Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Синтез и исследования биологической активности новых потенциальных блокаторов рецептора NR3C4

На правах рукописи

БРЫЛЕВ МАКСИМ ИГОРЕВИЧ

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ НОВЫХ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ БЛОКАТОРОВ РЕЦЕПТОРА Ш3С4

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

15 ЯКЗ 2015

Москва-2015

005557693

005557693

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Раменская Галина Владиславовна - доктор фармацевтических наук, профессор Официальные оппоненты:

Пятин Борис Михайлович - доктор фармацевтических наук, профессор, руководитель опытно-технологического отдела ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова»

Берлянд Александр Семенович - доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой общей и биоорганической химии стоматологического факультета ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения России

Ведущая организация: ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ»

Защита диссертации состоится «|Ь » срео]ра/Л 2015 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 117997, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49, и на сайте: www.mma.ru.

Автореферат разослан « » Л 2014 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.208.040.09 доктор фармацевтических наук, профессор

Демина Наталья Борисовна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Рак предстательной железы (РПЖ) относится к наиболее часто выявляемым опухолям среди онкологических заболеваний у мужчин. В структуре онкологической заболеваемости ряда стран рак простаты занимает 3-е место после рака легкого и желудка. В России заболеваемость РПЖ занимает 1-ое место по уровню прироста среди онкологических заболеваний у мужчин [Чиссов, 2011, Березин, 2013].

По данным многочисленных исследований, среди всех гормонально зависимых опухолей РПЖ является наиболее чувствительным к гормональной терапии. Одним из основных видов гормонотерапии в лечении рака простаты является применение препаратов-антагонистов рецептора NR3C4 (nuclear receptor subfamily 3, group С, member 4). Они блокируют связывание мужских половых гормонов с клеточными рецепторами, препятствуя проявлению биологических эффектов данных гормонов в клетках предстательной железы, тем самым останавливая рост опухоли [Kinkade C.W., 2008].

В настоящий момент одним из наиболее популярных антагонистов рецептора, применяемых для лечения РПЖ является стероидный препарат - ципротерона ацетат, обладающий, помимо целевого действия, рядом побочных [Thole Z., 2004].

В связи с этим, разработка эффективных препаратов, практически не обладающих побочными действиями стероидных аналогов, представляется важным этапом в создании лекарственных средств нового поколения.

Современные методы компьютерного моделирования активных соединений, основанные на информации о строении и биологических свойствах мишени, позволяют провести расчеты, направленные на получение структур соединений -потенциальных блокаторов рецептора NR3C4, с их последующим синтезом и исследованием биологической активности.

Степень разработанности темы исследования. Несмотря на множество исследований по разработке потенциальных препаратов-антагонистов рецептора NR3C4, сохраняется проблема их поиска, вследствие дороговизны получения. Применения в терапии стероидных препаратов (цитопротерона ацетат,

спиронолактон, мегестрола ацетат, медроксипрогесторона ацетат) приводит к снижению либидо, развитию эректильной дисфункции, оказывает токсическое действие на печень. В связи с этим, поиск нестероидных антагонистов рецептора NR3C4 на основе модифицированных аминокислот и пептидов обуславливает актуальность диссертационного исследования.

Цель и задачи исследования.

Цель - исследование и получение биологически активных веществ -блокаторов рецептора NR3C4.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать группы соединений, среди которых будет проводиться компьютерное моделирование потенциальных антагонистов рецептора NR3C4.

2. Провести компьютерное моделирование потенциальных антагонистов рецептора NR3C4.

3. Осуществить синтез наиболее перспективных соединений - блокаторов рецептора NR3C4.

4. Установить строение синтезированных соединений с помощью комплекса современных физико-химических методов (спектроскопия ЯМР ]Н, масс-спектрометрия и ИК-спектроскопия).

5. Определить основные кинетические характеристики процесса получения замещенных акридин-9(10Н)-онов в условиях микроволнового излучения и показать возможность применения микроволновой активации в химическом синтезе.

6. Оценить биологическую активность in vitro синтезированных соединений к рецептору NR3C4 с целью отбора потенциальных лекарственных средств.

Научная новизна исследования.

Научно обоснован выбор групп соединений для проведения компьютерного моделирования потенциальных антагонистов рецептора NR3C4.

Впервые проведено компьютерное моделирование потенциальных блокаторов рецептора NR3C4 среди соединений, относящихся к четырем группам: ацилированные амиды L- и D-аминокислот, ацилированные сложные эфиры L- и D-аминокислот, ацилированные аминоакридин-9(10Н)-оны, ацилированные по N-

концу ди- и трипептиды.

Синтезированы 32 (в том числе, 20 ранее не описанных) целевых соединения, структура которых подтверждена методами спектроскопии ЯМР 'Н, масс-спектрометрии и ИК-спектроскопии.

Впервые определены основные кинетические характеристики (константы скорости, энергия активации) процесса получения замещенных акридин-9(10Н)-онов в условиях микроволнового излучения.

Научно обоснован и экспериментально доказан выбор 3-х эффективных и безопасных потенциальных антагонистов рецептора М1зС4 нового поколения.

Теоретическая значимость исследования. Представленный в работе экспериментально-практический материал может служить теоретической базой для поиска и исследования новых лигандов рецептора 1\ГЕ1зС4.

Практическая значимость исследования.

С помощью методов компьютерного моделирования и органического синтеза получены 32 (в том числе, 20 ранее не описанных) соединения - потенциальных антагониста рецептора N1*^4. Среди синтезированных соединений проведен анализ результатов биоскрининга (аффинности, цитотоксичности и антагонистической активности к рецептору МП3С4). Выявлены 3 наиболее аффинных и малотоксичных антагониста рецептора МИ3С4, рекомендованных для дальнейшего углубленного изучения с целью создания лекарственных средств на их основе.

