Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Система интерферона у наркоманов с хронической HCV-инфекцией

па привал, рукиппкп

РГБ ОД

1 1 МАР 2092

КАСЬЯНОВА Наталия Владимировна

СИСТЕМА ИНТЕРФЕРОНА У НАРКОМАНОВ С ХРОНИЧЕСКОЙ НСУ-

Ш1ФЕКЦИЕЙ

14.00.36-Аллсргологая и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2002

Работа выполнена в ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научные руководитель:

академик РАМН, доктор медицинских паук, профессор, Ершов Ф.И.

Официальные оппоненты:

д.м.н., проф. С.Г.Чешик д.б.и., . А.В.Пронин

Ведущая организация: Московский научно-исследовательский институт вакцин и сыворотоь им. ИИ.Мечшжова

Защита диссертации состоится_ < марта 2002 г. в_ часов

на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 ГУ 1ШИЭМ

им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, по адресу: 123098 г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Автореферат разослан^? ^¿СЕС-С/С/ 2002 г.

Ученый секретарь ,г\

диссертационного совета ^ V

доктор медицинских наук, профессор у^З РУСАКОВА Е.В.

О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальпость проблемы. Одной из самых актуальных проблем инфекголопщ на сегодняшний день остается проблема парентеральных вирусных гепатитов, особое место среди которых занимает вирусный гепатит С (ВГС).

Важность данной проблемы обусловлена не только особенностями вируса гепатита С, повсеместным распространением данной инфекции и высоким процентом формирования хронических форм, циррозов печени и гепатоцелюлярных карцином после перенесенного острого вирусного гепатита С (Dozza M.-S. et al., 1990; Schrumpf E. et al., 1990; Takano S. et al., 1995; Kaneko S. et al., 1994; Di Bisceglie A.M. et al., 1994; De Mitri M.S. et al., 1995), но и неблагоприятной современной эпидемической ситуацией.

За последние несколько лет во всем мире, в том числе и в России, отмечается увеличение частоты инфицирования вирусом гепатита С, что обусловлено катастрофическим ростом численности "инъекционных" наркоманов, составляющих основную и самую многочисленную группу риска по заболеваемости данной инфекцией (Martin Y. et al., 1990; Михайлов М.И. с соавт., 1992; GaleazziB. et al., 1995; Онищенко Г.Г. с соавт., 1999).

Известно, что одной из причин хронизации острых форм вирусных инфекций, в том числе ОВГ является снижение функциональной активности иммунной системы, интегральной частью которой является система интерферона (ИФН), обеспечивающая координацию пролиферации, дифференцировки и активации эффекторных клеток иммунной системы.

Многообразие оказываемых системой ИФН эффектов (противовирусный, антимикробный, антипролиферативный, иммуномодулирующий,

радиопротективный и др.) является свидетельством значимости и универсальности этой системы (Ершов Ф.И., 1996). Доказано, что ИФН всех классов даже в малых концентрациях вызывают пролиферацию и возрастание активности естественных киллеров, обладающих выраженной цитолитической активностью, и участвуют в развитии резистентности к вирусным инфекциям и опухолевому росту.

Известно, что хронические вирусные гепатиты (ХВГ) сопровождаются недостаточностью ингерферонообразования, характеризующегося глубоким подавлением синтеза ИФН иммуноцитами крови (Ершов Ф.И., 1996; Levin S. et al., 1985; Григорян C.C., 1992). Было установлено, что у лиц с наркотической зависимостью значительно выражена депрессия продукции а- и у-ИФН, что указывало на глубокий дефект в клеточном звене системы иммунитета, вероятно, обусловленный действием опиатов, являющихся косвенными иммуносупрессорами (Мельников И.В. с соавт., 1997).

Отражением функционального состояния системы ИФН в целом

является инггерфероновый статус (ИФН-статус) (Ершов Ф.И., 1996; Ершов Ф.И. с соавт., 1986; Мезенцева М.В. с соавт., 1997). Обзор научной литературы по ИФН-дефицитным состояниям и синдромам свидетельствует о высокой информативности определения ИФН-статуса (Готовцева Е.П. с соавт., 1989). Доказано, что мониторинг ИФН-статуса при использовании препаратов экзогенного ИФН, индукторов ИФН или иммуномодуляторов может служить критерием эффективности проводимой терапии, а тенденция к нормализации или восстановлению показателей ИФН-статуса свидельствует о повышении неспецифической резистентности организма и, как правило, коррелирует с положительной клинической динамикой заболевания или выздоровлением (Ершов Ф.И., 1996; Григорян С.С. с соавт., 1990; Кузнецов В.П., 1998).

Мировым стандартом в лечении ВГС до настоящего времени остаются препараты ИФН-а. Однако конечный результат проводимой ингерфероногерапии (ИФН-терапии) зачастую оказывается

неудовлетворительным (МагееШп Р. е1 а1., 1991; БееГ Ь. й а1., 1991; МопёеШ М., 1996).

Несмотря на большое количество публикаций, касающихся ИФН-терапии ВГС, состояние системы ИФН у больных ХВГС в динамике заболевания анализировалось мало. Недостаточно внимания уделено также изучению особенностей интерфероногенеза в самой многочисленной группе больных ХВГС - группе "инъекционных" наркоманов. Слабо исследовался вопрос комплексной оценки показателей ИФН-статуса на разных этапах ИФН-тералии, а также выявление зависимости активности инфекционного процесса от показателей системы ИФН.

Использование препаратов экзогенного ИФН в терапии больных ХВГС, основную часть из которых составляют лица с наркотической зависимостью, а также недостаточная эффективность проводимого лечения, объясняет необходимость изучения функционального состояния системы ИФН у данного контингента пациентов.

Цель исследования. Изучить состояние системы ИФН на разных этапах ИФН-терапии у наркоманов с ХВГС.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить функциональное состояние системы ИФН при ХВГС по основным ее показателям, а именно, способности клеток крови к синтезу сывороточного ИФН, а-иу-ИФН.

2. Провести сравнительный анализ показателей активности сывороточного ИФН, а- и у-ИФН в группах больных без наркотической зависимости и пациентов, употребляющих наркотики.

