Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Симпатическая иннервация и продукция интерлейкина-1 макрофагами при канцерогенезе

Г Г г

ОД

На правах рукошзси

ЛСЗКИН ИГОРЬ ДМИТРИЕВИЧ

СИМПАТИЧЕСКАЯ ИННЕРВАЦИЯ И ПРОДУКЦИЯ ККТЕРЛЕЙКИНА-1 МАКРОФАГАМИ ПРИ КАНЦЕРСГЕНЕЗЗ.

14.00.36 - Аллергология и икмунодргия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

НОВОСИБИРСК - 1896

Работа выполнена в Институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель: доктор кед. наук, член-корр. РЛЫН, профессор В.А.Козлов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Г.В. Идова

доктор медицинских наук В.А. Изранов

Ведущее учреждение: НИИ психического здоровья ТЩ СО РА!!Н

Запита диссертации состоится "_" _1996г.

в_час. мин, на заседании диссертационного совета

Д 001.01.01 (Аллергология и иммунология) Института клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630091, г.Новосибирск, ул. Яд-ринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО РАМН.

Автореферат разослан "_"_1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

О.Т.Кудаева

СВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Онкологические заболевания являются важней проблеыой человечества, и г**с!ст;шность борьбы с ними во многом зависит от успехов медико-биологических наук в изучении систем организма, отвечающих аа противоопухолевую защиту.

Одной из таких систем является система мононуклеарных фагоцитов, поскольку макрофаги играют важную роль в индукции и регуляции иммунного ответа. В настоящее время установлено, что судьба возникающей опухоли во многом определяется функциональной активностью инфильтрирующих ее макрофагов (Glomo R., 1986). При этом, с одной стороны, макрофаги являются защитными клетками хозяина, продуцируя такие цитокины как ИЛ-1 и ЯЮ-а, которые обладают разнообразными регуляторными свойствами как для самой иммунной системы (Кетлинский С.А. и соавт., 1992), так и в отношении ряда опухолей, проявляя, таким образом, свою противоопухолевую активность (Суслов А.П., 1990). С другой стороны, ассоциированные с опухолью макрофаги в ряде случаев обладают иммуносупрессорными свойствами, опосредованными целым спектром секретируемых факторов, которые влияют на функции клеток иммунной системы, подавляя их активность на самых ранних этапах неопластических заболеваний (Puchs B.B. et al., 1989; Grabstein K.H. et al., 1986). Поэтому изучение механизмов регуляции функциональной активности макрофагов на моделях экспериментального канцерогенеза имеет важное значение для поисков путей повышения эффективности методов иммунокоррекции у онкологических больных.

Несмотря на то, что в настоящее время активно разрабатываются подходы к противоопухолевой терапии с использованием возможностей модуляции функциональной активности иммуяокомпетентных клеток путем применения нейроактивных препаратов (Lissonl Р. et al., 1993), практически неизученным является вопрос о роли нарушений нервной системы, характерных для канцерогенеза, в процессе формирования противоопухолевого иммунитета.

Так, данные последних лет убедительно свидетельствуют о влиянии симпатической нервной системы на функциональную активность макрофагов, в частности, на продукцию ими ИЛ-1 (Brown R. et al., 1991). В то же время, не ясно как изменяется продукция этого цито-кина при канцерогенезе, в условиях структурно-функциональных нарушений симпатической иннервации. Между тем, исследования в этом направлении могли бы дать информацию, необходимую для целенаправ-

ленной коррекции неврологических и иммунологических нарушений у онкологических больных.

Поэтому, целью данной работы было исследовать свягь изменения функциональной активности альвеолярных макрофагов с состояниеи симпатической иннервации легких при канцерогенезе в легких шеей BALB/c, индуцированном уретаном.

Исходя из поставленной цели, в процессе выполнения работы решались следующие задачи:

1. Исследовать изменения плотности адренергической иннервации легких, содержания катехоламинов в паренхиме легких и продукцию ИЛ-1 альвеолярными макрофагами в латентную фагу канцерогенеза.

2. Иэучить изменения плотности адренергической иннервации легких, содержания катехоламинов в легочной паранхиме и продукции ИЛ-1 альвеолярными макрофагами опухоленосителей после появления макроскопических аденом легких.

3. Определить влияние норадреналина, фактора роста нервов и субстанции Р на продукцию ИЛ-1 альвеолярными макрофагами здоровых мышей и опухоленосителей в условиях In vitro.

4. Исследовать эффекты норадреналина и фактора роста нервов в условиях in vitro на продукцию ИЛ-1 альвеолярными макрофагами здоровых мышей, получавших фактор роста нервов.

5. Установить влияние фактора роста нервов в условиях in vivo на величину объёмной плотности адренергических нервных волокон в легких, содержание катехоламинов в легочной паренхиме и продукцию ИЛ-1 альвеолярными макрофагами здоровых мышей.

6. Изучить влияние фактора роста нервов в условиях in vivo на величину объёмной плотности адренергических нервных волокон, содержание катехоламинов в легочной паренхиме, продукцию ИЛ-1 альвеолярными макрофагами и количество аденом легких у опухоленосителей.

Основные результаты исследования и их новизна.

Впервые проведен одновременный анализ продукции ИЛ-1 альвеолярными макрофагами, плотности адренергической иннервации, содержания катехоламинов в легких и параметров опухолевого роста при уретаниндуцированном канцерогенезе у мышей BALB/c.

