Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Содержание и синтез цитокинов при псориазе

Анна Станиславовна

СОДЕРЖАНИЕ И СИНТЕЗ ЦИТОКИНОВ ПРИ ПСОРИАЗЕ

14.00.36 - аллергология и иммунология 14.00.11 - кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ии348 юза

Санкт-Петербург 2009

003481038

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И.П. Павлова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ.

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Тотолян Арег Артемович Доктор медицинских наук, профессор Монахов Константин Николаевич

Официальные оппонепты:

Доктор медицинских наук, профессор Сельков Сергей Алексеевич Доктор медицинских наук, профессор Горланов Игорь Александрович

Ведущее учреждение:

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Защита состоится «_ // » Ш^^/Уи 2009 года в /у часов на заседании диссертационного совета ДМ 001. 022. 01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН (197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН, по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12.

Автореферат разослан «_

/Г » _2009 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

Бурова JI.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Псориаз - хронический дерматоз мультифакториальной природы с доминирующим значением в развитии генетических факторов, характеризующийся гиперпролиферацией эпидермальных клеток, нарушением кератинизации, воспалением в дерме (Соколовский Е.В. и соавт., 1999). Эпидемиологические исследования последних лет показали, что псориаз встречается практически во всех климатогеографических зонах земного шара, однако отмечаются расовые отличия в частоте заболевания. Распространенность псориаза варьирует в разных странах, и, по данным различных авторов, составляет от 0,1% до 2% (Lomholt G., 1963; BrandrupF., Green А., 1981; Christophers Е., 2001). В Европейских странах псориаз поражает 1,5-2% популяции, в Канаде заболевание встречается с частотой до 4,7%, в Азиатских странах встречается реже (0,4% в Китае). У 14-47% больных псориазом наблюдается артрит и/или спондилит (Gladman D.D., 1998). В настоящее время число больных псориазом в России составляет приблизительно 3 млн. человек; отмечается тенденция к росту заболеваемости среди лиц трудоспособного возраста, увеличению числа тяжелых, непрерывно рецидивирующих форм заболевания (Беляев Г.М. и соавт., 2005). К настоящему времени доля больных псориазом среди всех больных дерматозами составляет 12-15% (Соколовский Е.В. и соавт., 1999). Установлено, что у 60-70% больных псориаз предшествует артриту, у 10-20% - псориаз развивается одновременно с артритом и примерно у 20% кожные проявления псориаза могут развиться после возникновения поражения суставов (Логинова Е.Ю. и соавт., 2008). Артрит предшествует развитию псориаза чаще у детей, имеющих отягощенный семейный анамнез по псориазу (Насонов E.JL, 2008). В формировании и реализации клинических проявлений псориаза участвуют многочисленные факторы. Многие зарубежные и отечественные исследователи отмечают ведущую роль иммунных механизмов в патогенезе псориаза (ШегайМ.М., и соавт., 1998; Gottlieb А.В., 2003; Pietrzak А.Т., 2008). В связи с распространенностью данного заболевания и не выясненным первичным патогенетическим механизмом, представляется актуальным исследование хемокинов, хемокиновых рецепторов, основных цитокинов, участвующих в патогенезе псориаза, и транскрипционного маркера Т-регуляторных клеток - FOXP3. Данное исследование позволит уточнить патогенез заболевания, охарактеризовать длительность и течение хронического повреждения в коже.

Цель работы. Оценить закономерности системной продукции и местного синтеза цитокинов при псориазе с целью изучения иммунопа-тогенеза и поиска новых биомаркеров заболевания.

Задачи работы

1. Определить нормальные значения уровня цитокинов в сыворотке крови и в моче, а также экспрессию мРНК СС- и СХС-хемокинов в биоптатах кожи практически здоровых лиц.

2. Определить в сыворотке крови больных псориазом содержание следующих цитокинов:

- провоспалительных цитокинов (IL-la, IL-ip, IL-9, IL-12 (р40), IL-12(р70), IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, TNF-а, TRAIL, MIF, LIF; IL-2Ra, IFN-a2);

- противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-IRA);

- Thl-цитокинов (IFN-y, TNF-P, IL-2,);

- ТЬ2-цитокинов (IL-4, IL-5, IL-6);

- факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул (FGFbasic, SCF, SCGF, PDGF-BB, P-NGF, VEGF, HGF, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, IL-7, ICAM-1, VCAM-1);

- хемокинов (CCL27/CTACK, CXCLl/GROa, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-la, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8, CCLll/eotaxin, СХСЫОЛР-Ю, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-la и CCL4/MIP-lp).

3. Оценить содержание цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y, GM-CSF, TNF-a) в сыворотке крови и моче у больных псориазом и у больных атопическим дерматитом и склеродермией, и в зависимости от клинической активности процесса.

4. Исследовать экспрессию мРНК FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже при псориазе.

5. Определить экспрессию мРНК некоторых СС- и СХС-хемокинов и их рецепторов в визуально здоровой и в пораженной коже больных псориазом по сравнению с атопическим дерматитом и склеродермией.

