Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Содержание свободного ионизированного Са2+ в тромбоцитах и их агрегация при органических болезнях сердца у детей

Р Г 6 од

на правах рукописи

БЕРЕЗНЕВА Наталия Анатольевна

СОДЕРЖАНИЕ СВОБОДНОГО ИОНИЗИРОВАННОГО Са2+ В ТРОМБОЦИТАХ И ИХ АГРЕГАЦИЯ ПРИ ОРГАНИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЯХ СЕРДЦА У ДЕТЕЙ

!4.00.09-Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте педиатрии Российской АМН.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор В.И. Сербии доктор медицинских наук, профессор В.Г. Пинелис.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ю.М. Белозеров, доктор медицинских наук, профессор М.И. Баканов.

Ведущая организация — Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова

Защита состоится се^юл^/л^ 1997года

в 14-00 часов на заседании диссертационного совета К 001.24.01 в НИИ педиатрии РАМН по адресу: 117963, ГСП-1, г. Москва, Ломоносовский проспект, д.2/62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ педиатрии РАМН. Автореферат разослан ¡^О-^ 1997 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

О. П. Фомина

Актуальность проблемы. Проблема сердечно-сосудистых заболеваний у детей является актуальной а виду их широкой распространенности. Осложняясь сердечной недостаточностью, тромбозами и эмболиями, эти заболевания часто приводят к инвалидизации и смертности в детском возрасте. Применяемая в настоящее время терапия не всегда является эффективной (Студеникин М.Я., Сербии В.И., 1984). Очевидно, что прогресс в борьбе с заболеваниями сердца на базе широких профилактических и лечебных мероприятий невозможен без глубокого изучения их патогенеза.

Большую роль в физиологии и патологии миокарда играют ионы кальция. Они принимают как непосредственное участие в регуляции клеточного метаболизма и сократимости, так и опосредованно, через семейство кальций-связывающих белков регулируют функцию сократительного аппарата клетки и скорость ряда метаболических процессов (Nishida Е. et а!.,1977; Siess W.,1989; Flesch М., 1996). Имеются также данные о функционировании потенциал- и рецегтгорзависимых систем, участвующих в поступлении кальция в кардиомиоциты, его мобилизации и секвестирования.(Левицкий Д.О. и др., 1981; Pietrobon D. et al., 1988)

Нарушения физиологических механизмов регуляции кальциевого гомеостаза в шокарде играют важную роль в возникновении и развитии ряда заболеваний ;ердца (Gwathmey J.К. et al., 1991). В конечном счете эти нарушения могут привести : структурным и функциональным изменениям рецепторного аппарата, обмена ггоричных посредников, изменению свойств самих миофибрилл, нарушению в них нергетического обмена, развитию склеротических изменений в миокарде.

Более того, при лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы рименяются разнообразные фармакологические препараты, некоторые из ггорых оказывают то или иное влияние на обмен внутриклеточного кальция. Так, ■ггагонисты кальция опосредуют своз влияние на клеточную активность путем <гмбирования процессов поступления ионов кальция в клетку (Nayer,1988). зрдечные гликозиды ингибируют калий-натриевую АТФ-азу, что снижает гмбранный потенциал и вызывает перераспределение ионов кальция в цитозоле и ¡мбранных структурах клетки (Brass L,F.,1984),

Однако эти вопросы в настоящее время изучены недостаточно. Это связано с тем, что непосредственное измерение свободного ионизированного кальция в кардиомиоцитах затруднено и проводится только при хирургических вмешательствах на сердце (Arai М. et а!., 1993). Поэтому в изучении особенностей клеточного обмена при заболеваниях сердечно-сосудистой системы немаловажную роль играет выбор модели. В последние годы широкое распространение получили исследования, проведенные на клетках крови. (Gafter U. et al., 1989; Мазаев A.B., Меньшиков М.Ю., Бугрий Е.М.,1989; Бершова Т.В. и др. 1996). Использование в качестве объекта исследования клеток крови позволяет работать с материалом, получаемым в ходе клинического обследования и лечения больных. Выбор тромбоцитов в качестве объекта исследований при заболеваниях сердца позволяет оценить не только изменения кальциевого гомеостаза, но и их функцию, в частности агрегацию, так как известно, что при патологии миокарда тромбоциты могут способствовать развитию таких грозных осложнений, как тромбозы и эмболии.

Большинство исследований по изучению нарушений кальциевого гомеостаза в клетках крови выполнено на взрослом контингенте больных, в основном при артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца и аритмиях (Киктев В.Г., Меньшиков М.Ю., 1988; Мазаев A.B. и др., 1989). У детей проведены лишь единичные исследования при артериальной гипертензии и нарушениях ритма (Пинелис В.Г. и др., 1988; Бершова Т.В. и др., 1994, 1996). В литературе мы не встретили данных о нарушениях кальциевого гомеостаза в клетках крови при таких органических заболеваниях сердца у детей каккардиомиопатии, врожденные пороки сердца.

Исходя из выше изложенного, данная работа ставила своей целью: выявить особенности нарушений кальциевого гомеостаза в тромбоцитах и их агрегационную способность при некоторых органических заболеваниях сердца у детей и оценить возможности фармакологических влияний на эти процессы.

Задачи исследования.

1. Изучить особенности кальциевого гомеостаза в тромбоцитах у детей при кардиомиопатиях (гипертрофической и дилатационной), аритмиях и некоторых врожденных пороках сердца и их зависимость от степени нарушения кровообращения.