Методология и методы исследования. При выполнении работы были использованы методы компьютерного моделирования, оценки АОМЕ/Т-свойств, органического синтеза, флеш- и обращеннофазовой хроматографии, ТСХ, денситометрии, спектроскопии ЯМР 'Н, масс-спектрометрии, ИК-спектроскопии, поляризационной спектрофлуориметрии, флуоресцентной и конфокальной микроскопии.

Публикации. По тематике диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 5 статей в изданиях, включенных в перечень ведущих периодических изданий ВАК РФ.

Степень достоверности результатов. Достоверность полученных в ходе

работы результатов обеспечивалась определенным набором физико-химических и биологических методов исследования.

Расчетный поиск потенциальных антагонистов рецептора МК3С4 проведен с использованием методов компьютерного моделирования. Структура синтезированных соединений подтверждена современными физико-химическими методами. Результаты биологического исследования получены на достаточно большом количестве повторностей. Все результаты обработаны методом математической статистики и являются достоверными.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации были представлены и доложены на VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа,

2013), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации» (Санкт-Петербург, 2013), Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург,

2014), Международном молодежном научном форуме «Ломоносов» (Москва, 2014), научно-практической конференции «Новые химико-фармацевтические технологии» (Москва, 2014).

Личный вклад автора. Данные, представленные в автореферате и диссертации, получены при непосредственном участии автора как на этапах постановки задач и разработки подходов к их выполнению, так и при проведении экспериментальных исследований, статистической обработке и анализе полученных результатов, написании публикаций. Диссертация и автореферат написаны лично автором.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности «14.04.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пункту 1 и 2 паспорта «Фармацевтическая химия, фармакогнозия».

Связь выполненной работы с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом:

«Развитие научных и научно-методических основ, базовых и инновационных подходов при разработке, внедрении и применении лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01201261653).

Основные положения, выносимые на защиту.

Выбранные группы соединений для проведения компьютерного моделирования.

Смоделированные методом докинга соединения — потенциальные антагонисты рецептора ЫИ-зС4 и их расчетные характеристики.

Разработка методов синтеза соединений, обладающих наилучшими расчетными характеристиками.

Результаты исследования синтезированных соединений физико-химическими методами.

Методы и результаты исследования кинетических закономерностей получения производных акридин-9(10Н)-она в условиях микроволнового излучения.

Методы и результаты исследования биологической активности синтезированных соединений к рецептору М1зС4.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 135 страницах, включает 11 рисунков и 17 таблиц, приложение 1, 2, 3, 4. Библиография состоит из 209 наименований.

Во введении обоснована актуальность работы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость.

В первой главе диссертации проведен обзор литературных данных относительно строения и функций рецептора №1зС4, его роли в возникновении и развитии различных патологических нарушений. Рассмотрены основные препараты, применяемые для терапии данных нарушений. Показаны особенности протекания процессов получения биологически активных соединений в условиях микроволнового излучения.

Вторая глава посвящена обсуждению результатов проведенных исследований

по поиску новых эффективных антагонистов рецептора NR3C4.

В третьей главе представлены методики синтеза, исследований синтезированных соединений физико-химическими методами, определения основных кинетических параметров получения акридин-9(10Н)-онов в условиях микроволнового излучения, биотестирования. Далее представлены выводы по проделанной работе и список литературы. В приложениях к диссертационной работе приложены протоколы исследования биологической активности испытуемых соединений (приложения 1-4).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Компьютерное моделирование потенциальных антагонистов рецептора NR3C4. Для моделирования связывания веществ с рецепторами NR3C4 (докинг) и оценки энергии лиганд-белкового взаимодействия использовали программный комплекс «Алгокомб» [Ramensky, 2007]. Липофильность, степень связывания с белками плазмы крови, растворимость в воде, степень пассивного всасывания в кишечнике, токсичность (ADME/T-свойства) прогнозировали при помощи программ Accelrys Discovery Studio (DS Version 2.5.0.9167).

Для характеристики липофильности использовали коэффициент распределения концентраций препаратов между н-октанолом и водой (log Р). При выборе рекомендуемых значений исходили из предположения, что чем больше липофильность соединения, тем лучше оно будет растворяться в липидной фазе и тем больше вероятность проникновения его в клетку [Leo, А., 1971].

При определении допустимых значений степени связывания соединений с белками плазмы крови руководствовались значениями данного параметра для уже известных антагонистов рецептора NR3C4 (этинилэстрадиол, ципротерона ацетат), для которых он составляет более 90 %.

При пероральном приеме препарат должен быть абсорбирован в желудочно-кишечном тракте. Необходимыми условиями этого процесса являются адекватные водорастворимость и всасывание в кишечнике. В качестве дескриптора растворимости соединения в воде использовали логарифм величины растворимости

При расчете степени пассивного всасывания испытуемого соединения в кишечник рекомендуемым значением являлся уровень более 90 %.

Рассчитываемые параметры АЕ)МЕ-свойств и соответствующие им диапазоны рекомендуемых значений приведены в таблице 1.

Таблица 1. Рассчитываемые параметры АОМЕ-свойств и соответствующие им диапазоны рекомендуемых значений

Параметр Рекомендуемые значения

Липофильность соединения >0

Степень связывания с белками плазмы крови > 90 %

Растворимость в воде при 25°С, 1о£(8\у) -6,5 - 0

Степень пассивного всасывания в кишечнике > 90 %

Для оценки токсичности была выбрана модель, предсказывающая острую токсичность для крыс (LD5o) при пероральном введении.