Научная новизна

Впервые определена экспрессия хемокинов и хемокиновых рецепторов в коже практически здоровых лиц. Выявлено, что в коже практически здоровых лиц экспрессируются гены хемокинов (CCL4/MIP-1P, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8) и гены рецепторов для СС-хемокинов (CCR1, CCR3 и CCR5), однако отсутствует экспрессия СС-хемокинов (CCL3/MIP-la, CCLll/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и рецепторов для семейства СХС-хемокинов. Показано, что у больных псориазом с индексом PASI менее 10 и с индексом PASI более 20 значительно повышено содержание в сыворотке крови: CCL4/MIP-lp, CCL7/MCP-3, CCLll/eotaxin, CCL27/CTACK, CXCLl/GROa, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-la по сравнению с практически здоровыми лицами, а также повышено содержание CXCL10/IP-10 в сыворотке крови у пациентов с индексом PASI< 10. Установлены особенности экспрес-

сии генов хемокинов и их рецепторов в коже больных псориазом по сравнению с атопическим дерматитом и склеродермией. Установлена зависимость экспрессии генов хемокинов и их рецепторов в коже от распространенности и тяжести течения псориаза и псориатического артрита, а также определена их корреляция с индексами прогрессии данной патологии, индексами VAS и PASI.

Впервые определены лабораторные маркеры активности псориаза в моче: выявлена прямая корреляционная зависимость между индексом PASI и концентрациями IL-6 и IL-8 в моче при псориазе и взаимосвязь между уровнем IL-6 и содержанием белка в моче, что может указывать на диагностическую значимость этого цитокина как маркера «активности поражения почек» при псориазе. Установлена повышенная экспрессия гена FOXP3 в коже больных псориазом по сравнению с практически здоровыми лицами. Изучен уровень экспрессии гена FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже у больных псориазом, также установлены закономерности экспрессии этого гена по мере прогрессирования заболевания. Выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнем экспрессии гена FOXP3 в визуально здоровой коже больных псориазом и индексом тяжести и распространенности заболевания (PASI).

Теоретическая значимость работы

В данной работе освещены три аспекта иммунопатогенеза псориаза: участие цитокинов, Т-регуляторных клеток, а также хемокинов и их рецепторов в формировании и поддержании псориатического воспаления. С помощью мультиплексного анализа цитокинов показано вовлечение в патогенез псориаза «цитокинового каскада», включающего активацию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, Thl- и Th2-цитокинов, хемокинов, а также факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул. На уровне регуляторных Т-клеток было выявлено нарастающее повышение экспрессии гена FOXP3 по мере прогрессирования заболевания. Выявлена прямая корреляционная зависимость между индексом тяжести и распространенности псориаза и концентрациями IL-6 и IL-8 в моче.

Третий аспект относится к определению закономерностей повышенного местного синтеза СС- и СХС-хемокинов и хемокиновых рецепторов в кожных биоптатах больных псориазом, участвующих в формировании и поддержании воспаления в коже. Высказана гипотеза о наличии в визуально непораженной коже больных псориазом повышенного содержания мРНК хемокинов (CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß, CCLll/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и двух рецепторов для CXCL8/IL-8 (CXCR1 и CXCR2) как потенциальных биомаркеров заболевания, что наиболее значимо в дебюте псориаза, особенно при суставных его проявлениях.

Практическая значимость работы

Определение показателей повышенной экспрессии мРНК хемоки-нов (CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-ip, CCLll/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и рецепторов (CXCR1 и CXCR2) в сочетании с повышенной экспрессией мРНК FOXP3 в коже предполагается рекомендовать к использованию в клинической практике для дифференциальной диагностики псориаза, что наиболее значимо в дебюте заболевания, особенно при суставных его проявлениях. Для определения активности заболевания рекомендуется определять IL-6 и IL-8 в моче, предлагаемые «маркеры» активности псориаза, которые определяются с помощью неинвазивных методов и доступны для клинического применения. Для уточнения поражения почек при псориазе возможно определение IL-6, который коррелирует с содержанием белка в моче.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. В сыворотке крови больных псориазом значительно увеличено по сравнению с практически здоровыми лицами содержание провоспали-тельных цитокинов (IL-ip, IL-6, IL-9, IL-12 (p40), IL-13, IL-16, IL-18, TNF-a, IL-2Ra, IFN-a2 и LIF), Thl-цитокинов (IFN-y); ТЬ2-цитокинов (IL-5), хемокинов (CCLll/eotaxin, CCL4/MIP-lp, CCL7/MCP-3, CCL27/CTACK, CXCLl/GRO-a, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-la), а также факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул (GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, SCGF, p-NGF, HGF и ICAM-1).

2. У пациентов с псориазом по сравнению с больными атопическим дерматитом и склеродермией повышенная экспрессия мРНК хемокинов (CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-1P, CCLll/eotaxin, CCL24/eotaxin-2), хемокино-вых рецепторов (CXCR1 и CXCR2) и FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже сочетается с повышенным содержанием IL-6, GM-CSF, IFN-y и TNF-a в сыворотке крови и повышенным содержанием IL-4, IL-10, GM-CSF, IFN-y и TNF-a в моче.

3. Рост клинической активности псориаза сопровождается повышенным содержанием IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-y и TNF-a в периферической крови и повышенным содержанием IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-y в моче в сочетании с повышенной экспрессией мРНК FOXP3, хемокинов (CCL11/ eotaxin, CCL24/eotaxin-2, CCL3/MIP-la и CCL4/MIP-1P) и рецепторов для CXCL8/IL-8 (CXCR1, CXCR2) вбиоптатах визуально здоровой и пораженной кожи.

