Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Особенности оценки иммунотоксических и иммунофармакологических свойств различных групп фармакотерапевтических веществ

На правах рукописи

КОВАЛЕНКО ЛАРИСА ПЕТРОВНА

ОСОБЕННОСТИ ОЦЕНКИ ИММУНОТОКСИЧЕСКИХ И ИММУНОФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РАЗЛИЧНЫХ ГРУПП ФАРМАКОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

Научные консультанты: академик РАМН, доктор медицинских наук наук, профессор С.Б. Середенин,

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор И.С. Гущин доктор медицинских наук, профессор Т.А. Воронина доктор медицинских наук Т.Н. Давыдова

Ведущее учреждение - Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова

Защита состоится 2003 г.

в" " час. на заседании диссертационного совета Д.001.024.01 в ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д. 8.

доктор медицинских наук, профессор I А. А. Польнер!

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Е.А. Вальдман

2-e>oJ-fl

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Основной целью в исследовании возможной токсичности новых лекарственных средств на доклиническом этапе является доказательство их безопасности, установление зависимых и независимых от дозы побочных эффектов и степени их обратимости, определение соотношения пользы и риска при доказанной необходимости применения препарата (Т.А. Гуськова, 1990). На первых этапах упорядочения оценки безопасности лекарств влияние на иммунную систему не изучали или использовали методологию выявления профессиональных заболеваний (нанесение препаратов на кожу, ингаляционное воздействие). Однако антигенность высокомолекулярных препаратов животного и микробного происхождения (вакцин, антисывороток), метаболитов беталактамных антибиотиков (A.L. de Weck, 1971, G.T. Stewart, 1973, Д.К. Новиков и соавт., 1998) выраженное влияние лекарственных средств (гормональных препаратов, циклофосфамида и др.) или имеющихся в них примесей, стабилизаторов и консервантов на иммунную систему привело к созданию различных методологических подходов изучения иммунотоксичности на уровне национальных программ разных стран (M.I. Luster et al., 1992, J. Descotes et al., 1995, H.W. Vohr, 1995). В настоящее время еще не выработано единой программы по изучению иммунотоксичности, наиболее активные исследования в этом направлении ведутся в Голландии и США (I. Kim-ber et al., 1999).

Известны различные механизмы нарушений иммунной системы, сопровождающихся последовательным возникновением признаков иммунодефицитной, аллергической, аутоиммунной и онкологической патологии! Большинство психотропных, кардиотроп-ных и антимикробных лекарственные средств и их метаболитов оказывают выраженное действие на клеточные мембраны, разные субпопуляции клеток и их эндогенную регуляцию, что может привести к подавлению или стимуляции иммунитета и возникновению воспалительных реакций различной этиологии. Так, экспрессия СОХ-2 в нейронах коры головного мозга, гиппокампа и других клетках усиливает патологические изменения при болезни Альцгеймера, сосудистых деменциях, раке прямой кишки и аденома-тозных полипах, что привело к комплексному лечению^этщ-заболеваний совместно с

1 рос. НАЦИОНАЛЬНАЯ!

библиотека \

!

НПВП нового поколения, а также поиску нейротропных препаратов с противовоспалительным компонентом действия (J. Botting, 2000). Для сердечных гликозидов и ряда других кардиотропных средств характерна способность к кумуляции с увеличением токсичности метаболитов. Частота аллергических осложнений колеблется при применении пенициллинов и цефалоспоринов, полученных по разным технологиям, в связи с наличием высокомолекулярных примесей, различием в реактогенности антигенных детерминант и перекрестной сенсибилизации, что определяет актуальность дальнейшего изучения этой проблемы (В.А. Baldo et al., 2001, В.М. Brooks et al., 2001, T.M. Со-enen et al., 2001). Дополнительно следует отметить, что мембраноактивные соединения а также элементы лекарственных форм, предложенных для повышения избыточности действия (противораковые препараты в виде дисперсных мицеллаобразных липидов, липосомальные формы лекарственных средств), способствуют возникновению псевдоаллергических реакций (J. Szebeni et al., 1999-2001), что указывает на необходимость экспериментального изучения этих реакций у создаваемых лекарств.

Среди разработанных в НИИ фармакологии РАМН новых фармакологических средств скрининг производных меркапто-бензимидазола, пролинсодержащих пептидов и 3-оксипиридинов выявил соединения с антиоксидантными и мембранопротекторны-ми свойствами, высокой активностью и широтой фармакологических эффектов - афо-базол, ноопепт и мексидол (Т.А. Воронина, С.Б. Середенин, 2002, Т.А. Гудашева, 1998, R.U. Ostrovskaya et al., 1998). Олигопептиды обладают широким спектром функциональной активности, представляя собой регуляторы нервной, эндокринной и иммунной систем (О.Л. Воронина, A.A. Замятнин, 2001), что могло обусловить наличие у но-опепта иммунофармакологических свойств. У ряда производных 3-оксипиридина и 5-окспиримидина обнаружили антиоксидантные и иммуномодулирующие свойства (Д.Н. Лазарева с соавт., 1995), в связи с чем исследование наиболее активных соединений этих групп может выявить новые перспективные препараты, предназначенные для коррекции различных нарушений иммунной системы.

Целью исследования явилось совершенствование системы оценки аллергизирующего и иммунотоксического действия на основе анализа иммунофармакологических эффектов мембраноактивных веществ различной химической структуры и фармакологиче-

ской активности. Для достижения указанной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Усовершенствование и разработка экспериментальных моделей при сравнительном изучении аллергизирующих свойств бетактамных антибиотиков и аминогли-козидов, изучение влияния высокомолекулярных примесей на аллергизирующие свойства пенициллинов и цефалоспоринов.

2. Создание экспериментальной модели для изучения псевдоаллергических реакций.

3. Характеристика и прогноз аллергизирующих (для антибиотиков) и аллергизирующих и иммунотоксических свойств разных групп психотропных и кардио-тропных средств.

4. Изучение роли кумуляции метаболитов в механизме токсического действия на примере кардиотропного препарата боннекор.

5. Изучение иммунофармакологических свойств оригинальных психотропных препаратов, обладающих мембранотропным действием.

6. Разработка на основе полученных данных методологических подходов к оценке иммунотоксических и аллергизирующих свойств мембраноактивных средств в дополнение к предшествующим "Методическим рекомендациям по оценке аллергенных свойств фармакологических средств" 1988 года и " Методическим рекомендациям по оценке иммунотоксических свойств фармакологических средств" 1992 года.

Научная новизна работы

На основании полученных данных впервые охарактеризованы аллергизирующие и иммунотоксические свойства новых кардиотропных, психотропных средств и ряда других изученных мембраноактивных соединений.

Создана оригинальная, экономичная и информативная модель для выявления псевдоаллергии, которая может быть использована и для скрининга новых противовоспалительных и противоаллергических средств.

Выяснен механизм связанного с кумуляцией, летального действия метаболитов антиаритмического препарата боннекор.

Изучены выраженные противовоспалительные свойства препарата ноопепт, что дополняет информацию о механизмах его нейропротективного действия.

Впервые определены иммунокорригирующие свойства ноопепта, выявлено значительное увеличение спонтанной пролиферативной активности спленоцитов под действием препарата, что указывает на возможность усиления пролиферации различных типов клеток головного мозга.

Среди производных 3-оксипиридинов и 5-оксипиримидинов найдено активное им-мунотропное соединение ОПМ-411 с выраженной противоопухолевой активностью.

Экспериментально доказано наличие высокомолекулярных примесей у р-лакгамных антибиотиков отечественного производства, удаление которых методом ультрафильтрации приводило к выраженному уменьшению аллергизирующих свойств бензилпени-циллина.

Практическая значимость

Научные положения и выводы выполненной работы явились основой для дополнения и совершенствования изданных Фармакологическим комитетом РФ " Методических рекомендаций по оценке аллергенных свойств фармакологических средств" 1988 года, создания новых " Методических указаний по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ" 1999 года и "Методических указаний по оценке иммуно-токсического действия фармакологических веществ", которые вошли в "Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" 2000 года.

Создана оригинальная экспериментальная модель для выявления псевдоаллергических реакций у мембраноактивных соединений.

Даны рекомендации по удалению высокомолекулярных примесей р-лактамных антибиотиков, что ведет к значительному снижению аллергенности беталактамидов.

Определены и изучены новые свойства (противовоспалительные и иммунокорригирующие) препарата ноопепт, что позволит расширить его использование при заболеваниях нервной системы, связанных с развитием воспалительных процессов и иммуноде-фицитных состояний.

Скрининг среди ряда производных 3-оксипиридинов и 5-оксипиримидинов выявил активный иммуномодулятор ОПМ-411 с противоопухолевой активностью.

Материалы по изучению аллергизирующих свойств препаратов (карфециллин, карбенициллин, азлоциллин, цефалотин, суспензия ампициллина, цефалексин, суспензия цефалексина, рифампицин, бефол, апилактоза, рондоферрин, рондекс-М, лада-стен) аллергизирующих и иммунотоксических свойств пептида-дельта-сна, тропокси-на, афобазола, ноопепта, брадизола вошли в комплект документов, на основании которых Минздрав РФ разрешил их клинические испытания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработка на основе полученных данных методологических подходов к оценке иммунотоксических и аллергизирующих свойств мембраноактивных средств различных фармакотерапевтических групп с выявлением их возможного иммунофармако-логического действия.

2. Создание оригинальной экспериментальной модели псевдоаллергической реакции на конканавалин А, которая позволяет определять влияние изучаемых веществ на острое экссудативное воспаление и выявить противовоспалительные свойства у новых мембраноактивных соединений.

3. Доказательство отсутствия аллергизирующих и иммунотоксических свойств кардиотропных средств, синтезированных в ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Заку-сова РАМН, при введении их в терапевически эффективных дозах.

4. Определены аллергизирующие свойства и высокомолекулярные примеси у изученных беталактамных антибиотиков отечественного производства, предложены методы удаления примесей и продуктов полимеризации.

5. Выявлены противовоспалительные и иммунокорригирующие свойства ноопепта и противовоспалительные свойства производных 2-меркапто-бензимидазола.

6. Скрининг иммунотропной активности среди ряда соединений 3-оксипиридинов и 5-оксипиримидинов с иммуномодулирующими свойствами определил наиболее активное соединение ОПМ-411, обладающее также выраженной противоопухолевой активностью.

Основные сведения об апробаиии работы

Основные результаты диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Химиотерапия бактериальных инфекций" (Алма-Ата, 1979), 4-й Всесоюзной конференции "Побочное действие лекарственных средств" (Москва, 1982), I Всесоюзном съезде токсикологов (Ростов-на-Дону, 1986), 6-м Всесоюзном съезде фармакологов (Ташкент, 1988), 8-м Международном симпозиуме токсичности лекарственных средств (Берлин,

1988), информационной конференции по клиническому применению бефола (Тбилиси,

1989), 4-й конференции "Биоантиоксиданты" (Москва, 1992), 4-м, 5-м и 8 конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 1997, 1998 и 2001), VII Международном конгрессе по иммунореабилитации "Аллергия, иммунология и глобальная сеть: взгляд в новое тысячелетие " (Нью-Йорк, 2001), 3-й Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам " (Суздаль, 2001), 2 съезде Российского общества фармакологов "Фундаментальные проблемы фармакологии" (Москва, 2003), на межлабораторной конференции ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (Москва, 2003), на 41 Конгрессе Европейского общества токсикологов (Флоренция, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 печатных работ.

Структура и объем диссертадии. Диссертация изложена на 323 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, 5 глав результатов собственных исследований, заключения и выводов. В работе имеется 78 таблиц, 19 рисунков. Библиографический указатель содержит 383 источника, из которых 131 принадлежит отечественным и 252 - зарубежным авторам.

Материалы и методы исследований Исследования выполнены на 5-ти видах экспериментальных животных: кроликах самцах породы Шиншилла (п=140) массой 2-2,5 кг; морских свинках альбиносах самцах (п=360) массой 200-250 гмышах самцах белых беспородных (п— 400); линий Balb/c (п= 27 ); СВА (n=2176 ); С57В1/6 (п= 504 ); гибридах Fi(CBAxC57Bl/6)

[n= 1100]- массой 18-20 г; собаках беспородных (п=18); крысах беспородных самцах (п=64) массой 150-170 г и 200 г.

В работе использованы следующие методы и экспериментальные модели: 1. -реакция пассивной гемагглютинации (с использованием микротитратора Такачи, Венгрия) на мышах СВА, С57В1/6 и кроликах; 2. - определение числа антителообра-зующих клеток (метод Ерне) на мышах СВА и С57В1/6; 3. - влияние препаратов на клеточный иммунный ответ (ГЗТ) в опытах на мышах F] (СВА х С57В1/6); 4. - локальный вариант реакции транплантат против хозяина на мышах СВА и F] (СВА х С57В1/6); 5. -оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов (поглощение частиц туши) в опытах на мышах Fj (СВА х С57В1/6), измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре Uniscan при длине волны 620 нм; 6. - оценка активности нейтрофилов мышей Fi (СВАх С57В1/6) в тесте хемилюминесценции (XJI), XJ1 регистрировали на хемилюминометре Bioorbit 1251 (Швеция); для активации XJI нейтрофилов использовали опсонизированный зимозан и форболмиристатацетат (ФМА); 7. - исследование спонтанной и индуцированной митогенами пролиферации спленоцитов у мышей F) (СВА х С57В1/6), асептически полученную суспензию спленоцитов культивировали в СС>2 инкубаторе в течение 72 часов, по окончании культивирования клетки переносили на стекловолокнистые фильтры (F/c Whatman, Англия) при помощи харве-стера (Flow, Англия), подсчет радиоактивности производили на сцинтиляционном р-счетчике; 8,- оценка анафилактогенной активности в реакции общей анафилаксии на морских свинках-альбиносах; 9. - оценка анафилактогенной активности в реакции активной кожной анафилаксии на морских свинках-альбиносах; 10. - реакция дегрануля-ции базофильных лейкоцитов (непрямой тест Шелли) на кроликах; 11.- реакция ГЗТ на морских свинках-альбиносах; 12. - реакция воспаления на конканавалин А на беспородных мышах, мышах линии СВА и Balb/c; 13. - отек стопы крыс на каррагенан (Sigma); 14. - адъювантный артрит у крыс, применяли метод, предложенный в работе JIEYUN JIANG с соавт., 1997, использовали полный адъювант Фрейнда (IIAO,Difco, USA) с добавлением в каждый мл по 5 мг убитых прогреванием микобактерий штамма БЦЖ-1; 15.- биохимические показатели сыворотки крови у собак определяли на биохимическом анализаторе Compur (Германия); 16. - определение гематологических показателей у собак, подсчет клеюк крови проводили на счетчике Picaskel (Венгрия). Пе-

ресчет доз для животных каждого вида проводили с учетом видовой чувствительности, массы и поверхности тела (E.L. Freireich et al., 1966).

Вторичный иммунодефицит у мышей вызывали введением за сутки до антигенной стимуляции 150 мг/кг циклофосфана (Serva) или циклофосфамида. При изучении противоопухолевой активности ОПМ-411 использовали опухолевой штамм карциномы легких Льюиса, полученного в лаборатории штаммов ВОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Опухоли в эксперименте прививали под кожу в область подмышечной впадины по 0,2 мл 30% взвеси. Очистку бензилпенициллина от высокомолекулярных примесей прово- t дили методом ультрафильтрации через мембраны типа Amicon. При определении высокомолекулярных белковых примесей использовали метод Лоури. Подготовка к обработке первичных данных и расчеты проводились в среде пакета статистических программ (PSP) Statistica (версия 6,0). Статистический анализ данных проводился с помощью t-критерия Стьюдента и непараметрического критерия Манн-Уитни (U- тест).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1.Сравнительная оценка аллергизирующих свойств антибиотиков

Для химической структуры беталактамидов характерно наличие ß-лактамного кольца, что обусловливает идентичность основного звена антимикробного эффекта и аллергизирующих свойств, которые и определяют основной вид побочного действия при лечении этими антибиотиками, причем количество аллергических осложнений при применении пенициллинов и цефалоспогинов в последние годы возрастает (R. Solensky et ^ al., 2002, M.J. Torres et al., 2002, D.P. Prasser et al., 2002). Беталактамиды являются се-

(

лективными ингибиторами синтеза мукопептидов клеточной стенки бактерий, находящихся в стадии размножения, однако в процессе биотрансформации образуется более 10 метаболитов, каждый из которых может бьггь гапггеном и соединяться с циркулирующими и тканевыми белками в организме человека (A.L. de Weck, 1971). Согласно данным клинических исследований (G.T. Stewart, 1973), наличие большого количества в.м. примесей (более 11 мг/100г), обладающих антигенными свойствами, в неочищенных производных 6-аминопенициллановой (6-АПК) и 7-аминоцефалоспорановой (7-АЦК) кислот примерно в 2 раза усиливает аллергизирующие свойства антибиотиков. В работах сотрудников фирмы Beecham (J.M. Dewdney, 1980) было показано, что

очищенные от высокомолекулярных примесей образцы бензилпенициллина и ампициллина, конъюгированные с сывороточными альбуминами или с бычьим гаммаглобули-ном, не стимулируют иммунную систему животных к формированию и развитию реакций анафилаксии. Введение мышам от 3 до 15 мг высокомолекулярных примесей из коммерческих образцов этих пенициллинов было достаточно для синтеза 1$>Е в высоких титрах.

Таблица № 1

Влияние очистки ультрафильтрацией №-соли бензилпенициллина на иммунологические показатели у кроликов

Число животных Тест Шелли РПГА

Число животных с положительной реакцией Среднее количество изменённых базо- филов (в %) животных с положительной реакцией Число животных с положительной реакцией Средний 1о& обратной величины титра антител

Бензилпенициллин очищенный

8 5 33,0 ± 2,9* 8 2,4 ±0,18*

Бензилпенициллин исходный

8 8 41,8 + 2,7 8 5,1 ±0,34

Контроль

8 - - - -

Примечание: *- различие между очищенным и исходным образцами Ыа-соли бензилпенициллина достоверно по ^критерию Стьюдента при Р<0,05.

Нами в первой серии экспериментов на кроликах было показано, что очистка промышленных образцов Ыа-соли бензилпенициллина от в.м. примесей методом ультрафильтрации через полунепроницаемые мембраны Аяпсоп уменьшала аллер-гизирующие свойства бензилпенициллина (табл. 1). После 2-го цикла иммунизации

бензилпенициллином в смеси ПАФ РПГА была положительной у всех животных опытных групп. Среднее значение обратной величины титра антител у животных 1-й опытной группы было равно 2,4, а у животных 2-й опытной группы - 5,1.

Тест Шелли был положительным у 5 из 8 животных 1-й группы и у всех животных 2-й группы, иммунологические показатели животных контрольной группы были отрицательными. Совместно с лабораторией готовых лекарственных форм Государственного научного центра по антибиотикам Минэкономики России (ранее Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков, ВНИИА) нами было проведено изучение наличия белковых примесей (табл. 2) в ряде производных 6-АПК и 7-АЦК. В изученных заводских образцах препаратов ампициллина и цефалексина обнаружили значительное количество в.м. примесей, в лабораторных образцах цефалотина белковых примесей не выявили. Таким образом, нами впервые экспериментально было доказано наличие высокомолекулярных примесей в промышленных образцах антибиотиков отечественного производства.

