Автореферат и диссертация по медицине (14.00.40) на тему:Современные аспекты диагностики, мониторинг и факторы прогноза риска предстательной железы

На правах рукописи

Морозов Андрей Петрович

СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ ДИАГНОСТИКИ, МОНИТОРИНГ И ФАКТОРЫ ПРОГНОЗА РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.00.40 - урология 14.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

ООЗ175544

Москва - 2007

003175544

Работа выполнена в Государственном учреждении Московском облает ном научно-исследовательском клиническом институте им. М.Ф.Владимирского.

Научные консультанты:

академик РАМН, д м н, профессор Маргарита Федоровна Трапезникова

член-корреспондент РАМН, д м н, профессор Николай Евгеньевич Кушлинский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.II. Авдошин

заведующий кафедрой урологии и оперативной нефрологии

медицинского факультета Российского университета Дружбы народов

доктор медицинских наук, профессор А.Г. Мартов

заместитель директора ФГУ НИИ «Урологии» Росмедгехнологий

доктор биологических наук, профессор Н.С. Сергеева

руководитель лаборатории прогноза эффективности консервативного лечения опухолей ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им П А Герцена» Росмедгехнологий

Ведущая организация: ФГУ Российский научный центр рентгенорадиологии Росмедтехнологий

Защита диссертации состоится «С» ^^ 2007г. в « / У» часов на заседании Диссертационного совета №208.049.01 при Московском областаом научно-исследовательском клиническом институте им. М Ф Владимирского по адресу Москва, ул. Щепкина, 61/2, корп 15, конференц-зал

С диссертацией можно ознакомиться в научно - медицинской библиотеке ГУ МОНИКИ им М Ф Владимирского

Автореферат разослан «^» /О 2007г Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Астахов П.В.

Список условных сокращений

Дпид - дезоксипиридинолин

ДГПЖ - доброкачественная гиперплазия предстательной железы

ЖХВР - жидкостная хроматография высокого разрешения

игх - иммуногистохимический метод

ИЛ-6 - интерлейкин-6

ИФА - иммуноферментный анализ

КФНТ - кислая фосфатаза, неингибируемая тартратом

Пид -пиридинолин

ПИН II - простатическая интраэпителиальная неоплазия II типа

ПКФ - простатическая кислая фосфатаза

ПСА - простатический специфический антиген

ПРИ - пальцевое ректальное исследование

РА - рецепторы андрогенов

РИА - радиоиммунный анализ

РПЖ - рак предстательной железы

РЭФР - рецептор эпидермального фактора роста

ТРУЗИ - трансректальное ультразвуковое исследование

ТУР - трансуретральная резекция

УЗИ - ультразвуковое исследование

5а-ДГТ - 5а-дигидротестостерон

17Р-ГСР - 17р-гидроксистероидредуктаза ЕвР - эпидермальный фактор роста аЖвГ - кислый фактор роста фибробластов ЬРвГ - основной фактор роста фибробластов

НЕ1*-2/пе11 - рецептор эпидермального фактора роста НЕЯ-2/пеи (с-егЬ2) ЮП - инсулиноподобный фактор роста I типа ШР2 - инсулиноподобный фактор роста II типа

ЮЕВР1,3 - белки 1 и 3 типа, связывающие инсулиноподобные факторы роста

Ю-67 - антиген пролиферативной активности

УЕСК - фактор роста эндотелия сосудов

ИУЕСР - рецептор фактора роста эндотелия сосудов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Проблема рака предстательной железы (РПЖ) в настоящее время считается одной из наиболее актуальных, так как среди злокачественных новообразований мочеполовых органов этот вид опухоли выявляется наиболее часто (JI М.Гориловский и соавт, 1999, Н А Лопаткин, 1999, В А Соловов, 2006) По данным отечественных и зарубежных авторов (Е М.Аксель, 2005, М И.Давыдов и соавт, 2006, Boyle Р et al, 1999) РПЖ занимает второе место с постоянной тенденцией к росту в последнее десятилетие, уступая первое место меланоме Высокие показатели летальности при РПЖ обусловлены длительным скрытым и бессимптомным развитием опухолевого процесса. При этом уже при первичном обращении от 60 до 80% больных имеют отдаленные метастазы (Б.В Бухаркин, 1999; А.М.Гарин, 2005) Кроме того, по данным ряда авторов через 18-25 месяцев после начала антиандрогенной терапии у большинства больных развивается гормонорезистентносгь опухоли и, как следствие, прогрессирование ее роста и метастазирование (В И Киселев и соавт, 2007) Эти факторы объясняют низкую выживаемость данного контингента больных и являются ведущей причиной смерти от РПЖ (А В Важенин и соавт, 2006).

Этиология РПЖ до настоящего времени не изучена Патогенетические механизмы активно исследуются и направлены на изучение «биологического» поведения опухоли с использованием современных молекулярно-биологических маркеров Задачей специалистов, работающих в данной области, является определение того набора наиболее значимых и дополняющих друг друга показателей, который бы позволил (при минимально возможной стоимости обследования) обеспечить максимальную эффективность лечения каждого больного

Одним из наиболее важных направлений в исследовании РПЖ является изучение метаболизма андрогенов в опухоли (ВГДегтярь и соавт, 2000) В настоящее время есть все основания полагать, что гормональное действие андрогенов в большинстве тканей-мишеней осуществляется не столько теми андрогенами, которые поступают в них из крови, сколько за счет образования активных метаболитов в самих тканях, в первую очередь андрогена-эффекгора (Shaw G et al, 2000). Из крови в ткань поступают неактивные андрогены-предшественники, источником которых являются стероидогенные ткани - половые

железы и надпочечники Качественный и количественный состав андрогенов в ткани-мишени зависит не только от секреции их половыми железами и надпочечниками, но и от активности ферментов метаболизма андрогенов в этой ткани, что обусловливает содержание каждого отдельного андрогена в клетке-мишени (ВГДеггярь, 1992) Для метаболизма андрогенов и для механизма их действия чрезвычайно важно превращение тестостерона (Т) в 5а-дигидротестостерон (5а-ДГТ) при участии фермента 5а-редуктазы (5а-Р), поэтому иногда этот фермент называют «ключевым» ферментом метаболизма андрогенов (В Г Дегтярь и соавт, 2000, Bruchovsky N, 1997) Важную роль во многих случаях играет фермент 17р-гидроксистероидредуктаза (17р-ГСР), в первую очередь во взаимном превращении Т и А4, и Е2, ДЭА и Д5-Зр-диол, при биосинтезе андрогенов и эстрогенов как в половых железах, так и в периферических тканях (Labne F et al, 1994, Bonney RC et al, 1996, Penning TM, 1997) Этот фермент проявляет преимущественно редуктазную активность, однако при некоторых патологических состояниях в периферических тканях соотношение редуктазной и дегидрогеназной активностей 17Р-ГСР может значительно изменяться, что имеет важное значение при канцерогенезе (Labne F. et al, 1994, Hakimi J M et al, 1997, El-AlfyM etal, 1999)

В настоящее время большое внимание уделяется проблеме неоангиогенеза в злокачественных новообразованиях, так как показана тесная связь между активностью процессов ангиогенеза в первичной опухоли и ее склонностью к инвазивному росту и метастазированию (С.В Луценко и соавт, 2005; Ferrara N, 1997, Muzzucchelli R, 2000) При РПЖ этой проблемой стали активно заниматься в последнее десятилетие и получены предварительные данные о важном клиническом значении этого показателя

Несмотря на то, что простатический специфический антиген (ПСА) считается общепризнанным опухолевым маркером, и широко используется в диагностике и мониторинге РПЖ, фактором, ограничивающим использование ПСА в ранней диагностике РПЖ, является его низкая специфичность, обусловленная повышением концентрации маркера в сыворотке крови при неопухолевых заболеваниях ПЖ, а также у здоровых мужчин в пожилом возрасте (JIМ Гориловский, 1999) Исследователи предлагают одновременно определять активность ПСА и VEGF, что по предварительным данным может иметь значение в

дифференциальной диагностике РПЖ, однако это требует дальнейших исследований

Одними из мощных аутокринно-паракринных регуляторов роста раковых клеток считаются инсулиноподобные факторы роста I и П типов (IGF1, IGrF2), которые непосредственно стимулируют процессы репликации и дифференцировки опухольтрансформировашшх клеток (Grimberg А. et al, 1999; Cohen Р, 2000) В литературе обсуждается возможность индукции роста злокачественных опухолей, в том числе и РПЖ, под действием IGF1 и IGF2 (Jose F. Сага, 1994) Кроме того, в литературе появились первые сообщения о том, что IGF наряду с ПСА могут быть использованы в дифференциальной диагностике РПЖ и доброкачественной гиперплазии (ДГГТЖ) Также известно, что IGF циркулируют в организме в комплексе с высокоспецифичными IGF связывающими белками (IGFBP), известно 10IGFBP, и доказано, что они присутствуют в тканях и плазме крови (Rechler М М et al., 1992) Показано, что IGFBP специфически связывают IGF1 и IGF2 и в различной степени снижают их биологические эффекты, поэтому 1GFBP рассматривают как модуляторы физиологических функций IGF IGF осуществляют свои эффекты путем связывания со специфическими рецепторами, имеющимися на поверхности клеток. В настоящее время описано два вида IGF рецепторов, I тип -рецепторы IGF-I и IGF-П тип - рецепторы IGF-II/манозо-б-фосфата (Rechler М М et al, 1985) Связывание гормонов с описанными рецепторами приводит к активации процессов митоза, влияет на метаболизм в клетках-мишенях, непосредственно стимулирует процессы репликации и дифференцировки (Е.Г Зезеров, 1999) Несмотря на активные экспериментальные и клинические исследования, однозначного понимания роли IGF-подобных пептидов и их рецепторов при РПЖ до сих пор нет

По данным клинических исследований 54-85% первичных больных РПЖ имеют метастазы в кости, которые чаще всего поражают кости таза, пояснично-крестцовый отдел позвоночника, что приводит к опасным для жизни осложнениям и в конечном итоге к гибели больных. Появление новых эффективных подходов к лечению метастазов в кости делает весьма актуальной проблему своевременной их диагностики Используемые для этого в клинической практике рентгенологические и радиоизотопные методы исследования скелета обладают недостаточной чувствительностью и специфичностью (М А Чибисова, 1993; Tubiana-Hulm М,

1991) По данным литературы, межмолекулярные пиридиновые связи коллагена, пиридинолин (Пид) и дезоксипиридинолин (Дпид), экскретирующиеся с мочой в составе коллагеновых фрагментов при деструкции костного матрикса, являются объективными критериями интенсивности костной резорбции при заболеваниях скелета метаболического характера (Seibel M J et al, 1992, Robins S P et al, 1995) Сведения литературы, касающиеся изучения пиридиновых связей коллагена при метастатическом поражении скелета у больных РПЖ немногочисленны, а их клиническая значимость продолжает изучаться (Coleman R.E. et al, 1992)

Другим наиболее экспериментально и клинически изученным биохимическим маркером костного метастазирования является активность щелочной фосфатазы (ЩФ) и, прежде всего, ее костного изофермента (Withold W et al, 1996, Woitge H W et al, 1996). Несмотря на общее признание этого фермента как рутинного теста, до настоящего времени не существует единого мнения о специфичности и взаимосвязи изменений ЩФ с другими биохимическими и клиническими критериями метастатического поражения скелета при РПЖ.

Определенный прорыв в области практического использования маркеров, связанных с РЭФР-зависимой регуляцией роста рака произошел после появления препарата Герцептин, представляющего собой гуманизированные антитела к HER2/neu - одному из рецепторов семейства ЕгЬВ, к которому принадлежит и РЭФР (Foekens J A et al., 1989, Coradini D et al, 2001) Блокирование HER2/neu может существенно замедлить или остановить рост опухолей, зависимых от подобных стимулов. Однако, эффективное использование биологически активных препаратов предусматривает предварительную оценку индивидуальной чувствительности больных к данному виду лечения В случае Герцептина общепринятым и наиболее адекватным методом оценки чувствительности является использование иммуногистохимического окрашивания опухолевых тканей на белок HER2/neu (р185) с последующей оценкой амплификации гена с-егЬВ-2 методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) (Foekens JA et al, 1991) Единого мнения о прогностической ценности HER2/neu при РПЖ пока нет (Andreasen Р.А et al, 1990, Coradmi D et al., 2001) Поэтому представляет интерес исследование экспрессии HER2/neu при РПЖ.

Одной из наиболее важных характеристик опухоли является потенциал ее пролиферативной активности (В X Хейфец и соавт, 2004) Стало известным, что

пролиферативный антиген К>67, тесно связан с биологически агрессивным поведением ряда опухолей, при этом выявлена значительная связь ме.кду показателем экспрессии антигена Кь67 в опухоли и временем прогрессирования заболевания, метастатическим статусом что, вероятно, может иметь клиническое значение при РПЖ.

Учитывая важность проблемы РПЖ, а также появление современных методологических подходов к оценке «биологического» поведения опухоли, проведение настоящего исследования является крайне актуальным не только для практического здравоохранения, но и для более глубокого понимания роли рада эндогенных факторов в патогенетических механизмах развития и прогрессирования заболевания

Цель настоящего исследования - определение клинического значения и возможности использования новых молекулярно-биологических маркеров в диагностике, мониторинге и оценке прогноза рака предстательной железы.

Задачи исследования:

1 Оценить с помощью иммуногистохимического метода исследовшшя чувствительность злокачественных опухолей предстательной железы к андрогенам (на основании выявления рецепторов андрогенов в цитозольной фракции биоптатов новообразований предстательной железы) с учетом основных клинмко-морфологических характеристик заболевания.

2 Провести сравнительное исследование общей редукгазной активности 17(3-ГСР (превращение А4 в Т) и дегидрогеназной активности 17Р-ГСР (превращения Т в А4) в растворимой фракции биоптатов доброкачественной гиперплазии и рака предстательной железы

3 Проанализировать корреляционные связи между общей редукгазной и дегидрогеназной активностями 17р-ГСР в растворимой фракции биоптатов доброкачественной гиперплазии и рака предстательной железы с уровнями общего тестостерона, 5 а-дигидротестостерона и андросгендиона в сыворотке крови этих больных

4 Изучить показатели индекса пролиферативной активности при анализе уровней экспрессии К1-67 в ядрах клеток рака предстательной железы и сопоставить его с основными клиническими, морфологическими и

биохимическими методами исследования. Оценить частоту выявления экспрессии рецептора эпидермального фактора роста - Нег-2/пеи

5 Определить уровень ключевого активатора ангиогенеза - фактора роста эндотелия сосудов (\TEGF) в сыворотке крови больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы и сравнить их с уровнем этого фактора роста у практически здоровых мужчин (группа контроля) Установить связь уровней УЕСР в сыворотке крови у больных раком предстательной железы с основными клиническими и морфологическими характеристиками заболевания, стадией опухолевого процесса, возрастом пациентов, гистологическим строением и степенью дифференцировки новообразования (градация Глисона), прогнозом заболевания

6 Провести сравнительное исследование уровней инсулиноподобных факторов роста (ЮР1, ГСР2), белков сыворотки крови, связывающих инсулиноподобные факторы роста (ЮРВР1 и ЮРВРЗ) у больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы, а так же проанализировать их взаимосвязь с УЕОБ и соотношением УЕОБ/ЮР1, УЕОР/ЮР2, с показателями ПСА и соотношением ЮТШСА, ЮР2/ПСА в диагностике и оценке прогноза рака предстательной железы

7 Исследовать уровни общего и свободного ПСА, их соотношение в сыворотке крови больных раком предстательной железы и сопоставить эти показатели с уровнем УБвР Оценить соотношение УБвР/ПСА как возможного маркера в выявлении данного заболевания

8 Методом жидкостной хроматографии высокого разрешения оценить экскрецию с мочой маркеров костного ремоделирования (пиридинолина и дезоксипиридинолина) у больных раком предстательной железы с костными метастазами и без метастазов и сравнить их с этими показателями у больных доброкачественной гиперплазией предстательной железы и группой практически здоровых мужчин

Научная новизна исследования

Впервые в отечественной литературе на достаточном клиническом материале одновременно проведено определение ряда молекулярно-биологических маркеров в сыворотке крови УЕвР, ПСА, ЮР1, ЮР2, ЮРВР1, ЮРВРЗ, щелочная фосфатаза, общий тестостерон, 5 а-дигидротестостерон, андростендион, в

опухолях редукгазная и дегидрогеназная активности 17Р-ГСД, уровни экспрессии Нег-2/пеи, рецепторов андрогенов, антигена пролиферативной активности Ю-67, в моче пиридинолин, дезоксипиридинолин у больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы

Полученные нами впервые сравнительные данные по определеаию редуктазной активности 17р-ГСД в опухолях предстательной железы позволяют заключить, что высокая редукгазная активность 17р-ГСД может быть связана с развитием РПЖ.

Определение уровней \ТЮР, ЮР1, ЮР2, ЮБВР! в сыворотке крови больных можно использовать в качестве молекулярных маркеров вместе с уровнем общего ПСА при диагностике РПЖ. Кроме того, изучение уровня выше указанных маркеров свидетельствует о возможном использовании 'этих показателей у мужчин в возрасте старше 40 лет с целью более раннего выявления РПЖ Показано, что с прогнозом РПЖ достоверно связаны исходные концентрации общего ПСА (р=0,001) и УЕОБ (р=0,001) в сыворотке крови.