Личный вклад автора

Автором лично выполнено проведение puneh-биопсий у больных псориазом, групп сравнения и практически здоровых лиц. Автором проводилась оценка тяжести заболевания, подсчет интегральных индексов -PASI и VAS, проведение ПЦР диагностики (выделение мРНК из биопта-

тов кожи, проведение обратной транскрипции, амплификация, проведение электрофореза и детекция продуктов амплификации). Вклад соавторов состоял в помощи при отборе, клиническом обследовании больных псориазом и псориатическим артритом и групп сравнения (Ильина Т.Н., Ше-меровская Т.Г., Хобейш М.М.), а также в освоении и постановке новых методов исследования (Сысоев К.А.). Доля участия автора в накоплении, обобщении, анализе материала составляет 100%.

Апробация работы

Основные положения диссертационного исследования были доложены на конференциях: Общества Молодых Ученых СПбГМУ имени акад. И.П. Павлова «Санкт-Петербургские научные чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007), II Международный молодежный медицинский конгресс (Санкт-Петербург, 2007), на конференции 8-th JOHN HUMPHREY (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (Санкт-Петербург, 2008), Объединенный иммунологический форум - 2008 (Санкт-Петербург, 2008), XIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени акад. В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009). Работа поддержана грантами Правительства Санкт-Петербурга № 4/04-05/19 в 2008 и№ 4/30.04/021 в 2009 году.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, включает список сокращений, введение, обзор литературы, описание материалов и методов, содержит три главы собственных наблюдений, обсуждение результатов исследования, заключение, выводы, практические рекомендации, приложение, содержит список литературы, включающий 243 источника (20 отечественных и 223 зарубежных). Работа содержит 20 таблиц и 17 рисунков.

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 6 печатных работ, в том числе 1 публикация в научном журнале рекомендованном ВАК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Всего обследовано 108 человек, из них 70 человек принадлежали к основной группе (пациенты с псориазом и псориатическим артритом, средний возраст 46,6±9,5 года), 20 человек составили группу сравнения (атопический дерматит, средний возраст 30,8±5,9 лет и склеродермия, средний возраст 46,1±11,8 лет) и 18 группу контроля (практически здоро-

вые лица, средний возраст 30,9±15,3 лет). У всех больных псориазом были собраны анамнестические данные о течении заболевания. Постановка диагноза осуществлялась на основании клинической картины, рентгенологического исследования суставов, анамнестических данных и выявления в большинстве случаев антигенов HLA В27, а также на основании новых диагностических критериев, разработанных в 2006 году международной группой исследователей CASPAR (Classification Criteria for Psoriatic Arthritis).

Для определения тяжести заболевания, наряду с оценкой клинической активности, были использованы индексы оценки кожных и суставных псориатических поражений - индексы PASI (Psoriasis Area and Severity Index) и VAS (Visual Analog Scale). Оценка PASI проводилась из расчетных данных: легкая степень до 10 баллов PASI включительно, средняя степень - от 10 до 20 баллов, тяжелая - 20 баллов и более. В группе пациентов с псориазом было 20 человек с индексом PASI менее 10 (средний возраст 45,1±10,3 лет), 30 пациентов с индексом PASI от 10 до 20 (средний возраст 42,2±7,5 лет) и 20 пациентов с псориазом с индексом PASI более 20 (средний возраст 47,1±11,8 лет).

Иммунологическое исследование биоптатов и образцов сыворотки крови и мочи больных проводилось в лабораториях Научно-методического центра по молекулярной медицине на базе СПбГМУ.

Материалом для исследования служили образцы кожных биоптатов, полученных методом punch-биопсии от пациентов, страдающих псориазом, из участков визуально неповрежденной кожи и из бляшечных элементов. РипсЬ-биопсия производилась с помощью одноразового стерильного пробойника диаметром Змм (Stumpp Medizintechnik GmbH, Германия). Всем пациентам проводилось определение экспрессии мРНК хемо-кинов CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß, CCL5/RANTES, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2, CXCL8/IL-8 и их рецепторов CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2 имРНК FOXP3 с помощью постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) с предварительной обратной транскрипцией. Реакционная смесь для ПЦР содержала следующие компоненты: 5х ПЦР-буфер (Амплисенс, Москва), деионизированная вода - до 20 мкл, прайме-ры (от 0,05 до 0,3 цМ) производства «Синтол» (Москва), ДНК-Taq поли-меразу («ДНК-Технология, Москва», 1,0 ферм.ед. в пробе) имРНК (7,5 мкл в пробе), в общем объеме 10 мкл. ПЦР проводили в амплификаторе ICycler (Bio-Rad, США). Режим ПЦР: денатурация ДНК при 95°С - 4 мин., 30 циклов амплификации (95°С - 30 е., 60°С - 30 е., 72°С - 30 е.), элонгация 72°С - 7 мин. Визуализацию полученных ПЦР-продуктов осуществляли в 1,5 % агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, при УФ освещении на трансиллюминаторе «Волна» (Россия). Полуколичествен-