2. Оценить изменения агрегационной способности тромбоцитов при вышеуказанных заболеваниях сердца.

3. Оценить эффективность применения ряда фармакологических препаратов (ренитека, изоптина и преднизолона) на клиническое течение заболевания, изменение гомеостаза ионов кальция в тромбоцитах и их агрегационной способности у детей с кардиомиопатиями и аритмиями.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное изучение функционального состояния тромбоцитов, выражающееся в оценке кальциевого гомеостаза и агрегации при кардиомиопатиях, врожденных пороках и аритмиях сердца у детей. Выявлено повышение содержания свободного цитоплазматического кальция ([Са2*]1 ) в интактных и активируемых тромбоцитах и усиление их агрегации у больных детей. Показано, что степень этих изменений зависит от характера заболевания, особенностей клинических проявлений и тяжести недостаточности кровообращения. На основании выявленных изменений показателей функционального состояния тромбоцитов установлено, что эти клетки принимают участие в патогенезе заболеваний сердца у детей.

Доказано, что наиболее существенное увеличение [Са2*} в интактных и активированных тромбоцитах, а также усиление их агрегации наблюдаются при обструктивной форме гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП). Наименее выраженные изменения указанных параметров выявлены у детей с врожденными пороками сердца ( ВПС). При кардиомиопатиях степень увеличения [Са2*} зависела от тяжести нарушения кровообращения. Обнаруженное впервые повышение [Са2+1 в интактных тромбоцитах, особенно у детей с кардиомиопатиями свидетельствует об усилении входа кальция, о торможении процессов выведения Са3* и его обратного захвата саркоплазматическим ретикулом и митохондриями, что косвенно отражает нарушения кальциевого гомеостаза в кардиомиоцитах, которые приводят к увеличению времени их диастолического расслабления.

Выявлена достоверная связь [Саг+]| в интактных тромбоцитах в безкальциевой среде с их агрегационной способностью у детей с кардиомиопатиями.

Впервые установлено, что под влиянием ренитека, наряду с улучшением клинического состояния больных, у ряда детей с кардиомиопатиями отмечается

снижение [Са2+1 в тромбоцитах и их агрегации, что свидетельствует об улучшении функционального состояния тромбоцитов под влиянием препарата.

Практическая ценность.

Содержание свободного цитоплазматического Са2* в тромбоцитах и степень их агрегации у детей с различными заболеваниями сердца являются дополнительным критерием клинической характеристики, установления тяжести недостаточности кровообращения и оценки эффективности проводимой терапии при кардиомиопатиях, аритмиях и врожденных пороках сердца.

В комплексной терапии кардиомиопатий показано применение ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), в частности ренитека, способствующего уменьшению Саг+ в тромбоцитах и снижению их агрегации.

Отсутствие клинического эффекта блокатора кальциевых каналов Ь-тапа изоптина указывает на необходимость проведения терапии, направленной на нормализацию вегетативного статуса и стабилизацию клеточных мембран.

Учитывая проагрегаторный эффект преднизолона, при назначении этого препарата необходима тщательная оценка исходного состояния гемокоагуляции и динамического контроля за ее параметрами.

Основные положения диссертации обсуждены на конференции молодых ученых НИИ педиатрии РАМН ( Москва, 1997), конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997). Исследования содержания в тромбоцитах свободного цитоплазматического кальция и их способности к агрегации внедрены в кардиологическом отделении НИИ педиатрии РАМН и рекомендуются для использования в детских кардиологических центрах с целью оценки тяжести недостаточности кровообращения и эффективности проводимой терапии у детей с различными заболеваниями сердечно-сосудистой системы.

Объем и структура диссертации.

Диссертация написана на ^¿страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, выводов и практическах рекомендаций. Работа иллюстрирована таблицей, зисунками, £ выписками из истории болезни. Список литературы включает ^отечественных и.^зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Объем и методы исследования.

Работа выполнена в НИИ педиатрии РАМН ( директор - академик РАМН, профессор М.Я. Студеникин), клиническая часть работы проводилась в кардиологическом отделении (руководитель - проф. В.И. Сербии), специальные исследования — в лаборатории клинической мембранологии ( руководитель - проф. В.Г. Пинелис).

В ходе проводимой работы было обследовано 60 детей с различными заболеваниями сердца в возрасте от 1 до 14 лет. В зависимости от характера заболевания все больные были разделены на 4 группы: с дилатационной кардиомиопатией (ДКМП) наблюдалось 14 детей (23,3%), с ГКМП - 16 ( 26,7%), с ВПС -12 (20%), с нарушениями ритма сердца (НРС) -18 больных (30%).

Диагноз заболеваний ставился на основании данных анамнеза, клинических проявлений, лабораторных и инструментальных методов исследования. Всем детям, проводилось общеклиническое обследование, включавшее общий анализ крови, общий анализ мочи, ЭКГ и ЭхоКГ. По показаниям выполняли рентгенографию органов грудной клетки, УЗИ органов брюшной полости и почек, проводили биохимический анализ крови.

