенной агарициновой кислоты

исследована путем сравнения ИК-, УФ-, ЯМР-спектроскопии с достоверным

стандартным образцом агарициновой кислоты (SIGMA - ALDRICH» № 666-99-9).

Идентичность выделенной агарициновой кислоты со стандартным образцом

подтверждена так же по совпадению физико-химических характеристик: значения

4

ЯГ при проведении метода тонкослойной хроматографии, температуры плавления.

Установлено, что для идентификации и количественного определения основных групп биологически активных веществ возможно использование фармакопейных методов анализа. Определение высших жирных кислот проводили методом газожидкостной хроматографии, полисахаридов и глюкозамина -гравиметрическим методом.

Изучена острая токсичность агарициновой кислоты и спиртового извлечения из лиственничной губки. Проведены фармакологические и микробиологические испытания спиртового извлечения и агарициновой кислоты, выделенных из данного гриба.

Практическая значимость результатов исследования.

Разработана методика выделения и идентификации агарициновой кислоты из сырья лиственничной губки. Показано, что лиственничная губка может быть новым источником агарициновой кислоты. Результаты изучения химического состава лиственничной губки могут быть положены в основу нормативной документации на сырье. Разработаны методики идентификации и количественного определения основных биологических активных веществ лиственничной 1убки. Внедрение результатов исследования в практику. Работа выполнялась по договору с ООО «Алтайвитамины» г. Бийск. Имеется акт внедрения на способ получения суммарного фитопрепарата из плодового тела лиственничной губки, и о его фармакологических свойствах.

На основании результатов исследования разработан и зарегистрирован патент Российской Федерации № 2330676 от 10 августа 2008 г. на способ получения агарициновой кислоты из лиственничной губки.

Апробация и публикация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы доложены на региональных научно-практических конференциях по фармации в г. Пятигорске, по фармакологии - в г. Москве, на конкурсах молодых ученых в г. Ростове - на - Дону, на международном съезде в г. Санкт-Петербурге, в центральной печати г. Воронеж. По материалам исследований опубликовано 6 работ, в том числе патент РФ.

5

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ПятГФА (номер государственной регистрации 01.200101060).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 38 таблиц, 25 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, трёх глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 177 источника, в том числе 11 иностранных. Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Обоснование значимости сырья лиственничной губки для её изучения.

2. Результаты исследования химического состава лиственничной губки.

3. Способ выделения агарициновой кислоты из лиственничной губки.

4. Методики идентификации и количественного определения агарициновой кислоты, выделенной из лиственничной губки.

5. Результаты качественного и количественного анализа основных БАВ: жирных кислот, полисахаридов и глюкозамина, содержащихся в плодовом теле лиственничной губки.

6. Результаты изучения острой токсичности агарициновой кислоты и спиртового извлечения из лиственничной губки.

1. Результаты фармакологических и микробиологических испытаний спиртового извлечения и агарициновой кислоты, выделенных из лиственничной губки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объектом исследования была лиственничная губка (трутовик лекарственный - Fungus Laricis, Fomitopsis officinalis Will семейства трутовиковых - Polyporaceae, класса базидиомицетов - Basidiomycetes), собранная на территории Алтайского края в период с 2004 по 2009 гг.

Анатомо'морфологическая идентификация и изучение химического состава лиственничной губки

Гимениальный гриб, паразитирующий на стволах лиственниц (Pinus Larix, Larix Europaea). Состоит из мицелия, пронизывающего древесину, и плодового тела. Плодовое тело лиственничной губки копытообразное, удлиненное, почти цилиндрической формы, величиной 20—30 см, многолетнее, 30 см в высоту и более килограмма массой. Поверхность плодового тела белого цвета, с коричнево-бурыми зонами, шероховатая, покрыта тонкой твердой растрескивающейся коркой; края тупые, закругленные; внутренняя ткань тела мягкая, со временем твердеет. Снизу шляпки гриба имеются слои трубочек - гименофор. Полости трубочек выстланы спороносным слоем, на спороносцах которого развивается по 4 эллипсоидальные гладкие, бесцветные споры.

Проведено анатомо-морфологическое исследование для идентификации сырья плодового тела лиственничной губки. Выявлены характерные диагностические признаки, по которым изучаемое сырье лиственничной губки отличили от других видов базидиальных грибов и достоверно установили подлинность объекта исследования.

Для стандартизации исследуемого сырья лиственничной губки на

первоначальном этапе исследования были установлены общие товароведческие

показатели сырья плодового тела лиственничной губки: влажность составила не

более 5,23%, общая зола - не более 1,41% и зола, нерастворимая в

хлористоводородной кислоте - не более 0,1% .