ную оценку проводили с помощью программы Gel-Pro, принимая за 100 % интенсивность флюоресценции ß-актина. Мультиплексное определение панели цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y, GM-CSF, TNF-cx (проводилось в сыворотке и моче 52 больных псориазом), а у 10 пациентов в сыворотке крови определялись: IL-la, IL-lß, IL-12 (р40), IL-12(р70), IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, TNF-a, TNF-ß, TRAIL, MIF, IL-10, IL-1RA, IL-2, IL-2Ra, IFN-a2, IFN-y, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13, LIF, FGFbas-ic, SCGF, PDGF-BB, ß-NGF, VEGF, HGF, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, IL-7, ICAM-1, VCAM-1, SCF, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß, CCL5/RANTES, CCL7/MCP-3, CCLll/eotaxin, CCL27/CTACK, CXCLl/GROa, CXCL8/IL-8, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL12/SDF-la с использованием коммерческих наборов и прибора BlO-Plex («BIORAD», США).

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы «Statistica 6.0» (StatSoft, США). Две группы независимых переменных сравнивались U-тестом Вилкоксона-Манна-Уитни. При отсутствии нормального распределения переменных использовалась ранговая корреляция по Спирмену. Достоверными считались различия между группами при р< 0,05, что является стандартным уровнем для медико-биологических исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Содержание цитокинов в сыворотке крови и в моче больных псориазом Первоначально у 10 пациентов было определено содержание 50 цитокинов. Эти цитокины, в зависимости от функциональной активности, были разделены на провоспалительные, противо-воспалительные, цитокины, продуцируемые Thl- и ТЬ2-клетками, ростовые и иммуногемопоэтические факторы, адгезионные молекулы. Было показано, что в сыворотке крови больных псориазом повышены значения провоспалительных цитокинов IL-lß, IL-12 (р40), IL-16, IL-18, IL-2Ra, IFN-a2, IL-9, IL-13 и LIF в группах с индексом PASI до 10 и более 20 по сравнению с практически здоровыми лицами (р< 0,01). Выявленный уровень IL-18 и IL-2Ra в сыворотке крови у больных псориазом с индексом PASI более 20 был достоверно повышен по сравнению с больными с индексом PASI менее 10, напротив, уровни IL-la и IL-16 были повышены у пациентов с индексом PASI менее 10 по сравнению с пациентами с индексом PASI более 20 (р < 0,005). Среди противовоспалительных цитокинов не были выявлены достоверные различия между больными псориазом и практически здоровыми лицами, а также различия между группами. Среди цитокинов, продуцируемых клетками Thl-типа, было выявлено повышенное значение IFN-y в группе с индексом PASI менее 10 по сравнению

с группой с индексом PASI более 20 (р < 0,05). По содержанию цитокинов, продуцируемых клетками ТЪ2-типа, было выявлено повышенное значение ÏL-5 в группе с индексом PASI менее 10 и более 20 по сравнению с практически здоровыми лицами (р< 0,01). Не было выявлено различий по концентрации цитокинов, продуцируемых клетками ТЬ2-типа, между группами с индексом PASI менее 10 и более 20. Было выявлено, что в сыворотке крови больных псориазом достоверно увеличены значения: CCL4/MIP-1P, CCL7/MCP-3, CCL11/eotaxin, CCL27/CTACK, CXCL9/MIG и CXCL12/SDF-la, как в группе с индексом PASI менее 10, так и в группе с индексом PASI более 20 по сравнению с практически здоровыми лицами (р < 0,01). Также было показано, что в сыворотке крови больных псориазом с индексом PASI менее 10 достоверно повышено содержание CXCL10/IP-10 по сравнению с практически здоровыми лицами (р < 0,01). Выявленный уровень CCL7/MCP-3 и CCL27/CTACK в сыворотке крови у больных псориазом с индексом PASI более 20 был достоверно повышен по сравнению с больными с индексом PASI менее 10, а уровень CXCLl/GROa был повышен у пациентов с индексом PASI менее 10 по сравнению с индексом PASI более 20 (р< 0,005). В ходе настоящей работы было установлено, что у пациентов с псориазом по сравнению с практически здоровыми лицами достоверно повышено значение цитокинов, относящихся к ростовым факторам: SCGF, beta-NGF (р< 0,01). Были выявлены повышенные значения факторов иммуногемопоэза (G-CSF, M-CSF и IL-3) и повышенные значения ICAM-1 в сыворотке крови больных псориазом с индексом PASI до 10 и более 20 по сравнению с практически здоровыми лицами (р < 0,01). Уровни IL-3 и ICAM-1 в сыворотке крови у больных псориазом с индексом PASI более 20 были достоверно повышены по сравнению с больными с индексом PASI менее 10, а уровень HGF был повышен у пациентов с индексом PASI менее 10 по сравнению с индексом PASI более 20 (р < 0,005).