Таблица № 2

Количество высокомолекулярных примесей в антибиотиках, _в пересчёте на 100 г препарата_

Антибиотики Высокомолекулярные примеси в мг

Ампициллин безводный (экспериментальный завод ВНИИА) 194

Цефалексии (Рижский завод) 394

Цефалексии (Финляндия) 22

Цефалотин (ВНИИА, лабор. образец) -

Кефлин (фирмы Лилли) 19

В связи с этим, нам кажется целесообразной разработка определенного регламента по выявлению и максимальной очистке беталактамидов от аллергизирующих примесей, как это было сделано при производстве церебролизина в Германии (К.А. Jellinger, 2002). При дальнейшем изучении в опытах на кроликах аллергизирующих свойств промышленных образцов цефалотина, цефалексина, суспензии цефалексина, азлоциллина, карфециллина, карбенициллина, ампициллина, суспензии ампициллина у всех антибиотиков были также выявлены аллергенные свойства, но менее выраженные, чем у бензилпенициллина.

При изучении амикацина нами была использована разработанная C.W. Chung и T.R.Carson модель гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок, которая позволила нам также выявить аллергизирующие свойства у изученных аминоглико-зидов. У части свинок опытных групп, которых иммунизировали амикацином в смеси с ПАФ, через 24 и 48 часов наблюдали аллергические реакции замедленного типа (инфильтраты, покраснение по всему участку диаметром 5-6 мм в местах в/к введения). После модификации мы успешно использовали эту модель при изучении аллергенности новых фармакологически эффективных соединений, включив ее в "Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств" 1988 года и в "Методические указания по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ" 1999 года.

2.ПСЕВДОАЛЛЕРГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ, АНАФИЛАКТИЧЕСКИЙ ШОК И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

2.1 Псевдоаллергическая реакция на конканавалин А эстриглутона, аллергенные свойства препарата АВП, азакраунэфира С-3 и апилактозы

При экспериментальном изучении противоаллергических средств для воспроизведения псевдоаллергических реакций применяются неиммунологические активаторы: вещество 48/80, декстран, лектины растительного происхождения (E.Khosravi et al., 1995). Теоретически предложенный нами метод основан на способности многофункционального поливалентного лектина конканавалина А (Кон А), выделенного из Canavalia ensiformis , высвобождать медиаторы аллергического воспаления (гистамина, лейкотриенов ) в результате прямого действия на рецепторы мембран тучных клеток и

базофильных лейкоцитов мышей (без участия реагинов с антигенами на мембранах клеток-мишеней). Кон А в концетрациях 1-10 мкг/мл обладает митогенной активностью к Т-лимфоцитам, введение препарата в больших коцентрациях приводит к подавлению иммунного ответа (И.Г. Дадьков с соавт., 1994). Мы вводили Кон А в цитоток-сичной концентрации 5 мг/мл. В отличие от других видов у крыс (которые наиболее часто используются для воспроизведения острого локального воспаления в виде отека стопы) высвобождение гистамина из тучных клеток под воздействием Кон А происходит в присутствие фосфатидил-Ь-серина (T.J. Sullivan, et al., 1975).

контроль 25 мг/кг 100 мг/кг 500 мг/кг

(Р<0,05) (Р<0,01)

Рис. 1 Влияние препарата эстриглутон на реакцию воспаления на Кон А (введение однократное, per os); по оси ординат - индекс реакции, по оси абсцисс - дозы препарата. Примечание: статистически достоверные различия с контролем по t-критерию Стью-дента при Р<0,05; - при Р<0,01.

С 1985 года в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова нами были выявлены единичные случаи выраженных реакций анафилаксии и псевдоаллергических реакций при изучении безопасности различных групп фармакологических соединений. При определении влияния адаптогенного препарата эстриглутон на реакцию воспаления на Кон А, однократное пероральное введение эстриглутона мышам в дозах 25 мг/кг, 100 мг/кг и 500 мг/кг (рис. 1) вызывало статистически достоверное увеличение реакции воспаления ( на 37,9% и 53,0%). В состав таблеток эстриглутона входили следующие мембраноактивные соединения: эфедрин - 0,025г ; стрихнин - 0,001 г ; глутаминовая

кислота-0,250 г ; сахар - 0,01г; крахмал-0,042 г; поливинил-пиролидон - 0,01 г; тальк-0,085 г; стеарат - 0,0035г.

Наличие судорог у мышей при введении больших доз эстриглутона, дозозависимое усиление реакции воспаления на Кон А и ряд других отрицательных характеристик не позволило положительно охарактеризовать этот препарат для последующего клинического изучения.

25-fl-

20 15 10 5 0

контроль 2 мг/кг п/к 60 п/к 60 в/в (Р<0,05) (Р<0,01)

Рис.2 Влияние препарата АВП на реакцию воспаления на Кон А; по оси ординат -индекс реакции, по оси абсцисс - доза препарата АВП. Примечание : - статистически достоверные различия с контролем по t-критерию Стьюдента при Р<0,05; - при Р<0,01.

При изучении аллергизирующих свойств высокомолекулярного (ДНК-содер-жащего) препарата АВП было выявлено усиление реакции гиперчувствительности немедленного типа (у 30-33% иммунизированных препаратом животных системных реакций анафилаксии и у 30-50% животных кожносенсибилизирующих антител к препарату), замедленного типа (у 30-60% животных), а также усиление реакции воспаления (рис. 2). Препарат АВП в различных дозах и при разных способах введения усиливал высвобождение медиаторов воспаления. Подкожное введение препарата в дозе 2 мг/кг усиливало реакцию воспаления по сравнению с контролем на 37%, внутривенное введение в дозе 60 мг/кг усиливало реакцию воспаления на 47%. Полученные данные свидетельствуют о наличии у препарата АВП провоспалительных свойств, усиливающих псевдоаллергическую реакцию воспаления на Кон А. По данным D.K. Ghosn с соавторами (2001), аналог микробной ДНК (CpG DNA) активирует экспрессию

СОХ-2 и ¡КЮБ-синтазы макрофагов мышей, увеличивая продукцию N0 и РОЕ2 и усиливая реакцию воспаления. При изучении известных противоаллергических и противовоспалительный средств на модели реакции на Кон А в дозах, эквивалентных терапевтическим и в 10 раз их превышающих, подавление реакции было наиболее выраженным при введении кларитина (1,3 мг/кг - на 56,1%, 13 мг/кг - 70,9%). Метод включен в перечень методов для изучения псевдоаллергии в "Методические указания по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ" 2000 года. В трех сериях экспериментов было проведено исследование аллергизирующих свойств ноотропного препарата азакраунэфира С-3 (СиНгв^С^-НСЛ) в различных дозах и с различными образцами препарата. В первой серии экспериментов азакраунэфир С-3 вызывал у части животных (22%-60%) аллергические реакции немедленного типа, аллергических реакций замедленного типа не выявили. В следующих опытах был изучен другой образец препарата (при иммунизации азакраунэфиром С-3 в дозе 5 мг/кг индекс анафилаксии по Weigle составил 0,33, в дозе 50 мг/кг - индекс Weigle -1,22), гиперчувствительности замедленнного типа не выявили. Достоверной активации реакции воспаления на Кон А также не определили. При изучении аллергизирующих свойств биологически активного продукта пчеловодства - апилактозы, препарат по всем изученным тестам в различной степени обнаружил сенсибилизирующие свойства. В связи с этим апилактоза была отнесена к потенциальным аллергенам, что является противопоказанием при назначении препарата больным с аллергией к продуктам пчеловодства. У препаратов эстриглутон, АВП и апилактоза наличие аллергизирующих свойств и/или псевдоаллергических реакций можно объяснить: в случае эстриглутона - его составом, а у ДНК-содержащего препарата АВП и апилактозы - высокомолекулярными активными компонентами. Аллергизирующие свойств азакраунэфира С-3 возможно вызваны активностью аминогруппы или различным количеством метаболитов или примесей.

2.2 Сравнительная оценка противовоспалительной активности заводских образцов противоаллергического препарата Рузам, изучение противоспали-телъных свойств препарата "Кошачий коготь"

Рузам разработан группой российских ученых во главе с академиком РАМН А.Г.Чучалиным. В основу создания был положен принцип культивирования термо-

Таблица № 3

Влияние препарата Рузам на реакцию воспаления на Кон А

№ и обозначение заводского образца препарата Рузам Количество животных в группе Индекс реакции % от контроля

Контроль 11 12,44±1,73 -

Рузам 1 (37°-37°) 1 доза 2 доза 10 10 7,91+2,62* 5,23+1,12* 63,59% 42,04%

Рузам 2 (37°-50°) 1 доза 2 доза 10 10 7,63±1,57* 9,72±1,34 61,33% 78,14%

Рузам 3 (50°-50°) 1 Доза 2 доза 10 9 11,28±3,23 10,84+2,17 90,68% 87,14%

Контроль 10 17,82±3,83" -

Рузам 4 (37°,фильтрат) 10 13,71+3,22 76,94%

Рузам 5 (37°,фильтрат) 11 20,34±4,13 114,14%

Рузам 6 (49°,фильтрат) 11 15,72±2,78 88,22%

Рузам 7 (фильтрат 1:100) 10 21,11+3,62 118,46%

Рузам 8 (60°) 10 19,90+2,41 111,67

Контроль 12 20,71 ±2,23 -

Рузам 9 1 доза 2 доза 12 12 20,52+2,23 21,93±4,25 99,08% 105,89%

Примечание: *- статистически достоверные отличия от контроля по 1- критерию Стьюдента при Р<0,05.

фильных микроорганизмов, предложенный профессором Б.Л. Мазуром и Е.Б. Галкиной. Рузам относится к новому классу пептидов, действующих на патогенетические механизмы аллергического воспаления. Механизм действия: термофильные штаммы

стафилококков, клонированные при повышенных температурных режимах, вырабатывают адаптивный пептид, обладающий антиаллергенными свойствами (Г.Л. Осипова, 1998). Профессором H.A. Колгановой (НИИ Пульмонологии МЗ РФ) было предложено изучить противовоспалительное действие заводских образцов препарата Рузам, используя реакцию воспаления на Кон А.

В опытах на белых мышах самцах было исследовано 9 образцов препарата Рузам (4 образца были изучены в 2-х дозах). Только два образца препарата подавляли реакцию воспаления на Кон А (табл. 3). Полученные результаты коррелировали с экспериментальными и клиническими данными (Е.С. Пыжева, 1997). Таким образом, реакция воспаления на Кон А зарекомендовала себя как хорошая модель для скрининга наиболее эффективных образцов противоаллергических средств с поликомпонентным механизмом действия.

контроль Кк20мг/кг Кк 200 мг/кг контроль Кк 20м г/кг Кк200мг/кг р/о р<0,01 а/б рс0,01

Рис. 3 Изучение противовоспалительных свойств препарата "Кошачий коготь" на модели воспаления на Кон А; по оси ординат - индекс реакции (в %), по оси абсцисс -дозы препарата. Примечание: различие с контролем значимо при р<0,01.

На модели реакции на Кон А (рис. 3) было проведено изучение противовоспалительной активности препарата "Кошачий коготь" (Кк), созданного на основе экстракта из коры перуанской лианы Uncaria Tomentosa Wild D.C., который, согласно доклиническим и клиническим испытаниям, кроме противоопухолевого действия обладает выраженными противовоспалительными свойствами при лечении артритов и артрозов

разного генеза, а также показан при аллергических заболеваниях кожи. Использование этой модели позволило установить, что однократное пероральное введение препарата в терапевтически эффективной дозе 20 мг/кг вызывает достоверное подавление реакции воспаления на 51,5%, в дозе 200 мг/кг - на 59,0%, при в/б введении препарата подавление реакции воспаления было еще более выраженным (соответственно на 64,0% и на 73,6%).

2.3 Изучение аллергизирующих свойств плазмозаменителей крови рондоферрина

и рондекса-М

Изучение аллергизирующих свойств плазмозамещающего средства полифункционального действия рондоферрина (полученного на основе железодекстранового комплекса по радиационно-химической технологии) и гемодинамического плазмозамени-теля крови рондекса-М (полученного на основе модифицированного декстрана с молекулярной массой 65000±5000) проводилось совместно с научно-фармацевтическим центром "Белмедпрепараты" (Минск). Известно, что декстран является неиммунологическим активатором, согласно данным литературы угрожающие жизни анафилактоид-ные реакции, характеризующиеся внезапным сердечно-сосудистым коллапсом и дыхательной недостаточностью, встречаются в 0,6-2,3% случаев у пациентов, получающих лечение декстраном железа (D.L. Burns et al., 1995).

При изучении аллергизирующих свойств рондоферрина у морских свинок 5-ти опытных групп, иммунизированных по различным схемам препаратом в терапевтических дозах 5,7 мл/кг и 28,6 мл/кг, а также в дозе 50 мл/кг системных реакций анафилаксии выявлено не было. Опыты по изучению активной кожной анафилаксии выявили наличие у 20% иммунизированных рондоферрином животных (в дозах 5,7 мл/кг и 28,6 мл/кг) кожносенсибилизирующих антител, что при составлении инструкции по применению нужно учитывать как возможное проявление индивидуальной чувствительности. При иммунизации морских свинок сухим рондоферрином в дозах 0,34 г/кг и 1,70 г/кг в смеси с ПАФ повышенной чувствительности замедленного типа выявлено не было. В результате проведенного изучения аллергизирующих свойств гемодинамического плазмозаменителя рондекса-М в тех же дозах, что и рондоферрина определили, что препарат не вызывает системных реакций анафилаксии и образования

кожносенсибилизирующих антител, повышенной чувствительности замедленного типа также выявлено не было.

Рондоферрин и рондекс-М подавляли реакцию воспаления на Кон А (табл. 4). Введение рондоферрина в терапевтической дозе 5,7 мл/кг незначительно подавляло реакцию воспаления (на 28,6%). Введение препарата в максимальной терапевтической дозе 28,6 мл/кг и в избыточной дозе 50 мл/кг вызывало подавление реакции на 35,7% и 64,3%. Рондекс-М в терапевтических дозах незначительно подавлял реакцию воспаления (на 26,30% и 23,1%), введение препарата в дозе 50 мл/кг вызывало выраженное подавление реакции на Кон А (более чем в 2 раза).

Таблица № 4

Влияние рондоферрина и рондекса-М на реакцию воспаления на конканавалнн А при однократном внутривенном введении

Доза препарата Число Индекс Степень вы-

1 животных реакции раженности

в группе

Контроль 10 14,13 ±2,61 100%

Рондоферрин

5,7 мл/кг 10 10,05 ±1,90 71,4%

28,6 мл/кг 10 9,05* ±1,41 64,3%

50,0 мл/кг 10 5,07**±1,82 35,7%

Контроль 10 18,15 ± 1,13 100%

Рондекс-М

5,7 мл/кг 10 13,38* ±2,19 73,7%

28,6 мл/кг 10 13,96 ±2,12 76,9%

50,0 мл/кг 10 8,62**±1,85 47,5%

Примечание: * - различие с контролем достоверно по ^критерию Стьюдента при Р< 0,05;** - при Р< 0,01.

3. ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЛЕРГИЗИРУЮЩИХ И ИММУНОТОКСИЧЕС-

КИХ СВОЙСТВ КАРДИОТРОПНЫХ И ПСИХОТРОПНЫХ СРЕДСТВ

3.1 Характеристика аллергизирующих и иммунотоксических свойств кардиоцик-лида (для внутривенного и перорального применения), метацизина и брадизола

При изучении лекарственных форм кардиотропных средств, синтезированных в ГУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (кардиоциклида для внутривенного и перорального применения, метацизина для перорального применения и брадизола для внутривенного применения) аллергизирующих свойств выявлено не было.

Кардиоциклид -[гидрооксалат №Ы-дицикло-гексиламида-Ы-(3 -диэтиаминопропил) - М-(п-нитробензоил) аминоуксусной кислоты ]- кардиотропный препарат, разработан совместно ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН и Арцнаймитгельверк (Дрезден), структурно устойчивое соединение, блокатор калиевых каналов. Однократное внутривенное (в дозах 0,34 мг/кг и 6,72 мг/кг) и пероральное (в дозах 3,64 и 36,4 мг/кг) введение кардиоциклида мышам линии СВА не вызывало достоверного изменения реакции воспаления на Кон А.

Внутривенное введение мышам различных линий кардиоциклида (однократно в дозах 0,34 мг/кг и 6,72 мг/кг) и пероральное введение препарата в течение 14 дней (в дозах 3,64 мг/кг и 36,4 мг/кг) не вызывало достоверного изменения массы тимуса, селезенки и подколенных лимфоузлов у животных опытных групп по сравнению с контролем, статистически достоверных изменений фагоцитарного индекса и изменений в кинетике хемилюминесцентного ответа нейтрофилов на опсонизированный зимозан по сравнению с контрольными образцами. Полученные результаты позволяют заключить, что антиаритмический препарат кардиоциклид в исследованном диапазоне терапевтических и субтоксических доз и разных способах введения не обладает иммуногокси-ческой активностью.

Метацизин - антиаритмический препарат, состоящий из этмозина [2-карбэтокси-амино-10(3-морфолилпропионил)-фенотиазина гидрохлорида] и этацизина [2-карб-эток-сиамино-10(3-диэтиламинопропионил)-фенотиазина гидрохлорида] в пропорции 6:1, синтезированных и фармакологически изученных в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН. При введении метацизина в дозах 11, 33 и 55 мг/кг мышам линий

СВА и С57ВЬ/6 определили подавление антителообразоваяие к ЭБ у мышей линии СВА. Было отмечено также некоторое депрессивное действие на Т-клеточное звено иммунной системы (табл.5), метацизин в дозах 11 мг/кг и 55 мг/кг вызывал дозозависимое подавление РТТТХ (табл.6).

Таблица № 5

Влияние метацизнна на клеточный иммунитет (ГЗТ) при перораль-

I

Примечание: п - число животных.

Таблица № 6

При изучении аллергизирующих свойств антиаритмического препарата бради-зол- 2-[2-(диэтиламино)этилтио]5- этокси-бензимидазола дигидрохлорида) определили,' что однократное в/в введение брадизола мышам линии СВА с в двух дозах: терапевтически эффективной для мышей (2,8 мг/кг) и в дозе в 5 раз превышающей терапев-

ном введении метацизина мышам

Индекс Степень

Доза препарата реакции выраженности

Контроль 20,68 + 3,12 п=10 100%

11 мг/кг 14,24 ±2,13 п=10 68,9%

110 мг/кг 16,43 ±1,23 п=10 79,4%

СВАхС57В1/6) однократно

Влияние метацизнна на клеточный иммунитет (РТПХ)

, Доза препарата Индекс реакции при взвешивании лимфоузлов Индекс реакции на клеточном уровне

Ир= Еш Рк %к контролю Иу=Д В % к контролю

Контроль 2,90 100% 7,180±0,796 п=9 100%

11 мг/кг 1,70 58,62% 4,890±1,656 п=12 68,11%

55 мг/кг 1,26 43,44% 4,056*±0,734 п=14 56,49%

Примечание: *- различия с контролем достоверны по (-критерию Стьюдента приР<0,05.

