Системный подход к банкированию пуповинной крови для восстановительной медицины

Яковлева, Мария Валерьевна

Диссертации по медицине → Восстановительная медицина, спортивная медицина, лечебная физкультура, курортология и физиотерапия

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.11) на тему:Системный подход к банкированию пуповинной крови для восстановительной медицины

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Яковлева, Мария Валерьевна Москва 2010 г.

Ученая степень: доктора медицинских наук

ВАК РФ: 14.03.11

Автореферат диссертации по медицине на тему Системный подход к банкированию пуповинной крови для восстановительной медицины

'32

Яковлева Мария Валерьевна

СИСТЕМНЫЙ ПОДХОД К БАНКИРОВАНИЮ ПУПОВИННОЙ КРОВИ ДЛЯ ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

14.03.11

«Восстановительная медицина, спортивная медицина, лечебная физкультура, курортология и физиотерапия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

- 9 лен 2010

Москва

-2010

004616732

Работа выполнена в ГУЗ г. Москвы «Банк стволовых клеток Департа здравоохранения г. Москвы», ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский испытательный институт медицинской техники» Росздравнадзора.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

О.А.Машков М.Е.Рождественский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Ю.Г. Боженков Ю.Л.Веневцева Л.Б. Лазебник

Ведущее учреждение: Институт детской гематологии и трансплантологии Р.М.Горбачевой Санкт-Петербургского государственного медицинского университета И.П.Павлова

на заседании диссертационно] _ _ г, , Всероссийс

научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техни Росздравнадзора. Адрес: 129301, г. Москва, ул. Касаткина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУ «Всероссийс научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техни Росздравнадзора. Адрес: 129301, г. Москва, ул. Касаткина, 3

Автореферат разослан «_»_2010 г.

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Цыганова Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной из самых актуальных проблем современной медицины является охрана оровья, для решения которой разработаны и утверждены соответствующие концепции и юграммы, цель которых - сохранение и восстановление здоровья человека. Социальное ачение восстановительной медицины состоит в ограничении формирования потока льных, поддержании оптимальной работоспособности и качества жизни. Разработка вейших корригирующих технологий, направленных на сохранение и восстановление 'нкциональных резервов организма человека, восстановление его оптимальной ботоспособности является основной стратегией современной восстановительной дицины (Разумов А.Н., Бобровницкий И.П. 2002, 2003; Косорлукова Т.В., 2005). Для льнейшего развития клеточного направления восстановительной медицины чрезвычайно гуален вопрос подготовки достаточного количества эффективного и безопасного еточного материала для повышения регуляторных, компенсаторных и адаптивных зможностей организма.

После появления первых публикаций об успешном проведении трансплантаций попоэтических стволовых клеток (ГСК) пуповинной крови (ПК) в конце 80-х гг. XX века, чали свое развитие первые банки ПК (Gluckman Е., 1989). ПК, представленная для пользования криобанками, в настоящее время является альтернативным костному мозгу точником гемопоэтических стволовых клеток, применяемых для трансплантации у детей и зослых при ряде злокачественных заболеваний, синдромах недостаточности костного зга, гемоглобинопатиях и некоторых генетических метаболических расстройствах luckman Е., 2006, 2010; Rocha V., 2006). Мировая ассоциация доноров костного мозга rorld Marrow Donor Association - WMDA) собирает информацию о числе заготовленных л ниц банками ПК по всему миру начиная с 1999 года. На 2008 год WMDA сообщает о стельности 112 банков, которыми заготовлено более 450 тыс. единиц ПК. В настоящее гмя в Европе существует 18 банков ПК, которые получили аккредитацию в NetCord-FACT ще 40 находятся на стадии регистрации (Navarrete С., 2009). На настоящий момент в мире полнено более 10000 трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток с толкованием ПК (Majhail N.S., 2006). По данным Gluckman T., Rocha V. начиная с 2006 Ш около 20% трансплантаций стволовых клеток, проводимых в Европе пациентам в ipacre до 20 лет, являются трансплантациями ПК (http://www.worldmarrow.org/). Это вдетельствует о том, что ПК является ценным клеточным ресурсом для тех пациентов, горым не был найден совместимый донор костного мозга, особенно это важно для групп шческих меньшинств. Особенности ГСК ПК являются предпосылкой для увеличения шчества трансплантаций с их применением. (Wagner J. Е., 1992; Harris D. Т., 1996; Kogler 1996; Ikuta К., 1998; Rubinstein P., 1999; Gluckman E„ 2005, Querol S., 2009). Увеличение :тупного пула единиц ПК улучшает вероятность обнаружения донорского материала с

мальными характеристиками. \ л

\ \ / ! \ " /

Успех трансплантации во многом зависит от достаточного количества ГСК, поэт важным вопросом применения ПК в клинической практике является оценка качес трансплантата. (Bender J.G., 1994; Gonzalez В.Е., 1997; Traîneau R., 1998; Allan D.S., 20 Cotta S.V. et al., 2002; Marino M.P. et al., 2002). Главной причиной клинических иммунологических проблем после трансплантации и основным лимитирующ фактором выбора донора является HLA-несовместимость.

Популяционные исследования полиморфизма генов главного компле] гистосовместимости, проведенные у больных гемобластозами, свидетельствуют ассоциативной связи системы HLA с острым лейкозом, как у взрослых, так и у детей. (Do: М.Т. 1992, 1996, 1999; Tayler G.M. 2002, 2008, 2009; Тананов А.Т. 1982; Хамаганова Е. 1989; Зарецкая Ю.М., 2000, Рий A.A., 2007). Современные данные изучения HLA систе: при острых лейкозах у детей практически отсутствуют.

Изучение и разработка высокотехнологичных методов банкирования ПК определение стратегии HLA- типирования представляются актуальной задачей, так i позволяют расширить возможности для восстановления функциональных резер! организма у большого количества пациентов, к которым неприменимы стандартн протоколы диагностики и лечения.

В связи с изложенным, целью настоящего исследования явилась разработ системного подхода и научно обоснованной технологии банкирования пуповинной крови применением высокотехнологичных и молекулярно-генетических методов восстановительной медицине.

Задачи исследования:

1. Исследовать совокупность анте- и интранатальных факторов, оказывающих влияние состав и эффективность выделения ГСК ПК.

2. Проанализировать клеточный состав, иммунологическую характеристику, урове спонтанного апоптоза лейкоцитов, общее количество, жизнеспособность и эффективно! клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц ГСК ПК.

3. Оценить влияние технологий обработки ПК на качество и эффективность выделег мононуклеарной фракции.

4. Оптимизировать алгоритм использования различных молекулярно-генетических метох HLA-типирования при банкировании ПК и исследовать генетический полиморфи антигенов гистосовместимости у здорового населения московского региона.

5. Исследовать характер распределения специфических генов HLA-системы при остр лейкозах у детей и глютенчувствительной целиакии, а также выявить HLA-марке предрасположенности / устойчивости к ним.

6. Разработать технологический алгоритм и научно обосновать системный подход банкированию ПК для восстановления функциональных резервов организма трансплантаций в восстановительной медицине.

Научная новизна

Впервые на большом фактическом материале ПК определена совокупность анте- и ггранатальных факторов, оказывающих влияние на состав и эффективность выделения Ж.

Впервые показано, что результаты автоматического гематологического анализатора и ¡етооптической микроскопии независимы друг от друга и взаимно дополняют референтные тчения клеточного состава ПК. Получены данные уровня спонтанного апоптоза ¡йкоцитов в ПК, общего количества, жизнеспособности и эффективности клонирования мопоэтических колониеобразующих единиц в конечном клеточном продукте, которые фактеризуют эффективность материала для неродственной трансплантации и ^становления функциональных резервов организма.

Впервые в России оптимизированы процессы проведения исследований и оценки ¡зультатов НЬА-типирования большого количества образцов ПК здоровых новорожденных периферической крови при различных заболеваниях, представленные двумя элекулярными высокотехнологическими методами, такими как 880 на автоматическом юцессоре и ББР, позволяющие получать достоверную и однозначную информацию.

Впервые на большом фактическом материале изучен характер распределения НЬА юцифичностей класса I и II у здорового населения московского региона и установлен юфиль генов НЬА системы, соответствующий европеоидам.

Впервые получены данные об особенностях распределения специфических аллелей нов НЬА системы, охарактеризованы дополнительные общие маркеры »едрасположенности /устойчивости при лейкозах у детей и при глютенчувствительной лиакии.

Впервые разработан и внедрен системный подход и оптимизирован технологический горитм комплексного использования высокотехнологичных методов сбора, оценки, стирования, криохранения ГСК ПК, что позволило получать качественный, эффективный безопасный клеточный материал.

Практическая значимость работы

Практическое значение работы заключается в том, что

Установлена необходимость совместного использования методов автоматического «счета клеток и светооптической микроскопии, взаимно дополняющих референтные ачения клеточного состава ПК.

Совокупность показателей общего количества клеток, уровня спонтанного апоптоза йкоцитов, клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц определяет «неспособность и эффективность клеточного материала ПК.

Использование системного подхода и технологического алгоритма в банкировании < позволяет получать эффективный и безопасный клеточный материал.

Предложена стратегия HLA типирования с применением технологий SSO и S которая может быть применена в медицинских учреждениях. Профиль распределения геь главного комплекса гистосовместимости у здорового населения московского региона мож быть использован в качестве группы сравнения в области изучения «HLA и болезни» и популяционных исследованиях.

Основные положения, выносимые на защиту

Изучение совокупности анте- и интранатальных факторов, антропометрическ данных и пола новорожденного, различных состояний острой и хронической гипокс плода позволяет оценить их влияние на состав и эффективность выделения ГСК ПК д восстановления функциональных резервов организма.

Эффективность клеточного материала ПК для восстановления функциональн] резервов организма характеризуют количественный и качественный клеточный состав П определенный с применением автоматического гематологического анализатора светооптической микроскопии; уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, общ количество, жизнеспособность, эффективность клонирования гемопоэтическ колониеобразующих единиц.

Стратегия применения методов HLA-типирования образцов пуповинной крот представленная двумя технологиями, такими как SSO и SSP, позволяет проводить быстр; обработку большого количества биоматериала и получать достоверные и однозначт результаты.

Исследование полиморфизма генов HLA-системы позволяет изучить характ распределения аллельных специфичностей среди здорового населения московск популяции и обнаружить маркеры, определяющие риск или устойчивость к возникновеш заболеваний, таких как лейкозы у детей и глютенчувствительная целиакия.

Комплекс усовершенствованных высокотехнологичных методов сбора, оцеш тестирования, хранения ГСК ПК, является оптимальным, позволяет получать однозначнук достоверную информацию и требует для исследования минимального количест биоматериала.

Обоснованый и внедренный системный подход в банкировании ПК позволя получать эффективный клеточный материал для повышения регуляторных, компенсаторш и адаптивных механизмов организма и дальнейшего развития клеточного направлен восстановительной медицины.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследования внедрены в работу ГУЗ «Банк стволовых клет Департамента здравоохранения г. Москвы».

Работа выполнена на базе ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамен здравоохранения г. Москвы», ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский испытательный институт медицинской техники» Росздравнадзора, ЦПСиР ДЗ г. Москв

родильном доме № 10 Управления здравоохранения ЮЗАО г. Москвы, родильном доме № 8 Управления здравоохранения ЮВАО г. Москвы, родильном доме № 17 Управления здравоохранения CAO г. Москвы и городской больнице № 8 Управления здравоохранения АО г. Москвы, ФГУ «Федеральный научно-клинический центр деткой гематологии, нкологии и иммунологии», научно-исследовательном институте гастроэнтерологии .епартамента здравоохранения города Москвы.

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференциях и аучных форумах республиканского и международного уровня, в том числе на Российском ъезде гематологов и трансфузиологов (Москва, 2006), Stem cell therapy meeting 'егенсбург, 2007), Всероссийском симпозиуме «Актуальные вопросы тканевой и клеточной эансплантологии» (Москва, 2007), Российском медицинском форуме «Проблемы зансплантации пуповинной крови» (Москва, 2007), III Всероссийском симпозиуме Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007), 35 [еждународном симпозиуме Европейской группы ЕВМТ (Гетеборг, 2010г.), V еждународном симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических 1болеваний у детей» (Москва, 2009), XIV конгрессе педиатров России с международным гастием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2010г.), 5 иммуногенетической еждународной конференции «East-West Immunogenetics Conferece» (Пилсен, 2010г.), 36 [еждународном симпозиуме Европейской группы ЕВМТ (Вена, 2010г.), III научно -зактической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных |упп заболеваний, лабораторный анализ» (Москва, 2010), 24 Европейской конференции по кшуногенетике и гистосовместимости (European Immunogenetics and Histocompatibility onference, EFI and 17 the Italian Society for Immunogenetics and Transplantation, AIBT) Флоренция, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 44 научные работы в периодической печати, как в >ссии, так и за рубежом, в том числе 10 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 298 страницах печатного текста и состоит из следующих □делов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х ав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и иска литературы. Диссертация иллюстрирована 159 таблицами и 48 рисунками. 1блиографический указатель содержит 35 источников отечественной и 312 источников рубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

1. Образцы (ПК) 3964 доношенных новорожденных, полученные п] физиологических и оперативных родах, прошедшие тестирование и внесенные в реес неродственных доноров в г. Москве за период с 2003 по 2010гт. Поскольку ряд показатеж оценивались ретроспективно по данным медицинской документации, то не во всех случа: количество данных, включенных в расчет, совпадает с количеством образцов ПК. Сведем об общем объеме проведенных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Объем проведенных исследований

Наименование показателей Количество

Общее количество образцов пуповинной крови 3964

Сведения о течении беременности 1564

Сведения о количестве предшествующих родов 3964

Масса плаценты 3299

Степень зрелости плаценты 2995

Сведения о течении родов 2995

Подсчет клеток крови 3964

Выделение клеточного концентрата 3964

Степень разведения образцов ПК 3964

Оценка количества субпопуляций лейкоцитов и ГСК 3964

Оценка колониеобразующей активности лейкоцитарной 3964

Определение уровня некроза и спонтанного апоптоза 3964

НЬА-типирование 3964

Сбор ПК проводили после пережатия и пересечения пуповины производили пункци сосудов пуповины специальной закрытой системой для забора ПК фирмы Green Сго объемом 250 мл, содержащей 35,5 мл антикоагулянта CPDA. Сбор крови осуществляли течение 2-15 минут после родов (менее 5 минут - 3345 случаев (84,4%), от 5 до 10 минут 345 случаев (8,7%) и более 10 минут - 274 (6,9%)), до отделения плаценты (п=3904 (98,5% В случае сбора крови после отделения плаценты (п=50 (1,5%)), последняя помещалась специальную стерильную стойку и проводилась аналогичная процедура сбора. Полученнь материал хранили в темном месте при комнатной температуре и подвергали анализу i позднее 36 часов после процедуры сбора ПК.

Особенности течения беременности проанализированы у 1564 роженицы, ере; которых - полностью здоровыми были 248. Из 3964 новорожденных 2261 родились результате первых родов, 1136 - вторых, 350 - третьих и 100 - роды четвертые и более (' человек - 4-е роды, 14 - 5-е и 13 - 6-е). Процент мальчиков и девочек среди груп составленных по порядковому номеру родов, не отличался. В каждой из групп девочек мальчиков было приблизительно поровну. Масса плаценты проанализирована в 32!

случаях. Средняя масса плаценты в группе составила - 580,57±4,92, диапазон: 77,0 г -1138,0 г. Течение и осложнение родов прослежены у 1331 новорожденного. Все новорожденные были разделены на группы согласно способу родоразрешения: самостоятельные роды и роды путем кесарева сечения. Медиана длительности безводного промежутка составила 5 часов (от 20 минут до 19 часов 20 минут). Медиана длительности II периода родов (от начала потуг до рождения ребенка) составила 30 минут (от 10 минут до 1 часа 35 минут). Из 3964 образцов, для которых доступны данные относительно пола ебенка, мальчиков и девочек было 2069 (52,2%) и 1895 (47,8%), соответственно. Средняя асса при рождении была несколько выше у мальчиков (3629,24±18,25 г.; диапазон 2270000 г.), чем у девочек (3467,23±18,17 г.; диапазон 2300-4650 г.) (р<0,0001). Из 1564 оворожденных у 232 отмечалось изменение цвета околоплодных вод (224 - зеленые воды и - кровянистые), что является косвенным признаком внутриутробной гипоксии плода, у 180 - во время беременности была диагностирована внутриутробная гипоксия плода, у 361 — гмечалось обвитие пуповины при рождении, у 109 - отмечалась внутриутробная задержка 1звития плода. Медиана гестационного возраста в группе без внутриутробной задержки ивития составила 40 недель (диапазон 33-42), а в группе с задержкой развития - 38 недель шапазон 37-41). Все новорожденные, у которых имелись сведения о степени зрелости паценты на момент родов, были разделены на три группы по степени зрелости плаценты.

Выделение клеточного концентрата, содержащего стволовые клетки, проводилось в ;ептических условиях, в «чистом» помещении класса D двумя методами: методом зойного центрифугирования и аппаратным методом с помощью клеточного сепаратора Верах S100», Biosafe, Switzerland (1986 и 1978 образца, соответственно). Все обработанные 5разцы были подвергнуты криоконсервации в роботизированном криокомплексе 3ioArchive®", ThermoGenesis, USA. Непосредственно перед криоконсервацией, в каждый зразец добавлялся криопротектор DMSO в смеси с декстраном-40 в количестве 20% от зъема конечного продукта для предотвращения разрушения клеток концентрата ПК под «действием сверхнизких температур.

Степень разведения образцов ПК антикоагулянтом была различна и зависела от 5ъема собранной крови. Объем антикоагулянта в системе постоянный и составляет 35,5 мл, Зъем собранной крови колебался в пределах от 20,0 до 170,0 мл. Пересчет результатов соматического анализа крови проводился с учетом степени разведения каждого образца 1Я каждого показателя.

Подсчет клеток ПК производился двумя методами:

• все 3964 образцов ПК были подвергнуты анализу на автоматическом счетчике 1еток крови АВХ Pentra 60 С+ в режиме автоматической аспирации с определением 26 фаметров;

• для точной морфологической характеристики клеток ПК использовали мазки, ■оашенные по методу Паппенгейма-Крюкова (комбинированная окраска фиксатором-

красителем Мая-Грюнвальда и краской Романовского). Количество нормоблас определяли при подсчете лейкоцитарной формулы на 200 последовательно встречающих лейкоцитов с дальнейшим пересчетом на 100 (нормобласты/ЮОлейкоцитов).

Количество субпопуляций лейкоцитов и гемопоэтических стволовых клет определялось по экспрессии мембранных маркеров (CD - clusters of differentiation) в реакц) прямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами CD3, CD4, CD8, CD1 CD 14, CD 16, CD 19, CD25, CD30, CD31, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD56, CD6 CD62L, CD62E, CD71, CD90, CD106, CD117, CD133, HLA-DR «Becton Dickinson», США п] помощи проточной цитометрии на приборе FACSCalibur «Becton Dickinson», США.

Колониеобразующую активность лейкоцитарной фракции ПК определялась дву! методами:

1. культивирование в течение 14 суток в метилцеллюлозе (готовая среда, содержащ факторы роста «MethoCult 4338, StemCellTehnologies, Canada) с подсчетом количества КО mix, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э.

• Эффективность клонирования (ЭК) определяли как общее число КОЕ на 1 х 1 эксплантированных клеток

• Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в мл ПК, полученные величины эффективности клонирования умножали на чиа мононуклеарных клеток в 1 мл крови.

2. Культивирование в течение 7 суток в полутвердой среде в системе «агаровая кап. - жидкая среда» в с расчетом следующих показателей:

• колониеобразующая (КОС) и кластерообразующая (КлОС) способность - чиа колоний (малые-20-40 клеток, средние- 41-100 клеток и большие - более 100 клеток) кластеров (малые - 5-9 клеток, большие - 10-19 клеток) на 1 х 105 эксплантированнь клеток.

• эффективность клонирования (ЭК) - общее число колоний и кластеров на 1 х 1 эксплантированных клеток

• для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в мл крови, полученные величины эффективности клонирования умножали на чиа мононуклеарных клеток в 1 мл крови.

• пролиферативный потенциал (ПП) - отношение числа колоний к кластерам культуре.

