Автореферат и диссертация по медицине (14.00.31) на тему:Система доклинического иммунофармакологического изучения химиотерапевтических препаратов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПО АНТИБИОТИКАМ

На правах рукописи

УДК 615.33.015.4:612.112.014.467].07

Смолгаша Татьяна Васильевна

СИСТЕМА ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИММУНОФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ИЗУЧЕНИЯ ХИМИОТЕРАЛЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

14.00.31 - химиотерапия и антибиотики

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена в Государственном научном центре по антибиотикам (Генеральный директор - академик РАМН С.М.Навашин) Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители: кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник А.В.НИКИТИН, доктор медицинских наук С.Е.КУЛЕШОВ.

Официальные оппонента: доктор медицинских наук, старший научный сотрудник М.М.ВЯДРО; кандидат медицинских наук, доцент А.А.СЕРОВ

Ведущая организация - Научно-производственное объединение ВИЛАР, Москва.

Защита состоится " Н " /ре^/тдА/ 1993 г в 40 часов на заседании Специализированного Совета Д 098.03.01 в Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА) по адресу: 113105, г.Москва, ул. Нагатинская, За.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке ГНЦА.

Автореферат разослан " // " ЛИ&(Х/\А_ 1993 г

Ученый секретарь Специализированного Совета Л СВ8.03.01

кандидат лед ициноиих наук ' С. Н. КУЗНЕЦОВ А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность техн.

Доклиническое иммунофармакологическое изучение новых препаратов является важным этапом их внедрения в медицинскую практику. Иммунологические аспекты доклинического изучения лекарственных средств, несмотря на их весьма большое теоретическое и прикладное значение, представляют собой область, в которой еще недостаточно четко- обозначены совокупность необходимых методов, а также их дифференцирование по степени информативности и значимости.

В плане изучения иммуномодулирупцего действия антибиотиков, необходимым и своевременным представляется сведение отдельных методов в систему» отражающую последовательные этапы активации фагоцитирующих и иммунокомготентных клеток в процессе взаимодействия с возбудителем и развития иммунного ответа, а также разработка новых методов оценки действия антибиотиков,на клетки-эффекторы резистентности in vitro.

Другим важным и актуальным направлением системного подхода к решению задач иммунофармакологии является применение методов многофакторного анализа, принципиальными преимуществами которых, по сравнению с традиционными методами, являются возможность строгой количественной характеристики влияния факторов эксперимента (доз, сроков и длительности введения препаратов;» концентраций препаратов и ионного состава инкубационной среда и т.д.) и оценки их взаимодействий.

Большую актуальность приобретает иммунофармакологическое изучение химиотералевтических препаратов, обладающих выраженной способностью проникать через клеточные мембраны и накапливаться внутри кл&ток макроорганизма, в частности в фагоцитах. Данное свойство антибиотиков обеспечивает их терапевтический эффект при инфекциях с внутриклеточной локализацией. В то же время именно это обстоятельство обосновывает необходимость изучения действия препаратов на функции фагоцитирующих и иммунокомпетентных клеток.

Имеющиеся в литературе данные о действии на иммунную систему препаратов групп тетрациклинов и рифамицинов фрагментарна и противоречивы; результаты изучения хинолонов

немногочисленны и не дают возможности сделать выводы об их влиянии на иммунный ответ.

Цель работы и задачи исследования.

Целью исследования являлась разработка методической системы доклинического иммунофармакологического изучения антибиотиков с применением многофакторного анализа и комплексное исследование разработанных в ГНЦА препаратов (доксициклина, рифампицина, пефлоксацина и антибиотика Я 546), в качестве важной составной части их доклинического изучения.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. С применением математической теории эксперимента предложить оптимальные планы для оценки действия химиопрепаратов на адгезию лейкоцитов и иммунный ответ.

2. Разработать автоматизированный метод оценки адгезии лейкоцитов по активности внутриклеточных ферментов.

3. Изучить, действие рифампицина, доксициклина и пефлоксацина на последовательные этапы активации фагоцитирунцих клеток (хеыотаксис, адгезию, респираторный взрыв).

4. Провести многофакторный анализ действия рифампицина, доксициклина и пефлоксацина на иммунный ответ к Т-зависимому и Т-независимому антигенам в широком интервале дозо-временных параметров.

Б.Изучить влияние антибиотика * 546 на адгезию и хемотаксис лейкоцитов и первичный иммунный ответ.

Работа выполнена в рамках КГП ГКНТ 0.43.01. "Изыскать новые эффективные лекарственные средства, разработать технологию и освоить промышленные производства новых препаратов и их лекарственных форм" на 1986-^90'г.

Научная новизна результатов.

1. Впервые предложены методические подходы к изучению икмуномодулируицего действия антибиотиков с использованием многофакторного анализа.

2. Предложен оптимальный комплекс методов для оценки действия антибиотиков на функции лейкоцитов и макрофагов, системно адекватный динамике активации неспецифических защитных реакций и иммунного ответа.

3. Предложен метод оценки адгезии лейкоцитов по активности

- Б -

р-гексозаминидазы, характеризующийся высокой разрешающей способностью, информативностью и экономичностью по сравнению с другими методами.

4. Впервые с применением многофакторного анализа проведено изучение механизмов действия и получены математические модели влияния ионов кальция и магния на процессы адгезии лейкоцитов при действии доксициклина.