Установлено, что снижение продукции ИЛ-1 макрофагами опухоленосителей сочетается с уменьшением плотности адренергической ин-

кервадаи 6ar.se чем ка 605 по сразввнпэ со s^cps^si гетпт™?-:. Ее9Д9нйз fcatropa роста корзоч в огр-эсс::

Tor?.*es:i? как процосо дсюгшагиггют, тш: а сжгэгга прсйугсзн ИЛ-1.

Оп.-эчош игмгпзпяз дозобой зашзокмоега в огаэчгж&ств гов на неЗрозбдаагорн в прсцзссэ олухоявсого роста. Нсрздрзнаяз in vitro о:«аяглввт юткзкруазгв дебет» па продукция 1Ш-1 aaneo-дяряяя! нз!фофзгз'£! км=зд^спуха£$восате£бй в югачггвлыга бог.?« низких дозах по сравнеязз со 3sopossssi вдаолгза. Ври зтол тага было установлено «псенке епаулгругсяго лгйствзз субстгшшя ? яз продукказ ИЛ-1 1аяро$згшз олухаяенссйтеяой.

Обнаружено 'прздоз кзп£зру&аее дайотвкз ijssrropa рссез пзргоз на продукции НЛ-1 кафофагея! з условиях In vitro.

Впервуэ показано, что всэденкэ ©3 здорскэ гавота вызызг.-^? сюсеиие продукща ИЛ-1 ааьвеогяршт гякрсфггшж и кгкзкекгя es ответа на С?Н в норадреназш. алгдогкчгкя ебзсрукгтш у какрсЗз-гов опухолекосите.:ей.

Еаучная и практическая аналоги. гг.5г;г.;

В работе баго показано, что при развитии адэнсм дэгкгсх, нзду-щфовакшгх уреталей у i?j."3ft BALB/c, набхэдезтея сочгтантге игаэвв-нкя симпатической иннервации и функционального состояния мгкрефз-гов, с оп ро в евдаг^е с я изменением характера нервной регудодоа сро-дукцин ИЛ-1 макрофагами. Последнее проявляется Енраггенш-ш яыи ответа ка нейршэдиаторы и СРН в организме, опухохевосителэй, затрагивающими ¡сак макрофаги, так и сгататичесгаэ ЕЭЙроны. Это? процесс, по пере его развит:«, приводит к снияевга чупс-гапежъкости ыакрофагов к симулирующим нервным влияниям при повивгшш й2 чувствительности к ингибируюндш.

Представленный материал имеет большое теоретическое значение, поскольку получены экспериментальные данные, свидетельствующие о существенной роли роста и регенерации периферкческого эвена симпатической нервной системы в регуляции функциональной активности макрофагов в норме и при канцерогенезе. Полученные результаты значительно расширяют существующие представления о процессах взаимодействия важнейших гомеостатических систем организма (нервной и иммунной) в ходе индукции и развития опухоли.

Представленные данные имеют также и практическую ценность.

поскольку дала» об кзгзкклх сзгзга ^фс^атоз са согра^дкатори, погучзши» ка догшаЗ спугсеэЕсЗ посхэ is проаэрга у сзй>-

-огичзсгсас бодмаа, toryv &ш> ISSSSKS^SI да расрабоиа подходов к ах ascisainoS txppsrasu a-CitcEDp^iira и каяяааквй вр^сго-

Изод^рогаззоо cpizzzzzzi Оаягора роста езрдси да коррекция неврологических u Еногсхаопкзекш: у саахзогЕчгсках

Оодышх предсагвлгэтся cnsoc^i. посгюаку оа ихзт усЕЕ^ать опухолевый рос;.

Основ;"'? полоу^п-з. сз гг.~:ту

1. Ешгзррагс&зв у иггзй ВШЗ/о. ¡asyicpceaffiüú урзтаноа, сопровождается Е^сгаткои агжаткчэскоЗ sosapisissj лэлеа в свзгэшяи

СРОДУ1ОДШ liz-l

2. В процзесз раа^гжз саухст поо^здог-йте^ьсо шз&агэтся 2 периода игдояса^а фушйдаоцогьаоЗ истеноскз 1х_чх£агс*з - ранний и поздшй, различаемся по охпзту калрс&агоз па длпопояЕсахарцд, зсараотеру исаул1фугеэго дейстка СРН. ворадровадша н субстедщш Р in vitro аа продукции ПЛ-1 н по рзакщш адреЕергкчэсгаз нейронов на £?Н в усдозздх In vivo.

3. Нзькшенда фуккцмаагьной егсшваости какрофатоз пр-j канцерогенез сочзтаотся с по£*аавксы их чуЕствэтельЕости к ингкбврукэм и спикгннсу чувсгиггсаиости к сти^даругг^ги пд:;яшкга нервной системы.

Ащюбзтгтя 1^тор:.агов Д1юсертаща

Уатерсаш диссертации дол ose un и обсуждены на: 1. Ск^яозиу^г с уездународши участиал "Сазрс^зсаз проüzsizi клинической и зкс-пср^втааЕоЗ ЕСЕЗогзЁро^унологкн" (Россия-Тоыек. Декабрь, 8-10, 1932); 2. 2-й отчетной конференции ККИ СО PAÍS (Новосибирск,

1994); 3. сеиккгро ¿aб. нейроньауЕалогии ККИ СО РДО1 (Новосибирск,

1995); 4. конференции шесдых ученых ККИ СО РЛЫЗ (Новосибирск,

1996); 5. расгиреннш ceiamaps 11КИ СО РАУН (Новоскбирек, 1995). Публикации

По теиэ диссертации опубликовано 5 печатных работ. Диссертация состоит из следувда разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, заключение, выводы, указатель литературы. Диссертация содержит 112 страниц машинописного текста, иллтстрирована 23 рисунками. Список литературы включает 215 литературных источников, из них 33 отечественных и 182 иностранных.