Уровень некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцит«

ПК. Исследование проводилось при помощи проточной цитофлюориметрии дву»

методами: определение количества клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК щ

окрашивании Propidium iodid (PI) и определение числа локусов связывания мембранно

фосфатидил-серина в реакции прямой иммунофлюоресценции с использованием Annexin

FITC ("Phar Mingen"), согласно инструкциям производителей. Результаты реакщ

анализировали на проточном цитофлюориметре FACScan ("Becton Dickinson", США). Обработку полученных данных производили при помощи программы WinMDI 2.8 for Windows. Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов клеток ПК определяли как сумму PI+/Annexin V+ и РГ/Annexin V+ клеток, а уровень некроза, как количество PI+/Annexin V" клеток.

Исследование генетического полиморфизма HLA системы ПК. Были исследованы образцы пуповинной крови условно здоровых детей. Геномная ДНК выделялась из образцов ПК методом сепарации на магнитных частицах. Характеристики выделенной ДНК, её концентрацию и степень чистоты, измеряли с помощью спектрофотометра. Концентрация ДНК измерялась против чистого элюирующего раствора по оптической плотности OD260/280 Образцы для исследования соответствовали предъявляемым стандартным требованиям: концентрация ДНК была > 50 нг/мкл, и А260/280 составляло 1,7-1,9. Генотипирование проводили методом гибридизации с помощью олигонуклеотидных зондов. Считывание и интерпретация результатов проводилась с помощью сканирующего устройства и компьютерной программы РМР. Данным методом выявлялись HLA-специфичности по всем исследуемым локусам на уровне групп аллелей. Образцы, у которых были получены войные интерпретации результатов, дополнительно типировали методом ПЦР с помощью ллель-специфических праймеров. Регистрация сигналов электрофореграммы, ютографирование изображения и документирование их в электронном виде существлялось с помощью гельдокументирующей системы «ДиДжиДок» (США) и с спользованием компьютерной программы UPV. Интерпретацию результатов проводили с омощью таблиц фирмы - производителя праймеров.

2. Образцы периферической крови 187 детей с диагнозом OJIJI и 146 детей с иагнозом OMJI (112 мальчиков и 75 девочек, в возрасте от 6 мес. до 17 лет, средний эзраст составил 8,3 лет ± 4,6) и 146 детей, больных OMJI (88 мальчиков и 58 девочек, в эзрасте от 6 мес. до 17 лет, средний возраст составил 8,9 лет ± 5,2). Все пациенты имели еблагоприятный прогноз и нуждались в дальнейшей трансплантации ГСК. В зависимости г иммунологического варианта дети, больные OJIJI, были разделены на три группы: 1 )уппа B-OJIJI (98 пациентов); 2 группа T-OJIJI (37 пациентов); 3-ю группу составляли дети, неустановленным иммунологическим вариантом (52 пациента). Дети, больные OMJI, были оделены в зависимости от цитоморфологической характеристики заболевания в ютветствии с FAB классификацией на группы: М2 - 28 больных, М4 - 26 больных, М5 - 28 эльных и М7 - 18 больных. Группы больных вариантами OMJI МО (5 детей), OMJI Ml (5 гтей) и Мб (4 ребенка), были малочисленными и потому не были включены в следование. Помимо этого, была выделена группа с неустановленным морфологическим фиантом (32 ребенка).

3. Образцы периферической крови 46 пациентов с диагнозом ГЦ, разделенные на группы: 1 основная группа 28 детей в возрасте от 1 года до 17 лет (средний возраст - 7,53

+ 4,9, медиана составила - 6,0) и 18 взрослых от 19 лет до 81 года (медиана - 51,0, сред возраст - 48,4 ± 17,3) с установленным диагнозом ГЦ (всего 45 пациентов). Диагноз ГЦ бь установлен в соответствии с критериями ESPGHAN. 2 группа сравнения была представле] образцами ПК условно здоровых детей.

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли использованием критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони и тесту Ньюмена-Кейлса; д. вариационных рядов с непараметрическим распределением с помощью критерия Крускалл Уоллеса и критерия Манна-Уитни. Статистический анализ исследования ассоциащ проводился с использованием двупольной таблицы при помощи программы «Open Ер (Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health), версия 2.3 (2009/20/05). Полученнь результаты обработаны методами вариационной статистики пакета Excel Microsoft программы «Biostat», «SISA» и «EpiMax Table Calculator». При расчетах использоваг программы Excel 2002 Pro, STATISTIKA for Windows 8.0, Biostat for Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В развитии клеточного направления восстановительной медицины чрезвычаш актуален вопрос подготовки достаточного количества эффективного и безопасно] клеточного материала, применение которого при различных заболеваниях повыа регуляторные, компенсаторные и адаптивные механизмы возможности организма.

Особенности клеточного состава ПК новороиеденных

Результаты исследования количества клеток и их основных параметров бы;

проанализированы и представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Референтные значения клеточного состава ПК (п=3964)

Лейкоцитарная формула (M+m)

WBC/(xl09/n) 17,24 + 0,16

NEU/(xl0%) 8,41 ±0,10

LYM/(xl0%) 5,54 ± 0,06

МОЩхЮ9/л) 2,42 ± 0,033

EOS/(xlO%) 0,64 ±0,01

BAS/(xl0%) 0,23 ± 0,01

RBC /(х1012/л) 4,40 ±0,01

HGB/(rAi) 157,4 + 0,46

HCT(%) 32,29 + 0,14

МС\7(фл) 105,81+0,12

МСН/(пг) 35,83 + 0,04

МСНС/(пг) 338,6 + 0,24

RDW (%) 12.71+0,02

МСН/(пг) 35,83 + 0,04

PLT / /(х109/л) 307,54 ±1,97

MPV / (фл) 7,18 ±0,02

ПК характеризуется тем, что наряду со зрелыми элементами нейтрофильного ряда, содержит повышенное количество палочкоядерных нейтрофилов и более молодые формы -метамиелоциты и миелоциты, поэтому скрининг состава и характеристик клеток ПК, проводимый при помощи автоматических счетчиков клеток крови в работе банков ПК не вполне удовлетворителен. При исследовании ПК окрашенные мазки оценивали с помощью световой микроскопии. Полученные результаты (средние величины по группе) затем сравнивались с величинами, полученными при исследовании тех же образцов пуповинной крови при помощи автоматического анализатора клеток крови. Отмечено, что при автоматическом анализе занижается процентное соотношение нейтрофилов, а лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и базофилов увеличивается. Все изменения были статистически достоверны (табл. 3.).

Таблица 3.

Различия клеточного состава ПК при подсчете клеток при помощи автоматического

анализатора и светооптической микроскопии, в % (п=3964)

[ейкоцитарная формула Автоматический анализ (М+ш) Ручной подсчет (М+т)

гаи 47,48+ 0,44 57,48+ 0,47

ЬУМ 32,76+ 0,36 28,66+ 0,43

МОЫ 14,64 +0,124 9,95+ 0,19

ЕОБ 3,86+0,10 3,28+0,13

ВАБ 3,41+0,04 0,61+0,03

Примечание. р<0,0001

Установлено, что при большом содержании в ПК лейкоцитов и нормобластов величивается степень различий в определении базофилов (г=-0,44, р<0,0001), лимфоцитов =-0,25, р<0,0001), нейтрофилов (г=-0,22, р<0,0005). Полученные закономерности не шисят от сроков гестации, степени разведения образца ПК антикоагулянтом, времени, рошедшего после родов до начала сбора и обработки ПК.

Иммунологическую характеристику клеточного состава ПК (количество СБ34+ клеток ПК) определяли с помощью проточной цитометрии и оценивали как два параметра: роцент от общего количества лейкоцитов - 0,827+ 0,023 и абсолютное количество СИ 1еток - 0,100+0,003 в 1мл ПК. Оценивали количество С034+С0133+ клеток, как наиболее 1ннис предшественники гемопоэза, СБ133 СБЗГ - эндотелиальные предшественники, 0133+С0Ю6+ - мезенхимальные стволовые клетки; количество пролиферирующих :мопоэтических предшественников определяли по уровню экспрессии трансферринового

рецептора (С071) в ПК и концентрате - достоверных различий не было выявлено, 1 свидетельствует о качестве полученного концетрата стволовых клеток.

Количество колоний оценивалось на 105 МЫС и на 1 мл ПК. Также подсчитывая процент колоний каждого вида от их общего количества. Выявили преобладание раннг ГСК - КОЕ-ГЕММ-3 5,3 % (рисунок 1.).

% 40

30 ■

20 ■

10 •

0 ■

КОЕ-mix КОЕ-ГМ КОЕ-г КОЕ-М КОЕ-Эр

Рисунок 1. Распределение колониеобразующих единиц пуповинной крови

Была установлена статистически значимая положительная корреляционн; взаимосвязь между процентом CD34+ клеток в ПК и количеством KOE-mix в 1 мл образи (г=0,231; р=0,013), и между абсолютным количеством CD34+ клеток в ПК и KOE-mix в 1 образца (г=0,3888; р=0,001), КОЕ-ГМ (г=0,4285; р=0,001), КОЕ-Г (r=0,2887; р=0,0018), KOJ: М (г=0,3197; р=0,0005) и общим количеством КОЕ в мл образца (г=0,4187; р=0,001). Прямь корреляционных взаимосвязей между сроком гестации и количеством КОЕ не бьи выявлено. Уровень некроза лейкоцитов ПК составил 3,49 ± 0,28 %, при этом, урове] некроза лимфоцитов был ниже значений всех лейкоцитов (2,99 ± 0,34 %) и статистичеи значимо отличался от уровня некроза моноцитов и гранулоцитов, составлявшего 5,59 ± 0,' -% и 6,12 ± 0,65 % соответственно (р < 0,0001) (рис. 2.).

6.12

ГЗ I

4.32

■

Некроз(%)

Апоптоз (%)

|дЛимфоциты ЕЗМоноциты ДГранулоциты |

Рисунок 2. Уровень некроза и спонтанного апоптоза лейкоцитов ПК

Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов составил 9,18 ± 1,19 %. Уровеи спонтанного апоптоза лимфоцитов был ниже значений в общей группе (4,32 ± 0,7 %), г статистически отличался от уровня спонтанного апоптоза моноцитов и гранулоцитов (15,Г ± 2,02 % и 28,22 ± 2,51 % соответственно, р < 0,0001).

Такое соотношение показателей позволяет предположить большую жизнеспособност: лимфоцитов, что представляется позитивным результатом, учитывая тот факт, ч-популяция ГСК находится в пуле лимфоцитов. Это предположение подтверждает':

положительной корреляционной взаимосвязью количества лимфоцитов и колониеобразующей активностью ПК (табл. 4.).

Таблица 4.

Взаимосвязь количества лимфоцитов и колониеобразующей активности ПК

Лимфоциты

г Р

KOE-mix 0,399 <0,001

КОЕ-ГМ 0,4993 < 0,001

КОЕ-Г 0,4467 < 0,001

КОЕ-М 0,4995 < 0,001

КОЕ-Эр 0,2068 0,0018

КОЕ-сумма 0,5634 <0,001

Примечание: г - коэффициент корреляции; р - достоверность

При изучении взаимосвязи уровня спонтанного апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активности клеток ПК оказалось, что отмечается положительная корреляционная взаимосвязь между уровнем спонтанного апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активностью пуповинной крови, что доказывает однонаправленность процессов апоптоза и пролиферации (табл. 5.).

Таблица 5.

Взаимосвязь уровня апоптоза лимфоцитов и колониеобразующей активности ПК

Доля лимфоцитов на разных стадиях апоптоза

г Р

KOE-mix 0,4427 0,0208

КОЕ-ГМ 0,2948 0,1525

КОЕ-Г 0,3537 0,0828

КОЕ-М 0,3003 0,1447

КОЕ-Эр 0,1221 0,544

КОЕ-сумма 0,3677 0,0706

Примечание: г - коэффициент корреляции; р - достоверность

При исследовании клеточного состава ПК в зависимости от пола было выявлено, что девочек уровень лейкоцитов выше (17,74±0,24 х109/л; М±ш), чем у мальчиков (16,8±0,23 109/л; М±ш). В абсолютных количествах у девочек также больше нейтрофилов, но меньше эзинофилов (табл. 6.).

Было установлено, что количество эритроцитов (4,33±0,02 х1012/л) и содержание гмоглобина (155,1±0,7 г/л) у девочек меньше, чем у мальчиков (4,46±0,02 х1012/л; 159,5±0,6 'л; р<0,0001).

Таблица 6.

Зависимость лейкоцитарной формулы от пола новорожденного (М+т)

Пол WBC(xl0%) Лейкоцитарная формула (%)

NEU LYM MON EOS BAS

Девочки п 1920 1920 1920 1920 1920 1920

М+т 17,74+0,24 49,97+0,35 31,57+0,15 13,75 3,48+0,07 1,26+0,03

Мальчики п 2044 2044 2044 2044 2044 2044

М+т 16,80+0.23 47,10+0.34 33,23+0.30 14,29+0.17 4,16+0.09 1,18+0.03

Примечание. р<0,001

Гематокрит у девочек (31,79±0,2 %) также меньше. (32,76±0,19 %; р=0). Различий эритроцитарных индексах (MCV, МСН, МСНС, RDW) в зависимости от noj новорожденного не обнаружено. Количество тромбоцитов у девочек (314,87±2,98 х109/. больше, чем у мальчиков (300,72±2,62 х109/л; р<0,0001). CD34+ клеток больше в процентно (0,88±0,03 - мальчики; 0,77±0,03 - девочки; р=0,01) и в абсолютном количестве (0,106±0,0С - мальчики; 0,095±0,005 - девочки; р=0,002) (табл. 7.).

Таблица

Количество CD34+ клеток в ПК доношенных новорожденных.

Пол ребенка Параметры CD34 (%) CD34 (Ю'/тт3)

Девочки п 1920 1920

М+т 0,769+0,032 0,095 +0,005

Мальчики п 2044 2044

М+т 0,883 ±0,032 0,106± 0,005

Примечание. р<0,001

При изучении колониеобразующей активности ПК установлено, что у мальчике больше количество КОЕ-ГМ в 1 мл ПК (745,71±65,11 - девочки; 1216,7±185,45 - мальчик: р=0,022), имеется тенденция к увеличению количества КОЕ-М (691,64±78,6 - девочю 1052,1±252,09 - мальчики; р=0,19) и общего количества колоний (4883,13±455 - девочю 6070,8±691 - мальчики; р=0,16) в 1 мл образца ПК. При анализе эффективное! клонирования (на 105 МЫС) у мальчиков также больше КОЕ-Г (18,44±1,31 - девочк: 22,42±1,6 - мальчики; р=0,058). В процентном соотношении имеется тенденция увеличению количества КОЕ-гтх (р=0,11) у девочек, и уменьшению у них КОЕ-ГМ (р=0,1 и КОЕ-Эр (р=0,14).

Связь клеточного состава с массой тела новорожденного очень слабая: достоверн; положительная корреляция с массой тела ребенка обнаружена для нейтрофилов (г=0,1 р=0,0002), эозинофилов (г=0,14; р=0,0001), базофилов (г=0,12; р=0,0002) и гематокри-(г=0,2; р<0,0001). Все новорожденные были разделены на группы согласно массе тела пр рождении: <2500 г; 2500-3000 г; 3000-4000 г и >4000 г. При сравнении полученных даннь отмечено, что с увеличением массы тела ребенка при рождении увеличивается количесп

лейкоцитов - от 15,52±0,59 х109/л до 17,51±0,44 х109/л (р=0,01). Увеличивается абсолютное количество нейтрофилов и эозинофилов (р<0,0001 и р=0,004, соответственно), а количество моноцитов уменьшается (р<0,0001). В процентном соотношении у детей с большей массой тела нейтрофилов и эозинофилов больше, а лимфоцитов и моноцитов меньше. Концентрация гемоглобина и количество эритроцитов не зависят от массы тела ребенка. Отмечено увеличение гематокрита с увеличением массы тела ребенка (от 28,48±2,47% до 33,86±0,39 %; р<0,0001). Отмечено также уменьшение МСНС (р<0,0001) и увеличение MPV (р=0,025) с увеличением веса ребенка. При проведении регрессионного анализа достоверных корреляционных взаимосвязей количества СБ34+клеток и колониеобразующей активностью ПК и массы ребенка не получено. Наиболее статистически значимо увеличение среди КОЕ-mix (р=0,096).

Влияние технологического процесса на биологические свойства ПК.

Известно несколько методов редукции объема ПК и некоторые их недостатки, такие как длительный процесс центрифугирования и недостаточная надежность, сильно связанная с опытом и квалификацией оператора. Внедрен в эксплуатацию принципиально новый клеточный сепаратор, адаптированный к клеточным суспензиям малого объема (Sepax, Biosafe S.A., Eysins/Nyon, Швейцария). Эта система состоит из процедуры цитафереза с эффективной редукцией объема в функционально замкнутой системе. Конечный продукт собирается прямо в мешки для замораживания и может быть заморожен немедленно после добавления диметилсульфоксида (ДМСО). Ряд факторов, влияющих на клеточный состав и характеристики клеток ПК, может выходить за стандартные рамки программирования процесса сепарации. Эффективность метода автоматического выделения и метода двойного центрифугирования сравнили в условиях ситуаций, равных для каждого из методов.

Проводимая для уменьшения объема ПК крови процедура лейкоконцентрации, влияет на соотношение количества клеток ПК. Полученные данные представлены в таблице 8.

Таблица 8.

Клеточный состав ПК и концентрата (х 10%) (п=3964)

WBC NEU LYM MON EOS BAS

Клеточный состав ПК (х 109/л)

М+т 17,24+0,48 8,41+0,10 5,54+0,06 2,42+0,03 0,64+0,01 0,23+0,01

Клеточный состав концентрата ПК (х 107л)

М+т 39,00+0,48 18,30+0,27 13,10+0,19 5,20+0,08 1,10+0,01 0,20+0,01

Показано, что при проведении процедуры концентрации ПК, основанной на процессе

седиментации эритроцитов под действием гидроксиэтилкрахмала, доля нейтрофилов не

изменяется, доля лимфоцитов статистически значимо повышается (рис.3) за счет того, что

доля моноцитов, эозинофилов и базофилов статистически значимо снижается (рис.4). Это,

по-видимому, связано с большей потерей этих клеток при концентрации.

□ Пуповинная кровь О Концентрат

Рисунок 3. Доля нейтрофилов и лимфоцитов в пуповинной крови и концентрате мононуклеарной фракции ПК

Моноциты Эозинофилы Базофилы

□ Пуповинная кровь 0 Концентрат

Рисунок 4. Доля моноцитов, эозинофилов и базофилов в ПК и концентрате мононуклеарной фракции ПК.

Абсолютное количество субпопуляций лимфоцитов (СВЗ+клетки, С019+клетю С03+С04+клетки, СБЗ+СВ8+клетки, С016+С056+клетки, НЬА-ОЯ+клетки) такж повышается в процессе процедуры концентрации, но статистически незначимо. Степей повышения повторяет динамику лимфоцитов, определенную при помощи автоматическог счетчика клеток крови.

Полученные данные позволили охарактеризовать состав лимфоцитов ПК продемонстрировали отсутствие влияния процедуры концентрации ПК на количество состав СОЗ+лимфоцитов в сочетании с достоверным увеличением после концентрации дол МК-клеток и СОЗЗ+СБ13+клеток. Доля натуральных киллеров (1ЧК) С016+СБ56+клето среди ядросодержащих клеток пуповинной крови составила 5,97 ± 0,67% и статистическ значимо увеличилась после процедуры концентрации - 8,54 ± 0,91% (р = 0,027). Такс соотношение связано с тем, что при проведении процедуры концентрации лейкоцитов ГО происходит статистически незначительная потеря лейкоцитов вместе седиментирующимися эритроцитами, за счет эозинофилов, базофилов и моноцитов I следовательно, относительное количество ЫК-клеток и миелоидных предшественнике возрастает. Количество СБЗ+ лимфоцитов, опосредующих развитие РТПХ, в результат процедуры лейкоконцентрации практически не менялось и составило 17,9 ± 1,44% и 19,2 1,4% от всех ядросодержащих клеток соответственно. Количество и соотношени субпопуляций СБЗ+лимфоцитов - СБЗ+ С04+ клеток и СБЗ+С08+клеток в процесс

концентрации также не изменилось и составило до концентрации CD3+CD4+raeTKH - 12,62 ± 1,12%, CD3+CD8+toieTKH - 5,62 ± 0,53%; после концентрации CD3+CD4+ioieTKH - 13,23 ± 1,12%, CD3+CD8+ioictkh - 5,52 ± 0,48% от всех ядросодержащих клеток. Относительное количество предшественников миелопоэза - D33+ CD13+ клеток составило 12,5 ± 0,76% и статистически значимо увеличилось 15,82 ± 0,81% (р=0,005) после процедуры выделения, что может быть связано с большей потерей гранулоцитов при проведении процедуры выделения. Доля активированных лимфоцитов в результате лейкконцентрации также не изменилась и составила 0,40 ± 0,08% до выделения и 0,38 ± 0,09% после выделения. Количество С014+клеток не увеличилось и составило 8,65 ± 1,58% до выделения и 9,11 ± 1,76% после. Количество С015+клеток имело тенденцию к снижению, по-видимому, вследствие большей потери при процедуре выделения по сравнению с остальными субпопуляциями лейкоцитов и составило 39,32 ± 3,45% до выделения и 35,23 ± 3,26% после. Процедура лейкоконцентрации не влияет на количество СОЗ клеток, в том числе CD3+CD4+itneTOK и CD3+CD8+KneTOK и активированных лимфоцитов - С025+клеток. В результате процедуры лейкоконцентрации статистически значимо увеличилась доля С019+клеток и натуральных киллеров (NK) CD16+С056+клеток. Процедура лейкоконцентрации не влияет на содержание С034+клеток CD133+iuictok и субпопуляций. Полученные данные имеют важное практическое значение при проведении планирования технологического процесса, так как показано, что при проведении процедуры концентрации ПК, доля нейтрофилов не изменяется, доля лимфоцитов статистически значимо повышается за счет снижения доли моноцитов, эозинофилов и базофилов.