Методика синтеза соединений. Синтез отобранных на основании проведенного компьютерного моделирования пептидов осуществляли с применением автоматизированного синтезатора ABI 433А по стратегии FastMoc 0,25 ммоль, подразумевающей использование полимерной подложки и FMOC-аминокислот в количестве 0,25 и 1 ммоль соответственно [ABI 433А Peptide Synthesizer, User Guide, 2004]. Модифицированные аминокислоты синтезировали жидкофазным способом химического синтеза. Синтез производных акридин-9(10Н)-она осуществляли с применением микроволнового реактора MARS.

Методика очистки полученных соединений. Очистку синтезированных соединений проводили с помощью обращено-фазовой ВЭЖХ на флеш-хроматографе PuriFlash 450 (InterChim, France) при градиентном элюировании.

Методика анализа структуры синтезированных соединений. Спектры ЯМР 'Н ацилированного аминоакридин-9(10Н)-она, ацилированных амидов и эфиров аминокислот регистрировали на спектрометре «Bruker Avance 600» (Bruker, Germany), используя в качестве растворителя ДМСО-dô. Чистоту синтезированных соединений и их молекулярную массу определяли методом масс-спектрометрии на жидкостном хроматомасс-спектрометре Acquity UPLC H-class LC (Waters, USA) со спектрофотометрическим (А. = 220 нм) и масс-спектрометрическим детекторами.

ИК-спектры испытуемых веществ регистрировали с помощью спектрометра ФСМ 1201 (Мониторинг, Россия), таблетки в КВг.

Методика проведения кинетических исследований получения замешенных акридин-9(10Н)-онов в среде концентрированной серной кислоты в условиях микроволнового излучения. Кинетические исследования проводили для реакций получения акридин-9(10Н)-она, 3-метилакридин-9(10Н)-она, 4-карбоксиакридин-9(10Н)-она, 4-нитроакридин-9(10Н)-она из соответствующих дифениламин-2-карбоновых кислот (ДФАК) в среде концентрированной серной кислоты (93,5±1%) в условиях микроволнового излучения на лабораторной микроволновой установке MARS. Выявление кинетических закономерностей процесса проводили методом отбора проб, анализ которых осуществляли при помощи количественной ТСХ с использованием высокоэффективных пластин «Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ». Проэлюированные хроматограммы регистрировали на видеоденситометре «Сорбфил» (Sorbfïl, Россия) при длине волны 254 нм. Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программы «Сорбфил 1.8». По полученным данным строили кинетические кривые расходования исходных ДФАК и определяли графическим методом константы скорости реакции и энергию активации процессов получения замещенных акридин-9(10Н)-онов в среде концентрированной серной кислоты в условиях микроволнового излучения.

Методика исследования биологической активности синтезированных соединений к рецептору NR3C4. Цикл исследований биологической активности синтезированных соединений включал определение аффиности испытуемых веществ к рецептору NR3C4 методом поляризационной спектрофлуориметрии, исследование цитотоксичности соединений методом флуоресцентной микроскопии, исследование антагонистической активности к рецептору NR3C4 наиболее аффинных и наименее токсичных веществ по их способности вызывать специфические клеточные сигналы при связывании с рецептором внутри клеток AR-UAS-bla GripTite™ 293 с регистрацией сигнала методом конфокальной микроскопии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Компьютерное моделирование потенциальных антагонистов рецептора NR3C4. Компьютерное моделирование выполнялся с целью предварительного отбора потенциальных блокаторов рецепторов NR3C4 для их последующего синтеза и биологического тестирования in vitro.

Метод компьютерного моделирования лиганд-белковых комплексов (докинг) позволяет оценивать энергию связывания вещества с заданной пространственной конфигурацией (конформацией) белка рецептора. Общепринятым источником данных о конформациях белка является база данных структур лиганд-белковых комплексов Protein Data Bank (PDB).

В настоящий момент нет прямых доказательств связи селективного антагонистического действия лигандов на рецептор NR3C4 и конформации, принимаемой белком при образовании комплекса. Исходя из предположения, что принимаемая белком конформация - это один из факторов, определяющих действие лиганда на рецептор, из базы данных PDB была выбрана конформация белка с индексом 1XNN, представляющая собой комплекс белка рецептора NR3C4 с селективным антагонистом бицикло-1Н-изоиндол-1,3(2Н)-дионом, содержащий две молекулы воды в лиганд-связывающем домене (рисунок 1).

В качестве основного режима расчета был выбран докинг в комплекс 1XNN с учетом наличия молекул воды в лиганд-связывающем домене рецептора.

Рисунок 1. Лиганд-белковый комплекс 1XNN: белок рецептора NRjC4 и селективный антагонист бицикло-1 Н-изоиндол-1,3(2Н)-дион

Вследствие малого размера лиганд-связывающего домена рецептора МЯ3С4 расчеты проводились среди 40000 соединений, относящихся к четырем группам: ацилированные амиды Ь- и Б-аминокислот, ацилированные сложные эфиры Ь- и О-аминокислот, ацилированные аминоакридин-9(10Н)-оны, ацилированные по Ы-концу ди- и трипептиды. Соединения, обладающие наилучшими расчетными характеристиками, приведены в таблице 2.