- Б -

ыаТйРпалы н столы ссстдсшт.

ааотпкэ. Sffin3D:^-?!rrj Сылн провздеЕЫ ш ООО lürss-ca^om лз-.•п-; EäLB/o и с:соло 50 tirrs5-c2iasc3 (C?AsC57Bl/0) Fi fan кспоасо-вапа да бпогестсфсзшпа сгскзжостп '12-1. lim лиси BALB/c бил:; подучепн га ШП "Сто-богая", а ггт; (СЗЛгС57В1/б) Fi били разсадз-П!гз SEI СЮ РА121. Все епзотеш Е22одк.-:гь на сгсбоднса pasaos двигательной шстаЕнсстн без огргтгсзгш доступа к еодэ я ш^э.

Препасз~з.

йшстср роста керзаз. Испокзосагсз кюгпй

TS «Jajrrop. Препараты Cilva .tsSsoho прэдостаадэпы арс$. В.Н. Karrno-ntí, Институт фазиалопа A3 Беларуси a Еи^спэ ti. Johnsen, D3psrtrant of Phsrnacolesy, Washington University Ibdlcal School. In vivo CPH пргсекягсл в доз-э 6,5 ю&лю.ь Енутрхсагэщго по схекз, описанной В.Н. Каззвсснч (1934). Продолжите л>нссгь поддерзизакггго курса шгьекцкй варькрегага в 8аяискыостн от еггач кгследогаhiss. Контрольные этвотнвэ получаса разный объем растворителя по той г,з

CXGL'3.

Норздреналкн. При^энял^я в виде норадрзвагиЕа гндрстгртрага (1ЕЮ "Здоровье", Харьков) для инкубации альвэаягрпк иакрофагоз в культура.

Субстанция Р (любезно предоставлена д.м.н. А.А.Всзулей, центр психического здоровья РА5Л1, Цосква). Лиофально высуЕэнкая субстанция Р ("Sigma") разводилась средой RFÜI-1640 и хранилась при t -20°С.

Опухолевая модель. Аденома лелапс кндуцировализд урегаяси у мьшей BALB/c. Уретан (метилкарба^т) ("Реахим") вводился в виде 107. раствора в среде 199 внутр!Гбргсттно 8 раз в течение 1 месяца в дозе 0,7 иг/г на 1 инъекщоо. Контрольным етезотным по тон se схсие водился равный объем среды 199. Шраленность опухолевого процесса оценивалась путем подсчета количества опухолей у каздой мши и измерением среднего диаметра одной опухоли у кавдого животного на легких, фиксированных 10Z раствором нейтрального формалина до потери ими воздушности. Также для оценки суммарного объёма опухолевого процесса применялся интегративный количественный показатель (ИКП), вычисляемый как произведение количества опухолей у одного животного на их средний диаметр.

Гистохимическое выявление адренергических нервных волокон.

Окраска нервных волокон проводилась жидкостным методом конденсации катехоламинов с глиоксиловой кислотой (SPG-метод), впер-

VJ.J Da la "erro J.C. u Ssjrcscn J.U. в 1B76 году (Torro

J.C. ct al., 1C73) E i^wJS cas»T£i::síeii£OBss кислота Oiua. сйЗсзйэ предоогаагзш к.и.о. В.К.СВзрндоло2131 (газ. фуюодюиагьвоп Е5£раюрфоШ1а EEsnayta Csssasortaj 00 РШ).

Cpotzj в tczoziziozoo »."„.ело к рагсиатрхгзшсь под

яаааасцакаа» изфоекоаои £Ш! К-3 со сбз¥о&щ>тр&&: cci-2, CGC21-2, COIS. Сотсгзтр^а праводмггь вря приставки ШЛЯ-1А

с ^xop&opsEisascáa Саатрш КЗ.

Прз слрогасзЕга кзтеосги адронергкчгскис uepasis волокон cpssu с eillosisktilbcu 05121 u окуляр«! s7 с йсполь-

«сзкянси щцдоятрдо&скоз сскпз 1! подсчипйа^ссь кгш!-vcc?no сзрс-с-эчзЕнй сэргЕих еолозюя с вертшешг&до: линиям» сетка. Еассчзт еохся по сгг5 псгэргностн среза и результат вьфеаазса в козкзог&з Езросзчзака гл 100 погей врешш.

Са^сгагржсгс» сгродохэш» солоргаши казехозшшов прозоди-£53 С SKOÜKJiSÍSCU 21. окулярам 10 И 80ИДСЦ ДКСЩЭТрШ 0,5 в 25 справа еазраша K№íaz. ИЕтеисквногть фгаореецзидеш Еырада&н в уегогаог еггзы'*л (у. е.).

ПЗСЕГЗГГЛ культура адьвеоддрных u-aitpg?a.roB.

АгуПоол^р^э цакрс£агк получали из броахо-альвеодяркш сшаов ко;: слезсво С. Хапт (1GSQ). трехкратно отшваак средой Игла и обо-гсали í-Jircc;i2ú к плзспзну. Прншшяе клетки в концентрации 10б/ил isziубароьии в 85-душвпи плоскодонных телятах ("Nunclcn") в течепш 18 ч в епюофзре с БХ СОг при те»гпературе 37°С.