Это позволило на основании анализа полученных клинических, морфологических и биохимических данных доказать значимость молекул« рно-биологических маркеров в диагностике, мониторинге и прогнозе рака предстательной железы

Практическая значимость исследования

Показано, что совместное определение в сыворотки крови УЕОБ и общего ПСА позволяет улучшить клиническую диагностику РПЖ на добиопсийном эгапе, особенно при уровне ПСА более 10 нг/мл и \nEGF менее 160 пг/мл. Также, у больных РПЖ целесообразно исследование концентрации ЮР1, так как у данной категории пациентов уровень ЮР1 в сыворотке крови прямопорпорционгльно коррелировал со значениями общего ПСА. При этом показано, что использование пороговых значений общего ПСА (10 нг/мл), \ТЮР (160 пг/мл) и ЮРВР1 (65 нг/мл) позволило выработать алгоритм диагностических решений Следовательно, применение вышеуказанных маркеров дает возможность определения индивидуальной вероятности правильного диагноза до выполнения биопсии Кроме того, трактовка этих Показателей у мужчин в возрасте старше 40 лет

помогает раннему выявлению РПЖ, и, стало быть, может способствовать более эффективному лечению этих пациентов и улучшению качества их жизни Кроме того, при многофакторном анализе обнаружено, что с прогнозом РПЖ достоверно связаны показатель Глисона (р=0,001), исходные концентрации общего ПСА (р=0,001) и VEGF (р=0,001) в сыворотке крови Также убедительно доказано, что первичным методом диагностики метастатического поражения костей при РПЖ является определение экскреции пиридинолина и дезоксипиридинолина в моче, так как их концентрация свидетельствует о высокой диагностической специфичности при деструктивных процессах в костях. При этом, положительная иммуногистохимическая реакция на рецепторы андрогенов в преобладающем большинстве биоптатов злокачественных опухолей предстательной железы -весьма важный маркер при уточнении гистогенеза метастатического очага поражения в костях, когда не выявлен первичный источник опухоли

Таким образом, на основании молекулярно-биологических исследований уровней VEGF, ПСА, IGF1, IGF2, IGFBP1, IGFBP3, щелочной фосфатазы, общего тестостерона, 5 а-дигидротестостерона, андростендиона - в сыворотке крови; показателей экспрессии рецепторов андрогенов, антигена пролиферативной активности Ki-67 и Her-2/neu, редуктазной и дегидрогеназной актавностей 17р-ГСД - в опухоли, уровня экскреции пиридинолина, дезоксипиридинолина - в моче доказано практическое значение выше указанных маркеров в диагностике, мониторинге и оценке прогноза рака предстательной железы

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены на конференции «Национальные дни лабораторной медицины России-2004» (Москва, 20-22 октября 2004г.), на XII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 18-22 апреля 2005г); на конференции «Национальные дни лабораторной медицины России-2005» (Москва, 10-14 октября 2005г), на 16th International Congress on Anti-cancer Treatment (Париж, 1-4 февраля 2005г), на VI Всероссийском съезде онкологов «Современные технологии в онкологии» (Ростов-на-Дону, 11-15 октября 2005г ), на П Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 20-21 октября 2005г), на IX Российском онкологическом конгрессе (Москва, 22-24 ноября 2005г.), на ХШ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006г), на

международной научно-практической конференции «Ведущий многопрофильный госпиталь страны основные функции, достижения и направления развитая» (Москва, 1-2 июня 2006г); на XIV Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007г)

Апробация диссертации проведена 14 декабря 2006г на совместной научной конференции отделения урологии, кафедры урологии, кафедры онкологии и торакальной хирургии факультета усовершенствования врачей Московского областного научно-исследовательского клинического института им М Ф Владимирского и лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ Российского онкологического научного центра им ННБлохина РАМН

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликована 21 научная работа Структура и объем работы

Диссертация написана на 208 страницах машинописного текста, включает введение, обзор данных литературы, глав «Материалы и методы исследования» и «Результаты собственных исследований», обсуждение полученных данных, выводы и список цитируемой литературы, который состоит из 38 работ отечественных и 264 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 58 рисунками

Внедрение результатов исследования в практику.

Предложенные молекулярно-биологические маркеры внедрены в работу урологического отделения МОНИКИ им М Ф.Владимирского, в медицинском центре «Центр здоровья и реабилитации» г Москвы, в медицинском центре «Столичный доктор» г Москвы; в урологическом отделении ГКБ № 20 г Москвы Основные положения, выносимые на защиту

1. Уровни общего ПСА в сыворотке крови больных ДГПЖ и РПЖ достоверно различались При пороговом значении общего ПСА равном 10 нг/мл ошибочная классификация в группе ДГПЖ составляет 22,2%, в группе РПЖ - 22,4%

2 У больных ДГПЖ уровень общего ПСА в сыворотке крови повыпщется после 70 лет, у больных РПЖ - после 60 лет При однородном варианте

гистологического строения РПЖ уровень общего ПСА в сыворотке крови был достоверно ниже, чем при смешанных гистологических вариантах опухоли

3 У больных ДГГОК коэффициент соотношения УЕОР/ПСА достоверно выше, чем при РПЖ

4. При длительности анамнеза заболевания от одного года и более значения ЮР1 в сыворотке крови больных РПЖ выше, чем при ДГПЖ, а также при наличии сопутствующих заболеваний у больных обеих групп по сравнению с их отсутствием

5 Концентрация ЮР2 в сыворотае крови практически здоровых мужчин достоверно выше, чем у больных ДГПЖ и РПЖ.

6 Соотношение ЮРВР1/ПСА высокодостоверно различается между больными РПЖ и ДГПЖ При уровнях ГОРВР1 до 65 пг/мл и ПСА до 10 нг/мл в сыворотке крови точность диагностики РПЖ составляет 100%

7 При длительности анамнеза заболевания от одного года и более у больных РПЖ концентрация ЮРВРЗ в сыворотке крови достоверно выше, чем при ДГПЖ

8 Определение концентрации \ТЮР в сыворотке крови при значениях общего ПСА более 10 нг/мл, а уровня ШРВР1 - при значениях ПСА до 10 нг/мл в сыворотке крови позволяет с минимальной вероятностью ошибки уточнить клинический диагноз РПЖ у 50% пациентов с этим заболеванием

9 Значение уровней \ТЮР, ЮР1, ЮР2, ЮРВР1 в сыворотке крови, а также соотношения ЮРВР1/ПСА у больных вместе с уровнем общего ПСА можно использовать в качестве дополнительных молекулярных маркеров в диагностике РПЖ, а показатели УЕвР и общего ПСА в оценке прогноза безрецидивной выживаемости, на ряду с общепринятым критерием Глисона

10 Редуктазная активность 17р-гидроксистероиддегидрогеназы в РПЖ на порядок выше по сравнению с ДГПЖ Общая активность 170-гидроксистероиддегидрогеназы в растворимой фракции тканей РПЖ прямо пропорциональна концентрации 4-андростен-3,17-диона в сыворотке крови больных

11 У больных РПЖ с метастазами в костях экскретируемые с мочой пиридиновые связи в составе коллагеновых фрагментов при деструкции

костного матрикса выше, чем у больных без признаков поражения скелета, больных ДГПЖ и практически здоровых мужчин соответствующего возраста. Диагностическая эффекшвность выявления метастазов РПЖ в костях высока при определении уровней экскреции пиридинолина и дезоксипиридинолина в моче этих пациентов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика больных

В исследовании включено 178 пациентов с новообразованиями предстательной железы в возрасте от 48 до 83 лет, которые обследовались и получали лечение в клинике урологии МОНИКИ им М Ф Владимирского в период с января 2001 по март 2006 гг Диагноз у всех пациентов установлен впервые и подтвержден данными гистологического исследования У большинства больных выявлен мелкоацинарный РПЖ

Больные с новообразованиями предстательной железы были разделены на 2 группы, 1-я группа - 52 больных ДГПЖ (средний возраст 66,9±2,7 лет) и 2-я гр уппа - 126 больных РПЖ (средний возраст 66,4±1,2 лет). Группу контроля составили 85 практически здоровых мужчин (средний возраст 64,5±2,2 лет) В группе больных ДГПЖ медиана длительности анамнеза составила 12 месяцев, в группе больных РПЖ - 11 месяцев

Табли да 1.

Степень дифференцировки РПЖ по Глисону__

Степень Количество наблюдений Частота выявления

дифференцировки (Абс.) (%)

(баллы)

4 13 10,3

5 18 14,3

6 40 31,8

7 42 33,3

8 13 10,3

Как видно из данных таблицы 1, наибольшее число больных РПЖ имело степень дифференцировки опухоли по Глисону равную 6-7

Основные методы биохимического анализа Определение биохимических показателей сыворотки крови

До выполнения ТРУЗИ, ПРИ и биопсии и не ранее чем через две недели после последнего ПРИ, ТРУЗИ у больных брали 25 мл венозной крови Взятие крови осуществляли в чистую, сухую пробирку, кровь отстаивали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Отобранную сыворотку немедленно анализировали или разделяли на аликвоты по 3 мл и замораживали при температуре -20°С Заготовленные образцы сыворотки размораживали однократно непосредственно перед исследованием В сыворотке крови определяли содержание общего ПСА, VEGF, IGFBP1, IGFBP3, IGF1, IGF2, общего Т, 5а-ДГТ, A4, и общую активность щелочной фосфатазы (ЩФ)

Определение концентрации общего простатического специфического

антигена в сыворотке крови Концентрацию общего ПСА определяли в образцах сыворотки крови при помощи гетерогенного одноступенчатого иммуноферментного анализа «Enzym um -Test PSA» («Boehnnger Mannheim», Германия) на основе стрептавидиновой технологии с применением двойных моноклональных антител, высокоспецифичных для общего ПСА, связанного с ингибитором протеиназ al-химотрипсином Определение концентрации общего ПСА проводили на автоматическом иммуноферментном анализаторе ES300 («Boehnnger Mannheim», Германия) Принцип метода основан на связывании ПСА, находящегося в сыворотке крови больного, с моноклональными биотинилированными антителами, в свою очередь связывающимися с покрывающим пробирки стрегггавидином, и последующим связыванием с антителами в составе конъюгата (ПСА-пероксидаза) Конечные результаты оценивали по интенсивности окраски, развивающейся в процессе конъюгации со специфическим хромогеном ABTS Построение калибровочных кривых проводили при использовании пяти стандартов с концентрацией ПСА: 0,0, 0,47, 1,88; 10,28; 53,41 нг/мл Для кошроля каждой серии исследовали 2 образца, стандартизованных по концентрации ПСА низкого (1,351,85 нг/мл) и высокого (11,2-15,2 нг/мл) уровней

В соответствии с рекомендациями фирмы, разработавшей эту технологию, и литературными данными в качестве порогового значения для общего ПСА была принята концентрация 4 нг/мл

Определение концентрации инсулиноподобных факторов роста и транспортирующих их белков в сыворотке крови

Концентрацию IGF1 и IGF2 определяли в сыворотке крови натощак иммуноферментным методом при использовании наборов реактивов фирмы «DSL» (США) и автоматического ридера Е1х800 («Biotek Instruments Inc », США)

Концентрацию IGFBP1 и IGFBP3 в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом при использовании наборов реактивов фирмы «DSL» (США)

Определение концентрации VEGF в сыворотке крови

Концентрацию свободного фактора роста эндотелия сосудов определяли в сыворотке крови Исследование проводили иммуноферментным методом «сэндвичевого» типа с использованием стандартного набора реактивов «Quantikme human VEGF» («R&D Systems Inc », США) Принцип метода основан на связывании свободного VEGF, находящегося в сыворотке крови больного, с моноклональными антителами мышей, покрывающими стенки пробирок, и биотинилированными поликлональными кроличьими антителами к человеческому VEGF, в свою очередь связывающимися с стрептавидином, конъюгированным со щелочной фосфатазой Конечные результаты оценивали по интенсивности окраски, развивающейся в процессе конъюгации со специфическим хромогеном, используя компьютерную программу для анализа результатов иммуноферментного анализа Все измерения проводили на автоматическом универсальном ридере для микропланшет Е1х800 фирмы «Bio-Tek Instruments, Inc » (США).

Определение концентрации общего тестостерона в сыворотке крови

Концентрацию общего тестостерона (Т) определяли в образцах сыворотки крови при помощи конкурентного иммунологического анализа на основе прямой хемилюминесцентной технологии при использовании тест-системы «ACS 180 Testosteron» («Bayer», США) Определение концентрации гормона проводили на автоматической хемилюминесцентной системе ACS 180 («Bayer», США)

Количественное определение метаболитов андрогенов при изучении

метаболизма

Биоптаты РПЖ массой 100-150 мг растирали в фарфоровой ступке в жидком азоте и добавляли Na-фосфатный буфер (0,01 моль/л, pH 7,4) во льду из расчета 1 мл буфера на 200 мг ткани Гомогенат центрифугировали при 5000g с охлаждением

в течение 10 мин (центрифуга Optima TM TLC, «Beckman», США) Надосадочную жидкость использовали для определения активности ферментов метаболизма андрогенов и определения общей концентрации белка по Лоури

В стеклянные пробирки 12x70 мм вносили 10 мкл раствора (смесь бензола-этанола, 9 1) очищенного [3Н]андрогена (индикаторной дозы - 8000-12000 имп/мин) и 10 мкл этанольного раствора немеченых A4 или Т, соответственно, необходимой концентрации, которую выбирали с таким расчетом, чтобы конечная концентрация субстрата в пробе составляла 10"7 моль/л Дополнительно в пробы добавляли прогестерон до конечной концентрации 30 мкмоль/л для подавления активности 5а-Р Растворитель выпаривали на водяной бане при температуре не выше 60°С Во льду в пробирки вносили 50 мкл гомогената (в контрольную пробу - 50 мкл фосфатного буфера) и 50 мкл раствора (в фосфатном буфере), содержащего 10 мкг D-глюкозы, по 25 мкг НАДН и НАДФН или НАД* или НАДФ+ После инкубации в водном термостате при 37°С в течение 30 мин к каждой пробе добавляли 10 мкл 1N соляной кислоты и 10 мкл этанольного раствора немеченых андрогенов с концентрацией 1,0 мг/мл определяемого метаболита и пробы лиофилизовали К сухому остатку добавляли 10 мкл смеси бензол-этанол абсолютный (9'1, по объему), наносили на хроматографические пластинки с тонким слоем силикагеля 70-80 мкл раствора каждой пробы, хроматографировали трижды в системе бензол-ацетон-этанол абсолютный (9 1 0,5, по объему), высушивали пластинки 10 мин при температуре 120° и проявляли в насыщенных парах йода Пятна соответствующих андрогенов вырезали, помещали в сцинтилляционные флаконы, инкубировали 10 мин с 0,5 мл метанола, добавляли 5 мл сцинтилляционной жидкости, радиометрировали на спектрометре LS 6500 («Beckman», США) и рассчитывали количество метаболитов андрогенов, образованных 1 мг общего белка гомогената (надосадочной жидкости) Активность ферментов выражали в пкмолях соответствующего метаболита, образованного 1 мг общего белка гомогената за 30 мин

Сбор и обработка мочи Исследование маркеров резорбции костной ткани (пиридинолина и дезоксипиридинолина) проводили во второй спонтанной утренней порции мочи, которую собирали больные с 8 до 10 часов в специальные контейнеры После центрифугирования при 3000g в течение 10 мин в пробах мочи определяли

концентрацию креатинина

Определение пиридиновых связей коллагена проводили после гидролиза мочи с эквивалентным объемом 12 М соляной кислоты при 107°С в течение 18 часов в герметично закрытых пробирках с целью выделения связанных с белками пиридиновых связей из экскретаруемых с мочой коллагеновых фрагментов После кислотного гидролиза пробы мочи центрифугировали 2 мин при 12500g Определение пиридиновых связей коллагена Уровни Пид и Дпид в моче определяли методом ЖХВР, разработанным D Eyre et al (1984) и модифицированным S.Robins et al (1986) при использовании автоматизированной системы «Gilson Aspee» («Anachem Ltd », Великобритания) и хроматографической колонки Microsorb С18-10смх46 мм («Ramin Instrument Со», США). Детекция Пид и Дпид основана на природной флюоресценции пиридина, входящего в их состав, измерение которой осуществляли при использовании флуоресцентного монитора «Shimadzu RF-530» (Япония)

Предварительную твердофазную экстракцию проводили на колонках из микрогранулированной целлюлозы СС31 Пробы гидролизованной мочи объемом 0,5 мл наносили на колонки, которые затем промывали смесью подвижной фазы (первичный бутиловый спирт • уксусная кислота . вода в соотношении 4 1 1) в объеме 8 мл с проточной скоростью 0,75 мл/мин Для удаления бутаноловой фазы колонки промывали тетрагидрофураном в объеме 0,5 мл на каждую колонку, после чего проводилась элюция Пид и Дпид при помощи параионного растворителя гептафтормасляной кислоты (0,44 мл) на основе уксусной кислоты с предварительно добавленным ацетилированным Пид в качестве внутреннего стандарта (концентрация - 120 нмоль/л) для оптимизации иденггафикащли и количественной оценки выделенных пиков

Разделение Пид, Дпид и внутреннего стандарта с другими флюоресцирующими компонентами достигали при помощи ЖХВР с использованием 2-х растворителей А - 0,01М водный раствор гептафтормасляной кислоты и Б - 0,01М гептафтормасляная кислота в 75% водном растворе ацетонитрила. Проточная скорость органических растворителей постоянно поддерживалась на уровне 1 мл/мин

Экстрагированные образцы мочи и стандарт, вносимый в каждую серию из 44 образцов, автоматически наносили на хроматографическую колонку в составе

растворителей А и Б при их соотношении 83 17 Двухступенчатый градиент ацетонитрила достигался при пропорциональном увеличении растворителя Б с 17 до 20% в течение 7 мин, и затем до 25% последующие 5 мин с резким увеличением его концентрации до 70% Полный цикл (28,5 мин) завершался подготовкой колонки к разделению следующего образца при постепенном снижении концентрации растворителя Б до исходной концентрации 17% Одновременно измеряли флюоресценцию элюатов при следующих условиях спектроскопии возбуждение - при 295 нм и эмиссия - при 400 нм.