Учитывая, что основными БАВ лиственничной губки являются агарициновая

кислота и смолы, была получена липидная фракция (60% по отношению к

исходному сырью) лиственничной губки, из которой были выделены агарициновая

7

кислота (9,5%) и смолистая фракция (48,5%), которые были подвергнуты качественному и количественному анализу.

Выделение, идентификация и количественное определение агарициновой кислоты, содержащейся в лиственничной губке

Разработан способ получения агарициновой кислоты из плодового тела трутовика лекарственного (лиственничной губки). Сырье лиственничной губки экстрагировали в аппарате Сокслета 95%-ньм этанолом до истощения сырья. Полученный экстракт упаривали и охлаждали до образования осадка. Осадок отделяли и промывали на фильтре 95% этанолом, получали техническую агарициновую кислоту. Полученную агарициновую кислоту растворяли при нагревании в 95% этаноле, затем охлаждали и отделяли осадок фильтрованием через стеклянный фильтр. Перекристаллизацию повторяли несколько раз. Полученную агарициновую кислоту высушивали до постоянной массы и взвешивали. Полноту извлечения агарициновой кислоты контролировали хроматографическим методом. Система растворителей - хлороформ: уксусная кислота: вода (13:2,5:1). При полном извлечении агарициновой кислоты пятно с ИГ = 0,67+0,02 при длине волны 365 нм отсутствует. Результаты получения агарициновой кислоты из лиственничной губки представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты получения агарициновой кислоты из сырья лиственничной губки (ЛГ)

№ партии Взято сырья, г Найдено АК, % Метрологические

сырья ЛГ характеристики

1 100,0 9,52 х = 9,51%

2 100,0 9,47 Б0=0,032

3 100,0 9,56 1*50=0,339

4 100,0 9,52 5.1=0,0132

5 100,0 9,48 л* =0,0338

6 100,0 9,51

Как следует из выше представленной таблицы, содержание агарициновой кислоты в сырье лиственничной губки составляет не менее 9 %.

Далее проводилась разработка методик идентификации агарициновой кислоты. Физические и физико-химические свойства выделенного вещества сравнивали со свойствами стандартного образца агарициновой кислоты («81дша-А1с1г1сЬ» № 666-99-9). Исследование показало, что выделенная агарициновая кислота - это кристаллический порошок белого цвета с легким желтоватым оттенком, без запаха, горько-сладкого вкуса, практически нерастворимый в воде, мало растворимый в 1 моль/л растворе натрия гидроксида, растворим при нагревании в этаноле 95% в соотношении 1:10. Данных по выделению и идентификации агарициновой кислоты из растительного сырья в доступной литературе нет.

Для идентификации агарициновой кислоты, выделенной из лиственничной губки применялись методы УФ -, ИК -, ЯМР - спектроскопии, определения температуры плавления, а так же тонкослойной и бумажной хроматографии в сравнении со стандартным образцом агарициной кислоты.

Температура плавления стандарта агарициновой кислоты составила 135 температура плавления изучаемого вещества - 135 ±1°С, а при изучении проб смешения этих компонентов температура плавления также составила 135+1°С. Это дало возможность сделать предварительный вывод об идентичности полученного порошка агарициновой кислоты со стандартным образцом.

Изучена возможность использования метода тонкослойной хроматографии дяя идентификации агарициновой кислоты, выделенной из лиственничной губки, в сравнении со стандартным образцом агарициновой кислоты, так как данная методика является наиболее доступной. На хроматограмме проявляется пятно агарициновой кислоты, выделенной из сырья агарициновой кислоты, которое соответствует пятнам стандарта агарициновой кислоты и пробе смешения. Это подтверждает идентичность стандартного образца агарициновой кислоты и вещества, выделенного из лиственничной губки, так как соответствующие им пятна

на хроматограммах имеют одинаковый вид и равные значения кт= 0,67±0,02.

9

Для идентификации агарициновой кислоты были изучены УФ - спектры 0,5% растворов выделенного вещества, стандартного образца агарициновой кислоты и пробы смешения данных образцов в 95% спирте этиловом. Измерение проводили с помощью спектрофотометра СФ-56 в области 200-350 нм. Максимум светопоглощения всех трех образцов находился в области 20б+2нм. УФ - спектры представлены на рисунке 1.

, - с»-гвйа-гг1

Рисунок 1 - УФ - спектры 0,5% растворов исследуемых веществ

1- - достоверный стандартный образен агарициновой кислоты

2. ---- агяришшор.ая кислота, выделенная и* ЛГ*

3. проба смешения агариянновои кислоты и её стандарта

Обработка спектральных данных позволила сделать предположение о том, что выделенное нами вещество из лиственничной губки является индивидуальным соединением и является агарициновой кислотой.