тическую (14 мг/кг) вызывало выраженное дозозависимое подавление (рис. 4) реакции воспаления на Кон А (соответственно на 55,83% и 62,15%).

Введение брадизола мышам гибридам И) (СВА х С57ВЬ/6) в течение 14-ти дней внутрибрюшинно в дозе 14 мг/кг приводило к увеличению массы селезенки и тимуса у животных опытной группы. В/б введение брадизола в течение 14 дней в дозах 2,8 мг/кг

I

контроль

брадизол 2,8 мг/кг (Р<0,05)

брадизол 14 мг/кг (Р<0,05)

Рис. 4 Влияние препарата брадизол на реакцию воспаления на Кон А (введение однократно, внутривенно); по оси ординат - индекс реакции, по оси абсцисс - дозы препарата. Примечание: различие с контролем статистически значимо при р<0,05.

и 14 мг/кг не вызывало достоверных изменений фагоцитарного индекса.

В качестве источника нейтрофилов использовали гепаринизированную кровь мышей гибридов Б] (СВАхС57В1/6). Параметры хемилюминесценции нейтрофилов исследовались после двухнедельного в/б введения брадизола в дозах 2,8 мг/кг и 14 мг/кг (табл. 7). После добавления к суспензии нейтрофилов зимозана в указанной дозе уровень стимулированной хемилюминесценции - Д1 у контрольных животных составил 15,8±1,5 тУ, что в 6,7 раза превысило спонтанный уровень свечения. Интегральный показатель хемилюминесценции - Б составлял 19345,1±647,3 тУ. Изучение кинетики хемилюминесцентного ответа нейтрофилов на зимозан в контрольной и опытных группах животных выявило, что двухнедельное в/б введение брадизола в дозе 14 мг/кг приводило к достоверному (в 2,8 раза) подавлению вспышки хемилюминесценции, интегральный показатель ХЛ был уменьшен в 3,7 раза. Изучаемые параметры кривой

хемилюминесценции при этом составили: Д1 (14 мг/кг брадизола) - 5,6±0.8 шУ; в (14 мг/кг брадизола) - 5203,3±153,2 ед.

Таблица № 7

Влияние брадизола на показатели хемилюминесцентного ответа нейтрофилов, активированных зимозаном при внутрибрюшинном введении препарата в течение

14 дней

Доза брадизола А1 (ту) Уровень значимости в, (ед.) Уровень значимости

контроль (п=10) 15,8±1,5 19345,1+647,3

14-ти дневное в/б введение 2,8 мг/кг (п=10) 13,1+1,2 р>0,05 16684,2±442,1 р>0,05

14-ти дневное в/б введение 14 мг/кг (п=10) 5,6±0,8* р<0,01 5203,3±153,2* р<0,01

Примечание: п - количество животных; Д1 - показатель уровня активированной хемилюминесценции; Б - интегральный показатель хемилюминесценции, * статистически достоверные отличия от контроля при р<0,01 (^критерий Стьюдента).

Введение препарата в/б в течение 14 дней в дозах 2,8 и 14 мг/кг как мышам вы-сокореагирующей линии СВА, так и мышам низкореагирующей линии С57ВЬ/6 не вызывало достоверной стимуляции антителообразования. Влияние брадизола на клеточный иммунный ответ изучали по реакции ГЗТ в опытах на мышах гибридах Р1(СВАхС57ВЬ/6). Введение препарата в дозе 14 мг/кг в течение 14 дней до иммунизации ЭБ достоверно подавляло реакцию ГЗТ по сравнению с контролем на 23% (табл.10).

Синтезированный и фармакологически изученный в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН препарат брадизол - производное 2-меркапто-бензимидазола, обладает специфическим брадикардическим действием, улучшает функциональное состояние очага ишемии (И.Б. Цорин, 1997). Нейтрофилы играют играют ключевую роль в по-стишемическом воспалении ( Б. БсИпееЬе^ег е1 а1., 2002). При остром инфаркте миокарда активированные нейтрофилы (самая многочисленная популяция полиморфно-

ядерных гранулоцитов) оказывают выраженное цито- и органотоксическое действие, увеличивая зону инфаркта. Подавление хемилюминесцентного ответа нейтрофилов, активированных зимозаном, указывает на наличие у препарата антиоксидантных свойств, что характерно для производных 2-меркапто-бензимидазола, в частности бемитила и томерзола (С.Б. Середенин, А.Д. Дурнев, 1992). Дозозависимое подавление реакции воспаления на Кон А также косвенно указывает на наличие у препарата антиоксидантных свойств, поскольку процесс активации кислорода в различных типах клеток начинается сразу после добавления Кон А или ФГА (Л.Д. Смирнов, B.C. Сускова, 1989).

Таблица № 8

Влияние брадизола на клеточный иммунитет (ГЗТ) при введении препарата

в течение 14-ти дней

Доза препарата Индекс реакции: Ир = Еаи_ х 100 % р. Степень выраженности ГЗТ (% к контролю)

Контроль 37,321±2,031 п=10 100 %

2,8 мг/кг 31,89+4,192 п=10 85,5 %; р>0,05

14 мг/кг 28,75+2,700* п=10 77,0 %; р<0,05

Примечание: * - статистически достоверные отличия от контроля при р<0,05 ^-критерий Стьюдента), п - количество животных.

3.2 Видовая специфичность действия кардиотропного препарата боннекор

Некоторые антиаритмические препараты обладают малой терапевтической широтой и специфической видовой чувствительностью, в связи с чем в дополнительных доклинических исследованиях необходимо анализировать возникновение токсических эффектов при многократном введении этих соединений и кумулятивные свойства их активных метаболитов. Разработанное и изученное в кооперации с Арцнаймиттельверк (Дрезден) и НИИ фармакологии РАМН антиаритмическое средство боннекор в опытах на крысах обладало значительно большей терапевтической широтой (ЛД50 самцов-102 мг/кг, ЛД50 самок-149 мг/кг), чем в опытах на собаках. При изучении нами хронической токсичности боннекора в течение 6-месяцев на 18 беспоподных собаках обоего

пола доза 50 мг/кг оказалась для собак непереносимой, из 6-ти собак, которым вводили препарат в дозе 15 мг/кг, только одна собака дожила до конца эксперимента, остальные погибли в различные сроки, введение боннекора в дозе 5 мг/кг не оказывало выраженного действия на систему кроветворения и биохимические показатели крови. При изучении фармакокинетических характеристик активных метаболитов боннекора подтвердилось предположение (А.П.Родионов с соавт., 1992), что более сильное влияние метаболитов сказывается при многократном введении, т. к. период полувыведения у всех метаболитов боннекора значительно больше, чем у самого препарата. Кроме того, бон-некор и метаболит М-2 в условиях эксперимента обладал антиоксидантной активностью, метаболиты М-3 и М-4 не обладали свойствами антиоксидантов в пероксидазной тест-системе. Основной метаболит М-1 обладал выраженной прооксидантной активностью и в 3,3 раза более высокой токсичностью при в/в введении по сравнению с бонне-кором. После введения боннекора в дозе 15 мг/кг у выживших собак на ЭКГ было отмечено чередование атриовентрикулярной блокады с желудочковой тахикардией, а также изменение биохимических показателей, что согласовывалось с данными по фарма-кокинетике препарата и 4-х его метаболитов. Таким образом, наличие большого количества активных продуктов деградации у изучаемых соединений может привести к тяжелым аллергенным (как в случае беталактамных антибиотиков), так и токсическим кумулятивным эффектам. При назначении боннекора (терапевтическую дозу для человека понизили до 1 мг/кг) было рекомендовано учитывать, что препарат обладает малой терапевтической широтой и передозировка может привести к нежелательным побочным эффектам.

3.3 Изучение аллергизирующих и иммунотоксических свойств афобазола, тропок-

сина, ладастена

Наличие иммунофармакологических и возможных иммунотоксических свойств у психотропных средств (в связи с взаимодействием между иммунной и нервной, иммунной и нейроэндокринной системами) является наиболее прогнозируемым, но механизмы действия психотропных средств на иммунную систему, в частности адаптоге-нов, фармакологических соединений с выраженными антиоксидантными свойствами и пептидных препаратов различаются. Воспаление является многокомпонентным процессом с множеством альтернативных и перекрещивающихся связей, где большую

роль играют временные и концентрационные характеристики различных типов клеток и медиаторов воспаления. При мозговой травме воспаление включает в себя изменение экспрессии генов, затем увеличение различных протеинов, провоспалительных цитокинов (IL-1(5 и TNF-a), хемокинов (IL-8), хемоатграктангов (МСР-1), молекул адгезии (ICAM-1) и инфильтрацию пораженных сосудов и тканей в основном нейтро-фильными лейкоцитами, а затем моноцитами и макрофагами. При инсульте наблюдается значительная инфильтрация микрососудов головного мозга лейкоцитами, вызывающими периваскулярный отек (R.H.Fabian et al., 1999, M.Ginsberg, 2001). Лейкоциты генерируют различные токсичные продукты окисления, способствующие (совместно с провоспалительными цитокинами) адгезии лейкоцитов к эндотелию сосудов и прохождению через него в паренхиму мозга, увеличивая зону поражения на 25-45% (X. Wang et al., 2000, H. Sheng et al., 2002). Свободнорадикальная активность лейкоцитов усиливается при различных формах воспаления и приводит к экспрессии iNOS-синтазы в лейкоцитах, циклооксигеназы-2 , запускающей синтез эйкозаноидов. В связи с токсическим действием активированных нейтрофилов при сердечных и мозговых травмах различного генеза в последние годы разрабатывается антилейкоцитарная фармакологическая стратегия (X.Wang et al., 2000). Поэтому при изучении иммуноток-сичности препаратов различных фармакотерапевгаческих групп, в частности кардио-тропных и нейропротективных средств или иммуномодуляторов адъювантного типа, подавление или стимуляцию активированных нейтрофилов нельзя расценивать однозначно.

При изучении аллергизирующих свойств синтезированного в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН - производного 2-меркапто - бензимидазола, - (2-[2-(морфолино)эталтио]-5-этоксибензимидазол дигидрохлорида), селективного анксио-литика афобазола реакций анафилаксии, образования кожносенсибилизирующих антител к препарату и аллергических реакций замедленного типа не выявили. Пероральное введение препарата в дозах 5 и 50 мг/кг вызывало незначительное уменьшение реакции воспаления на Кон А (рис.5), при в/в введении афобазола в тех же дозах наблюдали выраженное подавление реакции (на 63,0% и 32,2%). Препараты брадизол и афобазол, относящиеся к разным фармакотерапевтическим группам, но к одному классу химических соединений (производные 2-меркапто-бензимидазола), при в/в введении в оди-

наковом диапазоне доз оказывали выраженное противовоспалительное действие на экссудативный отек на Кон А.

Изучение иммунотоксичности афобазола не выявило выраженного действия на основные показатели иммунитета.

контроль 5 и 80 мг/кг контроль 5 и 50 Мг/кг рег 08 в/в (Р<0,05)

Рис. 5 Влияние афобазола на реакцию воспаления на Кон А (при пероральном и внутривенном введении); по оси ординат- индекс реакции, по оси абсцисс - дозы препарата. Примечание: различие с контролем статистически значимо при Р<0,05.

В настоящее время экспериментально доказаны аллергизирующие свойства оваль-бумина, вызывающего стимуляцию продукции (I. КшЬег М а!., 1999). Наша усовершенствованная модель сенсибилизации морских свинок альбумином БКЯ (основным компонентом которого является овальбумин) вызывает у морских свинок альбиносов умеренную реакцию анафилаксии (Т.Г. Хлопушина с соавт., 1991) и удобна при изучения нерастворимых в воде и физиологическом растворе препаратов. При изучении аллергизирующих свойств синтезированного в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН антагониста серотонина, противомигреневого средства - тропоксина (3-(4,5-триметоксибензоил-оксиимино)-8-метил-8-азабицикло[3,2,1 ]окгана гидрохлорида определили, что иммунизация морских свинок препаратом в дозе 20 мг/кг не усиливает выраженность анафилактической реакции, вызванной 3-х кратной иммунизацией 0,6% раствором белка куриного яйца (БКЯ). Незначительное усиление анафилактической реакции при введении тропоксина в дозе 200 мг/кг и образование кожно-сенсибилизирующих антител к препарату у 20% животных дает основание предположить о возможности проявления индивидуальной чувствительности к тропоксину, что

необходимо учитывать при составлении инструкции по применению препарата. Иммунизация животных тропоксином в смеси с ПАФ не вызвала аллергических реакций замедленного типа. Введение препарата per os в дозах 20 и 200 мг/кг также не вызывало изменения реакции воспаления на Кон А. При изучении иммунотоксических свойств тропоксина пероральное введение препарата в дозе 20 мг/кг мышам линии СВА на "-1" день и через сутки после иммунизации ЭБ вызывало некоторую стимуляцию антите-лообразования (АОК). Тропоксин не подавлял клеточный иммунный ответ (по данным ГЗТ и РТПХ). При введении тропоксина мышам низкореагрующей на ЭБ линии С57В1/6 была обнаружена зависимая от дозы препарата стимуляция иммунного ответа (20 мг/кг - на 28,3%, 400 мг/кг - на 44,23%).

Ладастен - адамантансодержащее соединение [Ы-(2-адамантил)-Ы-(пара-бромфе-нил)амин производного адамантана], обладающее выраженными анксиолитическими свойствами, повышающее пролиферацию антителообразующих клеток, осуществляет стимуляцию эффекгорной и регуляцию супрессорной функции Т- лимфоцитов (Н.Г. Арцимович с соавт., 2000), что может вызвать селективную стимуляцию Th2 хелперов. При изучении аллергизирующих свойств ладастена животных иммунизировали 3-х кратным пероральным введением 0,6 % раствора БКЯ, затем ладастеном, при внутри-сердечном введении БКЯ у животных развивалась реакция анафилаксия различной степени тяжести.

В результате проведенных экспериментов определили, что выраженных изменений в интенсивности системной реакции анафилаксии у животных опытных групп по сравнению с контролем не развивается. Иммунизация животных препаратом в дозах дозах 30 мг/кг и 300 мг/кг в смеси с ПАФ не вызывала аллергических реакций замедленного типа. Пероральное введение ладастена мышам линии Balb/c в дозе 300 мг/кг вызывало достоверное подавление реакции воспаления на Кон А (на 48,9%).

3.4 Изучение аллергизирующих и имунофармакологических свойств дипептидно-

го ноотропа ноопепта

Ноопепт - этиловый эфир Ы-фенил-ацетил-Ь-пролил-глицина, (Патент РФ 2119496; Patent US 5,439, 930), синтезирован и фармакологически изучен в ГУ НИИ фармакологии им.В.В. Закусова РАМН. Ноопепт является пептидным аналогом пирацетама с вы-

раженными ноотропными и нейропротективными свойствами (S.B. Seredenin, Т. A.Boronina, Т. A. Gudasheva, R.U. Ostrovskaya et al., 1995).

При выявлении иммунотоксических свойств ноопепта нами были обнаружены его иммунокорригирующие свойства, которые затем были изучены по расширенной программе. 14-ти дневное введение ноопепта мышам per os в дозах 10 мг/кг и 100 мг/кг вызывало достоверное (в 3,6 и в 2,9 раза) повышение фагоцитарного индекса по сравнению с контрольными данными (табл. 9).

Таблица № 9

Влияние препарата ноопепт на выведение туши in vivo

Доза ноопепта Фагоцитарный индекс (усл.ед.) Уровень значимости

Контроль (п=10) 5,05+1,40

14-дневное п/о введение 10 мг/кг (п=10) 18,13+2,89 р<0,01

14-дневное п/о введение 100 мг/кг (п=10) 14,48±1,75 р<0,001

Примечание: * - статистически достоверные отличия от контроля при р<0,05 (^критерий Стьюдента), п - количество животных.

По данным литературы (О.Л. Воронина с соавт., 2001), пролинсодержащий оли-гопептид глицин-аргинин-пролин (ОР.Р) усиливал адгезивные свойства макрофагов, кх подвижность и способность к фагоцитозу.

Генерацию активных форм кислорода в суспензии нейтрофильных гранулоцитов мышей оценивали методом люминолзависимой клеточной хемилюминесцснции (ХЛ). При изучении влияния ноопепта на активность нейтрофилов контрольных животных мышей уровень спонтанной ХЛ суспензии нейтрофилов - 1сп составлял 2,0±0,3 тУ. После добавления к суспензии нейтрофилов форболмиристатацетата (ФМА) уровень стимулированной ХЛ - А1 у ингактных животных (группа контроля) составил 10,8±1,7 шУ, что в 5,7 раз превысило спонтанный уровень свечения. Интегральный показатель ХЛ - Б составлял 1937,7±238,6 тУ. Через 15 минут после внутривенного введения мы-

шам препарата в дозе 5 мг/кг определили выраженное снижение показателей уровня стимулированной ХЛ (Д1) в 6 раз и интегрального показателя ХЛ (Б) - в 3,8 раза (табл.10).

Таблица № 10

Показатели хемилюминесцентного ответа на ФМА и зимозаи

Доза ноопепта Д1(щу) Уровень зна- 1 8(ед) чимости I Уровень значимости

Контроль (14=11) 10,8+1,7 I 1937,7±238,6

Ноопепт 5мг/кг,в/в (N=9) 1,8+0,4 р<0.01 505,2+82,5 р<0.01

Контроль (N=9) 12,4±4,4 13322,4+4488,8

I Ноопепт . 5 мг/кг,в/в (N=9) 2,1±0,5 р < 0.05 2961,4±647,9 р < 0.05

Примечание: N - количество животных; Д1 - показатель уровня активированной ХЛ; 8 - интегральный показатель ХЛ; р<0,05, р<0,01 - статистически достоверные отличия от контрольных показателей по критерию Стьюдента.

Изучение кинетики хемилюминесцентного ответа нейтрофилов на опсонизиро-ванный зимозан в контрольной и опытных группах животных выявило изменения, качественно сходные с полученными при добавлении ФМА. После добавления к суспензии нейтрофилов зимозана в указанной дозе уровень стимулированной ХЛ - Д1 у контрольных животных составил 12,1 ±4,4 тУ, что в 5,8 раз превысило спонтанный уровень свечения. Интегральный показатель ХЛ - в составлял 13322,4±4488,8 тУ. Через 15 минут после в/в введения ноопепта в дозе 5 мг/кг также наблюдалось статистически достоверное по сравнению с контролем (р<0,05) подавление хемилюминесцентного ответа нейтрофилов, стимулированных зимозаном: Д1 - в 5,7 раза и интегрального показателя ХЛ (Б) - в 4,5 раза.

Ноопепт в наших опытах при разных способах введения мышам вызывал стимулирующее действие на гуморальное звено иммунитета у мышей различных линий при разной антигенной нагрузке. У мышей линии С57В176 усиление иммунного ответа

Таблица № 11

Влияние препарата ноопепт на гуморальный иммунитет мышей самцов линии С57ВЬ/б (введение в/м, однократно)

Номер и обозначение группы Число животных в группе Величина иммунного ответа при антигенной нагрузке 5x106 (в/в)

Число АОК на селезенку Средний logí титров антител вРПГА

Группа 1 контроль 7 12844,57±5925,79 3,43±0,90

Группа 2, день "-1" 0,5 мг/кг 8 18795,00+5131,89 4,63±0,77

Группа 3, день "-1" 5 мг/кг 7 28461,14±14679,93 5,86±0,99

Группа 4, день "0" 0,5 мг/кг 8 33357,00±8235,07* 5,00±0,76*

Группа 5, день "0" 5 мг/кг 7 33826,66+13105,53* 5,87±1,28*

Группа 6, день "+1" 0,5 мг/кг 8 38872,00±15173,65* 5,75+0,59**

Группа 7, день "+1" 5 мг/кг 8 38492,88+10344,86* 6,25+1,47**

Примечание: различие с контролем достоверно при * - р < 0,05, * * - р < 0,01.