Таблица 2. Потенциальные антагонисты рецептора NR3C4 и их расчетные характеристики

Синтезированное соединение Расчетные характеристики, полученные с помощи программ Алгокомб и Accelrys Discovery Studio

№ Тип соединения R' R" Оценка энергии связывания Растворимость, log Sw Пассивное всасывание в кишечнике Связывание с белками плазмы крови IogP LD50, мг/кг

Ацилированные амиды L- и D-аминокислот

1 у «в1 о CT* чЛал H -15,59±0,77 -2,03±0,10 > 20 % > 95 % 0,71 ±0,03 23±1

2 Лхл H -15,09±0,74 0,21 ±0,01 > 20 % > 90 % 1,60±0,07 596±28

3 он /Ч \ /° R'HN NHR" CF, /-chj -1S,09±0,70 -0,03±0,I9 > 90 % > 95 % 2,92±0,14 377±I8

4 -15,03±0,74 -2,71 ±0,13 > 90 % > 90 % 1,72±0,08 5200±202

5 Лхх н -14,94±0,70 -1,81±0,09 > 90 % > 95 % 1,31 ±0,06 4400±200

6 r'nh^^o но,, ANR,, Лхл н -14,68±0,70 -1,99±0,09 > 90 % > 90 % 0,90±0,04 3200±150

7 ¿r^ Лхх -14,54±0,69 -2,03±0,10 > 90 % > 90 % 1,00±0,04 5600±278

8 ¿r^ н -14,52±0,69 -2,43±0,12 > 90 % > 90 % 1,54±0,07 5900±291

9 Ахл н. -14,51±0,68 -1,89±0,09 > 90 % > 90 % 1,22±0,05 4300±211

Ацилированные э<Ьиры L- и D-аминокислот

10 RO^O ^"^nhr" NHj Qu CF, -15,ОНО,75 -4,32±0,21 > 90 % > 95 % 4,22±0,19 369±18

и ud Sr- "rtx. -14,53±0,68 -5,61 ±0,26 > 90 % > 90 % 4,92±0,24 1200±58

Синтезированное соединение Расчетные характеристики, полученные с помощи программ Алгокомб и Accelrys Discovery Studio

№ Тип соединения R' R" Оценка энергии связывания Растворимость, log Sw Пассивное всасывание в кишечнике Связывание с белками плазмы крови logP LD50, мг/кг

12 Va -15,01 ±0,74 -5,81 ±0,27 > 90 % > 90 % 4,91 ±0,24 1100±53

13 «'V0 Va -14,53±0,68 -5,61 ±0,26 > 90 % > 90 % 4,90±0,24 1200±58

14 б''" Vor -14,69±0,72 -5,57±0,26 > 90 % > 90 % 4,62±0,22 1100±53

15 i0' er* Vtx -14,68±0,70 -4,28±0,21 > 90 % > 90 % 3,61±0,17 599±28

16 Yr/ -14,38±0,69 -5,57±0,26 > 90 % > 90 % 4,62±0,22 1100±53

17 "'о. ,о Cr so, Cr* Va -13,96±0,65 -4,28±0,21 > 90 % > 90 % 3,61±0,17 599±28

18 Va, -13,87±0,65 -5,61±0,26 > 90 % > 90 % 4,90±0,20 1200±58

19 Va -13,32±0,65 -5,81±0,27 > 90 % > 90 % 4,90±0,24 1100±53

Дампированные аминоакпидин-9Г 1 ОШ-оны

20 H -12,94±0,64 -6,33±0,30 > 90 % > 95 % 4,62±0,22 348±17

Ацилированные по N-kohiiv ди- и трипептиды

21 PhCO-Tip-Ser-NH2 -15,12±0,75 -2,18±0,08 > 20 % > 95 % 0,91 ±0,04 1500±74

2*' PhCO -Tip-Gly-NH2 -14,06±0,68 -2,58±0,12 > 90 % > 95 % 1,33±0,06 260±12

23 PhCO -Trp-Ala-NH2 -13,58±0,67 -3,05±0,15 > 90 % > 95 % 1,83±0,08 297±14

24 PhS02-Thr-Phe-NH2 -13,56±0,67 -2,47±0,12 > 20 % > 95 % 0,72±0,03 2±0,09

25 Tyr-Trp -9,18±0,45 -2,73±0,12 >20% > 95 % 0,52±0,02 315±15

26 Ac-D-Glu-D-Tyr-NH2 -9,05±0,45 -0,73±0,03 > 20 % < 90 % 0,74±0,03 35±1

27 Ac-Tyr-Pro-Ala-NH2 -8,84±0,44 -0,99±0,04 > 20 % > 90 % 0,63±0,02 10±1

28 Ac-D-Phe-D-Tyr-NH2 -8,48±0,42 -1,94±0,09 > 90 % > 90 % 1,12±0,05 83±4

29 Ac-Pro-Trp-NH2 -8,33±0,41 -2,15±0,09 > 90 % < 90 % 0,45±0,01 274±13

30 Ac-D-Tyr-Trp-NH2 -7,9б±0,39 -2,73±0,13 > 20 % > 95 % 1,44±0,06 315±15

31 Ac-D-Pro-Tyr-NH2 -7,87±0,39 -1,03±0,05 > 90 % > 95 % 0,14±0,04 36±1

32 Ac-Tyr-Pro-Pro-NH2 -7,72±0,38 -1,35±0,06 > 20 % < 90 % 0,32±0,01 10±1

Из таблицы видно, что большей энергией связывания при лиганд-белковом взаимодействии должны обладать >1-ацилированные производные аминокислот по сравнению с другими группами соединений.

Синтез соединений. В процессе докинга ациллированных амидов Ь- и Б-аминокислот (соединения 1-9, таблица 2) наилучшие расчетные характеристики были получены для транс-З-гидрокси-Ь-пролина, Ь-треонина, Ь-фенилаланина и Б-тирозина. Схема синтеза представлена на рисунке 2.