Выделение лейкоцитов в целом меньше при аппаратном методе обработки пуповинной крови (MABК), чем при двойном центрифугировании (МДЦ) (70,28±0,51, 72,4±0,45 - соответственно; р=0,002), а выделение мононуклеаров и лимфоцитов выше, (MNC: 77,94±0,53 70,11±0,49; р<0,0001; лимфоциты: 80,73±0,58 71,7±0,54-соответственно; р<0,0001). Редукция же эритроцитов при МАВК выше, чем при МДЦ (20,85±0,5; 36,45±0,51 - соответственно, р<0,0001).

Оптимизация исследования HLA-типирования ПК и периферической крови у пациентов при различных заболеваниях.

Типирование ПК по HLA-системе имеет свои специфические особенности: необходимость быстрой обработки большого количества биоматериала при ограниченном количестве каждого образца и невозможности его повторного сбора. Поэтому использование чувствительных методов HLA-типирования, требующих для исследования минимального количества ДНК, являются критическим фактором.

Проведение HLA-типирования с использованием двух методов молекулярной биологии. В ГУЗ «БСК ДЗМ» впервые в России была апробирована и успешно внедрена технология обратной дот-блот гибридизации с олигонуклеотидными зондами (SSO) в автоматическом режиме на процессоре Dynal autoRELI™ 48 mk, позволяющая проводить

скрининговое НЬА-типирование большого количества образцов. Для разрешения неоднозначной интерпретации результатов типирования этих образцов проводилось повторное типирование с применением метода ПЦР с аллель-специфическими праймерами (БЗР), что позволило достичь 100% однозначности результатов.

Генетический полиморфизм НЬА-системы в московской популяции здоровых детей.

В настоящее время в ГУЗ «БСК ДЗМ» хранится около 4000 образцов ПК, типированных по пяти локусам системы НЬА-А, -В, -С, -БЯВ, -БС)В1. Установлены 17 специфических групп аллелей локуса НЬА-А, 32 специфичности локуса НЬА-В, 14 специфичностей локуса НЬА-С, 14 специфичностей гена НЬА-В11В1 и 5 специфичностей гена В<ЗВ1. Частота тех или иных генов гистосовместимости среди доноров стволовых клеток во многом зависит от этнических признаков входящих в неё лиц. Анализ распределения НЬА-специфичностей по локусам класса I и класса II (специфических групп аллельных вариантов) определил наиболее часто и наиболее редко встречаемые варианты в московской популяции.

Анализ распределения НЬА-специфичностей у московской популяции определил, что наиболее часто встречаемыми по локусам класса I являются (в долях): НЬА-А*02 (0,288), А*03 (0,134), А*01 (0,114), А*24 (0,096); НЬА-В - В*07 (0,120), В*35 (0,0793), В*44 (0,101), В*18 (0,084), В*08 (0,067), В*13 (0,066); С\у*07 (0,257), Сш*12 (0,134), Сш*06 (0,130), Сш*04 (0,0128).

По классу II с наибольшей частотой встречаются следующие группы аллелей гена 01Ш1 - *07 (0,143), *13 (0,139), *15 (0,133), *11 (0,130), *01 (0,110), *04 (0,110) и группы аллелей гена В()В1 - *03 (0,330), *06 (0,222). Наиболее редко встречающимися группами аллелей были выявлены следующие: А* 69 (0,0033), А*34 (0,00035), А*80 (0,00035), В*47 (0,0036), В* 45 (0,002), В*46 (0,002), В*53 (0,0017), В* 73 (0,0015), В*54 (0,0003) и В*78 (0,0003).

Проведенные исследования и анализ литературных данных (Зарецкая Ю.М., 2008) свидетельствуют, что характер распределения генных частот НЬА класса I и II в популяции московского региона в целом соответствуют таковому для европеоидов.

Характер распределения встречаемости генов НЬА-системы у детей с ОЛЛ. Были обследованы 187 детей с ОЛЛ из различных регионов России. Для изучения характера распределения генов НЬА-системы пациенты, больные ОЛЛ, были разделены в зависимости от их иммунологического варианта на 2 группы: на В-ОЛЛ и Т-ОЛЛ. Была исследована группа из 98 детей с В-ОЛЛ (57 мальчиков и 41 девочка), в возрасте от 6 мес. до 17 лет (средний возраст составил 8,2 лет ± 4,8). Особенности характера распределения генов гистосовместимости в этой группе больных по сравнению с группой сравнения здоровых детей представлены на рис. 5.

0,2 0,18 0,16 0,14 0,12 доли 0,1 -0,080,060,04 0,020-

Рисунок 5. Частота встречаемости НЬА-специфичностей у детей, больных В-ОЛЛ.

Для изучения факторов риска развития заболевания использовали метод случай-контроль. Если этот показатель превышал (Ж > 2, то он считался значимым (Зарецкая Ю.М., 1983). Частота встречаемости генов НЬА-системы была высокой в группе больных В-ОЛЛ по сравнению со здоровыми детьми по локусу НЬА-А - А*32; по локусу НЬА-В - В*15, В*50; В*47 по локусу НЬА-С - Сш*04; Сш*16 по локусу НЬЛ-ОЯВ - ВЯВ1*09 и БКВ1*14. Наиболее высокий риск развития В-ОЛЛ был выявлен у детей носителей ОЯВ1*09 и ОКВ1*14 (ОИ = 3,1 и 3,5 соответственно), но наиболее высокие показатели ЕЕ ассоциировались со специфичностью С\¥*04 (011=1,9). Следовательно, при наличии аллельных специфичносгей БИВ 1*09, ОГШ1*14 у индивида риск развития В-ОЛЛ возникал с большей вероятностью, чем со специфичностью НЬА-С\у*04, однако, на популяционном уровне заболевание ассоциировалось в большей степени с НЬА-Сал'*04 (17,4 % детского населения имеет риск заболеть) и со специфичностью НЬА-В* 15 (ЕЕ составляет около 12%), чем с Э11В1*09 и 01Ш1*14 (ЕЕ=6,3 % и 6,6 % соответственно). Следует также отметить, что, несмотря на обнаруженный высокий показатель риска развития В-ОЛЛ у детей, несущих в своем НЬА-генотипе В*50 (011=2,6), процент больных, у которых развитие заболевания связано с этой группой аллелей составляет всего лишь 4,3%, т. е, ассоциации с ним на популяционном уровне слабая. Были исследованы 37 детей больных Т-ОЛЛ (25 мальчиков и 12 девочек) в возрасте от 1 года до 17 лет (средний возраст составил 10,1 лет ± 4,9). Отличительные особенности характера распределения НЬА-генов в этой группе по сравнению со здоровыми детьми представлены на рис.6

р<0,05

--М 0,03

Ш$ да 3 ш

0.0&,

0,049

о,о,1* ;|

С\л/*04 С\л/*16 ОКВ1 "09 ОЯВ1*03 ОИВ1-14

Рисунок 6. Частота встречаемости специфичностей НЬА у детей больных Т-ОЛЛ

Было выявлено достоверное увеличение частоты встречаемости специфичное™ НЬА-В*14, Б1Ш1*01, БИВРИ и БС)В1*05 у больных детей с Т-ОЛЛ по сравнению < здоровыми. При этом относительные показатели, характеризующие риск развития остро! лейкоза Т-ОЛЛ у детей, имеющих эти группы аллелей, составляли от ОЯ=2,2 для НЕ/ ОКВ1*13 до 011=3,0 для НЬА-В*14. Показатель же этиологической фракции, указывающ( на силу ассоциации маркера с заболеванием, оказался невысоким (ЕР=9,5%) для НЬА-В*1 Для специфических аллельных вариантов 01Ш1*01, В1Ш1*13 и 0(ЗВ1*05 показатех этиологической фракции имели среднюю величину силы их ассоциации с данны заболеванием (ЕР=19,8%, ЕР=25,5% и ЕР=34,4% соответственно). Высокий уровет достоверности различия между группой сравнения и группой больных с Т-ОЛЛ дет« (р=0,0035, р=0,002 и р=0,002 соответственно), следовательно, их можно рассматривав маркерами развития Т-ОЛЛ у детей. Можно заключить, что иммунные варианты В-ОЛЛ Т-ОЛЛ имеют разные иммуногенетические маркеры предрасположенности и устойчивости данным заболеваниям. Более того, выявленные маркеры имеют разную силу ассоциации заболеванием.

Характер распределения частот встречаемости генов НЬА у детей с ОМЛ.

Были исследованы 146 детей, больных ОМЛ, в возрасте от 6 мес. до 17 лет (средни возраст составил 8,9 лет ± 5,2), по этническим признакам относящиеся к популяци европеоидов и разделенные на группы: ОМЛ М2 (28 детей), ОМЛ М4 (26 детей), ОМЛ М (28 детей) и ОМЛ М7 (18 детей). Дети с МО, М1и Мб вариантами в исследование не был включены из-за их малочисленности (всего 14 детей). Исследования по выявлению НЬА ассоциированных генов с вариантом промиелоцитарного лейкоза (МЗ) не проводились, та как типирование антигенов гистосовместимости у них не осуществлялось. У 32 дете больных ОМЛ морфологические варианты не были выявлены. В результате проведенны исследований у больных детей с ОМЛ были обнаружены достоверные отклонени распределения НЬА-генов от общепопуляционного распределения.

Можно заключить, что различные морфологические варианты ОМЛ, имеющи разнообразные хромосомные аномалии, в результате которых экспрессируютс разнообразные опухолевые белки на лейкозных клетках, имеют и многообразны иммуногенетические маркеры предрасположенности и устойчивости к этому заболеванш (рис. 7-10).

0,4 0,3-доли 0,20,1 -О-

о,оаэ

ОР=(В1-07

Рисунок 7. Частота встречаемости НЬА-специфичностей у детей, больных ОМЛ М-2.

Рисунок 8. Частота встречаемости НЬА-специфичностей у детей, больных ОМЛ М-4.

Рисунок 9. Частота встречаемости НЬА-специфичностей у детей, больных ОМЛ М5.

Рисунок 10. Частота встречаемости НЬА-специфичностей у детей, больных ОМЛ М7.

С целью выявления «общего маркера» для миелобастного лейкоза (ОМЛ) была исследована общая группа всех больных детей (146 пациентов) с ОМЛ, независимо от варианта. Из них было 88 мальчиков и 58 девочек. Был обнаружен целый ряд аллелей НЬА-генов с достоверно аномальным их распределением у детей, больных ОМЛ, по сравнению с группой здоровых детей. Это специфичности относящиеся, как к классу I - А*24, А*68, С*05, С\у*07, так и к классу II - ОБШ1*11, ШШ1*07, БС>В1*02. Следовательно, специфичности С\у*05 и НЬА-С\у*07 являются маркерами риска развития ОМЛ у детей, а НЬА-011В1*07 - маркером устойчивости к этому заболеванию у детей. Причем специфичность С\у*07 имеет высокой силы ассоциацию и предрасположенность к ¡аболеванию ОМЛ у детей. Полученные данные представлены в таблице 9.

Таблица 9.

Иммуногенетические факторы предрасположенности и устойчивости к развитию OMJI у детей (п=146).

HLA-специфичнос ти Маркеры риска Маркеры устойчивости

P OR CI EF, % P OR CI PF, %

А*24 0,02 1,820 1,08-2,41 - - - - -

А*68 0,04 1,8 1,06-3,06 - - - - -

Cw*05 0,05 2,2 1,26-4,09 7,8 - - - -

Cw*07 0,0001 2Д 1,45-3,22 35,5 - - - -

DRB1*11 0,05 1,5 1,02-2,08 - - - - -

DRB1*07 - - - - 0,001 0,6-In:l,7 0,36-0,88 11,0

DRQB1*02 - - - - 0,03 0,6-In:l,7 0,41-0,93 15,0

Примечание: р - уровень достоверности; OR (odds ratio) - отношение шансов; CI (confidenc interval) - доверительный интервал, EF/PF - этиологическая /превентивная фракция.

Частота встречаемости специфичностей локусов НЬА у пациентов с ГЦ.

В настоящее время роль генетической предрасположенности в развитии ГЦ н вызывает сомнения. Для изучения генетической предрасположенности к ГЦ был проведе сравнительный анализ как отдельных аллельных вариантов всех генов НЬА, так и и межлокусных сочетаний в генотипе больных и в группе сравнения.

По литературным данным стойкую ассоциацию с ГЦ чаще всего связывали антигенами НЬА-Р<3 (Парфенов А.И., 2007). В наших исследованиях был изучен локу НЬА-ВС)В1*. Статистически значимая положительная ассоциация с ГЦ была выявлена дл специфичности НЬА-БС2В1*02, которая составила 42,86% (£=0,4286) основной группы отличие от 21,14% (Г=0,2114) группы сравнения, р=0,011; г=2,538. Достоверного отличи5 позволяющего исключить «нулевую гипотезу» по специфичность НЬА-0()В1*03, выявлен не было, однако была выявлена статистически значимая отрицательная ассоциация с ГЦ дл специфичности НЬА-В(2В1* 06 (основная группа - 7,14% (5=0,0714); группа сравнения 22,24% (£=0,2224), р=0,002.

Риск развития заболевания ГЦ.

Достоверно значимыми можно считать только специфичности НЬА-0(}В1*06 и НЬА 0(2В1*05. Сочетание низкого уровня показателей относительного риска и отношени шансов с высокими показателями превентивной фракции позволяет говорить о устойчивости к развитию ГЦ при наличии в НЬА-фенотипе данных специфичностей.

В результате проведенных исследований генотипов детей и взрослых пациентоЕ

больных ГЦ, были выявлены статистически значимые НЬА-специфичности и их сочетанш

являющиеся иммуногенетическими маркерами данного заболевания. Помимо этого, был]

выявлены НЬА-специфичности, достоверно подтверждающие отсутствие ГЦ. Впервьк

помимо DQ, были выявлены HLA-специфичности, которые можно характеризовать, как генетические маркеры этого заболевания: HLA-B*08; HLA-Cw*07; HLA-DRB 1 *03; HLA-DRB 1*07 и HLA-DQB 1*02.

Сочетание специфичностей в генотипе при ГЦ.

При исследовании HLA-генотипов основной группы и группы сравнения было обнаружено, что некоторые специфичности, определяющиеся как статистически значимые положительные ассоциации, встречаются в определенных сочетаниях. Необходимо отметить, что при отсутствии информации о генотипах родителей пациентов обеих экспериментальных групп и родителях здоровых испытуемых контрольной группы утверждать, что данные сочетания - гаплотипы не представляется возможным. Исходя из этого, статистическую обработку проводили без анализа величины неравновесного сцепления. Был произведен подсчет частот встречаемости подобных сочетаний, а также величин относительного риска и отношения шансов возникновения ГЦ при выявлении в генотипе следующих совместно встречающихся специфичностей:

1. Первая комбинация -HLA-B*08; HLA-DRB1*03; HLA-DQB1+02;

2. Вторая комбинация - HLA-DRB1 *07; HLA-DQB1 *02/HLA-DQB 1 *03;

В основной группе, наблюдалась следующая ситуация: первая комбинация совместно встречающихся специфичностей выявлялась у 70,59% пациентов, в группе сравнения - у 7,71% (р < 0,001). Вторая комбинация совместно встречающихся специфичностей, определялась у 23,53% пациентов основной группы, в группе сравнения - у 10,0% (р < 0,001). Полученные результаты свидетельствуют о достоверном отличии групп по изучаемым признакам.

Выявленые сочетания генетических маркеров заболевания ГЦ у детей и взрослых HLA-B*08; HLA-DRB 1*03; HLA-DQB1*02 и HLA-DRB 1*07; HLA-DQB 1 *02/HLADQB 1*03, можно рассматривать как самостоятельные генетические маркеры.

Ассоциации между HLA-специфичностями главного комплекса гистосовмести-мости и клиническими формами ГЦ у детей основной группы.

Основную группу исследуемых составляли пациенты в возрасте от 1 года до 17 лет (средний возраст 7,53 + 4,9). Распределение детей, больных целиакией, по полу - 11 (39,3%) девочек и 17 (60,7%) мальчиков. Распределение по полу в группе сравнения - 805 (47,35%) девочек и 895 (52,65%) мальчиков. В основной группе все пациенты были разделены для анализа клинических проявлений целиакии на 3 подгруппы. В первую подгруппу входили пациенты основной группы, в генотипе которых был выявлен первый вариант совместно встречающихся специфичностей, во вторую - пациенты основной группы со вторым сочетанием совместно встречающихся специфичностей и в третью - дети, в генотипе которых были выявлены другие сочетания специфичностей. В результате анализа клинических проявлений целиакии в основной группе не было выялено статистической разницы между клиническими формами в зависимости от варианта совместно

встречающихся НЬА-специфичностей в генотипе пациентов. Это подтвержает гипотезу, мультифакториальные заболевания следует рассматривать как зависимые, а не сцепленннь с генетическим фактором.

Системный подход и технологический алгоритм комплексного использовани высокотехнологичных и молекулярно-генетических методик в банкировании ГСК ПК.

Использование ГСК ПК в восстановительной медицине позволяет решить многие г проблем, стоящих перед здравоохранением. Основополагающим документом, регламент! рующим деятельность учреждений по работам с ГСК в части их создания, сбор; тестирования и хранения является Приказ № 325 МЗ РФ от 25.07.2003 «О развита клеточных технологий в Российской Федерации». Распоряжением Правительства Москвы с

11.07.2002 № 999-РП с изменениями, внесенными распоряжением Правительства Москвы о

01.09.2003 № 1561-РП было создано ГУЗ г. Москвы «Банк стволовых клеток Департамент здравоохранения Москвы». На все виды деятельности, осуществляемой ГУЗ «БСК ДЗМ> имеется лицензия Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и соцразвити на осуществление высокотехнологичной медицинской помощи № ФС - 99-01-006552 о 22.10.2009, выданная на срок до 22 октября 2014 года и 15 зарегистрированны медицинских технологий.

С 2003г. по 2010 г. в ГУЗ « БСК ДЗМ» было обработано 7010 единиц ПК, заложено н хранение 3964 единиц. Из ГУЗ «БСК ДЗМ» за период с 2008г. по май 2010 г. был выда клеточный материал и проведено 32 трансплантаций ПК детям с онкогематологическими : неонкологическими заболеваниями. Приживление трансплантата было зарегистрировано 18 пациентов (56,25%). Медиана времени до приживления нейтрофилов составила 24 дн (разброс 15-36 дней). Острая реакция трансплантат против хозяина (РТПХ) I - II степен: развилась у 14 (43,75%) пациента, случаев развития тяжелой РТПХ отмечено не былс Проявления хронической РТПХ выявлены у 2 (6,25%) пациентов. Смертность к 100 дш после трансплантации составила 28,5%. Общая выживаемость составила 56, 2%, с медиано] наблюдения 116 дней. Количество ядросодержащих клеток (ЯСК) на кг веса реципиента единице ПК является важным фактором, коррелирующим с результатами трансплантации Пациентов, которым трансплантировали два или три образца ПК было 16, что составил! 50%. При исследовании химеризма ПК у этих больных, отмечено приживление толью одного образца ПК, что соответствует данным литературы. Не было ни одного случа: развития РТПХ тяжелой степени, и только у двух пациентов было отмечено развит хронической РТПХ, что является важным преимуществом трансплантации ПК. Показано что ПК является эффективным источником ГСК для проведения трансплантации у больны: с онкологической и неонкологической патологией. Трансплантация ГСК ПК имеет ря; преимуществ перед трансплантацией костного мозга, таких как: отсутствие риска дл: здоровья матери и ребенка (донора), возможность длительного крихраненш гемопоэтических клеток, возможность использования не полностью НЬА-совместимы;

трансплантатов, низкий риск передачи инфекций, быстрота подбора трансплантата. Количество выданных образцов составило 1,7% от находящихся в криохранении. Этот показатель ниже, чем сообщается в международных исследованиях. Одной из причин столь низкого процента выданных ГУЗ «БСК ДЗМ» образцов ПК является низкая трансплантационная активность в России.