В дальнейшем проведено исследование ИК-спектров агарициновой кислоты, полученной из лиственничной губки, с целью установления ее структуры и идентичности со стандартным образцом агарициновой кислоты. На рисунке 2 представлены ИЬС спектры стандарта агарициновой кислоты и этой же кислоты, выделенной из лиственничной губки.

L'en

Рисунок 2 - ИК — спектры агарнциновой кислоты, выделенной из лиственничной губки и ее стандартного образца

1- ИК - спектр стандартного образца агарнциновой кислоты;

2 -ИК - спектр агарнциновой кислоты, выделенной из лиственничной губки.

Полученные данные свидетельствуют о том, что образец, выделенный из лиственничной губки и стандарт агарнциновой кислоты, полностью идентичны.

Для подтверждения структуры агарнциновой кислоты использовали так же метод |3С/'Н-ЯМР - спектроскопии. Получены ЯМР ПС - спектры агарнциновой кислоты, выделенной из лиственничной губки, и достоверного стандартного образца агарнциновой кислоты (рисунки 3 и 4).

Рисунок 3 - ЯМР 13С - спектр агарициновой кислоты, выделенной из лиственничной губки

Рисунок 4 - ЯМР 13С - спектр стандартного образца агарициновой кислоты

Таким образом, в результате анализа спектров ЯМР 'Н и |3С полностью подтверждена идентичность структуры стандартного образца агарициновой кислоты и агарициновой кислоты, выделенной из сырья лиственничной губки.

12

Следующим этапом работы явилась разработка метода количественного определения агарициновой кислоты, выделенной из сырья, так как в доступной литературе данных методов не описано.

Для количественного определения агарициновой кислоты использовали методику кулонометрического титрования. Титрование спиртового раствора агарициновой кислоты проводили 0,1 моль/л спиртовым раствором калия гидроксида при постоянной силе тока (10 мА), регистрируя время электролиза и рН раствора. Анализу подвергали стандартный образец агарициновой кислоты, полученный синтетически, и образцы, выделенные из сырья лиственничной губки. Полученная дифференциальная кривая титрования представлены на рисунке 5.

Рисунок 5 -Дифференциальная кривая титрования агарициновой кислоты

Количество агарициновой кислоты, прореагировавшего на электроде, пропорционально количеству электричества, прошедшего через раствор. Агарициновая кислота (АК) является производным лимонной кислоты. Поэтому дня проверки методики анализа в аналогичных условиях проводили титрование стандартного образца лимонной кислоты. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты определения агарнцнновой кислоты кулонометрическнм титрованием

Навеска Содержа Найдено

Анализируемый анализируемого Взято, ние мг/мл %, в пересчете

образец АК образца, г мг/мл влаги, % на сухое

вещество

образец 1 АК 0,1272 5,086 5,3 4,740 98,5

образец 2 АК 0,1706 6,823 5,2 6,352 98,3

образец 3 АК 0,1524 5,451 5,2 5,081 98,4

образец 4 АК 0,1615 5,989 5,2 5,576 98,3

образец 5 АК 0,1488 5,142 5,3 4,792 98,5

образец 6 АК 0,1349 5,144 5,2 4,794 98,4

стандарт АК 0,1250 5,011 5,0 4,715 99,5

лимонная к-та 0,1159 4,635 - 4,626 99,8

Как следует из таблицы 2 количественное содержание выделенной из сырья лиственничной губки составляет 98,4%, а стандартного образца - 99,5%.

В качестве альтернативной методики количественного определения агарициновой кислоты нами предложено потенциометрическое титрование.

Титрование спиртового раствора агарициновой кислоты проводили 0,1 моль/л спиртовым раствором гидроксида калия, добавляя титрант порциями и фиксируя значение рН. Индикаторным электродом служил стеклянный электрод, вспомогательным - хлорсеребряный. По полученным данным строили дифференциальную кривую титрования агарициновой кислоты, на которой имеется четко выраженный пик, максимум которого соответствует точке эквивалентности. Дифференциальная кривая титрования агарициновой кислоты представлены на рисунке 6.

Рисунок б - Дифференциальная кривая потенциометрического титрования

ягарициновой кислоты Для проверки методики в аналогичных условиях проводили титрование стандартного образца лимонной кислоты. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты определения агарициновой кислоты потенциометрическим титрованием

Анализируемый образец АК Навеска анализируемого образца, г Взято, мг/мл Содержа ние влаги,% Найдено

мг/мл %, с учетом влаги

образец 1 АК 0,5422 21,69 5,3 20,19 98,4

образец 2 АК 0,5253 21,01 5,2 19,58 98,4

образец 3 АК 0,5334 21,18 5,2 19,76 98,5

образец 4 АК 0,5241 21,44 5,3 19,96 98,4

образец 5 АК 0,5311 21,19 5,3 19,75 98,5

образец 6 АК 0,5405 21,09 5,2 19,66 98,4

стандарт АК 0,5308 21,23 5,0 20,42 99,4

Лимонная к-та 0,5224 21,44 21,42 99,9

Как следует из таблицы 3, содержание стандартного образца агарициновой кислоты составляет 99,4%, агарициновой кислоты, выделенной из шести партий сырья лиственничной губки- 98,4%, что подтверждает данные кулонометрического титрования. Таким образом, нами разработаны методы, позволяющие проводить количественное определение агарициновой кислоты, выделенной из плодового тела лиственничной губки.

Дальнейшим этапом нашей работы стало изучение валидационных характеристик методов количественного определения агарициновой кислоты. При этом руководствовались рекомендациями ICH. Для определения показателей качества применяли различные валидационные параметры в зависимости от характера методики. В данном случае определяли линейность, специфичность, правильность, прецизионность и точность

Проведение валидации методов количественного определения агарициновой кислоты позволило сделать вывод о пригодности методик для выполнения анализов в условиях производства.

Выделение, идентификация и количественное определение других БАБ лиственничной губки

Далее исследованию подвергали смолистую фракцию, выделенную из лиственничной губки, которая содержит различные биологически активные вещества, в том числе и жирные кислоты. Для идентификации и количественного определения высших жирных кислот, выделенных из сырья лиственничной губки, использовали метод газожидкостной хроматографии.

Хроматограмма высших жирных кислот лиственничной губки представлена на рисунке 7.

СП

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Время, мян

Рисунок 7 - Хроматограмма метиловых эфиров высших жирных кислот лиственничной губки

Массовые доли жирных кислот определяли методом внутренней нормализации. Результаты количественного определения высших жирных кислот в смолистой фракции лиственничной губки показаны в таблице 4.

Таблица 4- Компоненты смолистой фракции лиственничной губки.

№, Время, Высота, Площадь, Концентрация, Компонент,

п/п мин. мВ мВ*мин % кислота

1 4,228 28,642 8,006 8,789 пальмитиновая

2 7,871 1,860 0,122 0,134 олеиновая

3 8,602 33,951 4,741 5,205 линолевая

4 10,465 18,284 18,467 20,274 линоленовая

5 21,273 6,187 7,907 8,681 арахидоновая

6 41,719 2,642 5,740 6,302 бегеновая

Анализ результатов показал, что смолистая фракция, выделенная из лиственничной губки, содержит в своем составе следующие высшие жирные кислоты: 8,8 % пальмитиновая, 0,1 % олеиновая, 5,2 % линолевая, 20,3 % линоленовая, 8,7 % арахидоновая, 6,3 % бегеновая.

Далее из предварительно обезжиренного сырья лиственничной губки, по методике с использованием кислоты хлористоводородной (путем получения гидрофильной фракции) был получен глюкозамина. Идентификацию глюкозамина проводили с помощью метода тонкослойной хроматографии после детектирования раствором нингидрнна в сравнении со стандартным образцом. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Результаты получения глюкозамина из сырья

лиственничной губки

Взято сырья, г Найдено глюкозамина, г Содержание, % Метрологические характеристики

40,1224 1 1Г74. О S1 ~* X =2,8 SD = 0,0089 RSD = 0,3194% if=0,0037 0,0094

40,0451 111 1,1 1 и о

39,9675 1,1191 2,80

40,2031 1,1297 2,81

39,9689 1,1151 2,79

40,0224 1,1206 2,80

Таким образом, содержание глюкозамина в сырье лиственничной губки, составило 2,8% в пересчете от общей массы сырья. Данные исследования подтверждают литературные сведения о наличии глюкозамина в исследуемом сырье лиственничной губки.

Следующим этапом работы явилось изучение полисахаридного комплекса лиственничной губки. Выделение и количественное определение полисахаридов в плодовом теле лиственничной губки проводили по методу Sinner J. и Кочеткова Н.К. Установлено, что в углеводный комплекс плодового тела лиственничной губки входят: водорастворимые полисахариды (около 7°/о), пектины (около 18%) и

18

гемицеллюлоза (около 14%). Общее содержание полисахаридов в плодовом теле лиственничной губки составляет в среднем 39% в пересчете на абсолютно сухое сырьё.

Таким образом, основными биологически активными веществами, содержащиеся в лиственничной губке, являются: смолистые вещества (48%), агарициновая кислота (9,5%), глюкозамин (2,8%) и полисахариды (таблица б).

Таблица 6 - Основные биологически активные вещества лиственничной губки

№ п/п Биологически Содержание, %

активные вещества Найдено, % Литературные данные

1 Смолы 48,5 50

2 Агарициновая кислота 9,5 9-15

3 Глюкозамин 2,8 -

4 Полисахариды 7,1 _

Пекгины 1 О л ] о,и . .

6 Гемицеллюлоза 14,2

Изучение сроков годности сырья лиственничной губки Для сырья лиственничной губки нет критериев, позволяющих зафиксировать изменения его качества, происходящие при хранении. Мы провели дополнительные исследования, результаты которых дают возможность принять научно-обоснованное решение при установлении срока годности данного сырья лиственничной губки. В качестве критериев, позволяющих установить доброкачественность сырья лиственничной губки, были идентификация агарициновой кислоты (метод тонкослойной хроматографии) и её количественное определение. Выбранные показатели качества сырья лиственничной губки не изменялись в период наблюдения, который соответствовал 2 годам.

Изучение фармакологической и микробиологической активности агарициновой кислоты и спиртового извлечения из лиственничной губки

На основе данных литературы и собственных исследований установлено, что основная масса БАВ лиственничной губки представлена липидной фракцией, в составе которой обнаружены агарицииовая кислота и смолистые вещества, а также полисахариды. Эти данные дали основание для получения суммарного спиртового извлечения из плодового тела лиственничной губки, с использованием экстрагента - спирта этилового 95%. Выбор экстрагента был обоснован физико-химическими свойствами основных действующих веществ лиственничной губки.

Таким образом, получено суммарное спиртовое извлечение из лиственничной губки: сырье лиственничной губки предварительно настаивали в течение 12 часов, затем периодически экстрагировали при нагревании на кипящей водяной бане в колбе с обратным холодильником, в соотношении сырья и экстрагента - 1: 10. Затем его упаривали и высушивали при 40°С. Полученный суммарный фитопрепарат из сырья лиственничной губки, представляет собой порошок желтого цвета с характерным запахом и сладковато-горьким вкусом.

Далее нами определена острая токсичность агарициновой кислоты. Исходя из классификации токсичности агарицииовая кислота относится к классу малотоксичных веществ. Так же установлено, что спиртовое извлечение, полученное из лиственничной губки, относится к 5 классу токсичности т. с. к практически нетоксичным веществам (ГОСТ 12.1.007-76).

Результаты проведенных микробиологических исследований показали, что спиртовое извлечение из лиственничной губки и агарицииовая кислота не угнетают рост Escherichia coli, но обладают выраженной активностью в отношении грамположительных микроорганизмов рода Bacillus и подавляют рост спорообразующих микроорганизмов. Полученные результаты позволяют сделать выводы о том, что спиртовое извлечение из лиственничной губки и агарицииовая кислота могут быть использованы для создания антимикробных средств для наружного применения, а так же для разработки лекарственных препаратов при лечении кишечных инфекций.

Изучены некоторые фармакологические свойства спиртового извлечения из лиственничной губки. Были проведены исследования гипогликемической, желчегонной активности и гастропротективного действия.

Показано, что спиртовое извлечение из лиственничной губки оказывает желчегонное действие, и проявляет антиульцерогенную активность на хеликобактерподобной модели язвообразования.

На модели аллоксанового диабета установлено, что спиртовое извлечение из лиственничной губки обладает выраженной гипогликемической активностью.

Таким образом, сырье лиственничной губки может быть ценным источником для разработки лекарственных средств желчегонного, гипогликемического, противоязвенного и антимикробного действия.

На основании выполненных исследований химического состава лиственничной губки, разработаны показатели и установлены нормы качества, которые включены в проект фармакопейной статьи предприятия на сырье лиственничной губки.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено анатомо-морфологическое исследование сырья плодового тела лиственничной губки. Выявлены характерные диагностические признаки и достоверно установлена подлинность объекта исследования.

2. Определены числовые показатели сырья лиственничной губки: влажность составила не более 5,23%, общая зола - не более 1,41%, зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте - не более 0,1%.

3. Получена липидная фракция сырья лиственничной губки, из которой выделены агарициновая кислота (9,5%) и смолистая фракция (48,5%).

4. Методами ТСХ, ИК-, УФ-, ЯМР-спектроскопии подтверждена идентичность образцов агарициновой кислоты, выделенных из сырья лиственничной губки со стандартным образцом агарициновой кислоты.

5. Разработаны методы количественного определения агарициновой кислоты, выделенной из данного сырья. Количественное содержание которой составило 98,4%, а в стандарте 99,4%.

6. Методом ГЖХ идентифицированы в сырье лиственничной губки: пальмитиновая (8,8%), олеиновая (0,1%), линолевая (5,2%), линоленовая (20,3%), арахидоновая (8,7%) и бегеновая (6,3%) кислоты.

7. Проведено разделение и установлено количественное содержание фракции водорастворимых полисахаридов (около 7%), пектинов (около 18%) и гемицеллюлозы (14%).

8. Получен глюкозамин из лиственничной губки, содержание которого составило около 2,8% в пересчете на абсолютно сухое сырье.

9. Определена острая токсичности агарициновой кислоты, и спиртового извлечения из лиственничной губки.

Ю.Установлено, что спиртовое извлечение и агарициновая кислота из лиственничной губки обладают выраженным антимикробным действием.

11.Доказано, что спиртовое извлечение из лиственничной губки проявляет желчегонную, выраженную гипогликемическую активность и противоязвенное действие.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИИ

1. Пат. РФ № 2330676 С1. Российская Федерация. Способ получения агарициновой кислоты из лиственничной губки. Заявл. 09.01.07; опубл. 10.08.08, Бюл. №22,- 8 с. (Соавт. Айрапетова А.Ю., Гаврилин М.В., Шаталова Т.И.).

2. Идентификация агарициновой кислоты методом инфракрасной спектроскопии // Вестник Воронежского гос. ун-та. Серия: Химия. Биология. Фармация,-2006.-№ 2. - С. 231-232. ( Соавт. Гаврилин М.В., Беликов В.Г., Айрапетова А.Ю.).

3. Лиственничная губка (трутовик лекарственный): химический состав, применение // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорская ГФА. - Пятигорск, 2005,-Вып. 60. - С. 182-183. (Соавт. Беликов В.Г., Гаврилин М.В., Айрапетова, А.Ю.).

4. Получение сухого экстракта лиственничной губки и изучение его гипогликемической активности // Актуальные проблемы создания новых лек. препаратов природ, происхождения: материалы 10 Междунар. съезда «Фигофарм - 2006» 27-30 июня 2006 г.- СПб.: НИИХ СПбГУ, 2006. - С. 2630. (Соавт. Беликов В.Г., Гаврилин М.В., Айрапетова А.Ю., Крикова A.B.).

5. Разработка методов стандартизации и контроля качества лиственничной губки // От производителя до аптеки и потребителя: тез. докл. «Аптечный форум». - М., 2007. - С. 55-56. (Соавт. Беликов В.Г., Гаврилин М.В., Айрапетова А.Ю., Крикова A.B.).

6. Исследование химического состава сырья лиственничной губки // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорская ГФА.-Пятигорск, 2009. -Вып. 64.-С. 353-357.

ЦУКАНОВА ПОЛИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ СЫРЬЯ ЛИСТВЕННИЧНОЙ ГУБКИ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати ДА г, формат 60x84 16.

Бумага книжно-журнальная. Печать - ротопринтерная. Усл. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. заказ №

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Общая характеристика работы Актуальность темы

Природные биологически активные вещества играют важную роль в современной медицине, благодаря ряду преимуществ перед синтетическими. Как правило, они действуют мягче, проявляют меньше побочных действий. В последние годы наряду с растительными объектами ученые многих стран обратили внимание на грибы. К числу таких объектов относится лиственничная губка, которая является дереворазрушающим базидиомицетом. Лиственничная губка (трутовик лекарственный - Fomitopsis officinalis Will, Laricis fungus), находит широкое применение в народной медицине многих стран. Водные настои используют при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, нарушении обмена веществ, при тромбозах, заболеваниях эндокринной системы. Выявлено также применение извлечений из лиственничной губки в качестве противовоспалительного, кровоостанавливающего, гипогликемического и желчегонного средства. В научной литературе приводятся данные об иммуностимулирующем действии лиственничной губки, о применении её в качестве средства улучшающего деятельность кроветворной системы, а также как метаболического средства при злокачественных заболеваниях. По данным других ученых экстракт из лиственничной губки возможно использовать при некоторых вирусных заболеваниях и туберкулезе. Можно предположить, что фармакологическое действие лиственничной губки объясняется содержанием большого количества биологически активных веществ (БАВ). В лиственничной губке обнаружены агарициновая кислота, тритерпены, аминокислоты, органические кислоты, смолистые вещества и др.

Все вышесказанное позволяет сделать выводы, что лиственничная губка является ценным природным сырьем.

Однако для его внедрения в медицинскую практику необходимо решить многие вопросы. Прежде всего, следует определить основные группы биологически активных веществ, по которым возможно проведение стандартизации как самого сырья, так и полученных из него суммарных препаратов. Необходимо оценить методом скрининга наиболее ценные аспекты фармакологического действия.

Решение указанных вопросов позволит дать конкретные рекомендации по обоснованию возможности использования лиственничной губки. Поэтому изучение химического состава и стандартизация сырья лиственничной губки является актуальной задачей фармацевтической науки и практики.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы явилось изучение химического состава лиственничной губки, идентификация и количественное определение основных групп биологически активных веществ, содержащихся в плодовом теле лиственничной губки, стандартизация, и предварительные фармакологические исследования.

Основные задачи исследования:

1. Изучить химический состав лиственничной губки: выделить и идентифицировать основные группы биологически активных веществ, содержащихся в лиственничной губке.

2. Разработать методы выделения, идентификации и количественного определения агарициновой кислоты, содержащейся в лиственничной губке.

3. Провести исследование элементного состава лиственничной губки.

4. Разработать критерии стандартизации сырья лиственничной губки, подготовить проект фармакопейной статьи предприятия на данное сырьё.

5. Изучить острую и хроническую токсичность агарициновой кислоты и суммарного извлечения из лиственничной губки.

6. Провести фармакологические и микробиологические испытания суммарного извлечения лиственничной губки и агарициновой кислоты из лиственничной губки.

Научная новизна

Проведено исследование химического состава лиственничной губки. Установлено, что плодовое тело лиственничной губки содержит смолистые вещества (48,5%), в том числе следующие высшие жирные кислоты: пальмитиновую (8,8 %), олеиновую (0,1%), линолевую (5,2%), линоленовую (20,3%), арахидоновую (8,7 %), бегеновую (6,3 %); агарициновую кислоту (9,5%); полисахариды (7%), в том числе пектины (18%), гемицеллюлозу (14%) и глюкозамин (2,8%). Проведено исследование элементного состава лиственничной губки.

Показано, что лиственничная губка может быть новым источником агарициновой кислоты. Разработан метод выделения агарициновой кислоты из лиственничной губки, на основе которого зарегистрирован патент РФ. Химическая структура выделенной агарициновой кислоты исследована путем сравнения ИК-, УФ-, ЯМР- спектроскопии с достоверным стандартным образцом агарициновой кислоты (SIGMA - ALDRICH» № 666-99-9). Идентичность выделенной агарициновой кислоты со стандартным образцом подтверждена так же по совпадению физико-химических характеристик: значения Rf при проведении метода тонкослойной хроматографии, температуры плавления.

Установлено, что для идентификации и количественного определения основных групп биологически активных веществ возможно использование фармакопейных методов анализа. Определение высших жирных кислот проводили методом газожидкостной хроматографии, полисахаридов и глюкозамина - гравиметрическим методом.

Изучена острая токсичность агарициновой кислоты и спиртового извлечения из лиственничной губки. Проведены фармакологические и микробиологические испытания суммарного извлечения и агарициновой кислоты из лиственничной губки.

Практическая значимость результатов исследования

Разработана методика выделения и идентификации агарициновой кислоты из сырья лиственничной губки. Показано, что лиственничная губка может быть новым источником агарициновой кислоты. Результаты изучения химического состава лиственничной губки могут быть положены в основу нормативной документации на сырье. Разработаны методики идентификации и количественного определения основных биологических активных веществ лиственничной губки.

Проанализировано шесть партий сырья лиственничной губки, собранных в различных районах Алтайского края в период с 2004 по 2009 гг., и установлены нормы содержания БАВ.

Внедрение результатов исследования в практику

Работа выполнялась по договору с ООО «Алтайвитамины» г. Бийск. Имеется акт внедрения на способ получения суммарного фитопрепарата из плодового тела лиственничной губки, и о его фармакологических свойствах.

На основании результатов исследования разработан и зарегистрирован патент Российской Федерации № 2330676 от 10 августа 2008 г. на. способ получения агарициновой кислоты из лиственничной губки.

Разработан проект ФСП на сырье лиственничной губки, позволяющий определить подлинность и оценить его качество по основным биологически активным веществам.

Апробация и публикация результатов исследования

Основные положения диссертационной работы доложены и опубликованы на региональных научно-практических конференциях по фармации в г. Пятигорске, по фармакологии - в г. Москве, на конкурсах молодых ученых в г. Ростове - на - Дону, на международном съезде в г. Санкт-Петербурге, в центральной печати - г. Воронеж. По материалам исследований опубликовано 6 работ, в том числе патент РФ № 2330676 от 10 августа 2008 г. на способ получения агарициновой кислоты из лиственничной губки.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ПятГФА (номер государственной регистрации 01.200101060).

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы, 25 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, трёх глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 161 источника, в том числе 15 иностранных и приложения.

В первой главе диссертации обобщены данные литературы по описанию, химическому составу и применению лиственничной губки. Приведен исторический экскурс и первые упоминания о плодовом теле трутовика лекарственного. Описаны методы анализа и идентификации основных групп биологически активных веществ, содержащихся в лиственничной губке.

Во второй главе приведены результаты исследований по изучению химического состава лиственничной губки. Проведена анатомо-морфологическая идентификация сырья лиственничной губки, а так же определены товароведческие показатели. Получена липидная фракция из сырья лиственничной губки, из которой выделены очищенные образцы агарициновой кислоты. Подтверждена идентичность агарициновой кислоты (АК), полученной из шести партий сырья лиственничной губки, в сравнении со стандартным образцом, агарициновой кислоты (SIGMA ALDRICH) различными методиками. Определено количественное содержание агарициновой кислоты методом кулонометрического и потенциометрического титрования. Изучены валидационные характеристики данного метода, что позволило сделать вывод о пригодности методики для выполнения анализов в условиях производства.

В третьей главе выделены и идентифицированы из сырья лиственничной губки другие биологически активные вещества лиственничной губки. Методом газожидкостной хроматографии проведена идентификация жирных кислот в лиственничной губке. Исследованию подвергали смолистую фракцию лиственничной губки. Предложенная методика позволяет достоверно идентифицировать в сырье лиственничной губки пальмитиновую, олеиновую, линолевую, линоленовую, арахидоновую и бегеновую кислоты.

Обезжиренное сырье исследовали на присутствие различных групп полисахаридов по методу Н.К. Кочеткова. Был получен глюкозамина из сырья лиственничной губки. Получены фракции водорастворимых полисахаридов; пектинов и гемицеллюлозы.

В. четвертой главе — представлен экспериментальный- материал по фармакологическому и микробиологическому изучению агарициновой* кислоты и суммарного извлечения м лиственничной губки.

Определена- острая токсичность агарициновой кислоты и суммарного извлечения из лиственничной губки. Изучены антимикробные свойства агарициновой кислоты и суммарного извлечения из лиственничной губки, а так же желчегонное, гипогликемическое и противоязвенное действие суммарного извлечения из лиственничной губки на хеликобактерподобной модели язвообразования.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Обоснование значимости сырья лиственничной губки для её изучения.

2. Результаты исследования химического состава лиственничной губки.

3. Способ выделения агарициновой кислоты из лиственничной губки.

4. Методики идентификации и количественного определения агарициновой кислоты, выделенной из лиственничной губки.

5. Результаты качественного и количественного анализа основных БАВ: жирных кислот, полисахаридов и глюкозамина, содержащихся в плодовом теле лиственничной губки.

6. Результаты изучения острой токсичности агарициновой кислоты и суммарного извлечения из лиственничной губки.

7. Результаты фармакологических и микробиологических испытаний суммарного извлечения и агарициновой кислоты, выделенных из лиственничной губки.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено анатомо-морфологичеекое исследование сырья плодового тела лиственничной губки. Выявлены характерные диагностические признаки и достоверно установлена подлинность объекта исследования.

2. Определены числовые показатели сырья лиственничной губки: влажность составила не более 5,23%, общая зола - не более 1,41%, зола, нерастворимая в хлористоводородной кислоте - не более 0,1%. Определен макро - и микроэлементный состав лиственничной губки.

3. Получена липидная фракция из сырья лиственничной губки, из которой выделены агарициновая кислота (9,5%) и смолистая фракция (48,5%).

4. Методами ТСХ, ИК-, УФ-, ЯМР- спектроскопии подтверждена идентичность образцов агарициновой кислоты, выделенных из сырья лиственничной губки со стандартным образцом агарициновой кислоты.

5. Разработаны методы количественного определения агарициновой кислоты, выделенной из данного сырья. Количественное содержание выделенной агарициновой кислоты составило 98,4%, а в стандартном образце - 99,4%.

6. Методом ГЖХ идентифицированы в сырье лиственничной губки: пальмитиновая (8,8%), олеиновая (0,1%), линолевая (5,2%), линоленовая (20,3%), арахидоновая (8,7%) и бегеновая (6,3%) кислоты.

7. Проведено разделение и установлено количественное содержание фракции водорастворимых полисахаридов (около 7%), пектинов (около 18%) и гемицеллюлозы (14%). Методом бумажной хроматографии установлен моносахаридный состав некоторых фракций ПС. В ВРПС идентифицировали глюкозу и маннозу, в ПВ - арабинозу, в гидролизатах ГЦ А и ГЦ Б обнаружены моносахариды: глюкоза и арабиноза.

8. Получен глюкозамин из лиственничной губки, количественное содержание которого составило около 2,8% в пересчете на абсолютно сухое сырье.

9. Определена острая токсичности агарициновой кислоты, и спиртового извлечения из лиственничной губки.

Ю.Установлено, что суммарное извлечение и агарициновая кислота из лиственничной губки обладают выраженным антимикробным действием.

11. Доказано, что суммарное извлечение из лиственничной губки проявляет желчегонную, выраженную гипогликемическую активность и противоязвенное действие.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, сырье лиственничной губки может быть ценным источником для разработки лекарственных средств желчегонного, гипогликемического, противоязвенного и антимикробного действия.

На основании выполненных исследований химического состава лиственничной губки, разработаны показатели и установлены нормы качества, которые включены в проект фармакопейной статьи предприятия на сырье лиственничной губки.