я гн к

сн Я'-СООН | т 3 1 ПН

н^^Т -^Y *HC1-r.A0 0 —И

I II III IV

1= L-Thr; L-Phe; D-Tyr; 3-OH-L-Pro

R-= сн3 ;

f

R

HN

H N-R"

DIEA; EDCI HOBt

r

NH

R"^4> °

CH,

! o04-

} CF,

Рисунок 2. Общая схема синтеза ациллированных амидов L- и D-аминокислот

Гидрохлорид метилового эфира аминокислоты (II) получали пропусканием хлористого водорода через суспензию аминокислоты в метиловом спирте при О °С. Полученный продукт ацилировали карбоновой кислотой в присутствии 1-гидроксибензотриазола (HOBt), 1Ч-этил-1Ч,1Ч-диизопропиламина (DIEA) и 1-этил-(3'-(3-диметиламино)пропил)карбодиимида (EDCI). Полученный метиловый эфир N-ацилированной аминокислоты (III) гидролизовали до целевой кислоты (IV) раствором гидроксида лития. Реакцией последней с амином в HOBt, DIEA, EDCI получали конечный амид N-ацилированной аминокислоты (V). При получении Ы-метил-1<1-{[2-(трифторметил)фенил]ацетил}-0-тирозинамида (V) метиловый эфир ]Ч-{[2-(трифторметил)фенил]ацетил}-D-тирозина (III) обрабатывали раствором метиламина в метаноле.

В соответствии со схемой (рисунок 2) было получено 9 ранее не описанных веществ.

В процессе докинга ацилированных сложных эфиров Ь- и О-аминокислот (соединения 10-19, таблица 2) наилучшие расчетные характеристики были получены для Ь-пролина, О-пролина, цис-4-гидрокси-Б-пролина и Б-аланина (рисунок 3).

„Л™—»-V—11^V— ii

О о О О R- 0

I II UI IV V

I = L-Pro; D-Pro; D-AIa; 4-OH-D-Pro

r" = Vrr'' 'm i

Рисунок 3. Общая схема синтеза ацилированных сложных эфиров L- и D-аминокислот

Аминогруппы исходных аминокислот (I) бокировали ВОС-ангидридом. Полученную ВОС-защищенную аминокислоту (II) подвергали этерификации соответствующим спиртом в присутствии 4-диметиламинопиридина (DMAP) и дициклогексилкарбодиимида (DCC) с получением эфира аминокислоты (III). ВОС-защиту с аминогруппы эфира аминокислоты (III) удаляли трифторуксусной кислотой (CF3COOH). Конечный продукт (V) получали реакцией эфира аминокислоты (IV) и соответствующей арилуксусной кислоты в присутствии карбонилдиимидазола (CDI).

В соответствии со схемой (рисунок 3) синтезировано 10 ранее не описанных соединений.

Соединение 20 (ранее не описанное) синтезировали в условиях микроволнового излучения по следующей схеме (рисунок 4):

к , со,

1 NO NO,

О^ОК ■ o oi[

Рисунок 4. Схема синтеза соединения 20

По реакции Ульмана синтезировали 2-[(2-нитрофенил)амино]бензойную кислоту (III), которую затем циклизовали в среде концентрированной серной кислоты в условиях микроволнового излучения в 4-нитроакридин-9(10Н)-он (IV). 4-нитроакридин-9(10Н)-он (IV) восстанавливали хлоридом олова в соляной кислоте до 4-аминоакридин-9(10Н)-она (V). Далее взаимодействием последнего с 1-нафтоилхлоридом в пиридине получали конечный продукт (VI).

Синтез 12 пептидов был осуществлен при помощи автоматизированного, программируемого синтезатора ABI 433А (Applied Biosystems, USA). В качестве ацилирующих агентов использовали уксусную и фенилуксусную кислоты.

Таким образом, синтезированы 32 (в том числе 20 ранее не описанных) соединения (таблица 2), показавшие наилучшие расчетные характеристики.

Физико-химический анализ синтезированных соединений. Для подтверждения структуры и чистоты синтезированных соединений использовали методы физико-химического анализа (спектроскопия ЯМР 'Н, масс-спектрометрия и ИК-спектроскопия).

Экспериментально полученные молекулярные ионы соответствовали рассчитанным молекулярным массам данных соединений (таблица 3).

Таблица 3. Результаты исследования синтезированных соединений методом масс-спектрометрии

№ образца* Молекулярная масса Внешний вид Экспериментально полученный молекулярный ион, [М+Н]+ № образца* Молекулярная масса Внешний вид Экспериментально полученный молекулярный ион, [М+Н]+

1. 414,4 Желтые кристаллы 415,2 17. 400,4 Желтое масло 401,2

2. 391,4 Белые кристаллы 392,2 18. 421,9 Бесцветное масло 422,7

3 380,3 Белые кристаллы 381,1 19. 401,5 Бесцветное масло 402,3

4. 445,5 Белые кристаллы 446,3 20. 364,4 Желтые кристаллы 365,3

5. 409,5 Белый порошок 410,3 21. 408,5 Белый порошок 409,3

6. 437,5 Белые кристаллы 438,3 22. 378,4 Белый порошок 379,2

7. 413,4 Белые кристаллы 414,2 23. 392,5 Белые кристаллы 393,3

№ образца* Молекулярная масса Внешний вид Экспериментально полученный молекулярный ион, [М+Н]+ № образца* Молекулярная масса Внешний вид Экспериментально полученный молекулярный ион, [М+Н]+