по сравнению с контролем определили на всех сроках введения ноопепта по отношению к антигенному стимулу (табл. 11). Стимуляция гуморального иммунитета ноопептом наиболее выражена у мышей линий C57BL/6 и СВА, при введении препарата в продуктивную фазу иммунного ответа (+1 день), когда активная пролиферация и дифференцировка клеток - предшественников зрелых антителопроду-центов уже "запущена". В связи с полифункциональным действием олигопептидов трактовка результатов экспериментов in vivo достаточно сложна, где одновременно с прямым действием на клетки и цитокины иммунной системы они могут оказывать опосредованное влияние через эндокринную и иммунную системы.

Влияние препарата на синтез иммуноглобулина IgG было изучено в опытах на мышах линии СВА и C57BL/6. Как и в предыдущих экспериментах, более выраженную стимуляцию гуморального иммунного ответа отмечали у мышей линии C57BL/6. Стимуляция антителооблазования у мышей линии СВА была также более выраженной при введении ноопепта в продуктивной фазе иммунного ответа. У мышей линии C57BL/6

отмечали двухкратное увеличение среднего log2 титров антител при введении дипепти-да в индуктивную и продуктивную фазу иммунного ответа. Введение циклофосфана в дозе 150 мг/кг на 61-71% подавляло гуморальный иммунный ответ. Наиболее выраженное увеличение антителообразования наблюдали у мышей обеих линий с вторичным иммунодефицитом при введении препарата в индуктивную фазу иммунного ответа, у мышей линии C57BL/6 - и в продуктивную фазу гуморального иммунного ответа. Ноопепт не только восстанавливал иммунный ответ по сравнению с контролем, но и t увеличивал его в 2 раза.

' Таблица № 12

Влияние ноопепта на клеточный иммунитет (ГЗТ) при однократном введении в дозе 10 мг/кг и при введении препарата в течение 14 дней

Доза препарата Индекс реакции: Hp = PonJP1(xl00 Р. Степень выраженности ГЗТ. (% к контролю)

Введение ноопепта однократно

Контроль 37,09±6,75 п=8 100 %

10 мг/кг 54,13±9,05* п=8 145,9 % р<0,05

Введение ноопепта в течение 14 дней

Контроль 37,54±5,26 п=8 100 %

10 мг/кг 49,04±8,21* п=8 130,7% р<0,05

100 мг/кг 46,53±12,71 п=8 124,1 %

Примечание: * - статистически достоверные отличия от контроля при р<0,05 (t-критерий Стьюдента).

I ♦

' При изучении влияния препарата ноопепт на клеточный иммунитет методом ГЗТ

' в опытах на мышах р1(СВАххС57В1/6) выявляемый эффект зависел от метода и дли-

тельности введения препарата, при введении дипептида в терапевтически эффективной дозе имела место стимуляция ГЗТ (табл.12). Внутривенное введение дипептида в дозе 5 ^ мг/кг мышам с вторичным иммунодефицитом стимулировало реакцию ГЗТ на 60,2% по

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ }

библиотека

С.Петербург ' ' 09 ш акт ■

сравнению с контролем и на 87,9% по сравнению с мышами с вторичным иммунодефицитом.

Влияние ноопепта на спонтанную и индуцированную митогенами пролиферацию спленоцитов изучали в опытах на мышах F| (CBAxC57BL/6). Животным контрольной группы вводили физиологический раствор, животным 2-группы ноопепт вводили однократно в/в в дозе 5 мг/кг (табл.13), мышам 3-группы препарат вводили в течение 14 суток per os в дозе 10 мг/кг . Однократное в/в введение препарата вызывало выраженное увеличение (на 70,4%) спонтанной пролиферативной активности спленоцитов, при пероральном введении ноопепта в течение 14 суток также имелась тенденция к увеличению спонтанной пролиферации лимфоидных клеток. В то же время внутривенное и пероральное введение ноопепта приводит к достоверному снижению (почти в 2 раза) ответа В-лимфоцитов на липополисахарид. По данным М.А. Чижевской (1995), введение животным иммуномодуляторов стимулирующего типа сопровождается снижением

Таблица №13

Влияние препарата ноопепт на пролиферативную активность спленоцитов

Группа животных Включение 3Н-тимидина (имп/мин) в культурах:

Без митогена С конканава-лином А С липополисаха-ридом

Контроль (п=10) 26484±2443 744567±1155 127796±8849

Ноопепт 5 мг/кг, в/в, п=10 45129+6283* 72257±5165 67488±8549*

Примечание: * - статистически достоверные отличия от контроля при р<0,05 (t-критерий Стьюдента).

пролиферативного ответа селезеночных клеток на ЛПС и Кон А, супрессирующее воздействие - повышением ответа селезеночных клеток на данные митогены.

Влияние ноопепта на острое экссудативное воспаление при однократном и курсовом введении было изучено на модели отека стопы мышей на Кон А и отека стопы крыс на каррагенан. Однократное введение ноопепта в дозах 0,5 мг/кг и 5 мг/кг не вызывало достоверного снижения реакции (табл. 14), введение препарата per os в дозах 10, 50 и 100 мг/кг, как и препарата, сравнения (ибупрофен в дозе 10 мг/кг) вызывало

достоверное дозозавнснмое подаленне реакции воспаления на Кон А. При курсовом введении ноопепта в течение 10 дней перорально было выявлено значительное подавление реакции воспаления (на 52,4%), однократное в/в введение препарата в дозе 0,5 мг/кг вызывало подавление реакции воспаления на 36,9%, в дозе 5 мг/кг - на 50,9% по сравнению с контролем.

Таблица №14

Изучение противовоспалительного действия препарата ноопепт на модели _ реакции на конканавалин А_

Доза препарата Число животных в Индекс реакции

группе

Введение однократно, внутривенно

Контроль (физ. р-р) 8 28,214 ± 7,762

Ноопепт (0,5 мг/кг) 8 17,800 ±4,453*

Ноопепт (5 мг/кг) 8 13,849 + 5,942*

Введение однократно, перорально

Контроль (физ. р-р) 8 25,970 + 6,979

Ноопепт (0,5 мг/кг) 8 27,377 ±8,153

Ноопепт (5 мг/кг) 8 19,806 ± 8,598

Контроль (физ. р-р) 10 25,294 ±6,518

Ноопепт (10 мг/кг) 10 13,052 ±4,817*

Ноопепт (50 мг/кг) 10 11,422 ±4,944*

Ноопепт (100 мг/кг) 10 8,388 + 3,698*

Ибупрофен (10мг/кг) 9 12,272 + 4,028*

Введение перорально в течение 10 дней

Контроль (физ. р-р) 10 16,653 ±4,556

Ноопепт (5 мг/кг) 13 7,935 ± 3,797*

Примечание: * - статистически достоверные отличия от контроля по ^критерию Стьюдента при р < 0,05.

При изучении противовоспалительной эффективности ноопепта на модели отёка стопы на каррагенан использовали самцов беспородных белых крыс массой 170-200 г. Животным опытной группы за 30 минут до введения 0,1 мл 1% раствора каррагенана вводили внутривенно дипептид в дозе 5 мг/кг, в контроле - 0,1мл физиологического раствора. В контроле воспалительная реакция на каррагенан была максимально увеличена через 3 часа после его введения. Введение ноопепта в/в дозе 5 мг/кг вызывало через 3 часа подавление отёка на 62,2% по сравнению с контролем. Через 5 часов в

конце опыта дипептид подавлял увеличение отека стопы на 69,3%, массы опытных лап - на 43,8% по сравнению с контролем. Полученные данные свидетельствуют о выраженном дозозависимом подавлении реакции воспаления на Кон А при введении препарата ноопепт в различных дозах, однократно и при курсовом введении, перорально и внутривенно. Подавление реакции воспаления на каррагенан при внутривенном введении ноопепта в дозе 5 мг/кг достоверно уменьшало отек стопы, что также подтверждает наличие у препарата противовоспалительных свойств. Влияние ноопепта на хроническое иммунное воспаление изучали на модели адъювантного артрита у крыс. Результаты опыта представлены на рисунках 6 и 7. Ноопепт обладает противовоспалительными свойствами на пике первичной реакции (левая лапа с ПАФ, острое неиммунное воспаление, 3-4 день). Неспецифический воспалительный отек подавлялся при курсовом пероральном введении препарата в дозе 5 мг/кг. Более выраженное подавление реакции отмечали при курсовом внутримышечном введении препарата в дозе 0,5 мг/кг. Иммунологически индуцированный отек правой лапы (хроническое иммунное воспаление) в контроле имел максимальное значение на 12 день (если считать 0 день, то 13 день опыта). Выраженное подавление хронического иммунного воспаления определили при пероральном введении препарата в дозе 5 мг/кг (на 74,1%) и внутримышечном введении - в дозе 0,5 мг/кг (на 94,0%). Таким образом, ноопепт обладает противовоспалительным действием на первичный и вторичный артриты, при введении препарата в течение 25 дней в дозе 0,5 мг/кг (в/м) и 5 мг/кг (per os) крысам с адъювантным артритом (хроническое иммунное воспаление).

Совокупность полученных данных свидетельствует о выраженных противовоспалительных и иммунокорригируюших свойствах дииептидного ноотропа. Установленный нами в опытах на активированных нейтрофильных лейкоцитах мышей факт выраженного подавления (в 5-6 раз) ноопептом стимулированной зимозаном или форболмири-статацетатом хемилюминесценции, а также значительное подавление острого экссуда-тивного (отек на каррагенан и Кон А) и хронического воспаления при адьювантном артрите, доказывают наличие у ноопепта антиоксидантных и противовоспалительных свойств и влияния на функциональную активность активированных нейтрофилов,что,

Рис. 6 Влияние ноопепта на на неиммунное воспаление (левая лапа с ПАФ)

День введения

Рис.7 Влияние ноопепта на хроническое иммунное воспаление (правая лапа)

День введения

вероятно, является важной составляющей его противовоспалительного действия. Полученные данные согласуются с фибринолитическими и антитромботическими свойствами у пролинсодержащих пептидов, а также способности ноопепта уменьшать объем ишемического очага на модели фотоиндуцированного тромбоза (Г.А. Романова с со-авт., 2000). Наличие "мягких" иммунокорригирующих и выраженных противовоспалительных свойств у ноотропного и нейропротективного препарата ноопепт свидетельствует о перспективности его применения при различных нейроиммунных расстройствах.

К числу перспективных классов иммуномодуляторов относятся производные пиримидина (метилурацил, оксиметацил). Нами был проведен поиск иммунотропной активности среди 6-ти производных 3-оксипиридинов (СК-117, СК-143, СК-160 ) и 7-ми производных 5-оксипиримидинов. При изучении влияния препаратов на основные показатели гуморального и клеточного иммунитета наибольшую активность среди производных 3-оксипиридинов и 5-оксипиримидинов выявили у препарата ОПМ-411, которому дали условное название "пентаксидин".

Препарат ОПМ-4П обладает значительной иммунотропной активностью: повышает количество и функциональную активность лимфоцитов, продуцирующих антитела, стимулирует клеточный иммунитет, восстанавливает и повышает иммунный ответ после подавления его циклофосфаном, подавляет реакцию воспаления на Кон А, обладает защитным действием при применении его до введения цитостатика, нивелируя депрессивное влияние на иммунитет и проявляет иммунокорригирующие свойства Нами также было изучено влияние препарата ОПМ-411 на соматические показатели, число ^

лейкоцитов и рост экспериментального опухолевого штамма - карциномы лёгких Льюиса (табл. 15) у мышей (СВА х С57В1б)Рь и на противоопухолевую эффективность отечественного фторпиримидина фторафура, широко используемого в мировой практике для лечения солидных опухолей. Эффект ОПМ-411 на состояние мышей-опухоленосителей и рост опухолей оценивали после ранней (2-8 дни), отсроченной терапии (9-15 дни), введением в дозе 50 мг/кг один раз в сутки в течение 7 дней (суммарная доза равна 3/< ЛД50) и однократного введения суммарной дозы. При всех режимах введения, особенно при ранней терапии препарата 411, мышам-опухоленосителям регистрировалось достоверное торможение роста опухоли и лейкоцитоза без призна-

Таблица №15

Влияние пентаксидииа на соматические показатели и рост карциомы лёгких Льюиса при при различных режимах введения

Группы животных Число животных вес тела Лейкоциты тыс в мм3 Печень, г Селезёнка, мг Тимус, мг Вес опухоли,г

до терапии после терапии

Контроль рост* опухоли 19 24,0310,71 22,9010,49 24,0+1,85 1,5010,05 337±1б,2 35,6<Н2,20 2,71±1М2

Погтаксидии 50 мг/кг (2-8 дин) 10 23,2910,85 23,97±0,92 13,7010,54 Р<0,0| 1,4210,07 329114,4 42,5012,83 1,6510,26 Р < 0,01

Пентаксидни 50 мг/кг (9-15 лик) 10 23,73+0,63 23,0810,67 23,1012,08 1,47±0,(М 310118,2 30,7011,56 1,9910,17 Р < 0,05

Петаксидян ЗИмгЛсг ((равна 8 день) 10 23,0810,43 22,63Ю,43 17,05±1,31 Р<0,01 1,42±0,03 310114,5 37,№1,41 2,1010,20 Р<0,05

Примечание: 1 день опыта - инокуляция опухолевого штамма.

ков токсического воздействия на соматические показатели мышей опухоленосителей. Выявлена тенденция к некоторому увеличению противоопухолевого эффекта препарата 411 при использовании режима, оптимального для проявления иммуностимулирующего действия производных пиримидина. Имеются данные об усилении противоопухолевой эффективности фторафура при сочетании с природным пиримидиновым метаболитом урацилом, однако ни при одном из использованных режимов с препаратом ОПМ-411 не обнаружено значительного снижения токсичности и потенцирования противоопухолевой эффективности фторафура. Это позволяет предполагать, что противоопухолевые потенции препарата 411 реализуются не через воздействие на систему синтеза природных пиримидинов в опухоли, а посредством прямой стимуляции противоопухолевого иммунитета. Наличие противоопухолевой и противоинфекционной активности и ряд других свойств были подтверждены доктором медицинских наук A.B. Саниным (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи)

Таким образом, проведенная нами комплексная система оценки аллергизирую-щих и иммунотоксических свойств мембраноактивных соединений является также и иммунофармакологической характеристикой новых лекарственных средств, которая позволила нам выявить антиоксидантные и противовоспалительные свойства у изученных психотропных и кардиотропных препаратов и дополнить понимание их поликомпонентного механизма действия.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые методологические подходы к оценке иммунотоксических и аллергизирующих свойств мембраноактивных средств различных фармакотерапевтиче-ских групп на основе анализа их иммунофармакологической активности.

2. Создана оригинальная экспериментальная модель псевдоаллергической реакции на многофункциональный лекгин конканавалин А, позволяющая быстро и информативно определить влияние изучаемых веществ на острое экссудативное воспаление и выявить противовоспалительные свойства у мембраноактивных соединений.

3. При изучении аллергизирующих и иммунотоксических своств новых кардиотропных средств многократное введение различными способами метацизина, кардио-циклида и брадизола в терапевтически эффективных дозах не вызывало патоло-

гических изменений гуморального и клеточного иммунного ответа. Введение метаци-зина и брадизола в дозах, в 5 раз превышающих терапевтические, приводило к подавлению иммунитета. Внутривенное введение производных 2-меркапго-бензимидазола (брадизола и афобазола) оказывало выраженное противовоспалительное действие (на 55,8% и 63,0%).

4. Определен механизм летального токсического действия метаболитов антиаритмического препарата боннекор (при хроническом пероральном введении собакам в течение 6-ти месяцев в дозе 15 мг/кг), приводящего к атриовентрикулярной блокаде с желудочковой тахикардией.

5. При изучении аллергизирующих свойств азакраунэфира-С-3 (в дозах 5, 20 и 50мг/кг), апилактозы (в дозах 50 и 500 мг/кг) и препарата АВП (в дозах 2 и 60 мг/кг) выявили анафилактические реакции разной степени тяжести. Усиление реакции псевдоаллергии вызывали эстриглутон (в дозах 100 и 500 мг/кг) и препарат АВП (в дозах 2 и 60 мг/кг).

6. Доказано наличие аллергизирующих свойств у изученных беталактамных антибиотиков отечественного производства, в значительной степени обусловленных наличием высокомолекулярных примесей.

7. Препарат ноопепт, при разных способах и продолжительности введения в различных дозах, обладает выраженными противовоспалительными и иммунокорриги-рующими свойствами. Доказана перспективность его применения для лечения заболеваний нервной системы, связанных с наличием хронических воспалительных процессов различного генеза и развитием иммунодефицитных состояний при когнитивных нарушениях, физических и психоэмоциональных травмах.

8. Скрининг иммунотропной активности среди ряда соединений 3- оксипиридинов и 5-оксипиримидинов выявил наиболее активное соединение ОПМ-411. Установлено, что препарат способен корригировать лейкемоидную реакцию, индуцируемую ростом опухоли, уменьшая число кариоцитов в периферической крови. При всех режимах введения препарата 411 мышам-опухоленосителям .выявили достоверное торможение роста опухоли.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коваленко Л.П. Экспериментальное изучение внутриутробной сенсибилизации к пенициллинам // Материалы Всесоюзной конференции "Побочное действие антибиотиков" - М„ 1976, С. 85-87.

2. Быкова М.А., Соловьев В.Н., Бережинская В.В., Егоренко Г.Г., Фирсов А.А Коваленко Л.П., Березина Е.К., Долгова Г.В. К фармакологии рифампицина // Антибиотики, 1977, № 6, С. 525-530.

3. Коваленко Л.П., Соловьев В.Н. Аллергические осложнения при лечении бета-лактамными антибиотиками // Антибиотики, 1979, № 2, С. 140-153.

4. Коваленко Л.П., Соловьев В.Н. Экспериментальное изучение аллергизирующих свойств некоторых беталактамных антибиотиков // Материалы Всесоюзной конференции " Химиотерапия бактериальных инфекций " - Алма-Ата, 1979, С. 238-240.

5. Бережинская В.В., Соловьев В.Н., Березина Е.К., Долгова Г.В., Егоренко Г.Г., Коваленко Л.П., Быкова М.А., Фирсов A.A., Штегельман Л.А. Изучение влияния карфециллина на организм животных при одно- и многократном введении // Антибиотики, 1980, № 7, С. 513-519.

6. Соловьев В.Н., Бережинская В.В., Коваленко Л.П. Возможные осложнения,, возникающие при применении антибиотиков// Труды ВНИИА" Успехи в области производства и изучения антибиотиков" 1980, № 7, С. 57-75.