Дгл кулЪ?Ш52фованш шкрофагов использовали среду RFU1-1640 с £0б&3£8Е2СЫ 62 ЕнакитироЕалной эмбриональной телячьей сыворотки, 2ь£i L-rxora^iaa ("Slssa") и 80 ют/ш гевтаиищша. В качестве сти-^гзтора ¡£Гфо£агоз шюльзоБалн липополисахарид (ЛПС) Е. coll 0111 :Ш ("Dlfco") в концентрации 10 нкг/ил.

Супаркатаыт тестировался на активность ИЛ-1 общепринятым ие-ъодси спрэделениа величины кегштогениого з4Фекта в культуре ткыо-щяоз isea, сткуулированных субоптншльной дозой конканавалина А (КснА) (Phillips R., Rebson A.R., 1983). Результаты представляли в BJSS0 индекса влияния (ИВ):

число кш/шн в КонА-индуцированной культуре тиыоцитов с супернатантоа клеток

ИВ - .................. ...........-..........................

число иып/шш в ¡<онА-нндуцированной культуре тиыоцитов без супернатеита

В отдельных случаях возникала необходимость в оценке биологической активности ИЛ-1 в международных единицах (ME). Для построения калибровочной кривой использовался рекомбинантнкй ИЛ-1 ("Hoffman-La Roche"). По результатам тестирования строилась калибровочная кривая.

Статистическую обработку данных проводили методом непараметрического сравнения рядов Вилкоксона-Ыанна-Уитни. Корреляционный анализ проводился с использованием программ статобработки Statistical Graphic System, регрессионный анализ проводился автоматически, с применением программ SlgmaPlot.

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА УРЕТШЩУЦИРОВАННОЙ АДЕНОМЫ ЛЕГКИХ.

На первом этапе исследований была исследована морфологическая картина аденом легких на этапе формирования макроскопических опухолевых узлов (Змее.) и в конце исследованного нами периода канцерогенеза (бмес.), индуцированного уретаном у мышей линии BALB/c . Исследованные опухолевые узлы имели папиллярно-тубулярную структуру, не отличающуюся от описанной в литературе (Грицюте Л.А., 1957) и имели признаки доброкачественных аденом.

После гистологической верификации опухолевой модели, следующим этапом работы было выяснение количественных и временных характеристик опухолевого процесса (работа выполнена совместно с Л.А. Меркель).

Результаты 2-х серий экспериментов представлены на рис.1. Во всех экспериментах через 3 месяца после начала введения уретана у всех животных обнаруяивались опухоли легких. В обеих сериях развитие аденом легких у мышей сопровождалось снижением продукции ИЛ-1 и плотности адренергической иннервации и повышением содержания ка-техоламинов в легких, хотя время появления указанных изменений варьировало от 3-го до 5-го месяца со дня первой инъекции канцерогена.

Поскольку симпатическая нервная система и макрофаги являются важными регуляторными системами организма, изменяющимися в процессе опухолевого роста, и характер их взаимодействия при данной патологии является практически неизученным, в отличие от взаимодействий "макрофаг-опухоль" и "нервная система-опухоль", в дальнейших

о - количество одепса

V- ЛПС-стимулированная продукция НЛ-1

□ - плотность одренергическои иннервации

Ркс.1. Дкиахяка осис££Ш2 падгмостБОшгш вараыэтраа кэдцерагонгза. а-первая серия, б-втор&я серия

исследованиях необходимо было сконцентр:фовать усилия на этом аспекте изучаемой проблемы.

простая ИЛ- \ . СОСТОКШЕ АДРЕНЕРГИЧЕСКОЗ ККНЕРВАЩШ И СОДЕРЖАНИЕ КАТЕХОЛАМИНОВ В ЛЕГКИХ В ДИНАМИКЕ КАЩЕРСТЕНЕЗА.

Имеющиеся литературные данные о повреядакзэи влиянии ряда канцерогенов на нервные волокна и кммуносупрессоркая активность, установленная для уретана (Рябых Т.П. и соавт., 1983) сделали необходимым исследовать влияние введения уретана на величину объемной плотности адренергической иннервации легких, уровень катехоламинов в легочной паренхиме, продукцию ИЛ-1 и динамику этих показателей в процессе развития аденом легких.

Было проведено 3 серии экспериментов, в каздой из которых оценивалась объемная плотность симпатических нервных волокон, содержание катехоламинов в легких и продукция ИЛ-1 альвеолярными макрофагами в одни и те ке временные точки.

Во всех 3-х сериях отмечалась общая закономерность в снижении продукции ИЛ-1 и повышении содержания катехоламинов - во всех случаях время того и другого события совпадало и приходилось на снижение плотности адренергической иннервации на 602 и более. При этом время снижения продукции ИЛ-1 варьировало от 3-го до 5-го месяца канцерогенеза.

Поскольку во всех сериях ЛПС-стимулированная продукция снижалась раньше, чем спонтанная, полученные данные позволили думать о первичности нарушения ответа макрофагов опухоносителей на липопо-лисахарид. Поэтому представлялось необходимым проанализировать возможную зависимость стимулирующего эффекта ЛПС на продукцию ИЛ-1 от величины симпатической денервации и содержания катехоламинов в паренхиме легких опухоленосителей.