8. 429,9 Белый порошок 430,6 24. 383,4 Белые кристаллы 384,2

9. 409,5 Желтые кристаллы 410,3 25. 367,9 Белый порошок 368,7

10. 380,4 Желтое масло 381,1 26. 351,4 Белый порошок 352,2

11. 437,9 Бесцветное масло 438,7 27. 390,4 Белые кристаллы 391,2

12. 401,5 Бесцветное масло 402,3 28. 369,4 Белый порошок 370,2

13. 437,9 Желтое масло 438,7 29. 342,4 Белый порошок 343,2

14. 405,5 Желтое масло 406,3 30. 408,5 Белые кристаллы 409,2

15. 400,4 Желтое масло 401,2 31. 319,4 Белые кристаллы 320,2

16. 405,5 Бесцветное масло 406,2 32. 416,5 Белый порошок 417,3

* - формулы соединений см. в таблице 2

При подтверждении структуры синтезированных соединений использовали методы спектроскопии ЯМР 'Н и ИК-спектроскопии.

Спектры ЯМР 'Н соединений 1, 2 (таблица 2) содержат сигналы шести протонов двух СН3-групп в виде синглета (2,08 м.д.) и дуплета (1,08-1,13 м.д.), дуплет сигналов протона ОН-группы треонина в области 5,00-5,10 м.д, мультиплеты сигналов протонов имидазолидинового цикла в областях 3.15-3.21 и 3.34-3.39 м.д. В ИК-спектрах данных соединений присутствуют полосы поглощения, характерные для С-С ароматического фрагмента (область 1600-1440 см"1). Полосы в диапазоне 3200-3000 см"1 отвечают валентным колебаниям С-Н- и М-Н-связей.

В спектре ЯМР 'Н соединения 3 присутствуют синглет сигнала протона фенольной группы при 9,19 м.д., мультиплет сигнала протона амидной группы тирозина в области 7,88-7,90 м.д. ИК-спектр соединения содержит полосы поглощения, отвечающие колебаниям С-Р-связей (диапазон 1350-1100 см"1).

В спектрах ЯМР 'Н синтезированных соединений 4-9 наблюдаются мультиплеты сигналов протонов пирролидинового кольца гидроксипролина в областях 1,72-1,99, 3,42-3,76, 5,26-5,36 м.д., мультиплеты сигналов ароматических

протонов в области 6,73-7,99 м.д., синглет сигнала протона ЫН-группы в области 10,10-10,12 м.д., триплет сигнала протона амидной группы гидроксипролина в области 7,93-8,25 м.д., синглет сигнала протона группы ОН пирролидинового цикла в области 4,03-4,34 м.д. ИК-спектры соединений содержит полосы поглощения в интервале 3200-2900 см"1 характерны для валентных колебаний 14-Н- и С-Н-связей.

Спектр ЯМР 'Н соединения 10 содержит синглет трех протонов СН3-группы при 1,34 м.д., синглет сигнала протонов ОТЬ-группы при 2.89 м.д. В ИК-спеюре полученного соединения присутствуют полосы, характерные для карбонильных групп сложных эфиров (полосы поглощения в области 1750-1680 см'1). Полосы в диапазоне 1400-1000 см"1 отвечают валентным колебаниям С-Б-связей.

В спектре ЯМР 'Н соединения 11 наблюдаются мультиплеты сигналов протонов пирролидинового кольца гидроксипролина в областях 1,78-2,30, 3,27-3,82, 4,29-4,43, 4,75-4,77 м.д., синглет сигнала протона группы ОН пирролидинового цикла при 3,53 м.д. ИК-спектр соединения содержит полосы поглощения, отвечающие валентным колебаниям С-С1-связей (диапазон 1100-1020 см"1). Присутствуют полосы, характерные для связей С-С ароматического фрагмента (полосы поглощения в области 1625-1500 см"1).

В спектрах ЯМР 'Н соединений 12-19, в отличие от спектров соединений 4-9, отсутствует синглет сигнала ОН-группы пирролидинового кольца и триплет сигнала протона амидной группы пролина. Присутствуют мультиплеты сигналов протонов пирролидинового цикла в областях 1,64-1,85, 2,01-2,25 и 4,25-4,40 м.д. Наиболее характеристичными являются интенсивные сигналы карбонильных групп сложных эфиров (область 1750-1680 см"1), высокоинтенсивные сигналы С-С1- и С-Р-связей в интервале 1350-1000 см"1 на ИК-спектрах.

В спектре ЯМР 'Н соединения 20 присутствуют мультиплеты сигналов ароматических протонов в области 7,30-8,45 м.д., синглеты сигналов двух протонов 1ЧН-групп при 10,28 и 10,88 м.д. В интервале 1600-1440 см"1 ИК-спектра находятся полосы поглощения, соответствующие колебаниям связей С-С ароматического акридинового фрагмента. В области 3200-2900 см"1 присутствуют полосы поглощения, характерные для валентных колебаний С-Н- и 1М-Н-связей.

На рисунках 5 и 6 представлены спектр (таблица 2) соответственно.

ЯМР 'н и масс-спектр соединения 20

•0*0 ко'тг^согчю-о'лк-о к'о—оо-

"Т -ООЫч Мч к N «4545СП со« со

сооошооах^сосососогчк гчк N МчГчКкКККк

100 1» 233 Й0 зсо Э60

НО 6С0 6-0 ?00

Рисунок 6. Масс-спектр соединения 20

Таким образом, с применением современных физико-химических методов спектроскопии ЯМР 'Н, масс-спектрометрии и ИК-спектроскопии подтверждены

структуры синтезированных соединений. Данные масс-спектрометрии и ИК-спектроскопии рекомендуется использовать для последующей идентификации блокаторов рецептора NR3C4 с целью стандартизации лекарственных средств на их основе.

Определение кинетических закономерностей получения замещенных акридин-9(10Н)-онов в концентрированной серной кислоте в условиях микроволнового излучения. В результате проведенных кинетических исследований показано, что применение микроволнового излучения в качестве активатора химического процесса при синтезе замещенных акридин-9(10Н)-онов в среде концентрированной серной кислоты способствует сокращению времени реакции (в 3 раза при синтезе 4-карбоксиакридин-9(10Н)-она) и повышению выхода целевого продукта (на 12 %, при синтезе акридин-9(10Н)-она), по сравнению с аналогичными реакциями, проведенными при термическом способе нагрева. Использование микроволнового излучения также снижает энергию активации процесса на 1,2-23,3 кДж.

Таким образом, применение микроволновой активации в химическом синтезе является перспективным энергосберегающим способом получения биологически активных соединений.

Исследование биологической активности синтезированных соединений к рецептору NR3C4. Методом поляризационной спектрофлуориметрии исследовали аффинность синтезированных соединений по отношению к рецептору NR3C4. Метод исследования заключался в сравнительной оценке испытуемых веществ по их способности вызывать изменения поляризации флуоресценции при связывании с рецептором NR3C4 в растворе с применением коммерческого набора PolarScreen Green (Invitrogen Р3018).

По результатам скрининга наиболее аффинными по отношению к рецептору NR3C4 являлись соединения 11, 16-19. Данные вещества в концентрации 10 мкМ понижали поляризацию флуоресценции на 33-63 шР. Контрольный антагонист (ципротерона ацетат) в аналогичной концентрации снижал поляризацию флуоресценции на 159 шР.

Методом флуоресцентной микроскопии определяли неспецифическую цитотоксичность испытуемых соединений. Количество жизнеспособных клеток культуры АЛ-иАБ-Ыа Спр Гке™ 293 после инкубации с соединениями 16, 18, 19 в концентрации 1 мкМ составляло более 90 %.

Для соединений 16, 18, 19 исследовали антагонистическую активность в концентрации 1 мкМ по их способности вызывать клеточные сигналы при связывании с рецептором ОТ13С4 внутри клеток АЯ-иАБ-Ыа СпрТке™ 293 методом конфокальной микроскопии. В качестве контрольного агониста рецептора №13С4 использовали тестостерона пропионат, в качестве контрольного антагониста -ципротерона ацетат.

Клеточная культура сконструирована таким образом, что взаимодействие рецептора №13С4 с лигандом приводит к регистрируемым изменениям («зеленая» или «синяя» флуоресценция клеток). В присутствии агонистов рецептора №13С4 отмечается увеличение доли флуоресцирующих синим клеток, а в присутствии антагонистов рецептора наоборот, наблюдается преобладание «зеленой»

флуоресценции. В отсутствии лигандов рецептора ТЖ3С4 в клетках присутствует и «синяя», и «зеленая» флуоресценция (рисунок 7).

а) б) в)

Рисунок 7. Флуоресценция культуры АЯ-иАБ-Ыа йпрТйе™ 293: а) интактные клетки, б) при добавлении агониста рецептора ЫЯ3С4 (тестостерона пропионат), в) при добавлении антагониста рецептора КЯ3С4 (ципротерона ацетат)

Критерием оценки антагонистической активности испытуемых веществ являлось увеличение значения I (отношение «зеленой» флуоресценции к «синей», %) по сравнению с контролем (интактные клетки с ДМСО). Значение I для контроля принимали за 100%. Результаты эксперимента приведены на диаграмме (рисунок 8).

I, % 500

400

300 ■

200

100

НИ

Контроль Тестостерона Ципротерона

(интактные пропианат ацетат

клетки с (контрольный (контрольньй

растворителем) агонист) антагонист)

16*

18*

19*

Соединение

* - формулы соединений см. в таблице 2;

** - данные достоверно отличающиеся от показателей контрольного антагониста (ципротерон ацетата) при р<0,05.

Рисунок 8. Соотношение интенсивности «зеленой» (520 нм) и «синей» (450 нм) флуоресценции (I, % от контроля) при добавлении испытуемых соединений, контрольного агониста (тестостерона пропионат), контрольного антагониста рецептора N1^4 (ципротерона ацетат)

Из данных рисунка 8 видно, что в присутствии соединений 16, 18, 19 интенсивность специфической флуоресценции увеличивалась более, чем в 4 раза по отношению к показателю для контрольных клеток, и превышала значения контрольного антагониста (ципротерона ацетета) в 1,02-1,10 раз.

Таким образом, соединения 16, 18, 19 являются новыми эффективными антагонистами рецептора N1^04.

ВЫВОДЫ

1. Выбраны четыре группы соединений (ацилированные по Ы-концу ди- и трипептиды, ацилированные амиды Ь- и Б-аминокислот, ацилированные сложные эфиры Л- и Б-аминокислот, ацилированные аминоакридин-9(10Н)-оны) для проведения компьютерного моделирования антагонистов рецептора М1зС4.

2. Проведено компьютерное моделирование потенциальных антагонистов рецептора 1ЧЕ.зС4. Скринировано более 40000 соединений, среди которых для последующих исследований было отобрано 32 соединения, обладающих наилучшими расчетными характеристиками (высокая энергия лиганд-белкового взаимодействия, высокая липофильность, низкий уровень токсичности и др.).

3. Синтезированы 32 (в том числе 20 ранее не описанных) целевых соединения. Синтез соединений проведен с использованием автоматизированного пептидного синтезатора ABI 433А и микроволнового реактора MARS.

4. С помощью методов спектроскопии ЯМР 'Н, масс-спектрометрии и ИК-спектроскопии подтверждена структура синтезированных соединений. Данные масс-спектрометрии и ИК-спектроскопии рекомендуется использовать для последующей идентификации блокаторов рецептора NR3C4 с целью стандартизации лекарственных средств на их основе.

5. Определены основные кинетические характеристики процесса получения замещенных акридин-9(10Н)-онов в условиях микроволнового излучения. Показано, что применение микроволнового излучения способствует повышению выхода целевого продукта (на 12 %), снижению энергии активации процесса (на 1,2-23,3 кДж) и увеличению скорости реакции (до 3-х раз) по сравнению с термическим способом нагрева.

6. Изучена биологическая активность синтезированных соединений к рецептору NR3C4 путем определения аффинности, цитотоксичности и антагонистической активности. Выявлены 3 наиболее перспективных вещества, превосходящих по эффективности активации рецептора NR3C4 препарат сравнения (ципротерона ацетат) в 1,02-1,10 раз. Данные соединения рекомендованы для дальнейшего углубленного изучения с целью создания противоопухолевых лекарственных средств нового поколения.

Список сокращений

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ADME/T - всасывание, распределение, метаболизм, выделение, токсичность

ВОС - бутилоксикарбонил-

LBD - лиганд-связывающий домен

тР - единица измерения поляризации флуоресценции, миллиполяризация

NR3C4 - nuclear receptor subfamily 3, group С, member 4 - ядерный рецептор подсемейства 3, группа С, элемент 4

FMOC - флуоренилметилоксикарбонил-

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пелевин, H.A. Зависимость скорости циклизации замещенных по положениям 2 и 4 дифениламин-2-карбоновых кислот в серной кислоте от электронных свойств заместителей / H.A. Пелевин, Ю.Д. Маркович, Г.В. Назаров, С.Е. Галан, Т.Н. Кудрявцева, М.И. Брылев // Известия Академии наук. Серия химическая. - 2011. - № 3. - С. 577-580.

2. Маркович, Ю.Д. Кинетические параметры реакции внутримолекулярной конденсации дифениламин-2-карбоновых кислот в условиях микроволнового излучения / Ю.Д. Маркович, Т.Н. Кудрявцева, М.И. Брылев, H.A. Пелевин, В.Ю. Маркович, И.А. Королева // Журнал общей химии. - 2012. - Вып. 82, № 1. - С. 149152.

3. Брылев, М.И. Поиск новых эффективных блокаторов рецептора NR3C4 / М.И. Брылев, Г.В. Раменская, Д.С. Лоторев, Е.С. Мухачева, Н.Б. Кузнецова, Л.А. Павлова, А.Ю. Лизунов, H.A. Пелевин // Сб. докл. VI Российского симпозиума «Белки и пептиды»,- Уфа. - 2013. - С. 192.

4. Брылев, М.И. Новые антагонисты рецепторов NR3C4 / М.И. Брылев, Г.В. Раменская, Д.С. Лоторев, Е.С. Мухачева, Н.Б. Кузнецова, Л.А. Павлова, H.A. Пелевин, A.A. Алексеев, А.Ю. Лизунов // Сб. докл. I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации». - Санкт-Петербург. - 2013. - С. 27-28.

5. Брылев, М.И. Поиск антагонистов рецепторов NR3C4 методом молекулярного моделирования / М.И. Брылев, Г.В. Раменская, Д.С. Лоторев, Е.С. Мухачева, Н.Б. Кузнецова, Л.А. Павлова, H.A. Пелевин, A.A. Алексеев, А.Ю. Лизунов // Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье". -2014. - № 1.-С. 10-18.

6. Брылев, М.И. Математическое моделирование и синтез потенциальных антагонистов рецептора NR3C4 / М.И. Брылев // Сб. докл. Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2014».- Москва. - 2014.

7. Брылев, М.И. Поиск антагонистов рецептора NR3C4 / М.И. Брылев, Г.В. Раменская, Д.С. Лоторев, Е.С. Мухачева, Н.Б. Кузнецова, Л.А. Павлова, А.Ю. Лизунов, H.A. Пелевин // Молекулярная медицина. - 2014. -№ 3. - С. 28-33.

8. Брылев, М.И. Молекулярное моделирование антагонистов рецепторов NR3C4 / М.И. Брылев, А.Ю. Лизунов, Д.С. Лоторев, H.A. Пелевин // Сб. докл. XVII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием) «Фундаментальная наука и клиническая медицина -человек и его здоровье». - Санкт-Петербург. - 2014. - С. 64-65.

9. Брылев, М.И. Исследования биологической активности потенциальных антагонистов рецептора NR3C4 / М.И. Брылев, Г.В. Раменская, Д.С. Лоторев, Е.С. Мухачева, Н.Б. Кузнецова, Л.А. Павлова, А.Ю. Лизунов, H.A. Пелевин // Сб. докл. научно-практической конференции «Новые химико-фармацевтические технологии» - Москва. - 2014. - С. 140-142.

10. Брылев, М.И. Исследования биологической активности потенциальных антагонистов рецептора NR3C4 / М.И. Брылев, Г.В. Раменская, Д.С. Лоторев, Е.С. Мухачева, Н.Б. Кузнецова, Л.А. Павлова, А.Ю. Лизунов, H.A. Пелевин, О.Ю. Домашева // Бутлеровские сообщения. - 2014. - Т.38, № 4. - С. 48-52.

Подписано в печать: 09.12.2014 Тираж: 100 экз. Заказ № 1299 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru