Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Изучение возможности использования ксеноперикарда и ацеллюлярного кожного матрикса в качестве основы тканевых эквивалентов слизистых оболочек
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.01.17
Автореферат диссертации по медицине на тему Изучение возможности использования ксеноперикарда и ацеллюлярного кожного матрикса в качестве основы тканевых эквивалентов слизистых оболочек
На правах рукописи
Тагабилев Дмитрий Геннатулович
Изучение возможности использования ксеноперикарда и ацеллюлярного кожного матрнкса в качестве основы тканевых эквивалентов слизистых оболочек
14.01.17-хирургия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
2 1!ЮН 2011
МОСКВА 2011
4848624
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском научном центре хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН
Николай Олегович Миланов
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН
Александр Васильевич Гавриленко
доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН
Игорь Владимирович Решетов
Ведущая организация:
Федеральное Государственное Учреждение Институт Хирургии им. A.B. Вишневского Минздравсоцразвиткя России
Защита диссертации состоится « 21 » июня 2011 г. в 15:00 часов на заседании Диссертационного совета (Д 001.027.02) Учреждения Российской академии медицинских наук РНЦХ им. академика Б.В. Петровского РАМН
Адрес: 119991, г. Москва, ГСП-2, Абрикосовский пер., д.2
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГЩХ им. академика Б.В. Петровского РАМН
Автореферат разослан « 20 » мая 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук Э.А. Годжелло
Актуальность проблемы
При реконструктивных операциях в анатомических зонах содержащих слизистые оболочки, из-за отсутствия достаточного количества местных тканей, хирурги вынуждены использовать ткани, не предназначенные природой для функционирования в условиях данной реципиентной области. Несмотря на то, что огромное количество всевозможных методов широко применяется в клинике, единого подхода к пластике анатомических областей со слизистыми оболочками до сих пор нет (Миланов Н.О., 1999; Абдуллаев И.А., 2000; Жуманов А.Р., 2006; Amirzargar М.А., 2007). Это объясняется осложнениями, присущими всем методикам, а также не всегда удовлетворительными функциональными и косметическими результатами. Так, для пластики уретры при различных патологиях используются различные варианты кожно-фасциальных лоскутов на сосудистой ножке. Методика является одной из наиболее современных и дает хорошие результаты. Ее основными недостатками являются: риск декомпенсации кровообращения в лоскуте, рост волос в просвет сформированной неоуретры, хроническая воспалительная реакция кожи при длительном контакте с мочой, формирование конкрементов и послеоперационных свищей (Миланов Н.О., 2007). Многих проблем позволяет избежать применение аналогов слизистой оболочки, которые могут быть получены in vitro с применением клеточных технологий, при этом свойства пластического материала максимально приближены к свойствам нормальной ткани реципиентной области (Aala А., 2011).
Большинство важных для хирургов характеристик тканевого эквивалента, помимо клеточного материала, определяет тип носителя клеток (подложки). Идеального материала, способного служить основой любого тканевого эквивалента, на сегодняшний день не существует (Heck E.L., 1985; Hafemann В., 1999; Lee К.П., 2000; Nakamura Т., 2003; Ng K.W., 2005). Подложка подбирается индивидуально для каждого эквивалента с учетом особенностей клеток, а также с учетом характеристик необходимых для функционирования в каждой конкретной области реконструкции. Вопрос выбора материала подложки тканевого
эквивалента для реконструкции слизистых остается актуальным, поскольку предложенные в мировой литературе материалы имеют ряд недостатков, среди которых: недостаточная прочность, отсутствие эластичности, неудовлетворительные показатели биодеградации, недостаточная пористость, сложность транспортировки и хранения, неудобство в работе и высокая стоимость (М. Moharamzadeh К., 2007).
Отсутствие оптимального материала для создания тканевого эквивалента слизистых оболочек, отсутствие в доступной литературе общепризнанных хирургических критериев выбора материалов подложки, а также отсутствие экспериментальной модели для исследования свойств таких материалов явились основаниями для проведения данного исследования.
Цель исследования
Изучение в эксперименте возможности использования ксеноперикарда и ацеллюлярного кожного матрикса в качестве носителей клеточных трансплантатов для устранения протяженных дефектов слизистых оболочек (в том числе мочеиспускательного канала) с позиции хирургии.
Задачи исследования
1. Разработать экспериментальную биологическую модель для исследования свойств материалов подложек тканевых эквивалентов слизистых оболочек.
2. Разработать хирургические критерии выбора материалов для использования в качестве подложек тканевых эквивалентов слизистых оболочек.
3. Определить возможности применения методики ферментативно-химической обработки ксеноперикарда для получения ацеллюлярного кожного матрикса из полнослойной кожи.
4. Изучить в эксперименте особенности тканевой реакции на ацеллюлярный ксеноперикард и ацеллюлярный кожный матрикс.
5. Изучить способность культур клеток фиксироваться на поверхности ацеллюлярного кожного матрикса и ксеноперикарда.
6. Исходя из сформулированных критериев, провести сравнительную оценку ацеллюлярного кожного матрикса и ксеноперикарда для использования в качестве подложки клеточных трансплантатов, дать практические рекомендации.
Научная новизна
Сформулированы хирургические критерии выбора материала подложки тканевого эквивалента для реконструкции слизистой оболочки уретры.
В эксперименте изучена возможность применения ксеноперикарда в качестве материала подложки тканевого эквивалента слизистой.
Предложена методика увеличения темпов васкуляризации ксеноперикарда с помощью нанесения лазерных микроперфораций.
Практическая значимость
Разработана экспериментальная модель для исследования свойств материалов подложек тканевых эквивалентов.
Показана возможность использования ксеноперикарда в качестве материала основы при создании тканевых эквивалентов для реконструкции слизистых оболочек.
Обоснована необходимость увеличения порозности ксеноперикарда при использовании его для создания тканевых эквивалентов слизистых оболочек.
Предложена методика лазерного микроперфорирования ксеноперикарда.
Апробация работы
Результаты исследования доложены на У-УШ конференциях молодых ученых с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», международном форуме по нанотехнологиям
Нл13папо1есЬ 2010, втором (VII) съезде Российского общества пластических, реконструктивных и эстетических хирургов.
Апробация работы проведена 29.04.2011 года на совместной научной конференции отделения восстановительной микрохирургии и отделения пластической и челюстно-лицевой хирургии Российского научного центра хирургии им. академика Б.В. Петровского РАМН (директор - д.м.н., профессор С.Л. Дземешкевич).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура диссертации
Диссертация написана на русском языке, объём её составляет 123 страницы компьютерного набора. Работа состоит из оглавления, введения, 3 глав (в том числе обзора литературы), заключения, выводов, практических рекомендаций. Список использованной литературы включает 20 работ отечественных и 148 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 29 рисунками, 5 таблицами.
Содержание работы Материалы и методы исследования
Работа выполнена в Российском научном центре хирургии им. акад. Б.В.Петровского РАМН (директор - проф.СЛ. Дземешкевич) на базе отдела экспериментальных исследований в хирургии РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского РАМН (зав. отделом - к.м.н. И.Л. Жидков). Эксперименты на животных (крысах линии \Vistar) выполнены с соблюдением всех правил асептики, в соответствии с международными и Российскими принципами и нормами, регламентированными приказами МЗ СССР № 176 от 12.08.1977, № 1179 от 10.10.1983, № 267 МЗ РФ от 19.06.2003, Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации о
гуманном отношении к животным (1964), Европейской конвенцией по биоэтике (1996), основами законодательства РФ (1993).
Исходя из литературных данных, а также опыта проведенных ранее исследований тканевого эквивалента на основе коллагенового геля (Липский К.Б.. 2010), мы сформулировали следующие хирургические критерии пригодности материалов для использования в качестве подложек тканевых эквивалентов слизистых оболочек:
1) биосовместимость;
2) достаточная порозность;
3) механическая прочность достаточная для проведения хирургических манипуляций;
4) эластичность достаточная для сворачивания в трубку на катетере (для тканевого эквивалента слизистой оболочки уретры);
5) ригидность (для тканевого эквивалента слизистой оболочки уретры).
На соответствие данным критериям исследованы следующие материалы:
1) ацеллюлярный ксеноперикард;
2) ацеллюлярный микроперфорированный ксеноперикард;
3) ацеллюлярный кожный матрикс.
Ацеллюлярный кожный матрикс был выбран в качестве материала сравнения, поскольку в литературе описано несколько удачных примеров применения тканевых эквивалентов слизистой оболочки на его основе (СЬо К.Н., 2000; ОрЬоГ Я., 2002). К преимуществам этого материала относятся: прочность, низкая иммуногенность, способность сохранять характеристики после криоконсервации. Недостатками являются: необходимость предварительного обследования донора, высокие требования к условиям хранения и транспортировки, крайне высокая стоимость коммерчески-доступных продуктов. Ацеллюлярный ксеноперикард обладает сравнимой прочностью, низкой иммуногенностью, при этом он значительно более доступен. Недостатком данного материала является отсутствие естественных пор, а, следовательно.
предположительно низкая динамика интеграции тканевого эквивалента на его основе. Данный недостаток устранен нанесением лазерных микроперфораций, что позволило получить материал с принципиально новыми свойствами.
Ацеллюлярный ксеноперикард получали путем ферментативно-химической обработки перикарда быков и телят. Производили механическую очистку перикарда от серозной оболочки и жировой ткани. Обработку кожи для получения ацеллюлярного кожного матрикса проводили по той же методике, без предварительной деэпидермизации. После обработки проводили гистологическое исследование образцов материалов для контроля децеллюляризации.
Гистологическое исследование образцов ксеноперикарда и кожи, прошедших обработку, показало, что методика позволяет практически полностью удалить клеточные элементы из состава материала. После ферментативно-химической обработки материалы представляли собой однородную плотную ткань из продольно ориентированных коллагеновых и эластиновых волокон. В образцах кожи после обработки наблюдали отдельные скопления клеток, главным образом жировой и железистых тканей, а также эпидермиса. В образцах кожи обнаруживались каналы сосудов и выводных протоков желез, определяющие порозность материала. В образцах перикарда поры не выявлялись. Клеточная составляющая в образцах перикарда после обработки отсутствовала, это было обусловлено тем, что нативный перикард изначально содержал значительно меньшее количество клеток в сравнении с кожей.