Количественный анализ выделенных фракций пиридиновых связей коллагена, экскретируемого с мочой, проводили автоматически с учетом площади пиков Пид и Дпид стандарта известной концентрации, вводимого в систему для калибровки детектора.

Для снижения вариабельности экскреции Пид и Дпид в моче, обусловленной влиянием различных биологических факторов, их концентрацию соотносили с концентрацией креатинина, предварительно измеренного в каждой нативной пробе мочи (Рапге^ип М е1 а1, 1996) Конечные результаты выражали в единицах нмоль/ммоль креатинина мочи

Иммуногистохимические методы исследования опухолей предстательной железы Для иммуногистохимических исследований образцы тканей (биоптаты) РПЖ и ДГПЖ фиксировали в 10% забуференном формалине, заливали в парафин с точкой отвердения 56° С, готовили серийные срезы толщиной 3-5 мкм, а затем их депарафинировали по стандартной схеме

Иммуногистохимическнй анализ экспрессии Ю-67 при РПЖ и ДГПЖ Иммуногистохимическое исследование проводили пероксидазно-антипероксидазным методом (ПАП) с применением антител к К1-67 (антитела К1-в5, фирма «Эако», Дания, рабочее разведение антител 1.50)

Для Ю-67 использовалась микроволновая обработка 3 раза по 5 мин при 750 Вт и 10 мин при 600 Вт соответствующими охлаждениями в течение 2 мин между каждой процедурой Затем срезы охлаждали при комнатной температуре не менее 15-20 мин После этого срезы промывали в ТРИС-буфере 2-5 мин, просушивали и инкубировали с первичными антителами в течение 60 мин при комнатной температуре, затем 18 часов при температуре +4° С Далее в качестве вторичных

антител и пероксидазного комплекса использовали стандарный Kit фирмы «Diiko» (StreptABComplex/HRP, Mouse/Rabbit) Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали раствор диаминобензидина с докрашиванием ядер клеток гематоксилином Майера

Реакция на Ki-67 отражает степень пролифератиной активности клеток РПЖ, ДГПЖ и определяется в процентах Расчет проводили общепринятым методом вычисляли индекс мечения или количество окрашенных ядер опухолевых клеток этим маркером на 100 опухолевых клеток при репрезентативных полях зрения Этот показатель рассчитывали при анализе не менее 500-1000 клеток Иммуногистохимический анализ экспрессии онкобелка с-егЬВ-2 (Her-2/neu)

при РПЖ и ДГПЖ Исследование выполнено с помощью биотин-стрептавидинового иммунопероксидазного метода на серийных парафиновых срезах образцов тканей с применением антител к онкобелку с-егЬВ-2 («Dako», Дания, рабочее разведение антител 1 200) Проводили предварительную обработку парафиновых срезов в микроволновом режиме при мощности 650 Вт 2 раза по 5 мин с использованием восстанавливающего раствора рН 6,0 («Dako», Дания) Для визуализации реакции применяли раствор диаминобензидина DAB+ («Dako», Дания) Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера

При имуногистохимическом анализе оценивали интенсивность окрашивания, количество антиген-позитивных клеток и тип реакции (цитоплазматический, мембранный или смешанный)

Иммуногистохимическую реакцию оценивали как негативную («-» - нет реакции), слабо- («+» - < 10% окрашенных клеток), умеренно- («++» - > 10% клеток средней интенсивности окраски) и сильнопозитивную («+++» - > 10% клеток высокой интенсивности окраски). Для белка с-егЬВ-2 реакция считалась позитивной только при интенсивном окрашивании мембран раковых клеток (+++) Иммуногистохимический анализ экспрессии РА при РПЖ и ДГПЖ Анализ уровня экспрессии РА изучен в ядрах клеток РПЖ и ДГПЖ с помощью иммуногистохимического метода на серийных парафиновых срезах образцов тканей с применением ангател к белку PA («Dako», Дания, рабочее разведение антител 1 100)

При имуногистохимическом анализе оценивали интенсивность окрашивания ядер клеток РПЖ и ДГПЖ Расчет проводили общепринятым методом вычисляли индекс мечения или количество окрашенных ядер опухолевых клеток этим маркером на 100 опухолевых клеток при репрезентативных полях зрения Этот показатель рассчитывали при анализе не менее 500-1000 клеток.

Иммуногистохимическую реакцию оценивали как негативную («-» - нет реакции), слабую- («+» - < 30% окрашенных ядер клеток), умеренную- («++» - 3075% ядер клеток средней интенсивности окраски) и сильнопозитавную («+++» - > 75% ядер клеток высокой интенсивности окраски) Для белка РА реакция считалась позитивной при интенсивном окрашивании ядер раковых клеток (+++) Статистический анализ результатов исследования

Выбор центральных характеристик исследуемых количественных данных осуществляли после изучения формы их распределения Оценку различия распределения от распределения Гаусса проводили по критерию согласия Колмогорова-Смирнова При логнормальном распределении проводили математическое преобразование значений Рассчитывали среднее значение показателя и его 95% доверительные границы, ошибку среднего, а также медианы (для логнормальных показателей) и пределы колебания.

Рассчитывали абсолютные и относительные частоты качественных и ординальных признаков. Оценку различий частот проводили непараметрическим критерием у?, для малых выборок - точным критерием Фишера Расчет доверительных интервалов для малых долей проводили с учетом биномиального распределения.

Для выявления наиболее характерных связей между изучаемыми показателями проводили «факторный» анализ методом выделения главных компонент с последующим вращением корреляционной матрицы Рассчитывали точное значение р При множественных сравнениях значения р определяли с помощью специальных тестов с поправкой на множественность сравнений (всЬейе^евО При корреляционном анализе рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона, а также значимость его отличия от нуля

При статистическом анализе учитывали методологические требования Международного конгресса по гармонизации ввР "Статистические принципы для

клинических исследований" (ICH Guidelines // Good Clin. Pract, J.-1998.-Vol.5, N.4.-p.27-37).

Все вычисления проводили с помощью математических пакетов «СТАТИСТИКА» и SPSS.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

На рисунке 1 представлено распределение больных РГЩ и ДГШК с учетом возраста. Следует отметить, что больные РПЖ имели более широкие пределы колебания возраста.

Рис, 1. Распределение пациентов ло возрасту в труппе больных доброкачественной гиперплазией и раком предстательной ж слезы.

ео1раст,пят

труЛПи ДСфСи^-Чстпеииих простаты

Концетгграцшо общего ПСА в сыворотке крови определяли у 178 больных Д1ТТЖ и РПЖ, а в качестве центральной статистической характеристики показателя использовали медиану концентрации общего ПСА в сыворотке крови.

: -. nri.u

•ÎIJV 40? Ш >V4

-. -ГШ

Рис. 2. Распределение ПСА в сыворотке кропи больных до б рока чести с я кой гиперплазией и раком предстательной железы.

Как видно из данных рисунка 2 у 78% пациентов ДГПЖ концентрация ПСА в сыворотке крови была менее 10 нг/мл, В то же время в группе больных РПЖ у 86% пациентов значения ПСА были к пределах до 100 нг/мл.

При пороговом значении ПСА в сыворотке крови, равном 10 нг/мл, ошибочная верификация в группе ДГПЖ составила 22,2% ¡95% С1=6,4%-47,6%], а в группе больных РГ1Ж - 22,4% [95% С1=10,8-3 8,5%]. Следовательно, использование только этого маркера недостаточно для более точной диагностики РПЖ. При 'jtom, медианы: концентраций 1LCA в сыворотке крови в обеих группах различались достоверно (р=0,004) (табл. 2). Только у 11% больных ДГПЖ максимальное значение ПСА в сыворотке крови составило 31 ur/мл, в то время как у 46,9% больных РПЖ значения ПСА в сыворотке крови были ниже 31 нг/мл.

Таблица 2.

Уровень общего ПСАв сыворотке крови больных РПЖ и ДГПЖ

Обследованные группы больных Число пациентов Среднее значение (нг/мл) Медиана (нг/мл)

ДГПЖ 52 9,5±2.9 6,1

РПЖ 126 71,2±18,7 35,6

Пределы колебаний (нг/мл)

3,0-30,8~ 0,8-748

Дисперсионный анализ показал значительное повышение концентрации общего ПСА к сыворотке крови больных РПЖ при 6-8 степенях диффергащировки опухоли по Глисопу (р=0,045). Так, медиана величин ПСА при 4-ой степени

дифференцировки РПЖ равнялась 5,6 нг/мл, при 5-ой - 8,2 нг/мл, а при 6-ой, 7-ой и 8-ой степенях дифференцировки опухоли медианы ПСА равнялись соответствешо 40,44 и 40 нг/мл

Концентрация ПСА в сыворотке крови не зависела от наличия сопутствующих заболеваний у больных как ДГПЖ, так и РПЖ

При дисперсионном анализе с учетом возраста пациентов было обнаружено недостоверное повышение уровня общего ПСА у больных ДГПЖ Так, в возрасте до 60 лет медиана концентрации общего ПСА в сыворотке крови составила 4,6 нг/мл (максимальное значение ПСА не превышало 10 нг/мл), в возрастном периоде 60-70 лет медиана ПСА равнялась 5,1 нг/мл (у 2-х пациентов концентрация ПСА была в пределах 10-16 нг/мл), а в более пожилом возрасте (старше 70 лет) медиана ПСА равнялась 8,7 нг/мл, причем у 2-х пациентов концентрация ПСА в сыворотке крови была в пределах 30-35 нг/мл.

В то же время у больных РПЖ в возрасте до 60 лет медиана значений ПСА в сыворотке крови составила 12,2 нг/мл (максимальные значения ПСА не превышали 200 нг/мл) У больных в возрасте 60-70 лет медиана ПСА равнялась 33 нг/мл (максимальные значения ПСА не превышали 500 нг/мл), а у больных старше 70 лет медиана ПСА составила 38 нг/мл с максимальным значением маркера 748 нг/мл Таким образом, только у больных РПЖ в возрасте до 60 лет значения общего ПСА были заметно ниже (в 3 раза)

На основании анализа полученных данных можно полагать, что концентрация общего ПСА в сыворотке крови больных РПЖ может быть связана со степенью дифференцировки опухоли, в то время как при ДГПЖ - с возрастом пациентов

Уровни УЕвЕ в сыворотке крови больных РПЖ и ДГПЖ

Концентрацию ключевого активатора ангиогенеза УЕОБ в сыворотке крови определяли у 104 больных РПЖ, у 22 - ДГПЖ и у 35 - в контроле Во всех исследованных образцах сыворотки крови пациентов выявили УЕОБ В таблице 3 приведены результаты этого раздела исследований, при этом значения УЕвР у большинства больных РПЖ были выше по сравнению с контролем и не отличались от уровней УЕОБ у больных ДГПЖ

Таблица 3.

Уровни VEGF в сыворотке крови больных РПЖ, ДГПЖ и в контроле

Группы Число больных Среднее значение (пг/мл) Медиана (пг/мл) Пределы колебания (пг/мл)

РПЖ 104 143±15 97 17,5-476

ДГПЖ 22 116±42 63 31-519

Контроль 32 92±9 45 20-211

Определили коэффициенты соотношения УЕСБ/ПСА в анализируемых группах Выявили, что соотношение УЕОЕ/ПСА достоверно различалось между больными РПЖ и ДГПЖ (р=0,02) (табл 4)

Таблица 4.

Соотношение УЕвР/ПСА в основных группах больных новообразованиями

предстательной железы

Обследованные группы Число больных VEGF/ПСА (среднее значение) VEGF/I1CA (медиана)

РПЖ 104 9,2±0,2 3,5

ДГПЖ 22 20,9±3,6 12,9

Так, медиана соотношения VEGF/ПСА была почти в 4 раза ниже у больных РПЖ по сравнению с ДГПЖ. Изучение распределения соотношения VEGF/ПСА с анализом пороговых значений по кривой ROC показало, что граничное значение соотношения, равное 4,4, достоверно разделяет группы больных РПЖ и ДГПЖ с чувствительностью 57,1% и специфичностью - 88,9% (р=0,01) Как видно из полученных результатов чувствительность полученного теста недостаточна, только чуть более половины пациентов с РПЖ классифицируются как рак с вероятностью ошибки 11,1%

Достоверно различались значения VEGF в группах с различной степенью дифференцировки опухоли по Глисону (р=0,029) Так, медианы уровня VEGF при 4-8 степенях дифференцировки РПЖ составили 57; 75, 181, 148; 77 пг/мл, соответственно.

Показано, что величина PIN не была связана с показателями VEGF в сыворотке крови больных новообразованием предстательной железы (р=0,5)

Не выявили изменения значений VEGF у больных РПЖ и ДГПЖ при учете наличия сопутствующих заболеваний

Исследовали связь изменения уровней VEGF в сыворотке крови с возрастом пациентов. В группе больных мелкоацинарным РПЖ обнаружили прямило зависимость между уровнем VEGF в сыворотке крови и возрастом пациентов (г=0,42; р=0,038)

Отмечена прямая достоверная зависимость уровня VEGF и возраста пациентов при степени дифференцировки опухоли по Глисону равной 5-6 (г=0,47, р=0,02) Наличие или отсутствие сопутствующих заболеваний не изменяло данной зависимости.

Отмечена тенденция к увеличению средних значений VEGF в сыворотке крови при низкодифференцированном РПЖ (164,1±59,1 пг/мл) по сравнению с умеренно- (146,6±18,7 пг/мл) и высокодифференцированным (131,1±24,5 пг/мл).

У больных РПЖ обнаружена тенденция к прямой корреляционной зависимости между концентрациями общего ПСА и VEGF в сыворотке крови (г=0,52, р=0,08)

При исследовании совместного распределения значений VEGF и общего ПСА обнаружили, что при значении ПСА более 10 нг/мл и значении VEGF более 160 пг/мл в группах больных ДГПЖ и РПЖ не перекрывались.

Таким образом, совместное определение в сыворотке крови VEGF и общего ПСА позволило диагностировать РПЖ с вероятностью 100% [95% С1=81,5-100%] у 36,7% пациентов При уровне ПСА более 10 нг/мл и VEGF менее 160 пг/мл вероятность принадлежности больного к группе РПЖ составила 77,6% [95%С1=54,4%-99,0%]. В то же время, определение уровня VEGF в сыворотке крови не повышало эффективности разделения групп больных ДГПЖ и РПЖ в области «низких» значений ПСА - до 10 нг/мл

Концентрация IGFBP1 в сыворотке крови больных РПЖ н ДГПЖ

У 122 пациентов с новообразованиями предстательной железы определяли концентрацию IGFBP1 в сыворотке крови. Этот белок был обнаружен во всех обследованных образцах сыворотки крови.

Таблица 5.

Концентрация IGFBP1 в сыворотке крови больных РПЖ и ДГГ1Ж

Обследованные Число Средние Медиана Пределы

группы больных значения IGFBP1 колебаний

IGFBP1 (нг/мл) IGFBP1

(нг/мл) (нг/мл)

РПЖ 102 67±5 64 4,9-176,6

ДГПЖ 20 77±12 75 29,5-157,9

Контроль 25 66±7 62 4,6-169,5

При сравнении уровней IGFBP1 в сыворотке крови больных РПЖ и ДГПЖ не обнаружено достоверных различий (р=0,4) (табл. 5) Однако, при оценке соотношения IGFBPl/ПСА в группах больных РПЖ и ДГПЖ выявили высоко достоверные различия (р=0,004) Так, средние значения этого соотношения составили 4,2±0,8, (медиана - 1,9) в группе больных РПЖ и 15,4±3,6 (медиана -14,6) в группе больных ДГПЖ Анализ чувствительности и специфичности данного коэффициента с использованием кривой ROC показал, что пороговое значение, равное 5, наилучшим образом разделяло эти группы больных (р=0,001) (чувствительность теста - 81,3%, специфичность - 87,5%) Таким образом, при значении соотношения IGFBPl/ПСА менее 5 следует отнести пациента к классу ДГПЖ, а при значении соотношения от 5 и более - к классу РПЖ Следует отметить, что в области «низких» значений общего ПСА диагностическая ценность выше указанного соотношения снижалась

Дисперсионный анализ не выявил различий в уровнях IGFBP1 в возрастных группах до 60 лег, 60-70 лет и старше 70 лет у больных ДГПЖ (77±9, 78±22 и 76±20 нг/мл, соответственно) и недостоверное повышение уровня IGFBP1 в сыворотке крови больных РПЖ таких же возрастных групп 56±11, 66±7 и 73±8 нг/мл, соответственно Наибольшие различия между уровнями IGFBP1 в двух группах пациентов были в возрасте до 60 лет, а наименьшие - в возрасте старше 70 лет

У больных РПЖ зависимость между уровнем IGFBP1 в сыворотке крови и возрастом у пациентов была слабой, но достоверной (г=0,28, р=0,047). В тоже время у больных ДГПЖ эта зависимость отсутствовала (г=0,22; р=0,08)

Следует отметать, что при показателе степени дифференцировки опухоли по Глисону не более 5, зависимость усиливалась до значения (г=0,61; р=0,045) и ослабевала при больших значениях показателя Глисона.

Ни в одной из указанных групп больных не обнаружено связи между уровнем ЮБВР1 и длительностью анамнеза заболевания

Обнаружен различный характер связи между уровнями ЮРВР1 и общих) ПСА в сыворотке крови в группах больных РПЖ и ДГПЖ, хотя связь в обеих группах была недостоверной (г=0,27, р=0,069 и г=-0,5; р=0Д, соответственно)

В то же время корреляционная зависимость была достоверной для пациентов с показателем степени дифференцировки опухоли 3-6 баллов по Глисону (г=0,50, рЮ,014) и ослабевала при увеличении этого коэффициента до 7-8 баллов (г=0,19, р=0,4)

При дисперсионном анализе выявили достоверно более высокие уровни ЮРВР1 в сыворотке крови больных ДГПЖ (96±14 нг/мл) по сравнению с группой больных РПЖ (56±9,2 нг/мл) в области значений общего ПСА до 10 нг/мл (р=0,033) В то же время в области значений ПСА от 10 нг/мл и более уровни ГСРВР1 в сыворотке крови не различались значимо

При дисперсионном анализе изменений уровней ЮРВР1 в сыворотке крови больных РПЖ с учетом показателя Глисона не обнаружено достоверных отличий (р=0,5).