Скрининговое исследование уровня продукции 50 цитокинов в сыворотке крови больных псориазом выявило разноплановые изменения цитокинового профиля. В связи с этим были выбраны 8 основных цитокинов (IL-2, IL-6, TNF-a, IL-10, IFN-y, IL-4, GM-CSF и1Ь-8), участвующих в патогенезе псориаза, и были исследованы их концентрации у 52 пациентов. При оценке уровня цитокинов было отмечено статистически значимое увеличение содержания провоспалительных цитокинов: IL-2, IL-6, GM-CSF, IFN-y и TNF-a в сыворотке крови у больных псориазом по сравнению с практически здоровыми лицами (р< 0,01). Было установлено, что у больных псориазом повышено содержание цитокинов (GM-CSF и IFN-y) в сыворотке крови по сравнению с атопическим дерматитом (р < 0,01). Было выявлено, что содержание GM-CSF в сыворотке крови больных псориазом без поражения суставов повышено, а IL-8 снижено

по сравнению с сывороткой, полученной от пациентов с атопическим дерматитом (р< 0,01). В настоящей работе было показано, что у пациентов с атопическим дерматитом в сыворотке крови повышены значения IL-6, IFN-y и TNF-a по сравнению с практически здоровыми лицами

(Р<0,01).

При исследовании уровня цитокинов в моче больных псориазом выявлена повышенная концентрация противовоспалительного цитокина -IL-10, а также выявлено увеличение провоспалительных цитокинов (GM-CSF, IFN-y и TNF-a) по сравнению с практически здоровыми лицами (р < 0,05). Выявлено повышенное содержание цитокинов IL-2, IL-4 и IL-8 в моче больных псориазом по сравнению с больными со склеродермией (р < 0,01). Было установлено, что у больных псориазом в моче повышено содержание GM-CSF и IFN-y по сравнению с пациентами с атопическим дерматитом. Были выявлены повышенные значения в моче IL-10 и GM-CSF у больных псориазом (без поражения суставов) и сниженные значения IL-8 по сравнению с пациентами с атопическим дерматитом; и у пациентов с поражением суставов выявлены повышенные значения ILIO и GM-CSF по сравнению с пациентами со склеродермией (р < 0,01).

Было выявлено, что у больных псориазом без поражения суставов повышена концентрация IL-2 и IL-8 и у больных псориазом с поражением суставов повышены значения IL-2 и IL-4 в моче по сравнению с пациентами со склеродермией (р < 0,01).

В группе с максимальной активностью псориатического воспаления (индекс PASI более 20) выявлено увеличение провоспалительного цитокина - IL-2 в сыворотке крови по сравнению с практически здоровыми лицами (р < 0,001). В двух группах с индексом PASI менее 10 и индексом PASI более 20 выявлено увеличение GM-CSF в сыворотке крови по сравнению с практически здоровыми лицами (р < 0,001). Показано, что у пациентов с индексом PASI более 20 в сыворотке крови повышены значения IL-2, IL-6, IL-8, IL-10 и GM-CSF по сравнению с пациентами с индексом PASI менее 10 (р < 0,01). Также выявлено повышенное содержание IL-2 в сыворотке крови в группе с индексом PASI более 20 по сравнению с индексом PASI от 10 до 20 (р < 0,01). Определение уровня цитокинов в моче в зависимости от тяжести и распространенности кожного поражения показало повышенные значения IL-10, GM-CSF, IFN-y во всех трех группах по сравнению с практически здоровыми лицами (р < 0,001). В группе пациентов с индексом PASI менее 10 выявлено достоверно повышение TNF-a по сравнению с практически здоровыми лицами (р < 0,007). Было выявлено повышенное значение IL-8 в группе с индексом PASI более 20 по сравнению с индексом PASI менее 10 (р < 0,05).

Таблица 1. Концентрация цитокинов в сыворотке крови больных псориазом, пациентов со склеродермией, атопическим дерматитом и практически здоровых лиц

Группа обследованных Концентрация цитокинов в сыворотке крови (пг/мл), Ме (гшп-тах):

1Ь-2 1Ь-4 1Ь-6 1Ь-8 1Ь-10 см-свг №N-7 ТОТ-а

Псориаз (группа в целом) (п = 52) 0,1 (0-106,2)* 0 (0-159,8) 2,4 (0-86,5)* 0,5 (0-200,7) 0,1 (0-355,3) 7,3 (0-25,0)* 0 7,3 (0-75,3)*® 1,4 (0-11,3)*

- псориаз без поражения суставов (п=18) 0 (0-5,5) 0 (0-18,9) 0,4 (0-15,4) 0,37 (0-21,5)0 0 (0-4,3) 4,1 (0-10,7)п 1,9 (0-12,2) 0,4 (0-21,1)

-псориаз с поражением суставов (п = 34) 0,5 (0-106,2) 0 (0-111,8) 5,9 (0-86,5) 0,8 (0-51,5) 0,9 (0-7,0) 0,8 (0-25,0) 4,7 (0-75,3) 0,6 (0-11,3)

Склеродермия (п = 10) 0,1 (0,-15,8)* 0 (0-19,3) 3,0 (0,3-25,5)* 0,9 (0,4-7,1) 0 (0-3,6) 1,4 (0,2-9,7)* 2,3 (1,4-8,3) 0,3 (0,2-8,2)

Атопический дерматит (п = 10) 0,2 (0-1,3) 1,1 (0-4,5) 1,3 (0,4-6,5)* 1,3 (0,5-26,2) 0,1 (0-1,8) 0,4 (0-0,8) 3,5 (0,3-5,3)* 0,4 (0,4-1,9)*

Практически здоровые лица (п = 10) 0 (0-0) 0 (0-1,6) 0 (0-0,1) 1,0 (0-2,4) 0 (0-0,9) 0 (0-3,7) 0 (0-1,1) 0,1 (0-1,2)

*-достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, (р < 0,05)

О-достоверность различий показателя по сравнению с пациентами с атопическим дерматитом, (р < 0,01) (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Анализ взаимосвязи уровней цитокинов и клинических показателей позволил выявить прямую корреляционную взаимосвязь индекса PASI и уровня IL-8 (г = 0,5, р < 0,00001) в моче и обратную в сыворотке крови IFN-y и ЦИК (г = -0,51, р < 0,008). Была выявлена умеренная корреляционная зависимость между содержанием белка в моче пациентов и уровнем IL-6 (г = 0,4, р < 0,006).

Экспрессия FOXP3 в коже больных псориазом

В настоящей работе было показано, что в коже практически здоровых лиц не экспрессируется FOXP3, а в коже больных псориазом была выявлена достоверно увеличенная экспрессия гена FOXP3 как в пораженной коже, так и в визуально здоровой больных псориазом. Были выявлены достоверно повышенные значения экспрессии гена FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже больных псориазом по сравнению с практически здоровыми лицами, как в группе пациентов с поражением суставов, так и без поражения суставов (р < 0,005) (таблица 3). Достоверных различий между экспрессией FOXP3 в коже больных псориазом без поражения и с поражением суставов выявлено не было. При оценке результатов экспрессии мРНК FOXP3 в коже пациентов со склеродермией была выявлена повышенная экспрессия гена FOXP3 в визуально здоровой и в пораженной коже пациентов по сравнению с практически здоровыми лицами (р < 0,00001). Также была установлена повышенная экспрессия гена FOXP3 в визуально здоровой коже пациентов со склеродермией по сравнению с визуально здоровой кожей при псориазе (как в группе с поражением суставов, так и без поражения суставов) (р< 0,001), а в пораженной коже при псориазе выявлена повышенная экспрессия гена FOXP3 по сравнению со склеродермией (р < 0,005).

При оценке результатов экспрессии мРНК FOXP3 в коже пациентов с атопическим дерматитом была обнаружена повышенная экспрессия гена FOXP3 в визуально здоровой и в пораженной коже по сравнению с практически здоровыми лицами (р < 0,00001). Была установлена повышенная экспрессией гена FOXP3 в пораженной коже пациентов с атопическим дерматитом по сравнению с визуально здоровой кожей (р < 0,005). Во всех группах пациентов по индексу PASI была выявлена достоверная разница между визуально здоровой и пораженной кожей больных псориазом и кожей практически здоровых лиц (р < 0,00001). Корреляционный анализ индекса PASI и экспрессии мРНК FOXP3 в визуально здоровой коже больных псориазом выявил прямую корреляционную зависимость (г = 0,35, р = 0,0001).

Таблица 2. Концентрация цитокинов в моче больных псориазом, пациентов со склеродермией, атопическим дерматитом и практически _здоровых лиц_

Группа обследованных Концентрация цитокинов в моче (пг/мл), Ме (тт-тах

1Ь-2 1Ь-4 11,-6 1Ь-8 1Ь-10 ОМ-СвР ТОТ-а

Псориаз (группа в целом) (п = 52) 0,1 (0-10,8)** 0,2 (0-18,8)** 0,3 (0-625,3) 0,8 (0-78,9)** 1,2 (0-16,1)* 5,8 (0-36,4)*0 3,9 (0-179,7)*0 0,3 (0-39,7)*

- псориаз без поражения суставов (п = 18) 0,1 (0-10,8)** 1,2 (0-6,5) 0,1 (0-15,2) 0 (0-34,0) **0 0,3 (0-11,6)*0 7,9 (0-11,8) *<°> 5,0 (0-75,3)* 0,7 (0-12,7)*

-псориаз с поражением суставов (п = 34) 0 (0-8,2)** 0,2 (0-18,8)** 0,4 (0-625,3) 1,9 (0-78,9) 1,8 (0-16,1)*0 3,8 (0-36,4)*0 3,3 (0-179,7)* 0,3 (0-39,7)*

Склеродермия (п=10) 0,1 (0-15,8) 0 (0-19,3) 3,0 (0,3-25,5) 0,9 (0,4-7,1) 0 (0-3,6) 1,4 (0,2-9,7)* 2,3 (1,4-8,3)* 0,3 (0,2-8,2)*

Атопический дерматит (п= 10) 0 (0-0,4) 0 (0-4,5) 1,2 (0,4-2,2) 4,5 (0,5-26,2) 0 (0-0,2) 0 (0-0,8) 0,8 (0-5,3) 0,2 (0,1-0,4)*

Практически здоровые лица(п= 10) 0,1 (0-0,7) 0 (0-0,1) 1,3 (0-11,9) 0,7 (0,1-4,7) 0 (0-0) 0 (0-0) 0 (0-0) 0 (0-0,1)

♦-достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, (р < 0,05) **- достоверность различий показателя по сравнению с пациентами со склеродермией, (р < 0,01)

О-достоверность различий показателя по сравнению с пациентами с атопическим дерматитом, (р < 0,01) (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Таблица 3. Показатели уровня экспрессии мРНК БОХРЗ в кожных биоптатах больных псориазом, атопическим дерматитом, склеродермией

Группы обследованных Экспрессия мРНК FOXP3 в биоптатах:

визуально здоровой кожи пораженной кожи

Ме (min-max) Ме (min-max)

Псориаз (группа в целом) (п = 60) 5,4 (0-60,1) * 0 21,9 (4,5-90,1) * 0 "

псориаз без поражения суставов (п = 20) 6,5 (1,2-18,7)* О 18,9 (7,4-77,6) * 0"

псориаз с поражением суставов (п = 40) 5,1 (0-60,1) *0 36,0 (4,5-90,1) * 0"

Склеродермия (п = 10) 23,0 (0-89,0) * 8,1 (4,3-10,7) *"

Атопический дерматит (п=10) 9,2 (0-20,5) * 33,5 (0-43,5) *"

Практически здоровые лица (п = 18) 0(0-0)

* - достоверность различий по сравнению с практически здоровыми лицами, (р < 0,00001); О - достоверность различий показателя по сравнению с пациентами со склеродермией, (р < 0,001);

"- достоверность различий значений показателя пораженной кожи по сравнению с визуально здоровой кожей, (р < 0,005) (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Синтез хемокинов и хемокиновыхрецепторов в коже больных псориазом В ходе исследования было показано, что в коже практически здоровых лиц экспрессируются гены хемокинов CCL4/MIP-lß, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8 и гены рецепторов CCR1, CCR3 и CCR5 для СС семейства хемокинов, однако рецепторы для СХС семейства хемокинов не экспрессируются.

При сравнении результатов экспрессии хемокинов и их рецепторов в коже практически здоровых лиц в зависимости от возраста, было выявлено, что в группе 16-20 лет повышена экспрессия CXCL8/IL-8, по сравнению с группой 31-60 лет, также выявлено, что повышено значение CCL4/MIP-lß в группе 31-60 лет по сравнению с группой 16-20 лет (р < 0,05). При анализе экспрессии хемокинов и их рецепторов в коже больных псориазом и здоровых лиц была выявлена достоверно повышенная экспрессия CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2, CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß и рецепторов CXCR1 и CXCR2 как в визуально здоровой, так и в пораженной коже больных псориазом по сравнению с практически

здоровыми лицами (р < 0,05). При оценке результатов экспрессии хемоки-нов и их рецепторов в визуально здоровой коже больных псориазом и пациентов с бляшечной склеродермией и атопическим дерматитом (группы сравнения) была выявлена повышенная экспрессия CCL11/eotaxin (р= 0,01), CCL24/eotaxin-2 (р= 0,02), CCL4/MIP-lp (р = 0,02) как в визуально здоровой, так и в пораженной коже больных псориазом (рис. 2, А и Б).

По распространенности псориаза пациенты были разделены натри группы с PASI меньше 10, с PASI от 10 до 20 и с PASI более 20. В первой группе пациентов была выявлена достоверно повышенная экспрессия генов CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2, CCL5/RANTES и рецепторов CXCR1, CXCR2 в биоптатах визуально здоровой кожи. Экспрессия генов CCL11/eotaxin и CXCR1, CXCR2 в биоптатах пораженной кожи пациентов также была достоверно повышена (р< 0,05) (рис. 1, А и Б). Во второй группе была выявлена достоверно повышенная экспрессия генов CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2, CCL5/RANTES, CXCR1, CXCR2, CXCL8/IL-8 в биоптатах визуально здоровой кожи.

50 _ (Al Визуально здоровая кожа больных псориазом

40 35 30 25 20 15 10 5 0

70

60

50

40

30

20

10

0

Здоровые □ добровольцы I

Атопическим IСклеродермия 0 дерматит йПсорил)

л

тг Т- h

ГШ

M

1

Э01ЛКСИИ Эоыкснн? МР-1а МР 1& RAIITES

IL»

CCRJ CCR5 CXCR1

Votcóera-SKJVty

4В) Поражённая кожа больных псориазом

*

Il flb

дШ

Ш

*

ы

Э01.1КСИН Эоикспн? |.1Р1<х МР 1& RAIITES ILS CCR1 CCR3 CCR5 CXCR1 CXCR2

-достоверность различий по сравнению с практически здоровыми лицами (р < 0,05)

Рис. 1. Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов в визуально здоровой коже (А) и пораженной коже (Б) больных псориазом, склеродермией и атопическим дерматитом (р < 0,05).

В третьей группе была выявлена достоверно повышенная экспрессия генов CCL11/ео taxin, CCL24/eotaxin-2, CCL3/MIP-la, CXCR1, CXCR2, в биоптатах визуально здоровой кожи пациентов. Выявлена достоверно повышенная экспрессия генов CCLll/eotaxin, CCL24/ eotaxin-2, CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß, CXCR1, CXCR2, в биоптатах пораженной кожи пациентов (р< 0,05) (рис. 1, А и Б). Выявлена обратная корреляционная зависимость между экспрессией хемокинов: CCL24/eotaxin-2 (г= -0,94, р= 0,005), CCL3/MIP-la (г= -0,94, р= 0,005), CCL4/MIP-lß (г= -0,85, р= 0,03) и рецепторов: CCR5 (г= -0,79, р= 0,005) hCXCR2 (г= -0,94, р= 0,005), в визуально здоровой коже пациентов с псориазом и индексом PASI меньше 10. Выявлена прямая корреляционная зависимость между экспрессией мРНК CCLll/eotaxin (г = 0,69, р = 0,04) в визуально здоровой коже пациентов с псориазом и индексом PASI при его значениях от 10 до 20. Выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнем экспрессии CCR1 (г =

0.82. р= 0,02), CCR3 (г= 0,74, р= 0,02) hCCR5 (Г= 0,82, р= 0,006) в пораженной коже пациентов с псориазом и значениями PASI при его значениях от 10 до 20. В группе больных с индексом PASI более 20 корреляционных зависимостей выявлено не было.

Таким образом, полученные в работе данные характеризуют некоторые этапы патогенеза псориаза и показывают сложную многоступенчатую структуру формирования и поддержания воспаления при псориазе.

Выводы

1. В сыворотке крови больных псориазом достоверно повышено содержание провоспалительных цитокинов (IL-lß, IL-6, IL-9, IL-12 (р40), IL-13, IL-16, IL-18, TNF-a, IL-2Ra, IFN-a2 hLIF), Thl-цитокинов (IFN-y); Th2-цитокинов (IL-5), хемокинов (CCLll/eotaxin, CCL4/MIP-lß, CCL7/MCP-3, CCL27/CTACK, CXCLl/GRO-a, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-la), а также факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул (GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, SCGF, ß-NGF, HGF и1САМ-1) по сравнению с практически здоровыми лицами.

2. Повышенное содержание провоспалительных цитокинов (IL-6, GM-CSF, IFN-y и TNF-a) в сыворотке крови больных псориазом по сравнению с пациентами с атопическим дерматитом и склеродермией достоверно коррелирует с клиническими (PASI) и общелабораторными показателями (ЦИК).

3. У больных псориазом содержание IL-4, IL-10, GM-CSF, IFN-y и TNF-a в моче повышено по сравнению с атопическим дерматитом и склеродермией.

4. Повышенная экспрессия мРНК FOXP3 в пораженной и визуально здоровой коже при псориазе коррелирует с клинической активностью заболе-

вания и отражает отличие псориаза от атопического дерматита и склеродермии.

5. В коже практически здоровых лиц экспрессируются гены хемокинов (CCL4/MIP-lß, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8) и гены рецепторов для СС-семейства хемокинов (CCR1, CCR3 и CCR5), однако отсутствует экспрессия рецепторов для семейства СХС-хемокинов, а также СС-хемокинов (CCL3/MIP-la, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2).

6. Повышенный синтез хемокинов (CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß, CCL11/ eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и двух рецепторов для CXCL8/ÍL-8 (CXCR1 и CXCR2) в визуально здоровой коже больных псориазом позволяет рассматривать эти показатели как потенциальные биомаркеры заболевания, что наиболее значимо в дебюте псориаза, особенно при суставных его проявлениях.

Практические рекомендации

1. Выявление повышенной экспрессии мРНК хемокинов (CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-lß, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и рецепторов (CXCR1 и CXCR2) в сочетании с повышенной экспрессией мРНК FOXP3 в коже рекомендуется использовать для дифференциальной диагностики псориаза, что наиболее значимо в дебюте заболевания, особенно при суставных его проявлениях.

2. Определение концентрации IL-6 и IL-8 в моче при псориазе рекомендуется использовать для определения активности заболевания.

3. Для определения тяжести поражения почек при псориазе рекомендуется проводить определение уровня IL-6 в моче.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Бельтюкова A.C., Сысоев К.А., Тотолян Арег А. Экспрессия некоторых хемокинов и их рецепторов при псориазе // Тез. науч. работ II Международного молодежного медицинского конгресса «Санкт-Петербургские научные чтения-2007». - СПб, 2007. - С. 25.

2. Beltyukova A.S., Sysoev К.А., Totolyan Areg A. Expression of genes of chemokines and their receptors in patients with psoriasis // Сб. науч. тр. 8th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology. - Moscow, 2007. - P. 8.

3. Бельтюкова A.C., Сысоев K.A., Ильина Т.Н., Шемеровская Т.Г., Хобейш М.М., Монахов К.Н., Тотолян Арег А. Экспрессия мРНК хемокинов и хемокиновых рецепторов в коже больных с псориазом // Медицинская иммунология. - 2008. - Т. 10, № 4-5. - С.337-346.

4. Бельтюкова A.C., Сысоев К.А., Ильина Т.Н., Шемеровская Т.Г., Хобейш М.М., Монахов К.Н., Тотолян Арег А. Экспрессия мРНК хе-мокинов и хемокиновых рецепторов в коже больных с псориазом // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2 (11), № 2-3. -С.130.

5. Бельтюкова A.C. Хемокины и хемокиновые рецепторы кожи как потенциальные биомаркеры псориаза // Аннотации научных работ победителей конкурса грантов Санкт-Петербурга 2008 года для студентов, аспирантов молодых ученых и молодых кандидатов наук. - СПб.: Фонд «ГАУДЕАМУС». - С. 100.

6. Бельтюкова A.C., Сысоев К.А., Ильина Т.Н., Шемеровская Т.Г., Хобейш М.М., Монахов К.Н., Тотолян Арег А. Продукция цитокинов в сыворотке крови и моче пациентов псориазом Н Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 4. - С.364-365.

(

Подписано в печать 12.10.2009. Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ 290

Отпечатано в типографии ООО «Адмирал»

199048, Санкт-Петербург, В. О., 6-я линия, д. 59 корп. 1, оф. 40Н