Для увеличения порозности выполняли микроперфорирование ацеллюлярного ксеноперикарда с помощью твердотельного Nd-YAG лазера с ламповой накачкой и модуляцией добротности (длина волны 1,064 мкм) на лазерном гравирующем комплексе JET-SPOT (ЭКВИПЛЮС, Россия). Режим работы лазера подбирали индивидуально в зависимости от толщины, плотности и влажности каждого образца. Данная методика позволила получить равномерно распределенные по площади материала, сквозные поры диаметром от 0,04 до 0,2мм и плотностью до 20 на мм2 (в зависимости от технологического режима), с
минимальными признаками повреждения прилегающих зон материала. Данные показатели сопоставимы с величиной и плотностью капилляров дермы (рис. 1, 2).
Рис. 1. Ацеллюлярный микроперфорированный ксеноперикард.
Рис. 2. Ацеллюлярный микроперфорированный ксеноперикард, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 100х
Оценку соответствия свойств материалов предложенным хирургическим критериям проводили путем сворачивания образцов в трубку на катетере Фолея Chi6 и наложения фиксирующих узловых швов нитью PROLENE 6-0 (ETHICON, USA).
Образцы всех материалов оказались достаточно прочными и эластичными для сворачивания в трубку на катетере без каких-либо технических трудностей. Фиксирующие узловые швы не прорезывались, надежно удерживали сопоставляемые края материалов. Полученные трубчатые структуры оказались
достаточно ригидными для сохранения просвета без катетера (рис. 3). Механические свойства образцов позволяли достаточно комфортно работать с ними в условиях операционной раны. Таким образом, данные материалы полностью соответствуют хирургическим критериям, предложенным нами для материалов подложек тканевых эквивалентов слизистых.
Рис. 3. Трубка сформирована из микроперфорированного ксеноперикарда.
Культуры клеток для изучения возможности клеточной адгезии на поверхности материалов выделяли из кожного лоскута размером 1x1см. Лоскут тщательно промывали в растворе Хэнкса с антибиотиками, измельчали и подвергали ферментативной обработке (Диспаза 0,2%). Суспензию эпидермапьных кератиноцитов, осаждали центрифугированием и высевали в пластиковые культуральные флаконы («Costar») на полную питательную среду: DMEM: F-12 1:1 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 10нг\мл эпидермального фактора роста (ЭФР), 5мкг/мл инсулина («Sigma»), 10-6М изопротеринола («Sigma»), 5мкг/мл трансферрина («Sigma»). Пластиковые культуральные флаконы предварительно сорбировали коллагеном.
После формирования во флаконах многослойного эпителиального пласта проводили дестратификацию путем перевода культуры кератиноцитов на культуральную среду без ионов Са2+ (CNT 07 , «CELLnTEC») на 1 сутки.
Клетки снимали трипсином с поверхности культуральных флаконов, затем трипсин ингибировали небольшим количеством ЭТС. Суспензию эпидермальных кератиноцитов высевали на поверхность образцов испытуемых материалов
размером 4x5 см и запивали полной питательной средой для культивирования. Через 7 суток, после формирования на поверхности материала многослойного эпителиального пласта образцы фиксировали 4% нейтральным раствором формалина и проводили гистологическое исследование.
Данные гистологического исследования подтвердили наличие клеток на поверхности всех материалов через 14 суток после высевания культуры. Установлено, что клетки способны проникать в поры микроперфорированного материала и образовывать тонкий слой межклеточного матрикса, перекрывающий поры небольших размеров (рис. 4-6). Существенных различий в характере роста клеток на поверхности исследованных материалов выявлено не было.
Рис. 4. Кокультура кератиноцитов и фибробластов на поверхности ксеноперикарда, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 200х.
Рис. 5. Кокультура кератиноцитов и фибробластов на поверхности ацеллюлярноко кожного матрикса, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 200х.
микроперфорированного ксеноперикарда, окраска гематоксилином и эозином,
увеличение 200х.
Для создания экспериментальной модели и исследования тканевой реакции на материалы подложек тканевых эквивалентов проведены эксперименты на 65 самцах крыс, породы '\yistar, массой 220-260г.
Животные были разделены на 3 группы по 20 особей в каждой: животным первой группы имплантировали образцы ксеноперикарда, животным второй группы - образцы перфорированного ксеноперикарда, животным третьей группы - образцы ацеллюлярного кожного матрикса. Последние 5 животных составили группу сравнения. Распределение животных по группам представлено в таблице №1.
Таблица 1.
Распределение животных по группам (п=65).
Группы Перикард Кожный Перфорированный Контроль
Сроки матрикс перикард
3 суток 4 4 4 1
7 суток 4 4 4 1
14 суток 4 4 4 1
30 суток 4 4 4 1
180 суток 4 4 4 1
Всего 20 20 20 5
Для имплантации образцов материалов была выбрана область межлопаточного пространства. При выборе руководствовались критерием минимальной доступности области для самого животного, отсутствием важных анатомических образований, минимальной подвижностью подлежащих тканей.
Образцы испытуемых материалов нарезали на фрагменты размером 1x1см и отмывали от раствора консерванта (глутарового альдегида) в 400мл дистиллированной воды в течение полутора часов с 3-х кратной сменой раствора.
После выполнения общего обезболивания путем внутрибрюшинного введения Тиопентала натрия, шерсть в проекции операционного поля выбривали, кожные покровы четырехкратно обрабатывали раствором йодоната, операционное поле обкладывали стерильным материалом. Выполняли кожный разрез длиной 2см, тупым способом формировали подкожный карман достаточного размера для свободного расположения образца, имплантировали образец исследуемого материала, осуществляли фиксацию образца к подлежащим тканям четырьмя отдельными узловыми швами, нитью PROLENE 6-0 (ETHICON, Belgium), рану ушивали непрерывным швом, шелковой нитью на режущей игле MERSILK 4-0 (ETHICON, Belgium) (рис. 7).
Рис. 7. Образец материала фиксирован в сформированном подкожном кармане.
Кроме наблюдения за общим состоянием животных, динамического осмотра области экспериментальных ран, исследований макропрепаратов, выполняли
гистоморфологическое исследование ткани из области имплантации. Животных выводили из эксперимента на 3, 7, 14, 30 и 180 сутки с момента имплантации, путем внутрибрюшинного введения 0,5% раствора тиопентала натрия из расчета 120мг/кг. После прекращения сердечной деятельности выполняли забор тканей в межлопаточном пространстве в проекции образца, размерами 2,5x2,5 см.
Ткани фиксировали в 10% растворе формалина и заливали в парафин по стандартной методике. Материал обрабатывали в аппарате гистологической проводки тканей фирмы «Pool Scientific Instruments» (Швейцария) и заливали в парафин. Затем готовили серийные парафиновые срезы (не менее 10 серийных срезов с каждого макропрепарата), толщиной 4 микрона. Срезы фиксировали на предметные стекла, покрытые адгезивом (полилизин, APES) и инкубировали в термостате при 370С в течение 12 часов. Далее срезы депарафинировали и обезвоживали в батарее из 3-х ксилолов, 2-х абсолютных спиртов, 2-х 95% спиртов, 80% и 70% спирта и дистилированной воды. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Гистопрепараты исследовали с помощью микроскопа «Axioplan-2» фирмы Цейсс, фотосъемку проводили цифровой камерой «Hitachi». Исследовано 58 макропрепаратов, из которых выполнено 620 серийных срезов.
На ранних сроках после имплантации исследованных материалов наблюдалась картина умеренно выраженного экссудативного воспаления. Клеточная инфильтрация, выявленная вокруг образцов всех материалов (фибробласты, макрофаги, небольшое количество лимфоцитов), была более выражена вокруг образцов кожного матрикса (особенно со стороны эпителиальной поверхности); были обнаружены единичные клетки, мигрировавшие в толщу образцов кожи и перфорированного ксеноперикарда через поры, по каналам сосудов и придатков кожи.
На 7-е сутки после имплантации вокруг образцов ксеноперикарда сохранялась умеренная клеточная инфильтрация, наблюдали образование грануляционной ткани с единичными новообразованными сосудами. Похожую картину наблюдали вокруг образцов кожи с добавлением краевой инфильтрации
дермальной поверхности. Клеточная инфильтрация тканей со стороны эпителиальной поверхности оставалась более выраженной по сравнению с дермальной поверхностью, а также по сравнению с тканями, окружавшими образцы ксеноперикарда. Наблюдали активную миграцию клеток в толщу образцов перфорированного ксеноперикарда. В отличие от краевой инфильтрации, наблюдавшейся в образцах ацеллюлярного кожного матрикса на данном сроке, мигрировавшие через поры клетки проникали достаточно глубоко в толщу материала. В краевых участках пор наблюдалось формирование рыхлой грануляционной ткани с единичными новообразованными сосудами, что соответствовало гистоморфологической картине изменений наблюдавшихся в контрольной группе (рис. 8).
Рис. 8. Образец перфорированного ксеноперикарда в тканях, 7 сутки после имплантации, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 400х.
На 14-е сутки после имплантации выявлена слабая краевая инфильтрация перикарда, в образцах кожи наблюдали миграцию клеток в толщу трансплантата, на всех препаратах обнаруживали единичные сосуды в тканях вокруг образцов. Клеточная инфильтрация окружающих тканей несколько снижалась. Вокруг образцов перфорированного ксеноперикарда наблюдали формирование рыхлой грануляционной ткани с отдельными новообразованными кровеносными сосудами, полностью заполнявшей поры перфорированного ксеноперикарда. Состав и строение грануляционной ткани не отличались от наблюдавшихся в
I
группе сравнения. В просвете пор обнаруживались отдельные новообразованные сосуды (рис. 9).
Рис. 9. Образец перфорированного ксеноперикарда в тканях, 14 сутки после имплантации, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 200х.
К окончанию первого месяца наблюдали признаки ремоделирования всех материалов, клеточные включения определялись до трети толщины перикарда. Трансплантаты были окружены рыхлой соединительной тканью со сформированной сосудистой сетью, которая проникала до трети толщины кожного лоскута со стороны дермальной поверхности, и не проникала в толщу перикарда. Наблюдалось разрыхление краевых волокон коллагена материалов, наиболее выраженное с дермальной поверхности ацеллюлярного кожного матрикса, при этом со стороны эпителиальной поверхности наблюдали уплотнение соединительной ткани, признаки формирования соединительнотканной капсулы. Наблюдали формирование сосудистой сети, пронизывающей перфорированный ксеноперикард сквозь поры, краевые волокна коллагена были разрежены, выявлялись признаки постепенного ремоделирование материала. Процесс ремоделирования перфорированного ксеноперикарда на данном сроке наблюдения протекал значительно активнее, чем в остальных испытуемых материалах. Состав и строение соединительной ткани вокруг образца не отличался от таковых в контрольной группе (рис. 10).