Было обнаружено, что снижение стимулирующего эффекта ЛПС на продукцию ИЛ-1 макрофагами наблюдается при остаточной плотности • адренергической иннервации 40Х от контрольных значений (коэфф. корр. 0.6429, р-0.045). При.меньшей величине десимпатизации снижения ответа макрофагов на ЛПС не наблюдалось. В отношении содержания катехоламинов корреляция между ним и ответом макрофагов на ЛПС была недостоверной (коэфф. корр. -0.5549, р-0.0959). •

Эти данные позволили предположить, что и характер зависимости между уровнем катехоламинов и продукцией ИЛ-1 может меняться в за-

висимости от величины денервации. Корреляционный анализ, проведенный группах с величиной симпатической денервации от 0 до 60Z и свыше 60Х показал наличие достоверной отрицательной корреляции мезду уровнем катехоламинов и стимулированной продукцией ИЛ-1 в первой группе (коэфф. корр. -0,79, р-0,035), но не во второй (ко-эфф. корр. 0,3081, р-0.6919) . Уровнь спонтанной продушит ИЛ-1 ни в первой группе, ни во второй достоверно не коррелировал с уровнем катехол аминов.

Полученные данные позволили предположить, что в данной опухолевой модели нарушение ответа макрофагов на липополисахарид связано с определенной величиной симпатической денервации, а не с прямым влиянием опухоли на макрофаги. Это предположение было проверено в экспериментах с применением фактора роста нервов (ФРН) в условиях In vivo.

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ НА ВРЕМЕННЫЕ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ПАРАМЕТРЫ СНИЖЕНИЯ ПРОДУКЦИИ ИЛ-1. СИМПАТИЧЕСКОЙ ДЕНЕРВАЦИИ И ССДЕРЛАНИЯ КАТЕХОЛАМИНОВ В ЛЕГКИХ У 1ШЕЙ-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ.

Поскольку ФРН является облигатным трофическим фактором для адренергических нейронов и способен тормозить симпатэктоки», вызванную гуанетидином (Manning Р.Т. et al., 1985), и симпатическая нервная система играет главную роль в регуляции уровня ФРН в тканях (Heumann R., 1987), он применялся для защиты симпатической иннервации у опухоленосителей в период, предшествовавший снижению продукции ИЛ-1. Аналогичное введение для сравнения эффектов проводилось и здоровым животным. Контролем во всех случаях служило введение среды 199. Во всех экспериментальных группах оценивали следующие показатели: объёмную плотность симпатической иннервации легких, содержание катехоламинов в легочной паренхиме и продукцию ИЛ-1 альвеолярными макрофагами. У опухоленосителей также оценивалось влияние ФРН на количество аденом.

Выяснилось, что ФРН, вводимый опухоленосителям до момента снижения продукции ИЛ-1 (рис.2), замедлял как процесс десимпагиза-ции, так и снижение продукции ИЛ-1, предупреждая нарушение ответа макрофагов на ЛПС. С другой стороны, ФРН, вводимый по той же схеме здоровым животным (рис.3), оказывал другое действие, снижая стимулированную продукцию ИЛ-1 и достоверно не влияя на спонтанную. В то же время, фактор повышал плотность адренергической иннервации

И

о

и

баз ФРН

3 200 § 160 §• 120 -

ОРИ

□ -спонтанная продукция е23" без £Рп

« 200

Я 160

о

с* г> 120

и 80

ъч 40

0

я

о ж

0 а

1

а

16 12 8 4

О

2222_

Ш

**

СЗ-стиыулированная продукция

ВОЗ-

ЗРИ

Ркс.2. Э5$е«ти ЕЕедг:пк1 Оглтора роста ксргсз апухагслссптсляи ка продуяця:» 113-1 агагеакяршам !<г:фс-1.:1Гйцл (а), плотпсста ческнх нервных еожжон в .еэгтоя (С), содэ^тггкэ кагезогагсзсз з .тагочмоЯ паренжош (а) н иодкчостео адэнса лзгкга. Достоверность различий: * - п<0.05; ** - р<0.01

боз&РН а ФРН б з

180 г-

160 -

в 140 -

ч о 120 -

о. 100 -

я ВО -

о x 60 -

■л 40 -

20 -

0

спонтанная продукция ГЛ- без 4РН

стимулированная продукция Е23- $РН

Рис.Э. Эффепти введения фактора роста нерзоа вдоровым икзотнвд на продукции НЛ-1 альвеолярными макрофагами (а), плотность адренерги-ческкх нервных волокон в легких (б) н содержание катехоламкнав в легочной паренхиме (в).

Достоверность различий: * - р<0.05; ** - р<0.01

легких на 74Х у здоровых животных и в 2 раза у опухоленосителей. При этом фактор повышал содержание катехоламинов в легочной паренхиме только у здоровых мышей, но не у опухоленосителей. Ведение фактора роста нервов опухоленосителям приводило к стимуляции опухолевого роста, что свидетельствует об отсутствии прямой связи уровня продукции ИЛ-1 макрофагами опухоленосителей с параметрами опухолевого роста в условиях применения ФРН.

Полученные данные позволили предположить, что при канцерогенезе изменяется не только ответ макрофагов на ЛПС, но и характер действия нейромедиаторов и нейрогормонов (в частности, ФРН и но-радреналина). Это предположение было проверено в экспериментах In vivo и in vitro.

«

ЭФФЕКТЫ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВЕЛИЧИНЫ ДЕСИМПАТИЗАЦИИ ПРИ КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ.

Поскольку нами было показано неодинаковое действие экзогенно вводимого ФРН на продукцию ИЛ-1 у здоровых мышей и опухоленосителей и корреляционный анализ выявил 2 периода, различающихся по характеру адренергической регуляции продукции ИЛ-1 макрофагами, это позволило предположить, что и характер действия ФРН in vivo в выделенные нами периоды будет различен.