При наличии у больных РПЖ сопутствующего заболевания значения уровней ЮРВР1 в сыворотке крови были недостоверно более высокими но сравнению с больными, у которых сопутствующие заболевания отсутствовали (68,0±5,8 и 54,0±9,6 нг/мл, соответственно).

При анализе совместного распределения уровней общего ПСА и ЮРВР1 в сыворотке крови больных новообразованиями предстательной железы было обнаружено, что область «низких» (до 10 нг/мл) значений ПСА и одновременно «низких» (до 65 нг/мл) значений ЮРВР1 более характерна для больных РПЖ, чем для больных ДГПЖ (классы не перекрывались)

Таким образом, при одновременном выявлении в сыворотке крови ЮБВР1 в концентрации до 65 нг/мл и общего ПСА до 10 нг/мл, точность распознавания РПЖ у 12,5% пациентов составила 100% [95% С1=74,0-100%] При значешш общего ПСА в сыворотке крови менее 10 нг/мл и ШРВР1 более 65 нг/мл

вероятность принадлежности пациента к классу ДГПЖ составила 60% [95% С1=56,2- 87,8%] В тоже время любой уровень ГОРВР1 в сыворотке крови был не информативен в области значений общего ПСА от 10 нг/мл и более

Таким образом, при РПЖ показатель концентрация ЮРВР1 в сыворотке крови для диагностики в целом является менее информативным, чем уровни общего ПСА и УЕвР, однако одновременное использование ЮРВР1 при невысоких значениях ПСА может повысить точность диагностики РПЖ

Концентрация ГСРВРЗ в сыворотке крови больных РПЖ и ДГПЖ Концентрацию ЮРВРЗ в сыворотке крови определяли у 126 больных новообразованиями предстательной железы ЮРВРЗ обнаружен во всех исследуемых образцах

Средние значения ЮРВРЗ в сыворотке крови больных РПЖ и ДГПЖ не отличались достоверно (табл 6) В тоже время достоверно отличались концентрации ЮРВРЗ между больными РПЖ, ДГПЖ и группой контроля (р=0,001)

Таблица 6.

Концентрация ЮРВРЗ в сыворотке кровн больных _ ДГПЖ, РПЖ и в контроле__

Обследованные Количество Среднее Медиана Пределы

группы наблюдений значение ГСРВРЗ колебаний

ГСРВРЗ (нг/мл) (нг/мл)

(нг/мл)

Контроль 36 3150±105' 3180 1500-4600

ДГПЖ 22 1726±290" 1392 337-3158

РПЖ 104 2025±134л 1915 629-4580

Примечание: Р<0,001 ^2,3

Оценили коэффициенты соотношения ЮРВРЗ/ПСА в группах больных ДГПЖ и РПЖ и не выявили достоверных различий (247,5±59,4 и 145,6±37,5 соответственно, р=0,3)

Не обнаружили связи между уровнями ЮРВРЗ в сыворотке крови больных РПЖ, ДГПЖ и возрастом пациентов. Концентрация ЮРВРЗ в сыворотке крови больных РПЖ в возрастной группе до 60 лет составила 1957±209 нг/мл, в возрастной группе от 60 до 70 лет - 2141±230 нг/мл, в группе от 70 лет и более -1965±237 нг/мл и практически не различались

Дисперсионный анализ выявил достоверно (р=0,01) большие уровни ЮРВРЗ в сыворотке крови с длительностью анамнеза более 1 года у больных РПЖ по сравнению с ДГПЖ (2242±230 и 1049±256 нг/мл, соответственно).

У больных РПЖ без сопутствующих заболеваний в анамнезе прямая зависимость между ЮРВРЗ и общим ПСА также была недостоверной (г=0,45, р=0,16). Хотя при дисперсионном анализе было обнаружено существенное повышение уровня ЮРВРЗ в сыворотке крови больных РПЖ при показателе Глисона равном 6-8 баллов, однако выявленные различия также были недостоверными (рис 3)

5 6 7

Степень дифференцировки

~Т~ ±1 еб'БЕ

Рис. 3. Уровни ЮРВРЗ в сыворотке крови больных раком предстательной железы с учетом показателя Глисона.

В общей группе больных новообразованиями предстательной железы при наличии сопутствующих заболеваний концентрации ЮЕВРЗ в сыворотке крови (2132±170 пг/мл) были недостоверно выше по сравнению с группой пациентов без сопутствующей патологии (1680±240 пг/мл) (р=0,12) Эта закономерность проявлялась в обеих исследуемых группах.

Не доказана диагностическая значимость уровня ЮРВРЗ в сыворотке крови пациентов с «низкими» значениями общего ПСА

Таким образом, концентрация ЮРВРЗ в сыворотке крови была достоверно выше у больных РПЖ при длительном анамнезе

Концентрация ШИ в сыворотке крови больных новообразованиями предстательной железы и его связь с основными клиническими признаками болезни

Концентрацию ГСР1 в сыворотке крови измеряли у 126 пациентов с новообразованиями предстательной железы и ЮР1 был выявлен во всех образцах сыворотки крови

Таблица 7.

Концентрация ЮИ в сыворотке крови больных

ДГПЖ, РПЖ и в группе контроля__

Обследованные Количество Среднее Медиана Пределы

группы наблюдений значение 1СР1 колебаний

ЮИ (нг/мл) ЮГ1

(нг/мл) (нг/мл)

Контроль 38 198±37' 181 66-314

ДГПЖ 22 85±20^ 64 16-193

РПЖ 104 86±7,53 81 15-231

Примечание: Р<0,001 1ув2,3.

Как следует из данных, приведенных в таблице 7, медианы концентраций ЮБ1 в сыворотке крови больных РПЖ (81 нг/мл) и больных ДГПЖ (64 нг/мл) достоверно не отличались (р=0,7) В то же время, достоверно различались уровни ЮР1 в сыворотке крови между больными РПЖ, ДГПЖ и контролем (р=0,001)

Оценили коэффициенты соотношения ЮР 1/ПСА в группе больных ДГПЖ (12,1±3,4) и РПЖ (6,5±1,7), различия статистически недостоверны (р=0,2)

Достоверно более высокими (р=0,01) были концентрации ЮР1 в сыворотке крови больных РПЖ по сравнению с больными ДГПЖ при длительном (от 1 года и более) анамнезе (медианы 104 и 27 нг/мл, соответственно).

Корреляционный анализ выявил разную по знаку недостоверную зависимость между уровнем ЮР1 и длительностью анамнеза болезни в группе пациентов с ДГПЖ (г=-0,66, р=0,1) и РПЖ (г=0,24, р=0,1) При этом у больных ДГПЖ с длительным анамнезом отмечена тенденция к более низким уровням ЮР1 в сыворотке крови, чем при коротком анамнезе.

Заметно повышались уровни ЮР1 в сыворотке крови больных РПЖ при показателе Глисона равном 6-8 баллов (рис 4)

200

180

X

u. 2

120

100

80

60

о

I—I 254-75%

4

5

6

7

в

7X7 MlivMax

степчьдифферицировт опухопи

Рис. 4. Медиана и пределы колебания концентрации IGF1 в сыворотке крови больных РПЖ с учетом показателя Глисона.

Обнаружено, что уровни IGF1 в сыворотке крови больных в значительной степени зависели от сопутствующих заболеваний в анамнезе Так, медиана уровня IGF1 в сыворотке крови в общей группе больных с сопутствующими заболеваниями была в 3 раза выше (108 нг/мл) по сравнению с больными без сопутствующей патологии (40 нг/мл)

Дисперсионный анализ не выявил связи уровня IGF1 в сыворотке крови с возрастом больных новообразованиями предстательной железы, как и со степенью дифференцировхи опухоли, хотя у пожилых больных ДГПЖ или РПЖ высокой степени дифференцировки опухоли были обнаружены недостоверно более низкие значения IGF1, чем у пациентов молодого и среднего возраста

Между уровнем IGF1 и общим ПСА в сыворотке крови больных РПЖ без сопутствующей патологии была обнаружена достоверная прямая корреляционная связь (г=0,66, р=0,027)

Не доказана диагностическая значимость уровня IGF1 в сыворотке крови в области «низких» значений общего ПСА

Таким образом, нами показано, что уровень IGF1 в сыворотке крови повышался у больных новообразованиями предстательной железы с сопутствующими заболеваниями. При длительном анамнезе у больных РПЖ уровень IGF1 в сыворотке крови был достоверно выше по сравнению с больными ДГПЖ При отсутствии сопутствующих заболеваний у больных РПЖ уровни IGF1

в сыворотке крови прямо пропорционально коррелировали со значениями общего ПСА в сыворотке крови

Концентрация ШК в сыворотке крови больных новообразованиями предстательной железы и его связь с клиническими признаками болезни

При определении уровня ЮР2 в сыворотке крови 124 пациентов с новообразованиями предстательной железы этот фактор роста выявлен во всех исследованных образцах.

Таблица 8.

Уровни IGF2 (М±ш) в сыворотке крови больных _ Д111Ж, РПЖ и в группе контроля__

Обследованные Количество Среднее Медиана Пределы

группы наблюдений значение IGF2 колебаний

IGF2 (иг/мл) IGF2

(иг/мл) (иг/мл)

ДГПЖ 20 300±19' 299 204-385

РПЖ 104 sosis^ 312 208-444

Контроль 20 713±21J 727 627-787

Примечание: Р<0,001 3vsl,2

В двух основных группах больных уровни ЮР2 в сыворотке крови и характер его распределения достоверно не различались (р=0,7, табл 8)

Достоверно различались уровни ЮР2 в сыворотке крови у обеих групп больных новообразованиями предстательной железой от его значений в контроле (р=0,001).

Оценили коэффициенты соотношения ЮР2/ПСА у больных Д111Ж (52,3±12,7) и РПЖ (23,3±6,0), различия были недостоверными (р=0,07)

Не выявлено связи уровней ЮР2 в сыворотке крови со степенью дифференцировки РПЖ по Глисону

Средний уровень ЮР2 в сыворотке крови больных РПЖ не зависел также от возраста

Не выявлено корреляционной связи между значениями ЮР2 и общим ПСА в сыворотке крови в обеих группах больных При этом уровень ЮР2 не повышал точность диагностики РПЖ в области «низких» концентраций общего ПСА

Использование изученных показателей в диагностике РПЖ

Как известно, важным диагностическим показателем при заболеваниях предстательной железы является пороговый уровень общего ПСА в сыворотке

крови пациентов Кроме того, для оценки диагностической значимости использовали при анализе также пороговые значения УЕвБ и ЮРВР1 в сыворотке крови пациентов, выбранные нами по результатам собственных исследований

При использовании пороговых значений общего ПСА (10 нг/мл), УЕвР (160 пг/мл) и ЮРВР1 (65 нг/мл) в сыворотке крови пациентов с новообразованиями предстательной железы мы предлагаем следующий алгоритм диагностических решений

1-й этап:

- если уровень общего ПСА в сыворотке крови превышает 31 нг/мл, то больного следует отнести к классу РПЖ с вероятностью 100% [95% С1=86,8%-100%].

2-й этап:

- если уровень общего ПСА в сыворотке крови находится в пределах 10-31 нг/мл и при этом

- если уровень УЕй¥ в сыворотке крови превышает 160 пг/мл, то пациента следует отнести к классу РПЖ с вероятностью 100% [95% С1=63,1-100%],

- если уровень УБвР в сыворотке крови менее 160 пг/мл, то вероятность РПЖ составляет 66,7% [95% С1=52,3%-71,9%]

3-й этап:

- если уровень общего ПСА в сыворотке крови не превышает 10 нг/мл и при

этом.

- если уровень ЮРВР1 в сыворотке крови менее 65 нг/мл, то пациента следует отнести к классу РПЖ с вероятностью 100% [95% С1=74,0-100%],

- если уровень ЮРВР1 в сыворотке крови превышает 65 нг/мл, то вероятность РПЖ составляет 40% [95% С1=13,2%-44,8%]

Таким образом, при использовании одновременно уровней общего ПСА, УБвР и ЮРВР1 в сыворотке крови возможно определение индивидуальной вероятности правильного диагноза до выполнения биопсии, при этом у 42,5% пациентов вероятность правильного диагноза составляла 100%, а вероятность правильной диагностики РПЖ снижается, если величины находятся в пределах общий ПСА -10-31 нг/мл при уровне УЕвР до 160 пг/мл, общий ПСА - до 10 нг/мл при уровне ЮРВР1 более 65 нг/мл

Следовательно, результаты настоящего исследования показывают, что определение ряда маркеров (ростовых факторов, связывающих ростовые факторы белков одновременно с общим ПСА) в сыворотке крови пациентов с заболеваниями предстательной железы, позволяют повысить точность клинической диагностики РПЖ. По нашему мнению, уровни VEGF, IGF1, IGF2 и IGFBP1 в сыворотке крови больных можно использовать в качестве молекулярных маркеров вместе с уровнем общего ПСА в сыворотке крови при диагностике РПЖ

Кроме того, отличия в уровне изученных маркеров у обследованной группы сравнения (практически здоровые мужчины) указывают на возможность использования этих показателей у мужчин в возрасте старше 40 лет с целью раннего выявления РПЖ, что будет способствовать, более эффективному лечению этих заболеваний и улучшению качества их жизни.

Концентрация основных андрогенов в сыворотке крови и активность 170-ГСД в бионтатах РПЖ и ДГПЖ

В данном разделе исследований представлены результаты по определению общей редуктазной активности 17Д-ГСД в биоптатах новообразований предстательной железы различного гистологического строения Кроме того, у всех больных в сыворотке крови определяли концентрацию основных андрогенов - Т, 5й-ДГТ и A4

Во всех биоптатах опухолей предстательной железы была обнаружена редуктазная активность 17Р-ГСД, которая варьировала в широких пределах

Самая низкая активность 17р-ГСД была обнаружена в растворимой фракции ДГПЖ (18 пкмоль/мг белка) В РПЖ (249 пкмоль/мг белка) и при PIN (155 пкмоль/мг белка) активность этого фермента была на порядок выше, чем при ДГПЖ (р<0,0001 для ДГПЖ vs РПЖ и PIN по критерию Спирмена), но при этом активности 17Р-ГСД в биоптатах PIN и РПЖ не отличались между собой достоверно

Следовательно, редуктазную активность 17р-ГСД в растворимой фракции биоптатов можно расположить в следующем порядке РПЖ > PIN » ДГПЖ Эти данные нами получены впервые

Ни в одном наблюдении не обнаружено отличий в концентрации Т, 5<х-ДГТ и A4 в сыворотке крови больных всех трех групп, а средняя концентрация этих

андрогенов в сыворотке крови больных опухолями предстательной железы не превышала пороговых значений их нормальных величин для мужчин

Нами обнаружена прямая зависимость между концентрацией в сыворотке крови Т и 56-ДГТ у больных ДГПЖ (г=0,614 и р=0,007).

При анализе результатов по определению редуктазной активности 17Р-ГСД в растворимой фракции опухолей предстательной железы представлялось важным определить связь между этой активностью 17(3-ГСД и концентрацией в сыворотке крови больных выше указанных групп основных андрогенов, особенно Т и А4 Только в группе больных РПЖ нами была обнаружена прямая корреляционная зависимость между редуктазной активностью 17|$-ГСД и концентрацией А4 в сыворотке крови (г=0,638 и р=0,0047). По нашему мнению эта связь имеет большое значение именно для РПЖ.

Полученные нами впервые сравнительные данные по определению редуктазной активности 17Р-ГСД в опухолях предстательной железы позволяют заключить, что высокая редуктазная активность 17(3-ГСД может быть связана с развитием РПЖ

Маркеры резорбции костной ткани в моче больных РПЖ При сравнительном определении концентрации Пид в моче было установлено, что концентрация этого маркера у больных РПЖ с верифицированными метастазами в костях была достоверно (р<0,001) выше (149,7 нмоль/ммоль креатинина), чем у больных РПЖ без метастазов в костях (59,5 нмоль/ммоль креатинина) и примерно в 4 раза выше, чем в контрольной группе здоровых мужчин (37,1 нмоль/ммоль креатинина)

Экскреция с мочой Дпид в указанных группах больных коррелировала с концентрацией Пид. концентрация Дпид в моче больных РПЖ с метастазами в костях была достоверно выше (р<0,001) (45,3 нмоль/ммоль креатинина), чем соответствующий показатель в группе больных РПЖ без метастазов в костях (16,5 нмоль/ммоль креатинина) и в 4,3 раза выше, чем в контрольной группе (10,6 нмоль/ммоль креатинина).

Необходимо отметить высокую вариабельность концентрации пиридиновых связей коллагена в моче больных РПЖ с метастатическим поражением скелета, по сравнению с пациентами без метастазов в костях и практически здоровыми мужчинами Так, уровень экскреции Пид с мочой у больных РПЖ без метастазо з в

костях и в контрольной группе варьировал значительно в меньших пределах, чем у больных РПЖ с поражением скелета. При этом степень усиления экскреции Пид превышала показатели контрольной группы от 2 до 13 раз. Концентрация Дпид в моче больных РПЖ с метастазами в костях также отличалась значительно большей вариабельностью значений по сравнению с пациентами без метастазов и группой контроля, а степень усиления зкекретсии Дпид у больных с метастазами в костях превышала показатели контрольной группы от 2 до 8 раз.

Нами был проиеден анализ распределения показателей концентрации Пид и Днид мочи в исследуемых группах больных (рис. 5 и 6).