7. Коваленко Л.П., Стремовский Л.Л., Быкова М.А., Соловьев В.Н., Жуковская С.А. Аллергизирующие свойства натриевой соли бензилпенициллина в зависимости от степени очистки методом ультрафильтрации через полунепроницаемые мембраны // Сборник ВНИИА, 1980, № 46, С. 264-268.

8. Бережинская В.В.,Соловьев В.Н.,Березина Е.К., Долгова Г.В., Егоренко Г.Г., Быкова М.А., Коваленко Л.П., Фирсов A.A., Свиногеева Т.П. Изучение общетоксических и органотропных свойств цефалотина в остром и хроническом эксперименте//Антибиотики, 1981, № 1, С. 44-50.

9. Навашин С.М., Березина Е.К., Никитин A.B., Коваленко Л.П., Позднякова В.П. Возможные аллергические осложнения при антибиотикотерапии // Материалы 4-й Всесоюзной конференции " Побочное действие лекарственных средств" М., 1980,С. 24-26.

10. Коваленко JI.П., Гаршева Г.Б., Граковская Л.К. Влияние примесей на аллерги-зирующие свойства суспензий ампициллина и цефалексина // Труды ВНИИА "Вопросы гигиены труда и промышленной токсикологии в производстве антибиотиков " 1982, №14, С.106-111.

П.Егоренко Г.Г., Березина Е.К., Бережинская В.В., Долгова Г.В., Коваленко Л.П., Штегельман Л.А., Фирсов A.A., Быкова М.А. Изучение общетоксических и органотропных свойств сизомицина сульфата в хронических опытах на животных //Антибиотики, 1983, № 9,С. 678-682.

12.Бережинская В.В., Егоренко Г.Г.,Долгова Г.В., Свиногеева Т.П., Коваленко Л.П.,Березина Е.К., Штегельман Л.А. Изучение фармакологических свойств амикацина в эксперименте //Антибиотики и медицинская биотехнология, 1985, №5, С. 355-360.

13. Коваленко Л.П. Методические подходы к оценке аллергизирующего действия новых лекарственных препаратов // Материалы 1 Всесоюзного съезда токсикологов, Ростов-на-Дону, 1986, С. 473-474.

14. Бережинская В.В., Долгова Г.В., Егоренко Г.Г., Свиногеева Т.П., Штегельман Л.А., Коваленко Л.П., Руднева Н.М., Шептовицкая М.Г., Никитин A.B. Изучение общетоксических и органотропных свойств азлоциллина в остром и хроническом эксперименте // Антибиотики и медицинская биотехнология, 1987, № 6, С. 453460.

15. Коваленко Л.П., Руднева H.A. Доклиническое изучение безопасности противо-аритмического препарата боннекор в опытах на собаках// Материалы 6-го Всесоюзного съезда фармакологов, Ташкент, 1988, С. 178.

16.Kovalenko L.P., Rudneva N.M. Methodological approaches for the investigation of allergenic and imminomodulating properties of new drugs// 8th Intern. Symp.of Drug Toxicity, Berlin, 1988, Additional abstract, p. 322.

17. Кудрина Г.П., Шашкина Л.Ф.,Иванова В.М., Арзамасцев Е.В., Гневковская Т.В., Алтынбаева Р.Д., Портнова К.А., Шайдров В.В., Данюкова Г.В., Любимов Б.И., Коваленко Л.П., Адо А.Д., Медуницын Н.В., Черноусов А.Д., Федосеева В.Н., Аристовская Л.В., Осипенко A.M., Коган В.Ю., Миронова М.И. Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических веществ М., 1988,22 С.

18.3олотов H.H., Залилов К.Ю., Гашев С.Б., Коваленко Л.П. Синтетические антиоксиданты, взаимосвязь между антирадикальными свойствами и биологической активностью //14 Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Ташкент, 1988, Т.1, С.520.

19. Любимов Б.И., Смольникова Н.М., Сорокина A.B., Коваленко Л.П. Доклиническое изучение безопасности бефола // Материалы информационной конференции по клиническому применению бефола, Тбилиси, 1989, С. 7-8.

20. Коваленко Л.П., Руднева H.A., Алексеева C.B. Методические подходы при изучении противоаллергических и мембраноакгивных соединений // Материалы Всесоюзной конференции " Оценка фармакологической активности химических соединений : принципы и подходы " Старая Купавна, 1989, Т. 2, С. 329.

21. Коваленко Л.П., Сорокина A.B., Попова Г.Р., Батанова О Л., Любимов Б.И. Экспериментальное изучение безопасности препарата боннекор в опытах на ■собаках // Фармакология и токсикология, 1990, № 3, С. 54-57.

22. Любимов Б.И., Смольникова Н.М., Сорокина A.B., Стрекалова С.Н., Яворский А.Н., Коваленко Л.П., Попова Г.Р., Немова Е.П. Экспериментальное изучение безопасности бефола// В кн. "Бефол - новый оригинальный отечественный антидепрессант " под. Ред. A.B. Вальдмана, 1990, С. 109-113.

23.Хлопушина Т.Н., Кринская A.B., Коваленко Л.П., Жердев В.П. Влияние зиксорина на фармакокинетику антипирина у интакгных и сенсибилизированных морских свинок// Бюл. экспер. биол. и мед., 1991, № 7, С. 67-69.

А

24.Хлопушина Т.И., Кринская A.B., Коваленко Л.П., Любимов Б.И. Влияние зиксорина на развитие экспериментальной и пищевой анафилаксии у морских свинок// Экперим. и клинич. фармакология, 1992, № 1, С. 51-53.

25.Коваленко Л.П., Руднева H.A., Кузьмин В.И., Смирнов Л.Д. Поиск иммуно-модуляторов среди производных 3-оксипиридина // Материалы 4-й конференции "Биоантиоксиданты" М., 1992, С. 167.

26. Любимов Б.И., Коваленко Л.П., Телегин Л.Ю. Реакция на конканавалин А как метод изучения сенсибилизирующих свойств лекарственных веществ // Материалы симпозиума " Опыт оценки безопасности фармакологических средств в России (1991-1996 г.г.). Проблемы и перспективы " М., 1997, С. 38-39.

27. Алексеева C.B., Коваленко Л.П., Сорокина A.B., Телегин Л.Ю., Любимов Б.И.

Изучение иммунотоксических и аллергизирующих свойств препарата метацизин // Материалы 4-го конгресса " Человек и лекарство", М., 1997, С. 7.

28. Гетманская Н.В., Коваленко Л.П., Телегин Л.Ю., Бадыштов Б.А., Дурнев А.Д. Влияние препарата "Кошачий коготь" на некоторые показатели иммунитета у мышей // Токсикологический вестник, 1997, № 5, С. 22-26.

29. Любимов Б.И., Коваленко Л.П., Захаров С.П., Сорокина A.B., Алексеева C.B., Смольникова Н.М., Немова Е.П., Крылова A.M. Доклиническое изучение возможного общетоксического и специфического токсического действия препарата ГВС-111 // Материалы 5-го конгресса " Человек и лекарство", М., 1998, С. 586.

30. Любимов Б.И., Коваленко Л.П., Федосеева В.Н., Иванова A.C., Мастернак Т,Б., Ларин A.C., Кудрина Г.П.. Шашкина Л.Ф., Иванова В.М., Никитин A.B., Николаев А.Н., Арзамасцев Е.В., Гуськова Т.А., Жоголева И.Б., Верстакова О.Л. Методические указания по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ // в " Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ" М., 2000, С. 25-32.

31. Хаитов P.M., Атауллаханов Р.И., Иванова A.C., Мастернак Т.Е., Ларин A.C., Стеценко О.Н., Любимов Б.И., Коваленко Л.П., Телегин Л.Ю., Гуськова Т.А., Арзамасцев Е.В.. Никитин A.B., Кудрина Г.П., Верстакова О.Л. Методические указания по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ // в

"Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ" М., 2000, С. 33-38.

32. Коваленко Л.П., Мирамедова М.Г., Гудашева Т.А., Островская Р.У., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Иммунотропные и противовоспалительные свойства пролин-содержащего дипептида, ноопепта ГВС-1 И // Материалы VII Международного конгресса по иммунореабилитации " Аллергия, иммунореабилитация и глобальная сеть: взгляд в новое тысячелетие" Нью-Йорк, США, Intern. J. Immuno-rehab., 2001, N. 1,P. 19.

33.Коваленко Л.П., Мирамедова М.Г., Гудашева Т.А., Островская Р.У., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Иммунофармакологические свойства ноопепта // Материалы 8-го конгресса " Человек и лекарство", М., 2001, С. 576-577.

34. Коваленко Л.П., Алексеева C.B., Мирамедова М.Г., Гудашева Т.А., Островская

Р.У., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Экспериментальное изучение иммунотропных свойств ноопепта // Материалы 3-ей Международной конференции " Биологические аспекты индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" Суздаль, 2001, С. 74.

35.Коваленко Л.П., Смольникова Н.М., Алексеева С.В., Немова Е.П., Сорокина А.В., Мирамедова М.Г., Курапова С.П., Сидорина Е.И., Кулакова А.В., Даугель-Дауге Н О. Доклиническое изучение токсичности ноопепта // Эксперим. и клин, фармакология, 2002, Т. 65, № 1, С. 62-64.

36. Коваленко Л.П., Мирамедова М.Г., Алексеева С.В., Гудашева Т.А., Островская Р.У., Середенин С.Б. Противовоспалительные свойства ноопепта (дипептидного ноотропа, ГВС-111) // Эксперим. и клин, фармакология, 2002, Т. 65, № 1, С. 5355.

37. КоваленкоЛ.П., Алексеева С.В., Шипаева Е.В., Савельев В.Л., Гудашева Т.А. Островская Р.У. Противовоспалительные свойства кардиотропных и психотропных средств // Материалы 2-го съезда Российского Общества фармакологов "Фундаментальные проблемы фармакологии " 2003, Часть 1, С. 247.

38. Sorokina А.В., Kovalenko L.P.,., Gudasheva Т.А., Ostrovskaya R.U., Seredenin S.B. Role of activated neurotrophic leukocytes in pathogenesis of different diseases. 41st Congress of the European Societes of Toxicology, EUROTOX 2003, Florence (Italy), (в печати).

39. Коваленко Л.П. Особенности оценки иммунотоксичности препаратов разных групп фармакотерапевтических средств // Токсикологический вестник, 2004 (принята в печать).

í

looj- ft

i Ц\2. »14412

¡

Основной целью в исследовании возможной токсичности новых лекарственных средств на доклиническом этапе является доказательство их безопасности, установление зависимых и независимых от дозы побочных эффектов и степени их обратимости , определение соотношения пользы и риска при доказанной необходимости применения препарата (32, 41). На первых этапах упорядочения оценки безопасности лекарств влияние на иммунную систему не изучали или использовали методологию выявления профессиональных заболеваний (нанесение препаратов на кожу, ингаляционное воздействие). Однако, антиген-ность высокомолекулярных препаратов животного и микробного происхождения (вакцин, антисывороток), метаболитов беталактамных антибиотиков (189, 208, 221, 242), выраженное влияние лекарственных средств (гормональных препаратов, циклофосфамида) или имеющихся в них примесей, стабилизаторов и консервантов на иммунную систему привело к созданию различных методологических подходов изучения иммунотоксичности на уровне национальных программ разных стран (166,167,195,298). В настоящее время еще не выработано единой программы при изучении иммунотоксичности, наиболее активные исследования в этом направлении ведутся в Голландии и США (195).

Известны различные механизмы нарушений иммунной системы, сопровождающихся последовательным возникновением признаков иммунодефицитной, аллергической, аутоиммунной и онкологической патологии. Большинство психотропных, кардиотропных и антимикробных лекарственные средств и их метаболитов оказывают выраженное действие на клеточные мембраны, разные субпопуляции клеток и их эндогенную регуляцию, что может привести к подавлению или стимуляции иммунитета и возникновению воспалительных реакций различной этиологии. Так, экспрессия СОХ-2 в нейронах коры головного мозга, гиппокампа и других клетках усиливает патологические изменения при болезни Альцгеймера, сосудистых деменциях , раке прямой кишки и аде-номатозных полипах, что позволило проводить комплексную терапию этих заболеваний с применением НПВП нового поколения, а также поиску нейро-тропных препаратов с противовоспалительным компонентом действия . Для сердечных гликозидов и ряда других кардиотропных средств характерна способность к кумуляции с увеличением токсичности метаболитов (2, 5, 51, 57, 63, 122, 157, 188, 195, 309, 316). Частота аллергических осложнений колеблется при применении пенициллинов и цефалоспоринов, полученных по разным технологиям, в связи с наличием высокомолекулярных примесей, различием в реактогенности антигенных детерминант и перекрестной сенсибилизации, что указывает на необходимость дальнейшего изучения этой проблемы (51, 139, 179). Дополнительно следует отметить, что мембраноактивные соединения а также элементы лекарственных форм, предложенных для повышения избыточности действия (противораковые препараты в виде дисперсных мицеллаобразных липидов, липосомальные формы лекарственных средств), способствуют возникновению псевдоаллергических реакций (343, 344, 345), что указывает на необходимость экспериментального изучения этих реакций у создаваемых лекарств.

Среди разработанных в НИИ фармакологии РАМН новых фармакологических средств скрининг производных меркапто-бензимидазола, пролинсодер-жащих пептидов и 3-оксипиридинов выявил соединения с антиоксидантными и мембранопротекторными свойствами, высокой активностью и широтой фармакологических эффектов - афобазол , ноопепт и мексидол ( 5, 439, 930 ). Оли-гопептиды обладают широким спектром функциональной активности, представляя собой регуляторы нервной, эндокринной и иммунной систем (21), что могло обусловить наличие у ноопепта иммунофармакологических свойств. У ряда производных 3-оксипиридина и 5-окспиримидина обнаружили антиокси-дантные и иммуномодулирующие свойства (59, 96, 115), в связи с чем исследование наиболее активных соединений этих групп может выявить новые перспективные препараты, предназначенные для коррекции различных нарушений иммунной системы.

Цель исследования

Совершенствование системы оценки аллергизирующего и иммунотоксиче-ского действия на основе анализа иммунофармакологических эффектов мем-браноактивных веществ различной химической структуры и фармакологической активности. Для ее достижения необходимо решить следующие задачи:

1. Усовершенствование и разработка экспериментальных моделей при сравнительном изучении аллергизирующих свойств бетактамных антибиотиков и аминогликозидов, изучение влияния высокомолекулярных примесей на аллергизирующие свойства пенициллинов и цефалоспори-нов.

2. Создание экспериментальной модели для изучения псевдоаллергических реакций.

3. Характеристика и прогноз аллергизирующих (для антибиотиков) и аллергизирующих и иммунотоксических свойств психотропных и кардио-тропных средств.

4. Изучение роли кумуляции метаболитов в механизме токсического действия на примере кардиотропного препарата боннекор.

5. Изучение иммунофармакологических свойств оригинальных психотропных препаратов, обладающих мембранотропным действием.

6. Разработка на основе полученных данных методологических подходов к оценке иммунотоксических и аллергизирующих свойств мембраноактив-ных средств в дополнение к предшествующим "Методическим рекомендациям по оценке аллергенных свойств фармакологических средств" 1988 года и "Методических рекомендаций по оценке иммунотоксических свойств фармакологических средств" 1992 года.

Научная новизна работы

На основании полученных данных впервые охарактеризованы аллергизирующие и иммунотоксические свойства новых кардиотропных, психотропных средств и ряда других изученных мембраноактивных соединений.

Создана оригинальная, экономичная и информативная модель для выявления псевдоаллергии, которая может быть использована и для скрининга новых противовоспалительных и противоаллергических средств .

Выяснен механизм связанного с кумуляцией, летального действия метаболитов антиаритмического препарата боннекор.

Изучены выраженные противовоспалительные свойства препарата ноопепт, что дополняет информацию о механизмах его нейропротективного действия.

Впервые определены иммунокорригирующие свойства ноопепта, выявлено значительное увеличение спонтанной пролиферативной активности спленоци-тов под действием препарата, что указывает на возможность усиления пролиферации различных типов клеток головного мозга.

Среди производных 3-оксипиридинов и 5-оксипиримидинов найдено активное иммунотропное соединение ОПМ-411, с выраженной противоопухолевой активностью.

Экспериментально доказано наличие высокомолекулярных примесей у лактамных антибиотиков отечественного производства, удаление которых методом ультрафильтрации приводило к выраженному уменьшению аллергизи-рующих свойств бензилпенициллина.

Практическая значимость

Научные положения и выводы выполненной работы явились основой для дополнения и совершенствования изданных Фармакологическим комитетом РФ " Методических рекомендаций по оценке аллергенных свойств фармакологических средств" 1988 года и создания новых " Методических указаний по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ" 1999 года и "Методических указаний по оценке иммунотоксического действия фармакологических веществ", которые вошли в "Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" 2000 года.

Создана оригинальная экспериментальная модель для выявления псевдоаллергических реакций при изучении мембраноактивных соединений.

Даны рекомендации по удалению высокомолекулярных примесей р-лактамных антибиотиков, что ведет к значительному снижению аллергенности беталактамидов.

Определены и изучены новые свойства (противовоспалительные и иммуно-корригирующие) препарата ноопепт, что позволит расширить его использование при заболеваниях нервной системы, связанных с развитием воспалительных процессов и иммунодефицитных состояний.

Скрининг среди ряда производных 3-оксипиридинов и 5-оксипиримиди-нов выявил активный иммуномодулятор ОПМ-411 с противоопухолевой активностью.

Материалы по изучению аллергизирующих свойств препаратов (карфе-циллин, карбенициллин, азлоциллин, цефалотин, суспензия ампициллина, це-фалексин,суспензия цефалексина, рифампицин, бефол, апилактоза, рондофер-рин, рондекс-М, ладастен) аллергизирующих и иммунотоксических свойств пептида-дельта-сна, тропоксина, афобазола, ноопепта, брадизола вошли в комплект документов, на основании которых Минздрав РФ разрешил их клинические испытания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработка на основе полученных данных методологических подходов к оценке иммунотоксических и аллергизирующих свойств мембраноактивных средств различных фармакотерапевтических групп с выявлением их возможного иммунофармакологического действия .

2. Создание оригинальной экспериментальной модели псевдоаллергической реакции на конканавалин А, которая позволяет определять влияние изучаемых веществ на острое экссудативное воспаление и выявить противовоспалительные свойства у новых мембраноактивных соединений.

3. Доказательство отсутствия аллергизирующих и иммунотоксических свойств у кардиотропных средств, синтезированных в Институте фармакологии РАМН, при введении их в терапевически эффективных дозах.

4. Определены аллергизирующие свойства и высокомолекулярных примесей у изученных беталактамных антибиотиков отечественного производства, предложены методы удаления примесей и продуктов полимеризации.

5. Выявлены противовоспалительные и иммунокорригирующие свойства ноопепта и противовоспалительные свойства производных 2-меркаптобенз-имидазола.

6. Скрининг иммунотропной активности среди ряда соединений 3-оксипиридинов и 5-оксипиримидинов с иммуномодулирующими свойствами определил наиболее активное соединение ОПМ-411, обладающее также выраженной противоопухолевой активностью.