Поскольку длительное введение ФРН in vivo сопровождается гипертрофией симпатического и чувствительного отделов нервной системы, была прослежена динамика продукции ИЛ-1 после окончания введения препарата в течение 6-ти недель у здоровых животных и опухоленосителей. Показатели продукции ИЛ-1 в динамике сопоставлялись с плотностью адренергических нервных волокон в каждую временную точку.

Сразу после окончания введения ФРН здоровым животным (рис.4) снижалась стимулированная продукция ИЛ-1. Через 2 недели различия между "факторными" и контрольной группами еще сохранялись, но были недостоверными. Через 6 недель эти различия полностью нивелировались. При этом плотность симпатической иннервации у "факторных" животных прогрессивно снижалась и через 6 недель незначительно превышала контрольный уровень.

У мышей-опухоленосителей при введении фактора роста нервов в первый период были получены следующие результаты (рис.5). ФРН достоверно снижал стимулированную продукцию ИЛ-1. Через 6 нед. после

^ 3

й2 1

о

^3

0 2 6 зрзкя (над.)

о - баз 4РН

.Х/Л

240

а200

о 160 о.

£ 120

я ы

0 2 6 время (над.)

• - с ОРН

80 40 0

Г **

" > 1 ^

;| !! п

: !

0 2 врэия

в

(нвд.)

Рта:.4. Динамика эф$еятоа курса СРН на спонтаяиу» (а), Л1С-ст?иулз1-рсзаинуэ продукции 11Я-1 (б) и плотность адрэнертачвскоЯ кшсрзлхргя (а) лзгяля адоропыа ыигеЯ.

Все рисунки: по горизонтали - время после отмены ФРН в неделях. Достоверность различий: * - р<0.05; ** - р<0.01

6

24

I ~ 22 1

о

ж ^О-О

т___-

о—З

о 2 4 а

время (нед.)

0 2 4 6 время (нед.)

о - без ¿РН

!-1- бел ;?:)

6 4

>—4

* 2 1

0

30

25

о X 20

01

а 1Ъ

г> 10

а

£ 5

0

в _

* + О

** о"

о-

т •ф.

о г время 4 8 (нед.)

г

-

** *

т

~гй 1Н1

О 4

время (нед.)

ФРН ФРН

Рис.5. Влияние фактора роста нервов, вводимого в ранний период, на спонтанную (а), ЛПС-стимулированную (6) продукции ннтерлейкина-1 макрофагами, плотность адренергической иннервации (в) и среднее количество аденом (г) легких опухоленосителей.

ДостоЕ^нс-сть различий: * - р<0.05; ** - р<0.01

4

О

а

отмены фактора стимулированная продукция уке достоверно превышала соответствующий контрольный уровень. В то ье время, реакция на фактор адренергическш нервных волокон была полностью сохранена, хота эти животные отдкчащюь более быстрыми темпами последуюеего снкхенкя плотности симпатической иннервации по сравнении с "факторной" группой адорозах шшотных. При этой прявлялся как начальный стинулирукзД эйюкт С?Н на опухолевый рост, так и кнгкбирую-сдй эффект после его отеены. Поскольку в этот период сохранялось действие «РН на tsKpcsJarn и на адренергические нейроны, он был назван ранит периодои нарушения нервной регуляции функций макрофагов при канцэрогеневе.

В случае введения СРН tbsaM-опухоленосктеляи с уже подавленной продукцией ИЛ-1 альвеолярной цакрофагаии (рис.6) ни достоверного изменения продукции ИЛ-1, ни стимуляции роста адренергических нейронов не происходило, а плотность симпатической иннервации легких даае ииела тенденция к снкаенка. Этот период назван поздшш периодом. В этот период ФРН такве проявлял начальный стимулирующий эффект на опухолевый рост, но при этом отсутствовал эффект после отмены фактора.

ОТВЕТ ЦАКРОХ>АГОВ НА НЕЙРСбЕДИАТОРЫ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ ИЗМЕНЕНИЯ ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ.

Возможность выделения 2-х периодов опухолевого роста, различающиеся по характеру нейро-эндокринной регуляции продукции ИЛ-1 макрофагами поставили вопрос о нейрохимических аспектах наблюдаемого явления на уровне макрофагов. Поскольку опыты с введением ФРН показали как возможность сдвига во времени точки снижения продукции ИЛ-1, так и различный характер его действия на продукцию этого интерлейкина макрофагами в зависимости от периода введения фактора, было целесообразно исследовать изменение действия основных нейромедиаторов реагирующих на ФРН нейронов в условиях in vitro в зависимости от предложенной периодизации. Для проверки этого предположения было исследовано влияние фактора роста нервов, норадре-налина (основного нейромедиатора адренергических нейронов) и субстанции Р (основного нейромедиатора первичных афферентных нейронов) на продукцию интерлейкина-1 альвеолярными макрофагами здоровых животных и опухоленосителей в выделенные нами периоды развития опухолевого процесса.

ёЗ 2 1

240

Я 200 м 160 о

о

Й so

~ 40

о

а« д.

О 2 13

вреия (над.)