Анализ данных свидетельствует о высокой частоте повышения Пид в моче больных РПЖ с метастазами и костях. Так, усиление экскреции Пид гк> отношению к верхней фанице нормы (60,4 нмоль/ммоль креатинина) наблюдали у 77,5% больных. При этом более чем у 50% больных обнаружено значительное (в 2 раза и более) превышение нормальной концентрации Пид в моче с максимальным его значением равным 837 нмоль/ммоль ьереатина.

100 ео-ео

40

норма «0.4-100 101-300 201-41» 601-900

Интервалы значений для Пид (нмоль/ммоль крону.)

□ Вольные РПЖ с метасгаззии в костях □ Больные РПЖ о» метастазов в костях

Рис. 5. Распределение величин концентрации Пид в моче больных РПЖ с метастазами и без метастазов в костях.

и -------■ 11 "-■ г-"—™---Г..ЧИ1Г ■ ■ I- |-—.-Е ■

норма 25.2-60 51-11» 101-200 201-300

V! сервалы значений для Дпид (нисль/ммоль креэт ; Ш Больные гх>' с г^атэстазэни в костях п Больные РШ( без метзотэзов а костих

Рис. 6. Распределение величин концентрации Дпид в моче больных РПЖ с метастазами и без метастаз»» в костях.

Необходимо отметить, что повышение концентрации Пид в моче по сравнению с контрольной группой отмечено и у больных РПЖ без метастатического поражения скелета (р<0,001). Так, увеличение концентрации Лид было обнаружено у 5 пациентов без метастазов в костях (25% больных данной группы), однако степень усиления экскреции по Отношению к верхней границе нормы была незначительной - в среднем в 1,6 раза. Следует отметить, что нормальные показатели Пид в моче (> 60,4 пмоль/ммоль креатин и на) были отмечены только у 9 больных с поражением скелета (22,5% больных данной группы). В то же время, в группе больных РПЖ без метастазов в костях нормальные значения Пид наблюдали у 75% больных.

Уровень Дпид в моче больных РПЖ с метастазами в костях коррелировал с уровнем Пид. Самая высокая концентрация Дпид обнаружена нами в моче больных РПЖ с метастазами в костях. При этом уровень Дпид в моче превышал верхнее значение нормы (26,2 нмоль/ммоль креатииина) у 67,5% больных, а у более чем 20% пациентов обнаружено трехкратное увеличение нормальных показателей Дпид в моче, которое достигало максимальных величин (218,4 нмоль/ммоль креатинина). У больных РПЖ без метастатического поражения скелета та:<же наблюдали повышение уровня Дпид в моче по сравнению с контрольной группой (р<0,001). При этом только у 5% больных обнаружено увеличение концентрации

Дпид и степень усиления экскреции Дпид по отношению к верхней границе нормы была незначительной - в среднем в 1,3 раза

Следует отметить, что нормальный уровень Дпид в моче (<26,2 нмоль/ммоль креатинина) был отмечен только у 32,5% больных РПЖ с поражением скелета В то же время в группе больных РПЖ без метастазов в костях нормальный уровень Дпид был обнаружен у 95% больных

Таким образом, нами отмечена значительно более высокая частота и степень повышения уровня Пид и Дпид в моче больных РПЖ с метастазами в костях, по сравнению с больными, которые не имели клинических признаков поражения скелета и практически здоровыми мужчинами

Для сравнения, повышения точности и специфичности выявленных изменений экскреции Пид и Дпид с мочой при поражении скелета метастазами РПЖ нами проведено определение этих маркеров у 10 мужчин с ДГПЖ, включенных в исследование (табл 9)

Таблица 9.

Интервалы значений пиридинолина и дезоксипиридинолина (нмоль/ммоль

Показатели Больные РПЖ с метастазами в костях Больные ДГПЖ Контрольная группа

Пид 50-837 39-68 18-60

Дпид 8,7-218 9,2-20 4,9-26

Как видно из данных таблицы 9, уровни Пид и Дпид в моче больных ДГПЖ варьировали в небольших пределах - для Пид это составило от 39 до 68 нмоль/ммоль креатинина, а для Дпид - от 9,2 до 20 нмоль/ммоль креатинина

---И».?-

Больные РПЖ с метастазами а костях

□ больные доброкачественной гиперплазией

□ Контрольная групла

О

Рве. 7. Средние уровни экскреции пирндиволина с мочой у больных РПЖ 1К ДГПЖ.

Риг. 8. Средние показатели экскреции дезоксм пиридин о лила с моче и у больных РПЖ и ДГПЖ.

Средние уровни экскреции Пид и Дпид в этой группе больных составили 46,8 и 13,1 нмовь/ммоль креатинина, соответственно, и достоверно отличались от уровней дня больных РПЖ с метастазами в костях (в обоих случаях р<0,001) (¡рис. 7 и 8).

Полученные нами данные свидетельствует о резком отличии степени повышения экскреции пиридиновых связей коллагена в группе бальных РПЖ с метастазами о костях по сравнению е больными ДГПЖ. Более того, если нормальные показатели Пид (¿60 няоль/ммоль креатинина) и Дпид (£26 нмоль/ммоль креатинина) у пациентов с метастатическим поражением скелета были обнаружены в 22,3% и 32,5% случаев, соответственно, то при ДГПЖ

453

Я Больные РПЖ с метастазами в; костях

[^Больные добр о качестве л гой гиперплазией

□ Контрольная группа

нормальные значения Пид и Дпид наблюдали в подавляющем большинстве случаев При этом экскреция Пид с мочой превышала нормальный уровень только у 20% пациентов с ДГПЖ, а концентрация Дпид в моче у этой группы больных оставалась в пределах нормы в 100% случаев Кроме того, средние уровни Пид и Дпид у больных РПЖ с метастазами в костях превышали соответствующие показатели у пациентов с ДГПЖ в 3,2 и 3,5 раза, соответственно (р<0,001 в обоих случаях)

Важно отметить, что средние уровни пиридиновых связей коллагена в моче больных ДГПЖ незначительно превышали соответствующие средние показатели контрольной группы для Пид - в 1,3 раза, для Дпид - в 1,2 раза.

Таким образом, при анализе данных, полученных при сравнительном исследовании концентрации пиридинолина и дезоксипиридинолина в моче больных РПЖ с метастазами в костях было установлено значительное усиление их экскреции более чем у 65% больных. Это, несмотря на особенности метастатического поражения скелета, преимущественно сопровождающегося развитием остеосклероза, свидетельствует о наличии выраженной резорбции костной ткани при метастазах РПЖ в кости Отсутствие или незначительное повышение экскреции пиридиновых связей коллагена с мочой у больных РПЖ без поражения скелета, больных ДГПЖ и практически здоровых мужчин может свидетельствовать о высокой диагностической специфичности выявленных нами изменений

Экспрессия маркеров в опухолях предстательной железы

Проведен морфологический анализ биопсийного материала из предстательной железы 50 пациентов, у которых выявлен преимущественно мелкоацинарный рак разной степени дифференцировки по Глисону. Так, РПЖ по градации Глисона 4 обнаружен в 4 наблюдениях, 5 - в 7, 6 - в 17, 7 - в 17, 8 - в 5 случаях В нескольких случаях наряду с мелкоацинарными структурами опухоли выявлены участки крупноацинарного рака (2).

Мелкоацинарный рак (4-5 по Глисону) представлен мелкими тубулярными структурами округлой формы, плотно лежащими друг с другом, либо разделенными широкими фиброзными прослойками Клетки, образующие трубочки преимущественно мелкие, реже более крупные с обильной светлой цитоплазмой, ядра правильной округлой формы без ядрышка.

Опухоли, имеющие по Глисону градацию 6, представлены также мелкими трубчатыми структурами, но отличаются угловатой формой Клетки имеют более полиморфные и гиперхромные ядра, часто с ядрышком Довольно часто встречаются криброзные структуры

При сочетании мелкоацинарного РПЖ с участками скиррозного роста опухоли, либо с фокусами солидного строения без формирования трубочек, процесс расценивали по Глисону как 7

В тех случаях, когда были выявлены единичные железистые структуры и преобладали участки солидного характера, опухоль относили в группу с показателем 8 по Глисону Ядра в этих полях были полиморфные, гиперхромные, обязательно с ядрышком или несколькими ядрышками Выявлен таюке периневральный рост опухолей.

Проведено иммуногистохимическое исследование всех биоптатов опухолей с использованием антител к белкам Нег-2/пеи, РА и К-67

Показано, что реакция с антителом к Нег-2/пеи в подавляющем большинстве РПЖ была отрицательной и только в 2-х наблюдениях выявлена слабо положительная реакция в цитоплазме части клеток. Только у 1 больного ДГПЖ экспрессия Нег-2/пеи была равна «+»

В новообразованиях предстательной железы преобладала выраженная экспрессия (+++) РА. 81,8% - в ДГПЖ и 96,2% - в РПЖ как в ядрах раковых клеток, так и в ядрах эпителия неизмененной предстательной железы и в участках РШ-2. Отмечена также положительная реакция в ядрах стромальных клеток железы В одном наблюдении эта реакция была слабо положительной, причем по гистологической картине опухоль не имела каких-либо особенностей строения Полагаем, что положительная реакция на РА может быть весьма полезным маркером при уточнении гистогенеза метастатического очага поражения в костях, когда не выявлен первичный источник опухоли

Уровень экспрессии антигена пролиферативной активности Ю-67 определяли в опухоли 50 больных РПЖ и 13 пациентов с ДГПЖ

Частота новообразований предстательной железы с отсутствием экспрессии белка К1-67 в опухоли составила 10/76,9% - у больных ДГПЖ и 3/23,1% - у больных РПЖ (р=0,1)

Сопоставили значения показателя экспрессии К1-67 в опухоли больных РПЖ и ДГПЖ Среднее значение К1-67 у пациентов с ДГПЖ составило 17,5±6,8%, у больных РПЖ -18,0±2,4%, различия статистически недостоверны.

На основании этих данных следует отметить, что отсутствие экспрессии белка Ю-67 в опухоли предстательной железы может указывать на доброкачественный характер поражения органа

Экспрессия Ю-67 в опухоли не была связана с возрастом больных РПЖ Не выявили корреляционной зависимости у больных РПЖ между показателем экспрессии Ю-67 в опухоли и показателями общего ПСА, ЮР1, ЮР2, УЕвР, ЮРВР1, ЮРВРЗ в сыворотке крови

Показатель Ю-67 не был достоверно связан с показателем распространенности Т (ШМ) (р=0,8) Так, при Т[ показатель равнялся 20±14,0% (п=2), при Т2 - 17,9+8,2% (п=9), при Т3 - 19,0±2,6% (п=22), при Т4 - 9,8±2,6% У четырех больных РПЖ с отдаленными метастазами значение Ю-67 составило 11,7±2,7%

Уровень экспрессии Ю-67 в опухоли был связан со степенью дифференцировки РПЖ по Глисону (р=0,001) (табл 10)

Таблица 10.

Уровень экспрессии Ю-67 в РПЖ с учетом степени дифференцировки опухоли

по Глисону

Степень Число Ю-67 Пределы колебания

дифференцировки больных (%)

опухоли М±т

4 4 6,5±3,0 2-15

5 7 11,3±3,0 2-21

6 17 18,2±3,2 5-55

7 17 17,7±4,6 3-83

8 5 37,0±12,1 4-75

Примечание: Р 4-8 =0,008; Р 5-8 =0,009, Р 6-8 =0,03, Р 7-8 =0,024

Данное исследование указывает на то, что возможно определение комплекса некоторых биохимических показателей в сыворотке крови пациентов с заболеваниями предстательной железы, позволяющих уточнить клиническую диагностику. Кроме того, раскрывает отличия изучаемых маркеров у обследованных мужчин в группе сравнения (практически здоровые люди), а также позволяет использовать ряд биохимических показателей у мужчин после 40 лет с

целью раннего выявления новообразований предстательной железы Это будет способствовать эффективному лечению и реабилитации больных с патологией предстательной железы

Клинико-морфологические и биохимические показатели в оценке прогноза рака предстательной железы Анализ 5 летней безрецидивной выживаемости проведен у 126 больных РПЖ Рецидив заболевания виде метастазов и/или продолженного роста первичной опухоли выявлен у 72 (57,1%) больных, 5-летняя безрецидивная выживаемость в общей группе больных составила 28,8±5,9% Следует отметить, что наиболее высокий риск развития рецидива у обследованной нами группы больных РПЖ обнаружен на 2-м и 3-м году жизни от начала лечения.

Проведена оценка безрецидивной выживаемости больных РПЖ в группах с различным показателем распространенности Т (ПЧМ) При этом пациенты со стадией заболевания Т1 из-за небольшого количества наблюдений были объеденены с группой больных РПЖ с Т2 стадией, а стадия Т4 с ТЗ Два больных с распространенностью Т1 наблюдаются в течение 5 лет без признаков прогрессирования заболевания, 5-летняя безрецидивная выживаемость 20 больных с показателем распространенности Т2 составила 55,6±16,6% (медиана времени обнаружения рецидива не достигнута) В группе 52 больных РПЖ с распространенностью заболевания ТЗ 5-летняя безрецидивная выживаемость составила 35,7±9,9% (медиана -36,1±7,9 мес). Из 8 больных со значительной распространенностью процесса (Т4) у 6 развились метастазы в течение первых 2-х лет от начала лечения, 5-летняя безрецидивная выживаемость составила 0%

Неудовлетворительные результаты лечения отмечены у больных РПЖ с наличием отдаленных метастазов, выявленных при первичном обследовании Гак, в группе 72 больных РПЖ при отсутствии отдаленных метастазов 5-легаяя безрецидивная выживаемость составила 47,6±9,0%, тогда как в группе из 14 больных с наличием отдаленных метастазов - 35,7+19,9% Медианы времени до развития рецидива составили 39,6±6,3 мес и 20,6±11,2 мес соответственно, однако эти различия статистически незначимы (р=0,096)

Показатель 5-летней безрецидивной выживаемости больных РПЖ был достоверно выше в группе 46 больных с показателем Глисона менее 6 (86,1+7,5%) и снижался при повышении степени дифференцировки опухоли Так, при

показателе Глисона равном б у 34 больных 5-летняя безрецидивная выживаемость составила 31,3±12,6% (медиана - 27,0 мес.), при показателе Глисома 7 у 36 больных 5-легняя безрецидивная выживаемость составила 27,1+13,7% (медиана - 24,6 мес.), при показателе Глисона 8 у всех 10 больных РПЖ развился рецидив заболевания в первые 5 лет1 от начала лечения (медиана - 26,0 мес.) (р=0,03). Эти данные указывают, что при РПЖ с прогнозом заболевания связана не только распространенность процесса, но и степень дифференцировки опухоли.

Недостоверно более высокие показатели безрецидивной выживаемости отмечены в группе молодых пациентов. Так, у 26 больных в возрасте до 60 лет 5-летняя безрецидивиая выживаемость составила 64,8+14,3%, у 56 больных в возрасте от 60 до 70 лет - 46,1±10,7%, у 40 болышх старше 70 лет-47,9±11,9%.

Оценили различия в показателях безрецидивной выживаемости больных РПЖ я группах с пороговыми значениями общего ПСА равными 10 нг/мл (рис. 9). Так, в группе 80 больных РПЖ с исходным уровнем общего ПСА в сыворотке нрови до 10 нг/мл показатель 5-летней безрецидивной выживаемости составил 66,7±11,1% (медиана периода времени до развития рецидива не достигнута), тогда как у 36 больных при значениях общего ПСА более 10 нг/мл 5-летняя безрецидивиая выживаемость равнялась 11,1±6,2% (медиана - 25,1±7,8 мес.), различия статистически достоверны (р=0,001).

Рис. 9. Безрецидивиая выживаемость больных раком предстательной железы в зависимости от исходного содержания общего ПСА в сыворотке крови.

СРОК* НЭбЛВДОфШЯ, ИЙ5.

— РСА да 1 СЦГ/мп ■ ■ РСДбйп» Ю нг/мл

Оиенили различия в показателях безрецидивной выживаемости больных РГ1Ж в группах с пороговыми значениями равными 170 пг/мл (рис. 10), В

группе из 84 больных РПЖ с уровнем УЕОР в сыворотке крови менее 170 пг/мл показатель 5-летней безрецидивной выживаемости составил 64,7±11,1% (медиана периода времени до рецидива не достигнута за 5 лет наблюдения), тог да как у 40 больных РПЖ со значениями УЕСР более 170 яг/мл 5-летняя безрецидивная выживаемость составила 17.1±6,2% (медиана - 25,5±7,8 мес.), различия статистически достоверны (р=0,007).

СрОК* НВЙЛЮДЪНИЛ, КСС|

Рис. 10. Без рецидивная выживаемость больных раком предстательной железы в зависимости от исходного содержания УЕвР в сыворотке крови.

В то же время различия в показателях безрецидивной выживаемости больных РПЖ в группах с пороговыми значениями ШРВР1 равными 65 пг/мл были недостоверными (р=0,7), Так, в группе да 58 больных с исходными значениями ЮРВР1 в сыворотке крови =< 65 нг/мл 5-летняя безрецидивная выживаемость составила 44,б±7,7% (медиана периода времени до рецидива равнялась 32,4±7.8 мес,), у 64 больных со значениями ГОБВРI более 65 нг/мл 5-летняя безрецидивная выживаемость была равна 52,2±9,5%.

Не выявлено различий (р=0,13) в показателях беэрецидиввой выживаемости больных в зависимости от значений ЮРВРЗ в сыворотке крови, однако более высокие показатели безрецидивной выживаемости выявлены в группе бол:ышх РПЖ с исходным содержанием белка =с 1500 нг/мл (рис. 11). Так, у 50 больных с низким содержанием ЮРВРЗ 5-легняя безрепидивная выживаемость больных РПЖ

составила 60,6±Ю,5% (медиана периода времени до развития рецидива не достигнута за 5-легший срок наблюдения). Тогда как в группе на 74 больных РПЖ со значениями ЮБВР] в сыворотке крови > 1500 нг/мл 5-летняя безрецидивная выживаемостьсоставила42,0±8,9%(медиана-31,4±8.7 мес,).