Проведенные нами исследования функционального состояния тромбоцитов включали определение содержания в них свободного цитоплазматического кальция ([Са2+]() и их способности к агрегации. Мы остановили свой выбор клеточной модели на тромбоцитах по следующим соображениям: 1) доступность тромбоцитов как клеточного материала; 2) сходство тромбоцитов и кардиомиоцитов в структурном и функциональном отношениях по строению мембран, эндоплазматического ретикулума и митохондрий, по набору вторичных посредников и метаболизму; 3) тромбоциты в ряде случаев являются непосредственными участниками процессов, приводящих к осложнениям основного заболевания: при патологии сердечнососудистой системы повышение агрегации тромбоцитов может привести к развитию тромбоэмболий(Скворцов А А и др., 1989); 4) ярко выраженная способность кардиотропных препаратов влиять на клеточный метаболизм, в том числе на агрегацию тромбоцитов, также может быть обусловлена воздействием на механизмы регуляции кальциевого гомеостаза.

Контрольную группу составили 10 практически здоровых детей того же возраста.

[Са2*1 определяли в отмытых тромбоцитах. Для их выделения обогащенную тромбоцитами плазму центрифугировали ( 1800 оборотов в мин., 10 мин.) Образовавшийся осадок тромбоцитов ресуспендировали в буфере следующего состава: NaCI - 130мМ, KCI - 5 мМ, Na2HP04X 12Н20 - 0,5 мМ, HEPES 10 мМ, глюкозы 5 мМ ; MgCI2x 6Н20; рН-6,5; t-22° С ( буфер А). Для предотвращения спонтанной агрегации тромбоцитов, к суспензии добавляли апиразу 0,034 ед/мл , человеческий альбумин ( фракция У) 1 мг/мл. Для определения концентрации свободного цитоплазматического Са2+ суспензию тромбоцитов инкубировали с кальций-чувствительным флуоресцентным зондом Фура 2АМ в течение 40 мин. при температуре 37° С. Флуоресценцию нагруженных зондом тромбоцитов измеряли на спектрофлуориметре " Spex". Регистрацию флуоресценции фура-2 в тромбоцитах проводили в двухволновом режиме. Для мониторирования флуоресцентного сигнала использовали флуоресценцию, регистрируемую при длине волны эмиссии 495 нм, последовательно возбуждаемую при длинах волн 340 и 380 нм с частотой ЮОмс. каждые 10 сек. и хранимую в раздельных ячейках памяти запоминающего устройства DM 3000. Расчет концентрации Са2* в тромбоцитах проводили по методу, описанному G. Grynkiewicz et al. (1985).

Определение [CaJ+]¡ проводили в нестимулированных тромбоцитах ( как в безкальциевой среде, так и после добавления 1мМ Са2+ ) и при стимуляции томбоцитов АДФ ( 10 мкМ) и тромбином ( 0,1 ед/мл и 1,0 ед/мл). Все стимуляторы разводились 0,9% раствором хлорида натрия. При работе использовали реактивы фирмы "Sigma", Fura 2 AM фирмы «Molecular probes».

Измерение агрегации тромбоцитов проводили на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов "БИОЛА", модель 220LA ( Россия). Метод основан на анализе флуктуации светопролускания, вызванных случайными изменениями количества частиц в тонком лазерном оптическом канале.

Агрегация тромбоцитов изучалась в богатой тромбоцитами плазме, которую с целью стандартизации разбавляли аутологичной обедненной тромбоцитами плазмой до 200-220 тыс./мкл. В качестве индуктора агрегации использовалась АДФ в концентрациях 0,1 мкМ, 0,5 мкМ, 1,0 мкМ, 5,0 мкМ.

Результаты, полученные при обследовании детей с заболеваниями сердца, сравнивались с данными, полученными у практически здоровых детей или с результатами, полученными у больных после лечения. Обработка данных проводилась с использованием методов вариационной статистики с помощью статистической компьютерной программы " Призма". Достоверность результатов определялась с использованием критерия Стьюдента, при этом за достоверные принимались данные при р<0,05. Проводился также корреляционный анализ с вычислением коэффициентов линейной или нелинейной регрессии.

Результаты исследования и их обсуждение.

Проведенные исследования показали, что изменения функционального состояния тромбоцитов определялись как характером заболевания, так и тяжестью сердечной недостаточности (табл.1).

Таблица 1

Распределение обследованных больных по тяжести недостаточности

кровообращения

Заболевание НК 0-1 ст. НК 2а ст. НК 26-3 ст. Всего

ДКМП 4 3 7 14

ГКМП 10 6 0 16

ВПС 4 6 2 12

НРС 17 0 1 18

У здоровых детей , как видно на рис. 1, содержание кальция в интактных тромбоцитах, находящихся в среде без кальция, составило 59,73+3,65 нМ. После добавления в среду 1 мМ Саг* концентрация кальция в тромбоцитах возросла в среднем в 2 раза и составила 126,1+11,ЗнМ. Активация тромбоцитов АДФ у здоровых детей приводила к быстрому повышению в них [Са2*} — в среднем на 36,56% от уровня [Саг*]1 в кальций-содержащей среде. Затем [Са2*], несколько уменьшалась, но не достигала исходного уровня (рис.1). Тромбин в дозе 0,1 ед/мл вызывал примерно такое же увеличение [Са2+1 и такую же динамику, как и АДФ ( в среднем на 37,7%). В то же время активация тромбоцитов тромбином в дозе 1,0 ед/мл приводила к значительно большему повышению [Са2<]| ( в среднем на 210%). Повышение [Са2+1 было стойким, без тенденции к его снижению.

Исследование агрегационной способности тромбоцитов показало, что у здоровых детей АДФ в концентрации 0,1 мкМ приводила лишь к изменению формы тромбоцитов. Показатель агрегации тромбоцитов был равен 0.1056±0.02 у.е.

4->

о

со

§34

т* СО

о

ь

1-1

250

г500

О «

ы

-250 "

-30

500

750

1000

Время, сек

Б

О* 250 503 750 1000

Время, сек

Рис. 1. Содержание Са2* в интактных и активированных АДФ и тромбином тромбоцитах здоровых детей.

АДФ в дозе 0,5 мкМ у всех здоровых детей вызывала увеличение размеров агрегатов, что отражалось подъемом кривой на агрегатограмме. У 50% детей после достижения максимального значения кривая агрегатограммы плавно снижалась до исходного уровня. У остальных детей к 6 минуте регистрации средний размер агрегата еще превышал исходное значение. Показатель агрегации тромбоцитов при действии данной дозы индуктора был равен 0,317+0,044 у.е.

1,0 мкМ АДФ вызывала более быстрый и значительный подъем кривой на агрегатограмме, которая, доститув максимального значения, несколько опускалась, однако ни у одного ребенка не достигала исходного уровня к 6 мин регистрации. Показатель агрегации при этом составил 2,046+0,53 у.е.

При действии 5,0 мкМ АДФ наблюдалась сходная кинетика изменений кривой на агрегатограмме. Показатель агрегации у здоровых детей был при этом равен 15,33+4,26 у.е. Таким образом, у здоровых детей вызванная АДФ агрегация тромбоцитов является дозовозависимой и имеет Б-образный характер, что видно на рис. 5.

При изучении кальциевого обмена тромбоцитов при заболеваниях сердца выявлено увеличение [Са2<], в интактных тромбоцитах, а также кальциевых ответов, вызванных АДФ и тромбином (рис. 2).

Обнаруженное увеличение [Са2*]| не было связано с возрастом больных и длительностью заболевания. Аналогичные изменения рецептор-зависимого увеличения [Са2+], в интактных тромбоцитах и других клетках крови выявлены при артериальной гипертензии и аритмии (Кравченко А.Н. и др.,1988; Мазаев А.В. и др., 1989;). У детей с заболеваниями сердечно-сосудистой системы были проведены единичные исследования. Так, было обнаружено повышение [Са2+]( в тромбоцитах при первичной артериальной гипертензии (Пинелис В.Г. и др., 1988) и лизате эритроцитов при НРС (Бершова Т.В. и др., 1996).

Полученные данные показали, что в интакных тромбоцитах у детей с кардиомиопатиями, врожденными пороками и аримиями сердца имеет место достоверное увеличение [Са2*']| как при отсутствии Са2* в среде инкубации, так и при добавлении 1 мМ СаСЬ- Это свидетельствует о выраженных изменениях кальциевого гомеостаза в тромбоцитах у наблюдаемых нами детей, связанных,

вероятно, с нарушением не только входа Саг* через поврежденную плазматическую мембрану, но и систем секвестрации Саг* и его выхода. Обнаруженные нарушения кальциевого гомеостаза в интактных тромбоцитах, по-видимому, отражают глубокие изменения, которые, судя по клинико-инструментальным данным, имеют место в миокарде при заболеваниях сердца. Так, по данным М. Р1еэсЬ е1 а1. (1996), это может быть объяснено повреждением систем захвата Са2* саркоплазматическим ретикулом посредством сниженной активности Са2*-АТФ-азы и/или митохондрий. Эти изменения не зависят от характера повреждения миокарда и могут наблюдатся при различных заболеваниях сердца, приводящих к терминальной стадии сердечной недостаточности (Р1езс1т М. е! а1., 1996). Немаловажную роль в ДКМП (п=12) ГКМП (п=14)

т» 6

й. 200

СаС12 адф тромбин

О мМ 1 мМ 10цМ 0-1 «ЛИ 1,е Вд.'мп

CaCI2 адф тромбин

ОмМ 1 ыМ ЮнМ 0.1 «Д/МЛ ГО «¿»мл

£i 200-

ВПС (п=10)

СаС|2 адф тромбин Они 1 ММ 11«»»« '.»W-1

S 400-

НРС (п=12)

лА

CaClj О мИ 1 UM

Адф тромбин

ЮцИ 0.1 «А/мл 1,0«дГШ1

Рис. 2. [ Са2+], в тромбоцитах у здоровых детей и при заболеваниях сер; ИГ- здоровые - Ц - больные

увеличении [Ca2*], у большинства больных с различной патологией сердца играет гипоксия и увеличение содержания свободных радикалов. При этом происходит нарушение процессов тканевого дыхания и синтеза АТФ, необходимого для работы кальциевых насосов плазматической мембраны и внутриклеточных депо (Arbogast

Г?., 1993). Это приводит к снижению секвестирования ионов Са2+ во внутренние депо и выведения их из клетки, тем самым в цитоплазме поддерживается высокая [Са2*}. На прямую связь между увеличением перекисного окисления липидов и повышением Са2* в эритроцитах указывают данные Т.В. Бершовой, полученные у детей с НРС и ВПС (1995).

Определенное значение в изменениях [Са2*1 имеет №*/Са2* обмен. Литературные данные указывают, что у больных с заболеваниями сердца снижена активность №"7к*-АТФ-азы (Соколова С.Н., 1987), в результате чего происходит внутриклеточное накопление Ыа*, уменьшается его трансмембранный градиент, происходит реверсия №*/Са2+ обмена и внутриклеточный обменивается на наружный Саг\ Как уже было отмечено выше, в результате накопления свободных радикалов при патологш миокарда уменьшается синтез АТФ. Учитывая, что работа 1\1а"7Са2* обмена обеспечивается АТФ, можно предположить его блокаду и в результате этого увеличение [Са2+).

При анализе полученных данных естественно возник вопрос, зависит ли увеличение [Са2+]| от характера заболевания сердца? Проведенный анализ показал, что увеличение [Са2+]; наблюдалось у 92% больных с ГКМП, у 75% детей с ДКМП, у 70% больных с ВПС и только в половине случаев у детей с аритмиями. В целом, проведенный частотный анализ увеличения [Са2^ позволил распределить всех обследуемых больных следующим образом: ГКМП>ДКМП>ВПС>НРС.

Увеличение [Са2*1 в тромбоцитах у большинства детей с кардиальной патологией имело место не только в интактных тромбоцитах, но и при их активации такими агонистами, как АДФ и тромбин. Значительное повышение [Са2+]| в активируемых тромбоцитах связано как с усиленным его входом через рецептор-управляемые каналы, так и с усилением его выхода из внутриклеточных депо (Ткачук В.А., Авдонин П.А., 1989). Отсутствие отчетливой выраженной избирательности наблюдаемых изменений кальциевого гомеостаза в отношении какого-либо стимулятора клеточной активности свидетельствует о том, что у наблюдавшихся нами больных выявленные изменения не связаны с нарушениями рецепторного аппарата, а затрагивает саму функцию клеточных кальциевых каналов (Меньшиков М.Ю., 1995).

Анализ изменений [Са2^ в тромбоцитах больных детей позволил выявить также определенные особенности нарушений кальциевого гомеостаза внутри каждой нозологической группы.

Как уже отмечалось, практически у всех детей с ГКМП [Са2*} в тромбоцитах оказалась увеличенной, причем в наибольшей степени. В определенной мере эти изменения могут быть связаны с нарушениями гормональной регуляции, в частности, катехоламинов, концентрация которых при этом заболевании увеличена (РегкЛ ,1.К.,1981), тем более хорошо известен кальций-стимулирующий эффект этих соединений (Петровских П.Ф., Матвеева Л.С., 1983; ЯеМтапп С., \Л/егс1ап К., 1989). С другой стороны, более выраженное увеличение [Са2^ у этих больных в определенной мере может быть связано с усиленной сократимостью миокарда, часто наблюдаемой при данном заболевании (Мухарлямов Н.М., 1984) и с активацией всего контрактильного механизма.

£ х

п

О 100-

Л

т

необструкти вная форма ПШП

ВЕЗ обструктивная форма ГКМП

СаС1г

ОмМ 1мМ

АДФ ЮцМ

Рис. 3. Содержание Са2+ в тромбоцитах при обструкгивной и необструкгивной формах ГКМП.

У детей с ГКМП изменения [Са2*} в тромбоцитах зависели от формы заболевания. Оказалось, что наибольшее увеличение [Са2*]| было обнаружено у детей с обструкгивной формой ГКМП по сравнению с необструктивной формой заболевания (рис. 3). Возможно, эта зависимость обусловлена, с одной стороны, усиленной сократимостью миокарда левого желудочка, выявленной у больных с обструктивной формой, а с другой - гемодинамическим фактором, поскольку у этих больных более выражены нарушения кровообращения.

Еще одной особенностью нарушений кальциевого гомеостаза у детей с кардиомиопатиями по сравнению с другими больными является обнаруженная нами

зависимость изменений [Са2*} в тромбоцитах от степени недостаточности кровообращения, выражающаяся в значительном увеличении [Са2*1 по мере нарастания недостаточности кровообращения (рис.4). При ДКМП эта закономерность отмечалась только в интактных тромбоцитах в среде без Саг" .тогда как при ГКМП она имела место ив интактных, и в стимулированных тромбоцитах.

А

800-1 650500-400-т

Е х

г4 200Л 150т тз

£ 100500-1-

л т 4

ИСа*

1нМ Са" АД®

(10 мкМ)

тромбин (1,0 ед/мл)

Е~Г!-НК0-1 Ежа- НК2а 1-НК 26-3

Рис. 4. Зависимость концентрации Са2* от степени сердечной недостаточности в тромбоцитах больных с кардиомио-патиями. А —ДКМП; Б —ГКМП.

Это может свидетельствовать, что при ДКМП основную роль в нарушении Саг* -гомеостаза играет нарушение секвестрования Са2+ внутренними депо; тогда как при ГКПМ имеет место как нарушение секвестрования, так и повышенный вход Са2* в клетку. Эти данные указывают также на то, что гемодинамическиеизменения могут быть одной из причин повышения [Са2+1 в тромбоцитах и способствовать такому грозному осложнению как тромбоэмболия (см. ниже).

Как показали результаты настоящей работы, увеличение [Са2*]; в тромбоцитах были обнаружены только у 60% больных с НРС. Последнее в определенной мере может быть связано с отсутстствием у таких больных нарушений кровообращения. Повышение [Са2+], у детей с аритмией было обнаружено только в случаях сложных нарушений ритма (несколько эктопических очагов, пароксизмы желудочковой тахикардии, непароксизмальная тахикардия). Можно думать, что у этих больных множественность эктопических очагов приводит к грубым нарушениям в метаболизме миокарда и нарушению кальциевого гомеостаза. На множественный характер повреждения клеточных мембран при таких формах указывают данные, полученные на эритроцитах и миокарде детей с НРС Т.В.Бершовой (1996).

Итак, в тромбоцитах большинства больных с заболеваниями сердца, которые находились под нашим наблюдением, обнаружены нарушения Са2* гомеостаза, в основе которого лежат сложные мембранопатологические процессы.

Результаты исследования показали, что у большинства больных с патологией сердца увеличение [Са2+], в тромбоцитах сопровождалось повышением их агрегаци. Мы изучили агрегацию тромбоцитов на различные дозы АДФ.

Это позволило построить кривые «доза-эффект», анализ которых свидетельствует об изменениях не только чувствительности тромбоцитов, но и об их реактивности.

Выявлены также определенные особенности, связанные с характером заболевания сердца. Возрастающие концентрации АДФ вызывали дозовозависимую агрегацию как у больных, так и здоровых, однако, у детей с заболеваниями сердца наблюдались достоверно более высокие показатели (рис. 5).Так, наиболее высокая агрегация практически на все дозы индуктора была выявлена у детей с ГКМП, что свидетельствует о повышенной чувствительности и реактивности тромбоцитов таких больных. Обращает внимание, что у детей с ГКМП более высокие показатели агрегации тромбоцитов были обнаружены у больных с обструктивной формой по сравнению с необструктивной. У больных с кардиомиопатиями агрегация

тромбоцитов зависела также от тяжести сердечной недостаточности; она усиливалась с усугублением степени недостаточности кровообращения. При ВПС и НРС кривая "доза-эффект" была несколько сдвинута влево, что свидетельствует о повышенной чувствительности тромбоцтов к индуктору, изменений реактивности обнаружено не было.

Обращает внимание, что у ряда детей с заболеваниями сердца, особенно у больных с ДКМП и НРС, не отмечалось увеличения агрегации тромбоцитов после активации их АДФ, а иногда наблюдалось ее снижение. Это в определенной мере может быть связано с десенситизацией рецепторов или с уменьшением экспрессии АДФ рецепторов.

ДКМП

гкмп

150-.

100-

ё 50 5 25 * 20

А

I о

ДЦФ(йМ)

— 60

1 40

| 20

I 5

К *

3

ё 2

г оь

• ое-

3 0.40.2 8 00-1 1=

А

0.10 1.00 АДФ (мкМ)

А

V"

НРС

• 28-

1 18-

1 8

5 5-

е 9 3 0-

05:

л 04-

5 03

с 0.2-

я 01-

ж о 00-1

с

0 10 1 00 10 00 АДФ (мкМ)

60Н 402010-: 864г-

080.6-, 0.40.2-1 0.0-1

1.0

АДФ (мкМ)

Рис. 5. АДФ-индуцированная афегация тромбоцитов у детей с заболеваниями сердца.-----здоровые;--больные; * - р< 0,05

5

0.1

10.0

Поскольку агрегация тромбоцитов в значительной мере определяется изменениями внутриклеточной концентрации Са2* , можно предположить, что повышенная агрегационная способность тромбоцитов при ряде заболеваний сердечно-сосудистой системы связана с измененным внутриклеточным кальциевым обменом. Нами проведен корреляционный анализ содержания в тромбоцитах Са2* и их агрегационной способности. Выявлена достоверная корреляция между этими показателями при ГКМП при наименьшей дозе индуктора агрегации и при использовании 0,5 мкМ АДФ у больных с ДКМП ( рис. 6). У детей с НРС и ВПС этой зависимости выявить не удалось.

5 Г 50

г=0.63 (р< 0.02)

100 200 [Сг?\нМ

>ч

, о 1°Н

< 2 0.5

0.0

Г— 0.87 (р<0.005)

50 100 150

[Са2<],,нМ

200

Рис. 6. Зависимость афегации тромбоцитов от [Са ], у детей с кардиомиопатиями. А — ГКМП; Б — ДКМП .

.5-

Наряду с увеличением [Са2*], в тромбоцитах, пусковыми механизмами усиленной агрегации тромбоцитов могут быть следующие факторы: а) дисбаланс катехоламинов, который имеет место при ГКМП и НРС (Е$1ег е1 а1., 1989); б) интенсификация свободнорадикальных реакций и активация перекисного окисления липидов в миокарде (Саггаа е! а!., 1990), которые, выделяясь в кровь, вызывают агрегацию тромбоцитов. Одновременно с этим усиленное образование липидных перекисей в тромбоцитах при их агрегации способствует увеличению аккумуляции внутриклеточного Са2", подавлению активности аденилатциклазы с уменьшением концентрации цАМФ, активации простогландинового синтеза, модуляции активности рецепторных белков и функции сократительного аппарата кровяных пластинок. Иными словами, создается порочный круг, способствующий усилению афегации и осложняющий течение заболевания.

Одним из типичных осложнений, наблюдающихся при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, являются тромбоэмболии. Их частота колеблется в широких пределах и объясняется влиянием на их возникновение различных факторов: характера основного заболевания, тяжести недостаточности кровообращения, функционального состояния печени. Известно, что при недостаточности кровообращения тромбоэмболии возникают чаще, чем при заболеваниях сердца в состоянии компенсации [Студеникин М.Я., Сербии В.И.,1984]. Это связано с тем, что нарушение гемодинамики представляет собой фактор, способствующий их возникновению. Наблюдающаяся при некоторых заболеваниях сердца активация симпато-адреналовой и ренин-ангиотензин-альдостероновой систем приводят к нарушению коронарного кровотока, ухудшению питания миокарда, расстройству периферической микроциркуляции [Студеникин М.Я., Сербии В.И.,1984] и способствует развитию ишемии. В ишемизированном миокарде образуются метаболиты арахидоновой кислоты (Mullane K.M. et al., 1988), свободные радикалы и продукты перекисного окисления липидов, что может способствовать усилению агрегации тромбоцитов.

С целью изучения влияния терапии на [Ca2*]* в тромбоцитах, а также агрегацию нами проведена комплексная оценка действия различных препаратов при том или ином заболевании сердца. Эти исследования представляют интерес как для оценки риска возникновения тромбоэмболических осложнений, так и раннего выявления эффективности проводимой терапии. У детей с кардиомиопатиями было изучено влияние ренитека — ингибитора ангиотензинпревращающего фермента , учитывая, что в прогрессировании сердечной недостаточности при этих заболеваниях важную роль играет активация ренин-ангиотензин-альдостероновой ситемы, что ведет к венозной и артериальной вазоконсгрикции, застойному перераспределению крови в тканях и повышению объема циркулирующей крови (Remme W.J., 1986). Имеются данные, что ингибиторы АПФ способствуют /лучшению функции миокарда ( Li А.М.,1993), в том числе и при лечении детей с гардиомиопатиями (Larry А., Latson M.D., 1991). Препараты этой группы оказывают злагоприятное влияние на нарушенный кальциевый гомеостаз, т.к. имеются данные, ■ITO ангиотензин II (АГ II) ускоряет гидролиз фосфоинозитола до инозитол

трифосфата и диацилглицерола и способствует повышению [Са2*1 в цитозоле (Endoh M, 1995).

На фоне длительного применения ренитека у 4-х больных с кардиомиопатиями отмечалось снижение [Са2*]:, при этом оно наблюдалось у всех детей с положительным терапевтическим эффектом. Нами также было выявлено снижение агрегационной способности тромбоцитов под влияние этого ингибитора АПФ (рис. 7). Это согласуется с литературными данными, что АГ II повышает свертываемость крови (Spillert C.R. et а!., 1993). Снижение уровня системного и тканевого АГ II на фоне лечения ингибиторами АПФ ведет к увеличению продукции N0, простациклина, тканевого активатора плазминогена, подавлению адгезии тромбоцитов и нормализации функции эндотелия (Каган-Пономарев М.Я.; Добровольский А.Б.,1996).

В литературе имеются данные об использовании в лечении аритмий, ГКМП, первичной легочной гипертензии, артериальной гипертензии блокаторов кальциевых каналов (McTavich D., Sorkin Е.М., 1989; Arnold M. Katz et al., 1985). В нашей работе y детей с НРС использовался блокатор Са2* каналов изоптин (верапамил), действие которого связано с блокированием входа Са2+ через потенциал-зависимые кальциевые каналы плазматической мембраны и уменьшением освобождения внутриклеточного кальция из депо сарколеммы (Flaim S.F., 1981). Более того, было установлено, что этот препарат может ингибировать как кальмодулин-чувствительную, так и кальмодулин-нечувствительную фосфодиэстеразу и с этим эффектом, по-видимому, связана его способность блокировать кальциевые каналы (Atlas D., Adler M., 1981). Проведенные исследования показали, что 2-х недельный курс лечения изоптином приводил к недостоверному по сравнению с исходным уровнем снижению [ Са2*], в тромбоцитах у больных с НРС, независимо от клинического эффекта проводимой терапии. Нам не удалось также выявить существенных изменений способности тромбоцитов к агрегации на фоне применения блокаторов Са2* каналов.

В лечении ряда заболеваний сердца, в частности ДКМП широко используются глюкокортикоиды, в том числе и преднизолон. Однако необходимо учитывать, что эта терапия может приводить к сосудистым осложнениям, которые описаны во многих работах (Doll D.C., Yarbro J.W., 1994). Механизмы опосредованных глюкокортикоидами нарушений включают повреждение эндотелиальных клеток,

£• . os

^ V

5 a oe

? o<-

| 02-1 <

\

\

Рис.7. Влияние ренитека на содержание в тромбоцитах [Са2*| и их

агрегацию. А - нестимулированные тромбоциты; Б- после ■ стимуляции АДФ; 1- до лечения; 2- на фоне лечения.

"волнение" каскада тромбообраэования, активацию и агрегацию тромбоцитов, изменение гомеостаза тромбин-простациклина, дисрегуляцию цитокининов [ Doll

D.C., Yarbo I.W., 1994). Этими изменениями могут быть объяснены наблюдавшиеся нами повышение агрегации тромбоцитов у детей с ДКМП, получающих преднизалон, по сравнению с больными, в терапии которых данный препарат не использовали (табл.2), а также повышение агрегации тромбоцитов in vitro под влиянием преднизолона. Усиление агрегации тромбоцитов происходит несмотря на уменьшение [Са2*} в них (табл. 2) и связано, по-видимому, с прямым ингибирующим

Таблица 2

Функциональное состояние тромбоцитов у детей с ДКМП, не получающих глюкокортикоиды и на фоне терапии преднизолоном.

Агрег ация тромбоцитов Содержание CaJ* в тромбоцитах

Доза АДФ без преднизолона с преднизолоном Индукторы ДО преднизо лона С преднизоло ном

0,1 мкМ 0,14±0,03 0,213+0,05 Са^ в среде без кальция 100,7+ 15,34 79,4±8,17

0,5 мкМ 0,61±0,13 0,66+0,2 1мМ Са2* 196,1± 27,63 140,2+17,8

1,0 мкМ 2,9±0,62 3,95+0,175 10 мМ АДФ 320,7± 61,57 219±39,68

5,0 мкМ 17,2±3,29 56,9±17,66

влиянием преднизолона на инозитольный цикл и активность тирозин киназы, факторов, вызывающих агрегацию (Нег Е. е1 а!., 1990). Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов (Суманова Ш.Б., 1981; Цыгин А.Н. и др., 1994) об усилении коагуляции под влиянием глюкокортикоидов и свидетельствуют о необходимости контроля за состоянием гемостаза у детей, длительно получающих эти препараты.

Таким образом, обобщая результаты проведенных исследований, можно заключить, что у детей с органическими заболеваниями сердца имеются нарушения кальциевого гомеостаза, заключающиеся в повышении содержания [Са2*]1 и в интактных, и в активированных тромбоцитах, а также усиление их агрегации. В этом плане, тромбоциты, вероятно, отражают изменения, происходящие в миокарде при некоторых заболеваниях сердца и поэтому являются адекватной моделью для изучения патогенеза этих заболеваний и эффективности проводимой терапии.

ВЫВОДЫ

1. Кардиомиопатии, врожденные пороки сердца и аритмии у детей как правило сопровождаются нарушениями кальциевого томеостаза в тромбоцитах и их агрегационной способности в виде повышения содержания свободного цитоплазматического Са!* и усиления агрегации под влиянием АДФ.

2. При гипертрофической кардиомиопатии наблюдается более выраженное по сравнению с другими болезнями сердца увеличение ионизированного Са2* в лнтактных тромбоцитах, очевидно, в результате нарушения систем входа, зыведения ионов Са2* из клетки и их секвестрования внутренними депо. Эти вменения отражают нарушения сократительной и диастолической функций лиокарда..

3. Повышение ионизированного Са2+ в тромбоцитах (как в ¡естимулированных, так и после стимуляции АДФ) и их агрегационной активности у юльных гипертрофической кардиомиопатией зависит от формы заболевания и тепени недостаточности кровообращения. Выраженность этих изменений арастает с усугублением тяжести поражения сердца.

4. У детей с дилатационной кардиомиопатией наблюдается повышение грегационной способности тромбоцитов, усиливающееся по мере нарастания едостаточности кровообращения, что увеличивает риск возникновения тромбозов эмболий у этого контингента больных.

5. У детей с гипертрофической и дилатационной кардиомиопатиями гмечается достоверная связь концентрации ионизированного Са2> в интактных юмбоцитах с их агрегационной способностью при стимуляции АДФ.

6. Ингибитор ангиотензинпревращающего фермента ренитек, наряду с 1иническим улучшением кардиомиопатии у ряда детей, вызывает снижение уровня ггоплазматического Са2* в тромбоцитах и их агрегации.

7. Повышение содержания С а2* у 60% больных с аритмиями, а также значительная эффективность терапии блокатором кальциевых каналов оптином свидетельствует, что механизм развития нарушений сердечного ритма у да детей связан не только с дисфункцией потенциалзависимых кальциевых -!алов Ь-типа.

8. Длительная терапия преднизолоном у детей с дилатационной кардиомиопатией вызывает усиление агрегационной способности тромбоцитов, поэтому при его применении необходимо осуществлять периодический контроль за состоянием гемостаза не реже 1-2 раз в месяц.

Практические рекомендации.

1. Определение функциональной активности тромбоцитов ( содержания внутриклеточного кальция и агрегации ) целесообразно использовать в качестве дополнительных критериев оценки особенностей клинического течения, выраженности патологического процесса и оценки эффективности проводимой терапии при болезнях сердца у детей.

2. В комплексную терапию сердечной недостаточности необходимо включать ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, оказывающие благоприятный эффект на функцию тромбоцитов и препятствующие развитию такого осложнения, как тромбоэмболия.

3. При назначении преднизолона необходима тщательная оценка исходной агрегации тромбоцитов и ее динамический контроль. При наличии у больных гиперагрегации терапия преднизолоном должна сочетаться с профилактическим назначением антиагрегантов.

4. В терапии больных с нарушениями ритма сердца необходимо проведение мероприятий, направленных на нормализацию вегетативного статуса и стабилизацию плазматической мембраны кардиомиоцитов.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Состояние обмена ионизированного кальция в тромбоцитах у детей с гипертрофической кардиомиопатаей. - 4-й Российский национальный конгресс " Человек и лекарство"- 1997г. Тез. докладов,- с.17,- (соавт. Т.П. Сторожевых, В.Г. Пинелис).

2. Функциональное состояние тромбоцитов при дилатационной кардиомиопатии у детей. - 4-й Российский национальный конгресс " Человек и лекарство"- 1997г. Тез. докладов,- с.18,- (соавт. Т.П. Сторожевых, В.Г. Пинелис).

3. Функциональное состояние тромбоцитов у детей с гипертрофической кардиомиопатией,- Депонировано.- №26.615 от 23. 06. 1997г.( соавт. Сторожевых Т.П.).