. б [ 5 . 4

! 3

2 1 0

30 25 20 15 10

=8:

0 24ÎT вргмя (нзд.)

m

m г~п

I «

- * Г J

- r^H

- plj ■ '

- i j ■ Г 1 î J

О 2 S ареыя (над.) о- 6sз SPH

СЗ-Саз îrii Pïîc.6. Шггяккз "с.тгсрз роста гг®расз,

0 4

е- îPH * ГГ':- $РН

ея^киого з css^is-sl из cncïrrajîfiya (a), Я5С-cr:aiy.zz?aiz.4ity!i (б) ЕгрОл^тгэ кг-ггсзссЛ«-иа-1 кгяро-5.агаш1, окотассть пжерг^ц^ (з) я ерзд-

îkso колэтесгго ареной (г) легкза сrrjzazc::«гшггкй. Достоверность различии: * - р<0.05; ** - р<0.01

| |- спонтанная продукция

«РН (иг/ил) Œ3- стимулированная продукция

Pis:.?, йлпякиэ С?Н на продукция ИЛ-1 вяавеааярньмя ыгкрс§зггш< здороши мивед (а) и опуяолзноснтолеЯ в 1-й (б) и во 2-й (в) периода а условиях In vitro.

Достоверность различий: * - р<0.05; ** - р<0.01

У едоропз »геотек йй! окаг^еал кнгкЗирувсзй зффэкт на стк^у-гиросгкзув продукта ЕЛ-1 в концентрацгз: БООнг/ш н се в&ид кг; споатапзу» (рис.7а). В тагак £е 51хпер1£йита^, проведенных с ю::-рофзгс^л спуходопоситглей б равней периоде, фактор скигал к спс::-тапнуа, и сгюудъ-ровагшую продукция лнтерлэ£ккыа, пр;; этом тшшаз доьа ££Н сюкадась до 250 кг/ил по сраикши с контрольна; лыБотвка (р^о.7б). У оаухолзкосителей ъ поздней периоде (р::с.7ь), фактор ез шшлл ш1 на спонтанную, ш: на стгсгулированкую продукт 1Ш-1.

В аналогичных зксперю:зита;: проведенных с норадреналинои, бал: подучены следуище ревулътьты (р;:с.В). У вдороБьк ь^ей (а)норад-рзналзо в дозе 10_с1! подавлял с г продукци 11Л-1, ес

влахи ка спонтаннуз. В остадьпих исследованных концентрата:: ко-радроналнн достоверно ез ьеклл ка этот показатель. У опуходспос::-тело;*: в ранке:: пер::з;;г (б) норадрекаш: оказывал ингкбкругсщо действие кап на спонтовгуз. таге к на стимулированную продукта ИЛ-1 в концентрациях 10~10-10-6Ц, не влияя в дозе 10_6П. В поздазы . периоде норадренгшш оказьпал ингибируюцее дейатвкз только на спонтанную продукции 11Л-1 в концентрации Ю-10и, ко не влиял в более высоки (в).

Ревультаты опытов с субстанцией Р представлены на рис.9. У здоровых шсэй субстация Р увеличивала стимулированную продукта ИЛ-1 и не влияла на спонтанную (а). У опухоленосителей в ранний период (б) в отношении стимулированной продукции ИЛ-1 были получены результаты, в целом сходные со здоровыми животными. В то се время, субстанция Р подавляла спонтанную продукцию 'в концентрациях 10~1О-10~8 моль/л. У опухоленосителей в позднем периоде (в) субстанция Р не влияла на стимулированную продукцию ИЛ-1 при сохранении ингибирующего действия на спонтанную в концентрациях Ю"10-Ю"8 моль/л.

Проведенные эксперименты показали существенные изменения ответа альвеолярных макрофагов на ФРН, норадреналин и субстанцию Р у опухоленосителей в различные периоды канцерогенеза, что доказывает последовательное изменение нервной регуляции функций макрофагов на уровне клеток-мишеней в процессе развития и роста опухоли. Полученные результаты свидетельствуют о повышении чувствительности макрофагов опухоленосителей к ингибирующим и снижении - к стимулирующим влияниям нервной системы.

7

„ ¡3

Зз

§2 1 О

шШШ

п

о го so :о

| | - спонтскнгл продукция Ргз.З. Оггглтгэ

норгдрсналлн Ш)

3 - ст!шу.тнровгияая пргдузция

гз

"t

адпргпя (о,) и с^угогтпосгт

(з) псргс;" i з ve.-сття In riiro. Достоверность различий: * - р<0.С5; - р<0.01

з 1-Я (С) я ГО 2-Я

з б з

субстанция Р Ш)

CD -спонтанная продукция feS - стимулированная продукция

Ркс. 9. Влияние субстанцки Р на продукции НЛ-1 аяаЕсалгтзньги изкра-|*атамм здоровых мьшэЯ (а) и спухолгнооггелсЯ в 1-Я (б) и во 2-Я (в) периода в условиях In vitro. Достоверность различии: * - р<0.05; ** - р<0.01

- 18 -

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ liAKPOSATOB ЗДОРОВЫХ ШЕЙ К НЕЙРОИЕДИАТОРАМ.

Поскольку досиипатиеация сопровождается повьшением в тканях уровня эвдогенного фактора роста нервоЕ (Heumann R., 1987) и выраженной 12,й(унссупресскей (Madden K.S., Livnat S., 1991) к, как показали наз: предыдущие эксперименты, введение ФРН здоровые животным приводит к подавлении продукции ИЛ-1 альвеолярными макрофага-13!, нахс: было высказано предположение о ведущей роли накопления эндогенного фактора в подавлении продукта! ИЛ-1 макрофагами при канцерогенезе. Поэтому представляло интерес оценить возможность модуляции ответа макросов здоровых шшей на нейроыедиатори в условиях введения фактора ln vivo (рис.10).

-2.0

Я

¿1.0 0.5 0.0

о esq ьаа

ФРК (иг/мл)

I I - спонтькнья продук-.-ня

норадреналин Ш) Е2 -стимулированная продукция

Рис.10. Ллкяппа аавдвикя S?íí вдоршыы hüiau ¡¡в чуясэтэтгеллностъ алышаляриш ка1фо$агов к С?И (a) ü ¡юрадраналшу (С) п у слои;«:: In vitro.