Рис. 11. Ъезрецидивная выживаемость больных раком предстательной железы в зависимости от исходного содержания ЮРВРЗ & сыворотке крови.

Наибольшие различия в показателях 5-летней безрецидивной выживаемости больпых РПЖ обнаружены в группах со значениями ЮР1 =< и более 40 нг/мл, однако различия были статистически недостоверными (р=0,26). Так, в группе из 42 больных РПЖ с низким содержанием белка (=<40 нг/мл) 5-летняя безрецидивная выживаемость составила 56,1 ±12,2 нг/мл (медиана периода времени до рецидива не была достигнута за 5-летний срок наблюдения). Тогда как в группе из 84 больных с более высоким содержанием белка (>40 нг/мл) 5-летняя безрецидивная выживаемость составила 47,7±8,2% (медиана - 33,8±б,4 мес.).

Не выявлено различия в безрецидивной выживаемости больных РПЖ в группах с значениями ЮР2 менее и более медианы этого показателя - равной 300 нг/мл (р=0,97). Не обнаружено связи с безрецидивной выживаемостью больных РПЖ следующих показателей: УШР/ЮР!, УЕОРДСР2, IG.P1/ПСА и ЮР2/ПСА.

Таким образом, анализ исходных показателей ПСА в сочетании с уровнем \TEGF оказывается эффективным не только с целью уточнения дооперационной диагностики в клинической практике, но и в оценке прогноза заболевания. Наилучшие отдаленные результаты лечения обнаружены у 30 больных с исходным уровнем ПСА =< 10 нг/мл и УЕОЕ; * =< 170 пг/мд. У этих пациентов в течение 5-летиего срока наблюдения рецидив РПЖ не выявлен, тогда как 5-лепняя

безрецидивная выживаемость в группе 84 больных, хотя бы с одним неблагоприятным значением из двух выше указанных показателей, была многократно ниже и не превышала 30%

При многофакгорном анализе обнаружено, что с отдаленными результатами лечения больных РПЖ достоверно связаны следующие факторы показатель Глисона (р=0,001), исходные концентрации общего ПСА (р=0,001) и УЕОБ (р=0,001) в сыворотке крови

ВЫВОДЫ

1 Уровни общего ПСА в сыворотке крови больных доброкачественной гиперплазией и раком предстательной железы достоверно различались (9,5±2,9 и 71,0±19,0 нг/мл, соответственно, р=0,004). При пороговом значении общего ПСА, равном 10,0 нг/мл, ошибочная классификация в группе доброкачественной гиперплазии составила 22,2% [95% С1=6,4%-47,6%], а в группе рака - 22,4%.

2 При однородном варианте гистологического строения рака предстательной железы уровень общего ПСА в сыворотке крови был достоверно ниже (медиана -26,0 нг/мл), чем при смешанном гистологическом строении опухоли (медиана -45,0 нг/мл; р=0,005)

3. Коэффициент соотношения УЕОЖГСАобщ у больных доброкачественной гиперплазией предстательной железы был достоверно выше, чем при раке (медианы 13,9 и 3,5 соответственно, р=0,004)

4 При сроках заболевания от одного года и более уровни ЮБ1 в сыворотке крови больных раком предстательной железы были достоверно выше по сравнению доброкачественной гиперплазией (медианы 104,0 и 27,0 нг/мл соответственно, р=0,008)

5 Концентрация ЮР2 в сыворотке крови практически здоровых мужчин была достоверно (р=0,001) выше (713±21 нг/мл), чем у больных доброкачественной гиперплазией (300±19 нг/мл) и раком предстательной железы (305±8 нг/мл)

6 При оценке соотношения ШРВР1/ПСАо6щ определены высокодостоверные различия между больными раком и доброкачественной гипершнвией предстательной железы (4,2±0,8 и 15,4±3,6 соответственно, р=0,00004)

7 При сроках заболевания более чем один год у больных раком предстательной железы уровень ЮРВРЗ в сыворотке крови был почти в два раза

выше по сравнению с доброкачественной гиперплазией (2242±230 и 1050±258 нг/мл соответственно, р=0,016)

8 Определение уровня УЕОБ при значениях ПСА более 10 нг/мл, а уровня ЮРВР1 - при значениях ПСА до 10 нг/мл в сыворотке 1фови позволяет с высокой достоверностью уточнить клинический диагноз рака предстательной железы у 50% пациентов.

9 Доказано, что редуктазная активность 17р-гидроксистероиддегидрогеназы в раке предстательной железы на порядок выше по сравнению с доброкачественной гиперплазией Общая активность 17р-гидроксистероиддегидрогеназы в растворимой фракции рака предстательной железы прямо пропорциональна концентрации 4-андростен-3,17-диона в сыворотке крови больных

10 Выявлена высокая эффективность определения пиридинолина и дезоксипиридинолина в моче в качестве чувствительных и специфичных критериев диагностики костных метастазов в случаях рака предстательной железы.

11 Установлено, что экспрессия рецептора эпидермального фактора роста -Нег-2/пеи в подавляющем большинстве опухолей предстательной железы была отрицательной

12 Обнаружено, что экспрессия рецепторов андрогенов практически во всех наблюдениях была резко положительной как в ядрах раковых клеток, так и в ядрах эпителия неизмененной ткани предстательной железы и в участках РВД-2, что может быть использовано в дифференциальной диагностике костных метастазов из первично не выявленного очага

13 Отсутствие экспрессии белка Кл-67 в опухоли предстательной железы может указывать на доброкачественный характер поражения органа. У больных раком предстательной железы уровень экспрессии белка Ю-67 достоверно отражает степень дифференцировки опухоли по Глисону.

14 При многофакторном анализе обнаружено, что с прогнозом РПЖ достоверно связаны показатель Глисона (р=0,001), исходные концентрация общего ПСА (р=0,001) и УЕвР (р=0,001) в сыворотке крови

Практические рекомендации

1. Совместное определение в сыворотки крови УЕОБ и общего ПСА позволяет улучшить клиническую диагностику РПЖ на добиопсийном этапе, особенно при уровне ПСА более 10 нг/мл и УЕОР менее 160 пг/мл

2. Целесообразно исследование концентрации ЮР1 так как у больных РПЖ уровень этого фактора роста прямо пропорционально коррелирует со значениями общего ПСА в сыворотке крови.

3 Использование пороговых значений ПСА (10 нг/мл), УЕвР (160 пг/мл) и ЮРВР1 (65 нг/мл) позволяет выработать алгоритм диагностических решений, а применение вышеуказанных маркеров дает возмоясность определения индивидуальной вероятности правильного диагноза до выполнения биопсии.

4 Трактовка этих показателей у мужчин в возрасте старше 40 лет помогает раннему выявлению РПЖ, что может способствовать более эффективному лечению этих заболеваний и улучшению качества жизни

5 Первичным методом диагностики метастатического поражения костей при РПЖ является определение экскреции пиридинолина и дезоксипиридинолина с мочой, так как их концентрация свидетельствует о высокой диагностической специфичности при деструктивных процессах в костях

6 Положительная иммуногистохимическая реакция на рецепторы андрогенов в преобладающем числе биоптатов из опухоли предстательной железы весьма полезный маркер при уточнении гистогенеза метастатического очага поражения в костях, когда не выявлен первичный опухолевый очаг.

7 С прогнозом РПЖ достоверно связаны показатель Глисона, исходные концентрации общего ПСА и УЕОР в сыворотке крови

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1 Ключевой активатор ангиогенеза - фактор роста эндотелия сосунов у больных раком и доброкачественного гиперплазией предстательной железы // Сибирский онкологический журнал -2004.-№2-3(10-11).-С 107-110 (Трапезникова М.Ф, Шибаев А Н, Казанцева И А, Морозов А П, Миронова О С, Гуревич Л Е, Уренков С Б, Кушлинский НЕ).

2. Рецепторы андрогенов в цитозольной фракции рака предстательной железы и длительность безрецидивной выживаемости больных на фоне эстрогенотерапии В материалах конгресса «Национальные дни лабораторной медицины России-2004» (Москва, 20-22 октября 2004г.) // Клиническая

лабораторная диагностика -2004 -№9 -С 11-12 (Светозарский Н JL, Казанцева И А, Трапезникова М.Ф, Гориловский JIМ, Кушлинский Н.Е., Морозов АЛ)

3 Фактор роста эндотелия сосудов у больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы // Вестник РАМН -2005 -№5 -С 14-16 (Трапезникова М Ф, Морозов АП, Шибаев А Н, Казанцева И А, Миронова О С, Гуревич JI Е, Уревков С Б., Кушлинский HJE ).

4. Редукгазная активность 17ß-rCP в биоптатах предстательной железы // В материалах XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 18-22 апреля 2005г) -М -2005 -С.52-53 (Трапезникова М Ф., Бабкина Т В, Морозов А.П, Деггярь ВТ, Казанцева И А, Копаева JIБ )

5 Чувствительность специфичность определения концентрации фактора роста эндотелия сосудов и инсулиноподобных факторов роста I и 2-го типа при раке предстательной железы // В материалах XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 18-22 апреля 2005г)-М-2005.-С 264 (Трапезникова М Ф, Казанцева И А., Морозов А П, Шибаев А Н, Яншин А.А, Кушлинский НЕ)

6 Редукгазная активность 17р-гидроксистероидредуктазы в опухолях предстательной железы разного гистологического строения // Бюлл экспер. биол -2005-том 139, №6 -С 684-687 (Трапезникова МФ, Деггярь В Г, Морозов АП, Бабкина Т В, Казанцева И А, Кушлинский Н.Е)

7 Факторы роста при раке предстательной железы Чувствительность и специфичность определения их концентрации в сыворотке крови // В материалах конференции «Национальные дни лабораторной медицины России-2005» (Москва, 10-14 октября 2005г) // Клиническая лабораторная диагностика-2005.-№9-С.19 (Трапезникова М Ф , Казанцева И А, Морозов А П, Шибаев АН).

8 Insulin-like growth factors (IGF-1 and IGF-2) in prostate cancer detection // 16-th International Congress on anti-cancer treatment (Paris, Februaru lth-44, 2005) -P.296-297 (Trapezmkova M.F., Morozov A.P , Urenkov S В , Shibaev AN, Yanshin A A, Kushlinsky NE)

9 Инсулиноподобные факторы роста и фактор роста эндотелия сосудов при раке предстательной железы // В материалах VI Всероссийского съезда онкологов «Современные технологии в онкологии» (Ростов-на-Дону, 11-15 октября

2005г) -Ростов-на-Дону -2005,-том 2 -С 147-148 (Трапезникова М Ф, Морозов А.П, Шибаев А Н, Миронов О С, Яншин АА, Уренков С .Б, Казанцева И А.).

10 Чувствительность и специфичность определения концентрации факторов роста (ЮР-1, ЮР-2, У1ЮР) в сыворотке крови при раке предстательной железы // В материалах П всероссийской конференции «Мужское здоровье» -М -2005 -С 189-190 (Трапезникова МФ, Морозов АП, Шибаев АН, Кушлинский НЕ)

11 Факторы роста в диагностике раке предстательной железы // В материалах П Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 20-21 октября 2005г )-М-2005-С 268 (Трапезникова М Ф, Морозов А П, Шибаев А Н, Казанцева И А)

12 Факторы роста в диагностике рака предстательной железы Н В материалах IX Российского онкологического конгресса (Москва, 22-24 ноября 2005г)-М-2005 -С211 (Трапезникова М.Ф., Морозов А.П, Шибаев АН, Казанцева И А, Лякина Л Т )

13 Факторы роста (УБвР, ЮР-1 и ЮР-2) в сыворотке крови при раке предстательной железы // В материалах XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006г.).-М -2006 -С 304 (Трапезникова М Ф, Шибаев А Н, Морозов А П, Казанцева И А, Бабкина ИВ)

14 Значение биохимических маркеров костного метаболизма при поражении скелета у больных раком молочной и предстательной желез // В тезисах международной научно-практической конференции «Ведущий многопрофильный госпиталь страны основные функции, достижения и направления развития» (Москва, 1-2 июня 2006г)-М-2006.-С 191 (Пашков М.В, Любимова НВ., Кожарская Г В, Кочергина Н В , Морозов А П)

15. Факторы роста при раке и доброкачественной гиперплазии предстательной железы // В тезисах международной научно-практической конференции «Ведущий многопрофильный госпиталь страны: основные функции, достижения и направления развития» (Москва, 1-2 июня 2006г.) -М.-2006.-С 197 (Трапезникова М Ф, Морозов А.П, Шибаев А Н, Казанцева И А)

16 Значение биохимических маркеров костного метаболизма при поражении скелета у больных раком молочной и предстательной желез // Сибирский онкологический журнал-2006-№3(19)-С 116-117 (Любимова НВ,

Пашков М В, Кожарская Г В., Кочергина Н В., Карабекова 3 К, Морозов А П, Гольдберг В Е )

17 Биохимические маркеры костного ремоделирования при поражении скелета у больных раком молочной и предстательной желез // Молекулярная медицина -2007 -№1 -С 20-23 (Любимова Н В, Пашков М.В, Кожарская Г В , Карабекова 3 К, Морозов А П, Томе М Г )

18 Белок 1-го типа, связывающий инсулиноподобные факторы роста в сыворотке крови при раке и аденоме предстательной железы // Урология.-2007 -№2 -С 50-53 (Трапезникова М Ф, Кушлинский Н Е, Морозов А П).

19. ИФР связывающий белок 1-го типа при раке предстательной железы // В материалах XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007г.)-М-2007-С 157-178 (Трапезникова М.Ф., Морозов А.П, Казанцева И А, Любимова Н.В )

20 Открытое рандомизированное сравнительное исследование сравнительной эффективности и безопасности селективного а-адреноблокатора сетегиса (теразозин) в лечении больных хроническим бактериальным простатитом // Урология -2007 -№2 -С 33-37 (Трапезникова М Ф, Дутов В В., Уренков С Б , Морозов А П, Поздняков К В , Бычкова Н В)

21 Острая задержка мочеиспускания при аденоме предстательной железы // Урология.-2007.-№3-С 98-102 (Трапезникова МФ, Морозов АП, Поздняков К.В )

Заказ №239 Объем 2 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Актуальность темы. Проблема рака предстательной железы (РПЖ) в настоящее время считается одной из наиболее актуальных, так как среди злокачественных новообразований мочеполовых органов этот вид опухоли выявляется наиболее часто (В.А.Соловов, 2006). В структуре онкоурологических заболеваний в России РПЖ составляет 36% (В.Н.Шолохов, 1999). По данным отечественных и зарубежных авторов РПЖ занимает второе место с постоянной тенденцией к росту в последнее десятилетие (М.П.Гойхберг и соавт., 1984; Н.Е.Кушлинский и соавт., 2003; М.И.Давыдов и соавт., 2006), уступая первое место меланоме. Так, за период с 1990 по 1995 гг. прирост заболеваемости РПЖ составил 32,3% (В.В.Двойрин и соавт., 1996). За период с 1985 по 1995 гг. прирост смертности от РПЖ составил 29,8% (Е.М.Аксель и соавт., 1996). В целом по России 5-летняя выживаемость среди взятых на учет больных РПЖ составляет около 25%. Статистические данные также показывают, что ежедневно регистрируется в России 25-30 новых случаев РПЖ, а умирает 1417 пациентов (Е.М.Аксель и соавт., 2002). Высокие показатели летальности при РПЖ обусловлены длительным скрытым и бессимптомным развитием опухолевого процесса, при этом уже при первичном обращении от 60 до 80% больных имеют отдаленные метастазы (Б.В.Бухаркин, 1999; А.М.Гарин, 2005). Кроме того, по данным ряда авторов уже через 18-25 месяцев после начала антиандрогенной терапии у большинства больных развивается гормонорезистентность опухоли и, как следствие, прогрессирование ее роста и метастазирование, что и объясняет весьма низкую выживаемость данного контингента больных (А.В.Важенин и соавт., 2006). Это заболевание является ведущей причиной смерти от злокачественных опухолей у мужчин. Следовательно, повышенный интерес отечественных и зарубежных исследователей к проблеме РПЖ объясняется неуклонным ростом заболеваемости и смертности, а также трудностями своевременной диагностики этого заболевания (Н.А.Лопаткин, 1999; Л.М.Гориловский и соавт., 1999).

Этиология РПЖ не известна, патогенетические механизмы активно исследуются и направлены на изучение «биологического» поведения опухоли с использованием современных молекулярно-биологических маркеров в оценке ранней диагностики болезни, инвазивной и метастатической активности опухоли. Все это позволит выявить новые факторы прогноза и маркеры неблагоприятного течения заболевания, оценить чувствительность опухоли к гормональным и химиотерапевтическим препаратам.

Благодаря успехам биохимии и молекулярной биологии, в настоящее время в арсенале исследователей и клиницистов имеется огромное количество биологически значимых показателей, которые могут помочь в прогнозе раннего рака предстательной железы и выборе адъювантной терапии при распространенном процессе. Задачей исследователей, работающих в данной области, является определение того набора наиболее значимых, дополняющих друг друга показателей, который позволил бы при минимально возможной стоимости обследования обеспечить максимальную эффективность лечения каждого больного (Н.С.Сергеева, 2006). Спектр исследований в каждом конкретном случае может зависеть от стадии заболевания, возраста больного, планируемой терапии и материально-технической базы учреждения.