Рис. 10. Образец перфорированного ксеноперикарда в тканях, 14 сутки после имплантации, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 200х.
Таким образом, образцы ацеллюлярной кожи показали значительно лучшую динамику процессов интеграции и ремоделирования по сравнению с образцами неперфорированного ксеноперикарда. В образцах ксеноперикарда затруднены быстрая миграция клеток в толщу материала за счет высокой плотности материала и практически полного отсутствия пор. Можно предположить, что низкая пористость, медленные интеграция и ремоделирование материала подложки значительно осложнят процессы адаптации и приживления тканевого эквивалентана основе ксеноперикарда, особенно на ранних сроках. С другой стороны, наличие остаточных клеток в образцах кожного матрикса увеличивает вероятность возникновения иммунных реакций на материал при имплантации его пациентам. Поэтому использование ксеноперикарда при условии повышения его порозности выглядит более предпочтительным. Повышение порозности ксеноперикарда за счет нанесения лазерных микроперфораций значительно облегчило миграцию клеток в толщу материала, ускорило динамику процессов интеграции в окружающие ткани и ремоделирования материала.
К окончанию 6-го месяца наблюдали значительную резорбцию перфорированного ксеноперикарда. Определялись отдельные островки упорядоченных коллагеновых волокон материала, окруженные соединительной тканью с разветвленной сосудистой сетью (рис. 11). Выявлена продолжавшаяся краевая резорбция образцов неперфорированного ксеноперикарда, пограничные
коллагеновые волокна были разрежены, включены в структуру окружающей соединительной ткани, при этом коллагеновые волокна в толще образца сохраняли упорядоченность и плотность. По границе эпителиальной поверхности образцов ацеллюлярного кожного матрикса было выявлено образование нежной соединительнотканной капсулы, при этом со стороны дермальной поверхности наблюдаются признаки ремоделирования схожие с таковыми в образцах ксеноперикарда, но выраженные в большей степени.
Рис. 11. Образец перфорированного ксеноперикарда в тканях, 14 сутки после имплантации, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 200х.
Таким образом, по результатам гистоморфологического исследования испытуемые материалы не вызывают выраженной острой или хронической воспалительной реакции. Степень и характер гистоморфологических изменений в тканях вокруг образцов на всех сроках наблюдения соответствует таковым, наблюдаемым в группе сравнения. Исключение составляет более выраженная клеточная инфильтрация тканей прилегающих к эпителиальной поверхности образцов кожного матрикса. В клеточном составе инфильтрата выявляется большее количество лейкоцитов, лимфоцитов и эозинофилов по сравнению с контрольной группой и образцами остальных испытуемых материалов. Данная особенность, по всей видимости, объясняется наличием в составе кожного матрикса остаточных клеток, поскольку в состав кожи входит многослойный плоский ороговевающий эпителий, который не удается полностью удалить в
процессе предварительной обработки материала. Остатки разрушенных клеток, сохраняющиеся на эпителиальной поверхности кожного матрикса, содержат иммуногенные компоненты, такие как антигены клеточных мембран и фрагменты ДНК. В связи с этим, наблюдается более активная воспалительная реакция, которая на ранних сроках проявляется выраженной клеточной инфильтрацией окружающих тканей, а на более поздних сроках сменяется формированием капсулы.
Тканевая реакция на образцы ацеллюлярного ксеноперикарда на всех сроках наблюдения значительно не отличается от изменений происходящих в тканях животных контрольной группы. В процессе обработки перикарда, изначально содержащего очень небольшое количество клеток, происходит почти полная децеллюляризация материала. Кроме того, отщепляются концевые телопептиды коллагена обладающие высокой иммуногенностью. Таким образом, материал становится иммунологически инертным, чем и объясняется отсутствие выраженных иммунных реакций со стороны организма животного.
При создании тканевых эквивалентов слизистых оболочек предпочтительно использовать в качестве подложек иммунологически инертные материалы, так как в процессе адоптации и интеграции клеточного трансплантата дополнительный стресс (иммунная реакция со стороны реципиента) может пагубно сказаться на его приживлении.
Если предположить, что эпителиальная поверхность кожного матрикса будет использоваться в качестве несущей поверхности для клеточного трансплантата и длительное время не будет контактировать с иммунокомпетентными клетками реципиента, то, возможно, удастся добиться соблюдения оптимальных условий для приживления трансплантата. Однако со временем такой контакт неизбежен, так как материал будет прорастать тканями реципиента, и иммунокомпетентные клетки достигнут его эпителиальной поверхности. На основании данных нашего исследования результат такого взаимодействия прогнозировать невозможно. Необходимо отметить, что предварительная механическая деэпидермизация, а
также применение методики более полной децеллюляризации кожи могла бы решить проблемы, возникающие при использовании кожного матрикса с остаточными скоплениями клеток.
Уже на ранних сроках исследований было выявлено, что крайне низкая порозность перикарда, как и ожидалось, затрудняет процессы его интеграции и ремоделирования. Клетки ответственные за этот процесс (фибробласты, макрофаги) не могут проникать в толщу материала и воздействуют только на краевые участки материала. Следует ожидать, что при имплантации тканевого эквивалента на основе ксеноперикарда, клетки на его поверхности будут страдать, так как они окажутся практически изолированными от организма реципиента, а значит, не будут увлажняться и получать питательные вещества. Сохранение поверхностной влажности и адекватного снабжения клеточного трансплантата питательными веществами и кислородом особенно важны на ранних сроках после имплантации, когда клетки переживают стресс при переносе их из лабораторных условий в условия живого организма.
Предложенная нами методика нанесения лазерных микроперфораций на ацеллюлярный ксеноперикард, позволяет получать сквозные отверстия заданного диаметра с необходимой плотностью. Данные гистоморфологического исследования подтвердили, что получаемые отверстия служат входными воротами для миграции клеток в толщу материала. Быстрая миграция клеток уже в первые дни после трансплантации обеспечивает прорастание пор грануляционной тканью и кровеносными сосудами, что, возможно, будет играть ключевую роль в процессе интеграции материала подложки тканевого эквивалента. Кроме того, наличие пор должно обеспечить поступление внеклеточной жидкости из раны в зоне реконструкции к клеткам поверхности непосредственно после трансплантации, что создаст более благоприятные условия для приживления эквивалента.
На поздних сроках наличие пор обеспечивает выгодные условия для более полного и быстрого ремоделирования материала. Как показали наши
исследования, к окончанию 6-го месяца после имплантации образцы перфорированного ксеноперикарда практически полностью интегрируются в собственную соединительную ткань реципиента, сохраняются небольшие фрагменты, имеющие исходную конфигурацию коллагеновых волокон. С практической точки зрения эта особенность может быть очень важна. При реконструкции слизистых у детей, например реконструкции мочеиспускательного канала, необходимо, чтобы пластический материал "рос" вместе с ребенком. Очевидно, что материал не являющийся частью организма не будет расти вместе с ним, а, следовательно, может нарушать нормальное формирование органа. С другой стороны, материал, который полностью интегрируется в окружающие ткани, волокна которого большей частью замещаются коллагеном организма и окружены активными клетками, возможно, не будет мешать правильному формированию мочеиспускательного канала.
Способность клеток (кератиноцитов и фибробластов) фиксироваться на поверхности всех исследованных материалов была подтверждена результатами нашего исследования. Поверхность ацеллюлярного кожного матрикса и ксеноперикарда представлена коллагеновыми и эластиновыми волокнами, к которым кератиноциты и фибробласты имеют выраженную тропность, что подтверждается и литературными данными.
ВЫВОДЫ
1. Экспериментальная модель для исследования материалов подложек тканевых эквивалентов создается путем имплантации образца исследуемого материала лабораторным животным (крысам) под кожу в области межлопаточного пространства.
2. При выборе материала подложки тканевого эквивалента для закрытия дефектов слизистых оболочек необходимо руководствоваться не только биологическими, но и хирургическими критериями, включающими прочностные характеристики, эластичность, ригидность, биосовместимость, пористость.
3. Использованная в работе методика ферментативно-химической обработки ксеноперикарда не позволяет добиться адекватной децеллюляризации при обработке кожи.
4. Ацеллюлярный кожный матрикс, по сравнению с ксеноперикардом, активнее интегрируется в ткани и васкуляризируется за счет наличия естественных пор.
5. При увеличении порозности ксеноперикарда за счет нанесения лазерных микроперфораций, динамика интеграции в ткани и васкуляризации значительно возрастает.
6. Ксеноперикард и ацеллюлярный кожный матрикс являются хорошими поверхностями для фиксации культур фибробластов и кератиноцитов.
7. Наиболее подходящим для использования в качестве подложки является перфорированный ацеллюлярный ксеноперикард, что обусловлено быстрым прорастанием пор материала грануляционной тканью с последующим формированием сосудистой сети.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕДАЦИИ
1. При исследовании свойств материалов подложек тканевых эквивалентов целесообразно проводить имплантацию материалов подкожно в область межлопаточного пространства мелким лабораторным животным.
2. При создании тканевого эквивалента слизистой оболочки для реконструкции уретры рекомендуем использовать достаточно прочные, эластичные и пористые биосовместимые материалы.
3. Для получения ацеллюлярного кожного матрикса по методике ферментативно-химической обработки ксеноперикарда необходимо проводить предварительную механическую деэпидермизацию кожи.
4. При использовании ацеллюлярного ксеноперикарда в качестве основы тканевых эквивалентов для реконструкции слизистых оболочек рекомендуем повышение порозности материала путем нанесения микроперфораций.
5. Микроперфорирование кееноперикарда рекомендуем осуществлять с помощью твердотельного Nd-YAG лазера с ламповой накачкой и модуляцией добротности (длина волны 1,064 мкм).
6. Плотность микроперфораций должна быть максимальной, при условии сохранения структурной целостности материала.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Новые технологии в хирургии XXI века: перспективы применения стволовых клеток // Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии. - 2004. - № 3. - С. 45-53 (Соавт.: Старцева О.И.).
2. Клеточные технологии в реконструкции уретры // Материалы V конференции молодых ученых с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва. - 2006. - С. 56. (Соавт.: Миланов Н.О., Старцева О.И., Жуманов А.Р.).
3. Тканевой эквивалент для закрытия протяженных дефектов уретры // Материалы VI конференции молодых ученых с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва. - 2007. - С. 71. (Соавт.: Миланов Н.О., Старцева О.И., Жуманов А.Р.).
4. Возможности использования клеточных технологий в реконструкции мочеиспускательного канала // Материалы VII конференции молодых ученых с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва. - 2008. - С. 65. (Соавт.: Миланов Н.О., Липский К.Б., Гуляев И.В.).
5. Создание тканевых эквивалентов слизистых оболочек // Материалы VIII конференции молодых ученых с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва. - 2009. - С. 10. (Соавт.: Липский К.Б., Гуляев И.В.).
6. Тканевой эквивалент слизистой оболочки для устранения протяженных дефектов уретры // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. - 2010. -№3 (34). - С. 65. (Соавт.: Липский К.Б., Гуляев И.В.).
7. Tissue equivalent for urethra reconstruction (Тканевой эквивалент для реконструкции уретры) // Nanotechnology in medicine (Нанотехнологии в медицине). (Материалы Международного форума по нанотехнологиям Rusnanotech 2010). - Москва 1-3 ноября 2010г. - С. 197. (Соавт.: Липский К.Б., Гуляев И.В.).
8. Тканевой эквивалент слизистой оболочки для устранения протяженных дефектов уретры // Тезисы второго (VII) съезда Российского общества пластических, реконструктивных и эстетических хирургов 1-2 декабря 2010. Москва. - С. 87-88. (Соавт.: Миланов Н.О., Липский К.Б., Гуляев И.В.).
9. Клеточные технологии и тканевая инженерия в реконструкции слизистых оболочек (обзор литературы) // Хирург. - 2010. - №2. - С. 27-33.. (Соавт.: Липский К.Б., Гуляев И.В.).
Типография РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского РАМН Зак. №236 Тираж 100 экз.
Оглавление диссертации Тагабилев, Дмитрий Геннатулович :: 2011 :: Москва
Введение.
Глава1. Аналитический обзор литературы.
1.1 Современное состояние проблемы пластики слизистых оболочек на примере мочеиспускательного канала.
1.2 Реконструкция слизистых оболочек с использованием методов тканевой инженерии.
1.3 Применение тканевых эквивалентов.
1.4 Теоретическое обоснование состава тканевых эквивалентов слизистых оболочек.
1.4.1 Эпителиальный компонент живого аналога слизистой оболочки.
1.4.2 Собственная пластинка живого аналога слизистой оболочки.
1.5 Существующие материалы подложек тканевых эквивалентов.
1.5.1 Алломатериалы.
1.5.2 Синтетические подложки на основе продуктов природного происхождения.
1.5.3 Синтетические подложки на основе продуктов органического синтеза.
1.5.4 Ксеноматериалы.
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1 Получение исследуемых материалов.
2.1.1 Ацеллюлярный ксеноперикард.
2.1.2 Ацеллюлярный кожный матрикс.
2.1.3 Ацеллюлярный микроперфорированный ксеноперикард.
2.2 Оценка соответствия хирургическим критериям.
2.3 Исследование клеточной адгезии.
2.4 Создание биологической модели для исследования тканевой реакции на материалы подложек тканевых эквивалентов слизистых оболочек.
2.4.1 Предварительный этап исследования тканевой реакции.
2.4.2 Основная серия экспериментов.
2.4.2.1 Подготовка образцов к имплантации.
2.4.2.2 Имплантация материалов.
2.4.3 Гистоморфологическое исследование.
Глава 3. Результаты.
3.1 Получение исследуемых материалов.
3.2 Предварительное исследование тканевой реакции.
3.3 Получение микроперфорированного ксеноперикарда.
3.4 Оценка соответствия хирургическим критериям.
3.5 Исследование клеточной адгезии.
3.6 Гистоморфологическое исследование.
Введение диссертации по теме "Хирургия", Тагабилев, Дмитрий Геннатулович, автореферат
Пластическая и реконструктивная хирургия непрерывно развивается, улучшаются и дополняются существующие методики, на основе результатов передовых научных исследований разрабатываются принципиально новые. В арсенал пластических хирургов постоянно входят последние достижения современной науки и техники. Возможности реконструктивной хирургии позволяют сегодня осуществлять сложнейшие восстановительные операции. Многие обширные дефекты остающиеся после травм, ранений, сосудистых и онкологических заболеваний, которые еще не так давно не могли быть устранены, сегодня с помощью применения микрохирургической техники доступны для коррекции.
Появление методики выполнения микрососудистых анастомозов позволило использовать для нужд пластической и реконструктивной хирургии свободные реваскуляризируемые лоскуты. Таким образом, появилась возможность компенсировать недостаток тканей в месте дефекта, путём заимствования аутологичной ткани пространственно разобщенной с областью оперативного вмешательства [17].
Методика микрохирургической аутотрансплантации тканей прекрасно зарекомендовала себя в лечении остеомиелита, хирургической коррекции пола, коррекции дефектов после обширных оперативных вмешательств в онкологии, урологии, травматологии и других областях реконструктивной хирургии [18, 19, 53, 65, 157, 163].
По мере того как расширялись показания для применения микрохирургической техники, у хирургов появилась новая задача -добиться максимального соответствия свойств тканей лоскута требованиям, предъявляемым реципиентной зоной. Прежде всего, это касается анатомических областей, в которых ткани подвергаются агрессивному воздействию различных биологических жидкостей.
Роль естественного ограничительного барьера между подлежащими тканями и агрессивной средой биологической жидкости в организме выполняют слизистые оболочки. Наличие слизистых оболочек во рту, во влагалище, в уретре надежно предохраняет организм от проникновения чужеродных агентов, а также защищает подлежащие ткани от воздействия кислых и щелочных сред, ферментов. Это происходит за счет наличия в составе слизистых оболочек специализированных эпителиев.
При реконструктивных операциях в этих анатомических зонах, из-за отсутствия достаточного^ количества местных тканей, хирурги вынуждены использовать ткани с неподходящими типами (эпителиев, не предназначенные природой для функционирования в условиях данной реципиентной области. Несмотря на то, что огромное количество всевозможных методов уже широко применяется в клинике, единого подхода к пластике анатомических областей со слизистыми оболочками до сих пор' нет. Это» объясняется осложнениями, присущими- всем методикам, а также не всегда удовлетворительными функциональными и косметическими результатами. Так при пластике уретры после травм, хирургической коррекции пола, лечении уретральных свищей используются различные варианты кожно-фасциальных лоскутов на сосудистой ножке. Методика является одной из наиболее современных и дает хорошие результаты. Ее основными недостатками являются: риск декомпенсации кровообращения в лоскуте, рост волос в просвет сформированной неоуретры, хроническая воспалительная реакция кожи при длительном контакте с мочой, в результате чего возникает проблема формирования конкрементов и послеоперационных мочевых свищей, значительно снижающая качество жизни пациентов [1,7, 14].
Для реконструкции мочеиспускательного канала, как и для- других анатомических образований: содержащих слизистые оболочки, предложено множество материалов [130, 158, 159;, 161,. 162]. Клиническое применение нашли: свободные кожные лоскуты, слизистые оболочки щеки и мочевого пузыря, червеобразный отросток, мочеточник, лиофилизированная твердая мозговая оболочка. Применение этих материалов ограничено в силу ряда причин. Например, забор аутотрансплантатов слизистых оболочек большого размера? сопряжен с возникновением тяжелых осложнений в донорской области: Необходимость проведения объемных хирургических вмешательств; для-забора пластического материала,: также является существенным^ недостатком.
Перспективным направлением в? решении некоторых из обозначенных проблем пластических материалов;, применяемых сегодня, является использование аналогов: слизистой оболочки (тканевых эквивалентов), которые могут быть получены in vitro, с применением клеточных технологий [4, 107]! При созданииf тканевых эквивалентов» существует возможность учесть достоинства! и недостатки; уже существующих материалов и: максимально приблизить свойства полученного пластического материала к свойствам нативной ткани реципиентной области.
Существуют различные концепции применения: клеточных технологий" в медицине. Среди них- выделяются два принципиальных направления - клеточная терапия, и тканевая инженерия. Клеточная терапия направлена на лечение заболеваний при помощи местного; или системного введения различных клеток, предварительно накопленных в культуре. Тканевая инженерия подразумевает создание в лабораторных условиях живых аналогов тканей и органов из небольшого количества доступных для забора клеток. Уровень развития клеточной биологии и тканевой инженерии позволяет выделять из нескольких кубических миллиметров биопсийного материала и накапливать в. культуре такое количество клеток, которое достаточно для. создания тканевого эквивалента площадью несколько квадратных дециметров [6]. Это позволяет минимизировать объем хирургического вмешательства при заборе ткани для выделения клеток.
В создании живого эквивалента ткани, помимо клеточного материала, огромную роль играет выбор материала носителя клеток (подложки). Именно эта часть тканевого эквивалента отвечает за многие свойства, определяющие перспективы его клинического применения. Идеального материала способного служить основой любого тканевого эквивалента на сегодняшний день не существует. Подложка подбирается индивидуально для каждого эквивалента с учетом особенностей клеток, которые планируется фиксировать на ней, а также с учетом требований предъявляемых со стороны реципиентной зоны.
Успешное создание тканевого эквивалента в условиях лаборатории далеко не всегда гарантирует его успешное внедрение в клинику. Зачастую, непонимание клеточных биологов особенностей, задач стоящих перед хирургами приводит к тому, что использование тканевого эквивалента в клинике становится невозможным из-за' неправильного выбора материала подложки.
Помимо того, что материал основы тканевого эквивалента должен позволять адсорбировать на своей поверхности достаточное количество живых клеток, он должен, иметь некоторые специфические свойства, позволяющие использовать его для устранения конкретных дефектов. Отсутствует единое мнение о том, в чьем ведении должен находиться вопрос выбора материала для создания тканевых эквивалентов. На наш взгляд, знание специфики реконструируемой анатомической области, а также знание особенностей хирургических материалов- дает хирургам больше возможностей; для правильного выбора материала подложки? по & сравнению1 с клеточными биологами. Специфику материала; для« устранения; дефекта всегда определяет хирург, при этом, общепризнанные хирургические критерии; выбора материалов-подложки* тканевых эквивалентов в доступной литературе отсутствуют. Как уже отмечалось, при устранении дефектов слизистых в различных анатомических областях требуются материалы с различными свойствами, поэтому разработать некий универсальный материал, способныйслужить основой тканевому эквиваленту для устранения всех, дефектов, невозможно. В связи с тем, что в нашем учреждении накоплен огромный опыт хирургического лечения различных патологий уретры, одной" из задач данного исследования стала формулировка хирургических критериев- выбора материалов подложки живого? тканевого эквивалента слизистой оболочки для устранения протяженных, дефектов мочеиспускательного канала; На основании: собственного опыта и литературных данных; предложить материал подложки тканевого? эквивалента слизистой и экспериментально обосновать возможности его применения;
Сегодня существует удачный опыт создания' эпителиальных выстилок на? искусственных коллагеновых носителях [4, 6, 12]. Однако при- трансплантации; в, результате довольно длительного периода; приживления^ и* адаптации;, большая« часть клеток гибнет, что является значительным препятствием на пути внедрения методик в клинику. Кроме: того; механические свойства; наиболее распространенных тканевых эквивалентов; на основе коллагеновых гелей не позволяют хирургам использовать их для создания трубчатых, структур, а также использовать катетеры.
Отделом восстановительной микрохирургии РНЦХ разработана и внедрена' в- клинику методика? пластики преддверия неовлагалища; свободным расщепленным уретральным лоскутом, полученным из избытка уретры при хирургической коррекции пола при М\Ж-транссексуализме [8]. Хорошие результаты, полученные с использованием данной методики, убедительно доказывают принципиальную возможность успешной аутотрансплантации слизистой уретры.
Аутотрансплантаты из различных участков ротовой полости (свободные лоскуты слизистой десны, щеки и неба) являются рутинными материалами, применяющимися для закрытия мягкотканых дефектов [34]. Поскольку ткани этих трансплантатов не являются для организма чужеродными, отсутствует проблема их отторжения. Однако, с использованием аутотрансплантатов связан ряд трудностей, включая: осложнения в донорской зоне, нехватку тканей и утрату оригинальных характеристик трансплантата. Для решения этих проблем с начала 80-х годов, было предложено использовать эпителиальные трансплантаты, полученные из клеток накопленных в культуре. Источником клеток служил небольшой фрагмент^ слизистой, полученный при биопсии. Данные трансплантаты предлагалось использовать для лечения ожоговых ран [107] и закрытия дефектов слизистой ротовой полости [94, 155]. Однако первые трансплантаты, представленные монослойными эпителиальными пластами без поддерживающей подлежащей, основы, были очень хрупкими, сложными в обращении и склонными к сокращению [51]. Достижения тканевой инженерии позволили выработать альтернативный подход, а именно позволили получать трехмерные модели кожи и слизистых оболочек, путем совместного или изолированного культивирования кератиноцитов и фибробластов на трехмерных матрицах in vitro. Были получены удовлетворительные клинические результаты при использовании для закрытия дефектов в ротовой полости полнослойных эквивалентов слизистой' рта [78, 95]1
Также показано; что использование тканевых эквивалентов слизистых позволяет снизить раневую контракцию и образование рубцов [52]. В' последнее десятилетие, исследования сосредоточены на разработке и характеристике эквивалентов слизистой оболочки« рта с применением новых дермальных подложек и современных методик культивирования эпителиальных клеток [108]. Как уже отмечалось, слизистая рта является одним из наиболее распространенных материалов для пластики уретры, по этому тканевые эквиваленты слизистой оболочки рта также могут быть использованы для реконструкции мочеиспускательного канала,
Наиболее распространенным материалом подложи1 при создании тканевых эквивалентов слизистой оболочки является ацеллюлярный кожный матрикс [42]. Тканевые эквиваленты на его основе уже внедрены в клинику. Однако данный материал имеет ряд недостатков, основным из которых является его донорская природа, определяющая сложность получения, высокую стоимость коммерческих продуктов, а также этические проблемы, связанные с использованием алломатериалов. В нашей работе, ацеллюлярный кожный матрикс был» выбран в качестве материала для сравнения, поскольку свойства его достаточно хорошо изучены, а возможность создания на его основе эквивалента слизистой оболочки для реконструкции уретры описана в литературе.
В качестве альтернативы ацеллюлярному кожному матриксу, мы предложили ацеллюлярный ксеноперикард. Этот материал также хорошо изучен в хирургии, обладает свойствами схожими с ацеллюлярным кожным матриксом, однако его применение не связано с необходимостью предварительного обследования донора, стоимость его ниже, а этические проблемы связанные с использованием, алломатериалов отсутствуют. В литературе описан опыт использования данного материала для реконструкции уретры в эксперименте, результаты которого оказались неудовлетворительными [92]. Сведения о создании на основе ксеноперикарда тканевых эквивалентов слизистых оболочек в доступной литературе отсутствуют.
Отсутствие оптимального материала для создания на его основе тканевого эквивалента слизистых оболочек, отсутствие в доступной литературе общепризнанных хирургических критериев выбора материалов подложки, а также экспериментальной модели для исследования их свойств явились основаниями для проведения данного исследования.
Цель работы
Изучить в эксперименте возможности использования ксеноперикарда и ацеллюлярного кожного матрикса в качестве носителей клеточных трансплантатов для устранения протяженных дефектов слизистых оболочек(в том числе мочеиспускательного канала) с позиции хирургии.
Задачи
1. Разработать экспериментальную биологическую модель для исследования свойств материалов подложек тканевых эквивалентов слизистых оболочек.
2. Разработать хирургические критерии выбора материалов для использования в качестве подложек тканевых эквивалентов слизистых оболочек.
3. Определить возможности применения методики ферментативно-химической обработки ксеноперикарда для получения ацеллюлярного кожного матрикса из полнослойной кожи.
4. Изучить в эксперименте особенности тканевой реакции на ацеллюлярный ксеноперикард и ацеллюлярный кожный матрикс.
5. Изучить, способность культур- клеток фиксироваться на поверхности ацеллюлярного кожного матрикса и ксеноперикарда.
6. Исходя из сформулированных критериев, провести сравнительную оценку ацеллюлярного кожного матрикса и ксеноперикарда для использования в качестве подложки клеточных трансплантатов, дать практические рекомендации.
Актуальность темы
Несмотря на то, что при различных патологиях предложено более 300 методик реконструкции мочеиспускательного канала, процент осложнений остается достаточно высоким. Краеугольным камнем всех методов реконструкции является выбор материала-для закрытия дефекта уретры, что особенно актуально для дефектов большой протяженности. Забор аутотрансплантатов большого объема, применяющихся для реконструкции наиболее часто и успешно, сопряжен с возникновением осложнений в донорской области. Достижения клеточной биологии' и тканевой инженерии позволяют формировать in vitro живые аналоги человеческих тканей (в частности слизистых оболочек), однако зачастую использование таких тканевых эквивалентов в клинике оказывается невозможным из-за их несоответствия хирургическим требованиям. Материал подложки является неотъемлемой частью любого тканевого эквивалента слизистой- определяющей многие важные свойства структуры, в том числе прочностные характеристики, биосовместимость, васкуляризацию. Совокупность этих свойств во многом определяет возможность использования аналогов тканей в клинике. Таким образом, правильный выбор материала подложек тканевых эквивалентов слизистой оболочки для реконструкции мочеиспускательного канала является актуальным вопросом хирургии и тканевой инженерии.
Научная новизна
В работе впервые четко сформулированы хирургические критерии выбора материала подложки тканевого эквивалента слизистой оболочки для реконструкции уретры на протяжении. Процесс создания тканевого эквивалента рассмотрен с учетом хирургических требований и перспектив прикладного использования трансплантата.
Впервые рассмотрена возможность применения ксеноперикарда в качестве материала подложки тканевого эквивалента слизистой.
Предложена методика увеличения темпов васкуляризации материала с помощью нанесения лазерных микроперфораций, благодаря чему был получен материал с принципиально новыми характеристиками.
Заключение диссертационного исследования на тему "Изучение возможности использования ксеноперикарда и ацеллюлярного кожного матрикса в качестве основы тканевых эквивалентов слизистых оболочек"
Выводы
На основании полученных результатов, нами были сделаны следующие выводы:
1. Экспериментальная модель для исследования материалов подложек тканевых эквивалентов создается путем имплантации образца исследуемого материала лабораторным животным (крысам) под кожу в области межлопаточного пространства.
2. При выборе материала подложки тканевого эквивалента для закрытия дефектов слизистых оболочек необходимо руководствоваться не только биологическими, но и хирургическими критериями, включающими прочностные характеристики, эластичность, ригидность, биосовместимость, пористость.
3. Использованная в работе методика ферментативно-химической обработки ксеноперикарда не позволяет добиться адекватной децеллюляризации при обработке кожи.
4. Ацеллюлярный кожный матрикс, по сравнению с ксеноперикардом, активнее интегрируется в ткани и васкуляризируется за счет наличия естественных пор.
5. При увеличении порозности ксеноперикарда за счет нанесения лазерных микроперфораций, динамика интеграции в ткани и васкуляризации значительно возрастает.
6. Ксеноперикард и ацеллюлярный кожный матрикс являются хорошими поверхностями для фиксации культур фибробластов и кератиноцитов.
7. Наиболее подходящим для использования в качестве подложки является перфорированный ацеллюлярный ксеноперикард, что обусловлено быстрым прорастанием пор материала грануляционной тканью с последующим формированием сосудистой сети.
Практические рекомендации
1. При исследовании свойств материалов подложек тканевых эквивалентов целесообразно проводить имплантацию материалов подкожно в область межлопаточного пространства мелким лабораторным животным.
2. При создании тканевого эквивалента слизистой оболочки для реконструкции уретры рекомендуем использовать достаточно прочные, эластичные и пористые биосовместимые материалы.
3. Для получения ацеллюлярного кожного матрикса по методике ферментативно-химической обработки ксенОперикарда необходимо проводить предварительную механическую деэпидермизацию кожи.
4. При использовании ацеллюлярного ксеноперикарда в качестве основы тканевых эквивалентов для реконструкции слизистых оболочек рекомендуем повышение порозности материала путем нанесения микроперфораций.
5. Микроперфорирование ксеноперикарда рекомендуем осуществлять с помощью твердотельного Ш-УАС лазера с ламповой накачкой и модуляцией добротности (длина волны 1,064 мкм).
6. Плотность микроперфораций должна быть максимальной, при условии сохранения структурной целостности материала.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Тагабилев, Дмитрий Геннатулович
1. Абдуллаев И.А., Адамян Р.Т., Гагарина C.B. Пригодность свободного кожного лучевого васкуляризированного лоскута для заместительной уретропластики. Андрол. и генит. Хир. 2000; 2:43-48.
2. Бокерия JI.A., Каграманов И.И., Кокшенев И.В. и др. Результаты протезирования трехстворчатого клапана биопротезом из глиссоновой капсулы печени. Бюл. НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН 2007; Т.8. 6:318.
3. Васильев A.B., Демин Н.В., Роговая О.С. Применение клеточных технологий для реконструкции уретры в детской урологии. Андрол. и генит. Хир. 2009; 4:36-39.
4. Груша Я.О., Федоров A.A., Дземешкевич В.В. и др. Клинико-морфологические особенности применения ксеноперикарда в пластике орбиты и век. Вест. Офтальм. 2004; 5:19-21.
5. Демин Н.В., Файзулин А.К. Лечение уретральных свищей у детей с использованием методов тканевой инженерии. Андрол. и генит. Хир. 2009;4:31-35.
6. Гуляев И.В. Осложнения и их профилактика при микрохирургической аутотрансплантации лучевого лоскута в реконструкции уретры: Автореферат дис. . канд. мед. Наук. М; 2008.
7. Жуманов А. Р. Новый способ неовагинопластики с одномоментной пластикой преддверия неовагины: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М; 2006.
8. Кармадонов A.B., Подолужный В.И., Зайков И.Н. Применение модифицированного ксеноперикарда при ненатяжных пластиках rpbDK передней брюшной стенки. Сиб. мед. журн. 2008; 2:28-33.
9. Константинов Б.А., Черепенин Л.П., Иванов A.C. и др. Первый опыт клинического применения моностворчатых ксеноперикардиальных трансплантатов. Груд, и серд.-сосуд. хир. 1990; 5:3-7.
10. Липский. К.Б., Гуляев И.В., Тагабилев Д.Г. Тканевой эквивалент слизистой оболочки для устранения протяженных дефектов уретры. Вопр.реконстр: и пласт, хир. 2010; 3(34): 65-66.
11. Миланов Н.О., Адамян Р.Т, Казарян Т.В. Осложнения микрохирургической фаллопластики у транссексуалов. Анн. пласт., реконстр; и эстет. Хир. 2001; 1:55-62.
12. Миланов Н.О., Адамян Р.Т., Карибеков Т.С. Аутотрансплантация реваскуляризированных тканей- в пластической; хирургии урогенитальной области. М., 2007. 210с.
13. Миланов Н.О., Адамян Р.Т, Козлов Г.И. Коррекция пола: при: транссексуализме.—М., 1999. 151с.
14. Миланов Н.О., Адамян Р.Т., Липский К.Б. Подготовка лучевого; кожно-фасциального аутотрансплантата для протяженной уретропластики. Анн. пласт., реконстр^ и эстет. Хир. 2007; 4:70-73.
15. Трофимов Е.И., Миланов Н.О., Адамян Р.Т. Микрохирургическая аутотрансплантация тканей направление восстановительной хирургии. Анн. РПЦХ РАМП. 2002; 11:13-19
16. Трофимов Е.И., Гудовский Л.М., Миланов Н.О. Десять лет применения микрохирургических технологий в реконструктивной хирургии трахеи. Груд, и серд.-сосуд. Хир. 2008; 2:36-42.
17. Трофимов Е.И., Гурджидзе Т.Ю., Мехтиханова Г.Р. Микрохирургическая аутотрансплантация покровных тканей при закрытии дефектов кисти. Анн. пласт., реконстр. и эстет. Хир. 2010; 4:6070.
18. Черепенин Л.П., Иванов А.С., Балоян Г.М. и др. Применение бесклеточного ксеноперикарда при истмопластике коарктации аорты // V Всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов. Тез. Докл. и сообщ. Новосибирск 1999. 18с.
19. A1 Halees Z., A1 Shahid М., A1 Sanei A., et al. Up to 16 years follow-up of aortic valve reconstruction with pericardium: a stentless readily available cheap valve? Eur J Cardiothorac Surg. 2005; 28(2):200-5
20. Andrian E., Grenier D., Rouabhia M. In vitro models of tissue penetration and destruction by Porphyromonas gingivalis. Infect Immun. 2004; 72:46894698.
21. Andrich D.E., Dunglison N., Greenwell T.J., et al. The long-term results of urethroplasty. J Urol. 2001; 170:90-92.
22. Andrich D.E., Leach C. J . Mundy A.R. The Barbagli procedure gives the best results for patch urethroplasty of the bulbar urethra. BJU International. 2001;88:385-389.
23. Arenholt-Bindslev D, Jepsen A, MacCallum DK, Lillie Ш. The growth and structure of human oral keratinocytes in culture. J Invest Dermatol. 1987; 88(3):314-9.
24. Atala A., Freeman M. R., Vacanti J. P., et al.: Implantation in vivo and retrieval of artificial structures consisting of rabbit and human urothelium and human bladder muscle. J. Urol. 1993; 150:608.
25. Atala A., Vacanti J.P., Peters C.A., et al.: Formation of urothelial structures in vivo from dissociated cells attached to biodegradable polymer scaffolds in vitro. J. Urol. 1992; 148: 658-662.
26. Atkinson M.E., Jowett A., White F.H. Principles of anatomy and oral anatomy for dental students. Taddington: Cava Cadavers. 2000. 560p.
27. Atula S., Grenman R., Syrjänen S. Fibroblasts can modulate the phenotype of malignant epithelial cells in vitro. Exp Cell Res. 1997; 235(1): 180-187.
28. Baden H.P., Goldaber M.L., Kvedar J.C. Keratinocytes stimulate prostaglandin 12 synthesis by 3T3 cells and exhibits enhanced cornification when exposed to protaglandin 12 analogues. J. Cell. Physiol. 1992; 150:269.
29. Bapat S.S., Padhye A.S., Yadav P.B. et al. Preputial skin free graft as dorsal onlay urethroplasty: Our experience of 73 patients. Indian J Urol. 2007; 23(4):366-8.
30. Baskin LS, Ebbers MB. Hypospadias: anatomy, etiology, and technique. J Pediatr Surg. 2006 Mar;41(3):463-72.
31. Baskin L.S., Duckett J.W. Buccal mucosa grafts in hypospadias surgery. Br J Urol. 1995;3:23-30.
32. Bazeed M.A., Thüroff J.W., Schmidt R.A., et al.: New treatment for urethral strictures. Urology. 1983; 21:53-57.
33. Berthod F., Hayek D., Damour O., et al. Collagen synthesis by fibroblasts cultured within a collagen sponge. Biomaterials. 1993; 14:749754.
34. Bhargava S., Chappie C.R., Bullock A.J., et al. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU Int. 2004; 93(6):807-l 1.
35. Black A.F., Bouez C., Perrier E. et al. Optimization and characterization of an engineered human skin equivalent. Tiss. Eng. 2005;11:723-33.
36. Boelsma E., Verhoeven M.C., Ponec M. Reconstruction of a human skin equivalent using a spontaneously transformed keratinocyte cell line (HaCaT). J Invest Dermatol. 1999; 112(4):489-98.
37. Boxman I. L., Lowik C., Aarden L., et al.: Modulation of IL-6 production and IL-1 activity by keratinocyte-fibroblast interaction. J. Invest. Dermatol. 1993; 101:316.
38. Carr M.C.: Complications of bowel augmentation. Dial. Pediatr Urol. 1995; 18:2.
39. Chakrabarty K.H., Dawson R.A., Harris P. et al. Development of autologous human dermal-epidermal composites based on sterilized human allodermis for clinical use. Br J Dermatol. 1999; 141(5):811-23.
40. Chen C.H., Wei H.J., Lin W.W. et al. Porous tissue grafts sandwiched with multilayered mesenchymal stromal cell sheets induce tissue regeneration for cardiac repair. Cardiovasc Res. 2008; 80(l):88-95.
41. Chen F., Yoo J.J., Atala A. Experimental and clinical experience using tissue regeneration for urethral reconstruction. World J Urol. 2000; 18(1):67-70.
42. Cho K.H., Ahn H.T., Park K.C., et al. Reconstruction of human hard-palate mucosal epithelium on de-epidermized dermis. J Dermatol Sci. 2000; 22(2):117-24.
43. Choi Y.S, Hong S.R., Lee Y.M. et al. Study on gelatin-containing artificial skin: I. Preparation and characteristics of novel gelatin-alginate sponge. Biomaterials. 1999; 20:409-^117.
44. Choi Y.S., Hong S.R., Lee Y.M., et al. Studies on gelatin-containing artificial skin: II. Preparation and characterization of cross-linked gelatin-hyaluronate sponge. J Biomed Mater Res. 1999; 48(5):631-9.
45. Cilento B.G., Freeman M.R., Schneck F.X., et al.: Phenotypic and cytogenetic characterization of human bladder urothelia expanded in vitro. J. Urol., 1994; 152:665.
46. Claveau I., Mostefaoui Y., Rouabhia M. Basement membrane protein and matrix metalloproteinase deregulation in engineered human oral mucosa following infection with Candida albicans. Matrix Biol. 2004; 23(7):477-86.
47. Clugston P.A., Snelling C.F., Macdonald I.B., et all. Cultured epithelial autografts: three years of clinical experience with eighteen patients. J Burn Care Rehabil. 1991; 12(6):533-9.
48. Cusano A., Fernandes R. Technology in microvascular surgery. Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 2010; 22(l):73-90.
49. Dawson R.A., Goberdhan N.J., Freedlander E., et al.: Influence of extracellular matrix proteins on human keratinocyte attachment, proliferation and transfer to a dermal wound model. Burns. 1996; 22:93.
50. De Filippo R.E., Yoo J J., Atala A.: Urethral replacement using cell seeded tubularized collagen matrices. J Urol. 2002; 168(4 Pt 2):1789-92.
51. Douwes J. (l-->3)-Beta-D-glucans and respiratory health: a review of the scientific evidence. Indoor Air. 2005; 15(3): 160-9.
52. Eaglstein W.H., Iriondo M., Laszlo K. A composite skin substitute (graftskin) for surgical wounds. A clinical experience. Dermatol Surg. 1995; 21(10):839-43.
53. Eder I.I., Corvin S.C., M. Marcus V., et al.: Selective culture conditions for different types of primary human bladder cells. World J. Urol., 2000; 18:371-375.
54. El-Ghalbzouri A., Lamme E.N., van Blitterswijk C., et al. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 2004; 25(15):2987-96.
55. El-Kasaby A.W., Alia M.F., Noweir A., et al.: One-stage anterior urethroplasty. J Urol. 1996; 156: 975-8.
56. Elliott S.P., Metro M.J., McAninch J.W.: Long-term followup of the ventrally placed buccal mucosa onlay graft in bulbar urethral reconstruction. J Urol. 2003; 169:1754-7.
57. Fichtner J., Filipas D., Fisch M., et al.: Long-term outcome of ventral buccal mucosa onlay graft urethroplasty for urethral stricture repair. Urology. 2004; 64:648-50.
58. Folkman J., Hochberg M. Self-regulation of growth in three dimensions. J Exp Med. 1973; 138(4):745-53.
59. Foroutan H.R., Khalili A., Geramizadeh B., et al. Urethral reconstruction using autologous and everted vein graft: an experimental study. Pediatr Surg Int. 2006; 22(3):259-62.
60. Friedrich J.B., Moran S.L., Bishop A.T., et al. Free vascularized fibula grafts for salvage of failed oncologic long bone reconstruction and pathologic fractures. Microsurgeiy. 2009; 29(5):385-92.
61. Fusenig N.E. Epithelial-mesenchymal interactions regulate keratinocyte growth and differentiation in vitro. In: The keratinocyte handbook. Leigh IM, Lane EB, Watt FM, editors. Cambridge: University Press, 1994; pp. 71-94.
62. Gentzkow G.D., Iwasaki S.D., Hershon K.S., et al. Use of dermagraft, a cultured human dermis, to treat diabetic foot ulcers. Diabetes Care. 1996;19(4):350-4.of autologous silicone for use
63. Ghosh M.M., Boyce S., Layton G., et al. A comparison of methodologies for the preparation of human epidermal-dermal composites. Ann Plast Surg. 1997; 39(4):390-404.
64. Hafemann B., Ehsslen S., Erdmann C.,et al. Use of a collagen/elastin-membrane for the tissue engineering of dermis. Burns; 1999; 25(5):373-84.
65. Hagi-Pavli E., Williams D., Thornhill M.H., et al. The effect of different surfactants on epithelial haemostasis. J Dent Res. 2004; 83(Spec Iss A): 1230.
66. Heck E.L., Bergstresser P.R., Baxter C.R. Composite skin graft: frozen dermal allografts support the engraftment and expansion epidermis. J Trauma. 1985; 25(2):106-12.
67. Henly D.R., Barrett D.M., Welland T.L., et al.: Particulate in periurethralinjections: local tissue effects and search for migration. J: Urol; 1995; 153:2039-2043.
68. Herson M.R., Mathor M.B., Altran S., et al. In vitro construction of a potential skin substitute through direct human- keratinocyte plating ontodecellularized glycerol-preserved allodermis. Artif Organs. 2001; 25(11):901■ ■. ■■.'■
69. Hong S.R., Lee S.J., Shirri J.W., .ah Study on gelatin-containing artificial skin IV: a comparative study on the effect of antibiotic and EGE on cell proliferation,during epidermal healing. Biomaterials. 2001 ; 22:2777-2783.
70. Humby G.A. A one-stage; operation for hypospadias. Br J Urol. 1941; 24:84-92.
71. Hosam S. Al-Qudah, Richard A. Santucci. Exxtended complications of urethroplasty Int. Braz. J. Urol; 2005; 31(4):315-325.
72. Izumi K., Feinberg S.E., Iida A., et al. Intraoral grafting of an ex vivo produced oral mucosa equivalent: a preliminary report. Int J Oral Maxillofac Surg. 2003; 32(2): 188-97.
73. Izumi K., Feinberg S.E., Terashi H., et al. Evaluation of transplanted tissue-engineered oral mucosa equivalents in severe combined immunodeficient mice. Tissue Eng. 2003; 9(l):163-74.
74. Izumi K., Takacs G., Terashi H., et al. Ex vivo development of a composite human oral mucosal equivalent. J Oral Maxillofac Surg. 1999; 57(5):571-7.
75. Izumi K., Terashi H., Marcelo C.L., et al. Development and characterization of a tissue-engineered human oral mucosa equivalent produced in a serum-free culture system. J Dent Res. 2000; 79:798-805.
76. Kahveci R., Kahveci Z., Sirmali S., et al. Urethral reconstruction with autologous vein graft: an experimental study. Br J Plast Surg. 1995; 48(7):500-3.
77. Kaiser H.W., Stark G.B., Kopp J., et al. Cultured autologous keratinocytes in fibrin glue suspension, exclusively and combined with STS-allograft (preliminary clinical and histological report of a new technique). Burns. 1994; 20(l):23-9.
78. Kane C.J., Tarman G.J., Summerton D.J., et al.: Multi-institutional-experience with buccal mucosa onlay urethroplasty for bulbar urethral reconstruction. J Urol. 2002; 167:1314- 7.
79. Kaur P., Carter W.G.: Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts. J. Cell Sei. 1992; 103:755.
80. Kellner D.S., Fracchia J.A., Armenakas N.A.: Ventral onlay buccal mucosal grafts for anterior urethral strictures: long-term followup. J Urol. 2004; 171:726-9.
81. Khawaja N.A., Lundqvist C.K., Cruchley A.T., et al. HgC12 induces IL-6 and IL-8 production in a stratified oral mucosal culture system. J Dent Res. 2002; 81 (Spec Iss A):496.
82. Khorramizadeh M.R., Tredget E.E., Telasky C., et al. Aging differentially modulates the expression of collagen and collagenase in dermal fibroblasts. Mol Cell Biochem. 1999; 194(l-2):99-108.
83. Kim J., Suh S.W., Shin J.Y., et al. Replacement of a tracheal defect with a tissue-engineered prosthesis: early results from animal experiments. J Thorac Cardiovasc Surg. 2004; 128:124-129.
84. Kinkead T.M., Borzi P.A., Duffy P.G., et al. Long-term followup of bladder mucosa graft for male urethral reconstruction. J Urol. 1994; 151(4):1056-8.
85. Krejci N.C., Cuono C.B., Langdon R.C., et al. In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis. J Invest Dermatol. 1991; 97(5):843-8.
86. Lara R.C., Lucon A.M., Arap S. Urethroplasty using a bovine pericardium graft: an experimental study using normal urethras from dogs. Braz J Med Biol Res. 2004; 37(3):327-31.
87. Lauer G. Autografting of feeder-cell free cultured gingival epithelium. Method and clinical application. J Craniomaxillofac Surg. 1994; 22(l):18-22.
88. Lauer G., Otten J.E., von Specht B.U., et al. Cultured gingival epithelium. A possible suitable material for pre-prosthetic surgery. J Craniomaxillofac Surg. 1991; 19(l):21-6.
89. Lauer G., Schimming R. Tissue-engineered mucosa graft for reconstruction of the intraoral lining after freeing of the tongue: a clinical and immunohistologic study. J Oral Maxillofac Surg. 2001; 59(2): 169-75.
90. Lauer G., Schimming R. Clinical application of tissue-engineered autologous oral mucosa transplants. Mund Kiefer Gesichtschir. 2002; 6(6):379-93.
91. Lee K.H. Tissue-engineered human living skin substitutes: development and clinical application. Yonsei Med J. 2000; 41(6):774-9.
92. Lee S.B., Jeon H.W., Lee Y.W., et al. Bio-artificial skin composed of gelatin and (l-->3), (l-->6)-beta-glucan. Biomaterials. 2003; 24:2503-2511.
93. Lee R.H., Pulin A.A., Seo M.J., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 2009; 5(1):54-63.
94. Leslie B., Barboza L.L., Souza P.O., et al. Dorsal tunica vaginalis graft plus onlay preputial island flap urethroplasty: experimental study in rabbits. J Pediatr Urol. 2009; 5(2):93-9.
95. Lindell O., Borkowski J., Noll F., et al.: Urethral stricture repair: results in 179 patients. Scand J Urol Nephrol. 1993; 27:241-5.
96. Livesey S.A., Herndon D.N., Hollyoak M.A., et al. Transplanted acellular allograft dermal matrix. Potential as a template for the reconstruction of viable dermis. Transplantation. 1995; 60(l):l-9.
97. Lumen N., Hoebeke P., Oosterlinck W. Urethroplasty for urethral strictures: quality assessment of an in-home algorithm. Int J Urol. 2010;17(2):167-74.
98. Lundqvist C.K., Thornhill M.H., Williams D.M., et al. The effect of sodium lauryl sulphate on epithelial homeostasis. J Dent Res. 2002; 81 (Spec Iss A):3054.
99. Ma L., Gao C., Mao Z., et al. Collagen/chitosan porous scaffolds with improved biostability for skin tissue engineering. Biomaterials. 2003; 24(26):4833-41.
100. MacCallum D.K., Lillie J.H. Evidence for autoregulation of cell division and cell transit in keratinocytes grown on collagen at an air-liquid interface. Skin Pharmacol. 1990; 3(2):86-96.
101. Madden M.R., Finkelstein J.L., Staiano-Coico L., et al. Grafting of cultured allogeneic epidermis on second- and third-degree burn wounds on 26 patients. J Trauma. 1986; 26(11):955-62.
102. Mao J.S., Liu H.F., Yin Y.J., et al. The properties of chitosan-gelatin membranes and scaffolds modified with hyaluronic acid by different methods. Biomaterials. 2003; 24(9):1621-9.
103. Masuda I. An in vitro oral mucosal model reconstructed from human normal gingival cells. Kokubyo Gakkai Zasshi. 1996; 63(2):334-53.
104. McAninch J.W., Morey A.F.: Penile circular fasciocutaneous skin flap in 1-stage reconstruction of complex anterior urethral strictures. J Urol. 1998; 159:1209-13.
105. McKay I., Woodward B., Wood K., et al. Reconstruction of human skin from glycerol-preserved allodermis and cultured keratinocyte sheets. Burns. 1994; 20(Suppl l):19-22.
106. Memmelaar J. Use of bladder mucosa in one-stage repair of hypospadias. J Urol. 1947;58:68-73.
107. Merguerian P., Chavez D.R., Hakim S.: Grafting of cultured uroepithelium and bladder mucosa into de-epithelialized segments of colon in rabbits. J. Urol. 1994; 152:671-674.
108. Merne M., Syrjanen S. The mesenchymal substrate influences the epithelial phenotype in a three-dimensional cell culture. Arch Dermatol Res. 2003; 295(5): 190-8.
109. Mitchell M.E., Adams M.C., Rink R.C. Urethral replacement with ureter. J Urol. 1988;139(6):1282-5.
110. M. Moharamzadeh K., Brook I.M., Van Noort R., et al. Tissue-engineered oral mucosa: a review of the scientific literature. J Dent Res. 2007; 86(2): 115-24.
111. Morey A.F., Tran L.K., Zinman L.M.: Q-flap reconstruction of panurethral strictures. BJUInt. 2000; 86:1039-42.
112. Moriyama T., Asahina I., Ishii M., et al. Development of composite cultured oral mucosa utilizing collagen sponge matrix and contracted collagen gel: a preliminary study for clinical applications. Tissue Eng. 2001; 7(4):415-27.
113. Mostefaoui Y., Claveau I., Ross G., et al. Tissue structure, and IL-lbeta, IL-8, and TNF-alpha secretions after contact by engineered human oral mucosa with dentifrices. J Clin Periodontol. 2002; 29(11): 1035-41.
114. Mostefaoui Y., Claveau I., Rouabhia M. In vitro analyses of tissue structure and interleukin-lbeta expression and production by human oral mucosa in response to Candida albicans infections. Cytokine 2004; 25:162— 171.
115. Mundy A.R. Reconstruction of posterior urethral distraction defects. Urol Clin North Am. 1997; 5:139.
116. Nakamura T., Endo K., Cooper L.J., et al. The successful culture and autologous transplantation of rabbit oral mucosal epithelial cells on amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003; 44(1):106-16.
117. Nanni L., Vallasciani S., Fadda G., et al. Free peritoneal grafts for patch urethroplasty in male rabbits. J Urol. 2001; 165(2):578-80.
118. Ng K.W., Khor H.L., Hutmacher D.W. In vitro characterization of natural and synthetic dermal matrices cultured with human dermal fibroblasts. Biomaterials. 2004; 25:2807-2818.
119. Ng K.W., Tham W., Lim T.C., rt al. Assimilating cell sheets and hybrid scaffolds for dermal tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2005; 75(2):425-38.
120. Nimni M.E. Collagen: molecular structure and biomaterial properties. In: Encyclopedic handbook of biomaterials and bioengineering. Part A: Materials. Wise D.L., editor. New York: Marcel Dekker Inc. 1995; pp. 1229-1243.
121. Nittayananta W., Coombs R.W., Ayehunie S., et al. Development of a human oral epithelial tissue model to study HIV transmission and the role ofbeta-defensins. XV International AIDS Conference, Bangkok, Thailand, 2004 July 11-16.
122. Ojeh N.O., Frame J.D., Navsaria H.A. In vitro characterization of an artificial dermal scaffold. Tissue Eng. 2001; 7(4):457-72.
123. Okazaki M., Yoshimura K., Suzuki Y., et al. Effects of subepithelial fibroblasts on epithelial differentiation in human skin and oral mucosa: heterotypically recombined organotypic culture model. Plast Reconstr Surg. 2003; 112(3):784-92.
124. Olsen L., Bowald S., Busch C., et al. Urethral reconstruction with a new synthetic absorbable device. Scand. J. Urol. Nephrol. 1992; 26:323-326.
125. Ophof R., van Rheden R.E., Schalkwijk J., et al. Oral keratinocytes cultured on dermal matrices form a mucosa-like tissue. Biomaterials. 2002; 23(17):3741-8.
126. Ozgok Y., Ozgur M.T., Kilciler M.: Use of bladder mucosal graft for urethral reconstruction. IJU. 2000; 7:355-360.
127. Pansadoro V., Emiliozzi P., Gaffi M., et al.: Buccal mucosa urethroplasty in the treatment of bulbar urethral strictures. Urology. 2003; 61:1008-10.
128. Petzoldt J.L., Leigh I.M., Duffy P.G., et al.: Culture and characterisation of human urothelium in vivo and in vitro. Urol. Res. 1994; 22:67.
129. Pretre R., Kadner A., Dave H., et al. Tricuspidisation of the aortic valve with creation of a crown-like annulus is able to restore a normal valve function in bicuspid aortic valves. Eur J Cardiothorac Surg. 2006; 29(6):1001-6.
130. Purdue G.F. Dermagraft-TC pivotal efficacy and safety study. J Burn Care Rehabil. 1997; 18:13-4.
131. Ralston D.R., Layton C., Dalley A.J., et al. The requirement for basement membrane antigens in the production of human epidermal/dermal composites in vitro. Br J Dermatol. 1999; 140(4):605-15.
132. Rennekampff H.O., Kiessig V., Griffey S., et al. Acellular human dermis promotes cultured keratinocyte engraftment. J Burn Care Rehabil. 1997;18(6):535-44.
133. Rheinwald J.G., Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 1975; 6(3):331-43.
134. Rosdy M., Clauss L.C. Terminal epidermal differentiation of human keratinocytes grown in chemically defined medium on inert filter substrates at the air-liquid interface. J Invest Dermatol. 1990; 95(4):409-14.
135. Rosdy M., Pisani A., Ortonne J.P. Production of basement membrane components by a reconstructed epidermis cultured in the absence of serum and dermal factors. Br J Dermatol. 1993;129(3):227-34.
136. Rouabhia M., Deslauriers N. Production and characterization of an in vitro engineered human oral mucosa. Biochem Cell Biol. 2002; 80(2): 189-95.
137. Ruszymah B.H. Autologous human fibrin as the biomaterial for tissue engineering. Med J Malaysia. 2004; 59(Suppl B):30-l.
138. Saintigny G., Bonnard M., Damour O., et al. Reconstruction of epidermis on a chitosan cross-linked collagen-GAG lattice: effect of fibroblasts. Acta Derm Venereol. 1993; 73(3):175-80.
139. Schmalz G., Schweikl H., Hiller K.A. Release of prostaglandin E2, IL-6 and IL-8 from human oral epithelial culture models after exposure to compounds of dental materials. Eur J Oral Sci. 2000; 108:442-448.
140. Shaul D.B., Xie H.W., Diaz J.F., et al. Use of tabularized peritoneal free grafts as urethral substitutes in the rabbit. J Pediatr Surg. 1996; 31(2):225-8.
141. Sinha R.J., Singh V., Sankhwar S.N., et al. Donor site morbidity in oral mucosa graft urethroplasty: implications of tobacco consumption. BMC Urol. 2009; 21:9:15.
142. Smola H., Stark HJ., Thiekötter G., et al. Dynamics of basement membrane formation by keratinocyte-fibroblast interactions in organotypic skin culture. Exp Cell Res. 1998; 239(2):399-410.
143. Southgate J., Hutton K.A., Thomas D.F., et al.: Methods in laboratory investigation. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab. Invest. 1994; 71:583.
144. Takeda K., Gosiewska A., Peterkofsky B. Similar, but not identical, modulation of expression of extracellular matrix components during in vitro and in vivo aging of human skin fibroblasts. J Cell Physiol. 1992;153(3):450-9.
145. Tardif F., Goulet J.P., Zakrazewski A., et al. Involvement of interleukin-18 in the inflammatory response against oropharyngeal candidiasis. Med Sei Monit. 2004; 10(8):239-249.
146. Theodorescu D., Balcom A., Smith C.R., et al. Urethral replacement with vascularized tunica vaginalis: defining the optimal form of use. J Urol. 1998; 159(5): 1708-11.
147. Thornhill M.H., Cruchley A., Lopez-Ribot J., et al. In vitro modeling of oral candidiasis. J Dent Res. 2005; 84(Special Iss A):318.
148. Ueda M., Ebata K., Kaneda T. In vitro fabrication of bioartificial mucosa for reconstruction of oral mucosa: basic research and clinical application. Ann Plast Surg. 1991; 27(6):540-9.
149. Vaissiere G., Chevallay B., Herbage D., et al. Comparative analysis of different collagen-based biomaterials as scaffolds for long-term culture of human fibroblasts. Med Biol Eng Comput. 2000; 38(2):205-10.
150. Vaughan E.D. Functional outcomes of free tissue transfer in head and neck cancer reconstruction. Oral Oncol. 2009; 45(4-5):421-30.
151. Villavicencio Mavrich H., Moreno R.P., Sariol J.C., et al. Experience \ with lyophilized human dura mater for urethral strictures. J Urol. 1998; 160(4): 1310-11.
152. Villavicencio H. Reconstructive plastic surgery of urethral stenosis: urethroplasty with lyophilized dura mater. Arch Esp Urol. 1989; 42(4):309-12.
153. Wang H., Pieper J., Peters F., et al. Synthetic scaffold morphology controls human dermal connective tissue formation. J Biomed Mater Res A. 2005; 74(4):523-32.
154. Webster G.D., Brown M.W., Koefoot R.B. Jr, et al. Suboptimal results of full thickness skin graft urethroplasty using extrapenile skin donor sites. J Urol. 1984; 131:1082-3.
155. Webster G.D., Ramon J. Repair of pelvic fracture posterior urethral defects using an elaborated perineal approach: experience with 74 cases. J Urol. 1991; 145:744-748.
156. Wong C.H., Wei F.C. Microsurgical free flap in head and. neck reconstruction. Head Neck. 2010; 32(9):1236-45.
157. Wood D.N., Andrich D.E., Greenwell T.J., et al. Standing the test of time: the long-term results of urethroplasty. World J Urol. 2006; 24(3):250-4.
158. Yoshizawa M., Feinberg S.E., Marcelo C.L., et al. Ex vivo produced human conjunctiva and oral mucosa equivalents grown in a serum-free culture system. J Oral Maxillofac Surg. 2004; 62(8):980-8.
159. Yoo J.J., Atala A. Tissue engineering applications in the genitourinary tract system. Yonsei Med J. 2000; 41(6):789-802.
160. Zacchi V., Soranzo C., Cortivo R., et al. In vitro engineering of human skin-like tissue. J Biomed Mater Res. 1998; 40(2): 187-94.
161. Zimmerman W.B., Santucci R.A. A simplified and unified approach to anterior urethroplasty. Nat Rev Urol. 2010; 7(7):386-91.