Достоверность различий: * - р<0.05; ** - р<0.01

Введение фактора роста нервов здоровым мышам приводило к снижению стимулированной продукции ИЛ-1, исчезновению эффекта ФРН в условиях In vitro (а), к сдвигу эффективных доз для норадреналина в область 10-8М (б), что существенно не отличается от аналогичных показателей мышей-опухоленосителей..

Эти данные свидетельствуют, что длительное воздействие повышенных доз фактора роста нервов на организм приводит к изменениям фунциональной активности макрофагов, сходным с наблюдающимся при

- 19 - .

канцерогенезе, включая изменение их чувствительцсети к нэйроядкэ-Top2.'i. Поэтому повьсбнне уровня ÍPH в десныпатнвированных тканях ксзет быть одним иа кэханнэмов ша<уносупрессга1, наблюдаемся пра десимпатизации, в том чзгсде при канцерогенезе.

вывода

1. При канцерогенезе в легких, индуцированной уретанса у tssseñ BALB/c, происходят закономерные изменения а регулятсрпсп бди» "симпатическая нервная систеыа-альвеолярные макрофаги", проявляв-гдееся в виде снижения плотности симпатической иннервации, повыгэ-ния уровня катехолаыннов в легких и снижения продукции ИЛ-1 альвеолярными макрофагами.

2. При умекьсении плотности адренергической иннервации легких опухоленосителей более чем на 60Z происходит снижение продукции ИЛ-1 альвеолярными макрофагами. Введение фактора роста нервов в предшествующий этому период замедляет оба процесса, что говорит об участии ФРН и симпатической нервной системы в регуляции продукции этого цитокина при канцерогенезе.

3. У опухоленосителей. при десгашатизации меньшей 60%, <8=3 и норадреналин In vitro подавляют продукцию ИЛ-1 макрофагами в более низких концентрациях по сравнению со здоровыми животными, что свидетельствует о повышении в этот период чувствительности макрофагов опухоленосителей к кнгиОиругсцим влияниям симпатической нервной системы.

4. У опухоленосителей, при десимпатизации превышающей 60Х, ®Н . и норадреналин In vitro не влияют на стимулированную продукция ИЛ-1 при сохранении ингибиружцего эффекта норадреналина на уровень спонтанной продукции, что говорит об углублении нарушений регуляции функциональной активности макрофагов опухоленосителей в этот период.

5. У опухоленосителей, при десимпатизации меньшей 60Z, ФРН In vivo снижает продукцию ИЛ-1 и усиливает рост адренергических нервных волокон, но оба этих эффекта не обнаруживаются при большей величине десимпатизации, что говорит о комбинированном характере нарушений ответа на этот фактор при канцерогенезе.

6. ФРН увеличивает количество опухолей легких независимо от периода, в который вводится фактор, что свидетельствует о его стимулирующем влиянии на канцерогенез, индуцированный уретаном.

V

\

1

7. Черев месяц aoozo oasssn СРВ, вводного опухоленоситслям с жвгашой десиыпативациа меньвей 602, с целью ее замедления, наб-яяается тормсасешю саухсиеваго росте, которое отсутствует ops: ведения этого фактора в Оожэе поздний период, что говорит об из-»¿аийстш характера варанов рэгулядин опухолевого роста сккпатичес-KBS отделан ворвной снстеш в процессе существования опухоли.

СИЮСК РАБОТ, СПУВШОВАНЕЫХ ПО ТЕШ ДИССЕРТАЦИИ.

1.£свдкп К.Д., Е^рлггкна А.В.. Абрамов В.В.. Козлов В.А. Симпатическая иннервацца костного иозга у кшей BALB/c в условиях хими-чоского какцэрогейеаа. //Тез. сшш. с международным участием "Современен проблемы клинической и экспериментальной психонейроимму-иалогшГ Poccks-Touck. Декабрь, 8-10. 1992. - с.79-81.

2.2оекин И.Д., Абрамов В.В.. Цурлыгина А.В.. Козлов В.А. О роли симпатической денервацци при химическом канцерогенезе в легких в патогенезе нарушения продукции интерлейгаша-1 альвеолярными макрофагами. //Вши. 8KCQ. биол. и мед. - 1993. - N4. - с.419-421.

3.Lozhkln I.D., Abranov V.V., Shurllglna A.V.. Kozlov V.A. On the role of sympathetic denervation at chemical carcinogenesis In the lungs during disturbances of lnterleukln-1 producnlon by alveolar macrophages.//Abstracts of 2-nd International Congress ISN1M. (Salerno. Italy. September. 12-17, 1993) - p.249.

4. Ложкин И.Д.. Абрамов В.В. Симпатическая иннервация легких и продукция ИЛ-1 альвеоляркши макрофагами при канцерогенезе. //ВЮлл. 00 РАМН. - 1994. - К4. - с.85-88.

Б. Ложкин И.Д., Абрамов В.А., Козлов В.А. Влияние фактора роста нервов на продукций интерлейкина-1 макрофагами здоровых животных и опухоленосителей в условиях In vivo.//C6opH. тез.. посвященных 25-летию СО РАМН "Клинические и экспериментальные исследования молодых ученых сибирского отделения РАМН".- Новосибирск. 1996. с. 69.

Зак. 51. T«IJX 100. Печ. л. 1

Типография СО РАМН, Новосибирск, ул. Академика Тимаком, 9, UN.