5. Проведен многофакторный анализ и разработаны статистические полиномиальные модели действия доксициклина и рифампицина на иммунный ответ к Т-зависимым и Т-независимым антигенам в широком интервале дозо-временных параметров.

6. Изучено действие пефлоксацина на функции лейкоцитов и иммунный ответ к Т-зависимым и Т-независимым антигенам ln vivo.

7. Впервые изучено действие антибиотика Я 546 на иммунный ответ и функции лейкоцитов.

Научно-прситхчесная значимость полученных результатов.

Предложен комплекс методов доклинического изучения действия химиотерапевтических препаратов на функции лейкоцитов и иммунный ответ. Обоснована необходимость использования многофакторного анализа для оптимизации исследований и получения количественных характеристик действия препаратов.

Изучена иммуномодулирупцая активность антибиотика * 546, результаты исследования защищены авторским свидетельством.

Проведено комплексное иммунофармакологическое изучение разработанных в ГНЦА антибиотиков: рифампицина, доксициклина и пефлоксацина, являющееся важной составной частью их доклинического токсикологического изучения. Материалы по изучению пефлоксацина вшшчены в документацию для получения разрешения на клиническое изучение препарата.

Апробация. Материалы диссертационной работы доложены на Всесоюеном семинаре "Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты", Москва, 1988; Научной конференции "Фактора клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях", Челябинск, 1990; Международной конференции молодых ученых "Получение, исследование, применение антибиотиков и биологически активных веществ", Москва, 1990; 9-м Международном

симпозиуме по перспективам развития химиотерапии, Женева, 1990; 4-й конференции по химиотерапии инфекционных болезней и опухолей, Прага, 1992.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, зарегистрировано 1 авторское свидетельство.

Практическое использование полученных результатов.

Предложенный комплекс методов и схемы многофакторных экспериментов могут быть рекомендованы для оценки действия новых химиопрепаратов " на функции лейкоцитов,

макрофагов и иммунный ответ в научно-исследовательских учерекдениях, связанных с изучением биологически активных соединений.

Структура работ.

Диссертация написана на /29 стр. и состоит из введения ( 6 стр), обзора литературы ( h i стр), комплекса методов исследования ( 3/ стр), главы, в которой изложены результаты исследования ( 9G стр), заключения ( !5~ стр), выводов ( I стр), списка литературы ( i9- стр.). Библиография включает в себя /?£* литературных источников, из них ¿g на русском языке. Работа иллюстрирована 5"3 рисунками, и 17- таблицами.

МАТЕРИАЛУ И МЕТОДУ

Живожные. Мыши линии СБА массой 18-20 г. (использовались при изучении действия препаратов на иммунный ответ и на хемотаксис и адгезию лейкоцитов в условиях in vivo); морские свинки массой 300-350 г.(использовались для получения клеток). Всего использовано 700 животных (650 мышей, 50 морских свинок).

Клетки. Для экспериментов в условиях in vitro использовали лейкоциты и макрофаги морских свннок.

Лейкоциты (преимущественно нейтрофшы) получали из перитонеальной полости морских свинок через 18 часов после внутрибршшнного введения 10 мл 0,1% раствора пептона.

Макрофаги выделяли из перитонеальной полости морских свинок через 72 часа после введения 10 мл 0,1% раствора пептона.

МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ХЕМОТАКСИСА ЛЕЙКОЦИТОВ

Действие препаратов на хемотаксис лейкоцитов оценивали in

In vitro лейкоциты проинкубировали с исследуемыми препаратами и вносили в лунки агарозных камер, хемотаксис оценивали по расстоянию миграции под агарозой. Ex vivo препараты вводили животным-донорам клеток, хемотаксис тестировали в условиях in vitro, на предметных стеклах под агарозой. in vivo препараты вводили мшпвм перорально, хемотаксис оценивали по выходу клеток в подкожный воздушный мешок у мышей.

Метод оценки лигрсщш нейтрофиов под агарозой [Nelson R.D. 19751. На предметные стекла наносили 0,6% агарозный гель, приготовленный на питательной среде RPMI, забуференной 25мМ HEPES-NaOH, pH 7,2 с добавлением 0,5% желатина. В агарозе вырезали лунки, в одни из которых вносили лейкоциты, в другие хемоаттрактант (трипептид ímet-leu-phe в концентрации 10_6М). После инкубации стекла фиксировали глутаровым альдегидом и окрашивали. Расстояние спонтанной и направленной миграции оценивали под микроскопом, с помощью окуляр-микрометра.

Метод оценки хелотаксиса лейкоцитов в полость воэдушого лешиа. В методе использована идея создания подкожного воздушого мешка, предложенного Kowanko 1.0. 1986, дальнейшие этапы в собственной модификации. Мышам создавали в области спины подкожный воздушный мешок введением !) мл стерильного воздуха с помолц>ю шприца с насадкой-фильтром. В образовавшийся воздушный мешок вводили 0,5 мг зимозана А. Через 18 часов после введения зимозана мышей забивали и выделяли клетки, вышедшие в воздушный мешок. О количестве клеток в полученной суспензии судили по активности пероксидазы в клеточных лизатах. Определение активности фермента проводили на автоматизированном лабораторном комплексе "BIOHEK" (BECKHAM, USA).

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ ЛЕИКОЦИТОВ Действие препаратов на адгезию лейкоцитов оценивали in vitro и in vivo .

in vitro препараты и лейкоциты вносили в лунки 96-луночных микропластин, оценивали адгезию по прилипанию к пластику обработанному альбумином, in vivo препараты вводили мышам в подкожный воздушный мешок, в который был индуцирован выход лейкоцитов, оценивали адгезию по количеству клеток, выделенных

- а -

(неприлипших) из воздушного мешка.

Оцешеу адгезии лейкоцитов яо прилипанию плеток к поверхности пластика 96-луночных мщхтмхтш [Miller D.K. 1988], обработанных альбумином {Dahlgren С.19873, проводили .с помощью разработанного нами метода по содержанию фермента р-гексозаминидазы в прилипших к пластику лейкоцитах (в опытах с пефлоксацином адгезию оценивали по активности пероксидазы).

Клетки суспендировали в зависимости от условий опыта в следующих инкубационных буферных растворах: а) среде RPHI 1640 с добавлением ЧСА 1 мг/мл, или б) 0,15 M NaCl, забуференном 25 (AI HEPES ( рН 7,2), содержащем глюкозу (2 мг/мл) и ЧСА (1 мг/мл) без или в присутствии ионов Са и Mg.

В лунки микропластин раскапывали суспензию лейкоцитов (по 200 тыс. кл на лунку ).После инкубации клеток при 37° в течение 40 мин без или в присутствии испытуемого препарата из лунок отбирали аликвоты для определения секреции р-гексозаминидазы (дегрануляции клеток). Пластины промывали 3 раза физиологическим раствором. Адгезивованные клетки лизировали \% раствором тритона Х-100.

Для определения активности фермента 0-гексозоаминидазы к 100 мкл клеточных лизатов добавляли 100 мкл субстратного раствора <4 мМ раствор 4-нитрофенилЧ1-ацвтил-р-1^глюкозаминида в цитратном буфере 50мЫ, рН 5,0), инкубировали 1 час, реакцию останавливали добавлением 50 мкл IN NaOH. Оптическую плотность регистрировали при длине волны 4f0 км. В соответствующих контрольных пробах учитывали неспецифический фон и оценивали влияние различных факторов инкубационной среда (например, антибиотиков) на активность ферментов в образцах.

Практически все этапы работы выполняли автоматизировано на лабораторном комплексе "biomek" (beckjíah, usa).

Оценку адгезии по прилипанию лейкоцитов к поднохнил тнанял проводили в собственной модификации. В предложенном нами способе оценки адгезии в условиях in vivo использована идея создания "воздушного мешка" (искуственной подкожной полости), применявшегося для изучения хемотаксиса in vivo [Kowanko I.e. 19вб].

Воздушный мешок создавали мышам линии СВА, введением подкожно в области спины 5 мя стерильного воздуха с помощью

подкожно в области спины б мл стерильного воздуха с помощью шприца с насадкой- фильтром. Для индукции выхода лейкоцитов, в образовавшуюся полость вводили 0,5 мг зимозана А. Через 18 часов после введения зимозана, в воздушный мешок вводили исследуемые препараты в различных концентрациях. Через 40 мин после введения препарата клетки выделяли. О количестве выделенных из воздушного мешка клеток судили по активности ß-гексозаминидазы в лизатах клеток. Определение активности фермента проводили автоматизированно на лабораторном комплексе "BIOÜEFC" (BECKHAN, USA).

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЕМИЛШИНЕСЦЕНЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ Хемшпоминесценцию лейкоцитов [Metoalf I.A.] определяли после предварительной инкубации клеток в присутствии антибиотика с отмывкой перед тестированием. Отмывку клеток производили в двух режимах: традиционном (с центрифугированием) и ускоренном (путем разведения в 50 раз).

В качестве объекта фагоцитоза использовали зимозан, опсонизированный аутологичной сывороткой морских свинок. В качестве сцинтиллята в инкубационную среду (раствор Хенкса) добавляли люминол 10~^М.

Регистрацию световых импульсов производили в

сцинтапляционном счетчике Kark-з в режиме гетерогенного счета или на биохемилюминометре (БХЛ). Измерения проводили в кинетическом режиме. Пробы помещали в счетчик для измерения на 30 сек,' и после измерения продолжали инкубацию при 37°.

Для проведения хемилюминесцэнтной реакции в бескпеточной системе исследуемые препараты вносили в среду следующего состава: HgOg 10-®М в боратном буфере рН=9,6 с люминолом 10_5М, хемилюминесценцшо инициировали добавлением пероксидазы хрена в конечной концентрации 0,01 мкг/мл.

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОДУКЦИИ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА МАКРОФАГАМИ Количество продуцируемой макрофагами перекиси водорода оценивали микрометодом [Piok В. 1981].

Макрофаги инкубировали в пристутствии антибиотиков в среде, содержащей феноловый красный (О,СБ мг/мл) и пероксидазу хрена (0,1 мг/мл). Оценивали влияние антибиотиков на спонтанную (без

активатора) и индуцированную зимозаном продукцию перекиси водорода. Реакцию" останавливали 0,1N раствором NaOH. Интенсивность продукции HgOg оценивали по изменению оптической плотности. Практически все этапы работы выполняли атоматизированно на комплексе "бгомек" (beckman, USA).

МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА Влияние препаратов на синтез антител к Т-зависимым антигенам оценивали в реакции гемагглютинации по титру агглютининов в сыворотке мышей, иммунизированных эритроцтами барана внутрибрюшинно, в дозе 1x10е клеток на мышь. Антибиотики вводили мышам перорально, в широком диапазоне доз, в течение 7 дней в различные сроки относительно иммунизации (с -6-го по 0-й, с -3-го по 3-й, с 0-го по 6-й день). Содержание антител определяли на 7 день после иммунизации.

Влияние препаратов на синтез антител к Т-независимым антигенам оценивали по кинетике синтеза igG и igM антител в сыворотке мышей, иммунизированных I фракцией вакцины EV. Содержание антител определяли иммуноферментным методом [Avrameas S. 1971, Coleman D.I. 1971, Engvall Б. 1971]. Антибиотики вводили иммунизированным животным перорально, в широком диапазоне доз, в течение 7 дней после иммунизации (в опытах с рифампицином и доксициклином) или в течение 3, 6 или 9 дней после иммунизации (в опытах с пефдоксацином). Сыворотку для тестирования антител получали на 7, 14, 21 дни (в опытах с рифампицином и доксициклином) или на 3, 6, 9 дни (в опытах с пефлоксацином) относительно иммунизации.

Реакцию гемагглютинации и иммуноферментный анализ проводили на автоматизированном лабораторном комплексе "ВЮМЕК" (BECKüAN, USA).

МЕТОД МНОГОФАКТОРНОГО АНАЛИЗА С применением многофакторного анализа было исследовано влияние рифампицина, доксициклина и пефдоксацина на гуморальный иммунитет, а также влияние докициклинаГионов кальция и магния на адгезию лейкоцитов. Планирование экспериментов и обработку результатов проводили в соответствии с планами многофакторного анализа й 18 и Jä 35 [Налимов В.В. 1982]. Графичекие отображения модели выполняли с помощью программы statgraphics.

РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОВЕДО+ЫХ ИССУЕДОВАНЯ

Для иммунофармакологического изучения антимикробных препаратов был разработан комплекс методов, позволяющих оценить действие антибиотиков на основные клеточные популяции, участвующие в реализации антимикробного действия (нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты).

Предлагаемые методы позволяют исследовать последовательные этапы осуществления неспецифиеского и иммунного ответа: хемотаксис и адгезию фагоцитов, респираторный взрыв при фагоцитозе, антителообразование, в частности синтез 1вМ- и 1^-антител. Важность оценки данных показателей определяется совпадением сроков проведения химиотерапии и реализации неспецифических защитных реакций и первичного иммунного ответа к возбудителю.

Отбор методов для определения каждого из показателей активности фагоцитирующих и иммунокомпэтентных клеток проведен по принципу наибольшей информативности, высокой производительности, сокращения расходов материалов (микрометоды, многофакторный анализ) и возможности автоматизации исследований.

Многофакторный анализ явился основой ряда экспериментов и его применение дало возможность получить целостную картину иммуномодулиругацего действия препаратов в широком интервале дозо-временных факторов. Принципиально важным преимуществом использования многофакторного анализа явилась возможность оценки взаимодействия факторов (концентраций, доз, времени).

Разработанный комплекс методов с использованием многофакторного. анализа был применен для изучения антибиотиков широкого спектра действия: рифампицина, доксициклина, представителя группы хинолонов- пефлоксацина, а также пептидного антибиотика * 546.

Применение предложенного комплекса методов позволило получить целостную картину иммуномодулирующе го действия антибиотиков.

ВЛИЯНИЕ ДОКСИЦШШНА НА ФУНКЦИИ ФАГОЦИТИРУЩИХ КЛЕТОК И ИММУННЫЙ ОТВЕТ

Доксициклин оказывал модулирующее действие на отдельные показатели функциональной активности фагоцитов и на иммунный ответ (табл.1).

In vitro доксициклин вызывал зависимое от концентрации торможение адгезии лейкоцитов. Проведение многофакторного анализа, варьируемыми факторами которого являлись концентрация доксициклина и концентрации ионов кальция и магния, позволило установить, что внесение в инкубационную среду избыточных количеств ионов кальция и магния (б мМ) приводит к восстановлению адгезии, подавленной доксициклином (рис.3).

Концентрация ионов Mg2+ является основным фактором, компенсирующим снижение адгезии под действием доксициклина. Высокие концентрации ионов магния (10 мМ) могут стимулировать адгезию лейкоцитов, несмотря на присутствие доксициклина в инкубационной среде (рис.3).

Добавление в инкубационную среду избытка ионов Mg (10 мМ) перед внесением доксициклина (100 мкг/мл) или одномоментно с ним полностью отменяло тормозящее действие антибиотика на адгезию лейкоцитов. В то же время добавление ионов % после инкубации клеток с доксициклином не восстанавливало способности клеток к адгезии, что может быть связано с блокированием доксициклином клеточных рецепторов.

Проведение специальных экспериментов по изучению действия доксициклина на хемилюмине сцентную реакцию в бесклеточной системе позволило выявить наличие у антибиотика факторов -гашения хемилюминесценции. В связи с чем регистрацию хемилюминееценции лейкоцитов, преинкубированных с доксициклином проводили после отмывки клеток от антибиотика.

Использование различных режимов отмывки при изучении действия доксициклина на хемилюминесценцию лейкоцитов позволило установить, что доксициклин в высоких концентрациях 10-100 мкг\мл обладает способностью подавлять ответную реакцию клеток на стимулятор: при ускоренной отмывке клеток наблюдалась задержка реакции на активатор у клеток, преинкубированных с доксициклином (рис.1). Однако тормозящее действие

Таблица 1

Влияние доксициклина на функции фагоцитирующих клеток и иммунный ответ

Объект Условия Доза или

воздей- функции опыта концентрация Эффект

ствия

нейтрофилы

хемотаксис in vitro sx vivo

in vivo

0,1-100 мкг/мл О

7,8 мг/кг +

13, 130 мг/кг О

65 мг/кг f

адгезия

1 )

in vitro • in vivo

0,1-100 мкг/мл 1-100 мкг/мл

хемилюми-несценция'

2)

их vitro

0,1-10 мкг/мл 100 мкг/мл

О +

макрофаги продукция перекиси водорода '

1п vitro

0,1 мкг/мя. 1 мкг/мл 10 мкг/мл 100 мкг/мл

0 +

1

лимфоциты синтез

гемагглкь

и АОК

тининов

Д)

ín vivo

6,5-35,5 мг/кг 65 мг/кг

О

4-

синтез антител к I фракции вакцины Wí

ín vivo

13 мг/кг 71,5 мг/кг 130 мг/кг

О

Примечания:

1) Спонтанная адгезия лейкоцитов.

2) Режим отмывки - центрифугированием.

3) Индуцированная зимозаном продукция перекиси водорода.

4) Введение препарата в течение 7 дней после иммунизации.

5) Определение антител на +7 день.

Условные обозначения: + стимулирующий эффект; * тенденция к стимуляции; О отсутствие эффекта; - эффект торможения; 4, тенденция к подавлению.

Рисунок 1. Хвмилюминесвднция лейкоцитов, преинкубированннх с

доксициклином (в условиях ускоренной отмывки).

По оси абцисс время (в минутах);

по оси ординат количество импульсов в минуту х 103.

Обозначения : * хемилюминэсцвнция в контрольных образцах (1); Д хемилюминесценция клеток, преинкубированных с доксициклином в концентрациях 10 мкг/мл (2), 100 мкг/мл (3).

Рисунок 2. Хемилшинесценция лейкоцитов, проинкубированных

с доксициклином (после отмывки центрифугированием).

По оси вбцисс время инкубации (в минутах):

по оси ординат количество импульсов в минуту х 103.

Обозначения : * хемилшинесценция в контрольных образцах (1) ; А хемилшинесценция клеток, проинкубированных с доксициклином в концентрациях 0,1 мкг/мл (2), 1 мкг/мл (3), 10 мкг/мл (4), 100 мкг/мл (5).

доксициклина не является необратимым. В процессе отмывки происходит восстановление функций клеток. При оценке хемилюминесцентной реакции клеток через 40 мин после окончания действия антибиотика (после отмывки центрифугированием) наблюдалась стимуляция хемилюминесценции лейкоцитов, преинкубированных с доксициклином в концентрации 100 мкг/мл (рис.2).

Применение многофакторного анализа при изучении влияния доксициклина на первичный иммунный ответ позволило установить дозо-временные зависимости действия антибиотика на синтез антител.

При пероральном введении мышам в течение 7 дней после иммунизации доксициклин в диапазоне доз, соответствующих терапевтическому уровню (13 мг/кг), не оказывал значительного влияния на ситез .антител, как к Т-зависимому, так и к Т-независимому антигенам.

Многократное увеличение дозы антибиотика (65-130 мг/кг) приводило к снижению уровня антител. Более значительный супрессивный эффект наблюдался при введении доксициклина в течение 7 дней до иммунизации.

ВЛИЯНИЕ РНФАМШЩИНА НА ФУНКЦИЙ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК И ИММУННЫЙ ОТВЕТ.

Рифамтщин оказывал стимулирующее действие на ряд показателей функциональной активности фагоцитов и иммунный ответ (табл.2).

При Зх кратном введении рифампицина в дозе 23 мг/кг морским свинкам-донорам клеток и тестировнии хемотаксиса под агарозой была отмечена тенденция к стимуляции рифампицином направленной миграции нейтрофилов.

При тестировании хемотаксиса in vivo по выходу клеток в искуственннй очаг воспаления (воздушный мешок с введенным в него зимозаном) установлено, что у мышей, которым перорально, в течение 5 дней вводили рифампицин, выход кпэток в воздушный мешок выше, чем в контроле. В дозе 39 мг/кг рифампицин достоверно стимулировал на 63% хемотаксис лейкоцитов в полость подкожного воздушного мешка.

В условиях in vitro обнаружена стимуляция адгезии рифампицином в концентрациях 50- 100 мкг/мл. В экспериментах in vivo выявлена тенденция к стимуляции адгезии рифампицином.

Использование бесклеточной системы для выявления у антибиотиков факторов гашения хемилкминесценции и дальнейшее изучение хемилюминесцентной реакции клеток после отмывки от антибиотика позволило подвергнуть сомнению имеющиеся в литературе данные, о подавлении рифампицином хемилкминесценции лейкоцитов, полученные при регистрации хемилкминесценции в присутствии антибиотика.

Повышение рифампицином в концентрациях 0,1 и 1 мкг/мл продукции перекиси водорода макрофагами свидетельствует о том, что рифампицин в малых концентрациях обладает способностью стимулировать фагоцитарные клетки.

Применение многофакторного анализа при изучении влияния рифампицина на гуморальный иммунный ответ позволило установить, что, в зависимости от дозы, рифампицин оказывает различный модулирующий эффект на гуморальный ответ.

Введение рифампицина мышам перорально, в течение 7 дней в дозе 39 мг/кг стимулирует, в диапазоне доз 100-200 мг/кг не оказывает значительного влияния на синтез антител к Т-зависимым и Т-независимым антигенам. Подавление синтеза антител наблюдается при использовании доз, многократно превышающих терапевтический уровень (390 мг/кг).

Эффект модуляции гуморального иммунного ответа рифампицином зависит от срока введения антибиотика относительно иммунизации. Стимуляция атителогенеза наблюдается при введении рифампицина в дозах, соответствующих терапевтическому уровню (39 мг/кг), в течение 7 дней после иммунизации. Введение антибиотика в тех же дозах, но в более ранние сроки с -3-го по 3-й день относительно иммунизации оказывает менее выраженный стимулирующий эффект. При введении антибиотика в течение 7 дней до иммунизации стимуляции гуморального иммунитета не наблюдается.

Влияние рифампицина и

Таблица 2

на функции фагоцитирующих клеток иммунный ответ

Объект воздействия

Функции

Условия опыта

Доза или концентрация

Эффект

нейтрофилы хемотаксис

адгезия

1 )

in vitro 0,1-100 мкг/мл О

ex vivo 23,3 мг/кг

in vivo 39 мг/кг +

195-390 мг/кг *

in vitro 0,1-10 мкг/мл О

50-100 мкг/мл +

in vivo 1-10 мкг/мл О

100 мкг/мл т

хэмилши-несценция'

2)

1п vitro

0,1-10 тт/ш 100 мкг/мл

t

О

макрофаги продукция перекиси-. водорода

1п vitгo

0,1 мкг/мл 1 гжг/мл 10 мкг/мл

лимфоциты синтез и АОК

гемаггдаь танинов

in vivo

39-78 мг/кг 117 мг/кг

синтез антител к I фракции,., вакцины ВV '

39 мг/кг 214 мг/кг 390 мг/кг

+

О

Примечания:

1 ) Спонтанная адгезия лейкоцитов, г) Режим отмывки - центрифугированием.

3) Индуцированная зимозаном продукция перекиси водорода.

4) Введениэ препарата в течение 7 дней после шмунизации.

5) Определение антител на +7-й день.

Условные обозначения: + стимулирующий эффект; т тенденция к стимуляции; О отсутствие эффекта; - эффект торможения; 4, тенденция к подавлению.

X

Рисунок 3. Зависимость адгезии лейкоцитов от концентраций ионов кальция и магния при концентрации доксицшишна 1 мкг/мл. По оси X - концентрация ионов магния ( тМ ); по оси У - концентрация ионов кальция ( шМ ); по оси г - адгезия (Дол/чао).

Рисунок 4. Влияние- пефлоксацина на синтез гемагглютининов у мышей, иммунизированных эритроцитами барана. По оси X - доза пефлоксацина (мг/кг); по оси У - срок введения антибиотика относительно иммунизации; по оси Ъ - уровень гемагглютининов (в % к конто.™ >.

ВЛИЯНИЕ АНТИБИОТИКА Л 546 НА ФУНКЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ И ИММУННЫЙ ОТВЕТ Антибиотик * 546 - оригинальный антибиотик пептидной природы, разработанный в ГНЦА. Представляет собой лолипептид, включающий в свою структуру 4 небелковых и 4 белковых аминокислоты. Препарат проявил высокую эффективность в низких дозах (0,5 мг/кг) при экспериментальном остром и хроническом сепсисе и пневмонии, вызванных вирулентными штаммами синегнойной палочки, что позволило предположить наличие у препарата, наряду с антибактериальным действием и иммуномодулирующих свойств. [Еодункова Л.Е. и др. 1989 г. Авт.свид. * 1554386J

Изучение иммуномодулирующего действия антибиотика J6 546 показало, что в условиях in vitro антибиотик JS 546 в концентрациях 0,1-100 мкг/мл не оказывал значительного влияния на хемотаксис нейтрофнлов под агарозой. Однако, в случае введения антибиотика внутрибркшшно морским свинкам, клетки, выделенные из перитонеальной полоста через 18 часов после введения антибиотика обладали несколько повышенной хемотаксической активностью (табл.4)

Выявлено стимулирующее действие антибиотика JJ 546 на синтез гемагглютиндаов у мышей, иммунизированных эритроцитами барана. Эффект активации наиболее выражен при введении препарата на +1-й день относительно иммунизации (табл.3).

Таблица 3.

Влияние антибиотика JS 546 на синтез гемагглютининов у мышей, иммунизированных эритроцитами барана (при введении антибиотика на 0-й и +1-Й день)

Срок введения Доза антибиотика, мг/кг

антибиотика Контроль 0,01 0,1 1

среднее значение логарифмов (log) титров антител

0-й день 2.2 4*} 3,2 2

+1-й день 4,4 5,7*) 5,8*) 6,4а>

*)- достоверность > 95% по Вилкоксону-Уайту

ВЛИЯНИЕ ПЕФЛОКСАЦИНА НА ФУНКЦИЙ ЛЕЙКОЦИТОВ И ИШУННЫИ ОТВЕТ

Пефлоксацин в условиях in vitro не оказывал значительного влияния на адгезию и индуцированную зимозаном хемилюминесценцию лейкоцитов (табл.5).

При изучении действия пефлоксацина на синтез антител к Т-независимым антигенам (X фракции вакцины EV), было установлено, что в дозах, соответствующих терапевтическому уровню (100 мг/кг) пефлоксацин не оказывал значительного влияния на синтез IgM и IgG антител. В более высокой дозе 200 мг/кг пефлоксацин незначительно тормозил образование igM и IgG антител. При использовании малых доз пефлоксацина (5 мг/кг) наблюдалась незначительная стимуляция антителообразования (рис.5, 6).

Уровень IgM - антител практически не зависил от длительности введения препарата. В то время, как уровень IgG антител имеет оптимум, соответствующий длительности введения препарата в течение 6 дней.

Влияние пефлоксацина на синтез антител к Т-зависимому антигену носит более сложный характер (рис.4) и зависит от доз и сроков введения препарата.

Все исследуемые препараты были изучены в широком диапазоне доз и концентраций, охватывающих терапевтический уровень. В некоторых сучаях модулирующий эффект препаратов относился к дозам и концентрациям, выходящим за рамки терапевтического уровня. Рассматривая лишь узкий спектр доз, соответствующих терапевтическим для человека (в расчете по поверхности тела), и концентраций, соответствующих создаваемых в крови при приеме антибиотика, можно отметить, что все исследуемые препараты (доксициклин, рифампицин и пефлоксацин) в терапевтическом диапазоне доз и концентраций не угнетали иммунный ответ и не подавляли функции фагоцитирующих клеток, а в некоторых случаях оказывали стимулирующий эффект на отдельные показатели.

Доксициклин в дозе 13 мг/кг (соответствующей терапевтическому уровню) при введении в течение 7 дней после иммунизации, не оказывает значительного влияния на гуморальный иммунный ответ у мышей (к Т-зависимому и Т-независимому антигенам). В концентрации 1 мкг/мл доксициклин не влияет на

Таблица 4

Влияние антибиотика * Б46 на функции лейкоцитов и иммунный ответ

Объект воздействия Функции Условия опыта Доза или концентрация эффект

нейтрофилы хемотаксис in vitro 0,1-100 мкг/мл 0

ex vivo 1 мг/кг +

адгезия15 in vitro 0,05-50 мкг/мл_ 0

лимфоциты и АОК синтез гемагглЮр. тининов ' in vivo 0,01-1 мг/кг +

Таблица 5 Влияние пефлоксацина на функции лейкоцитов и иммунный ответ

Объект воздействия Функции Условия опытов доза или концентрация Эффект

адгезия15 in vitro 0,1-100 мкг/мл 0

хемилюми-несценция in vitro 0,1-100 мкг/мл 0

лимфоциты и АОК синтез антител к I фракции вакцины ЕУ in vivo 5 мг/кг 102,5 мг/кг 200 мг/кг + 0 4-

Примечания: Условные обозначения:

1) Спонтанная адгезия лейкоцитов. + стимулирующий эффект;

г) Введение препарата на + 1-й день ^ тенденция к стимуляции;

О отсутствие эффекта; - эффект торможения; + тенденция к подавлению.

5

102,5

У

Рисунок 5. Влияние пефлоксацина на синтез з&М-антител у мнией, иммунизированных I фракцией вакцины ВУ.

По оби X - доза антибиотика (мг/кг);

по оси У - длительность введения антибиотика (дни)

по оси 2 - уровень 1гМ-антител (в % к контролю).

Рисунок 6. Влияние пефлоксацина на синтез 1§0-антител у мышей, иммунизированных I фракцией вакцины ЕУ. •

По оси X - доза антибиотика (мг/кг);.1

по оси У - длительность введения антибиотика (дни)

по оси % - уровень 1§0-антител (в % к контролю).

хемилкминесценцию лейкоцитов и стимулирует на 39% продукцию перекиси водорода макрофагами. In vitro, в концентрациях 1-5 мкг/мл доксициклин снижает на 7-10% адгезию лейкоцитов, в условиях in vivo снижение адгезии доксициклином носит недостоверный характер. Введение в перитонеальную полость морских свинок доксициклина в дозе 7,8 мг/кг индуцирует выход в перитонеальную полость морских свинок большого количества нейтрофилов, обладающих повышенной хемотаксической активностью.

Рифампицин в дозе 39 мг/кг (соответствующей терапевтическому уровню) при введении мышам в течение 7 дней после иммунизации, стимулирует синтез гемагглютининов и синтез IgM- и lgG-антител к I фракции вакцины EV. При 3-х кратном введении рифампицина в дозе 23 мг/кг морским свинкам-донорам клеток отмечена тенденция к стимуляции хемотаксиса перитонеальных нейтрофилов под агарозой. Введение рифампицина мыиам в дозе 39 мг/кг, в течение 5 дней стимулирует на 63% выход лейкоцитов в очаг воспаления (подкожный воздушный мешок с введенным зимозаном). В концентрациях 1-10 мкг/мл рифампицин не оказывает значительного влияния на адгезию лейкоцитов. После отмывки от антибиотика лейкоцитов, проинкубированных с рифампицином в концентрациях 1-10 мкг/мл, наблюдается тенденция к стимуляции хемилюминесценции. В концентрации 1 мкг/мл рифампицин стимулирует продукцию перекиси водорода макрофагами на 22%. Приведенные данные свидетельствуют о стимулирующем действии рифампицина на процессы активации лейкоцитов и макрофагов , что может рассматриваться как важный фактор синергизма действия антибиотика с факторами неспецифической резистентности и факторами, обеспечивающими иммунный ответ.

Пефлоксацин в концентрациях 1-10 мкг/мл не оказывает влияния на адгезию и хемилкминесценцию лейкоцитов. В дозе 100 мг/кг, соответствующей средней терапевтической для человека, не влияет на синтез агглютининов у мышей, иммунизированных эритроцитами барака и на синтез IgM- и igG- антител у мышей, иммунизированных I фракцией вакцины EV. В дозе 200 мг/кг, соответствующей максимальной терапевтической, незначительно тормозит синтез Igtf- и IgG- антител к I фракции вакцины ev у мышей.

' ВЫВОДЫ

1. Комплекс методов для изучения действия антибиотиков на функции лейкоцитов и иммунный ответ с использованием многофакторного анализа мокет применяться при доклиническом изучении химиопрепаратов.

2.Разработавый метод оценки адгезии лейкоцитов отличается высокой чувствительностью, производительностью, и может быть рекомендован для изучения in vitro лекарственных препаратов.

3. Экспериментально установленное стимулирующее действие рифампицина на функции лейкоцитов и иммунный ответ является обоснованием безопасности применения препарата при терапии инфекционных заболеваний.

4. Получены количественные характеристики модифицирующего влияния ионов кальция и магния на снижение адгезии лейкоцитов под действием доксициклина, что создает предпосылки для дальнейшего изучения тонких механизмов побочного действия препаратов в ряду тетрациклинов.

Б. Математические модели действия доксициклина, рифампицина и пефлоксацина на иммунный ответ дают возможность прогнозировать эффекты препаратов и оценивать взаимодействия дозо-временных факторов в широком интервале значений.

6. Пептидный антибиотик * 546 обладает иммуностимулирующей активностью, что свидетельствует о перспективности дальнейшей разработки пептидных антибиотиков.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зебрев А.И., Смолкина Т.В., Руднева н.А., Траханова М.Н., Михеева Г.Н. Влияние антибиотиков на адгезию лейкоцитов // тезисы докладов Всесоюзного семинара "Колонизационная резистентность и химиотерацевтические антибактериальные препараты". - М., 1988.- ч.2,- С.175-176.

2. Смолкина Т.В., Зебрев А.И., Быкова И.С., Никитин А.В. Ичогофакторный анализ ишуномодулируюцего действия доксициклина // Тезисы докладов научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях". - Челябинск, 1990. - С. 213.

3. Смолкина Т.В., Зебрев А.И., Быкова И.О. Влияние доксициклина и рифампицина на хемилюмзнесцэнцию лейкоцитов // Тезисы докладов Международной конференции молодых ученых "Получение, исследование, применение антибиотиков и биологически'активных веществ". - М., 1990. - С.23.

4. Зебрев А.И., Смолкина Т.В., Никитин А.В. Зависимое от Mg2+ тормокение адгезии лейкоцитов, вызванное доксициклином // Антибиотики и химиотерапия. - 1990. - Л 8. - С. 28-30.

5. S.M.Navashin, A.Y.Nikitin, I.P.Fomina, A.I.Zebrev, T.V.Smolkina, V.M.Fiehman. Multifactorial analysis of doxyoyoline elfeot on adhesion of neutrophiles // Abetr. 9th Int. SYmp. Future Trends in ohemother. - Geneva, 1990. - P.70.

6. A.V.Nikitin, S.H.Navaehin, I.P.Fomina, A.I.Zebrev, T.V.Smolkina, V.M.Fiehman. Multifactorial analysis of doxyoyoline effeot on the primary immune response // Abetr. 9th Int. SYmp. Future Trends in ohemother.- Geneva, 1990. - P.72.

7. Никитин А.В., Смолкина Т.В., Зебрев А.И. Влияние рифампицина и доксициклина на хемилюминесценцию лейкоцитов // Антибиотики и химиотерапия. - 1991. - Л 9. - С. 13-16.

8. Смолкина Т.В., Никитин А.В., Зебрев А.И., Свиногеева Т.П. Влияние рифампицина и доксициклина на хемотаксис лейкоцитов// Антибиотики и химиотерапия.- 1992.- * 3.- С.22-25.

9- Смолкина Т.В., Зебрев А.И., Никитин А.В. Влияние рифемпицина и доксициклина на продукцию перекиси водороде макрофагами // Антибиотики и химиотерапия. -1992. - Л 7. -С. 17-19.

10. S.M.Navaehin, I.P.Fomina, A.V.Nikitin, T.V.Smolkina, A.I.Zebrev, АЛ-Iordanova. Iranunomodulating Aotivity of Pefloxaoin // 4-th Biennial Conference on Chemotherapy of Infeotious Diseaeee and Malignancies. - Prague, Czechoslovakia, 1992.

11 Бодункова* Л.Е., Новикова Л.М., Зебрев А.И., Смолкина Т.В., Вядро МЫ., Иваницкая Л.П., Никитин А.В., Фомина И.П., Юендеров Б.А., Кудинова М.К., Шаройко Е.С., Кобрин М.Б., Ушакова Т.А., Мальцев Н.И. Штамм бактерий Flavobaoterium вр.-продуцент антибиотика J8646 и способ получения антибиотика Ж546. 1989 г. Авт.свид. Я 1Б54386

Тир. 80

Подписано в печагь 31.12.92

Зак. I

МГП "Атомполиграфсервис"