Основные сведения об апробации работы

Основные результаты диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Химиотерапия бактериальных инфекций" (Алма-Ата, 1979), 4-й Всесоюзной конференции "Побочное действие лекарственных средств" (Москва, 1982), 1-м Всесоюзном съезде токсикологов (Ростов-на-Дону, 1986), 6-м Всесоюзном съезде фармакологов (Ташкент ,1988), 8-м Международном симпозиуме по токсичности лекарственных средств (Берлин, 1988), информационной конференции по клиническому применению бефола (Тбилиси, 1989), 4-й конференции "Биоантиоксиданты" (Москва, 1992), 4-м, 5-м и 8-м конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 1997, 1998 и 2001), VII Международном конгрессе по им-мунореабилитации "Аллергия, иммунология и глобальная сеть: взгляд в новое тысячелетие" (Нью-Йорк, 2001), 3-й Международной конференции "Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам" (Суздаль,2001), 2-м съезде Российского общества фармакологов " Фундаме-тальные проблемы фармакологии" (Москва, 2003), на межлабораторной конференции ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (Москва, 2003), на 41-м Конгрессе Европейского общества токсикологов (Флоренция, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 323 страницах текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, 5 глав результатов собственных исследований, заключения и выводов. В работе имеется 78 таблиц, 19 рисунков. Библиографический указатель содержит 383 источника, из которых 131 принадлежит отечественным и 252 -зарубежным авторам.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые методологические подходы к оценке иммуноток-сических и алл ер газирующих свойств мембраноактивных средств различных фармакотерапевтических групп на основе анализа их иммунофармаколо-гической активности.

2. Создана оригинальная экспериментальная модель псевдоаллергической реакции на многофункциональный лектин конканавалин А, позволяющая быстро и информативно определить влияние изучаемых веществ на острое экссудативное воспаление и выявить противовоспалительные свойства у новых мембраноактивных соединений.

3. При изучении аллергизирующих и иммунотоксических своств кардио-тропных средств многократное введение различными способами метацизина, кардиоциклида и брадизола не оказывало патологического усиления гуморального и клеточного иммунного ответа. Введение метацизина и брадизола в дозах, в 5 раз превышающих терапевтические, приводило к подавлению иммунитета. Внутривенное введение производных 2-меркапто-бензимидазола (брадизола и афобазола) оказывало выраженное противовоспалительное действие (на 55,8% и 63,0%).

4. Определен механизм летального токсического действия метаболитов антиаритмического препарата боннекор (при хроническом пероральном введении собакам в течение 6-ти месяцев в дозе 15 мг/кг), приводящего к атриовентрикулярной блокаде с желудочковой тахикардией.

5. При изучении аллергизирующих свойств азакраунэфира С-3 (в дозах 5, 20 и 50мг/кг), апилактозы (в дозах 50 и 500 мг/кг) и препарата АВП (в дозах 2 и 60 мг/кг) выявили анафилактические реакции разной степени тяжести. Усиление реакции псевдоаллергии вызывали эстриглутон ( в дозах 100 и 500 мг/кг) и препарат АВП (в дозах 2 и 60 мг/кг).

6. Доказано наличие аллергизирующих свойств у изученных беталактам-ных антибиотиков отечественного производства, в значительной степени обусловленных наличием высокомолекулярных примесей.

7. Препарат ноопепт, при разных способах и продолжительности введения в различных дозах, обладает выраженными противовоспалительными и имму-нокорригирующими свойствами. Доказана перспективность его применения для лечения заболеваний нервной системы, связанных с наличием хронических воспалительных процессов различного генеза и развитием иммуноде-фицитных состояний при когнитивных нарушениях, физических и психоэмоциональных травмах.

8. Скрининг иммунотропной активности среди ряда соединений 3-оксипиридинов и 5-оксипиримидинов выявил наиболее активное соединение ОПМ-411. Установлено, что препарат способен корригировать лейкемоидную реакцию, индуцируемую ростом опухоли, уменьшая число кариоцитов в периферической крови. При всех режимах введения препарата ОПМ-411 мы-шам-опухоленосителям выявили достоверное торможение роста опухоли.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Механизмы иммунного ответа сопряжены со многими физиологическими процессами, на которые воздействуют различные факторы. Иммунофармако-логическая активность лекарственных средств при их введении также способна нарушить гомеостаз организма, вплоть до индукции различных патологических состояний. Сложность этих процессов состоит в том, что их признаки являются отражением динамической функции многих типов клеток, находящихся в разном состоянии, различных посредников, имеющих постоянно меняющиеся концентрационные и временные характеристики (34,188) .

Иммунотоксические эффекты значительно варьируют, однако три основных варианта иммунотоксичности могут быть экспериментально идентифицированы : 1) прямая иммунотоксичность; 2) гиперчувствительность ; и в меньшей степени - 3) аутоиммунные заболевания (188, 245). Прямая иммунотоксичность химических реагентов и лекарственных средств имеет отношение к изменению качества нормального иммунного ответа и выражается в иммуномо-дуляции, включающей как иммуносупрессию (иммунодепрессию), так и имму-ностимуляцию. По химической природе истинные антигены ,как правило, являются известными макромолекулярными соединениями (белками, олигопеп-тидами, полисахаридами, гликолипидами, полифосфатами), что страхует организм от легкой индукции специфического иммунного ответа и патологических процессов с компонентами иммунного воспаления и участием антигенспеци-фичных лимфоцитов (35,109). Лишь относительно небольшая часть низкомолекулярных лекарственных средств (к которым относятся высокореактивные метаболиты беталактамных антибиотиков), называемых гаптенами, которые, согласно классической теории Ландпггейнера, способны ковалентно соединяться с циркулирующими и тканевыми белками или другими макромолекулами организма, становятся антигенами и подвергаются процессинговой обработке антигенпредставляющими клетками (АРС), что может в итоге привести к гиперсенсибилизации. Наличие свободных SH-, амино- и гидроксильных групп в метаболитах белактамидов усиливало их способность вступать в соединение с различными протеинами (338).

Циклоспорин, глюкокортикоиды, иммунотропные средства, цитотоксичес-кие иммунодепрессанты и ряд других препаратов активно влияют на различные фазы и эффекторные механизмы резистентности и специфического иммунного ответа, в таких случаях решающим фактором соотношения пользы и риска при применении препарата может быть исходное состояние пациента. Большинство изученных нами фармакологических соединений с мембрано-тропной активностью могут уменьшать (в единичных случаях усиливать) деструктивные воспалительные процессы в очагах поврежденной ткани не вызывая необратимых патологических нарушений иммунной системы.

Под влиянием лекарственных средств, вводимых в организм, может активироваться или угнетаться апоптоз клеток иммунной и других систем организма, что может обусловить развитие иммунодефицита или ,наоборот, развитие как аллергических так и аутоимунных реакций. По мнению Д.К. Новикова с соавторами (91, 92), все лекарства действуют на те или иные клеточные рецепторы и ферменты, в частности прямо или опосредованно изменяя экспрессию Раз-антигена (СЭ95) на клетках или его лиганда (БазЬ), в результате чего меняется способность клеток к апоптозу. В частности избыточность, недостаточность или глубокие дефекты механизмов апоптоза в нейтрофилах могут лежать в основе патогенеза многих заболеваний, а также быть следствием развития самого патологического процесса и способствовать его отягощению (89). Некоторые токсические и псевдоаллергические эффекты лекарственных средств у чувствительных, генетически предрасположенных пациентов могут быть также опосредованы механизмами апоптоза.

Основные клинические прояления иммуносупрессии наблюдают чаще всего при инфекционных и раковых заболеваниях (2,12, 41). Одним из вариантов возникновения онкологических осложнений может быть проявление гено-токсичности эндогенных метаболитов, вызванное окислительным стрессом фагоцитирующих клеток, способных образовывать АФК (41,363). Согласно данным, представленным в монографии А.Д. Дурнева и С.Б. Середенина (41), возможная роль фагоцитирующих клеток в качестве значимого источника эндогенных мутагенов была экспериментально подтверждена в опытах на клетках китайских хомяков, в которых было выявлено увеличение уровня хромосомных и генных мутаций, культивируемых с нейтрофилами мышей и крыс, активированных ФМА. Усиление генотоксичного действия ПМЯЛ на патогенную микрофлору под воздействием АФК или прямого взаимодействия органических радикалов с ДНК микроорганизмов при инфекционном процессе является одним из факторов неспецифического иммунитета (207, 257). Увеличение уровня мутаций у микроорганизмов было обнаружено при инкубации последних с гранулоцитами здоровых доноров, этот показатель не возрастал при использовании тех же клеток из крови больных хроническим гранулематозом, не способных продуцировать супероксид-радикал кислорода.

При различных формах ишемии, эмоциональном стрессе, сосудистых де-менциях, таких аутоиммунных заболеваниях, как ревматоидный артрит, красная волчанка, сопровождающихся выраженным окислительным стрессом многих типов клеток, мощный цитотоксический потенциал нейтрофилов, составляющих у человека более 60% лейкоцитов крови, усиливает основное заболевание или может привести (в случае изменения синтеза ДНК) к еще более тяжелым последствиям (70,201, 209, 265).

Так как неспецифические и специфические факторы (гуморального и клеточного) иммунитета включаются в мощную защиту против микробных агентов, организм при инфекционных заболеваниях проходит через различные экстремальные состояния. Становится все более очевидным, что при анализе действия иммуноактивных соединений необходимо учитывать взаимодействие с гипотамус-гипофиз-надпочечниковой системой (НРА), осуществляемое гормонами и иммунорегуляторными медиаторами (360). В настоящее время доказано действие 1Ь-1|5 на секрецию АКТГ, индукция 1Ь-1р секреции АКТГ зависит от пептида гипоталамуса СШ7, который стимулирует секрецию АКТГ гипофиза (153, 182,197,358, 360), что подтвердило гипотезу о влиянии иммунорегулято-ров на ЦНС. Известно, что АКТГ, вырабатываемый гипофизом, стимулирует рост коры надпочечников и образование в ней эндогенных глюкокортикоидов, предотвращающих "превышение" иммуновоспалительных процессов, уменьшая защитный ответ организма хозяина на инвазию патогена (или другого агента), который может вызвать гиперсенсибилизацию или аутоиммунные расстройства. Поэтому имеющиеся в литературе данные о действии иммуномоду-ляторов, которые "сами" снижают повышенные и увеличивают исходно сниженные показатели иммунитета , должны подтверждаться опытами на гипофи-зэктомированных животных (99, 229).

Доказано, что бензол, пестициды, кадмий, кобальт, ванадий, асбест, органические фосфаты, озон и ряд других соединений (многие лекарственные средства в больших дозах) оказывают иммунодепрессивное действие на человека и грызунов, что может вызвать или усилить хронические инфекционные заболевания (188, 189, 208, 221, 242, 245,). Программы США по изучению иммуно-токсичности направлены прежде всего на обнаружение иммунодепрессивных свойств химических агентов, не уделяя должного внимания проблемам гиперчувствительности (195). Однако, как справедливо отмечают представители европейской школы (298, 363), изучение возможности поливалентной гиперсенсибилизации при все возрастающем приеме лекарственных средств и пищевых добавок для человеческой популяции в целом более актуально. В 1996 году во Франкфурте представители различных стран, члены the European Inflammation Society, обсуждали наиболее важные направления при изучении имму-нотоксичности лекарственных средств и пищевых добавок (298). По мнению E.Gleichmann (Dusseldorf, Germany), сенсибилизация к ксенобиотикам встречается намного чаще, чем иммуносупрессия. Специфическая сенсибилизация и высвобождение цитокинов CD4+ Т- клетками являются решающими в возникновении большинства аллергических и аутоиммунных патологий, напримерв Испании, где сенсибилизация к пенициллинам в процентном отношении более выражена, пенициллины стимулируют в основном CD4+ Т- клетки, в других странах - CD4+ Т и CD8+ Т- лимфоциты, что вероятно связано с иммуногенети-ческими различиями в популяции (W. Pichler, Berne, Switzerland). Тяжелые металлы также способны изменять структуру антигенных белков на пептидные фрагменты таким образом, что они могут связываться с молекулами II класса главного комлекса гистосовместимости ( МНС) и активировать Th-2 клетки, в результате чего возникает секреция IL-4, что обеспечивает необходимый сигнал для синтеза IgE.

Основателями изучения и разработки экспериментальных моделей для выявления анафилактогенных свойств фармакологических препаратов являются представители фармацевтических фирм Японии, с 1991 года, согласно рекомендациям Japanese Pharmaceutical Manufacturers Association, каждый новый лекарственный препарат необходимо тестировать на антигенность (298). На 37 конференции токсикологов в Сиетле в 1998 году: "Токсикология белковой ал-лергенности: предсказание и характеристика", было отмечено, что 1-2% человеческой популяции имеют IgE- зависимую аллергию к белкам, поэтому усовершенствование и обсуждение экспериментальных моделей на животных и других методов для оценки потенциальной аллергии к белкам, является важнейшим приоритетом для токсилогических исследований, что поможет оценить риск белковой иммунизации у гиперчувствительных индивидуумов (238). При экспериментальном изучении селективного действие овальбумина (OVA) и бычьего сывороточного альбумина (BSA) на субпопуляцию CD4+ Т-хелперов (I.Kimber et al.,1999) было доказано, что при иммунизации овальбу-мином происходит синтез IgE антител, бычий сывороточный альбумин вызывает синтез IgG2a антител. Это исследование имеет принципиальное значение для понимания иммунотоксичности известных высомолекулярных антигенов, которые чаще чем другие вещества могут вызвать селективное развитие ТЪг -клеток, что может вызвать аллергическую сенсибилизацию. Поэтому при выраженной стимуляции лекарственными средствами субпопуляции CD4+ Т хелперов (что свойственно например производным адамантана) необходимо более тщательное изучение их возможных аллергизирующих свойств.

Установление выраженной стимуляции фармакологически эффективным соединением Th2 клеток, в результате чего возникает преимущественно IgE-ответ (функциональными или нефункциональными иммунологическими методами) является с нашей точки зрения одним из наиболее важных показателей иммунотоксичности изучаемого вещества. Согласно данным, представленным в монографии И.С. Гущина (34), у человека избирательное возникновение ТЪ2 ответа зависит от природы антигена, пути и режима его поступления в организм, наследственных признаков у атопических больных, факторов среды, существования комплексных влияний цитокинов, которые усиливают как дифференцировку ТЬ-клеток, так и синтез и секрецию ^Е.

До сих пор нет удовлетворительного теоретического обоснования, почему одни вещества (фармакологические средства, пищевые добавки) с выраженной антигенной активностью стимулируют ^в-ответ, а некоторые лекарственные препараты с небольшим молекулярным весом и отсутствием активных метаболитов вызывают выраженные анафилактические реакции. Поэтому даже обнаружение только кожносенсибилизирующих антител в реакциях активной или пассивной кожной анафилаксии после введения изучаемого соединения необходимо учитывать при дальнейшем изучении препарата в клинике (в связи с меньшей чувствительностью интактных морских свинок, мышей и крыс по сравнению с разнородной человеческой популяцией).

При изучении аллергизирующих свойств плазмозамещающего средства полифункционального действия рондоферрина, внутривенное введение препарата вызывало у мышей дозозависимое подавление реакции на Кон А, однако, в реакции активной кожной анафилаксии у 20% морских свинок были обнаружены кожносенсибилизирующие антитела. Исследование аллергизирующих свойств гемодинамического плазмозаменителя рондекса-М в тех же дозах, что и рондоферрина показало, что препарат не вызывал системных реакций анафилаксии и образования кожносенсибилизирующих антител. При иммунизации морских свинок рондексом-М в смеси с ПАФ повышенной чувствительности выявлено также не было. Внутривенное введение рондекса-М вызывало у мышей подавление реакции на Кон А. Изучение алллергизирующих свойств и возможных псевдоаллергических реакций для подобного рода соединений должно проводится наиболее тщательно, в связи с наличием в клинике анафилактоидных реакций различного генеза при внутривенном введении плазмозаменителей.

В "Методических рекомендациях по оценке аллергенных свойств фармакологических средств" 1988 года на различных экспериментальных моделях (в частности модифицированного нами метода оценки гиперчувствительности замедленного типа в опытах на морских свинках) было рекомендовано изучение алергизирующих свойств новых фармакологически эффективных соединений при испытании 2-х уровней доз (терапевтической и на порядок выше), эквивалентных исследуемым на других видах животных при изучении хронической и других специфических видов токсичности. Ранее сенсибилизирующих свойства определяли используя конъюкгивальную пробу и при нанесении препаратов в течение 20 дней на депилированный участок кожи животных и затем разрешающей дозы на другой бок для определения возможных аллергизирующих реакций, адекватных профессиональным аллергическим заболеваниям у рабочих. Нами было рекомендовано считать, что если число сенсибилизированных животных в группе по одному из предложенных тестов составляет менее 50%, то наблюдаемые эффекты рассматриваются как проявление индивидуальной чувствительности. Если число сенсибилизированных животных в опытной группе составляет 50% и выше, то лекарственное средство относится к потенциальным аллергенам. Постановка реакции общей и активной кожной анафилаксии по общепринятой в настоящее время схеме на морских свинках позволила нам выявить анафилактогенные свойства у соединений, обладающих выраженными сенсибилизирующими свойствами (апилакгозы, ДНК-содержащего соединения АВП, азакраунэфира С-3). Определение влияния нерастворимых в воде и физиологическом растворе препаратов на выраженность реакции анафилаксии (при иммунизация морских свинок БКЯ, основным компонентом которого является овальбумин) является чувствительным и удобным методом, позволяющим оценить анафилактогенные свойства у изучаемых веществ, однако этот метод еще не введен в методические рекомедации.

В «Методические указания по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ» 1999 года в качестве оригинального метода для выявления псевдоаллергических реакций нами была рекомендована реакция воспаления на конканавалин А (метод включен в раздел 4. Псевдоаллергические реакции «Методических указаний по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ» 1999 года).

Пенициллины и цефалоспорины являются высокоэффективными и наиболее широко применяемыми антибиотиками (79, 309, 364). Идентичность основного механизма антимикробного терапевтического действия и образования антигенных комплексов при раскрытии беталактамного кольца не позволяет уменьшить аллергизирующие свойства этих антибиотиков в результате воздейтвия на беталактамное кольцо. В тоже время частота аллергических осложнений при применении беталактамидов зависит от наследственных признаков и общего состояния пациентов, пути введения, реакционной способности антибиотиков и продуктов их деградации образовывать прочные ковалентные связи с циркулирующими и тканевыми белками в организме, наличия высокомолекулярных примесей и продуктов полимеризации в получаемых ферментативным способом препаратах. Экспериментальное и клиническое изучение аллергизирующих свойств больших и малых антигенных детерминант беталакгамных антибиотиков является примером детального изучения иммунотоксичности их активных метаболитов (138, 206, 212, 302, 307, 316, 320), прежде всего бензилпе-нициллина. Бензилпенициллин является самым реакгогенным антибиотиком с точки зрения стимуляции гиперчуствительности по всем 4 типам. В организме в процессе биотрансформации образуется более 10 метаболитов, каждый их которых может быть гаптеном. Пенициллин может непосредственно реагировать с е-аминогруппами белка, образуя комплексы макромолекул, кроме пени-циллоила остальные продукты деградации также высокоаллергенны, возможно, что 20% реакций на пенициллины являются псевдоаллергическими (90, 91). Однако имеющиеся знания не способствовали уменьшению полиморфизма возникающих аллергических и псевдоаллергических реакций в разнородной человеческой популяции и все возрастающей (за последние 20 лет) поливалентной ^-зависимой, наиболее опасной 25% сенсибилизации населения индустриальных стран (308, 361). Согласно данным хиругического центра в Далласе (Я.Бокпзку е1 а1., 2000, 2002 г.г.), около 10% пациентов имели аллергию к пенициллинам (в обзорах по клиническим данным до 1980 г. аллергия к пенициллинам составляла 1-10%), эта популяция гетерогениа, в частности в последние годы наблюдают много пациентов с развитием анафилактоидных реакций к пенициллинам и отсутствием к ним положительных кожных тестов (M.J. Torres et al., 2002). Важна правильная диагностика анафилактических и неиммунологических анафилактоидных реакций, которые могут быть вызваны антибиотиками (258). IgE-антитела в сыворотках больных гетерогенны и определяются к большим и/или к малым антигенным детерминантам пенициллина, ампициллина, амоксициллина и цефалоспоринов в каждом конкретном случае по-разному (Z. Zhao et al., 2001). Отсутствие в ряде стран (в том числе и в России) требований по максимальной очистке от высокомолекулярных примесей (многие из которых вызывают в основном IgE-зависимые аллергические осложнения) полусинтетических пенициллинов и цефалоспоринов, созданных на основе 6-АПК и 7-АЦК, согласно экспериментальным и клиническим данным (51, 338), способствует увеличению количества аллергических осложнений при приеме получаемых ферментативным способом препаратов. Высокомолекулярные фракции пептидного препарата церебролизин (также полученного ферментативным способом) вызывали у пациентов аллергические реакции (228), в связи с чем его производство в Германии было приостановлено до внедрения новых технологий, позволивших идентифицировать и удалять аллергенные примеси, что привело практически с ликвидации аллергических осложнений при приеме этого пептидного препарата.

Полученные нами данные также доказывают наличие аллергизирующих свойств у всех изученных пенициллинов и цефалоспоринов и согласуются с данными литературы о менее выраженных побочных аллергических реакциях при лечении беталакгамидами по сравнению с бензилпенициллином. Впервые были выявлены высокомолекулярные примеси у антибиотиков отечественного производства, удаление которых методом ультрафильтрации приводило к уменьшению аллергизирующих свойств.

Псевдоаллергические реакции на лекарственные препараты являются не менее опасными чем реакции, протекающие по 1 типу гиперчувствительности, так как мембраны многих типов клеток не выдерживают избыточного фармакологического воздействия (342, 343, 344). Наиболее часто псевдоаллергические реакции с различным механизмом действия возникают у женщин от 40 до 80 лет, особенно с сопутствующими хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарной системы, почек и нейроэндо-кринной системы, нередко со смертельным исходом (63, 92). Кроме того, комп-лементзависимые иммунологические травмы воспроизводят один из типовых патологических процессов - повреждение, которое может привести к снижению активности нейронов, вплоть до выпадения их функции, т.е. к индукции одного из типовых патогенетических механизмов неврологических расстройств (55). Связанные с нейтрофилами медиаторы и активация системы комплемента могут стимулировать выделение гистамина и других активных веществ из тучных клеток и базофилов. Активация альтернативного пути комплемента, что вызывает появление С5а и СЗ анафилатоксинов, наблюдается при внутривенном введении декстранов, плазмозаменителей и других лекарственных средств, особенно при многократных внутривенных инфузиях, дестабилизирующих клеточные мембраны и систему комплемента. Механизмы псевдоаллергии на лекарства разнообразны и напоминают соответствующие типы истинных аллергических реакций (190,302, 313,343).

Предложенная нами модель для изучения псевдоаллергических реакций теоретически была основана на способности конканавалина А высвобождать из тучных клеток и базофильных лейкоцитов мышей медиаторы воспаления без участия реакции антиген-антитело. Поливалентный лектин конканавалин А обладает полифункциональным механизмом действия, активируя не только высвобождение гистамина и лейкотриенов из тучных клеток и базофилов, но также активно влияет на нейтрофилы (активирует СОХ-2 на клеточных мембранах) и лимфоциты (митоген для Т-хелперов), быстро вызывая выраженный отек и воспаление, при внутривенном введении мышам оказывает значительное повреждающее действие на печень (20, 38, 109, 340). Процесс активации кислорода в различных типах клеток начинается сразу после добавления Кон А или ФГА, причем генерация активных форм кислорода (АФК) зависит от присутствия ионов кальция и глюкозы (115). Кон А стоит в одном ряду действующих агентов, вызывающих запуск дыхательного взрыва фагоцитарных клеток и также относится к, так называемым рецептор-опосредованным стимулам, используемым в используемым в хемилюминесцентном анализе ПМЯЛ (20). Поэтому частично подавление или стимуляция реакции воспаления на Кон А фармакологически активными веществами, возможно, связано с активацией или подавлением разных типов реакций. Учитывая современное представление о том, при гиперсенсибилизации может быть запущено сразу несколько патологических механизмов разными типами клеток и медиаторов, реакция воспаления на Кон А может быть использована не только для выявления псевдоаллергии, но и как модель при изучении противовоспалительных свойств фармакологически активных веществ с разным (в том числе и в процентном соотношении) механизмом действия. Наличие выраженного дозозависимого подавления реакции воспаления на Кон А указывает на выявление у исследуемого вещества противовоспалительных свойств, что при необходимости указывает на целесообразность дополнительного его изучения, а также дополняет понимание механизма поликомпонентного действия этого препарата.

При однократном пероральном введении психотропного стимулятораи эстриглутона в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг было получено статистически достоверное увеличение реакции воспаления на Кон А (на 37,9% и 53,0%), что, наряду с другими отрицательными характеристиками препарата, не позволило рекомендовать его для дальнейшего изучения. К потенциальным аллергенам были отнесены апилактоза и препарат АВП (при применении которого были обнаружены и псевдоаллергические реакции). Полученные данные позволили рекомендовать реакцию воспаления на Кон А в качестве метода для выявления псевдоаллергических реакций.

Реакция воспаления на Кон А зарекомендовала себя как хорошая скринин-говая модель для выявления наиболее эффективных заводских образцов противоаллергических средств с поликомпонентным механизмом действия. Были выявлены 2 из 9-ти наиболее активных промышленных образца препарата Рузам, адаптивного пептида, обладающего антиаллергенными свойствами, оказывающего системное противовоспалительное действие, с ингибирующей активностью по отношению к ферментативным системам лейкоцитов и макрофагов, участвующих в выработке медиаторов воспаления (102). Метод оказался более эффективным, чем метод пассивной кожной анафилаксии на морских свинках и был в дальнейшем успешно использован для определения заводских образцов препарата с максимальной активностью. Полученные результаты коррелировали с экспериментальными и клиническими данными (94, 102 ).

У кардиотропных средств, синтезированных и фармакологически изученных в НИИ фармакологии РАМН (кардиоциклида для перорального и внутривенного введения, метацизина и брадизола), аллергизирующих свойств выявлено не было. При изучении иммунотоксичности этих препаратов в терапевтически эффективных дозах они или не влияли на изученные показатели неспецифического, гуморального и клеточного иммунитета (кардиоциклид), или подавляли иммунный ответ при введении в высоких дозах (метацизин, брадизол). Метацизин не подавлял первичный иммунный ответ мышей линии СВА, не оказывал существенного воздействия на число АОК при введении препарата в "0"день и день "+1". При введении метацизина в высокой дозе выявили достоверное понижение антителообразования в реакции РПГА.

Введение мышам брадизола внутрибрюшинно в дозе 14 мг/кг в течение 14-ти дней приводило к некоторому увеличению массы тимуса и селезенки у животных опытной группы по сравнению с контролем. Было показано, что двухнедельное в/б ведение препарата в дозе 14 мг/кг вызывало статистически достоверное (в 2,8 раза) подавление хемилюминесцентного ответа нейтрофи-лов на опсонизированный зимозан по сравнению с контрольными образцами. Курсовое введение брадизола в дозах 2,8 мг/кг и 14 мг/кг не вызывало достоверных изменений фагоцитарного индекса перитонеальных макрофагов по сравнению с контрольными данными. При введении брадизола в течение 14-ти дней в двух дозах мышам линий СВА и С57ВЬ/6 не было выявлено иммунотоксического действия на гуморальный иммунный ответ. У мышей гибридов р1(СВАхС57ВЬ/6) курсовое в/б введение брадизола в дозе 14 мг/кг мг/кг дней подавляло реакцию ГЗТ на 23%.

При изучении аллергизирующих свойств брадизола выявили достоверное дозозависимое подавление реакции воспаления на Кон А при однократном внутривенном введении препарата в дозах 2,8 мг/кг и 14,0 мг/кг (соответственно на 55,83% и 62,15%). Полученные данные свидетельствуют о наличии у брадизола противовоспалительных свойств, что, возможно, связано и с действием на активированные нейтрофилы. Противовоспалительные свойства были обнаружены у препаратов, относящихся к разным фармакотерапевтиче-ским группам, но к одному классу химических соединений (производным 2-меркапто-бензимидазола), в частности антиаритмический препарат брадизол (2-[2-(диэтиламино)этилтио]5-этоксибензимидазол дигидрохлорид) и селективный анксиолитик афобазол (2-[2-(морфолино)этилтио]-5-этоксибенз-имидазол дигидрохлорид), при внутривенном введении в одинаковом диапазоне доз оказывали выраженное противовоспалительное действие на экссудативный отек на Кон А. Согласно данным литературы, производные имидазола, в частности бемитил и томерзол, способны взаимодействовать со свободными радикалами и обладают антиоксидантными свойствами (113).

Для кардиотропных средств характерно наличие малой терапевтической широты и специфической видовой чувствительности, поэтому необходимо анализировать возможность возникновения токсических эффектов при применении этих препаратов и кумулятивных свойств их активных метаболитов. В «Методических указаниях по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» 2000 года нет четких указаний по оценке токсического действия препаратов для наружного применения (мазей, антисептических средств в виде растворов). Изучение токсических кумулятивных эффектов кардиотропных препаратов или их метаболитов в ряде случаев нуждается в дополнительных доклинических исследованиях.

Разработанное и изученное в кооперации с Арцнаймитгельверк (Дрезден) и НИИ фармакологии РАМН антиаритмическое средство боннекор (тирацизин) в опытах на крысах обладало значительно большей терапевтической широтой, чем в опытах на собаках, которые погибали в различные сроки введения бон-некора в дозе 15 мг/кг При изучении фармакокинетических характеристик активных метаболитов боииекора наиболее сильное влияние метаболитов сказывалось при многократном введении, в связи с различным периодом полувыведения препарата и 4-х его метаболитов. Основной метаболит М-1 обладал выраженной прооксидантной активностью, с чем возможно связана его высокая токсичность при в/в введении. После введения боннекора у выживших собак на ЭКГ было отмечено чередование атриовентрикулярной блокады с желудочковой тахикардией, что согласовывалось с данными по фармакокинетике препарата и 4-х его метаболитов. Различная видовая чувствительность экспериментальных животных при изучении кардиотропных средств должна учитываться при доклиническом исследовании препаратов с малой терапевтической широтой.

Иммунофармакология объединяет иммунологию, патологию и фармакологию и является одним из наиболее быстро развивающихся научных направлений в области биомедицинских исследований, включающим взаимодействие между нервной, эндокринной и иммунной системами (53, 54, 109, 360). Наличие иммунофармакологических свойств у психотропных средств (в связи с взаимодействием между иммунной и нервной, иммунной и нейроэндокринной системами) является наиболее прогнозируемым, однако механизмы действия психотропных средств на иммунную систему, в частности адаптогенов, анти-оксидантов и олигопептидов различаются. Кроме того, в иммунологических расстройствах, возникающих при неврологических заболеваниях, может иметь место имеет патология нервной регуляции функций иммунной системы (53, 55). При изучении иммунотоксичности новых производных адамантана и ими-дазола (к которым относится левамизол), олигопептидов, производных пиридина и пиримидина, обнаружение иммунотоксических или иммунофармакологических свойств достаточно вероятно. Имунокорригирующие и иммунофар-макологические свойства психотропных средств могут являться частью их поликомпонентного фармакологического действия и направлены на патофизиологические процессы, вызванные основным заболеванием.

В механизме стрессорного снижения функций и повреждения многих внутренних органов значительную роль имеет действие избытка катехоламинов, Р-адренергические рецепторы (увеличение плотности р-АР рецепторов лимфоцитов) и активация ПОЛ, которые приводят к повреждению клеточных мембран. Стимуляция Р-адренорецепторов вызывает увеличение в нормальных киллерах (НК) уровня цАМФ и снижает их цитостатическую активность, предварительное введение Р-адреноблокаторов снижает этот эффект, длительный иммобилизационный стресс вызывает выраженную депрессию активности НК. При возрастании в макрофагах соотношения циклических нуклеотидов цАМФ/цГМФ снижается поглощение фагоцитируемого материала, высвобождение лизосомальных ферментов, хемотаксис (31,73,109). Уровень цитокинов у здоровых людей и нестрессированных животных достаточно низкий, экспрессию цитокинов вызывают инфекции, травмы, физиологические и психические стрессы, хронические заболевания ЦНС, такие как рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, синдром Дауна (38, 66, 360, 376).

Острая фаза физиологического ответа организма ( выработка цитокинов, генерация нейроэндокринного сигнала) на психологические и физические стрессы имеет много общих аспектов с инфекционными и воспалительными травматическими стрессами (136, 155, 182, 383). В экспериментальных исследованиях ЛПС является потенциальным стимулятором синтеза IL-1, IL-6 и TNF-a, он также индуцирует синтез цитокинов в чистой клеточной культуре клеток глии, без клеток крови (159, 256, 360). Различные зоны гипоталамуса активируются под влиянием стресса. Экспрессия IL-ip mRNA, IL-1га (223) в гипоталамусе увеличивалась через 30 минут после иммобилизационного стресса у крыс, экспрессия IL-6 mRNA в среднем мозге (midbrain) - через 4 -24 часа после иммобилизационного стресса (330, 360). В монографии В.В. Абрамова с соавторами (2) и других работах говорится о проникновениии IL-1Р и TNF-a через ГЭБ, однако в ряде исследований было показано,что пик объема между 0,05 и 0,3% от общей дозы меченных йодом1" IL-ip и TNF-a найдено в каждом грамме мозговой ткани через 20-60 минут после их в/в введения , поэтому маловероятно, что такая часть цитокинов, поступающих в мозг, обладает физиологически значимым действием (360). В настоящее время преобладает гипотеза, что стимуляция IL-1 HP А оси идет путем увеличения синтеза посредников, которые прямо взаимодействуют с нейросекреторными процессами в гипоталамусе. Этими посредниками являются классические нейротрансмитгеры, такие как катехоламины (142, 356), гистамин (360), а также эйкозаноиды (в основном ПГЕ2) и оксид азота ( 322 , 360).

Как указывалось ранее, иммунотоксические (включающие аллергизи-рующие) свойства химических агентов и лекарственных средств изучаются в Голландии по наиболее полной и современной 2-х уровневой схеме с обязательным определением наличия IgE антител, а также идентификации лимфоцитов селезенки методом кластерного анализа (195). Введение специалистами ГНЦ Института иммунологии в "Методические указания по оценке иммунотоксических свойств фармакологических веществ" 2000 года в качестве одного из методов изучение активности нейтрофилов в тесте хемилюминесценции (которого нет в программах по изучению иммуно-токсичности США, Голландии и Германии) является с нашей точки зрения принципиально важным и актуальным для современной иммунотоксикологии. В последние годы все более пристальное внимание уделяется нейтрофильным лейкоцитам, которые являются первой линией обороны при инфекционных заболеваниях (31, 209, 265, 365), однако в связи с убедительными данными о цитотоксичности активированных нейтрофилов прооксидантные свойства фармакологически эффективных соединений далеко не вседа являюся положительным качеством для лекарственных средств и просто недопустимы для ней-ротропных и кардиотропных препаратов. Зрелые нейтрофилы имеют короткую продолжительность жизни и запрограмированы на апоптоз, который ограничивает токсический потенциал ПМЯЛ и способствует устранению излишних нейтрофилов из воспалительных участков, способствуя завершению острого воспалительного процесса. Эндотелиальная трансмиграция играет важную роль в регуляции апоптоза ПМЯЛ, адгезионные молекулы (ICAM-1) модулируют процесс програмированной клеточной гибели, р2 интегрины потенцируют TNF-a индуцированный апоптоз, тем самым предотвращается миграция ПМЯЛ, что ведет к локализации воспалительного процесса (89, 196, 299, 350, 365, 367). TNF-a стимулирует эффекторные функции нейтрофилов с одновременной индукцией апоптоза, причем функционирование и жизнеспособность нейтрофилов регулируется взаимным влиянием цитокинов (89, 365). Раэ-индуцированный апоптоз нейтрофилов супрессируется глюкокортикоидами, колониестимулирующими факторами, ЛПС и ингибиторами тирозинкиназ (89, 270, 286, 328, 324). Согласно данным экспериментальных и клинических исследований, имеется достаточное количество фактов, указывающих, что при многих заболеваниях нейтрофилы причиняют значительно больше вреда, чем пользы ( 70, 217, 265, 365). При инфекциях, различных формах стресса, ишемии мозга под действием хемат-трактантов ПМЯЛ активно передвигаются в зону воспаления. В отличие от макрофагов, киллинг микроорганизмов нейтрофилы осуществляют в основном в стадии незавершенного фагоцитоза (45,70, 209, 265), оказывая выраженное цито- и органотоксическое действие. Свободнорадикальная активность лейкоцитов усиливается при различных формах воспаления и приводит к экспрессии ¡№)8-синтазы в лейкоцитах, циклооксигеназы-2 на клеточных мембранах, запускающей синтез эйкозаноидов, в частности ПГЕг (280, 292, 314, 329). Для цито- и органотоксического действия нейтрофилов важны временные характеристики (обычно 24-36 часов после начала воспаления). При ишемии мозга активированные нейтрофилы появляются в зоне поражения через 2 часа, примерно через 6 часов начинается наиболее активная адгезия клеток к эндотелию микрососудов, прохождение через ГЭБ и инфильтрация ткани мозга, максимум инфильтрации нейтрофилами в зоне ишемизированной ткани мозга наступает на 2 - 3 сутки, значительно увеличивая зону инфаркта мозга (31, 209, 267, 365). При инсульте наблюдается выраженная инфильтрация микрососудов головного мозга лейкоцитами, вызывающими периваскулярный отек ( 209, 217 ). Поэтому, в связи с токсическим действием нейтрофилов при ишемии, посттравматических рас-стройсвах различного генеза, в последние годы разрабатывается антилейкоцитарная фармакологическая стратегия, включающая введение монокло-нальных антилейкоцитарных антител, действие на провоспалительные цито-кины (1Ь-1р + ЮТ-а ) и молекулы адгезии на клетках эндотелия (177, 365,

378). При активации мембранных оксидаз и фосфолипидов нейтрофилов резко (более чем в 50 раз) возрастает потребление кислорода и окисление глюкозы, возникает респираторный взрыв с образованием мощных биооксидантов-перекиси водорода и свободных радикалов: супероксидного аниона, гидро-ксильного радикала, синглетного кислорода. Хемилюминесценция, которая сопровождает дыхательный взрыв нейтрофилов, может использоваться для определения про- и антиоксидантных свойств изучаемых соединений. Введение антинейтрофильных антител при локальной ишемии у крыс уменьшало супероксидную активность и аккумуляцию нейтрофилов, а также размер инфаркта на 45-50% (177). На нейтрофилах и ряде других клеток находятся Р2 пуринорецепторы, антагонисты Р2 рецепторов угнетают развитие воспалительного процесса (46).

В отличие от нейтрофилов моноциты крови являются универсальной формой блуждающих и фиксированных незрелых макрофагов, у них более продолжительный (по сравнению с нейтрофилами) жизненный цикл, они медленнее (после нейтрофилов) проникают в очаг воспаления. Фагоцитирующие мононуклеары выполняют защитную функцию при воспалительной реакции и запускают генетически детерминированную программу восстановления дефекта в очаге воспаления. Поэтому необходимы четкие временные и дозовые характеристики при применении препаратов с иммуномодулиру-ющими свойствами адъювантного типа, чтобы дифференцировано стимулировать макрофагальное звено иммунитета (70,360).

При изучении психотропных препаратов с активирующими адаптогенными свойствами обнаружение аллергизирующих свойств и псевдоаллергических реакций достаточно вероятно. По нашим данным, препарат эстриглутон усиливал реакцию воспаления на Кон А, азакраунэфир С-3 обладал выраженными аллергизирующими свойствами, у производного адамантана - ладастена аллергизирующих свойств выявлено не было. В то же время нужно отметить, что для психотропных препаратов, применяемых при нейроастенических расстройствах (при наличии вторичного иммунодефицита), активация различных неиммунопатологических факторов иммунитета целесообразна (7, 8).

Одной из нейрохимических мишеней анксиолитиков, мембранных модуляторов ГАМК-БД рецепторного комплекса при фармакологической коррекции стресса, является регуляция структурных и функциональных мембранорецепторных взаимодействий, мембранопротекторные и антиокси-дантные эффекты анксиолитиков этой группы являются одним из механизмов восстановления рецепторного участка мембраны (24). При изучении иммуно-токсичности селективного анксиолитика афобазола (производного 2-мер-капто-бензимидазола) нами не было выявлено аллергизирующих свойств, выраженного действия на основные показатели иммунитета, при пероральном введении препарата в терапевтической дозе имелась некоторая тенденция к стимуляции клеточного иммунитета ( на 15%), в/в ведение в терапевтически эффективной дозе 5 мг/кг вызывало значительное подавление (63,0%) реакции воспаления на Кон А. По данным В.И. Ратникова с соавторами (103) производное меркапто-бензимидазола под шифром МБИ-2 оказывало активизирующее действие на продукцию интерлейкина-2 и стимулировало клеточный иммунитет в реакции ПЧЗТ, стимуляция клеточного иммунитета характерна и для левамизола.

Известно, что пептидные препараты часто обладают более или менее выраженными иммунномодулирующими и/или противовоспалительными свойствами, а также усиливают пролиферативную активность различных типов клеток (15, 211). Проведенное нами экспериментальное изучение препаратов дельта-сон индуцирующего пептида (Б81Р) и Рузама показало, что Б81Р в терапевтически эффективной дозе оказывал незначительное стимулирующее действие на гуморальный иммунитет у мышей линии СВА , более выраженное у мышей линии С57В1/6. Пептидный препарат Рузам, действующий на различt ные патогенетические механизмы аллергического воспаления, обладал противовоспалительным действием, в частности на экссудативный отек на Кон А.

В настоящее время при изучении иммунной регуляции пептидами большое внимание уделяется полифункциональным олигопептидам (содержащим от 2 до 50 аминокислотных остатков), которые в отличие от белков не обладают устойчивой пространственной конфигурацией, в результате чего они могут проявлять большую конформационную подвижность, в частности их химические радикалы могут менять свое расположение в пространстве и подстраиваться под специализированные рецепторные структуры (21,61,75).

При изучении аллергизирующих и иммунотоксических свойств дипептид-ного ноотропа ноопепта нами были обнаружены его иммуномодулирующие и противовоспалительные свойства, которые затем были изучены по расширенной программе. Ноопепт в наших опытах при разных способах введения мышам вызывал стимулирующее действие на В-клеточное звено иммунитета у мышей различных линий при разной антигенной нагрузке. У мышей линии C57BL/6 стимулирующий эффект был наиболее выражен при в/м введении препарата через сутки ("+1" день) после антигенной стимуляции (при введении препарата в дозе 0,5 мг/кг - 302, 6 %, в дозе 5 мг/кг - 299, 7 %). Иммуномостимулирующее действие дипептида на АОК в дозе 10 мг/кг воспроизводилось и при пероральном введении. При изучении влияния препарата ноопепт на клеточный иммунитет (ГЗТ) выявляемый эффект зависел от метода и длительности введения препарата. При однократном пероральном введении дипептида в дозе 10 мг/кг было выявлено стимулирующее действие препарата (на 45,9% по сравнению с контролем). Введение препарата ноопепт в дозе 10 мг/кг в течение 14 дней до иммунизации ЭБ стимулировало реакцию ГЗТ по сравнению с контролем на 30,7%, в дозе 100 мг/кг - на 24,1%.

14-ти дневное пероральное введение ноопепта в дозах 10 мг/кг и 100 мг/кг вызывало достоверное (в 3,6 и в 2,9 раза) повышение фагоцитарного индекса по сравнению с контрольными данными, что характерно для пролин-содер-жащих пептидов. По данным литературы (21), олигопептид глицин-аргинин-пролин (GRP) также усиливал адгезивные свойства макрофагов, их подвижность и способность к фагоцитозу.

Введение циклофосфана в дозе 150 мг/кг в/б за 24 часа до антигенной стимуляции подавляло иммунный ответ на 38,0% по сравнению с контролем. В/в введение ноопепта в дозе 5 мг/кг на «+3» день восстанавливало первичный IgM иммунный ответ у мышей линии СВА на 48,4%. Наиболее выраженное 4-х кратное увеличение IgG иммунного ответа наблюдали у мышей обеих линий с вторичным иммунодефицитом при введении препарата в индуктивную фазу иммунного ответа, у мышей линии C57BL/6 - и в продуктивную фазу гуморального иммунного ответа. Ноопепт оказывал также стимулирующее воздействие на ГЗТ у мышей гибридов Fi(CBAxC57BL/6), более выраженное у мышей с вторичным иммунодефицитом. В/в введение дипептида в дозе 5 мг/кг мышам Fi с вторичным иммунодефицитом стимулировало реакцию ГЗТ на 60,2% по сравнению с контрольной группой животных и на 87,9% по сравнению с мышами с вторичным иммунодефицитом.

Совокупность полученных данных свидетельствует об иммуннокорри-гирующих свойствах разработанного препарата. При изучении влияния препарата ноопепт на пролиферативную активность спленоцитов было установлено, что в условиях in vivo препарат усиливает спонтанную пролиферативную активность спленоцитов и несколько повышает пролиферативный ответ Т-клеток на Кон А. При однократном внутривенном введении препарат оказывает выраженное увеличение (на 70,4%) спонтанной пролиферативной активности спленоцитов, при пероральном введении ноопепта в течение 14 суток в дозе 10 мг/кг также имеется тенденция к увеличению спонтанной пролиферации лимфоидных клеток. Полученные данные объясняют увеличение массы селезенки и тимуса у мышей при 14-ти дневном введении ноопепта per os в дозе 10 мг/кг. По данным Манько В.М и Чижевской М.А. (67, 127), воздействие имму-номодуляторов на организм нормальных и облученных мышей приводит к изменениям пролиферативной активности селезеночных клеток in vitro, характер которого (подъем или снижение) совпадает с направлением модуляции иммунного ответа (стимуляция или супрессия). Изменение пролиферативной активности селезеночных клеток при введении иммуномодулятора не связано непосредственно с его митогенным действием на клеточную пролиферацию, зависит от дозы вводимого препарата и может быть различным у мышей различных генотипов.

Известно, что при хронических стрессирирующих воздействиях у крыс была выявлена значительная инволюцию тимуса, в результате апоптоза тимоцитов под действием эндогенных глюкокортикоидов (358), поэтому вероятное усиление пролиферативной активности тимоцитов под действием стресс-протек-тивного препарата ноопепт также является важным иммунокорригирующим свойством. В дальнейшем действие подобных препаратов на иммунную систему целесообразно изучать и в опытах на стрессированных животных.

Установленный нами в опытах на активированных нейтрофильных лейкоцитах мышей факт выраженного подавления (в 5-6 раз) ноопептом стимулированной зимозаном или форболмиристатацетатом хемилюминесценции, а также значительное подавление острого экссудативного (отек на каррагенан и Кон А) и хронического воспаления при адъювантном артрите, доказывают влияние ноопепта на полиморфноядерные лейкоциты, что, вероятно, является важной составляющей его противовоспалительного действия. Влияние на нейтрофилы может быть поликомпонентным, (прямым или опосредованным), что свойственно олигопептидам. Согласно данным Р. СаМейе-СЬеге1 с соавторами (171), более вероятно,что люминолзависимая хемилюминесценция определяет кинетику внутриклеточной продукции свободнорадикальных процессов внутри нейтрофилов, кроме того было выявлено, что ФМА является активатором про-теинкиназы С, вызывающей увеличение функциональной активности активированных нетрофилов. Однако опсонизированный зимозан является рецептор-опосредованным стимулятором активации нейтрофилов, на мембранах которых иммуногистохимическими методами при различных формах воспаления обнаружили циклооксигеназу-2 (265).

Таким образом, препарат ноопепт обладает противовоспалительной активностью благодаря своему ( внутри- и/или внеклеточному) антиоксидантному действию на нейтрофилы и другие клетки, однако нельзя исключать влияние препарата на различные медиаторы иммунитета и воспаления, пролифератив-ную активность клеток, антимитогенный эффект ( учитывая подавление ноопептом митогенной активности ЛПС в культуре В-лимфоцитов). Полученные данные согласуются с фибринолитическими и антитромботическими свойствами у пролинсодержащих пептидов, а также способности ноопепта уменьшать объем ишемического очага на модели фотоиндуцированного тромбоза ( Я. Ов^оузкауа е1 а1., 1999).

Ноопепт обладает рядом специфических свойств регуляторных олигопеп-тидов. По механизму действия у ноопепта есть общие черты с миелопептидом МП-1 и с гексапептидом тимуса иммунофаном, но в отличие от олигопептидов более сложной структуры дипептид при пероральном введении быстро всасывается и поступает в системный кровоток и затем в мозг (107). Наличие в структуре ноопепта циклической аминокислоты пролина и стабилизирующих N- и С-концевых замещений служат дополнительными факторами повышения устойчивости препарата к воздействию ферментативной системы кишечника (29, 107, 291). Гексапептид МП-1 (Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-THr) увеличивал или восстанавливал уровень антителообразования у мышей, которых повергали действию ионизирующей радиации или вводили циклофосфамид (76). Мп-1 стимулировал Кон-А-индуцированную пролиферацию спленоцитов, полученных от старых мышей, и не влиял на пролиферативный ответ спленоцитов, полученных от молодых животных. Подобно имунофану, ноопепт обладает противовоспалительными и иммунокорригирующими свойствами (61).

Наличие "мягких" иммунокорригирующих и выраженных противовоспалительных свойств у ноотропного и нейропротективного препарата ноопепт свидетельствует о перспективности его применения при различных нейроим-мунных расстройствах.

К числу перспективных классов иммуномодуляторов относятся производные пиримидина, обладающих выраженными антиоксидантными и имму-номодулирующими свойствами. Обладая низкой токсичностью, они стимулируют нуклеиновый и белковый обмен, ускоряют пролиферацию и дифферен-цировку клеток, оказывают противовоспалительное действие, повышают резистентность организма к инфекции (16, 115). Производные пиримидина, в частности сульфонопиримидиновое производное диуцифон, активны при ВИЧ-инфекции (М.Н.Папуашвили с соавт., 2001, 2002). Среди азотсодержащих фе-нольных антиоксидантов, производные 3-оксипиридина (3-ОП), структурные аналоги соединений группы витамина Вб, также обладают иммунотропными свойствами. Разработанный в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН в качестве психотропного средства препарат мексидол (23, 25, 88) обладает выраженным антиоксидантным и мембранопротекторным действием. Нами был проведен поиск иммунотропной активности среди 6-ти производных 3-оксипиридинов и 7-ми производных 5-оксипиримидинов, в сравнении с изученными ранее двумя 5-оксипиримидинами ОПМ-11 и ОПМ-311 (115). При изучении влияния препаратов на основные показатели гуморального и клеточного иммунитета наибольшую активность среди производных 3-окси-пиридинов и 5-оксипиримидинов выявили у препарата ОПМ-411 , которому дали условное название "пентаксидин". Препарат ОПМ-4П обладает значительной иммунотропной активностью: повышает количество и функциональную активность лимфоцитов, продуцирующих антитела, стимулирует клеточный иммунитет, восстанавливает и повышает иммунный ответ после подавления его циклофосфаном, подавляет реакцию воспаления, обладает защитным действием при применении его до введения цитостатика, нивелируя депрессивное влияние на иммунитет и проявляет иммунокорригирующие свойства.

Нами также было изучено влияние препарата ОПМ-411 на соматические показатели, число лейкоцитов и рост экспериментального опухолевого штамма - карциномы лёгких Льюиса у мышей Fi (СВА х С57В16), и на противоопухолевую эффективность отечественного фторпиримидина фторафура, используемого для лечения солидных опухолей. Влияние ОПМ-411 на состояние мышей-опухоленосителей и рост опухолей оценивали после ранней (2-8 дни) и отсроченной терапии (9-15 дни), дробным введением в дозе 50 мг/кг один раз в сутки в течение 7 дней (суммарная доза равна % ЛД50) и однократного введения суммарной дозы на 8-ой день после инокуляции опухоли. При всех режимах введения препарата ОПМ-411 мышам-опухоленосителям регистрировалось торможение роста опухоли, наиболее выраженное при ранней терапии (2-8 дни введения), оптимальной для проявления иммуностимулирующего действия производных пиримидина. Лимфотропный потенциал препарата ОПМ-411, оцениваемый по увеличению веса тимуса мышей-опухоленосителей также наиболее выражен при этом режиме и ранней терапии опухоли.

Препарат 411 частично корригировал лейкемоидную реакцию индуцируемую ростом опухоли, уменьшая число кариоцитов периферической крови. Коррекция лейкоцитоза препаратом ОПМ-411 также была наиболее выражена при ранней терапии (на 43% при введении ОПМ-411 в 1-8 дни) и уменьшалась при увеличении срока применения препарата от момента инокуляции опухоли. Однако при курсовом и однократном введении препарата ОПМ-411 в сочетании с фторафуром не обнаружено значительного снижения токсичности и потенцирования противоопухолевой эффективности фторафура, которое позволило бы уменьшить его дозу. Уменьшение терапевтической дозы фторафура имеет принципиальное значение при клинической терапии опухолей, так как фторафур в высоких дозах обладает выраженной нейротоксической активностью (195).

Таким образом, в результате терапии препаратом ОПМ-411 мышей, несущих трансплантаты карциномы лёгких Льюиса, обнаружено выраженное торможение роста опухоли без признаков токсического воздействия на соматические показатели мышей-опухоленосителей. Не выявлено значительного снижения токсичности и повышения противоопухолевой эффективности цитостатика фторпиримидинового ряда - фторафура при комбинированном применении с препаратом ОПМ-411, что позволило предположить, что противоопухолевые свойства препарата ОПМ-411 реализуются посредством прямой стимуляции противоопухолевого иммунитета.

При дальнейшем изучении иммуномодулирующих свойств препарата ОПМ-41 ¡совместно с д.м.н. A.B. Саниным, НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, были выявлены различные иммуномодулирующие свойства, в том числе стимуляция естественной резистентности и выраженная активация пролиферации и миграции стволовых кроветворных клеток, позволяющих отнести препарат ОПМ- 411 к перспективным иммуномодуляторам. Противоопухолевое действие препарата было подтверждено модуляцией активности естественных киллеров. Важной особенностью препарата является его активирующее действие на пролиферацию и миграцию стволовых кроветворных клеток. Усиление пролиферации СКК под действием пентаксидина может быть использовано в медицинской практике при восстановлении лимфогемопоэза от лучевых, химиотерапевтических воздействий и при вторичных иммунодефицитах. Указанные иммуномодулирующие свойства ОПМ-411 свидетельствуют о перспективности его изучения в качестве препарата, используемого при лечении заболеваний, связанных с развитием иммунодефицитных состояний при инфекционных заболеваниях, для повышения противоопухолевого иммунитета, при различных возрастных и функциональных нарушениях иммунитета.

Таким образом, оценка иммунотоксичности разных групп фармакотерапев-тических средств должна основываться на совокупности данных о химическом строении, наличии активных иммунотоксичных метаболитов у изучаемых соединений, являются ли исследуемые классы химических веществ мембрано-акгивными, обладающими антиоксидантными, мембранопротекгорными свойствами или, наоборот, усиливающими образование активных форм кислорода, инициирующих процессы перекисного окисления в мембранных липидах, приводящих к разрушению липидной основы мембран, которые в конечном итоге могут вызвать нарушение ДНК клеток или изменить программу физиологически обоснованного апоптоза. При изучении возможных иммунотоксических свойств новых фармакологически эффективных веществ необходимо проанализировать данные литературы об основном фармакологическом действии изучаемого класса химических соединений, имеющиеся данные о побочных эффектах препаратов с подобным механизмом действия в клинике. Кроме того, необходимо учитывать различную чувствительность экспериментальных животных к разным группам фармакотерапевтических веществ, имеющиеся скромные возможности даже центральных научных учреждений не позволяют полностью соответствовать Good Laboratory Practice (GLP) и рекомендовать для серийных иммунотоксикологических исследований иммуноферментный и кластерный анализ. Вместе с тем, безусловно необходимо пересматривать имеющееся еще представление о малой эффективности экспериментального изучения аллергизирующих свойств новых лекарственных средств и псевдоаллергических реакций. Обобщая наш многолетний опыт по изучению аллергизирующих и иммунотоксических свойств лекарственных средств можно заключить, что предложенный в новых методических указаниях по оценке аллергизирующих и иммунотоксических свойств фармакологических веществ (110) комплекс методов и методологических подходов позволяет выявлять не только аллергизирующие свойства и иммунотоксичность у новых фармакологически эффективных соединений, но и наличие противовоспалительных и ряда других иммунофармакологических свойств.

В дальнейшем целесообразно более широко использовать различные иммунопатологические модели, в частности гипофизэктомированных и стресси-рованных животных, изучать на клеточном уровне участие в реализации иммунотоксических и иммунофармакологических эффектов действие блокаторов кальциевых каналов, агонистов и антагонистов (5- и Р2- рецепторов. Проведенная нами оценка аллергизирующих и иммунотоксических свойств мембра-ноактивных соединений позволила нам выявить новые свойства у изученных кардиотропных и психотропных препаратов и дополнить понимание их поликомпонентного механизма действия.