3. Установить корреляцию между показателями системы ИФН и клиническими критериями заболевания.

4. Изучить характер нарушений в системе ИФН на разных этапах ИФН-терапии и зависимость данных нарушений от длительности лечения.

5. Исследовать вопрос о целесообразности применения методики

определения индивидуальной клеточной чувствительности при подборе препаратов ИФН-а для лечения больных ХВГС. Научная повпзна.

Впервые на разных этапах шггерферонотератш исследованы нарушения в системе ИФН у наркоманов с ХВГС. Полученные данные свидетельствуют о том, что по сравнению с пациентами, не употреблявшими наркотики, у лиц с наркотической зависимостью ИФН-терапия оказывала стимулирующее влияние на синтез а- и у-ИФН, причем более выраженное у наркоманов с низкими показателями активности указанных ИФН до лечения.

В процессе ИФН-терапии проведен сравнительный анаше показателей ИФН-статуса и биохимических и вирусологических параметров заболевания. Было установлено, что при ХВГС имеет место несоответствие между увеличением синтеза ИФН и нормализацией показателей активности сывороточных трансаминаз ( биохимический ответ) и элиминацией из крови вирусной РНК (вирусологический ответ).

Нарушения, выявленные в системе ИФН, по-видимому, являются одной из причин недостаточной эффективности ИФН-терапии при ХВГС.

Впервые была применена новая методика определения индивидуальной клеточной чувствительности у больных ХВГС. Практическая значимость.

Результаты мониторинга биохимических и вирусологических показателей заболевания свидетельствовали о преимуществе и целесообразности использования новой методики определения индивидуальной клеточной чувствительности к препаратам ИФН-а, позволяющей контролировать эффективность проводимой терапии, а также прогнозировать результаты лечения ХВГС препаратами ИФН-а.

Апробация материалов диссертации.

Основные результаты исследований представлены на Международных конгрессах по Интерферонам и Цитокинам в Париже (1 сентября, 1999), в Амстердаме (5-9 ноября, 2000), в Кливленде (11 октября, 2001), а также на конгрессе по биотехнологиям в Гаване (1999 г.) и на совещании по "СПИДу и ассоциированным инфекциям" ( 2000 г.).

Апробация диссертационной работы состоялась 21 декабря 2001 года на конференции лаборатории Интерфероногенеза НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, РАМН. Публикация.

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях в том числе тезисы в материалах 3-х международных конференций по исследованию юггерферонов и цитокинов. Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на /Уу страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и указателя литературы. Список литературы содержит 199 работ

Л'?

отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7^ таблицами и рисунками.

Собственные исследования. Материалы в методы.

Характеристика клинического материала. Для решения вышеперечисленных задач были исследованы образцы крови, полученные от 128 больных ХВГС. Все больные были разделены на 4 группы: I группа состояла го 42 пациентов с наркотической зависимостью, получавших препараты ИФН-а. В качестве группы сравнения была выделена П группа больных, состоявшая из 68 человек без наркотической зависимости, также находившихся на ИФН-тералии. Препараты ИФН-а (реаферон, ингронА, роферонА) назначались в стандартной дозе 3 млн. ME 3 раза в неделю внутримышечно в течение 12 месяцев, виферон в виде ректальных свечей по 1 млн. ME 2 раза в день 3 раза в неделю той же продолжительностью.

Контрольные группы больных, состоявшие го 8 человек с наркотической зависимостью и 10 ненаркоманов, получали плацебо. Наблюдение за указанными больными проводились так же в течение 12 месяцев.

Материалом для исследования служили образцы крови больных ХВГС, в которой определяли содержание сывороточных трансаминаз (АЛТ и ACT), вирусной РНК и способность клеток крови к продукции а-, у- и сывороточного ИФН. Контроль результатов исследования проводился до начала ИФН-терапии и через 1,3,6 и 12 месяцев лечения.

Реактивы. В работе были использованы: среда RPMI-1640; генгамицин (0,08 мг/мл); глютамин (0,3 мг/мл); бычья сыворотка - 2% в среде; вирус болезни Ньюкасла, штамм Канзас (ВБН); фитогемагглютинин (ФГА Р, "Difco"); вирус везикулярного стоматита, штамм Индиана (ВВС); диплоидная культура клеток (штамм L-41); гепарин; 1 н. HCL; 1 н. NaOH; референс человеческого ИФН-а и ИФН-у; человеческий лейкоцитарный ИФН (ЧЛИ) и лейкинферон ("Интекор", Москва, Россия), реаферон (НПО "Вектор", Новосибирск, Россия), реальдирон ("Биотехна", Литва), интрон А ("Шеринг-Плау", США), роферон А ("Хофман-Ля Рош", Швейцария), веллферон ("Глаксо-Веллком", Великобритания), гаммаферон (НПО "Фермент", Рига, Латвия).

Определение показателей активности сывороточных трансаминаз.

Проводилось с помощью биохимического метода исследования крови. Первостепенное значение представляло определение показателей активности алашшаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (ACT). За нормальные показатели принимались значения не превышающие 50 ммоль/мл. Определение вирусной РНК. Тестирование вирусной РНК в сыворотке крови больных ХВГС осуществлялось с помощью RT-PCR (по методике кислой гуанидин тиоционат-фенол-хлороформ экстракции) (Chomczynski P., Sacchi N., 1987).

Метод определения интерферонового статуса. Для оценки функциональной активности системы ИФН проводилось изучение ИФН-статуса до лечения и в процессе ИФН-терапии. ИФН-стагус включал: определение показателей

сывороточного (циркулирующего) ИФН, способность клеток крови

больных к продукции а- и у-ИФН ( Ершов Ф.И., Григорян С.С., 1996), а также определение индивидуальной клеточной чувствительности к препаратам ИФН-а, в основе которой лежит эффект "праймирования" (Мезенцева М. В., Наровлянский А. Н. и др., 1997).

Определение способности клеток крови к продукции а- и у-ИФН проводилось in vitro в условиях стимуляции лейкоцитов соответственно ВБН или ФГА. Для определения указанных показателей использовали 96-луночные круглодонные планшеты, все лунки которых заполняли 160 мкл среда RPMI-1640 с глютамином и гентамицином (всего 9 лунок на каждую пробу). Далее в лунки со 160 мкл среды RPMI-1640 вносили: в первые три - по 20 мкл физиологического раствора, содержащего ВБН, во вторые - по 20 мкл ФГА, в третьи - по 20 мкл среды RPMI-1640. Затем во все лунки добавляли по 20 мкл цельной гепарингоированной крови исследуемого больного. Планшеты инкубировали при 37 С° в течении 24 часов в атмосфере 5 % СОг. Общий расход крови на одно тестирование составлял 180 мкл. Оставшуюся кровь центрифугировали для осаждения форменных элементов крови и получения сыворотки, в которой определяли сывороточный ИФН. Титрование ИФН проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах с диплоидной культурой клеток L-41 в среде Игла с 10% бычьей сывороткой (105 кл/мл). Культуру в объеме 200 мкл на 1 лунку выращивали 24-48 ч до образования сплошного монослоя при 37 С в атмосфере 3% СОг. В качестве тест-вируса использовали ВВС. За единицу активности ИФН принимали величину, обратную его разведению, задерживающую деструкцию монослоя на 50% (МЕ/мл). При каждом титровании в качестве референс-препарата использовали человеческий лейкоцитарный ИФН с известной активностью.

За показатели активности а-ИФН в норме принимался показатель >64 Ед/мл, у-ИФН >16 Ед/мл и сывороточного ИФН - 0-8 Ед/мл.

Статистическая обработка результатов. Для определения статистической достоверности полученных результатов был использован критерий Стьюдента, обсчет данных исследования производился с помощью программы Excel ("Microsoft", США) и программы статистической обработки результатов Statn. Различия между параметрами считались достоверными при р < 0,05.

Результаты собственных исследований и их обсуждение.

Влияние пвтерферопотерашш на объектпвпые показатели заболевания. На

первом этапе работы был проведен сравнительный анализ влияния ингерферонотерапии на показатели активности сывороточных трансаминаз и вирусной РНК. В результате ингерферонотерапии по сравнению с показателем до лечения увеличивалось количество пациентов в обеих группах с положительным биохимическим ответом. По сравнению с контрольными группами больных, где за все время наблюдения ни у одного пациента не было выявлено спонтанной элиминации вируса гепатита С, ИФН-тералия оказывала положительное влияние на прекращение вирусной репликации.

Анализ функционального состояния системы интерферона у больных ХВГС в процессе ИФН-терапии. Имеющиеся литературные данные по некоторым вирусным инфекциям свидетельствуют о том, что восстановление показателей ИФН-статуса может служить дополнительным критерием клинического улучшения и эффективности проводимой терапии.

Исследования ИФН-статуса показали, что у больных ХВГС в редких случаях отмечалось его комплексное восстановление по трем основным показателям (способности клеток крови к синтезу а-, у- и сывороточного ИФН) (рис. 1). К концу 6-ого мес. лечения у 8% больных (п=7) было установлено полное восстановление ИФН-статуса, а к концу 12-ого мес. ИФН-терапии - лишь у 3% пациентов (п=2).

Рисунок 1. Частота полного восстановления ИФН-статуса у больных ХВГС в процессе ИФН-терапии.

количество больных с полным восстановлением ИФН-статуса

¡□Ненаркоманы

100 80 во

40

20 О

ШНаркоманы ]

100 8060 40 200в месяц 12 месяц

В дальнейшем мы анализировали нарушения в системе ИФН у больных ХВГС по отдельным показателям ИФН-статуса.

До лечения препаратами ИФН-а большинство пациентов обеих групп имели низкие индивидуальные показатели активности а-ИФН (16-32 Ед/мл) и -у-ИФН (0-8 Ед/мл) и нормальные показатели активности сывороточного ИФН (0-8 Ед/мл) (табл. 1).

Ингерферонотерапия оказывала более выраженное стимулирующее влияние на синтез а-ИФН в группе больных с наркотической зависимостью, где к концу 3-6 месяцев лечения уменьшалось количество пациентов с низкими индивидуальными показателями активности указанного ИФН.

Большинство всех исследуемых больных ненаркоманов на всех этапах ИФН-терапии имели низкие индивидуальные показатели активности а-ИФН (16-32 Ед/мл).

Индивидуальные показатели активности у-ИФН у большинства пациентов обеих групп были низкими (0-8 Ед/мл) на всем протяжении ИФН-терапии.

Индивидуальные показатели активности сывороточного ИФН у большинства пациентов обеих групп находились в пределах физиологически допустимых значений (0-8 Ед/мл).

Таблица 1. Влияние ИФН-терапии на изменение индивидуальных показателей активности а- и у-ИФН в группах больных ХВГС.

сроки лечения группы больных количество больных с низкими индивидуальными показателями активности ИФН

а-ИФН (<64 ед/мл) у-ИФН (<16 ед/мл)

% абс. % абс.

до лечения наркоманы п=42 77% 32 77% 32

ненаркоманы п=б8 67% 46 61% 41

3 мес. наркоманы п=35 33% 12 67% 23

ненаркоманы п=59 100% 59 88% 52

6 мес. наркоманы 11=31 38% 12 62% 19

ненаркоманы п=55 80% 44 80% 44

12 мес. наркоманы п=25 83% 21 100% 25

ненаркоманы п=52 79% 41 65% 34

Анализируя средние показатели активности указанных ИФН в обеих группах больных (табл. 2), мы отметили парадоксальный факт, что в группе пациентов с наркотической зависимостью к концу 6-ого месяца лечения средний показатель активности а-ИФН восстанавливался до нормальных значений -64,0±1,3 Ед/мл (р<0,05). Длительная ИФН-терапия до 12 мес. в указанной группе больных приводила к угнетению а-интерфероногенеза и достоверному снижению среднего показателя активности а-ИФН до 32,0±12,0 Ед/мл (р<0,05).

В группе ненаркоманов средние показатели активности а-ИФН оставались низкими на всем протяжении ИФН-терапии.

В обеих группах больных, несмотря на лечение, отмечалась депрессия у-звена системы ИФН. Длительное до 12 мес. лечение препаратами ИФН-а

. больных с наркотической зависимостью способствовало еще

большему угнетению у-продуцирукмцей способности клеток крови.

Средние показатели активности сывороточного ИФН в обеих группах больных на всем протяжении ИФН-терапии до 12 мес. не превышали физиологически допустимых значений.

В контрольных группах больных отмечались низкие средние показатели активности а- и у-ИФН.

Таблица 2. Влияние ИФН-терапии на средние показатели активности а-, у- и сывороточного ИФН в группах больных ХВГС.

тип ИФН группы больных средние показатели активности ИФН (ед/мл)

до лечения 3 мес. 6 мес. 12 мес.

а- ИФН наркоманы ИФН 30,0±2,5 32,4 ±2,5 64,0 ±1,3* 32,0 ±12,0***

К не иссл. 48,0 ±16,0 не иссл.

ненаркоманы ИФН 37,0±5,1 28,0 ±2,6 34,7 ±4,4 33,0 ±3,7

К не иссл. 32,0± 16,0 не иссл.

т- ИФН наркоманы ИФН 7,8± 1,0 8,7 ±4,1 10,3 ±2,4 4,9 ±1,0***

К не иссл. 5,2 ±1,7 не иссл.

ненаркоманы ИФН 8,6 ±1,5 4,3 ±1,7* 6,0 ±1,3 8,0 ±1,5**

К не иссл. 7,3± 4,4 13,3 ±2,7

сывор. ИФН наркоманы ИФН 3,2 ±0,8 1,3± 1,3 5,3 ±1,7 1,8 ±1,0

К не иссл. 12,0 ±4,0* не иссл.

ненаркоманы ИФН 2,7 ±0,8 1,5 ±1,0 1,9 ±0,7 3,7 ±0,9

К не иссл. 6,7± 1,3 6,7 ±4,7

ИФН-группа больных, получавших лечение препаратами ИФН-а К-контрольная группа больных * р<0,05 достоверность различия с соответствующим показателем до лечения ** р<0,005 достоверность различия с соответствующим показателем 3-его мес.

лечения

***р<0,05 достоверность различия с соответствующим показателем 6-ого мес.

лечения

Характеристика изменений в системе ИФН у больных ХВГС с низкими и нормальными показателями активности а- н у-ИФН до лечения.

Поскольку до лечения больные имели разные индивидуальные показатели активности а- и у-ИФН, представлялось важным проанализировать влияние ! ИФН-терапии на а- и у-продуцирукицую активность клеток крови у больных с низкими и нормальными показателями активности указанных ИФН до лечения.

Было установлено, что ИФН-терапия оказывала стимулирующее влияние на а- и у-ингерфероногенез в группах больных с исходно низкими показателями активности а- и у-ИФН, причем более выраженное в группе наркоманов.

К концу 6-ого мес. лечения в группе наркоманов было отмечено достоверное восстановление среднего показателя активности а-ИФН до 68,6±7,4 Ед/мл (р<0,05) и тенденция к повышению синтеза у-ИФН до 12,5±1,5 Ед/мл.

Длительное лечение препаратами ИФН-а приводило к угнетению а- и у-продуцирующей способности клеток крови в данной группе больных и статистически достоверному снижению средних показателей активности указанных ИФН (табл. 3).

В группе ненаркоманов была отмечена тенденция к повышению синтеза ИФН по сравнению с показателем до лечения, более выраженная в отношении а-ИФН, однако до нормы его средний показатель не восстанавливался (табл. 3).

Таблица 3. Влияние ИФН-терапии на изменение средних показателей активности а- и у-ИФН в группах больных ХВГС с низкими показателями указанных ИФН до лечения.

группы больных сроки лечения и наблюдения средние показатели активности ИФН (ед/мл)

а-ИФН (низкий <32 ед/мл) у-ИФН (низкий <8 ед/мл)

наркоманы до лечения ИФН 24,7 ±2,5 5,2 ±0,8

К

к концу 6 мес. ИФН 68,6 ±7,4* 12,5 ±1,5*

к 48,0 ±16,0 6,0± 1,2

к концу 12 мес. ИФН 20,0± 4,0** 6,0 ±1,3***

к не иссл. не иссл.

ненаркоманы до лечения ИФН 20,0± 2,1 2,9 ±0,6

к

к концу 6 мес. ИФН 31,3± 4,1* 5,2± 2,4

к 28,0 ±12,0 6,7 ±4,7

к концу 12 мес. ИФН 36,0± 6,6* 8,2 ±1,9*

к не иссл. не иссл.

ИФН-группа больных, получавших лечение препаратами ИФН-а K-контрольная группа больных

* р<0,05 достоверность различия с соответствующим показателем до лечения ** р<0,05 достоверность различия с соответствующим показателем 6-ого мес. лечения

***р<0,005 достоверность различия с соответствующим показателем 6-ого мес.

В обеих группах больных наркоманов и ненаркоманов с нормальными показателями активности а- и у-ИФН до лечения в процессе ИФН-терапии наблюдалось угнетение ингерфероногенеза (табл. 4).

Таблица 4. Влияние ИФН-терапии на изменение средних показателей активности а- и у-ИФН в группах больных ХВГС с нормальными показателями указанных ИФН до лечения.

группы больных сроки лечения и наблюдения средние показатели активности ИФН (ед/мл)

а-ИФН (нормальный >64ед/мл) у-ИФН (нормальный >16 ед/мл)

наркоманы до лечения ИФН 76,8 ±12,8 19,2 ±3,2

К

к концу 6 мес. ИФН 44,8 ±7,8* 5,6 ±2,6***

К не иссл. не иссл.

к концу 12 мес. ИФН 21,3± 5,3**** 4,8 ±1,4***

К не иссл. не иссл.

ненаркоманы до лечения ИФН 83,2± 9,8 16,0 ±2,1

К

к концу 6 мес. ИФН 24,0± 8,0** 2,8± 0,5**

К 20,0 ±4,0** 5,3 ±1,3

к концу 12 мес. ИФН 37,3± 5,3** 7,5 ±3,1*

К не иссл. не иссл.

ИФН-группа больных, получавших лечение препаратами ИФН-а К-контрольная группа больных

*р<0,05; **р<0,001; ***р<0,005 достоверность различия с соответствующим показателем до лечения

****р<0,05 достоверность различия с соответствующим показателем 6-ого мес. лечения

Система интерферона при ХВГС и объективные показатели заболевания.

По аналогии с другими вирусными инфекциями представлялось важным исследовать, имеется ли корелляция между показателями системы ИФН и лабораторными критериями активности ХВГС. С этой целью в каждой группе больных наркоманов и ненаркоманов были сопоставлены результаты, полученные в ходе мониторинга показателей активности сывороточных трансаминаз и вирусной РНК, с показателями активности а- и у-ИФН.

Оказалось, что в группах больных, где, несмотря на проводимую ИФН-терапию, сохранялись повышенными показатели активности сывороточных трансаминаз (отрицательный биохимический ответ) и в крови продолжала тестироваться вирусная РНК (отрицательный вирусологический ответ), средние показатели активности а- и у-ИФН были снижены, а различия между ними статистически не достоверны ¿»0,05) (табл. 5).

Таблица 5. Средние показатели активности а- и у-ИФН в труппах больных ХВГС с отрицательным биохимическим и вирусологическим ответами.

сроки средние показатели активности ИФН (вед/мл)

лечения наркоманы ненаркоманы

группа с группа с группа с группа с

отриц. отриц. отриц. отриц.

биохимическим вирусологическим биохимическим вирусологическим

ответом ответом ответом ответом

а- т- а- у- а- у- а- У-

ИФН ИФН ИФН ИФН ИФН ИФН ИФН ИФН

до 35,0± 10,3± 34,6± 9,5± 56,0± 9,2± 42,7± 11,4±

лечения 3,9 1,6 3,7 1,5 16,6 3,7 8,6 2,2

3 мес 36,0± 2,5± 32,0± 2,7± 26,7± 2,7± 32,0± 3,3±

10,1 0,5 6,0 0,7 5,3 0,7 1,2 0,7

6 мес 48,0± 7,1± 44,0± 6,5± 42,7± 6,0± 41,1± 4,9±

7,8 2,4 12,0 3 Л 10,2 3,4 5,9 2,0

12 мес 26,7± 4,0± 36,0± 5,0± 32,0± 10,7± 39,1± 8,9±

5,3 2,0 10,1 1,7 4,6 3,2 6,6 1,9

р>0,05 различия в показателях недостоверны

Можно было предположить, что в группах больных с положительным ответом на лечение препаратами ИФН-а (нормализация показателей активности сывороточных трансаминаз и элиминация из крови вирусной РНК) показатели активности а- и у-ИФН будут выше, чем в группах с отрицательным ответом. Однако было установлено, что в группах больных, как с положительным биохимическим, так и вирусологическим ответами, а- и у-продуцирующая способность клеток крови угнетена (табл. 6). Причем, результаты статистической обработай свидетельствовали о недостоверности различий в средних показателях активности а - и у-ИФН между группами с отрицательным и положительным ответами.

Таблица 6. Средние показатели активности а- и у-ИФН в группах больных ХВГС с положительным биохимическим и вирусологическим ответами.

сроки средние показатели активности ИФН (вед/мл)

лечения наркоманы ненаркоманы

группа больных группа больных с группа группа больных с

с положительным больных с положительным

положительным биохимическим вирусологическим ответом положительным биохимическим вирусологическим ответом

ответом ответом

а-ИФН Y-ИФН а-ИФН 7" ИФН а-ИФН У-ИФН а-ИФН 7- ИФН

до 32,0± 6,0± - - 34,7± 14,0± - -

лечения 11,3 3,4 1,6 4,6

3 мес 37,3± 9,3± 41,6± 8,0± 26,7± 2,7± 25,6± 4,0±

4,1 3,5 9,6 2,2 5,3 0,7 3,9 Ы

6 мес 44,0± 14,Ot 54,4± 11,5± 29,7± 12,9± 36,0± 9,0±

4,6 6,6 20,0 6,9 2,3 3,7 10,1 2,5

12 мес 40,0± 4,5± 25,6± 6,8± 35,2± 10,4± 32,0± 11,6±

8,0 1,3 3,9 2,5 7,8 2,4 7,2 2,9

р>0,05 различия в показателях недостоверны

Таким образом, у обследованных нами больных, имело место несоответствие между объективными параметрами заболевания и показателями системы ИФН, так как мы не обнаружили прямой корреляции между улучшением биохимических и вирусологических показателей заболевания и повышением синтеза а- и у-ИФН в данных группах пациентов.

Прогнозирование эффективности ИФН-тераппи у больных ХВГС. Было установлено, что несмотря на проводимое лечение препаратами ИФН-а и положительную динамику показателей активности сывороточных трансамин аз и вирусной РНК, нарушения в системе ИФН сохраняются. Таким образом, из-за вариабельности индивидуального ответа пациентов на ИФН-терапию, в большинстве случаев исследование ИФН-статуса при ХВГС является не столь информативным критерием клинического улучшения или эффективности ИФН-терапии, как при других вирусных инфекциях. В связи с этим необходимо было найти другие методические подходы для прогнозирования эффективности проводимого лечения. Таким подходом явилась новая методика определения индивидуальной клеточной чувствительности, разработанная в отделе "Интерфероногенеза" (Мезенцева М.В., Наровлянский А.Н, Амченкова А.М., 1997).

Известно, что вся популяция людей по чувствительности к экзогенным ИФН разделена на 4 группы: а+у+; а+ у-; а - у+; а- у- (Мезенцева М.В. с соавт., 2001).

Ранее было замечено, что одним из факторов, определяющих ИФН-чувствительностъ, является функциональное состояние организма и, в частности, характер заболевания. Результаты проведенных нами исследований

показали, что при ХВГСпо сравнению с группой практически здоровых доноров увеличивалось количество пациентов, составляющих группы лиц а+у-1 а-у-, и уменьшалось количество пациентов, составляющих группу а-у+.

Было показано, что большинство больных ХВГС (84%) обладали 1увстшпелъностъю к одному из препаратов ИФН-а, наиболее часто 1рименяемых в лечении ХВГС (реаферон, интрон А, роферон А, реальдирон), тричем число таких лиц было больше в группе больных ХВГС, чем в группе щоровых доноров (77%). Параллельно с этим при ХВГС уменьшалось голичество больных, чувствительных к ИФН-у (42% при ХВГС против 53% в группе здоровых доноров).

В процессе лечения одним из препаратов ИФН-а (виферон, реаферон, интрон роферон А) большинство больных ХВГС сохраняли чувствительность к эдному из указанных выше препаратов ИФН-а (100-90-86-83%% к концу 1,3,6 л 12 мес. лечения против 84% до лечения), а также было отмечено увеличение отличества больных, чувствительных к препарату ИФН-у (67-64-64-63%% к сонцу 1,3,6 и 12 мес. лечения против 42% до лечения) и одновременно к трепаратам и ИФН-а и ИФН-у (а+у+) - 67-64-54-60%% к концу 1,3,6 и 12 мес. течения против 36% до лечения (табл. 7).

Имеющиеся литературные данные, позволяют предположить, что при хиительной ИФН-тералии уменьшение количества больных, чувствительных к трепаратам ИФН-а, объясняется образованием антиинтерфероновых антител.

Таблица 7. Распределение здоровых доноров и больных ХВГС по количеству тиц, чувствительных к препаратам ИФН-а и ИФН-у.

препараты ИФН здоровые доноры (п=57) абс. % больные ХВГС

ДО лечения (п=128) абс. % в процессе ИФН-терапии

1 мес. (п=95) абс. % 3 мес. (п=94) абс. % 6 мес. (п=8б) абс. % 12 мес. (ч=77) абс. %

чувствительные к одному из препаратов ИФН-а 44 77% 108 84% 95 100% 85 90% 74 86% 64 83%

чувствительные к ИФН-у 30 53% 54 42% 64 67% 60 64% 55 64% 49 63%

чувствительные одновременно к ИФН-а и ИФН-1(а+7+) 21 37% 45 35% 64 67% 60 64% 46 54% 46 60%

Тот факт, что клеточная чувствительность к препаратам ИФН является не постоянным параметром, а изменяется в процессе лечения, указывал на целесообразность исследования изменений ИФН-чувствительности конкретно к каждому из препаратов ИФН-а, наиболее часто применяемых в лечении ХВГС.

Было показано, что в процессе ИФН-терапии изменяется количество больных, тувствительных к реаферону, интрону А, роферону А (рис. 2), что

свидетельствовало о том, что ИФН- чувствительность является

индивидуальным параметром. Это обстоятельство указывало на то, что для обеспечения целенаправленного действия ИФН-тералии целесообразно предварительное определение индивидуальной клеточной чувствительности.

Рисунок 2. Изменение количества больных, чувствительных к препаратам ИФН-а в процессе ИФН-тералии.

количество больных(в%%),чувсгвительных к реаферону

100 90 S0 70 ео so

40

30 20 10 о

Долечент 1ыесяц Эмеояца вмесяцяв

количество больных (в%%),чувствительных к интронуА

100 90 80 70

ео

50 40 30 20 1В 0

количество больных (в%%), чувствительных к роферонуА

1С0 90 80 70

ео

50 40

30 ТО

ю о

Ppnerniv 1шсяц змэся? BhecnjB

Для проведения подобного исследования были выделены 2 группы больных: I группа больных, клетки крови которых in vitro были чувствительны к одному из препаратов ИФН-а, и П группа пациентов, клетки крови которых in vitro были резистентны к препарату ИФН-а.

Сравнительные результаты лечения в обеих группах больных показали, что в 1-ой группе пациентов почти в 1,5 раза чаще отмечался положительный биохимический ответ и в 2 раза чаще положительный вирусологический ответ по сравнению со П-ой группой больных (рис. 3).

Рисунок 3. Сравнительные результаты лечения в группах больных чувствительных и резистентных к препаратам ИФН-а.

количество больных с положительным биохимическим ответом

Чувствительные больные □ Резистентные больные

1 месяц 3 месяца в месяцев

количество больных с положительным вирусологическим ответом

Я Чувствительные больные □ Резистентные больные

3 месяца 6 месяцев

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о целесообразности использования новой методики определения индивидуальной клеточной чувствительности при лечении больных ХВГС препаратами ИФН-а.

Выводы

1. Исследование ИФН-статуса у больных ХВГС, получавших лечение препаратами ИФН-а, показало, что у большинства пациентов, как до начала ИФН-терапии, так и в процессе лечения, отмечались низкие индивидуальные показатели активности а- и у-ИФН.

2. Впервые установлено, что у больных ХВГС без наркотической зависимости а- и у-ИФНпродуцирующая способность клеток крови угнетена, в то время как у наркоманов отмечено восстановление синтеза а-ИФН к концу 6-ого месяца лечения при стойко сохраняющейся депрессии у-звена системы ИФН на всем протяжении ИФН-терапии (до 12 месяцев). Длительное лечение препаратами ИФН-а (более 6 месяцев) приводило в дальнейшем к угнетению а-ивстерфероногенеза в группе больных ХВГС с наркотической зависимостью.

3. Препараты ИФН-а оказывали стимулирующее влияние на синтез а- и у-ИФН у больных с низкими показателями активности указанных ИФН до лечения. Обнаруженный эффект был более выражен у больных ХВГС с наркотической зависимостью.

4. В процессе ИФН-терапии больных ХВГС по сравнению с показателем до лечения увеличивалась численность пациентов, чувствительных одновременно к препаратам и ИФН-а (реаферон, реальдирон, ингронА, роферонА) иИФН-у (а+у+) или одному из них (а+ или у+).

5. У больных ХВГС имело место несоответствие между биохимическими и вирусологическими параметрами забролевания и показателями системы ИФН, что связано с вариабельностью индивидуального ответа пациентов на ИФН-терапию.

6. Впервые показано, что назначение препаратов ИФН-а больным ХВГС целесообразно проводить с использованием вновь разработанных методов определения индивидуальной клеточной чувствительности клеток крови пациентов к данным препаратам, что хорошо коррелирует с эффективностью проводимой ИФН-терапии.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мезенцева М.В., Касьянова Н.В., Быченко Д.В., Коваленко A.JL, Ершов Ф.И. -Циклоферон в терапии острого вирусного гепатита С у наркоманов. // Клиническая фармакология и терапия.-2000.-№ 1.-стр.89-91.

2. Мезенцева М.В., Наровлянский А.Н., Оспельникова Т.П., Касьянова Н.В., Цветнова М.В., Ершов Ф.И. - Прогнозирование эффективности интерферонотерапии при различных формах патологии. // Иммунология. - № 4. -2001.-е. 41-44

3. Ершов Ф.И., Касьянова Н.В.- Новые лекарственные средства в терапии вирусных гепатитов.//Инфекции и антимикробная терапия.-2001.-том 3. - № 1. - стр. 17-24

4. Mezentseva M.V., Tsvetnova М. V., Kasyanova N. V., Ershov F. I., Narovlyansky A.N. Effects of the blood serum that inhibit or stimulate IFN action in patients with viral pathology. - Journal of Interferon and Cytokine Research. - vol. 19. -1999.-p.113

5. Kasyanova N.V., Mezentseva M.V., Bychenko D.V., Narovlyansky A.N., Ershov F.I. The usage of cycloferon in therapy of active hepatitis С in drug addicts. - Journal of Interferon and Cytokine Research. - vol. 19.-1999.-p. 109

6. Mezentseva M.V., Narovlyansky A.N., Tsvetnova M.V., Kasyanova N.V., Ershov F.I. - New method for determination of immunoreactivity in patients with viral and other pathologies optimization of immunotherapy.-Cuba, Habana-99.-p.105-107

7.Mezentseva M.V., Narovlyansky A.N., Kasyanova N.V., Tsvetnova M.V., Vershinina M.Yu., Kalinchuk O.V., Polonsky V.O., Ershov F.I. - Sensitivity of IFN preparations and IFN inducers in patients with different viral infections. II European Cytokine Network.-2000.-vol. 11. - p. 178.

Считаю своим приятным долгом выразить огромную благодарность моему научному руководителю д.м.н., проф., акад. РАМН Ершову Ф.И. за постоянное внимание, консультации, всестороннюю помощь и полученные знания.

За помощь в проведении настоящей работы искренне признательна медицинским работникам 2-ой Клинической инфекционной больницы г. Москвы, помогавшим в сборе клинического материала-к.м.н., Рязанцевой М.А. и врачу-инфекционисту Павловой Л.Е.

Выражаю огромную благодарность всем сотрудникам лаборатории "Йнтерфероногенеза" НИЙЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН за помощь и поддержку.

Глубокую признательность выражаю ученому секретарю НИИЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, д.м,н., профессору Русаковой Е.В.

Подписано в печать &4.0/. 2002 г. Формат 60x84/16

Тираж экз._Заказ /У_Объем А3> п.л.

ООО «Техполиграфцентр» ПЛД № 53-477 Тел./ф.: 151 -26-70

ф

Актуальность проблемы. Интегральной частью иммунной системы является система интерферона, обеспечивающая координацию пролиферации, дифференцировки и активации эффекторных клеток иммунной системы. Система ИФН - это быстрореагирующая система неспецифической защиты клеток от вирусной инфекции, опережающая специфические способы защиты.

Многообразие оказываемых системой ИФН эффектов (противовирусный, антимикробный, антипролиферативный,иммуномодулирующий, радиопротективный и др.) является свидетельством значимости и универсальности этой системы (18, 83). Доказано, что даже малые концентрации ИФН всех классов вызывают пролиферацию и возрастание активности ЕК, обладающих выраженной цигголитической активностью и участвуют в развитии резистентности к вирусным инфекциям и опухолевому росту.

Отражением функционального состояния системы ИФН в целом является понятие ИФН-статус (18, 19, 51, 72). Обзор научной литературы по ИФН-дефицитным состояниям и синдромам свидетельствует о высокой информативности определения ИФН-статуса (7). Известно, что при хронических вирусных инфекциях развивается вторичный иммунодефицит, сопровождающийся глубоким подавлением синтеза ИФН иммуноцитами крови. В свою очередь недостаточность интерферонообразования приводит к прогрессированию хронических инфекций с развитием их рецидивов и в некоторых случаях к летальным исходам (18, 147, 8). Доказано, что степень подавленияпродукции ИФН клетками крови находится в прямой зависимости от тяжести хронического процесса (124).

Едва ли не самой актуальной проблемой инфектологии на сегодняшний день остается ВГС.

После идентификации в 1989 году возбудителя ВГС, известного ранее как вирусный гепатит ни А, ни В, стало ясно, что основной процент всех ХВГ, ЦП и ГЦК приходится на данную инфекцию (86, 117,178, 185, 140, 116, 115). Важность проблемы ВГС обусловлена еще и тем, что инфекция имеет повсеместное распространение, а ограничение ее по ряду причин не представляется возможным. Во-первых, за последние несколько лет во всем мире отмечается рост заболеваемости ВГС, связанный с катает офическим увеличением численности лиц, употребляющих парентеральные наркотические препараты (43, 61, 127, 150). Во-вторых, актуальной на сегодняшний день остается проблема лечения ВГС, мировым стандартом в лечении которого считается ИФН-а, обеспечивающий устойчивый ответ лишь у 15% больных ХВГС (154, 181,155). До сих пор не найдены радикальные методы лечения ВГС.

Доказано, что мониторинг ИФН-статуса при использовании препаратов экзогенного ИФН, индукторов ИФН или иммуномодуляторов может служить критерием эффективности проводимой терапии, а тенденция к нормализации или восстановлению показателей ИФН-статуса свидельствует о повышении неспецифической резистентности организма, и, как правило, коррелирует с положительной клинической динамикой заболевания или выздоровлением (18,9,37).

Несмотря на огромное количество публикаций, касающихся интерферонотерапии вирусного гепатита С, состояние системы ИФН при ХВГС у взрослого контингента больных анализировалось мало. Недостаточно внимания уделено изучению состояния системы ИФН усамой многочисленной группы больных ХВГС - больных с наркотической зависимостью. Слабо анализировались показатели ИФН-стаггуса у больных ХВГС на разных этапах ИФН-терапии, а также связь между показателями активности инфекционного процесса и основными параметрами системы ИФН.

В связи с вышесказанным важным аспектом исследования является изучение функционального состояния системы ИФН у больных ХВГС с целью прогнозирования результатов и контроля эффективности лечения, а также проведение сравнительного анализа показателей системы ИФН у больных без наркотической зависимости и употребляющих наркотики. Представляется актуальным выявить преимущества и показать целесообразность лечения ХВГС препаратами ИФН-а с использованием новой методики определения индивидуальной клеточнойчувствительности, как способа повышения эффективности ИФН-терапии. Цель исследования. Целью настоящего исследования является изучение функционального состояния системы ИФН на разных этапах ИФН-терапии у больных ХВГС с наркотической зависимостью.

Достижение указанной цели потребовало решения следующих задач:1. Изучить функциональное состояние системы ИФН при ХВГС по основным ее показателям, а именно, способности клеток крови к синтезу сывороточного ИФН, а- и у-ИФН.

2. Провести сравнительный анализ показателей сывороточного ИФН, а-и у-ИФН в группах больных без наркотической зависимости и пациентов, употребляющих наркотики.

3. Установить корреляцию между нарушениями в системе ИФН и биохимическими и вирусологическими показателями заболевания при ХВГС4. Изучить характер нарушений в системе ИФН на разных этапах ИФН-терапии и их зависимость от продолжительности лечения.

5. Исследовать вопрос о целесообразности применения методики определения индивидуальной клеточной чувствительности при подборе препаратов ИФН-а для лечения больных ХВГС.

Научная новизна работы.

Впервые на разных этапах ИФН-терапии исследованы нарушения в системе ИФН у наркоманов с хронической HCV-инфекцией. Полученные данные свидетельствовали о том, что по сравнению с пациентами, не употреблявшими наркотики, у лиц с наркотической зависимостью ИФН-терапия оказывала стимулирующее влияние на синтез а- и у-ИФН, причем более выраженное у наркоманов с низкими показателями активности указанных ИФН до лечения.

В процессе ИФН-терапии проведен сравнительный анализ показателей ИФН-статуса и биохимических и вирусологических параметров заболевания. Было установлено, что при ХВГС имеет место несоответствие между увеличением синтеза ИФН и характером биохимического и вирусологического ответа. Нарушения, выявленные в системе ИФН, по-видимому, являются одной из причин недостаточной эффективности ИФН-терапии при ХВГС.

Впервые была применена новая методика определения индивидуальной клеточной чувствительности у больных ХВГС. Практическая значимость работы.

Результаты мониторинга биохимических и вирусологических показателей заболевания свидетельствовали о преимуществе и целесообразности использования новой методики определения индивидуальной клеточной чувствительности к препаратам ИФН-а,tm11позволяющей контролировать эффективность проводимой терапии, а также прогнозировать результаты лечения ХВГС препаратами ИФН-а. Апробация материалов диссертации. Основные результаты исследования представлены на Международных конгрессах по Интерферонам и Цитокинам в Париже (1 сентября, 1999), Амстердаме (5-9 ноября, 2000), Кливленде (И октября, 2001), а также на конгрессе по биотехнологиям (Гавана, 1999) и на совещании по "СПИДу и ассоциированным инфекциям" (2000 г.).

Считаю своим приятным долгом выразить огромную благодарность моему научному руководителю акад. РАМН, д.м.н., проф. Ершову Ф.И. за постоянное внимание, всестороннюю помощь и полученные знания.

За помощь в проведении настоящей работы, сборе клинического материала и консультациях искренне признательна врачам 2-ой Клинической инфекционной больницы г. Москвы к.м.н. Рязанцевой М.А. и врачу-инфекционисту Павловой JI.E.

Выражаю огромную благодарность всем сотрудникам отдела "Интерфероногенеза" за помощь и поддержку.

Глубокую признательность выражаю ученому секретарю ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, д.м.н., проф. Русаковой Е.В.

ЧАСТЫ.

ВЫВОДЫ:

1. Исследование ИФН-статуса у больных ХВГС, получавших лечение препаратами ИФН-а, показало, что у большинства пациентов, как до начала ИФН-терапии, так и в процессе лечения, отмечались низкие индивидуальные показатели активности а- и у-ИФН.

2. Впервые установлено, что у больных ХВГС без наркотической зависимости а- и у-продуцирующая способность клеток крови угнетена, в то время как у наркоманов отмечено восстановление синтеза а-ИФН к концу 6-ого месяца лечения при стойко сохраняющейся депрессии у-звена системы ИФН на всем протяжении ИФН-терапии до 12 месяцев. Длительное лечение препаратами ИФН-а более 6 месяцев приводило в дальнейшем к угнетению а-интерфероногенеза в группе больных ХВГС с наркотической зависимостью.

3. Препараты ИФН-а оказывали стимулирующее влияние на синтез а- и у-ИФН у больных с низкими показателями активности указанных ИФН до лечения. Обнаруженный эффект был более выражен у больных ХВГС с наркотической зависимостью.

4. В процессе ИФН-терапии больных ХВГС увеличивалась численность пациентов чувствительных одновременно к препаратам и ИФН-а ( реаферон, реальдирон, интрон А, роферон А) и ИФН-у (а-н/+) или одному из них (а+ или у+).

5. У больных ХВГС имеет место несоответствие между биохимическими и вирусологическими параметрами заболевания и показателями системы ИФН, что связано с вариабельностью индивидуального ответа пациентов на ИФН-терапию.

6. Впервые показано, что назначение препаратов ИФН-а больным ХВГС целесообразно проводить с использованием вновь разработанных методов определения индивидуальной клеточной чувствительности клеток крови пациентов к данным препаратам, что хорошо коррелирует с эффективностью проводимой ИФН-терапии.