На этапе НЬА-типирования возникает ряд сложностей, связанных с организацией этого процесса на большом массиве биоматериала и ограниченным объемом крови каждого образца. В настоящей работе представлена оптимальная модель для разрешения этой проблемы.

Проведенная оценка эффективности процедуры лейкоконцентрации с учетом особенностей течения беременности и родов позволила выработать критерии отбора образцов ПК для проведения процедуры выделения ГСК. На основании результатов исследования клеточного состава ПК при помощи автоматического анализатора клеток крови и микроскопии окрашенных мазков, получены его референтные значения и степень расхождения значений, что позволило оптимизировать методику расчетов клеточности. Для оценки эффективности лейкоконцентрата ГСК ПК необходимо определение уровня спонтанного апоптоза лейкоцитов в ПК, общего количества, жизнеспособности и эффективности КОЕ.

Для дальнейшего развития клеточного направления восстановительной медицины -банки ПК, имеющие регистр неродственных доноров, должны быть инспектированы и аккредитированы в соответствующих органах контроля. Необходима ясная политика в отношении селекции доноров ПК, скрининга материала и его тестирования. Трансплантационные центры должны предоставлять полную информацию о проведенной процедуре трансплантации, анализ которой позволит гарантировать безопасность и эффективность материала. Таким образом, анализ результатов проведенного исследования и разработанный системный подход к банкированию пуповинной крови позволил оптимизировать технологический алгоритм комплексного использования высокотехнологичных и молекулярно-генетических методов получения эффективного и безопасного клеточного материала для восстановительной медицины.

Выводы

1. Определены факторы, оказывающие влияние на состав и эффективность выделения ГСК ПК, такие, как: анте- и интранатальные особенности течения беременности, родов, пол -юворожденпого антропометрические данные, различные состояния острой и хронической лшоксии плода.

общего количества и клонирования гемопоэтических колониеобразующих един характеризует эффективность и жизнеспособность конечного клеточного материала ПК.

3. Выявлено, что при аппаратном методе обработки ПК по сравнению с двойны центрифугированием выделение лейкоцитов меньше (70,28±0,51 и 72,4±0/ соответственно; р=0,002), а выделение мононуклеаров (77,94±0,53 - аппаратный 70,11±0,49 - ручной; р<0,0001), лимфоцитов (71,7±0,54 - ручной; 80,73±0,58 - аппаратны] р<0,0001) и редукция эритроцитов (36,45±0,51 - ручной; 20,85±0,5 - аппаратный; р<0,000 выше.

4. Установлено, что в результате обработки ПК различными методами, характеристик клеточного концентрата соответствуют показателям цельной ПК по соотношению основны субпопуляций лейкоцитов, при этом колониеобразующая активность не изменяется.

5. Впервые на большом фактическом материале (3964 образца) оптимизирован процессы проведения и оценки результатов HLA-типирования ПК и периферической кров1 представленные двумя молекулярными методами, такими как SSO и SSP, позволяющи получать достоверную и однозначную информацию.

6. Впервые на большом фактическом материале (3964 образца) получены данны генетического полиморфизма антигенов гистосовместимости у здорового населени московского региона для формирования группы сравнения в области изучения «HLA болезни» и популяционных исследований в связи с высокой экономическо эффективностью.

7. Впервые выявлены особенности распределения HLA-специфичностей по классам I II при заболевании глютенчувствительной целиакией и острым лейкозом у дете{ Использование выявленных особенностей распределения HLA-специфичностей дл диагностики и лечения, позволяют успешно реализовать постулат восстановительно медицины в виде ограничения формирования потока больных и обеспечения поддержани оптимальной работоспособности и качества жизни пациентов.

8. Впервые разработаны принципы системного подхода и оптимизирова: технологический алгоритм комплексного использования высокотехнологичных j молекулярно-генетических методов банкирования ПК, что позволило получат качественный, эффективный и безопасный клеточный материал, применение которого npi различных заболеваниях повысит регуляторные, компенсаторные и адаптивные механизм! восстановительного процесса организма с улучшением качества жизни.

Практические рекомендации

1. Определенные анте- и интранатальные факторы, влияющие на состав i эффективность выделения гемопоэтических стволовых клеток, следует учитывать npi выборе метода обработки ПК.

2. Полученные референтные значения клеточного состава ПК, количества CD34+ клеток и клеток предшественников гемопоэза и их динамику, а также высокую экономическую эффективность данного решения, рекомендуется использовать в качестве группы сравнения и при проведении планирования технологического процесса в банках ПК.

3. Оптимизированную стратегию использования молекулярно-генетических методов HLA-типирования рекомендуется применять при организации банкирования ПК для восстановительной медицины.

4. Выявленные генетические маркеры предрасположенности /устойчивости к развитию B-OJIJI, T-OJIJI и ОМЛ у детей рекомендуется использовать в качестве дополнительных критериев при диагностике и лечении острых лейкозов у детей.

5. Выявленные генетические маркеры глютенчувствительной целиакии рекомендуется использовать в качестве дополнительных критериев при диагностике и лечении в профильных медицинских учреждениях.

6. Системный подход к банкированию ПК: рекомендуется использовать в профильных шдицинских учреждениях России.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Майорова O.A., Яковлева М.В., Румянцев С.А., Подколзина Э.А., Сухин Г.М., Спиридонова Е.И., Лебедева Л.Л. Организационные принципы создания и

функционирования банков пуповинной крови (по стандартам NetCord и FAHCT). Вопросы ематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2005, т.4, №2, с.92-97.

2. Абдуллаев Р.Т., Румянцев С.А., Сухин Г.М., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева LB., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова O.A. вровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, гранулоцитов и CD34+ клеток пуповинной :рови, периферической крови и костного мозга. Российский иммунологический журнал, :006, т. 9., Suppl 3, с. 133;

3. Боякова Е.В., Румянцев С.А., Сухин Г.М., Плясунова С.А., Шутьева А.Б., Сабирова С.Э., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Абдуллаев Р.Т., Яковлева М.В., Лайорова O.A., Количество CD34+ и СВ133+ клеток пуповинной крови доношенных юворожденных, Матер. Российского Съезда гематологов и трансфузиологов (апрель 2006)// 'оссийский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 2, с. 132;

4. Подколзина Э.А., Румянцев С.А., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Спиридонова Е.И., Абдуллаев Р.Т., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Лайорова O.A. Факторы, влияющие на эффективность выделения лейкоцитарной фракции [уповинной крови, Матер. Российского Съезда гематологов и трансфузиологов (апрель 1006)// Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, с. 134

5. Румянцев С.А., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Спиридонова Е.И., VöflymmeB Р.Т., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майорова

O.A. Клеточный состав пуповинной крови в зависимости от осложнений беременности родов. Российский иммунологический журнал, 2006, т. 7, Suppl 3, с. 116;

6. Румянцев С.А., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Шутьева А.Б., Спиридонова Е.1 Абдуллаев Р.Т., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Яковлева М.В., Майоро: O.A. Клеточный состав пуповинной крови в зависимости от осложнений беременности родов, Матер. Российского Съезда гематологов и трансфузиологов (апрель 2006 Российский иммунологический журнал, 2006, т. 9., Suppl 3, с. 116;

7. Podkolzina Е.А., Karpova Е.Е., Spiridonova E.I., Boyakova E.V., Shutyeva A.E Yakovleva M.V., Mayorova O.A., Roumiantsev S.A. Effect of pregnancy and intranatal factors < stem cell count in cord blood leukokoncentrat unit. Stem cell therapy meeting, Regensbur Germany, 2007, p. 96-98.

8. Podkolzina E.A., Karpova E.E., Spiridonova E.I., Boyakova E.V., Shutyeva A.E Yakovleva M.V., Mayorova O.A., Roumiantsev S.A. Comparison of cord blood volume reductic methods efficacy. Stem cell therapy meeting, Regensburg, Germany, 2007, p. 102.

9. Боякова E.B., Румянцев C.A., Шутьева А.Б., Сабирова С.Э., Подколзина Э.-А Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Райкина Е.В., Яковлева М.В., Майорова O.A. CD34+ CD133+ клетки пуповинной крови доношенных новорожденных. Материалы I Всероссийского симпозиума «Актуальные вопросы тканевой и клеточнс трансплантологии» Москва, 25-26 апреля 2007, с. 12-13.

10. Боякова Е.В., Румянцев С.А., Шутьева А.Б., Сабирова С.Э., Подколзина Э.А Карпова Е.Э., Румянцева Ю.В., Райкина Е.В., Яковлева М.В., Майорова O.A. CD34+ CD133+ клетки пуповинной крови доношенных новорожденных. Материалы I Всероссийского симпозиума «Актуальные вопросы тканевой и клеточно трансплантологии» Москва, 25-26 апреля 2007, с. 12.

11. Боякова Е.В., Пащенко А.Б., Яковлева М.В., Майорова O.A., Румянцев С./ Субпопуляции CD34+ и СВ133+ клеток пуповинной крови доношенных новорожденны; Материалы IV симпозиума «Биологические основы терапии онкологических гематологических заболеваний» Онкогематология, 2008, №4, с.42

12. Боякова Е.В., Короткова Н.В., Пащенко А.Б., Яковлева М.В., Майорова О.А Румянцев С.А.. Иммунологическая характеристика лимфоцитов пуповинной кров доношенных новорожденных. Материалы IV симпозиума «Биологические основы терапи онкологических и гематологических заболеваний» Онкогематология, 2008, №4, с.41-42

13. Майорова O.A., Яковлева М.В., Румянцев С.А. Проблемы трансплантаци: пуповинной крови Российский медицинский форум 2007, с. 152 Плясунова С.А., Румянце С.А., Яковлева М.В., Майорова O.A. Определение клеточного состава пуповинной кров: при помощи микроскопии и автоматического счетчика. Материалы IV симпозиум «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний: Онкогематология, 2008, №4, с.66

14. Плясунова С.А., Румянцев С.А., Боякова Е.В., Пащенко А.Б., Яковлева М.В., Майорова О.А. Зависимость клеточного состава пуповинной крови от пола и веса новорожденных. Материалы IV симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» Онкогематология, 2008, №4, с.65-66

15. Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Яковлева М.В., Майорова О.А. Румянцев С.А. Сравнение эффективности метода двойного центрифугировании и аппаратного метода при выделении лейкоцитарной фракции пуповинной крови. Материалы IV симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний» Онкогематология, 2008, №4, с.67

16. Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Яковлева М.В., Майорова О.А., Румянцев С.А.. 1рогностическое факторы эффективности выделения лейкоцитарной фракции пуповинной рови Материалы IV симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и ематологических заболеваний» Онкогематология, 2008, №4, с.66

17. Румянцев С.А., Плясунова С.А., Боякова Е.В., Пащенко А.Б., Спиридонова Е.И., 1ковлева М.В., Майорова О.А. Клеточный состав пуповинной крови при наличии гипоксии о время беременности и родов. Журнал Онкогематология № 4 2008, стр. 70-71.

18. Osipova Е., Astrelina Т., Purbueva В., Ystiugov A., Skorobogatova Е., Dishleva Z., Loumiantsev S., Yakovleva M., Mayorova О. Immunophenotype of human bone marrow MSCs on arly and late passages during ex vivo expansion. 35st Annual Meeting of the European Group for llood and Marrow Transplantation 25st Meeting of the Nurses Group 8th Meeting of the EBMT )ata Management Group, Goteborg, Sweden, March 28-April 1, 2009, P-422

19. Осипова Е.Ю. Астрелина Т.А., Устюгов А.Ю., Пурбуева Б.Б., Скоробогатова Е.В., Паманская Т.В., Дышлевая З.М., Яковлева М.В., Майорова О.А., Румянцев С.А. Динамика корости роста и иммунофенотипа мезенхимальных стволовых клеток костного мозга еловека на ранних и поздних пассажах при культивировании ex vivo. Онкогематология 009 (Материалы симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и ематологических заболеваний», Москва 29.01.-31.01.2009г.), №4, с.62-63.

20. Osipova E.U., Astrelina Т.А., Purbueva В.В., Skorobogatova E.V., Dishlevaya Z.M., loumiantsev S.A., Mayorova O.A., Ustyugov A.Y., Yakovleva M.V. «Dynamics of mmunphenotype of human bone marrow MSCs on early and late passages during ex vivo xpansion.» 35th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation, 009, PI, c.265-267.

21. Лебедева Л.Л., Потапова Т.Н., Пухликова Т.В., Ставцев Д.С., Астрелина Т.А., 1ковлева М.В. Иммуногенетические факторы предрасположенности и резистентности к ютрому лимфобластному лейкозу у детей. Сборник материалов XIV Конгресса педиатров 'оссии с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 15-18 эевраля 2010г., № 478, с. 480-482.

22. Лебедева Л.Л., Потапова Т.Н., Пухликова Т.В., Ставцев Д.С., Астрелина Т. Яковлева М.В. Ассоциации антигенов HLA системы с хроническим миелолейкозом у дете Сборник материалов XIV Конгресса педиатров России с международным участш «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 15-18 февраля 2010г., № 479, с. 481-483.

23. Лебедева Л.Л., Потапова Т.Н., Пухликова Т.В., Ставцев Д.С., Астрелина Т./ Яковлева М.В. Взаимосвязь антигенов HLA системы с различными морфологически?, вариантами острого миелоидного лейкоза у детей. Сборник материалов XIV Конгрес педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии», Москв 15-18 февраля 2010г., № 480, с. 482-484.

24. Пухликова Т.В., Лебедева Л.Л., Потапова Т.Н., Рославцева Е.А., Астрелина Т./ Яковлева М.В. Значение генетических факторов в развитии целиакии у детей. Сборш материалов XIV Конгресса педиатров России с международным участием «Актуальнь проблемы педиатрии», Москва, 15-18 февраля 2010г., № 656, с. 658-660.

25. Шаманская Т.В., Астрелина Т.А., Качанов Д.Ю., Паина О.В., Скоробогатова Е.Е Дышлевая З.М., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Лебедева О.В., Яковлева М.В. Опь трансплантации пуповинной крови банка стволовых клеток Москвы. Сборник материале XIV Конгресса педиатров России с международным участием «Актуальные проблем педиатрии», Москва, 15-18 февраля 2010г., № 656, с. 660-661.

26. Lebedeva L., Potapova T., Puchlikova T., Astrelina T., Yakovleva M.V. Estabilishment < typing strategy in Moscow Stem Cell Bank., Book of Abstracts & Scietific Program. 5th Eas West Immunogenetics Conferece, 4-5 March, 2010, Pilsen, Czech Republic, p 29.

27. Lebedeva L., Potapova T., Puchlikova T., Astrelina T., Yakovleva M.V. Study on Û corelation between of HLA genes and chronic myeloid leukemia in children. // 24 th Europea Immunogenetics and Histocompatibility Conference (EFI) and 17th Annual Meetting of the Italia Society for Immunogenetics and Transplantation (AIBT), Tissue Antigenes, 2010, 75(№5), P36I p.636

28. Lebedeva L., Potapova T., Puchlikova T., Astrelina T., Yakovleva M.V. Immunogeneti factors of predisposition in acute lymphoblastic leukemia. // 24 th European Immunogenetics an Histocompatibility Conference (EFI) and 17th Annual Meetting of the Italian Society fc Immunogenetics and Transplantation (AIBT), Tissue Antigenes, 2010,75(№5), P361 p.636.

29. Lebedeva L., Potapova T., Puchlikova T., Astrelina T. Yakovleva M.V. Communication с HLA assotiation genes in chronic children with acute myeloid leukemia. // 24 th Europea Immunogenetics and Histocompatibility Conference (EFI) and 17th Annual Meetting of the Italia Society for Immunogenetics and Transplantation (AIBT), Tissue Antigenes, 2010, 75(№5),, P33( p.336-339

30. Shamanskaya T., Astrelina T., Kachanov D., Paina O., Skorobogatova E., Dishleva Z Podkolzina E., Karpova E., Lebedeva L., Yakovleva M. Moscow Stem Cell Bank; experience с transplantation cord blood. Bone Marrow Transplantation, 36st Annual Meeting of the Europea

oup for Blood and Marrow Transplantation 26st Meeting of the Nurses Group 9th Meeting of the JMT Data Management Group, 2nd EBMT Quality Management Meeting , Vienna, Austria, larch 21-24, 2010, P-583, S154

31. Osipova E., Nikitina V., Astrelina T., Skorobogatova E., Dishlevaya Z., Roumiantsev S., akovleva M. Cytogenetic analysis and stability of human bone marrow MSCs during ex vivo <pansion.. Bone Marrow Transplantation, 36st Annual Meeting of the European Group for Blood id Marrow Transplantation 26st Meeting of the Nurses Group 9th Meeting of the EBMT Data lanagement Group, 2nd EBMT Quality Management Meeting , Vienna, Austria, March 21-24, 010, P-904, S279

32. Lebedeva L.L., Potapova T.N., Puhlikova T.V., Stavtsev D.S., Skorobogatova E.V., .strelina T.A., Yakovleva M.V. Nature of HLA-associated factors of predisposition and resistency l acute lymphoblastic leukemia. Bone Marrow Transplantation, 36st Annual Meeting of the uropean Group for Blood and Marrow Transplantation 26st Meeting of the Nurses Group 9th leeting of the EBMT Data Management Group, 2nd EBMT Quality Management Meeting , 'ienna, Austria, March 21-24,2010, P-409, S85

33. Tatarinova O., Osipova E., Dishlevaya Z., Astrelina T., Skorobogatova E., Roumiantsev S., akovleva M. Effect of allogenic bone marrow mesenchymal stem cells on the chemosensitivity of :ukemia cells to antileukemic drugs in vitro.. Bone Marrow Transplantation, 36st Annual Meeting f the European Group for Blood and Marrow Transplantation 26st Meeting of the Nurses Group th Meeting of the EBMT Data Management Group, 2nd EBMT Quality Management Meeting , 'ienna, Austria, March 21-24,2010, P-1327, S413

34. Puchlikova T., Lebedeva L., Potapova T., Roslavtseva E., Astrelina T., Yakovleva M.V. lenetic factors in development of children coeliac diseases. 26th International Pediatric association Congress of Pediatrics (IP A) 2010, South Africa, 4-9 August 2010, abstract &P.673.

35. Лебедева JI.JI., Потапова Т.Н., Пухликова T.B., Астрелина T.A., Яковлева M.B. Стратегия HLA-типирования в Московском банке стволовых клеток. III научно-рактической конференции «Современные технологии и методы диагностики различных рупп заболеваний, лабораторный анализ» 13-14 мая 2010, Москва, Научное издание -езисы докладов, с. 19-20.

36. Пухликова Т.В., Лебедева Л.Л., Потапова Т.Н., Рославцева Е.А., Сабельникова Е.А., хтрелина Т.А., Яковлева М.В. Значение генетических факторов в развитии целиакии у етей в г. Москве. III научно - практической конференции «Современные технологии и [етоды диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ» 13-14 мая 2010, 1осква, Научное издание - тезисы докладов, с. 20-21.

37. Осипова Е.Ю., Шаманская Т.В., Пурбуева Б.Б., Румянцев С.А., Астрелина Т.А., [ковлева М.В. Биологические свойства мезенхимальных стволовых клеток костного мозга еловека при экспансии ex vivo для клинического применения. III научно - практической онференции «Современные технологии и методы диагностики различных групп

зз

заболеваний, лабораторный анализ» 13-14 мая 2010, Москва, Научное издание - тез докладов, с. 17-18.

38. Шаманская Т.В., Астрелина Т.А., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Лебедева Л.] Скоробогатова Е.В., Паина О.В., Яковлева М.В. Использование пуповинной крови nj проведении аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у детей (от работы Московского банка стволовых клеток). Клеточная трансплантология и тканев инженерия. - 2010.-T.5.- №2.- стр.1-7.

39. Пухликова Т.В., Лебедева Л.Л., Потапова Т.Н., Рославцева Е.А., Сабельникова ЕJ Астрелина Т.А., Яковлева М.В. Значение генетических факторов в развитии целиакии. Вопросы современной педиатрии,- 2010.- 9(№4)- с. 24-27.

40. Шаманская Т.В., Астрелина Т.А., Подколзина Э.А., Карпова Е.Э., Лебедева Л.] Скоробогатова Е.В., Паина О.В., Яковлева М.В. Использование альтернативных источник« при проведении аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у дете Материалы IV научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы решения», Москва, 2010, с 50-51.

41. Круглова Я.А., Кашпор С.А., Калинина В.В., Астрелина Т.А., Яковлева М.1 Диагностика заболеваний лимфатической и кроветворной системы: морфология, цитохими иммуногистохимия. Материалы IV научно-практической конференции «Совремснн; гематология. Проблемы и решения», Москва, 2010, с 28-29.

42. Карпова Е.Э., Подколзина Э.А., Шаманская Т.В., Сергеев A.B., Астрелина TJ Яковлева М.В. Заготовка, вирусная и бактериальная безопасность концентратов пуповиннс крови, содержащих гемопоэтические стволовые клетки, причины осложнений. Материал IV научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения: Москва, 2010, с 18-20.

43. Пухликова Т.В., Лебедева Л.Л., Потапова Т.Н., Астрелина Т.А., Яковлева МЛ Иммуногенетические маркеры в развитии глютенчувствительной целиакии в московско популяции. Материалы IV научно-практической конференции «Современная гематологи Проблемы и решения», Москва, 2010, с 40-41.

44. Осипова Е.Ю., Шаманская Т.В., Пурбуева Б.Б., Астрелина Т.А., Яковлева M.I Биологические свойства мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека пр культивировании ex vivo в различных питательных средах. Материалы IV научнс практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения», Mockbj 2010, с. 37-38.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

JK - гемопоэтические стволовые клетки

Ц - глютенчувствительная целиакия

DE-mix - колониеобразующая единица смешанная

ОЕ-Г - колониеобразующая единица гранулоцитарная

DE-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная

ЮЕ-М - колониеобразующая единица макрофагальная

ОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроцитарная

iJIJI - острый лимфобластный лейкоз.

•МЛ - острый миелобластный лейкоз.

[К - пуповинная кровь

[П - пролиферативный потенциал.

AS - (basophile) количество базофилов крови (х109/л)

D - (clasters of differentiations) кластер дифференцировки

F - этиологическая фракция

OS - (eosinophile) количество эозинофилов крови (х109/л)

- частота встречаемости специфичности

[СТ - (hematocrit) гематокрит

EES 200 - 6% гидроксиэтилкрахмал с молекулярной массой 200 ООО дальтон

[GB - (hemoglobin) концентрация гемоглобина (г/л)

[LA - человеческие лейкоцитарные антигены (Human leukocyte antigen)

FA - leukocyte function-associated molecule.

YM - (lymphocyte) количество лимфоцитов крови (x 109In)

1CH - (mean corpuscular hemoglobin) среднее содержание гемоглобина в эритроцитах

ICHC - (mean corpuscular hemoglobin concentration) средняя концентрация

гемоглобина в эритроцитах (г/л)

1CV - (mean corpuscular volume) средний объем эритроцитов (фл/фемтолитры)

INC - (mononuclear cells) мононуклеарные клетки

ION - (monocyte) количество моноцитов крови (х 10%)

1PV - (mean platelet volume) средний объем тромбоцитов (фл/фемтолитры)

iEU - (neutrophile) нейтрофилы

IK - (natural killer) натуральные киллеры

[OD/SCID - тяжелая комбинированная иммунная недостаточность

[RBC - (nuclear red blood cell) нормобласты (/100 лейкоцитов)

|R - (odds ratio) однофакторное отношение шансов

СТ - (platelet crit) тромбокрит (%), отражает долю объема цельной крови,

занимаемой тромбоцитами

DW - (platelet distribution width) ширина распределения тромбоцитов по объему,

характеризует степень анизоцитоза (%)

F - превентивная фракция

LT - (platelet) количество тромбоцитов

ВС - (red blood cells) количество эритроцитов крови (х1012/л)

DW - (red cells distribution width) показатель гетерогенности эритроцитов по объему,

характеризует степень анизоцитоза

Л - (relative risk) - относительный риск возникновения заболевания

/ВС - (white blood cells) количество лейкоцитов крови (х109/л)

Отпечатано в РИО МГМСУ 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1. Заказ № 250. Тираж 120 экз.

Оглавление диссертации Яковлева, Мария Валерьевна :: 2010 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Организация банков пуповинной крови ^

1.2. Методы сбора пуповинной крови ^

1.3. Транспортировка, обработка, замораживание и 21 криохранение пуповинной крови

1.4. Характеристика пуповинной крови

1.5. Факторы, влияющие на состав пуповинной крови

1.6. Спонтанный апоптоз и некроз клеток крови

1.7. НЬА - типирование пуповинной крови и современные 42 представления о главном комплексе гистосовместимости

1.8. Взаимосвязь МНС с лейкозами

1.9. Взаимосвязь МНС с глютенчувствительной целиакией ^

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Глава 3. ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОЧНОГО СОСТАВА ПУПОВИННОЙ 75 КРОВИ

3.1. Влияние анте- и интранатальных факторов на качественные 75 и количественные характеристики клеток.пуповинной крови

3.2. Особенности течения беременности, родов, 111 антропометрических данных, пола новорожденного и срока гестации, влияющие на количество СБ34+ клеток пуповинной крови доношенных новорожденных

3.3. Влияние различных состояний острой и хронической 124 гипоксии плода на клеточный состав пуповинной крови доношенных новорожденных

3.4. Ручной и автоматический подсчет клеток ПК

3.5. Оценка определения морфологического состава пуповинной 140 крови

3.6. Иммунологическая характеристика клеточного состава 141 пуповинной крови

3.7. Анализ субпопуляций СБ34+ клеток и СБ133+ клеток ПК

3.8. Колониеобразующая активность пуповинной крови

3.9. Уровень спонтанного апоптоза и некроза клеток пуповинной 153 крови

3.10. Оценка нормобластов пуповинной крови

3.11. Оценка клеточного состава пуповинной крови в 162 зависимости от пола и массы тела доношенных новорожденных

Глава 4. ВЛИЯНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА НА

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПУПОВИННОЙ КРОВИ

4.1. Эффективность методов автоматического выделения клеток 179 (МАВК) и двойного центрифугирования (МДЦ) при проведении процедуры лейкоконцентрации ПК

4.2. Процедура лейкоконцентрации клеточного состава ПК

4.3. Прогнозирование эффективности процедуры 198 лейкоконцентрации ПК

Глава 5. ОПТИМИЗАЦИЯ ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫХ МЕТОДОВ 214 БАНКИРОВАНИЯ ПУПОВИННОЙ КРОВИ И ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ

5.1. Исследование генетического полиморфизма системы НЬА 214 пуповинной крови московского региона

5.2. Оптимизация исследования генетического полиморфизма 220 системы НЬА периферической крови при заболеваниях

Введение диссертации по теме "Восстановительная медицина, спортивная медицина, лечебная физкультура, курортология и физиотерапия", Яковлева, Мария Валерьевна, автореферат

Одной из самых актуальных проблем современной медицины является охрана здоровья человека, для решения которой разработаны и утверждены соответствующие концепции и программы, целью которых является сохранение и восстановление здоровья. Социальное значение восстановительной медицины состоит в реализации нового направления, ориентированного на создание системы лечения и воспроизводства здоровья человека, в виде комплексных лечебно-профилактических и медико-социальных мероприятий, ограничивающих формирование потока больных, обеспечивающих поддержание оптимальной работоспособности и качества жизни. Разработка новейших корригирующих технологий, направленных на сохранение и восстановление функциональных резервов организма человека, восстановление его оптимальной работоспособности является основной стратегией современной восстановительной медицины [25]. Для дальнейшего развития клеточного направления восстановительной медицины чрезвычайно актуален вопрос подготовки достаточного количества эффективного и безопасного клеточного материала для повышения регуляторных, компенсаторных и адаптивных возможностей организма.

После появления первых публикаций об успешном проведении трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в конце 80-х гг. XX века, начали свое развитие первые банки пуповиной крови [131]. Пуповинная кровь, представленная для использования криобанками, в настоящее время является альтернативным костному мозгу источником гемопоэтических стволовых клеток, применяемых для трансплантации у детей и взрослых при ряде злокачественных заболеваний, синдромах недостаточности костного мозга, гемоглобинопатиях и некоторых генетических метаболических расстройствах [142]. Банкирование пуповинной крови - это совокупность процессов сбора, обработки, тестирований и криохранения биоматериала. За прошедшее десятилетие во всем мире увеличилась роль пуповинной крови и ее применения для трансплантации. Мировая ассоциация доноров костного мозга (World Marrow Donor Association - WMDA) собирает информацию о числе заготовленных единиц банками пуповинной крови по всему миру начиная с 1999 года. На 2008 год WMDA сообщает о деятельности 112 банков пуповинной крови, которыми заготовлено более 450 тыс. единиц пуповинной крови. В настоящее время в Европе существует 18 банков пуповинной крови, которые получили аккредитацию в NetCord-FACT и еще 40 находятся на стадии регистрации [231]. На настоящий момент в мире выполнено более 10000 трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток с использованием пуповинной крови [205]. По данным Gluckman Т., Rocha V. начиная с 2006 года около 20% трансплантаций стволовых клеток, проводимых в Европе пациентам в возрасте до 20 лет, являются трансплантациями пуповинной крови (http://www.worldmarrow.org) [141]. Это говорит о том, что пуповинная кровь является ценным клеточным ресурсом для тех пациентов, которым не был найден совместимый донор костного мозга, особенно это важно для групп этнических меньшинств. Особенности гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови являются предпосылкой для увеличения количества трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови. [142,151,179]. Увеличение доступного пула единиц пуповинной крови улучшает вероятность обнаружения донорского материала с оптимальными характеристиками.

Успех трансплантации во многом зависит от достаточного количества гемопоэтических стволовых клеток, поэтому важным вопросом применения пуповинной крови в клинической практике является оценка качества трансплантата, в основе которой лежит определение количества и жизнеспособности гемопоэтических стволовых клеток, содержащихся в трансплантационном материале [141]. Главной причиной клинических и иммунологических проблем после трансплантации и основным лимитирующим фактором выбора донора является HLA-несовместимость.

Популяционные исследования полиморфизма генов главного комплекса гистосовместимости, проведенные у больных гемобластозами, свидетельствуют об ассоциативной связи системы HLA с острым лейкозом, как у взрослых, так и у детей. [14-16, 26, 28,29,32,97-100, 308-310]. Имеются данные, полученные отечественными авторами, которые показали повышение частоты встречаемости антигенов В17 и В40, а также снижение частоты встречаемости антигена DR7 у больных детей с острым лимфобластным лейкозом [29]. Практически отсутствуют современные данные изучения HLA системы при острых лейкозах у детей. Изучение и разработка высокотехнологичных методов банкирования пуповинной крови и определение стратегии НЬА- типирования представляются актуальной задачей, так как позволяют расширить возможности для восстановления функциональных резервов организма у большого количества пациентов, к которым неприменимы стандартные протоколы диагностики и лечения.

В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования явилась разработка системного подхода и научно обоснованной технологии банкирования пуповинной крови с применением высокотехнологичных и молекулярно-генетических методов в восстановительной медицине.

Задачи исследования:

1. Исследовать совокупность анте- и интранатальных факторов, оказывающих влияние на состав и эффективность выделения гемопоэтических стволовых клеток.

2. Проанализировать клеточный состав пуповинной крови, иммунологическую характеристику, уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов пуповинной крови, общее количество, жизнеспособность и эффективность клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц гемопоэтических стволовых клеток.

3. Оценить влияние технологий обработки пуповинной крови на качество и эффективность выделения мононуклеарной фракции пуповинной крови.

4. Оптимизировать алгоритм использования различных молекулярно-генетических методик НЬА-типирования при банкировании пуповинной крови и исследовать генетический полиморфизм антигенов гистосовместимости у здорового населения московского региона.

5. Исследовать характер распределения специфических генов НЛА-системы при острых лейкозах у детей и глютенчувствительной целиакии, а также выявить НЬА-маркеры предрасположенности / устойчивости к ним.

6. Разработать технологический алгоритм и научно обосновать системный подход к банкиров анию пуповинной крови для восстановления функциональных резервов организма и трансплантаций в восстановительной медицине.

Научная новизна

Впервые на большом количестве материала пуповинной крови определена совокупность анте- и интранатальных факторов, оказывающих влияние на состав и эффективность выделения гемопоэтических стволовых клеток.

Впервые показано, что результаты автоматического гематологического анализатора и светооптической микроскопии независимы друг от друга и взаимно дополняют референтные значения клеточного состава пуповинной крови. Получены данные уровня спонтанного апоптоза лейкоцитов в пуповинной крови, общего количества, жизнеспособности и эффективности клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц в конечном клеточном продукте, которые характеризуют эффективность материала для неродственной трансплантации и восстановления функциональных резервов организма.

Впервые в России оптимизированы процессы проведения исследований и оценки результатов HLA-типирования большого количества образцов пуповинной крови здоровых новорожденных и периферической крови при различных заболеваниях, представленные двумя молекулярными высокотехнологическими методами, такими как SSO на автоматическом процессоре и SSP, позволяющие получать достоверную и однозначную информацию.

Впервые на большом количестве материала изучен характер распределения HLA специфичностей класса I и II у здорового населения московского региона и установлен профиль генов HLA системы соответствующий европеоидам.

Впервые получены данные об особенностях распределения специфических аллелей генов HLA системы, охарактеризованы дополнительные общие маркеры предрасположенности /устойчивости при лейкозах у детей и глютенчувствительной целиакии.

Впервые разработан и внедрен системный подход и оптимизирован технологический алгоритм комплексного использования высокотехнологичных методов сбора, оценки, тестирования, криохранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, что позволило получать качественный, эффективный и безопасный клеточный материал, применение которого при различных заболеваниях повысит регуляторные, компенсаторные и адаптивные механизмы возможности организма.

Практическая значимость работы

Практическое значение работы заключается в том, что выявлена и показана необходимость совместного использования методов автоматического подсчета клеток и светооптической микроскопии, взаимно дополняющих референтные значения клеточного состава пуповинной крови.

Характеристиками, определяющими качество, жизнеспособность и эффективность конечного клеточного материала является совокупность показателей общего количества клеток, уровня спонтанного апоптоза лейкоцитов в пуповинной крови, клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц.

Обоснованый системный подход и оптимизация технологического алгоритма комплексного использования методик при банкировании пуповиной крови позволяют получать эффективный клеточный материал для дальнейшего развития клеточного направления восстановительной медицины.

В результате выполненной работы предложена стратегия совместного использования методов HLA типирования большого количества образцов пуповинной крови (с применением технологий SSO и SSP), которая может быть применена в медицинских учреждениях аналогичного профиля в России. Охарактеризованный впервые профиль распределения генов главного комплекса гистосовместимости у здорового населения московского региона может быть использован в качестве группы сравнения в области изучения «HLA и болезни» и в популяционных исследованиях.

Основные положения, выносимые на защиту

Изучение совокупности анте- и интранатальных факторов, особенностей течения беременности, родов, антропометрических данные, пола новорожденного и срока гестации, различных состояний острой и хронической гипоксии плода позволяет оценить их влияние на состав и эффективность выделения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для восстановления функциональных резервов организма.

Эффективность клеточного материала пуповинной крови для восстановления функциональных резервов организма характеризуют количественный и качественный клеточный состав пуповинной крови, определенный с применением автоматического гематологического анализатора и светооптической микроскопии; уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов в пуповинной крови, общее количество, жизнеспособность, эффективность клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц.

Стратегия применения методов HLA-типирования образцов пуповинной крови, представленная двумя технологиями, такими как SSO и SSP, позволяет проводить быструю обработку большого количества биоматериала и получать достоверные и однозначные результаты.

Исследование полиморфизма генов HLA-системы позволяет изучить характер распределения аллельных специфичностей среди здорового населения московской популяции и обнаружить маркеры, определяющие риск или устойчивость к возникновению заболеваний, таких как лейкозы у детей и глютенчувствительная целиакия.

Комплекс усовершенствованных высокотехнологичных методов сбора, оценки, тестирования, хранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, является оптимальным, позволяет получать однозначную и достоверную информацию и требует для исследования минимального количества исследуемого биоматериала.

Обоснованый и внедренный системный подход в банкировании пуповиной крови позволяет получать эффективный клеточный материал для повышения регуляторных, компенсаторных и адаптивных механизмов организма и дальнейшего развития клеточного направления восстановительной медицины.

Работа выполнена на базе ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы», ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» Росздравнадзора, ЦПСиР ДЗ г. Москвы, родильном доме № 10 Управления здравоохранения ЮЗАО г. Москвы, родильном доме № 8 Управления здравоохранения ЮВАО г. Москвы, родильном доме № 17 Управления здравоохранения CAO г. Москвы и городской больнице № 8 Управления здравоохранения CAO г. Москвы, ФГУ «Федеральный научно-клинический центр деткой гематологии, онкологии и иммунологии», научно-исследовательном институте гастроэнтерологии Департамента здравоохранения города Москвы.

Заключение диссертационного исследования на тему "Системный подход к банкированию пуповинной крови для восстановительной медицины"

выводы t 1. Определены факторы, оказывающие влияние на состав и эффективность выделения ГСК ПК, такие, как: анте- и интранатальные особенности течения беременности, родов, пол новорожденного антропометрические данные, различные состояния острой и хронической гипоксии плода.

2. Применение автоматического гематологического анализатора и светооптической микроскопии позволяет получить независимо друг от друга и взаимно дополнить референтные значения клеточного состава ПК. Уровень спонтанного апоптоза лейкоцитов, общего количества, клонирования гемопоэтических колониеобразующих единиц характеризует эффективность и жизнеспособность конечного клеточного материала ПК.

3. Выявлено, что при аппаратном методе обработки ПК по сравнению с двойным центрифугированием выделение лейкоцитов меньше (70,28±0,51 и 72,4±0,45 соответственно; р=0,002), а выделение мононуклеаров (77,94±0,53 - аппаратный и 70,11±0,49 - ручной; р<0,0001), лимфоцитов (71,7±0,54 - ручной; 80,73±0,58 -аппаратный; "р<0,0001) и редукция эритроцитов (36,45±0,51 - ручной; 20,85±0,5 -аппаратный; р<0,0001) выше.

4. Установлено, что в результате обработки ПК различными методами, характеристики клеточного концентрата соответствуют показателям цельной ПК по соотношению основных субпопуляций лейкоцитов, при этом колониеобразующая активность не изменяется.

5. Впервые на большом фактическом материале (3964 образца) оптимизированы процессы проведения и оценки результатов HLA-типирования ПК и периферической крови, представленные двумя молекулярными методами, такими как SSO и SSP, позволяющие получать достоверную и однозначную информацию.

6. Впервые на большом фактическом материале (3964 образца) получены данные генетического полиморфизма антигенов гистосовместимости у здорового населения московского региона для формирования группы сравнения в области изучения «HLA и болезни» и популяционных исследований в связи с высокой экономической эффективностью.

7. Впервые выявлены особенности распределения HLA-специфичностей по классам I и II при заболевании глютенчувствительной целиакией и острым лейкозом у детей^ Использование выявленных особенностей распределения HLAспецифичностей для диагностики и лечения, позволяют успешно реализовать постулат восстановительной медицины в виде ограничения формирования потока больных и обеспечения поддержания оптимальной работоспособности и качества жизни пациентов.

8. Впервые разработаны принципы системного подхода и оптимизирован технологический алгоритм комплексного использования высокотехнологичных и молекулярно-генетических методов банкирования ПК, что позволило получать качественный, эффективный и безопасный клеточный материал, применение которого при различных заболеваниях повысит регуляторные, компенсаторные и адаптивные механизмы восстановительного процесса организма с улучшением качества жизни.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определенные анте- и интранатальные факторы, влияющие на состав и эффективность выделения гемопоэтических стволовых клеток, следует учитывать при выборе метода обработки ПК.

2. Полученные референтные значения клеточного состава ПК, количества СБ34+ клеток и клеток предшественников гемопоэза и их динамику, а также высокую экономическую эффективность данного решения, рекомендуется использовать в качестве группы сравнения и при проведении планирования технологического процесса в банках ПК.

3. Оптимизированную стратегию использования молекулярно-генетических методов НЬА-типирования рекомендуется применять при организации банкирования ПК для восстановительной медицины.

4. Выявленные генетические маркеры предрасположенности /устойчивости к развитию В-ОЛЛ, Т-ОЛЛ и ОМЛ у детей рекомендуется использовать в качестве дополнительных критериев при диагностике и лечении острых лейкозов у детей.

6. Системный подход к банкированию ПК: рекомендуется использовать в профильных медицинских учреждениях России.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Яковлева, Мария Валерьевна

1. Бабак O.A. Динамическая оценка эритропоэза новорожденных. Автореферат диссертации кан.мед.наук. -М., 1999.

2. Байдун Л.В., Логинов A.B., Значение автоматического анализа крови в клинической практике. Гематология и трансфузиология, 1996,2.

3. Балика Ю.Д., Абубакирова A.M., Козлова С.И., Красильникова А.Я., Коваленко Л.В. Биохимические показатели крови матери, пуповинной крови и околоплодных вод при гипоксии плода. Акушерство и гинекология, 1988,7:23-25.

4. Балика Ю.Д., Елизарова И.П., Головацкая Г.И., Изменения в системе крови новорожденных как приспособительная реакция на роды. Акушерство и гинекология, 1973, 11:27-30.

5. Владимирская Е.Б., Майорова O.A., Румянцев С.А., Румянцев А.Г. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. М. ИД Медпрактика, 2005

6. Волынец М.Д. Морфологический состав и функциональная активность клеток пуповинной крови человека. Автореферат диссертации кан.мед.наук. -М., 1998. '

7. Бельмер C.B. Целиакия. Иммунологическая теория патогенеза целиакии // Русский медицинский журнал. 1996; 4(3): 15.

8. Вохмянина Н.В., Эмануэль В.Л. Современная концепция диагностики целиакии // Клинико-лабораторный консилиум. -2006: 20-22.

9. Гематология детского возраста. Руководство для врачей. Под редакцией H.A. Алексеева. Санкт-Петербург. «Гиппократ». 1998. с27-32.

10. Гематология/онкология детского возраста. Практическое руководство по детским болезням под общей редакцией В.Ф.Коколиной и А.Г. Румянцева. Том IV, с.81-113.

11. Гук Л.В., Л.В. Гук, Т.В. Савицкая, Д.А. Домнинский, В.О. Бобрынина, М.М. Шнейдер, A.A. Масчан, О.В. Алейникова Анализ частоты и прогностическогго значения мутаций генов FLT3, с-К1Т И NPM1 у детей с острым миелобластнымлейкозом// 2009.

12. Онкогематология №4. С.27-32t

13. Замараева Н.В. Пуповинная кровь человека альтернативный источник стволовых клеток для трансплантации. Автореф. дисс. док.мед.наук -М.,1999.

14. Зангиева Т.Д. Красная кровь плода человека в разные периоды внутриутробного развития. Вопросы охраны материнства и детства, 1972, 17,1,22

15. Зотиков А., H.A. Красникова, P.M. Кутьина, А.И. Удовтченко, Л.С. Любимова// Немендолевский тип наследования комплекса HLAZ/Иммунология 1989 №6 с.20-23.

16. Зотиков Е.А., Тананов А.Т., Мусатова B.C. HLA и болезни крови.// Материалы 2-й национальной конференции по медицинской биологии и генетике. Варна. Болгария. Тезисы докладов.-1976.- С.8.

17. Зотиков Е.А., Тананов А.Т., Мусатова В.С.Лейкоцитарные антигены человека и болезни крови.//Советская медицина. -1976,- №8. -С.25-28.

18. Кондратьева Е.И., Пузырев В.П., Рудко A.A. и др. Поиск ассоциации полиморфных вариантов генов-модификаторов с целиакией у детей и подростков Томской области // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. -2006; 20: 68-72.

19. Коровина H.A., Захарова И.Н., Лысиков Ю.А. Клинические аспекты целиакии у детей. Пособие для практических врачей-педиатров. М., МедЭкспертПресс, 2007: 10-16, 45-47.

20. Исследование системы крови в клинической практике. Под редакцией Г.И. Козинца и В.А. Макарова. Москва. «Триада-Х».1997; с9-49;259-97.

21. Кравкова Е.В. Морфологическая картина крови плода человека в разные периоды внутриутробной жизни. Акушерство и гинекология, 1954, 5, 16-25.

22. Левина Т.Н. Современный проточный счетчик в службе крови. Автореферат диссертации кан.биол.наук -М.,1999.

23. Маякова С.А. Острые лимфобластные лейкозы.// В кн. Лейкозы у детей/ М.практическая медицина, 2009.- С. 214-251.

24. Парфенов А.И. Целиакия. Эволюция представлений о распространенности, клинических проявлениях и значимости этиотропной терапии. М., Анахарсис, 2007: 38-47.

25. Попа A.B., Острые миелоидные лейкозы. .//В.кн. Лейкозы у детей. М.практическая медицина, 2009.- С.253-288.

26. Разумов А.Н., Бобровницкий И.П. Восстановительная медицина: роль и место в современной медицинской науке и системе здравоохранения. // - Курортные ведомости 2002. - № 4 стр. 13-19.

27. Рий A.A., Клинико-диагностическое значение антигенов HLA у больных острыми и хроническими лейкозами при проспективном наблюдении.// дис. на соиск. учен. степ, канд. мед.наук. 2007.

28. Станкуте Д. и др. Клиническая оценка некоторых биохимических показателей пуповинной крови новорожденных от матерей с поздним токсикозом беременности. Сборник «Болезни матери и ребенка», Vilnius, 1990, 56-61.

29. Тананов А.Т., Кутьина P.M., Турбина Н.С. и др. HLA антигены у больных с патологией системы крови.// Проблемы гематологии. 1981,№1.С.8-12.

30. Тимонова JI.A., А.Г. Румянцев. HLA-антигены I и II классов при остром лимфобластном лейкозе у детей. // Гематология и трансфузиология. 1989. Т.34. №5. С. 19-22.

31. Торубарова Н.А. Кошель И.В., Яцык Г.В. Кроветворение плода и новорожденного. Москва, «Медицина», 1993.

32. Флейшман Е.В. Хромосомный анализ в диагностике и прогнозировании лейкозов у детей.//В.кн. Лейкозы у детей. М.гПрактическая медицина, 2009.- С.93-194.

33. Хамаганова Е.Г., Зарецкая Ю.М., Молекулярные механизмы ассоциаций HLA-маркеров с резистентностью и развитию лейкоза.//Гематология и трансфузиология, т. 51, №1, с. 12-17, 2006.

34. Шабалин В.Н. и Серова Л.Д.,// Иммунология 1982, №3, с. 59-62.

35. Шмаров Д.А., Козинец Г.И. Лабораторно-клиническое значение проточно-цитометрического анализа крови, Москва, 2004.

36. Ярилин А.А. Основы иммунологии. //Учебник.-М.: «Медицина», 1999.-608 с34.

37. Amiel JL. Study of the leukocyte phenotypes in Hodgkin's disease. //In: Curtoni ES, Mattiuz PL, Tosi RM, eds. Histocompatibility Testing 1967, Copenhagen: Munksgaard, 1967. p. 7981.

38. Aiuti A, Tavian M, Cipponi A, Ficara F, Zappone E, Hoxie J et al. Expression of CXCR4, the receptor for stromal cell-derived factor-1 on fetal and adult human lympho-hematopoietic progenitors. Eur J Immunol 1999; 29: 18231831.

39. Aiuti A, Webb IJ, Bleul С et al. The chemokine SDF-1 is a chemoattractant for human CD34+• hematopoietic progenitor cells and provides a new mechanism to explain the mobilization of CD34+ progenitors to peripheral blood. J Exp Med, 1997; 185:111-120.

40. Aird I, Bentall HH, Roberts JAF. A relationship between cancer of stomach and the ABO blood groups.// British Medical Journal 1953; v. 1. p. 799-801.

41. Amiel JL. Study of the leukocyte phenotypes in Hodgkin's disease. //In: Curtoni ES, Mattiuz PL, Tosi RM, eds. Histocompatibility Testing 1967, Copenhagen: Munksgaard, 1967. p. 7981.

42. Arriett KL, Huang W, Valiante NM, Barber LD, Parham P. The Bw4/Bw6 difference between HLA-B*0802 and HLA-B*0801 changes the peptides endogenously bound and the stimulation of alloreactive T cells.// Immunogenetics 1998; v.48 p. 56-61.

43. Abé T., Makimoto A., Kawano Y. et al. Intra-apheresis recruitment of blood progenitor Alenzi FQ. Induction of apoptosis in myeloid progenitors by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Br J Biomed Sci. 2004;61(4):200-5.

44. Albert ED, Nísperos B, Thomas ED. HLA antigens and haplotypes in acute leukemia.// Leukemia Research 1977; v. 1: 261-269.

45. Altinkaynak S, Alp H, Bastem A, Selimoglu M, Energin M. Serum Ferritin and Hemoglobin Levels of mothers and their newborns. Published erratum appears in Turk J Pediatr 1995 Oct-Dec; 37(4):439.

46. Anthony RS., McKelvie ND., Cunningham AJ., et al. Flow cytometry using annexin V can detect early apoptosis in peripheral blood stem cell harvests from patients with leukaemia and lymphoma. Bone Marrow Transplant, 1998; 21(5): 441-446.

47. Arends MJ, Morris RG, Wyllie AH: Apoptosis: The role of endonuclease. Am J Pathol 136:593-608, 1990.

48. Aroviita P. Teramo K. Hiilesmaa V, Kekomaki R. Cord blood hematopoietic progenitor cell concentration and infant sex. Transfusion. 2005 Apr;45(4):613-21.

49. Axt R, Ertan K, Hendrik J, Wrobel M, Mink D, Schmidt W. Nucleated red blood cells in cord blood of singleton term and post-term neonates. J Perinat Med. 1999;27(5):376-81.

50. Barcena A, Park SW, Banapour B, Muench MO, Mechetner E. Expression of Fas/CD95 and Bcl-2 by primitive hematopoietic progenitors freshly isolated from human fetal liver. Blood 1996; 88:2013-2025.

51. Bienz M. Ludwig M., Mueller B.U. et. al. Risk assessment in patient with acute myeloid leukemia and a normal kariotape. //Clin. Cane. Res.- 2005-Vol.l l-P.1416-1424.

52. Bodmer JG, Marsh SG, Albert ED, et al. Nomenclature for the factors of the HLA system, 1998. //European Journal of Immunogenetics 1999; v.26 p. 81-116.

53. Bonnet D, Dick JE (1997). "Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell".//Nat. Med. V.3 (7): p.730-737

54. Begovich AB, McClure GR, Suraj VC, et al. Polymorphism, recombination, and linkage disequilibrium within the HLA class II region.// Journal of Immunology 1992; v. 148 p. 249258: •

55. Benacerraf В, McDevitt HO. Histocompatibility-Iinked immune response genes. Science 1972; v.175 p. 273-279.

56. Benacerraf B. Role of MHC gene products in immune regulation. Science 1981; v.212 p. 1229-1238.

57. Bonner JJ. Major histocompatibility complex influences reproductive efficiency: evolutionary implications.//Journal of Craniofacial Genetics and Developmental Biology 1986; Suppl 21 p. 5-11.

58. Bodmer WF. Evolutionary significance of the HLA system Review. //Nature 1972; v.237 p. 139-145.

59. Bortin MM, D'Amaro J, Bach FH, Rimm AA, van Rood JJ. HLA associations with leukemia.// Blood 1987; v.70 p. 227-232.

60. Browning M., McMichael A. HLA and MHC: genes, molecules and function //Oxford: BIOS Scientific Publisher Ltd;1996.p.353-373

61. Brown J.H., Jardetzky T.S., Gorga J.C., Stern L.J., Urban R.G., Strominger J.L., Wiley D.C. Three-dimensional structure of the human class II histocompatibility antigen HLA-DR1 // Nature.- 1993,- Vol.364.- P.33- 39.

62. Budowle B, Acton RT, Barger BO, et al. Properdin factor В and acute lymphocytic leukemia (ALL).// Cancer 1982; v.50 p. 2369-2371.

63. Bugawan, T. L., W. Klitz, A. Blair, and H. A. Erlich. 2000. High-resolution HLA class I typing in the СЕРН families: analysis of linkage disequilibrium among HLA loci. //Tissue Antigens 2000; v.56 p.392-404.

64. Bentley SA, Johnson A, Bishop CA, A parallel evaluation of four automated hematology analyzers. Am J Clin Pathol 1993; 100:626-32.

65. Bernstein PS, Minior VK, Divon MY. Nucleated red blood cells counts in small-for-gestational age fetuses with abnormal umbilical artery Doppler studies. Am J Obstet Gynecol ,1997; 177:1079-84.

66. Brady HJ, Gil-Gomez G, Kirberg J, Berns AJ. Bax alpha perturbs T cell development and affects cell cycle entry of T cells. Embo J 1996; 15: 6991-7001.

67. Buonocore G; De Filippo M; Gioia D; Picciolini T; Luzze E; Bocci V; Bracci R. Maternal and neonatal plasma cytokine levels in relation to mode of delivery. Biol-Neonate. 1995; 68(2): 104-10.

68. Buonocore G; De Filippo M; Gioia D; Picciolini T; Luzze E; Bocci V; Bracci R. Maternal and neonatal plasma cytokine levels in relation to mode of delivery. Biol-Neonate. 1995; 68(2): 104-10.

69. Bussolati В., Bruno S., Grange C., Buttiglieri S., Deregibus MC, Cantino D., Camussi G. Isolation of Renal Progenitor Cells from Adult Human Kidney, American Journal of Pathology. 2005; 166, стр. 545-555.

70. Castedo M, Hirsch T, Susin SA, Zamzani N, Marchetti P, Macho A, Kroemer G: Sequential acquisition of mitochondrial and plasma membrane alterations during early lymphocyte apoptosis. J Immunol 157:512-521, 1996.

71. Castedo M, Hirsch T, Susin SA, Zamzani N, Marchetti P, Macho A, Kroemer G: Sequential acquisition of mitochondrial and plasma membrane alterations during early lymphocyte apoptosis. J Immunol 157:512-521, 1996.

72. Castle V, Andrew M, Kelton J, Giron D, Johnston M, Carter C. Frequency and mechanism of neonatal thrombocytopenia. J Pediatr 1986; 108:749-55.

73. Cascino I, D'Alfonso S, Cappello N, et al. Gametic association of HSP70-1 promoter region alleles and their inclusion in extended HLA haplotypes.// Tissue Antigens 1993;v. 42 p.62-66.

74. Cascino I, Sorrentino R, Tosi R. Strong genetic association between HLA-DR3 and a polymorphic variation in the regulatory region of the HSP70-1 gene.// Immunogenetics 1993; v.37 p. 177-182.

75. Childhood cancer in Britain: the National Registry of Childhood Tumours and incidence rates 1978-1987. //Eur. J. Cancer, V.31A, p.2028-2034.

76. Collins WM, Dunlop WR, Zsigray RM, Briles RW, Fite RW. Metastasis of Rous sarcoma tumors in chickens is influenced by the major histocompatibility (B) complex and sex.// Poultry Science 1986; v.65 p. 1642-1648

77. Complete sequence and gene map of a human major histocompatibility complex. The MHC sequencing consortium .//Nature 1999; v.401p. 921-923

78. Carpentier NA, Jeannet M. Increased HLA-DR compatibility between patients with acute myeloid leukemia and their parents: implication for bone marrow transplantation. //Transplantation Proceedings 1987;v. 19 p.2644-2645.

79. Casper JT, Duquesnoy RJ, Borella L. Transient appearance of HLA-DRw-positive leukocytes in peripheral blood after cessation of antileukemia therapy. //Transplantation Proceedings 1980; v.12 p. 130-133.

80. Chan KW, Pollack MS, Braun D, Jr., O'Reilly RJ , Dupont B. Distribution of HLA genotypes in families of patients with acute leukaemia. Implications for transplantation. //Transplantation 1982; v.33 p. 613-615.

81. Chan KW, Pollack MS, Braun D, Jr., O'Reilly RJ, Dupont B. Distribution of HLA genotypes in families of patients with acute leukemia. Implications for transplantation. //Transplantation 1982; v.33p. 613-615.

82. Childhood cancer in Britain: the National Registry of Childhood Tumours and incidence rates 1978-1987. //Eur. J. Cancer, v.31 A, p.2028-2034.

83. Constantinidou, N., Polychronopoulou, S.; Georgi, P.; Panagiotou, J. P.; Haidas, S.Hla Class I and Class II Associations in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia 91 //Pediatric Research: V. 41(5)May, 1997 p 761-797

84. Compton MM: A biochemical hallmark of apoptosis: Internucleosomal degradation of the genome. Cancer Metast Rev 11:105-119, 1992.

85. Compton MM: A biochemical hallmark of apoptosis: Internucleosomal degradation of the genome. Cancer Metast Rev 11:105-119, 1992.

86. Cotter TG: Induction of apoptosis in cells of the immune system by cytoxic stimuli. Seminars Immunol 4:399-406, 1992.

87. Cutler C.s Antin JH. Peripheral blood stem cells for allogenic transplantation: a review. Stem Cells, 2001; 19:108-117.

88. D'Arena G, Musto P, Cascavilla N, Di Giorgio G, Fusilli S, Zendoli F, Carotenuto M. Flow cytometric characterization of human umbilical cord lymphocytes: immunophenotypic features. Hematologica 1998; 83; 197-203.

89. D'Arena G, Musto P, Cascavilla N, Di Giorgio G, Fusilli S, Zendoli F, Carotenuto M. Flow cytometric characterization of human umbilical cord lymphocytes: immunophenotypic features. Hematologica 1998; 83; 197-203.

90. D'Amaro J, Bach FH, van Rood JJ, Rimm AA, Bortin MM. HLA C associations with acute leukemia. //Lancet 1984; v. 2p. 1176-1178.

91. Doherty PC, Zinkernagel RM. A biological role for the major histocompatibility antigens. //Lancet 1975; V. 1, N. 7922, P. 1406-1409.

92. Dorak MT, Chalmers EA, Gaffney D, et al. Human major histocompatibility complex contains several leukaemia susceptibility genes. //Leukaemia & Lymphoma 1994; v. 12 p. 211-222

93. Dorak MT, Owen G, Galbraith I, et al. Nature of HLA-associated predisposition to childhood acute lymphoblastic leukemia. //Leukemia 1995; v.9 p. 875-878.

94. Dorak MT, Machulla HK, Hentschel M, Mills KI, Langner J, Burnett AK. Influence of the major histocompatibility complex for HLA-DR53 on age at onset of chronic lymphoid leukemia. //International Journal of Cancer 1996; v.65 p. 134-139.

95. Dorak MT, Lawson T, Machulla HKG, Darke C, Mills KI, Burnett AK. Unravelling an HLA-DR association in childhood acute lymphoblastic leukemia.// Blood 1999; v. 94 p.694-700.

96. Dausset J. Iso-leuco-anticorps.// Acta Haematologica 1959; v.20 p. 156-166

97. De Moor P, Louwagie A. Distribution of HLA genotypes in sibs of patients with acute leukemia. //Scandinavian Journal of Haematology 1985; v.34 p. 68-70.

98. De Moor P. Distribution of HLA genotypes in sibs of patients with acute lymphoblastic leukemia. //European Journal of Haematology 1989; v. 42 p. 317-318.

99. Degli-Esposti MA, Leaver AL, Christiansen FT, Witt CS, Abraham LJ, Dawkins RL. Ancestral haplotypes: conserved population MHC haplotypes.//Human Immunology 1992; v.34 p. 242-252.

100. Dyer PA, Ridway JC, Flanagan NG. HLA-A,B and DR antigens in chronic lymphocytic leukemia.// Disease Markers 1986; v.4 p.231-237.

101. Dom'en J, Cheshier SH, Weissman IL. The role of apoptosis in the regulation of hematopoietic stem cells: Overexpression of Bcl-2 increases both their number and repopulation potential. J Exp Med 2000; 191: 253-264.

102. Donna D. Evolutionary considerations in hematopoietic development. AnnN-Y AS, 1999, pp.84-91.

103. Edidin M. Function by association? MHC antigens and membrane receptor complexes.// Immunology Today 1988; v.9 p.218-219.

104. Endersen PC, Prytz PS, Aarbakke J: A new flow cytometric method for discrimination of apoptotic cells and detection of their cell cycle specificity through staining of F-actin and DNA. Cytometry 20:162-171, 1995.

105. Fadok VA, Voelker DR, Cammpbell PA, Cohen JJ, Bratton DL, Henson PM: Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol 148:2207-2216, 1992.

106. Fahnenstish H; Dame C; Allera A; Rosskamp R; Kowalewski S. Erythropoietin as a biochemical parameter for fetal hypoxia. Klin-Paediatr. 1995 Nov-Dec; 207(6): 326-30.

107. Faraldo MJ, Dux A, Muhlbock O, Hart G. Histocompatibility genes (the H-2 complex) and susceptibility to spontaneous lung tumors in mice.// Immunogenetics 1979; v.9 p. 383-404.

108. Fialkow PJ, Janssen JW, Bartram "Clonal remissions in acute nonlymphocytic leukemia: evidence for a multistep pathogenesis of the malignanc.// Blood. 1991 Apr v.l;77(7) p.1415-1417. ■

109. Ferber A, Grassi A, Akyol D, O'reilly-Green C, Divon MY. The association of fetal heart rate patterns with nucleated red blood cell counts at birth. Am J Obstet Gynecol 2003; 188:1228-30.

110. Forestier F. Some aspect of fetal biology. Fetal Ther. 1987, 2:181-187.

111. Forestier F., Cox W.L.; Daffos F.; Rainaut M. The assessment of fetal blood samples. Am.J. Obstet. Genecol. 1988,158,1184-1188.

112. Forestier F., Daffos F., Galacteros G., Bardakjan J., rainaut M., Beuzard Y. Hematological nalues of 163 normal fetuses between 18 and 30 weeks of gestation. Pediatr. Res., 1986, 20(4):342-346.

113. Forestier F., Daffos F., Rainaut Mi, Tri vin F. Blood chemistry of noemal fetuses at midtrimester of pregnancy. Pediatr. Res., 1987, 21,6:579-583.

114. Freireich EJ, Judson G, Levin RH. Separation and collection of leukocytes. Cancer Res 1965;25:1516-20.

115. Fuller TG,,Fuller A. The humoral immune response against an HLA class I allodeterminant correlates with the HLA-DR phenotype of the responder.// Transplantation 1999; v.68' p.173-182.

116. Gatti 'RA, Meuwissen HJ, Alien HD. Immunological reconstitution of sex-linked lymphopenic immunological deficiency. Lancet 1968;2:1366-9.

117. Gluckman, E., Rocha, Y., Boyer-Chammard, A., et al Outcome of cord-blood transplantation from related and unrelated donors. Eurocord Transplant Group and the European Blood and Marrow Transplantation Group.// N Engl J Med. 1997. v.337(6), p. 373-381.

118. Gorski J, Rollini P, Mach B. Structural comparison of the genes of two HLA-DR supertypic groups: the loci encoding DRw52 and DRw53 are not truly allelic.// Immunogenetics 1987; v. 25 p'. 397-402.

119. Gruen JR, Weissman SM. Evolving views of the major histocompatibility complex.// Blood 1997; v.90 p. 4252-4265

120. Gluckman E. Current status of umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation. // Exp. Hematol. 2000, v.28, p.l 197-205.

121. Gluckman E., Broxmeyer H.E. Hematopoietic Stem-Cell transplants using umbilical-cord bloodV/N. Engl. J. Med 2001, V.344 (24) p. 1860-61.

122. Gluckman T., Rocha V. Cord blood transplantation: state of the art //Haematologica, Vol. 94, Issue 4, p. 451-454 (2009)

123. Greaves F. and J. Wiemels, Origins of chromosome translocations in childhood leukaemia.// Nat. Rev., Cancer v.3 (2003), p. 639-649.

124. Greaves M., Infection, immune responses and the etiology of childhood leukemia.// Nat. Rev. Cancer v.6 (2006), p. 193-203.

125. Greaves, M.F. (1999) Molecular genetics, natural history and the demise of childhood leukaemia. //Eur. J. Cancer, v.35, p. 173-185

126. Gross L. Susceptibility to suckling-infant, and resistance of adult, mice of the C3H and of the C57 lines to inoculation with AK leukemia.// Cancer 1950; p. 1073-1087.

127. Gross L. Viral (egg-borne) etiology of mouse leukemia.// Cancer 1956; v.9 p. 778-791.

128. George D, Bussel JB. Neonatal thrombocytopenia. Semin Thromb Hemostat 1995; 21:27693. .

129. Gil-Gomez G, Berns A, Brady HJ. A link between cell cycle and cell death: Bax and Bcl-2 modulate Cdk2 activation during thymocyte apoptosis. Embo J 1998; 17: 7209-7218.

130. Gilmour J.R. Normal hemopoiesis in intrauterine and neonatal life. J.Pathol., 1942,52,25.

131. Green P.H., Cellier C., Ph. D. Celiac Disease//N. Engl. J.Med.-2007; 357: 1731-43.

132. Green P., Jabri B. Coeliac disease // Lancet. 2003; 362: 383-391.

133. Hedley DW, McCulloch EA: Generation of oxygen intermediates after treatment of blasts of acute myeloblasts leukemia with cytosine arabinoside: Role of bcl-2. Leukemia 10:11431149, 1996.

134. Hokama T. Relationship between maternal and cord blood plasma iron concentrations. J Trop Pediatr 1999Apr; 45(2): 120.

135. Hamilton MS, Hellstrom I. Selection for histoincompatible progeny in mice.// Biology of Reproduction 1978; v. 19 p. 267-270.

136. Han R, Breitburd F, Marche PN, Orth G. Linkage of regression and malignant conversion of rabbit viral papillomas to MHC class II genes. //Nature 1992; v.356 p. 66-68.

137. Haring V, Gray JE, McClure BA, Anderson MA, Clarke AE. Self-incompatibility: a self-recognition system in plants Review. //Science 1990; v. 250 p. 937-941.

138. Harris, D. T. Experience in autologous and allogeneic cord, blood banking.//J Hematother. 1996. v. 5(2), p. 123-128.

139. Harrison Ch., The detection and significance of chromosomal abnormalities in childhood acute lymphoblastic leukemia//Blood Reviews. 2001. Vol.15 P.49-59.

140. Heinzelmann EW, Zsigray RM, Collins WM. Cross-reactivity between RSV-induced tumor antigen and B5 MHC alloantigen in the chicken.// Immunogenetics 1981; v.13 p. 29-37.

141. Ivanovic Z, Dello Sbarba PD, Trimoreau F et al. Primitive human HPCs are better maintained and expanded in vitro at 1 percent oxygen than at 20 percent. Transfusion 2000; 40:1482-1488.

142. Jilma B., Hergovich N., Homoncik M. et al. Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) downregulates its receptor (CD 114) on neutrophils and induces gelatinase B release in humans. Br J Haematol 2000; 111:314-320.

143. Jones III CM., Greiss FC. The effect of labor on maternal and fetal circulating cteholamines. Am.J.Obstet. Gynecol. 1982,144,2,149-153.

144. Jonhston LA, Gallant P. Control of growth and organ size in Drosophila // BioEssays. 2002. V.24., 54-64.

145. Jones JS, Partridge L. Tissue rejection: the price for sexual acceptance.// Nature 1983; v.304 p.484-485.

146. Jonker M, Balner H . The major histocompatibility complex: a key to a better understanding of evolution. //Transplantation Proceedings 1980; v. 12 p. 575-581.

147. Jin K, Ho HN, Speed TP, Gill TJI. Reproductive failure and the major histocompatibility complex. //American Journal of Human Genetics 1995; v.56 p.1456-1467.

148. Jones JS, Partridge L. Tissue rejection: the price for sexual acceptance.// Nature 1983; v.304 p.484-485.

149. Jonker M, Balner H . The major histocompatibility complex: a key to a better understanding of evolution. //Transplantation Proceedings 1980; v. 12 p. 575-581.

150. Joventino LP, Stock W, Lane NJ, Daly KM, Mick R, Le Beau MM, Larson RA. Certain HLA' antigens are associated with specific morphologic and cytogenetic subsets of acute myeloid leukemia.// Leukemia. 1995 Mar; v.9(3) p.433-9.

151. Kerr JF*, Wyllie, AH and Currie, AR (1972). "Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics." Br J Cancer 26(4): 239-57.

152. KarellK. Dissecting genetic susceptibility to gluten sensitivity: HLA-linked risk factors in coeliac disease and dermatitis herpetiformis // Academic dissertation. Helsinki, 2003. — 17 p.

153. Klein J, O'hUigin C. Class II B Mhc motifs in an evolutionary perspective Review. //Immunological Reviews 1995; v.l43p. 89-111.

154. Klein J, Satta Y, O'hUigin C, Takahata N. The molecular descent of the major histocompatibility complex Review. //Annual Review of Immunology 1993; v. 11 p. 269295

155. Klein J. Evolution and function of the major histocompatibility complex: facts and speculations. In: Gotze D, ed. The Major Histocompatibility System in Man and Animals/ // New York: Springer-Verlag, 1976 p. 339-378.

156. Kothe E. Tetrapolar fungal mating types: sexes by the thousands.//FEMS Microbiological Reviews 1996; v. 18 p. 65-87

157. Kupfermann H, Mayer WE, O'hUigin C, Klein D, Klein J. Shared polymorphism between gorilla and human major histocompatibility complex DRB loci.//Human Immunology 1992; v.34 p.267-278.

158. Kybo K., Yamazaki Y., Hanaoka M., Nomura H., et al. HLA antigens in Mycobacterium avium-intracellulare pulmanory infection.//Am. J. Respir. Crit. Care -Med. 2000. v.l61p. 1368-1371.

159. Koenn ME, Kirby BA, Cook LL, Hare JL, et al. Comparison of Four Automated Hematology Analyzers. Clinical Laboratory Science Fall 2001; 14; 4.

160. Kuci S, Wessels JT, Buhring H-J, Schilbach K, et al. Identification of a novel class of CD 133+CD 34- peripheral blood cells with SCID-repopulating capacity. Journal Macs and more, 2003, vol.7 (1), 6-8.

161. Lopez-Vazquez A., Fuentes D., Rodrigo L. et al. MHC class I region plays a role in the development of diverse clinical forms of celiac disease in a Saharawi population // Am. J. Gastroenterol. -2004; 99(4): 662-667.

162. Louca A.S., Sollid L.M. HLA in celiac disease: unraveling the complex genetics of a complex disorder // Tissue Antigens. 2003; 61: 105-117.

163. Ludwig M. Solid Institute of Immunology, Rikshospitalet, University of Oslo, N-0027 Oslo, Norway Molecular, Basis of Celiac Disease // Annual Reviev of Immunology. — 2000; 18: 53-81. "

164. Lilly F, Boyse EA, Old LJ. Genetic basis of susceptibility to viral leukemogenesis. //Lancet 1964; ii p. 1207-1209.

165. Lilly F, Pincus T. Genetic control of murine viral leukemogenesis.// Advances in Cancer Research 1973; v,17p. 231-277.

166. Little A.-M and P. Parham. Polymorphism and evolution of HLA class I and II genes and molecules.//Rev.Immunogenetics. 1999. v.l.p. 105-123

167. Lundberg AS, McDevitt HO. Evolution of major histocompatibility complex class II allelic diversity: direct descent in mice and humans.//Proceedings of the National Academy of Sciences USA 1992;v. 89 p. 6545-6549.

168. Lardy NM, van der Horst AR. van de Weerd MJ, de Waal LP, Bontrop RE. HLA-DRB4 gene encoded HLA-DR53 specificity segregating with the HLA-DR7, -DQ9 haplotype: unusual association. //Human Immunology 1998; v.59 p. 115-118.

169. Leen-MP, Gorski J. DRB4 promoter polymorphism in DR7 individuals: correlation with DRB4 pre-mRNA and mRNA levels.// Immunogenetics 1997; v.45p.371-378.

170. Lechler R. HLA and Diseases.//Academic Press 1994. pp.2-23,83-171

171. Lerner SP, Finch CE. The major histocompatibility complex and reproductive functions Review. //Endocrine Reviews 1991; v. 12 p. 78-90.

172. Loetscher P., Mariagrazia Uguccioni Lorenza Bordoli, Marco Baggiolini, Bernhard Moser, Carlo Chizzolini& Jean-Michel Dayer CCR5 is characteristic of Thl lymphocytes.//Nature v.391, p.344-345 (22 January 1998)

173. Letsky EA. Erythropoiesis in pregnancy. J Perinat Med 1995; 23(1-2): 39-45

174. Levesque JP, Bendall LJ, Hendy J, Takamatzu Y, Simmons PJ. Neutrophil enzymes degrade CXCR4 on CD34+ progenitors: implications for progenitor cell mobilization. Blood 2002; 100: i07a.

175. Levesque JP, Haylock DN, Simmons PJ. Cytokine regulation of proliferation and cell adhesion are correlated events in human CD34+ hemopoietic progenitors. Blood 1996; 88: 1168-1176.

176. Lewis J, 1996: Neurogenic genes and vertebrate neurogenesis. J.Current- opinion in neurobiology 6:3.

177. Li F, Ambrosini G, Chu EY, et al. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin. Nature 1998; 396: 580-584.

178. Li F, Flanary PL, Altieri DC, Dohlman HG. Cell division regulation by BIR1, a member of the inhibitor of apoptosis family in yeast. J Biol Chem 2000; 275: 6707-6711.

179. Li F: Role of survivin and its splice variants in tumorigenesis. Br J Cancer. 2005 Jan 31;92(2):212-6.

180. Linette GP, Li Y, Roth K, Korsmeyer SJ. Cross talk between cell death and cell cycle progression: BCL-2 regulates NFAT mediated activation. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 9545-9552.

181. Liu F, Poursine-Laurent J, Link DC. Expression of the G-CSF receptor on hematopoietic progenitor cells is not required for their mobilization by G-CSF. Blood, 2000; 95: 30253031.

182. Lizard G, Fournel S, Genestier L, Dgedin N, Chaput C, Flacher M, Mutin M, Panaye G, Revillard J-P: Kinetics of plasma membrane and mitochondrial alterations in cells undergoing apoptosis. Cytometry, 1995, 21:275-283.

183. Lockshin RA, Zakeri Z. Programmed cell death and apoptosis: origins of the theory. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001, 2(7):545-50.

184. Ma Y, Zou P, Xiao J, Huang SA: Expression of survivin in cord blood CD34(+) stem/progenitor cells and its significance. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2003 May; 24(5):238-40.

185. Ma Y, Zou P: Functional expression of CD95/Fas antigen and Bcl-2 on cord blood hematopoietic progenitor cells. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2002; 22(l):24-7.

186. Malamut G., Meresse B,, Cellier C., Cerf-Bensussan N. Celiac disease in 2009: a future without gluten-free diet? // Gastroenterol. Clin. Biol. -2009; 33(8-9): 635^17.

187. Maconi M, Rolfo A, Cardaropolo S, Brini M, Danise P. Haematologic values in healthy and small for gestational age newborns. Lab hematol. 2005; 11(2): 152-6.

188. Majhail N.S., Brunstein C.G., Wagner J.E. Double umbilical cord blood transplantation. Curr Opin Immunol 2006; 18(5): 571-5. 4

189. McSween JM, Fernandez LA, Eastwood SL, Pyasmary AF. Restricted genetic heterogeneity in acute lymphocytic leukemia. //Tissue Antigens 1980; v. 16 p.70-72.

190. Melnick A, Licht JD (May 1999). "Deconstructing a disease: RARa, its fusion partners, and their roles in the pathogenesis of acute promyelocytic leukemia". //Blood V. 93 (10) p. 3167-215

191. Metzenberg RL. The role of similarity and difference in fungal mating. //Genetics 1990; v.125 p. 457-462.

192. Molecular biology of acute myeloid leukemia.Caligiuri MA, Strout MP, Gilliland DG.// Seminars in Oncoljgy. 1997 Feb; v.24(l) p.32-44

193. Mori H., S.M. Colman, Z. Xiao and A.M. Ford et al., Chromosome translocations and covert leukemic clones are generated during normal fetal development.// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. v.99 (2002), p. 8242-8247.

194. Mullis K.B. US Patent 4683 202, 1985

195. Majno G, Jons 1: Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol, 1995, 146:3-16.

196. Mazel S, Burtrum D, Petrie HT. Regulation of cell division cycle progression by bcl-2 expression: A potential mechanism for inhibition of programmed cell death. J Exp Med 1996; 183: 2219-2226.

197. McCarthy JM, Capullari T, Thompson Z, Zhu Y, Spellacy WN. Umbilical cord nucleated red blood cell counts: normal values and the effect of labor. J Perinatol. 2006 Feb: 26(2):89-92.

198. McCredie KB, Hersh EM, Freireich EJ. Cells capable of colony formation circulate in the peripheral blood of man. Science 1971;171:293-4.

199. Meberg A, Jakobsen E, Halvorsen K. Humoral regulation of erythropoiesis andi *thrombopoiesis in appropriate and small for gestational age infants. Acta Paediatr Scand. 1982 Sep;71(5):769-73.

200. Medcalf D., 1989 The molesular control of cell division, differentiation, commitment and maturation in hematopoietic cells. Nature 399:27.

201. Möhle R, Moore MA, Nachman RL et al. Transendothelial migration of CD34+ and mature hematopoietic cells: an in vitro study using a human bone marrow endothelial cell line. Blood, 1997; 89:72-80.

202. Möhle R., bautz F., Rafii S. et al. Regulation of Transendothelial Migration of Hematopoietic Progenitor Cells. Ann N-Y AS, 1999, 872: 176-186

203. Martinez-Climent JA. Molecular cytogenetics of childhood hematological malignancies.// 1997 Dec; v. 11(12) p. 1999-2021

204. Mori, M., P. G. Beatty, M. Graves, K. M. Boucher, and E. L. Milford. 1997. HLA gene and haplotype frequencies in the North American population -The National Marrow Donor Program Donor Registry. //Transplantation v.64 p. 1017-1027.

205. Muller .CA, Hasmann R, Grosse Wilde H, et al. Significant association of acute lymphoblastic leukemia with HLA- Cwl.ll Genetic Epidemiology 1988; v.5:p.453-461.

206. Naeye R, Localio R, Determining the time before birth when ischemia and hypoxemia initiated cerebral palsy. Odstet Gynecol 1995; 86:713-9.

207. Naeye R, Localio R, Determining the time before birth when ischemia and hypoxemia initiated cerebral palsy. Odstet Gynecol 1995; 86:713-9.

208. Nagafuji K, Takenaka K, Niho Y: Fas antigen expression on human hematopoietic progenitor cells. Nippon Rinsho. 1996 Jul;54(7): 1790-1796.

209. Nossner E, Goldberg JE, Naftzger C, Lyu SC, Clayberger C, Krensky AM. HLA-derived peptides which inhibit T cell function bind to members of the heat-shock protein 70 family. //Journal of Experimental Medicine 1996; v.l83p. 339-348.

210. Nowinski RC, Brown M, Doyle T, Prentice RL. Genetic and viral factors influencing the development of spontaneous leukemia in AKR mice. //Virology 1979; v.96 p. 186-204.

211. NETCORD. http://www.netcord.org

212. NihoY, AsanoY. Fas/Fas ligand and hematopoietic progenitor cells. Curr Opin Hematol 1998;5: 163-165.

213. Ogawa M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood , 1993, 81:2844.

214. Ogawa M., Matsunaga T. Humoral regulation of hematopoietic stem cells. Ann N-Y AS, 1999, 17-23.

215. Orgad S, Cohen IJ, Neumann Y, et al. HLA-A11 is associated with poor prognosis in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL).// Leukemia 1988; v. 2p. 79S-87S.

216. Ogasawara M, D H Kono and D T Yu. Mimicry of human histocompatibility HLA-B27 antigens by Klebsiella pneumoniae. //Infect Immun. 1986 March; v.51(3) p.901-908

217. Ober C, Elias S, Kostyu DD, Hauck WW. Decreased fecundability in Hutterite couples sharing HLA-DR.// American Journal of Human Genetics 1992; v.50 p.6-14.

218. Ober C, Weitkamp LR, Cox N, Dytch H, Kostyu DD, Elias S. HLA and mate choice in humans.// American Journal of Human Genetics 1997; v.61 p. 497-504.