Следует отметить, что для некоторых молекулярных маркеров конкретная биологическая функция пока не установлена. Практически ни один из молекулярных маркеров в их традиционном понимании не может быть использован для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований предстательной железы. Их основная роль заключается в том, чтобы помочь в оценке прогнозировании исхода заболевания и в индивидуализации лекарственной терапии. При этом, количество показателей, рассматривающихся в качестве потенциальных молекулярных маркеров, увеличивается лавинообразно, отражая достижения и находки в области изучения механизмов регуляции пролиферации и дифференцировки опухолевых клеток. В их число входят онкогены и протоонкогены, онкобелки, различные факторы роста и их рецепторы (в большинстве случаев также являющиеся продуктами онкогенов), рецепторы стероидных и пептидных гормонов, супрессорные гены и продукты их экспрессии, гормонозависимые белки, протеазы, участвующие в процессах метастазирования, интегрины, отвечающие за межклеточные контакты, активаторы ангиогенеза (Н.С.Сергеева, 2006).

Определение любого молекулярного маркера при раке предстательной железы может, в принципе, иметь два практических результата: либо выявление группы риска, требующей дополнительного лечения или более тщательного наблюдения, среди больных ранними стадиями, не подлежащих адъювантной терапии по другим клиническим и лабораторным показаниям, либо оценка чувствительности к определенным видам терапии и индивидуализация схем адъювантного лечения больных с распространенным процессом (Н.С.Сергеева, 2006).

Еще одним аспектом практического использования результатов изучения молекулярно-биологических характеристик опухолей предстательной железы может быть разработка новых препаратов, направленно воздействующих на эти молекулы и блокирующих, регулируемые ими процессы. Этот подход особенно актуален тогда, когда исследуемый маркер имеет непосредственное отношение к регуляции пролиферации и/или дифференцировки клеток или их метастатической активности.

Одними из наиболее важных направлений в этих исследованиях при раке предстательной железы считаются метаболизм андрогенов в опухоли и ее чувствительность к андрогенам (Н.Е.Кушлинский и соавт., 2005). В настоящее время имеются все основания полагать, что гормональное действие андрогенов в большинстве тканей-мишеней осуществляется не столько теми андрогенами, которые поступают в них из крови, сколько за счет образования активных метаболитов в самих тканях, в первую очередь андрогена-эффектора (В.Г.Дегтярь, 1992; В.Г.Дегтярь и соавт., 1998; В.Г.Дегтярь и соавт., 20006; Shaw G. et al., 2000). Следовательно, из крови в ткань поступают неактивные андрогены-предшественники, источником которых являются стероидогенные ткани — половые железы и надпочечники, и качественный и количественный состав андрогенов в ткани-мишени зависит не только от секреции их половыми железами и надпочечниками, но и от активности ферментов метаболизма андрогенов в этой ткани, что и обусловливает содержание каждого отдельного андрогена в клетке-мишени (В.Г.Дегтярь, 1992). Для метаболизма андрогенов и для механизма их действия чрезвычайно важно превращение Т в ДГТ при участии 5а-Р, поэтому иногда этот фермент называют «ключевым» ферментом метаболизма андрогенов (В.Г.Дегтярь и соавт., 2000а; Bruchovsky N., 1997). Важную роль во многих случаях играет фермент 17(3-ГСР, в первую очередь во взаимном превращении Т и А4, Е1 и Е2, ДЭА и Д5-ЗР-Д, при биосинтезе андрогенов и эстрогенов как в половых железах, так и в периферических тканях (Labrie F. et al., 1994; Bonney R.C. et al., 1996; Penning T.M., 1997; El-Alfy M. et al., 1999;). Этот фермент проявляет преимущественно редуктазную активность, однако при некоторых патологических состояниях в периферических тканях соотношение редуктазной и дегидрогеназной активностей 17Р-ГСР может значительно изменяться, как это показано, по данным предварительных исследований для предстательной железы у пожилых мужчин, что, безусловно, может иметь важное значение при канцерогенезе (Labrie F. et al., 1994; Hakimi J.M. et al., 1997; El-Alfy M. et al., 1999).

В настоящее время большое внимание уделяется проблеме неоангиогенеза в злокачественных опухолях, так как уже не вызывает сомнения тот факт, что опухоль не может развиваться и расти без образования в ней разветвленной сети сосудов, обеспечивающих снабжение клеток кислородом и питательными веществами. Интерес к этой проблеме возник более 30 лет назад, однако до относительно недавнего времени основной характеристикой активности неоангиогенеза в опухолях являлась микроскопическая оценка плотности сосудов в опухолевой ткани (микрососудистой плотности). И только относительно недавно, в результате изучения молекулярных механизмов ангиогенеза, интенсивно развивавшегося в последние 5-10 лет, было продемонстрировано наличие целого ряда регуляторных ангиогенных и антиангиогенных факторов, динамический баланс которых и обеспечивает формирование и распространение новых сосудов внутри опухоли.

В регуляции ангиогенеза тем или иным образом участвуют многие известные факторы роста и цитокины, такие как основные и кислые факторы роста фибробластов (оФРФ и кФРФ), эпидермальный фактор роста (ЭФР), а-и p-трансформирующие факторы роста (ТФР), тромбоцитарный фактор роста эндотелиальных клеток/тимидинфосфорилаза, фактор некроза опухолей, интерлейкины и др. Однако, наиболее важным положительным регулятором ангиогенеза бесспорно является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), называемый также фактором проницаемости сосудов. Уникальность этого фактора заключается в том, что, в отличие от всех других факторов роста, он митогенен только по отношению к эндотелиальным клеткам.

Основными растворимыми формами VEGF являются молекулы размером 121 и 165 аминокислотных остатков, они же являются и основными биологически активными формами VEGF.

На поверхности эндотелиальных клеток имеется три рецептора для VEGF, являющихся типичными рецепторными тирозинкиназами. Все рецепторы представляют собой трансмембранные гликопротеиды с мол. массой 170-235 кБа и для эффективного связывания VEGF с рецепторами необходимо его взаимодействие с гепарино-подобными компонентами внеклеточного матрикса. Показано (Speirs V. et al., 1999), что как опухолевые, так и стромальные клетки, выделенные из первичных карцином различного гистогенеза, продуцируют VEGF in vitro, и уровень его продукции значительно выше, чем у соответствующих клеток, выделенных из нормальной ткани соответствующего органа. Кроме того, показана тесная связь между активностью процессов неоангиогенеза в первичной опухоли и ее склонностью к инвазивному росту и метастазированию (Ferrara N., 1997; Muzzucchelli R., 2000).

Несмотря на то, что простатический специфический антиген (ПСА) в настоящее время считается общепризнанным опухолевым маркером, и широко используется в диагностике и мониторинге рака предстательной железы (РПЖ) (Л.М.Гориловский, 1999; Н.А.Лопаткин, 1999), фактором, ограничивающим использование ПСА в ранней диагностике и скрининге РПЖ, является его низкая специфичность и обусловлена повышением концентрации маркера в сыворотке крови при не опухолевых заболеваниях ПЖ, а также у здоровых мужчин в пожилом возрасте. Изучение механизмов канцерогенеза ПЖ за последнее десятилетие привело к открытию ряда биологически активных веществ, которые играют важную роль в этих процессах. Так, одними из мощных промоторов роста раковых клеток считаются инсулиноподобные факторы роста I и II типов (ИФР-I, ИФР-П), которые непосредственно стимулируют процессы репликации и дифференцировки опухольтрансформированных клеток.

Показано, что в неопластический процесс при РПЖ может быть вовлечен ИФР-I, и это происходит под влиянием локального воздействия гормонов, в частности, андрогенов. В литературе обсуждается возможность индукции роста злокачественных опухолей, в том числе и РПЖ, под действием ИФР-I и ИФР-П, мощных аутокринно-паракринных регуляторов роста и дифференцировки клеток при взаимодействии с другими биологически активными веществами. Кроме того, в литературе появились первые сообщения о том, что ИФР наряду с ПСА могут быть использованы в дифференциальной диагностике РПЖ и ДГПЖ.

Стало известно, что систему ИФР составляют лиганды, связывающие их белки и рецепторы (Jose F. Сага, 1994). Лиганды, ИФР-I и ИФР-П, - это пептиды, присутствующие в сыворотке крови и в тканях и вместе с инсулином представляющие группу сывороточных белков со сходной структурой и функциями. Указанные белки состоят из "А" и "В" цепей, связанных дисульфидными мостиками, на 50% гомологичны по структуре, однако каждый имеет свои особенности. ИФР-I и ИФР-П имеют соединяющий, или "С" пептидный сегмент, состоящий из 12 и 8 аминокислотных остатков, соответственно, который связывает обе цепи и "D" сегмент, продолжающий "А" цепь на 8 и 6 аминокислотных остатков, соответственно. Кроме того, известно, что существует 2 формы ИФР-П: с большим и меньшим молекулярным весом, причем первая форма продуцируется опухолями, а вторая обнаружена в сыворотке крови здоровых людей (Daughaday W.H. et al., 1988). Наличие общего в первичной структуре у ИФР и инсулина позволило высказать предположение и о сходстве их пространственного строения (Blundell T.L. et al., 1980).

ИФР циркулируют в организме в комплексе с высокоспецифичными ИФР связывающими белками (ИФРСБ), выполняющими важные биологические функции (Lamson G. et al., 1991; Rechler M.M. et al., 1992). В настоящее время известно 10 ИФРСБ, по мере открытия им присваивались соответствующие номера от ИФРСБ-1 до ИФРСБ-10, и доказано, что они присутствуют в тканях и в плазме крови и обладают подобными структурными и функциональными характеристиками (Rechler M.M. et al., 1992). ИФРСБ специфически связывают ИФР-I и ИФР-П, проявляя при этом высокую аффинность, и не связывают инсулин и проинсулин. У ИФРСБ-2, -5 и -6 определена большая связывающая способность к ИФР-П, а ИФРСБ-1 ,-3 и -4 проявляют одинаковое сродство, как к ИФР-1, так и к ИФР-П. Все десять белков в различной степени снижают биологические эффекты ИФР. Поэтому ИФРСБ скорее следует рассматривать как модуляторы физиологической функции ИФР-I. ИФРСБ-1 - это негликозилированный протеин, Mr 25000, который впервые выделили из децидуальной оболочки эндометрия и амниотической жидкости (Jose F. Сага, 1994). У человека ген ИФРСБ-1 связан с 7-й хромосомой и экспрессируется клетками децидуальной оболочки эндометрия, печени и грануляционной ткани яичников. Экспрессия гена и уровни указанного белка регулируются, в первую очередь, инсулином; отмечено увеличение экспрессии ИФРСБ-1 при дефиците инсулина у нелеченых больных сахарным диабетом и недостатке гормона роста, и резкую супрессию синтеза ИФРСБ-1 после инсулинотерапии. Детальное изучение структуры этого белка показало наличие в нем участка, состоящего из трех последовательно расположенных аминокислот Арг-Гли-Асп, которые принимают участие в связывании ИФРСБ-1 с белками клетки-мишени и помогают выполнению их биологической роли. Что касается функции, то доказано, что ИФРСБ-1 способен, в определенных условиях, как снижать, так и повышать активность обоих ИФР.

ИФРСБ-3 - основной циркулирующий в сыворотке крови белок этой группы, связывающий более 90% ИФР. У человека ген ИФРСБ-3 локализован в хромосоме 7, вблизи гена ИФРСБ-1. Его экспрессия отмечена в печени и во многих других тканях, в том числе и в почках, желудке, сердце, яичниках и яичках. В сыворотке крови ИФРСБ-3 находится в комплексе с зависящей от гормона роста кислотолабильной субъединицей, Mr 150000. Уровни этого ИФР связывающего комплекса зависят от гормона роста и отражают уровни ИФР-I в плазме крови; низкие показатели наблюдали у детей и при недостаточности гормона роста, а высокие - при введении гормона роста или ИФР-I. Относительно влияния указанного ИФРСБ на активность ИФР следует сказать, что описаны примеры как активирующего, так и подавляющего воздействия (Rechler М.М. et al., 1992; Jose F. Сага, 1994). При дальнейшем изучении ИФРСБ-3 было установлено, что он сохраняет способность подавлять пролиферацию и рост ткани, даже когда лишен возможности связываться с ИФР. Он ингибировал рост клеточной линии фибробластов, в которых был разрушен рецептор ИФР-I. Таким образом, ИФРСБ-3 может проявлять свое биологическое действие без участия ИФР-1. Дополнительные исследования показали связывание ИФРСБ-3 с поверхностными мембранами клеток, которое коррелировало с вызываемым им подавлением роста и пролиферации, и оба эти эффекта ингибировались ИФР-1. ИФРСБ-3 стимулировал также апоптоз и проявлял способность проникать в ядро. Известный ингибитор роста — онкосупрессор р53 стимулировал продукцию ИФРСБ-3 (Ю.А.Панков, 1999). Выше изложенные данные позволяют предположить, что для осуществления своей функции ИФРСБ-3 должен предварительно связаться со специфическим рецептором на поверхности клеток и, исходя из этого, его можно отнести к группе гормонов-ингибиторов роста и антагонистов ИФР-1.

ИФР осуществляют свои функции путем связывания со специфическими рецепторами, имеющимися на поверхности клеток. В настоящее время описано два вида ИФР рецепторов, I тип - рецепторы ИФР-1 и II тип - рецепторы ИФР-П/манозо-6-фосфата (Rechler М.М. et al., 1985). Оба типа рецепторов клонированы и определена их первичная структура. Связывание гормонов с описанными рецепторами приводит к активации процессов митоза и, подобно инсулину, влияет на метаболизм в клетках-мишенях. ИФР-1 является мощным промотором роста клеток, непосредственно стимулируя процессы репликации и дифференцировки (Froesch E.R. et al., 1990). Свою биологическую роль он выполняет, как уже было ранее отмечено, взаимодействуя с рецепторами ИФР I типа, однако имеются данные о том, что 1% имеющегося в наличии ИФР-1 связывается с рецепторами инсулина. Детальные исследования по изучению физиологической роли ИФР-1 показали, что очень незначительное количество последнего циркулирует в сыворотке крови в свободном состоянии. В норме, большая часть, 70-80% ИФР-1, как и ИФР-П, связана с f

ИФРСБ-3, образуя комплекс 150 kD, состоящий из субъединицы связывающего белка -3 (СБ-3), кислотолабильной субъединицы и одной молекулы ИФР (Е.Г.Зезеров, 1999). Эта довольно большая молекулярная форма не способна проникать через капиллярный барьер и, поэтому, имеет относительно большой период жизни, около 12-16 часов. Для сравнения укажем, что соединение ИФР с субъединицами СБ-1, СБ-2 или СБ-3, 50 Ш, составляет 20-30% , существует около 20-30 минут и может проникать через капиллярный барьер в ткани (Zapf J. et al., 1990). ИФР в свободной форме составляет всего 2% от общего количества и существует несколько минут (Guler Н.Р. et al., 1989). В литературе обсуждаются вопросы возможной индукции роста злокачественных опухолей, в том числе и рака предстательной железы, под воздействием ИФР-I и ИФР-П, которые являются мощными аутокринно-паракринными регуляторами роста и дифференцировки клеток, а также связь ИФР с показателями безрецидивной выживаемости и прогнозом болезни. В настоящее время ИФР рассматриваются в качестве маркеров опухолей различного гистогенеза, важных в прогностическом плане (Е.С.Герштейн и соавт., 1999), а также, как потенциальная мишень для блокирования передачи митогенного сигнала в клетку. Тем не менее, несмотря на активные экспериментальные и клинические исследования, однозначного понимания роли ИФР-подобных пептидов и их рецепторов при различных злокачественных опухолях человека и, в частности, при раке предстательной железы до сих пор нет.

Среди злокачественных новообразований, которые метастазируют в кости, рак предстательной железы занимает первое место. По данным C.S.Galasko (1986) 54-85% больных раком предстательной железы имеют метастазы в кости. Метастазы рака предстательной железы чаще всего поражают кости таза, пояснично-крестцовый отдел позвоночника. Такая локализация сопровождается выраженным болевым синдромом, приводит к опасным для жизни осложнениям и в конечном итоге к гибели больных.

Относительно высокая выживаемость этих больных (по данным R.Coleman (1994) медиана составила 24 месяца), а также появление новых эффективных подходов к лечению метастазов в кости делает весьма актуальной проблему своевременной их диагностики. Используемые для этого в клинической практике рентгенологические и радиоизотопные методы исследования скелета обладают недостаточной чувствительностью и специфичностью (М.А.Чибисова, 1993; Tubiana-Hulin М., 1991), что затрудняет раннюю диагностику метастазов в кости, правильное планирование терапии, а также наблюдение за течением процесса и оценку эффективности проводимого лечения.

Все выше перечисленное, делает актуальным поиск более чувствительных методов оценки состояния скелета у больных раком предстательной железы.

В последние несколько лет в связи с интенсивными исследованиями молекулярных механизмов костного метастазирования, а также появлением новых подходов к профилактике метастазов в кости, стала очевидной необходимость поиска чувствительных и специфичных маркеров, позволяющих проводить своевременную диагностику и мониторинг поражения скелета у больных раком предстательной железы.

По данным литературы, межмолекулярные пиридиновые связи коллагена, пиридинолин и дезоксипиридинолин, экскретирующиеся с мочой в составе коллагеновых фрагментов при деструкции костного матрикса, являются объективными критериями интенсивности костной резорбции при заболеваниях скелета метаболического характера (Robins S.P. et al., 1995; Seibel M.J. et al., 1992).

Сведения литературы, касающиеся изучения пиридиновых связей коллагена как критериев резорбции костной ткани при метастатическом поражении скелета, немногочисленны и выполнены на небольших группах онкологических больных (Coleman R.E. et al., 1992). Практически отсутствуют данные о значении и возможности клинического использования этих показателей в диагностике и мониторинге поражения скелета у больных раком предстательной железы.

Другим наиболее экспериментально и клинически изученным биохимическим маркером костного метастазирования является активность щелочной фосфатазы и, прежде всего, ее костного изофермента (Withold W. et al., 1996; Woitge H.W. et al., 1996). Несмотря на общее признание этого фермента как рутинного теста, до настоящего времени не существует единого мнения о специфичности и взаимосвязи изменений щелочной фосфатазы с другими биохимическими и клиническими критериями метастатического поражения скелета при раке предстательной железы.

Определенный прорыв в области практического использования маркеров, связанных с РЭФР-зависимой регуляцией роста рака произошел после появления препарата Герцептин, представляющего собой гуманизированные антитела к HER2/neu - одному из рецепторов семейства ErbB, к которому принадлежит и РЭФР (Foekens J.A. et al., 1989; Coradini D. et al., 2001).

Семейство тирозинкиназных рецепторов - продуктов онкогенов группы с-erbB, в которое входят четыре сходных по структуре трансмембранных рецептора - РЭФР (ErbB-1), ErbB-2 (HER2/neu), ErbB-3 (HER3) и ErbB-4 (HER4), - это одна из важнейших регуляторных систем передачи митогенного сигнала (Brown L.F. et al., 1999; Duffy M.J., 2001).

Помимо структуры, рецепторы семейства ErbB отличаются между собой по относительной специфичности и сродству к различным общим лигандам. Основной особенностью всех рецепторных тирозинкиназ является трансмембранная локализация и необходимость во взаимодействии с соответствующим лигандом (активирующим фактором) для реализации киназной активности и последующих биологических эффектов. После активации в результате связывания лигандов и димеризации внутренняя тирозинкиназа рецепторов активируется и приобретает способность фосфорилировать как сам рецептор, так и другие клеточные белки, участвующие в передаче митогенного сигнала. Рецепторы семейства ErbB могут образовывать как гомо-, так и гетеродимеры, при этом во многих случаях наиболее активными являются гетероструктуры с участием рецептора HER2/neu, не имеющего собственного лиганда.

Таким образом, HER2/neu - это уникальный представитель рассматриваемого семейства трансмембранных тирозинкиназ, так как, не имея собственного лиганда и не взаимодействуя ни с одним из известных факторов роста, активирующих родственные рецепторы, он является, тем не менее, ключевым звеном передачи митогенных сигналов всех ЭФР-подобных пептидов и необходим для успешного функционирования всей системы (Duffy M.J., 2001).

Блокирование HER2/neu может существенно замедлить или остановить рост опухолей, зависимых от подобных стимулов, однако эффективное использование биологически активных препаратов предусматривает предварительную оценку индивидуальной чувствительности больных к данному виду лечения. В случае Герцептина общепринятым и наиболее адекватным методом оценки чувствительности является использование иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания опухолевых тканей на белок HER2/neu (р185) с последующей оценкой амплификации гена с-егЬВ-2 методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) (Foekens J.A. et al., 1991).

Как правило, менее дорогостоящее иммуногистохимическое исследование проводится в качестве предварительного общего скрининга, а FISH-гибридизация используется в спорных случаях, когда ИГХ метод не дает строго положительного или строго отрицательного ответа. Подобный подход уже хорошо зарекомендовал себя в лечении больных раком молочной железы (РМЖ), позволяя обеспечить максимальную эффективность лечения Герцептином, избежав при этом неоправданных затрат. Несмотря на большое число клинических наблюдений больных раком молочной железы, единого мнения о прогностической ценности HER2/neu при РМЖ пока нет (Andreasen Р.А. et al., 1990; Coradini D. et al., 2001). Опубликованы данные, свидетельствующие о том, что опухоли с амплифицированным геном HER2/neu слабо реагировали на эндокринную терапию, но были чувствительны к последующей химиотерапии. В настоящее время принято считать также, что больным с НЕ112/пеи-положительными опухолями следует рекомендовать более интенсивные режимы химиотерапии, чем больным с опухолями, в которых выявлена повышенная экспрессии этого онкогена (Callagy G. et al., 2000). Работ по изучению экспрессии HER2/neu при раке предстательной железы не много и клиническая его значимость неизвестна. Поэтому представляет интерес исследование экспрессии HER2/neu при РПЖ.

Одной из наиболее важных характеристик опухоли является потенциал ее пролиферативной активности (В.Х.Хейфец и соавт., 2004). Стало известным, что пролиферативный антиген Ki-67, тесно связан с биологически агрессивным поведением ряда опухолей, при этом выявлена значительная связь между показателем экспрессии антигена Ki-67 в опухоли и временем прогрессирования заболевания, метастатическим статусом и объемом новообразования, что, вероятно, может иметь клиническое значение при РПЖ.

Успешное исследование выше указанных направлений исследований позволит предложить современные патогенетические методы лечения РПЖ, связанные с неизвестными ранее мишенями противоопухолевой терапии данного заболевания.

Учитывая важность проблемы РПЖ, а также появление современных методологических подходов к оценке «биологического» поведения опухоли, проведение настоящего исследования является крайне актуальным не только для практического здравоохранения, но и для более глубокого понимания роли ряда эндогенных факторов в патогенетических механизмах развития и прогрессирования заболевания.

Цель настоящего исследования - определение клинического значения и возможности использования новых молекулярно-биологических маркеров в диагностике, мониторинге и оценке прогноза рака предстательной железы.

Задачи исследования:

1. Оценить с помощью иммуногистохимического метода исследования чувствительность злокачественных опухолей предстательной железы к андрогенам (на основании выявления рецепторов андрогенов в цитозольной фракции биоптатов новообразований предстательной железы) с учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания.

2. Провести сравнительное исследование общей редуктазной активности 17П-ГСР (превращение А4 в Т) и дегидрогеназной активности 17Ш-ГСР (превращения Т в А4) в растворимой фракции биоптатов доброкачественной гиперплазии и рака предстательной железы.

3. Проанализировать корреляционные связи между общей редуктазной и дегидрогеназной активностями 17р-ГСР в растворимой фракции биоптатов доброкачественной гиперплазии и рака предстательной железы с уровнями общего тестостерона, 5а-дигидротестостерона и андростендиона в сыворотке крови этих больных.

4. Изучить показатели индекса пролиферативной активности при анализе уровней экспрессии Ki-67 в ядрах клеток рака предстательной железы и сопоставить его с основными клиническими, морфологическими и биохимическими методами исследования. Оценить частоту выявления экспрессии рецептора эпидермального фактора роста - Her-2/neu.

5. Определить уровень ключевого активатора ангиогенеза - фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). в сыворотке крови больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы и сравнить их с уровнем этого фактора роста у практически здоровых мужчин (группа контроля). Установить связь уровней VEGF в сыворотке крови у больных раком предстательной железы с основными клиническими и морфологическими характеристиками заболевания, стадией опухолевого процесса, возрастом пациентов, гистологическим строением и степенью дифференцировки новообразования (градация Глисона), прогнозом заболевания.

6. Провести сравнительное исследование уровней инсулиноподобных факторов роста (IGF1, IGF2), белков сыворотки крови, связывающих инсулиноподобные факторы роста (IGFBP1 и IGFBP3) у больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы, а так же проанализировать их взаимосвязь с VEGF и соотношением VEGF/IGF1, VEGF/IGF2, с показателями ПСА и соотношением IGFl/ПСА, IGF2/nCA в диагностике и оценке прогноза рака предстательной железы.

7. Исследовать уровни общего и свободного ПСА, их соотношение в сыворотке крови больных раком предстательной железы и сопоставить эти показатели с уровнем VEGF. Оценить соотношение VEGF/ПСА как возможного маркера в выявлении данного заболевания.

8. Методом жидкостной хроматографии высокого разрешения оценить экскрецию с мочой маркеров костного ремоделирования (пиридинолина и дезоксипиридинолина) у больных раком предстательной железы с костными метастазами и без метастазов и сравнить их с этими показателями у больных доброкачественной гиперплазией предстательной железы и группой практически здоровых мужчин.

Научная новизна исследования

Впервые в отечественной литературе на достаточном клиническом материале одновременно проведено определение ряда молекулярно-биологических маркеров в сыворотке крови: VEGF, ПСА, IGF1, IGF2, IGFBP1, IGFBP3, щелочная фосфатаза, общий тестостерон, 5а-дигидротестостерон, андростендион; в опухолях: редуктазная и дегидрогеназная активности 17Ш-ГСД, уровни экспрессии Her-2/neu, рецепторов андрогенов, антигена пролиферативной активности Ki-67; в моче: пиридинолин, дезоксипиридинолин у больных раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы.

Полученные нами впервые сравнительные данные по определению редуктазной активности 17Ш-ГСД в опухолях предстательной железы позволяют заключить, что высокая редуктазная активность 17П-ГСД может быть связана с развитием РПЖ.

Определение уровней VEGF, IGF1, IGF2, IGFBP1 в сыворотке крови больных можно использовать в качестве молекулярных маркеров вместе с уровнем общего ПСА при диагностике РПЖ. Кроме того, изучение уровня выше указанных маркеров свидетельствует о возможном использовании этих показателей у мужчин в возрасте старше 40 лет с целью более раннего выявления РПЖ. Показано, что с прогнозом РПЖ достоверно связаны исходные концентрации общего ПСА (р=0,001) и VEGF (р=0,001) в сыворотке крови.

Это позволило на основании анализа полученных клинических, морфологических и биохимических данных доказать значимость молекулярно-биологических маркеров в диагностике, мониторинге и прогнозе рака предстательной железы.

Практическая значимость исследования

Показано, что совместное определение в сыворотки крови VEGF и общего ПСА позволяет улучшить клиническую диагностику РПЖ на добиопсийном этапе, особенно при уровне ПСА более 10 нг/мл и VEGF менее 160 пг/мл. Также, у больных РПЖ целесообразно исследование концентрации IGF1, так как у данной категории пациентов уровень IGF1 в сыворотке крови прямопорпорционально коррелировал со значениями общего ПСА. При этом показано, что использование пороговых значений общего ПСА (10 нг/мл), VEGF (160 пг/мл) и IGFBP1 (65 нг/мл) позволило выработать алгоритм диагностических решений. Следовательно, применение вышеуказанных маркеров дает возможность определения индивидуальной вероятности правильного диагноза до выполнения биопсии. Кроме того, трактовка этих показателей у мужчин в возрасте старше 40 лет помогает раннему выявлению РПЖ, и, стало быть, может способствовать более эффективному лечению этих пациентов и улучшению качества их жизни. Кроме того, при многофакторном анализе обнаружено, что с прогнозом РПЖ достоверно связаны: показатель Глисона (р=0,001), исходные концентрации общего ПСА (р=0,001) и VEGF (р=0,001) в сыворотке крови. Также убедительно доказано, что первичным методом диагностики метастатического поражения костей при РПЖ является определение экскреции пиридинолина и дезоксипиридинолина в моче, так как их концентрация свидетельствует о высокой диагностической специфичности при деструктивных процессах в костях. При этом, положительная иммуногистохимическая реакция на рецепторы андрогенов в преобладающем большинстве биоптатов злокачественных опухолей предстательной железы -весьма важный маркер при уточнении гистогенеза метастатического очага поражения в костях, когда не выявлен первичный источник опухоли.

Таким образом, на основании молекулярно-биологических исследований уровней VEGF, ПСА, IGF1, IGF2, IGFBP1, IGFBP3, щелочной фосфатазы, общего тестостерона, 5а-дигидротестостерона, андростендиона -в сыворотке крови; показателей экспрессии рецепторов андрогенов, антигена пролиферативной активности Ki-67 и Her-2/neu, редуктазной и дегидрогеназной активностей 17(3-ГСД - в опухоли; уровня экскреции пиридинолина, дезоксипиридинолина - в моче доказано практическое значение выше указанных маркеров в диагностике, мониторинге и оценке прогноза рака предстательной железы.

Апробация работы

Основные результаты диссертации доложены на конференции «Национальные дни лабораторной медицины России-2004» (Москва, 20-22 октября 2004г.); на XII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 18-22 апреля 2005г.); на конференции «Национальные дни лабораторной медицины России-2005» (Москва, 10-14 октября 2005г.); на 16th International Congress on Anti-cancer Treatment (Париж, 1-4 февраля 2005г.); на VI Всероссийском съезде онкологов «Современные технологии в онкологии» (Ростов-на-Дону, 11-15 октября 2005г.); на II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 20-21 октября 2005г.); на IX Российском онкологическом конгрессе (Москва, 22-24 ноября 2005г.); на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006г.); на международной научно-практической конференции «Ведущий многопрофильный госпиталь страны: основные функции, достижения и направления развития» (Москва, 1-2 июня 2006г.); на XIV Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007г.)

Апробация диссертации проведена 14 декабря 2006г. на совместной научной конференции отделения урологии, кафедры урологии, кафедры онкологии и торакальной хирургии факультета усовершенствования врачей Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф.Владимирского и лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликована 21 научная работа.

Структура и объем работы

Диссертация написана на 208 страницах машинописного текста, включает введение, обзор данных литературы, глав «Материалы и методы исследования» и «Результаты собственных исследований», обсуждение полученных данных, выводы и список цитируемой литературы, который состоит из 38 работ отечественных и 264 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 58 рисунками.

выводы

1. Уровни общего ПСА в сыворотке крови больных доброкачественной гиперплазией и раком предстательной железы достоверно различались (9,5±2,9 и 71,0±19,0 нг/мл, соответственно, р=0,004). При пороговом значении общего ПСА, равном 10,0 нг/мл, ошибочная классификация в группе доброкачественной гиперплазии составила 22,2% [95% С1=6,4%-47,6%], а в группе рака - 22,4%.

2. При однородном варианте гистологического строения рака предстательной железы уровень общего ПСА в сыворотке крови был достоверно ниже (медиана - 26,0 нг/мл), чем при смешанном гистологическом строении опухоли (медиана — 45,0 нг/мл; р=0,005).

3. Коэффициент соотношения VEGF/ПСАобщ у больных доброкачественной гиперплазией предстательной железы был достоверно выше, чем при раке (медианы 13,9 и 3,5 соответственно, р=0,004).

4. При сроках заболевания от одного года и более уровни IGF1 в сыворотке крови больных раком предстательной железы были достоверно выше по сравнению доброкачественной гиперплазией (медианы 104,0 и 27,0 нг/мл соответственно, р=0,008).

5. Концентрация IGF2 в сыворотке крови практически здоровых мужчин была достоверно (р=0,001) выше (713±21 нг/мл), чем у больных доброкачественной гиперплазией (300±19 нг/мл) и раком предстательной железы (305±8 нг/мл).

6. При оценке соотношения IGFBPl/ПСАобщ определены высокодостоверные различия между больными раком и доброкачественной гиперплазией предстательной железы (4,2±0,8 и 15,4±3,6 соответственно, р=0,00004).

7. При сроках заболевания более чем один год у больных раком предстательной железы уровень IGFBP3 в сыворотке крови был почти в два раза выше по сравнению с доброкачественной гиперплазией (2242±230 и 1050±258 нг/мл соответственно, р=0,016).

8. Определение уровня VEGF при значениях ПСА более 10 нг/мл, а уровня IGFBP1 - при значениях ПСА до 10 нг/мл в сыворотке крови позволяет с высокой достоверностью уточнить клинический диагноз рака предстательной железы у 50% пациентов.

9. Доказано, что редуктазная активность 170-гидроксистероиддегидрогеназы в раке предстательной железы на порядок выше по сравнению с доброкачественной гиперплазией. Общая активность 17(3-гидроксистероидцегидрогеназы в растворимой фракции рака предстательной железы прямо пропорциональна концентрации 4-андростен-3,17-диона в сыворотке крови больных.

10. Выявлена высокая эффективность определения пиридинолина и дезоксипиридинолина в моче в качестве чувствительных и специфичных критериев диагностики костных метастазов в случаях рака предстательной железы.

11. Установлено, что экспрессия рецептора эпидермального фактора роста - Her-2/neu в подавляющем большинстве опухолей предстательной железы была отрицательной.

12. Обнаружено, что экспрессия рецепторов андрогенов практически во всех наблюдениях была резко положительной как в ядрах раковых клеток, так и в ядрах эпителия неизмененной ткани предстательной железы и в участках PIN-2, что может быть использовано в дифференциальной диагностике костных метастазов из первично не выявленного очага.

13. Отсутствие экспрессии белка Ki-67 в опухоли предстательной железы может указывать на доброкачественный характер поражения органа. У больных раком предстательной железы уровень экспрессии белка Ki-67 достоверно отражает степень дифференцировки опухоли по Глисону.

14. При многофакторном анализе обнаружено, что с прогнозом РПЖ достоверно связаны: показатель Глисона (р=0,001), исходные концентрации общего ПСА (р=0,001) и VEGF (р=0,001) в сыворотке крови.

Практические рекомендации

1. Совместное определение в сыворотки крови VEGF и общего ПСА позволяет улучшить клиническую диагностику РПЖ на добиопсийном этапе, особенно при уровне ПСА более 10 нг/мл и VEGF менее 160 пг/мл.

2. Целесообразно исследование концентрации IGF1 так как у больных РПЖ уровень этого фактора роста прямо пропорционально коррелирует со значениями общего ПСА в сыворотке крови.

3. Использование пороговых значений ПСА (10 нг/мл), VEGF (160 пг/мл) и IGFBP1 (65 нг/мл) позволяет выработать алгоритм диагностических решений, а применение вышеуказанных маркеров дает возможность определения индивидуальной вероятности правильного диагноза до выполнения биопсии.

4. Трактовка этих показателей у мужчин в возрасте старше 40 лет помогает раннему выявлению РПЖ, что может способствовать более эффективному лечению этих заболеваний и улучшению качества жизни.

5. Первичным методом диагностики метастатического поражения костей при РПЖ является определение экскреции пиридинолина и дезоксипиридинолина с мочой, так как их концентрация свидетельствует о высокой диагностической специфичности при деструктивных процессах в костях.

6. Положительная иммуногистохимическая реакция на рецепторы андрогенов в преобладающем числе биоптатов из опухоли предстательной железы весьма полезный маркер при уточнении гистогенеза метастатического очага поражения в костях, когда не выявлен первичный опухолевый очаг.

7. С прогнозом РПЖ достоверно связаны: показатель Глисона, исходные концентрации общего ПСА и VEGF в сыворотке крови.