219. Oguz FS, Kalayoglu S, Diler AS, Tozkir H, Sargin D, Carin M, Dorak MT. HLA system affects the age-at-onset in chronic myeloid leukemia. : Am J Hematol. 2003 Aug;73(4):256-62 • •

220. Orgad S, Cohen IJ, Neumann Y, et al. HLA-A11 is associated with poor prognosis in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL).// Leukemia 1988; v.2p. 79S-87S.p. 466468.

221. Papayannopoulou T, Craddock C. Homing and trafficking of hemopoietic progenitor cells. Acta Hematol 1997; 97:97-104

222. Papayannopoulou T. Bone marrow homing: the players, the playfield, and their evolving roles. Curr. Opin. Hematol. 2003; 10:214-219.

223. Papayannopoulou T. Bone marrow homing: the players, the playfield, and their evolving roles. Curr. Opin. Hematol. 2003; 10:214-219.

224. Perkov S, Flegar-Mestric Z, Seper I. Biologic variation in electrolytes and essential microelements in the blood of neonates and their mothers. Lijec vjesn 1998 Jun; 120(6): 145-150.

225. Perkov S, Flegar-Mestric Z, Seper I. Biologic variation in electrolytes and essential microelements in the blood of neonates and their mothers. Lijec vjesn 1998 Jun; 120(6): 145-150.

226. Perri T, Ferber A, Digli A, Rabizadeh E, Weissmann-Brenner A, Divon MY. Nucleated Red Blood Cells in Uncomplicated Prolonged Pregnancy. Obstetrics Gynecology 2004; 104:372376.

227. Perri T, Ferber A, Digli A, Rabizadeh E, Weissmann-Brenner A, Divon MY. Nucleated Red Blood Cells in Uncomplicated Prolonged Pregnancy. Obstetrics Gynecology 2004; 104:372376.

228. Peters R, Leyvraz S, Perey L. Apoptotic regulation in primitive hematopoietic precursors. Blood 1998; 92: 2041-2052.

229. Phelan J, Korst L, Ock AM, Martin G. Neonatal Nucleated red blood cells and Lymphocyte counts in fetal brain injury. Obstet Gynecol 1998; 91:485-9.

230. Phelan J, Korst L, Ock AM, Martin G. Neonatal Nucleated red blood cells and Lymphocyte counts in fetal'brain injury. Obstet Gynecol 1998; 91:485-9.

231. Piacentini M, Fesus I, Farrace MG, Ghibelli L, Piredda L, Meline G: The expression of "tissue" transglutaminase in two human cancer cell lines is related to with the programmed cell death (apoptosis). Eur J Cell Biol, 1995, 54:246-254.

232. Picaud JC, Putet G, Salle BL, claris O. Iron supplementation in preterm infants treated with erythropoiétin. Arch Pediatr 1999 Jun; 6(6): 657-664.

233. Pranke P, Failace RR, Allebrandt WF, Steibel G, Schmidt F, Nardi NB. Hematologic and Immunophenotypic Characterization of Human Umbilical Cord Blood. Acta Haematol 2001; 105; 71-76.

234. Pranke P, Failace RR, Allebrandt-WF, Steibel G, Schmidt'F, Nardi NB. Hematologic and Immunophenotypic Characterization of Human Umbilical Cord Blood. Acta Haematol 2001; 105; 71-76.

235. Phillips ML, Moule ML, Delovitch TL, Yip CC. Class I histocompatibility antigens and insulin receptors: evidence for interactions. //Proceedings of the National Academy of Sciences USA 1986; v.83 p.3474-3478

236. Powis SH, Geraghty DE. What is the MHC? //Immunology Today 1995; v. 16:p. 466-468.

237. Palm J. Maternal-Fetal histoincompatibility in rats: an escape from adversity.// Cancer Research 1974; v.34 p. 2061-2065.

238. Partanen J, Milner C, Campbell RD, Maki M, Lipsanen V, Koskimies S. HLA-linked heat-shock protein 70 (HSP70-2) gene polymorphism and celiac disease. //Tissue Antigens 1993; v. 41: p.15-19.

239. Penn DJ, Potts WK. The evolution of mating preferences and major histocompatibility complex genes.// American Naturalist 1999; v.153 p.145-164.

240. Potts WK, Manning CJ, Wakeland EK. Mating patterns in seminatural populations of mice influenced by MHC genotype. //Nature 1991; v.352 p. 619-621.

241. Rivett A.J., Hearn A.R. Proteasome function in antigen presentation:immunoproteasome complexes, peptide production, and interactions with viral proteins. // Curr. Protein Pept. Sci. 2004. Vol. 5(3). P. 153-61

242. Robin Foa and Antonella Vitale. Diagnostic and integrated work-up for the management of Acute * Lymphoblastic Leukemia //Division of Hematology, University "La Sapienza", Rome,.Italy (March 2007). European Leukemia Net.

243. Robinson J/, Waller MJ., McWillam H, Lopez R., Parham P., Marsh

244. Querol S., Rubinstein P., Marsh S.G. E., et al. Cord blood, banking: "providing cord blood banking for a nation". Br J Haematol 2009; 147(2): 227-35. 12272. Rathmell JC, Thompson CB. The central effectors of cell death in the immune system. Annu

245. Rev Immunol 1999; 17: 781-828.

246. Redzko S, Przepiesc J, Zak J, Turowski D, Urban J, Wysocka J. Hematologic parameters in the cord blood labor complicated by meconium-stained amniotic fluid. Ginekol Pol, 2000, 71(8):931-935.

247. Reed JC, Bischoff JR. BIR inging chromosomes through cell division—and survivin' the experience. Cell 2000; 102: 545-548.

248. Rocha- V., Cornish J., Sievers E. L. Et al; Comparison of outcomes of unrelated bone marrow and umbilical cord blood transplants in children with acute leukemia. // Blood .2001 v. 97 p.2962-71.

249. Sainio S, Jarvenpaa AL, Renlund M, Riikonene S, Teramo K, Kekomaki R. Thrombocytopenia in Term Infants: A Population-Based Study. Obstet Gynecol. 2000 Mar; 95(3):441-6.

250. Sainio S, Kekomaki R, Riikonen S, Teramo K. Maternal thrombocytopenia at term: a population-based study. Acta Obstet Gynecol Scand. 2000 Sep; 79(9):744-9.

251. Salafia CM; Minior VK; Lopez-Zeno JA; Whittington SS; Pezzullo JC; Vintzleos AM. Relationship between placental histologic features and umbilical cord blood gases in preterm gestations. Am J Obstet Gynecol. 1995 Oct; 173(4): 1058-1064.

252. Salafia CM; Minior VK; Lopez-Zeno JA; Whittington SS; Pezzullo JC; Vintzleos AM. Relationship between placental histologic features and umbilical cord blood gases in preterm gestations. Am J Obstet Gynecol. 1995 Oct; 173(4): 1058-1064.

253. Saracoglu F, Sahin I, Eser E, Gol K, Turkkani B. Nucleated red blood cells as a marker in acute and chronic fetal asphyxia. Int J Gynaecol Obstet. 2000 Nov: 71 (2): 113-118.

254. Saxonhouse MA, Rimsza LM, Christensen RD, Hutson AD, Stegner J, Koenig JM, Sola MC. Effects of anoxia on megakaryocyte progenitors derived from cord blood CD34pos cells. Eur J Haematol. 2003 Nov; 71(5):359-65.

255. Saxonhouse MA, Rimsza LM, Christensen RD, Hutson AD, Stegner J, Koenig JM, Sola MC. Effects of anoxia on megakaryocyte progenitors derived from cord blood CD34pos cells. Eur J Haematol. 2003 Nov; 71(5):359-65.

256. Schwartz KA. Gestational thrombocytopenia and immune thrombocytopenias in pregnancy. Hematol Oncol Clin North Am. 2000 Oct; 14(5): 1101-16.

257. Schreuder GM, Hurley CK, Marsh SG, et al. The HLA dictionary 1999: A summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, -DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens. //Human Immunology 1999; v.60 p. 11571181.

258. Serikov V, Hounshell C, Larkin S, Green W, Ikeda H, Walters MC, Kuypers FA. Human term placenta as a source of hematopoietic cells.//Exp Biol Med (Maywood). 2009 Jul; v.234(7) p.813-23.

259. Snell GD. Studies in histocompatibility. //Science 1981; v. 213p. 172-178.

260. Schreiber AB, Schlessinger J, Edidin M. Interaction between major histocompatibility complex antigens and epidermal growth factor receptors on human cells. //Journal of Cell Biology 1984; v. 98 p. 725-731.

261. Seremetis S, Cuttner J, Winchester R. Definition of a possible genetic basis for susceptibility to acute myelogenous leukemia associated with the presence of a polymorphic la epitope. //Journal of Clinical Investigation 1985; v.76 p.1391-1397.

262. Stiller CA, Allen MB and Eatock EM. Childhood cancer in Britain: The national registry of childhood tumours and incidence rates 1978-87. // Eur J Cancer .1995. V. 31A P. 20282034.

263. Svejgaard A, Ryder LP. Interaction of HLA molecules with non-immunological ligands as an explanation of HLA and disease association. //Lancet 1976; ii p. 547-549.

264. Satta Y, Mayer WE , Klein J. HLA-DRB intron 1" sequences: implications for the evolution ofHLA-DRB genes and haplotypes. Human Immunology 1996; 51: 1-12.

265. Scott R., Burger Umbilical Cord Blood' Stem Cells.// Handbook of Transfusion Medicine Academic Press 2001. p. 171-178.

266. Singal D. P. Fagnilli L Proliferation of alloantigen sensitized human peripheral blood lymphocytes by autologous cells associated with the HLA-B8/DR3//Clin. Exp. Immunol. 1982; v.49 (3) p.652-656.

267. Srivastava PK, Heike M. Tumour-specific immunogenicity of of 'stress-induced proteins: convergence of two evolutionary pathways of antigen presentation? //Seminars in-Immunology 1991; v.3 p.57-59

268. Shimizu S, Eguchi Y, Kamiike W et al. Induction of apoptosis as well as necrosis by hypoxia and predominant prevention of apoptosis by Bcl-2 and Bcl-XL. Cancer Res 1996; 56:2161-2166.

269. Siegel RM, Frederiksen JK, Zacharias DA, et al. Fas preassociation required for apoptosis signaling and dominant inhibition by pathogenic mutations. Science 2000; 288: 2354-2357.

270. Strasser A. Apoptosis: Death of aT-cell. //Nature, 1995, Vol.373, N.6513, P. 385-386.

271. Sun B, Bai CX, Feng K, Li L, Zhao P, Pei XT. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of CD34(+) hematopoietic stem/progenitor cells and their response to cytokines. Sheng Li Xue Bao. 2000 Apr;52(2): 143-146.

272. Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, et al. Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor. Nature 1999; 397: 441-446.

273. Sutherland DR, Keating A. et al. Sensetive detection and enumeration of CD 133+ 34+ cells in peripheral and cord blood by flow cytometry. Exp. Gematol, 1994, 1003-1010.

274. Tang, T. F., J. Wang, R. Slack, Y.-S. Lin, L. Li, U. Heine, J. Ng, R. J. Hartzman, and C. K. Hurley. 2002. DRB1*03 diversity and DRB3 associations in five major population groups in the United States. //Human Immunology v.63 p.221-228.

275. G. M Taylor, A Hussain, T J Lightfoot, J M Birch, T O B Eden and M F Greaves. HLA-associated susceptibility to childhood B-cell precursor ALL: definition and role of HLA-DPB1 supertypes. //British Journal of Cancer (2008) v. 98, p.l 125-1131.

276. G. M. Taylor, Simon Dearden, Paul Ravetto, Michelle Ayres, Pamela Watson, Adiba Hussain, Mel Greaves, Freda Alexander, Osborn B. Eden and UKCCS.// Investigators Human Molecular Genetics, 2002, V. 11, No. 14 p. 1585-1597

277. Thomson G. HLA Disease Association: Models for the Study of complex Human-Genetic Discords J/Crit. Rev. Lab. Sciences//1995; v.32(2) p. 183-219

278. Tiwari JL, Terasaki PI. HLA and Disease Associations.// New York: Springer-Verlag,-1985;

279. Tollefsen S., Arentz-Hansen H., Fleckenstein B. et al. HLA-DQ2 and -DQ8,signatures of gluten T cell1 epitopes in celiac disease // J. Clin. Invest. 2006; 116(8): 2226-2236.

280. The World Marrow Donor Association, http://www.worldmarrow.org

281. Thomas DB, Yoffey JM. Human fetal haemopoiesis. I. The cellular composition of fetal blood. Br.J.Haemat, 1962.8:290-295.

282. Tsao PN, Teng RJ, Chou HC, Tsou KI. The thrombopoietin level in cord blood in infants born mothers with pregnancy-induced hypertension. Biol Neonate.2002; 82(4):217-21.

283. Tsujimoto Y, Shimizu S, Eguchi Y, KamiikeW, Matsuda H. Bcl-2 and Bcl-xL block apoptosis as well as necrosis: possible involvement of common mediators in apoptotic and necrotic signal transduction pathways. Leukemia 1997; 11 (Suppl. 3):380-382.

284. Uchida N, He D, Tsukamoto A. The Unexpected G0/G1 Cell Cycle Status of Mobilized Hematopoietic Stem Cells From Peripheral Blood. Blood, 1997; 89(2):465-472

285. Udom-Rice I, Bussel JB. Fetal and neonatal thrombocytopenia. Blood Rev 1995; 9:57-64.

286. Ura H, Hirata K, Katsuramaki T. Mechanisms of cell death in hypoxic stress. Nippon Geka Gakkai Zasshi 1999; 100:656-662

287. Villalobos C, Rivera S, Weir-Medina J, Hassanhi M, Montiel M, González R Association of HLA class I and leukemia in mestizo patients of the state of Zulia, Venezuela. //Invest Clin. 2003 Dec; v.44(4) p.283-9

288. Von Fliedner VE, Sultan-Khan Z, Jeannet M. HLA-DRw antigens associated' with acute leukemia. //Tissue Antigens 1980; v. 16 p. 399-404.

289. Von Fliedner VE, Merica H, et ah Evidence for HLA-linked susceptibility factors in > childhood leukemia. //Human Immunology 1983; v.8 p. 183-193

290. Verreck' FA, Elferink D, Vermeulen CJ, et al. DR4Dw4/DR53 molecules contain a peptide from the autoantigen calreticulin. //Tissue Antigens 1995; v.45 p. 270-275.

291. Vjyvjdic S. Distribution of HLA antigens in families of patients with leukemia.//Medicinski pregled. 2008. Jan-Feb.v.61 (1-2). P. 22-26.

292. Vlug A, Schoenmakers HJ, Melief CJ. Genes of the H-2 complex regulate the antibody response to murine leukemia virus. //Journal of Immunology 1981; v. 126: p. 2355-2360.

293. Vojvodic S, Belie B, Popovic S. Association between HLA antigens and leukemia in the population of Vojvodina //Med Pregl. 2001; v.54(3-4) p. 128-34

294. Von Fliedner VE, Merica H, et al. Evidence for HLA-linked susceptibility factors in childhood leukemia. //Human Immunology 1983; v.8 p. 183-193

295. Walford RL, Finkelstein S, Neerhout R, Konrad P, Shanbrom E. Acute childhood leukemia in relation to the HL-A human transplantation genes.// Nature 1970; v.5231 p. 461-462

296. Wedekind C, Chapuisat M, Macas E, Rulicke T. Non-random fertilization in mice correlates with the MHC and something else. //Heredity 1996; v. 77 p. 400-409

297. Wedekind C, Seebeck T, Bettens F, Paepke AJ. MHC-dependent mate preferences in humans. //Proceedings of the Royal Society of London Series B: Biological Sciences 1995; v.260 p/245-249.

298. Weissman IL, Saito Y, Rinkevich B. Allorecognition histocompatibility in a protochordate species: is the relationship to MHC somatic or structural?// Immunological Reviews 1990; v.ll3p.227-241.

299. Werner-Favre C, Jeannet M. HLA compatibility in couples with children suffering from acute leukemia or aplastic anemia.// Tissue Antigens 1979; v. 13 p.307-309.

300. Wiemels, J.L., Cazzaniga, G., Daniotti, M., Eden, O.B., Addison, G.M., Masera, G., Saha, V., Biondi, A. and Greaves, M.F. (1999) Prenatal origin of acute lymphoblastic leukaemia in children. //Lancet, v.354, p. 1499-1503

301. WalkerNSmith JA, Sandhu BK Isolauri E, et al. Recommendations for feeding in childhood gastroenteritis. Guidelines prepared by the ESPGHAN working group of acute diarrhea. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 1997; 24:619-620.

302. Wintrobe's Clinical Hematology //Greer JP et al. 11th. Philadelphia: Lippincott, Williams, and Wilkins, 2004. P. 2045-2062

303. Wu J.Y., Liao C., Xu Z.P., et al. Banking and transplantation of umbilical cord blood in Guangzhou, China. Cytotherapy 2006; 8(5): 488-497. 10

304. Thomson G. HLA Disease Association: Models for the Study of-complex Human Genetic Discords .//Crit. Rev. Lab. Sciences/71995; v.32(2) p.' 183-219

305. Tiwari JL, Terasaki PI. HLA and1 Disease Associations.// New York: Springer-Verlag, 1985;

306. Tollefsen S., Arentz-Hansen Hi, Fleckenstein 13. et al. HLA-DQ2 and -DQ8, signatures of gluten T cell epitopes in celiac disease // J. Clin. Invest. 2006; 116(8): 2226-2236.

307. The World Marrow Donor Association, http://www.worldmarrow.org

308. Thomas DB, Yoffey JM. Human fetal haemopoiesis. I. The cellular composition of fetal blood. BrJ.Haemat, 1962.8:290-295.

309. Tsao PN, Teng RJ, Chou HC, Tsou KI. The thrombopoietin level in cord blood in infants born mothers with pregnancy-induced hypertension. Biol Neonate.2002; 82(4):217-21.

310. Tsujimoto Y, Shimizu S, Eguchi Y, KamiikeW, Matsuda H. Bcl-2 and Bcl-xL block apoptosis as well as necrosis: possible involvement of common mediators in apoptotic and necrotic signal transduction pathways. Leukemia 1997; 11 (Suppl. 3):380-382.

311. Uchida N, He D, Tsukamoto A. The Unexpected G0/G1 Cell Cycle Status of Mobilized Hematopoietic Stem Cells From Peripheral Blood. Blood, 1997; 89(2):465-472

312. Udom-Rice I, Bussel JB. Fetal and neonatal thrombocytopenia. Blood Rev 1995; 9:57-64.

313. Ura H, Hirata K, Katsuramaki T. Mechanisms of cell death in hypoxic stress. Nippon Geka Gakkai Zasshi 1999; 100:656-662

314. Von Fliedner VE, Sultan-Khan Z, Jeannet M. HLA-DRw antigens associated1 with acuteleukemia. //Tissue Antigens 1980; v. 16 p. 399-404.t

315. J of Clinical Investigation 1963; v.42 p. 13 82-1390.n. 2964

316. Zijlstra M, Melief CJ. Virology, genetics and immunology of murine lymphomagenesis. Review.// Biochimica et Biophysica Acta 1986; v. 865 p. 197-231.

317. Zijlstra M, Vasmel WL, Radaskiewicz T, Matthews E, Melief CJ. The H-2 complex regulates both the susceptibility to mouse viral lymphomagenesis and the phenotype of the virus-induced lymphomas. Review. //Journal of Immunogenetics 1986; v.13 p.69-76.

318. ZavazavaN, Eggert F. MHC and behavior. Immunology Today 1997; 18: 8-10.

319. Zinkernagel RM, Doherty PC. Restriction of in vitro T cell-mediated cytotoxicity in lymphocytic choriomeningitis within a syngeneic or semiallogeneic system.// Nature 1974; v.248 p. 701-702.

320. Zinkernagel RM. Cellular immune recognition and the biological role of major transplantation antigens.// Scandinavian Journal of Immunology 1997; v.46 p. 421-436.

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.11) на тему:Системный подход к банкированию пуповинной крови для восстановительной медицины

Автореферат диссертации по медицине на тему Системный подход к банкированию пуповинной крови для восстановительной медицины

Оглавление диссертации Яковлева, Мария Валерьевна :: 2010 :: Москва

Заключение диссертационного исследования на тему "Системный подход к банкированию пуповинной крови для восстановительной медицины"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Яковлева, Мария Валерьевна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций