Санитарная охрана территории от завоза и распространения особо опасных вирусных инфекций

Титенко, Алексей Михайлович

Диссертации по медицине → Эпидемиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Санитарная охрана территории от завоза и распространения особо опасных вирусных инфекций

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Титенко, Алексей Михайлович Иркутск 2005 г.

Ученая степень: доктора биологических наук

ВАК РФ: 14.00.30

Автореферат диссертации по медицине на тему Санитарная охрана территории от завоза и распространения особо опасных вирусных инфекций

На правах рукописи

ТИТЕНКО Алексей Михайлович

САНИТАРНАЯ ОХРАНА ТЕРРИТОРИИ ОТ ЗАВОЗА И РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОСОБО ОПАСНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ (ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.00.30 - эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Иркутск - 2005

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный консультант:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Онищенко Геннадий Григорьевич

Ямникова Светлана Сергеевна

Зыкин Леонид Федорович Короткое Владимир Борисович

Ведущее учреждение: Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится 2005 г. в ¿0 часов на за-

седании диссертационного совета Д. 208.078.01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб».

Автореферат разослан »£ 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Слудский A.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Санитарная охрана территории (СОТ) представляет систему общегосударственных мероприятий, направленных на предотвращение заноса из-за рубежа и распространения на территории страны особо опасных инфекций, ограничение и ликвидацию очагов этих болезней при их выявлении [Сергиев В.П., 1993]. Проблема СОТ комплексная, решается органами законодательной и исполнительной власти, а также специалистами различной направленности [Онищенко Г.Г. и др., 1998, 2002; Прометной В.И., 2003; Федоров Ю.М., 2004; Брюханова Г.Д., 2004].

Как известно, вспышки особо опасных вирусных инфекций (ООВИ) регистрируются не только в пределах естественных нозоареалов, но и на неэндемичных территориях вследствие заноса вирусов людьми или животными. Перечень ООВИ, на которые распространяются правила по СОТ, традиционно определяется контагиозностью, тяжестью заболевания, уровнем летальности, а также количеством больных при эпидемических вспышках [Васильев К.Г и др., 1974; Щепин О.П., Ермаков В В., 1982; Дроздов С.Г., Сергиев В.П., 1984; Онищенко Г.Г. и др., 2002]. В настоящее время в этот перечень в РФ входит семь ООВИ. Вместе с тем, по действующим Санитарным правилам СП 1.3.1285—03. к особо опасным вирусам I—И групп патогенности отнесены свыше 90 инфекционных агентов. Проведение анализа значения ООВИ для СОТ и планирование противоэпидемических мероприятий осложняется тем, что, как отмечал ранее Б.Л. Черкасский, «не приведены критерии, согласно которым возбудитель отнесен к той или иной группе патогенности. Не определено, чем эти возбудители отличаются друг от друга (кроме их таксономического положения) и почему регламентируется разной степени строгости режим работы с ними» [Черкасский Б.Л., 1996]. Накопленные за последние годы сведения по целому ряду ООВИ существенно меняют представления о реальной опасности некоторых инфекций.

Таким образом, актуальность работы определяется необходимостью комплексного анализа накопленной за последние 20—30 лет информации об ООВИ с точки зрения возможности их завоза на территорию РФ и возникновения вторичных очагов инфекций. В условиях расширения и активизации международных связей такая работа позволит дать обоснованные рекомендации по повышению готовности органов и служб здравоохранения к проведению мероприятий по СОТ. Для реализации такого подхода целесообразно определить критерии и признаки, которые позволили бы провести анализ каждой конкретной ООВИ, уточнить и обосновать круг инфекций, в отношении которых целесообразно проведение мероприятий по СОТ, а также сгруппировать их по значимости в пределах перечня. Это даст возможность, с одной стороны, наиболее полно определить круг вирусных инфекций, которые представляют опасность с точки зрения завоза и распространения на территории РФ, с другой — в каждом случае конкретизировать необходимый и достаточный комплекс профилактических и противоэпидемических мероприятий.

БИБЛИОТЕКА

■---- - ^— - —д » I ^

1УЖГ,

на их основе разрабатываются методы лабораторной диагностики ООВИ, без чего невозможно решение вопросов СОТ. Во-вторых, накапливаются данные о высокой степени гетерогенности циркулирующих в природе вариантов, по крайней мере, некоторых возбудителей ООВИ, что необходимо учитывать при проведении полноценного лабораторно-диагностического исследования В-третьих, для большинства ООВИ характерно отсутствие специфических симптомов, что не позволяет поставить корректный диагноз и реализовать этиологический подход в рамках СОТ без лабораторно-диагностических исследований. Наконец, вопросы изоляции и идентификации возбудителей ООВИ постоянно возникают в связи с выделением группы «новых и вновь возвращающихся инфекций», большая часть которых вызывается вирусными агентами [Дроздов С Г., Сергиев В П , 1984; Львов Д.К., 2000, 2002; Дашкевич В.А. и др , 2002; Сергиев В.П., 2000; Шевченко Ю Л. 2000; Шевченко Ю.Л., Онищенко Г Г., 2001; Они-щенко Г.Г. и др , 2003; Ьес1егЬеп> 1998]. Важно оперативное включение данных по этой группе ООВИ для рассмотрения их актуальности в плане СОТ. Серьезные вопросы возникают в связи с возможным применением ООВИ в диверси-онно-террористических целях [Онищенко Г.Г. и др., 2003] В этой связи особое внимание должно уделяться расследованию причин эпидемий и эпизоотий неизвестной, предположительно вирусной этиологии. Следовательно, целесообразна отработка общих подходов к эпидрасследованию подобных ситуаций и анализ возможной роли ООВИ в возникновении чрезвычайных ситуаций (ЧС).

Цель исследования

Научное обоснование совершенствования профилактических, противоэпидемических мероприятий и лабораторной диагностики особо опасных вирусных инфекций для обеспечения санитарной охраны территории

Задачи исследования

1. Разработать критерии и обоснования для дифференцированного анализа особо опасных вирусных инфекций с точки зрения их актуальности для санитарной охране территории.

2. Выделить группы (категории) особо опасных вирусных инфекций, для которых требуется проведение однотипных профилактических и противоэпидемических мероприятий по санитарной охране территории.

3. В соответствии с разработанными критериями и категориями провести сравнительный эпидемиологический анализ особо опасных вирусных инфекций с точки зрения их актуальности для санитарной охраны территории

4. На основе изучения биологических и молекулярно-биологических свойств филовирусов и альфавирусов разработать методические подходы и тактические приемы совершенствования лабораторной диагностики вызываемых ими инфекций.

5. Разработать общий подход к расследованию эпидемических вспышек (эпизоотий) неизвестной, предположительно вирусной, этиологии и апробировать его.

6. Дать оценку состояния лабораторной базы региона Сибири и Дальнего Востока в связи с необходимостью выполнения задач по санитарной охране территории в отношении вирусных инфекций.

Научная новизна исследований

Впервые сформулирован общий подход к отбору актуальных для СОТ ООВИ. Разработаны критерии для отнесения ООВИ к инфекциям, в отношении которых требуются мероприятия по СОТ, и 16 основных признаков (свойств) ООВИ, на основании которых проводится анализ ООВИ на соответствие критериям. Определены шесть категорий ООВИ в соответствии с их значимостью для СОТ, применение которых позволяет в зависимости от особенностей объединить ООВИ в три группы с однотипным набором профилактических и противоэпидемических мероприятий. Проведен анализ 34 ООВИ на соответствие предложенным критериям, признакам и категориям. По результатам анализа выделено 17 ООВИ, для которых целесообразно проведение мероприятий по СОТ. Применение предложенных критериев, признаков и категорий дает основания для отнесения возбудителей ООВИ к той или иной группе патогенности. Оценена вероятность выноса контагиозных ООВИ за пределы естественного ареала. Проанализированы условия, которые могут способствовать образованию вторичных очагов вирусных инфекций с учетом региональных особенностей (в Сибири и на Дальнем Востоке).

Изучены биологические свойства вирусов Эбола и Марбург. В плане разработки экспериментально-биологической модели изучена чувствительность морских свинок различного возраста к заражению вирусами Марбург и Эбола. Показано, что при серийных пассажах вирусов Эбола и Марбург возрастает вирулентность с сокращением инкубационного периода. Впервые показаны изменения морфологии бляшек, образованных вирусами после серийных пассажей на морских свинках. Изучена динамика образования специфических антител у морских свинок, иммунизированных вирусами Марбург и Эбола. Получены антисыворотки морских свинок с высоким титром специфических антител. Впервые показана индукция вируснейтрализующих антител у морских свинок, инфицированных вирусом Эбола, и разработан метод их определения.

С целью оптимизации подходов к лабораторной диагностике ООВИ изучены культуральные свойства вирусов Эбола (шт. Заир) и Марбург (шт. Voege), адаптированных к перевиваемым клеточным культурам Vero и BGM. Отмечено и описано цитопатогенное действие вирусов. Впервые изучена динамика репродукции вирусов Марбург и Эбола в культуре клеток при высокой и низкой множественности инфицирования. Определены сроки максимального накопления вируса в культуральной жидкости, его титры. Впервые показана гетерогенность популяции вирусов Марбург и Эбола по признаку формирования бляшек и по репродукции в культуре клеток Vero. Впервые изучена динамика экспрессии антигенов вирусов Марбург и Эбола в клетках Vero. Полученные данные послужили основанием для оптимизации непрямого метода флюоресцирующих антител. Впервые разработаны для вирусов Эбола и Марбург диагностические методы — клеточный иммуноферментный анализ для выявления антител и реакция нейтрализации (для вируса Эбола) Отработаны режимы инактивации вируссодержащего материла, контролей полноты инактивации. На основе разработанных методов предложена схема лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Эбола и Марбург.

Проведено детальное изучение структуры и состава вирионов и субвирусных компонентов вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ).

Впервые определен или уточнен ряд физико-химических параметров вирионов вируса ВЭЛ. Установлено, что константа седиментации вирионов составляет 265 S, плавучая плотность в сахарозе 1,18-1,19 г/см3, в хлористом цезии 1,19— 1,21 г/см3, изоэлектрическая точка вирионов pl = 6,5. Методом электронного парамагнитного резонанса показано, что вирионы ВЭЛ содержат двухслойную липидную мембрану, жесткость которой выше, чем у цитоплазматических мембран клетки-хозяина. Разработаны методы препаративного получения очищенных вирионов вируса ВЭЛ, оболочек и сердцевин вируса Впервые определен белковый состав исследованного штамма вируса ВЭЛ и разработан метод получения миллиграммовых количеств высокоочищенного белка С — группоспе-цифического антигена альфавирусов. Впервые показано, что вирионный РНП существует в форме сердцевин вируса и при действии температуры, замораживания-оттаивания, малых концентраций додецилсульфата натрия и ЭДТА распадается на РНК и белок. Впервые определены физико-химических параметры сердцевин вируса и проведено детальное исследование их структуры и стабильности. Константа седиментации сердцевин вируса ВЭЛ 153 S, плавучая плотность в сахарозе (на Д20) — 1,34 г/см3, в хлористом цезии — 1,41 г/см3. Выделенные вирусные антигены пригодны для получения кроличьих антисывороток, что закладывает основу для конструирования диагностических тест-систем. С применением комплекса вирусологических, молекулярно-биологических и электронно-микроскопических методов впервые показано, что лабораторные пулы вируса ВЭЛ одного и того же штамма гетерогенны по биологическим свойствам, полипептидному составу и особенностям структуры вирионов.

Предложена и апробирована общая схема анализа материала при расследовании вспышки инфекционного заболевания неизвестной, предположительно вирусной, этиологии. С применением этой схемы проведено изучение причин массовой гибели тюленей Байкала с целью определения опасности эпизоотии для населения и животных. Впервые доказана этиологическая роль морбилливирусов при эпизоотиях водных млекопитающих. От больных и павших животных выделено и охарактеризовано 4 штамма неизвестного ранее вируса, который получил название морбилливирус байкальской нерпы (МБН) Показана антигенная гетерогенность вариантов МБН, циркулирующих в популяции байкальских тюленей. На основе выделенных штаммов МБН сконструирована иммуноферментная тест-система и впервые проведен серологический мониторинг популяции.

Теоретическая и практическая значимость

ния работы фундаментальные данные по биологическим и молекулярно-био-логическим свойствам фило-, альфа- и морбилливирусов. Эти результаты послужили основой для формирования схемы лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Эбола и Марбург, также как и общей схемы исследования материала при эпидемии (эпизоотии) неизвестной, предположительно вирусной, этиологии. В целом проведенное исследование закладывает теоретические основы совершенствования мероприятий по СОТ от ООВИ.

Практическое значение работы заключается в следующем. На моделях вирусов Эбола и Марбург усовершенствованы подходы к лабораторной диагностике вызываемых ими инфекций. Отмеченный цитопатический эффект вирусов Эбола и Марбург на клетках Vero и BGM позволяет титровать инфек-ционность вируса по цитопатогенному действию. С использованием метода образования бляшек возможно определять инфекционную активность при изучении процессов размножения вируса. Способность вируса формировать бляшки под агаровым покрытием также может быть использована для получения клонированных пулов вирусов. Сведения о гетерогенности популяции вируса по признаку формирования бляшек позволяют изучать генетические различия вирусных клонов. Данные по экспрессии вирусспецифических антигенов в культуре клеток дают возможность определить оптимальные сроки приготовления слайд-антигенов и правильно оценивать результаты выявления антигенов вирусов Эбола и Марбург в инфицированных клетках методом флюоресцирующих антител. Разработанный метод клеточного ИФА применен при выявлении антител к вирусам Эбола и Марбург в сыворотках крови. Метод имеет преимущество перед традиционным твердофазным иммунофер-ментным анализом, так как для его постановки не требуется получения очищенного антигена в условиях максимальной биологической защиты. Полученные данные по чувствительности морских свинок различного возраста к заражению вирусами Эбола и Марбург позволили подобрать эффективные схемы иммунизации и дали возможность получить специфические высокоактивные антисыворотки к этим вирусам Выявление у зараженных морских свинок нейтрализующих вирус Эбола антител дает основания для разработки вакцин и специфических противовирусных иммунопрепаратов. Получены варианты вирусов Эбола и Марбург с различной вирулентностью для морских свинок, а также адаптированные к клеточным культурам. Эти варианты вирусов хранятся в музее живых культур Иркутского НИПЧИ.

С учетом мирового опыта и в результате собственных разработок создана лабораторная система максимальной биологической защиты, которая подтвердила свою эффективность при работе с возбудителями геморрагических лихорадок Эбола и Марбург Разработанный и апробированный метод контроля на специфическую безопасность in vivo и in vitro позволяет проводить оценку полноты инактивации инфекционного материала, что при работе с вирусами I—II групп патогенности является необходимым этапом при выносе инактивированного материала на чистую зону

торных условиях и испытана на практике при обследовании больной М из г. Корсаков с диагнозом «геморрагическая лихорадка Марбург?».

С целью отработки методических подходов к созданию лечебно-профилактических и диагностических препаратов на модели вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей показана необходимость проведения комплексного молекулярно-биологического изучения вирионов и структурных компонентов вируса Результаты определения физико-химических параметров вирионов и структурных компонентов вируса ВЭЛ и разработанные методы выделения и очистки указанных структур имеют практическую значимость для учреждений, занимающихся исследованием альфавирусов. Методы очистки вирионов, препаративного получения оболочек и сердцевин вируса, а также группоспецифического антигена альфавирусов - белка С - могут быть использованы в лабораториях, занимающихся получением антигенов альфавирусов как для их диагностики, так и при разработке субъединичных вакцин. Выявленная гетерогенность как лабораторных штаммов (вирус ВЭЛ и фило-вирусы), так и вариантов вируса, циркулирующих одновременно во время эпизоотии (морбилливирусы) имеет серьезное практическое значение при планировании и проведении лабораторно-диагностических исследований.

Определены подходы к расшифровке вспышек инфекционных заболеваний неясной, предположительно вирусной этиологии. Разработана комплексная схема изоляции вирусов в системах с различной пермиссивностью. Схема анализа материала апробирована при расследовании причин массовой гибели байкальской нерпы От больных и погибших животных выделен возбудитель и определена его таксономическая принадлежность. Четыре авторских штамма МБН, выделенные от тюленей, хранятся в музее живых культур Иркутского НИПЧИ. С использованием выделенных нами штаммов разработан метод клеточного иммуноферментного анализа и применен для серодиагностики этой инфекции и мониторинга популяции нерпы в озере Байкал.

Результаты исследований нашли отражение в приведенных ниже документах:

1. Методические рекомендации по проверке герметичности боксов биологической защиты и эффективности работы бактериальных фильтров в системе вентиляции (утв. зам. Председателя Госкомсанэпиднадзора России. N01-19/41-17 от 17.03.96).

2. Руководство по противоэпидемическому режиму работы с особо опасными вирусами I группы. - Иркутск, 1991,22 с. (Одобрено ученым советом Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока 24.06.91 и утв. директором института).

3. Методическое пособие по лабораторной диагностике возбудителей геморрагических лихорадок Эбола и Марбург (утв. зам. Председателя Госкомсанэпиднадзора России. N 01-19/35-17 от 17.03.96).

4. Методическое пособие «Мониторинг морбилливирусов у тюленей Байкала» (утв. зам. Председателя Госкомсанэпиднадзора России. N 01-19/3217 от 17.03.96).

5. Программа цикла усовершенствования врачей «Актуальные проблемы эпиднадзора за особо опасными и природно-очаговыми вирусными инфекциями» (утв. зам. начальника Управления подготовки и использования кадров Госкомсанэпиднадзора России 14 августа 1995 г.).

6. Руководство по специальной подготовке специализированных противоэпидемических бригад для работы в чрезвычайных ситуациях (утв. Первым зам. Министра здравоохранения РФ, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 31.01.99 г. - М., 1999).

7. Санитарная охрана территории. Организация и проведение первичных мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания карантинными инфекциями, контагиозными вирусными геморрагическими лихорадками, малярией и инфекционными болезнями неясной этиологии, имеющими важное международное значение. Методические указания МУ 3.4.1028-01. Минздрав России. - М., 2002. (утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 6 апреля 2001 г.).

8. Эпидемиология. Санитарно-эпидемиологические правила. Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности). СП 1.3.1285-03 (утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым зам. Министра здравоохранения Российской Федерации 12 марта 2003 г.).

9. Проведена паспортизация 24 вирусологических лабораторий центров Госсанэпиднадзора, противочумных станций и НИИ в субъектах РФ на территории Сибири и Дальнего Востока. Даны рекомендации по определению базовых лабораторий для работы с вирусами II группы патогенности. Материалы анализа с паспортами лабораторий направлены в Минздрав России 30.03.01. Исх. № 139 (24 стр.).

Материалы исследований широко используются при чтении лекций по микробиологии и вирусологии на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей (биологов) по особо опасным инфекциям при Иркутском НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока.

Апробация материалов диссертации

Результаты исследований были представлены на научных конференциях:

XI всесоюзная конференция по электронной микроскопии. - Москва, 1979; Стратегия генома РНК-содержащих вирусов животных. Международный симпозиум. - Москва, 1980; Второй Всесоюзный симпозиум «Магнитный резонанс в биологии и медицине». - Черноголовка, 1981; I всесоюзный биофизический съезд.

— Москва, 1982; Первая Верещагинская Байкальская международная конференция. — Иркутск, 1989; 10 всесоюзное совещание по изучению охране и рациональному использованию морских млекопитающих. — Москва, 1990; Состояние здоровья населения города Иркутска в связи с техногенным загрязнением окружающей среды. - Иркутск, 1991; Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций — Волгоград, 1992; Международный симпозиум. «Проблемы патологии и охраны здоровья диких животных». — Москва, 1992; Научно-практическая конференция, посвященная 70-летию образования санэпвд-службы Иркутской области. — Иркутск, 1993; Научно-практическая конференция «Проблемы природноочаговых и зоонозных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке». — Чита, 1993; Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы профилактики особо опасных природно-очаговых инфекционных болезней». - Иркутск, 1994; Ninth International Conference on Negative Strand Viruses.

— Estoril, Portugal, 1994; International Scientific conference «Tick-borne viral, rickettsial

and bacterial infections». — Irkutsk, 1996; Научно-практическая конференция, посвященная 100-летию образования противочумной службы России. — Саратов, 1997; 5-th International Potsdam Symposium on Tick-bome Diseases «Tick-bome Encephalitis and Lyme Borreliosis». — Berlin, Germany, 1999; Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы обеспечения здоровья международных путешественников». - Улан-Удэ, 2001; 6-th International Potsdam Symposium on Tick-borne Diseases. — Berlin, Germany, 2001; Научно-практическая конференция «Здоровье населения Иркутской области: проблемы и пути решения». — Иркутск, 2003 г.; Конференция, посвященная 70-летию Противочумного центра — Москва, 2004; научные конференции института 1987—2005 гг.; В завершенном виде работа доложена на научной конференции Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока 23.12.2004 г.

Публикации

Диссертация выполнена в рамках четырех тем НИР (№№ ГР 01.8.80009517; 01.9 30009498; 01.9 80010187; 01.9.80010188), а также в период работы комплексной межведомственной комиссии, которой было поручено организовать изучение причин массовой гибели тюленей Байкала (правительственная телеграмма № 14663-54-10 от 16 декабря 1987 г.), при непосредственном участии соискателя в качестве руководителя и ответственного исполнителя. Результаты исследований нашли отражение в двух монографиях. По теме диссертации опубликовано 68 работ, в том числе 21 — в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций; 12 — в материалах международных, всесоюзных и всероссийских конференций; 6 — в зарубежных журналах.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов, заключения, выводов, списка использованной литературы Работа изложена на 321 странице машинописного текста, содержит 34 таблицы и 68 рисунков. Библиографический указатель включает 357 информационных источников, в том числе 141 — отечественный и 216 — зарубежных.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Определены критерии отбора особо опасных вирусных инфекций для их дифференциации в зависимости от эпидемиологической значимости для санитарной охраны территории с учетом специфики вирусных болезней. Подобрана система категорий и признаков, позволяющая корректировать перечень особо опасных вирусных инфекций и выделять группы болезней со сходными эпидемиологическими характеристиками, имеющими значение для организации профилактических и противоэпидемических мероприятий

2. Систематизированы важные с точки зрения санитарной охраны территории сведения для 34 особо опасных вирусных инфекций Уточнены ареалы возбудителей, круг хозяев и переносчиков, вероятность заноса инфекции с формированием вторичных очагов. Пересмотрен перечень болезней, в отношении которых целесообразно проведение мероприятий по санитарной охране территории.

3. Получены новые фундаментальные данные о биологических свойствах вирусов I—II групп патогенности (фило-, альфавирусы), имеющих значение для совершенствования методов лабораторной диагностики и биологической защиты. Результаты исследований послужили основой разработки методов и схемы лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Эбола и Марбург, пригодных для применения в очагах инфекций.

4. Разработана общая схема лабораторного исследования материала при эпидемических вспышках (эпизоотиях) неизвестной, предположительно вирусной, этиологии На примере внезапно возникшей массовой гибели нерп Байкала апробированы принципиальные подходы к расследованию причин эпидемических вспышек (эпизоотий) неизвестной этиологии.

5. В результате оценки возможностей 24 вирусологических лабораторий на территории Сибири и Дальнего Востока даны рекомендации по совершенствованию лабораторно-диагностической сети для выполнения задач по санитарной охране территории.

Глава 1. Обзор литературы. Современные подходы к санитарной охране территории от завоза и распространения вирусных инфекций

Обзор состоит из трех разделов: 1.1. Международные и национальные медико-санитарные правила; 1.2. Изменения эпидемиологической активности вирусных инфекций. Новые и вновь возвращающиеся особо опасные вирусные инфекции; 1.3. Изучение фундаментальных свойств возбудителей особо опасных вирусных инфекций и разработка методов их лабораторной диагностики как одна из основных составляющих санитарной охраны территории.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. Материал и методы

Включает пять разделов: 2.1. Сбор и анализ эпидемиологических данных; 2.2. Экспериментальные животные и клеточные культуры; 2.3. Методы работы с альфавирусами; 2.4. Методы работы с филовирусами; 2.5. Методы работы с морбилливирусами.

Проанализированы директивные и инструктивно-методические документы Министерства здравоохранения Российской Федерации, СНГ и ВОЗ, касающиеся СОТ, и международные медико-санитарные правила. Составлены аналитические обзоры для 34 ООВИ по общему плану с учетом разработанных критериев и признаков, позволяющих оценить важность той или иной вирусной инфекции с точки зрения СОТ. Основой для подготовки аналитических обзоров по отдельным ООВИ служила электронная база данных, включающая более пяти тысяч источников по 2004 г. Основные сведения из аналитических обзоров суммированы в виде таблиц.

По опубликованным материалам проведен ретроспективный анализ заболеваемости ООВИ (вспышечной и спорадической) в эндемичных странах и регионах. Проанализированы материалы официальной статистики по заболеваемости ООВИ в Российской Федерации. Одновременно анализировались условия, способствующие возникновению вторичных очагов ООВИ и распространению ООВИ на территории Сибири и Дальнего Востока. Проведено также эпизоотолого-эпидемиологическое районирование (картирование) территорий природных очагов ООВИ.

Для сбора материала о штатах и оснащенности вирусологических лабораторий, лабораторий ООИ и эпидемиологических отделов центров ГСЭН в субъектах РФ Сибири и Дальнего Востока использованы специально разработанные анкеты. На основе собранных данных подготовлены паспорта практических вирусологических лабораторий региона. В Красноярском крае и Иркутской области проверена готовность госпитальной базы, предназначенной для изоляции и лечения больных ООВИ.

В экспериментальных исследованиях использовано 2040 морских свинок, 320 взрослых белых мышей, 200 мышей-сосунков, 300 девятидневных куриных эмбрионов, культуры клеток Vero, Vero Е6, HeLa, BGM и фибробластов эмбрионов кур. Вирусологически исследованы материалы от 16 нерп, серологически изучены сыворотки крови 436 нерп.

Глава 3. Общие принципы оценки значимости особо опасных вирусных инфекций для санитарной охраны территории

3.1. Разработка критериев и признаков для анализа нозологических форм особо опасных вирусных инфекций. Перечень ООВИ, на которые распространяются правила по СОТ, традиционно определяется контагиозностью, тяжестью заболевания, уровнем летальности, а также количеством больных при эпидемических вспышках [Щепин О.П., Ермаков В.В., 1982]. Нами выделено три основных критерия, на основании которых можно отбирать актуальные для СОТ ООВИ (табл. 1).

Критерий I Занос инфекции приводит к существенным социально-экономическим последствиям.

Социальные и экономические последствия эпидемий, в том числе ООВИ, неразрывно связаны. Это массовые заболевания, вызывающие гибель людей и панику среди населения, что значительно усложняет борьбу с ними. Экономические последствия заключаются в затратах на локализацию и ликвидацию эпидемий, сокращении количества трудоспособного населения, снижении объемов или прекращении международного товарообмена. Например, противоэпидемические мероприятия при вспышке геморрагической лихорадки Эбола 1976 г. в Заире, проводимые только по линии группы экспертов ВОЗ, обошлись в один миллион долларов США [Геморрагическая лихорадка Эбола в Заире в 1976 г.]. В историческом аспекте из ООВИ наиболее впечатляющие сведения имеются в отношении натуральной оспы (контагиозная ООВИ) и желтой лихорадки (неконтагиозная ООВИ) В Европе с VII до конца XVIII веков от оспы погибли не менее 150 млн. человек Завозные эпидемии желтой лихорадки неоднократно регистрировались в США, Португалии, Испании, Франции и привели к гибели десятков тысяч человек [Щепин О.П., Ермаков В.В , 1982]. Кроме того, одной из основных причин разработки мероприятий по санитарной охране границ, а затем и территорий, явились социально-экономические последствия эпидемий (вспышек), связанных с завозом инфекций, способных к массовому распространению. Под действие этого критерия подпадает группа инфекций вирусной этиологии, для которой характерна способность к эпидемическому распространению, тяжесть заболевания, высокая летальность Ликвидация последствий их заноса требует проведения дорогостоящих профилактических и противоэпидемических мероприятий 12

Таблица 1

Критерии и признаки для рассмотрения вирусных инфекций с точки зрения их значимости для санитарной охраны территории

Основные критерии Основные признаки для анализа

I Занос инфекции приводит к существенным социально-экономическим последствиям II Занос инфекции может привести к формированию вторичных очагов III Эффективность противоэпидемических и ограничительных мероприятий при управлении эпидемическим распространением инфекции 1 Тяжесть заболевания и летальность

2 Контагиозность и способность к эпидемическому распространению

3 Необходимый уровень защиты в зависимости от группы патогенности

4 Ареал инфекции, наличие очагов на территории России

5 Механизмы, пути и факторы передачи, устойчивость возбудителя во внешней среде

6 Длительность вирусемии, носительство (человек)

7 Природный резервуар вируса на эндемичных территориях (хозяева и переносчики),

8 Занос по путям естественной (сезонной) миграции хозяев и переносчиков

9 Занос в результате внешнеэкономических связей (численность населения эндемичных территорий, интенсивность грузовых и пассажирских перевозок)

10 Умышленный занос ООВИ

11 Степень риска формирования вторичных очагов ООВИ на неэндемичных территориях

12 Меры по предупреждению заноса ООВИ и ликвидации заносного очага на неэндемичной территории

13 Особенности противоэпидемических мероприятий по отношению к больным ООВИ, переболевшим и контактировавшим

14 Целесообразность ограничения миграций населения и импорта

15 Эффективность лечебно-профилактических средств

16 Возможности клинической и лабораторной диагностики, включая субвидовое типирование вирусов для установления происхождения и уровня патогенности занесенного возбудителя ООВИ

Критерий И. Занос инфекции может привести к формированию вторичных очагов.

Формирование вторичных очагов на неэндемичных территориях всегда приводит к отдаленным серьезным социально-экономическим последствиям Наглядным примером является занос лихорадки Западного Нила (ЛЗН) инфицированными комарами в Нью-Йорк в 1999 г , последующее укоренение этой инфекции с формированием природных очагов почти на половине территории США и на юге Канады [Яарро1е 1.Н. е1 а1., 2000/. В настоящее время для локализации очагов ЛЗН в США проводятся дорогостоящие мероприятия по борьбе с комарами. Занос Крымской геморрагической лихорадки в Саудовскую Аравию с клещами при импорте овец привел к формированию в Западной провинции природного очага этой инфекции [е1-Ахагу О.М. е1 а1., 1997]. Причины формирования вторичных очагов и расширения ареалов ООВИ в настоящее время недостаточно изучены. При проведении анализа ООВИ целесообразно определять территории, где имеются предпосылки формирования вторичных очагов.

Критерий III Эффективность противоэпидемических и ограничительных мероприятий при управлении эпидемическим распространением инфекции.

Установлено, что для ряда ООВИ противоэпидемические и ограничительные мероприятия, применяемые при СОТ, не эффективны Это относится к широко распространенным антропонозным вирусным инфекциям II группы патогенности, таким как ВИЧ и некоторые формы вирусных гепатитов. В таких случаях, ограничительные и контрольные мероприятия могут касаться импортируемых препаратов крови, некоторых профессиональных групп населения и пр. Значение противоэпидемических и ограничительных мероприятий при управлении эпидемическим распространением инфекции хорошо продемонстрировано на примерах ликвидации натуральной оспы и контроля за желтой лихорадкой

Как правило, актуальные для СОТ ООВИ должны соответствовать всем трем критериям, но в отдельных случаях возможны варианты. Например, занос ООВИ может привести к эпидемической вспышке с серьезными социально-экономическими последствиями без укоренения инфекции на неэндемичной территории (тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС), геморрагическая лихорадка Марбург в Европе). Другой вариант — формирование вторичных очагов на неэндемичных территориях может иметь социально-экономические последствия спустя какой-то период времени (завоз ЛЗН в Северную Америку).

Для детального анализа ООВИ на соответствие предлагаемым критериям целесообразно использовать следующие признаки, приведенные в таблице 1, что позволяет максимально учесть имеющуюся научную и оперативную информацию.

3.2. Категории особо опасных вирусных инфекций в соответствии с их значимостью для санитарной охраны территории. При проведении дальнейшего анализа ООВИ целесообразно объединить их в категории по группам патогенности возбудителей и эпидемиологической значимости, следуя предложенным ранее критериям и признакам. Мы рассматриваем ООВИ I—II групп патогенности, которые по классификации В.Д. Белякова относятся к зоонозным (за исключением натуральной оспы и ТОРС) [Беляков В Д , Яфаев Р X., 1989]. По действующим Санитарным правилам [СП 1.3.1285—03] около 90 вирусов включены в I и II группу патогенности Точное число таких возбудителей указать сложно, так как их перечень постоянно пополняется за счет открытия новых ООВИ. Следует отметить, что необходимый уровень биологической защиты в зависимости от группы патогенности возбудителя ООВИ является важным признаком, с учетом которого определяется объем мероприятий, проводимых в рамках Комплексного плана (КП) по СОТ [Марамович A.C. и др., 2001]. Предлагаем выделить шесть категорий ООВИ по их значимости для СОТ.

Первая категория — это ООВИ I группы патогенности, способные к эпидемическому распространению. Среди возбудителей ООВИ первой категории представлены три семейства вирусов: Poxviridae, Filoviridae и Arenaviridae. Заболеваемость натуральной оспой ликвидирована в мире, в связи с чем эта инфекция исключена из перечня Международных медико-санитарных правил [Ежек 3., 1987]. Для ООВИ первой категории реализуется аспирационный и/или контактный механизм передачи [Черкасский Б.Л., 1996].

Завоз этих инфекций на неэндемичные территории регистрировали неоднократно [Дроздов С.Г., Сергиев В.П , 1984; Титенко А.М 1991; Титенко A.M.

1993; ТитенкоА.М., Андаев Е.И 2001; ТитенкоА.М., 2002; Fleischer К., 2000; Gunther S., 2000]. Даже при выявлении единичного больного могут возникнуть эпидосложнения. Очевидно, что противоэпидемические мероприятия в случае завоза этих ООВИ на неэндемичные территории должны проводиться в максимальном объеме [СП 1.3.1285-03]. Необходимо также проведение мероприятий, препятствующих образованию вторичных очагов инфекции на неэндемичных территориях в случаях, когда для этого имеются благоприятные условия.

Вторая категория — это ООВИ II группы патогенности, способные к эпидемическому распространению. Среди возбудителей ООВИ этой категории представители двух семейств вирусов: Arenaviridae (вирус Калифорния), Bunyaviridae (вирусы Крымской геморрагической лихорадки, геморрагической лихорадки с легочным синдромом). Для ООВИ этой категории реализуются аспирационный и (или) контактный механизмы передачи [Черкасский Б.Л., 1996]. Предусмотренные КП мероприятия должны проводиться, как для ООВИ II группы патогенности [СП 1.3.1285-03]. Клиническая и лабораторная база, имеющаяся в РФ, может обеспечить регламентируемый режим ведения больных, защиты персонала и окружающей среды.

Третья категория — это ООВИ II группы патогенности, имеющие высокую эпидемиологическую значимость в мире, но ограниченную способность к эпидемическому распространению. В эту категорию входят возбудители как трансмиссивных, так и нетрансмиссивных ООВИ (бешенство, ГЛПС). Больной ООВИ, отнесенной к этой категории, не представляет эпидемической опасности, но может быть источником инфицирования медицинского персонала при контакте с кровью пациентов. Кроме того, с точки зрения СОТ, представляет опасность завоз хозяев и/или переносчиков возбудителей ООВИ этой категории. Ситуация может осложняться, если на неэндемичной территории имеются условия для формирования вторичных очагов Больные трансмиссивными ООВИ в период вирусемии могут инфицировать местных кровососущих членистоногих, что инициирует циркуляцию вируса с образованием вторичных очагов инфекции. ООВИ третьей категории отвечают всем критериям значимости для СОТ при возможности формирования вторичных очагов на неэндемичной территории. Включенные в КП мероприятия должны бьггь направлены на изоляцию больных, препятствовать завозу хозяев и/ или переносчиков этих ООВИ и проводиться, как предусмотрено для ООВИ II группы патогенности [СП 1.3.1285—03].

Четвертая категория — это ООВИ II группы патогенности, имеющие ограниченную эпидемиологическую значимость в мире и ограниченную способность к эпидемическому распространению. В эту категорию входят трансмиссивные ООВИ, которые отличаются от ООВИ третьей категории тем, что возможность их заноса на неэндемичные территории невелика. Например, вследствие низкой эпизоотологической активности природных очагов, незначительного ареала, низкой населенности эндемичных территорий, отсутствия активных экономических связей с ней и т д В случае заноса предусмотренные КП мероприятия должны проводиться как для ООВИ третьей категории. Вместе с тем, требуется детальный анализ ООВИ этой категории на предмет наличия или отсутствия их значимости для СОТ, особенно в отношении вероятности формирования вторичных очагов на неэндемичных территориях.

Пятая категория — «новые» и малоизученные ООВИ. Этой группе инфекций в последние годы посвящено очень много работ в рамках проблемы «новых и вновь возникающих инфекций» (emerging-reemerging diseases). Например, в 1998—1999 гг. среди работников свиноферм в Малайзии отмечена вспышка энцефалита, в ходе которой заболели 229 человек со 111 (48 %) летальными исходами. Возбудителем оказался неизвестный науке вирус Нипа (семейство Paramyxoviridae), передававшийся от свиней Механизм передачи инфекции контактный [Outbreak of Hendra-like virus-Malaysia and Singapore, 1998-1999] Все известные ранее парамиксовирусы включены в IV группу патогенности и не являются ООВИ Даже имеющиеся ограниченные сведения позволят полагать, что заболевание, вызываемое вирусом Нипа, относится к ООВИ. Информация по ООВИ этой категории должна постоянно отслеживаться и быть основой для оперативного принятия решений по СОТ. Прекрасной иллюстрацией успешных действий мирового сообщества в этом направлении являются успехи по ликвидации эпидемии ТОРС [SARS Reference - 07/2003].

Шестая категория — ООВИ, эндемичные для ограниченных территорий РФ. Их контроль осуществляется в рамках эпиднадзора, который необходимо совершенствовать К этой категории относятся ООВИ, для которых целесообразно вводить ограничительные мероприятия, препятствующие заносу на эндемичные территории новых (измененных) вариантов возбудителей. Из ООВИ заслуживает внимания, прежде всего, Крымская геморрагическая лихорадка, бешенство, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, лихорадка Западного Нила.

Как отмечено выше, не всегда имеются достаточные основания для включения возбудителя той или иной конкретной ООВИ в соответствующую группу патогенности и, соответственно, заболевание в ту или другую категорию значимости ООВИ для СОТ. Такое заключение может быть дано только после рассмотрения каждой ООВИ в рамках предложенных признаков и критериев. Предлагаемые категории значимости ООВИ для СОТ позволят объединить различные болезни в группы соответственно их особенностям. Выделение таких групп дает возможность для каждой из категорий ООВИ определить однотипный объем мероприятий, проводимых в рамках КП. Результаты рассмотрения отдельных ООВИ с применением предложенных критериев, признаков и категорий приведены в главе 4.

В Руководстве по противоэпидемическому обеспечению населения в чрезвычайных ситуациях (1995) ЧС определяется как «нарушение нормальных условий жизни и деятельности людей на объекте или определенной территории (акватории), вызванное аварией, катастрофой, стихийным или экологическим бедствием, эпидемией, эпизоотией, эпифитотией, а также применением возможным противником современных средств поражения и приведшее или могущее привести к людским и материальным потерям».

Очевидно, что анализ ООВИ, с точки зрения их значения в плане возникновения ЧС, должен проводиться комплексно, с учетом их особенностей. Предложенные нами признаки, критерии для анализа ООВИ и категории ООВИ позволяют их сгруппировать с точки зрения значимости для СОТ. Аналогичный подход можно реализовать при рассмотрении роли ООВИ в возникновении ЧС. Такой подход позволит, с одной стороны, наиболее полно

определить круг вирусных инфекций, которые представляют опасность с точки зрения возникновения ЧС на территории Российской Федерации, с другой — даст возможность в каждом случае конкретизировать необходимый и достаточный комплекс профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Предлагаем выделить также шесть категорий ООВИ по их значимости с точки зрения индукции ЧС как указано выше. Однако перечень инфекций будет шире. В случае заноса неэндемичных для территории ООВИ могут возникнуть эпидосложнения, которые по определению относятся к ЧС. При рассмотрении возможной роли ООВИ как причины возникновения ЧС важны еще два аспекта. Во-первых, ЧС могут возникнуть при заносе на эвдемичную по некоторым ООВИ территорию новых или измененных вариантов возбудителя. Во-вторых, ООВИ этой категории могут существенно усугублять не связанные с вирусными инфекциями ЧС любого характера, что необходимо учитывать при планировании профилактических и противоэпидемических мероприятий. Примером могут служить эпидемические осложнения последних лет, вызываемые вирусами ККГЛ, Западного Нила, геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Для ООВИ шестой категории целесообразно в рамках эпиднадзора вводить ограничительные мероприятия, препятствующие расширению природных очагов.

Предлагаемые категории значимости ООВИ для ЧС позволят объединить различные болезни в группы соответственно их особенностям. Выделение таких групп дает возможность для каждой из категорий ООВИ определить однотипный объем профилактических и противоэпидемических мероприятий и соотнести его с хорошо отработанными подходами по борьбе с такими инфекциями как чума, холера, сибирская язва, бешенство, ящур. Все сказанное выше в полной мере относится также к «новым» и малоизученным ООВИ. Таким образом, круг инфекций, которые следует рассматривать с точки зрения ЧС, необходимо расширить и пополнять по мере появления новых научных и оперативных данных.

Глава 4. Сравнительный анализ особо опасных вирусных инфекций с учетом общих принципов эпидемиологической оценки их актуальности для санитарной охраны территории

Для рассмотрения сведений по этому разделу работы составлены аналитические обзоры по общему плану с учетом разработанных нами критериев и признаков, позволявших оценить важность той или иной вирусной инфекции с точки зрения СОТ. Основные сведения из этих обзоров суммированы в виде таблиц. Для всех рассмотренных ООВИ подготовлены также карты ареалов. В анализ взято 34 ООВИ. Контагиозные ООВИ: геморрагические лихорадки Эбола (ГЛЭ), Марбург (ГЛМ), Ласса (ГЛЛ), Хунин (АГЛ), Мачупо (БоГЛ), Венесуэльская (ВГЛ), Бразильская (БрГЛ), Калифорнийская (КаГЛ), Крымская (КГЛ), с легочным синдромом (ГЛЛС), оспа обезьян (ОсО), а также энцефалит, вызываемый вирусом В обезьян. Неконтагиозные ООВИ- бешенство, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС), желтая лихорадка (ЖЛ), лихорадка Денге / геморрагическая лихорадка Денге (ЛД), лихорадка Западного Нила (ЛЗН), японский энцефалит (ЯЭ), энцефалит Сент-Луис (ЭСЛ), энцефалит Долины Муррея (ЭДМ), лихорадка долины Рифт (ЛДР), заболевания, вызываемые вирусами комплекса Калифорнийского энцефалита, восточный, западный, венесуэльский энцефаломиелита лошадей

(АЭ), лихорадка Чикунгунья (ЧИК), лихорадка О ньонг-ньонг (ОНН), Кьяса-нурской лесной болезни (КЛБ), клещевой энцефалит, Омская геморрагическая лихорадка (ОГЛ). Новые и малоизученные ООВИ: заболевания, вызываемые вирусами Нипа, Хендра, Менангле, Тогото, коронавирусом ТОРС

По опубликованным материалам проведен ретроспективный анализ заболеваемости ООВИ (вспышечной и спорадической) в эндемичных странах и регионах за последние 30 лет. Проанализированы материалы официальной статистики по заболеваемости особо опасными вирусными инфекциями в Российской Федерации Одновременно анализировались условия, способствующие возникновению вторичных очагов ООВИ и распространению ООВИ на территории Сибири и Дальнего Востока. Проведено также эпизоотолого-эпидемиологическое районирование (картирование) природных очагов ООВИ.

4.1. Оценка вероятности заноса особо опасных вирусных инфекций с эндемичных территорий. Для дальнейшего рассмотрения нами выделены три группы контагиозных ООВИ, отличающиеся по уровню заболеваемости на 100 тыс. населения. Первая группа — с показателем заболеваемости более 1,0; вторая — с показателем от ОД до 1,0 и третья — с показателем менее 0,1.

К первой группе относятся геморрагические лихорадки Ласса, Аргентинская, Эбола, заболевание ТОРС и лихорадка Нипа Вместе с тем вероятность заболевания одного человека существенно отличается в зависимости от страны и ООВИ Так, для геморрагической лихорадки Ласса она находится в пределах от 1/519 до 1/4 494; для геморрагической лихорадки Эбола от 1/19 238 до 1/133 647, для ТОРС от 1/12 075 до 1/1 125 428. В отношении этих инфекций следует отметить, что рост туризма и активизация экономических связей могут способствовать их завозу на неэндемичные территории.

Во вторую группу входят геморрагические лихорадки Марбург, Боливийская, Венесуэльская и оспа обезьян При этом частоты данных заболеваний для одного человека варьируют от 1/125 527 до 1/1 009 285.

К третьей группе относятся геморрагические лихорадки Бразильская, Калифорнийская, Крымская геморрагическая лихорадка и геморрагическая лихорадка с легочным синдромом В отношении первых двух отмечены только спорадические случаи заболеваний. Для геморрагических лихорадок с легочным синдромом и Крымской частоты заболевания одного человека составляют соответственно 1/5 193 075 и 1/2 995 170. Вирус В обезьян не рассматриваем, т к в мире описано всего около 40 случаев заболеваний [Prevention of D-virus infection- a safety program for macaque monkey handlers, 1999, http / /www haz-map com/Prevent.html], один случай передачи инфекции от человека к человеку контактным путем и предположительно два случая аспира-ционного заражения [Jainkittivong, Langlais, 1998].

В реальной ситуации вероятность завоза ООВИ больными людьми, ре-конвалесцентами или лицами, находящимися в инкубационном периоде заболевания могут быть как значительно выше, так и существенно ниже Тем не менее, при рассмотрении возможности завоза ООВИ на неэндемичные территории, помимо общепринятого показателя заболеваемости на 100 тыс населения полезно также использовать показатель частоты заболевания одного человека. Этот показатель позволяет оценить не только опасность выноса инфекции аборигенным населением, но и возможность заболевания

туристов, приезжающих из неэндемичных стран, в том числе и при краткосрочных турах.

4.2. Контагиозные инфекции. Рассмотренные контагиозные ООВИ (за исключением энцефалита В обезьян, Бразильской и Калифорнийской геморрагических лихорадок) соответствуют всем критериям значимости и актуальны для СОТ. Завоз даже одного больного на территорию может привести к эпидемическим осложнениям. Контагиозные ООВИ, в зависимости от группы патогенно-сги, отнесены нами к первой и второй категориям значимости ООВИ для СОТ. На территории Сибири и Дальнего Востока отмечено обитание видов позвоночных животных и/или членистоногих переносчиков, теоретически способных участвовать в циркуляции возбудителей геморрагических лихорадок Ласса, Хунин, Мачупо, ГЛЛС и КГЛ в пределах эндемичных территорий, что создает предпосылки формирования вторичных очагов в случае заноса этих вирусов (больными людьми, теплокровными животными или членистоногими). При завозе вируса В больными людьми или животными формирование вторичных очагов невозможно. В случае завоза оспы обезьян больными людьми или животными (обезьяны, белки) формирование вторичных очагов маловероятно. В отношении геморрагических лихорадок Эбола, Марбург, Калифорнийской, Бразильской, Венесуэльской достаточные для проведения анализа данные отсутствуют. В целом вероятность укоренения возбудителей инфекций этой группы, приуроченных преимущественно к тропикам, субтропикам, иногда к районам умеренной зоны с мягким климатом, крайне мала в климатических условиях Сибири и Дальнего Востока. Естественные нозоарелы всех этих инфекций не выходят за пределы 43° с.ш. (за исключением КГЛ).

В настоящее время из группы контагиозных инфекций для включения в перечень по СОТ можно рекомендовать ГЛЭ, ГЛМ, ГЛЛ, АГЛ, БоГЛ, ВГЛ, ГЛЛС, ОсО (табл. 2). На первые пять ООВИ распространяются действующие в настоящее время Правила по СОТ. В рамках СНГ в такой перечень включена также ОсО. В отношении КГЛ, как эндемичной для некоторых территорий России, мероприятия по контролю осуществляются в рамках эпиднадзора.

4.3. Некоитагиозные инфекции. Рассмотрение неконташозных ООВИ на соответствие критериям их актуальности для СОТ выявило существенные отличия между ними. Это природаоочаговые инфекции с преимущественно трансмиссивным механизмом передачи. Большинство из них имеет ограниченные ареалы в пределах одного континента. Для вирусов с более обширными ареалами (ГЛПС, бешенство и др ) имеется возможность дифференцировать географические варианты, что чрезвычайно важно для СОТ. Завоз инфекций этой группы (категории 3 и 4; глава 3) может быть реализован больными людьми, хозяевами вируса и переносчиками. Больной человек опасности для окружающих не представляет, хотя возможно лабораторное заражение персонала при работе с материалом. Заболевший должен бьггь изолирован от кровососущих членистоногих и возможных хозяев вируса на неэндемичной территории. Ограничения должны быть направлены на ввоз хозяев вируса и переносчиков. Завоз на неэндемичные территории инфицированных хозяев вируса и переносчиков может привести к возникновению локальных вспышек ООВИ, трудных для расшифровки Такие вспышки, не дадут дальнейшего эпидемического распространения инфекции, если на неэндемичной территории отсутствуют условия для формирования вторичных очагов и укоренения инфекции

В случае лихорадок желтой, Денге, Чикунгунья, Оньонг-ньонг, долины Рифт, энцефалита долины Муррея предпосылки для образования вторичных очагов отсутствуют. Для энцефалита Сент-Луис образование вторичных очагов маловероятно, так как предпосылки имеются только в подвальных помещениях, заселенных комарами Culex pipiens. При заносе возбудителей АЭ и КЛБ имеются предпосылки формирования вторичных очагов В случае эндемичных, по крайней мере, для некоторых территорий Сибири и Дальнего Востока ГЛПС, ЯЭ, ООВИ комплекса калифорнийского энцефалита, бешенства, ЛЗН имеются предпосылки как для заноса в природные очаги новых (измененных) вариантов возбудителя, что может способствовать как активизации очагов, так и образованию вторичных очагов на неэндемичных территориях.

Для включения в перечень по СОТ можно рекомендовать АЭ, КЛБ. Как конвенционная инфекция в перечень должны быть включена ЖЛ В перечень СНГ по СОТ включена также ДДР. Комплекс мероприятий по СОТ в отношении ЖЛ позволяет защитить территорию от завоза ЛД, ЧИК, ОНН, ЛДР, ЭДМ, ЭСЛ, если мероприятия будут распространяться на все виды транспорта из зарубежных стран, с которыми возможен завоз хозяев и переносчиков возбудителей ООВИ (табл 2) В отношении эндемичных для некоторых территорий России ГЛПС, ЯЭ, ООВИ комплекса калифорнийского энцефалита, бешенства, ЛЗН ограничительные мероприятия проводятся в рамках эпиднадзора.

4.4. Новые и малоизученные инфекции. Из группы рассмотренных новых или малоизученных ООВИ наибольшую эпидемиологическую опасность представляют заболевания, вызываемые вирусами ТОРС, Нипа и Тогото. Причем, энцефалит Нипа и заболевание ТОРС являются контагиозными инфекциями. Так как природные очаги лихорадки Тогото во многом совпадают с таковыми Крымской геморрагической лихорадки, имеются общие хозяева и переносчики инфекции, можно полагать, что есть предпосылки образования вторичных очагов в случае заноса возбудителя на неэндемичные территории. Следует также учитывать, что в России имеются природные очаги близкой к Тогото лихорадки Дхори. Недавно появилось сообщение о двух вспышках энцефалита Нипа в Бангладеш. На 17.01.04 сообщалось о 23 больных с 17 (74 %) летальными исходами и с 13.03.04 по 14.04.04 зарегистрировано 30 больных с 18 (60 %) летальными исходами. Больные млекопитающие в районе вспышек не обнаружены. Все заболевшие ели фрукты. Группа международных экспертов пришла к выводу, что фрукты могли быть заражены летучими мышами (Pteropodidae). Предполагаются контактный и фекально-оральный механизмы передачи инфекции, но не исключается и аспирационный [Nipah virus outbreak(s) in Bangladesh, January-April 2004//Weekly Epidemiological Record. - 2004. - № 17. - P. 161-172]. В связи с этими данными энцефалит Нипа может иметь значение для СОТ.

При сегодняшнем уровне знаний заболевания, вызываемое вирусами Хен-дра и Менангле не представляют эпидемиологической опасности, но могут иметь значение для организации ветеринарного контроля. Кроме того, имеющиеся в настоящее время ограниченные данные указывают на то, что вирусы Нипа, Хендра и Тогото следует отнести ко II группе патогенности.

4.5. Особо опасные вирусные инфекции, эндемичные дня отдельных территорий России. Эти инфекции следует рассматривать двояко: собственно как эндемичные (категория 6 ООВИ), а также в плане завоза и укоренения неэнде-

мичных для данной территории новых (измененных) вариантов их возбудителей (категории вторая-четвертая ООВИ). В отношении эндемичных для России ООВИ целесообразно совершенствовать систему эпиднадзора, которая, в том числе, будет препятствовать заносу новых (измененных) вариантов возбудителей, расширению площадей природных очагов и формированию новых природных очагов на неэндемичных территориях. Из карантинных инфекций данный вопрос успешно решается в Российской Федерации при чуме. Из ООВИ, в первую очередь, заслуживают внимания Крымская геморрагическая лихорадка, бешенство, геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, лихорадка Западного Нила, Омская геморрагическая лихорадка, японский и клещевой энцефалиты. Из них только ОГЛ не известна для других стран. Из группы ООВИ, эндемичных для территории России, к контагиозным инфекциям относится только КГЛ. Геморрагический синдром у больных отмечен в случае КГЛ, ГЛПС, ОГЛ и КЭ. С точки зрения СОТ имеет значение проведение тщательной дифференциальной диагностики этих инфекций с экзотическими КВГЛ.

Таким образом, рассмотренные выше группы ООВИ мы относим к первой-шестой категориям значимости ООВИ для СОТ (глава 3.2). Распределение ООВИ по категориям объединяет инфекции в группы, соответствующие их эпидемиологической значимости, и позволяет разработать для них однотипный комплекс профилактических и противоэпидемических мероприятий. Существенно, чтобы проводимые мероприятия были достаточны, но не чрезмерны. В последнем случае возможен неоправданный экономический ущерб. Если основываться как на ранее действовавших в России нормативных документах, так и на недавно утвержденных [СП 1.2.011-94, СП 1.3.1285—03], то предложенный нами подход указывает на необходимость трех вариантов однотипных профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Первый вариант — самый жесткий — реализуется при заносе ООВИ первой категории (контагиозные ООВИ I группы патогенности), а также в случае появления «новых» контагиозных ООВИ I группы патогенности. В этом случае в «Комплексных планах по санитарной охране территории от завоза и распространения карантинных и других особо опасных инфекций» (КП) на всех этапах должен быть предусмотрен уровень мероприятий, требуемый для ООВИ I группы патогенности (максимальная биологическая зашита и т.д). Особо сложные вопросы связаны с содержанием больных, проведением лечебно-профилактических мероприятий и лабораторно-диагностических исследований. Совместным Приказом Минздрава и Минобороны России № 558/416 от 20.11.99 организован «Центр специальной лабораторной диагностики и лечения особо опасных и экзотических инфекционных заболеваний» Основными задачами Центра является проведение диагностики особо опасных и экзотических инфекций вирусной, риккетсиозной и бактериальной этиологии, госпитализация и лечение больных с соответствующими заболеваниями Отмечено, что Центр удален от крупных населенных пунктов, имеются возможности использования для экстренной доставки больных военных вертолетов, что позволит эффективно решать проблему локализации особо опасных и экзотических инфекций и предупреждать любую возможность их распространения.

Второй вариант реализуется при заносе ООВИ второй категории и, по показаниям, для пятой категории ООВИ В КП на всех этапах должен быть

предусмотрен уровень мероприятий, требуемый для ООВИ II группы пато-генности. В этом случае обеспечить весь комплекс профилактических и противоэпидемических мероприятий, включая госпитализацию больных и лабора-торно-диагностические исследования, значительно проще и менее затратно

Наконец, третий вариант реализуется при заносе ООВИ третьей (неконтагиозные ООВИ II группы патогенности) и, по показаниям, пятой категорий. В случае этих инфекций больной неопасен для окружающих. Опасность представляет завоз хозяев и переносчиков вируса, а также контакт больного с местными кровососущими членистоногими. Необходимость проведения мероприятий по СОТ по третьему варианту наглядно демонстрируется на приведенном выше примере с заносом и укоренением лихорадки Западного Нила в Северную Америку. Все мероприятия в рамках КП должны проводиться с учетом того, что возбудитель относится к вирусам II группы патогенности.

Если в КП предусмотрены и отработаны три варианта однотипных профилактических и противоэпидемических мероприятий, то в случае опасности завоза и распространения как известных, так и «новых» ООВИ требуется только определить по какому из вариантов действовать в конкретной ситуации

Уровень проведения мероприятий по СОТ до 2003 г. основывался на Перечне возбудителей ООВИ I—IV групп патогенности [СП 1.2.0И—94]. Вместе с тем, имелись основания для пересмотра Перечня. По всем признакам возбудители Крымской, Калифорнийской, Бразильской и Венесуэльской геморрагических лихорадок, а также хантавирусного легочного синдрома следует отнести к I группе патогенности. Во II группу патогенности целесообразно включить вирусы Нипа, Хендра, Тогото В Перечне отсутствовали возбудители лихорадки Денге. Не учтены такие важные для лабо-раторно-диагностических исследований моменты как повышение уровня биологической защиты (с РЗ на Р4) при проведении работ с большими объемами или концентрациями вирусов II группы патогенности или с грызунами, инфицированными возбудителями геморрагической лихорадки с почечным синдромом.

Большая часть наших предложений включена в утвержденные в 2003 г. Санитарно-эпидемиологические правила «Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности)» СП 1.3.1285—03. После проведенного анализа и с учетом СП 1.3.1285-03 распределение ООВИ по категориям значимости для СОТ выглядит следующим образом (табл 2) Из контагиозных ООВИ в перечень по СОТ целесообразно включить ГЛЭ, ГЛМ, ГЛЛ, АГЛ, БоГЛ, ВГЛ, ГЛЛС, ОсО. На первые пять ООВИ распространяются действующие в настоящее время Правила по СОТ В рамках СНГ в такой перечень включена также ОсО. Из неконтагиозных ООВИ для включения в перечень по СОТ можно рекомендовать АЭ, КЛБ. Как конвенционная инфекция в перечень должна быть введена ЖЛ. В перечень СНГ по СОТ входит также ЛДР. Из «новых» и малоизученных ООВИ целесообразно введение в перечень по СОТ заболеваний, вызываемые вирусами ТОРС, Тогото и Нипа. Причем, ТОРС уже включен в этот перечень В отношении эндемичных для некоторых территорий России ООВИ мероприятия по их контролю осуществляются в рамках эпиднадзора

Таблица 2

Результаты анализа ООВИ на соответствие

их категориям значимости для СОТ_

№ п/п Категория ООВИ Возбудители ООВИ (перечень вирусов) Необходимый уровень биологической защиты<>|

1 Контагиозные ООВИ I группы патогенности, неэндемичные для территории РФ Эбола, Марбург, Ласса, Хунин, Мачупо, Гуанарито, оспы обезьян Максимальная биологическа< защита, I группа патогенности (Р4)

2 Контагиозные ООВИ II группы патогенности, неэндемичные для территории РФ Геморрагической лихорадки с легочным синдромом Защита, требуемая для возбудителей II группы патогенности (РЗ)

3 Неконтагиозные ООВИ II группы патогенности, имеющие высокую эпидемиологическую значимость в мире, но ограниченную способность к эпидемическому распространению на неэндемичных территориях Желтой лихорадки, лихорадки долины Рифт, американских энцефаломиелитов лошадей (венесуэльского, западного, восточного), Кьясанурской лесной болезни Защита, требуемая для возбудителей II группы патогенности (РЗ)

4 Неконтагиозные ООВИ II группы патогенности, имеющие ограниченную эпидемиологическую значимость в мире и ограниченную способность к эпидемическому распространению на неэндемичных территориях ООВИ, не вошедшие в категории 1, 2 и 3 В настоящее время не актуальны для СОТ Защита, требуемая для возбудителей II группы патогенности (РЗ)

5 «Новые» и малоизученные ООВИ ТОРС, Тогото, Нила Определяется по оперативным данным

6 ООВИ, эндемичные для территорий РФ Контроль этих ООВИ осуществляется в рамках эпиднадзора Защита, требуемая для возбудителей II группы патогенности (РЗ)

Глава 5. Изучение биологических и молекулярно-биологических свойств вирусов, разработка методов лабораторной диагностики особо опасных вирусных инфекций (на моделях филовирусов и альфавирусов).

5.1. Вирус Марбург

5.1.1. Репродукция в клеточных культурах. Для адаптации вируса Марбург к культуре клеток Vero первоначально провели три серийных пассажа. Проявление цитопатического эффекта наблюдали уже на первом пассаже. В зависимости от инфицирующей дозы, через 5—7 суток после инокуляции вируса погибает до 80 % клеток. В последующие сутки инкубации инфицированных культур отмечается полный лизис монослоя

Подобраны оптимальные условия, позволяющие с хорошей воспроизводимостью получать бляшки вируса Марбург и использовать этот метод для титрования инфекционной активности вируса. Показано, что вирус Мар-

бург формирует отчетливые бляшки в клеточных линиях Vero и BGM. Точечные бляшки появляются на 5—6 сутки после инокуляции вируса На 7— 8 сутки размеры бляшек увеличиваются и составляют от \ до 3 мм в диаметре в зависимости от состава и плотности агарового покрытия. При определении стандартности метода показано, что количество бляшек находится в линейной зависимости от концентрации вируса.

Высокая воспроизводимость предложенного метода бляшкообразова-ния позволяет использовать его как для титрования инфекционности вируса, так и для клонирования вируса Марбург. После окрашивания монослоя клеток нейтральным красным, наряду с негативно окрашенными бляшками формировались так называемые «красные» бляшки — участки клеточного монослоя, более интенсивно поглощающие краситель, причем, чаще всего наблюдали соотношение количества негативно окрашенных и «красных» бляшек как 1:10. При последующем клонировании и изоляции вируса из тех и других бляшек типичная морфология последних сохранялась на протяжении 4—5 пассажей (срок наблюдения). Слайд-антигены, приготовленные из клеток, инфицированных клонами вируса Марбург из морфологически отличающихся бляшек, специфически взаимодействовали с референс-сывороткой к вирусу Марбург. В последующих экспериментах мы изучали характер цитопатогенного действия (ЦПД) и уровни репродукции клонов из негативно окрашенных и «красных» бляшек в культуре клеток BGM При заражении культуры клеток вирусом, клонированным из «красной» бляшки, ЦПД развивалось на 7-8 сутки, а полный лизис монослоя наступал на 11 — 12 сутки после заражения. Титр вируса составил 6,00 ± 0,21 lg БОЕ/мл. Титр вируса, клонированного из негативной бляшки, составил 7,43 ± 0,14 lg БОЕ/мл на 7 сутки после заражения при более раннем развитии цитодеструкции клеточного монослоя.

Одноцикловая репродукция Заражение клеток проводили с множественностью 10 БОЕ/кл. Определена кривая накопления вируса в культуральной жидкости. Максимальное размножение вируса отмечено через 6—48 часов, при этом титр вируса в культуральной жидкости через 72 часа составил 7,54 ±0,11 lg БОЕ/ мл. Выход вируса в расчете на клетку составил 100—150 БОЕ.

Многоцикловая репродукция вируса. Заражение клеток проводили с множественностью 0,01 БОЕ/кл. Получены данные по динамике накопления вируса. Максимум продукции вируса отмечали на 6—7 сутки, титр инфекционности составил 7,13 ± 0,13 lg БОЕ/мл. Максимальное накопление вируса совпадало с началом цитодеструкции клеточного монослоя. Полученные данные по циклам репродукции вируса Марбург позволяют целенаправленно планировать эксперименты, как для получения инфекционных пулов вируса, так и для наработки биомассы вируса.

5.1.2. Экспериментальные модели инфекции. Нами изучена восприимчивость морских свинок массой 200—250 и 350—400 г к штамму Voege вируса Марбург, адаптированному к культуре клеток Vero. Животных заражали ви-руссодержащей культуральной жидкостью в дозе 2,5 х 102 БОЕ. Заражение проводили двумя способами — подкожно и внутрибрюшинно.

Три серийных пассажа вируса Марбург показали, что морские свинки массой 350—400 г не чувствительны к вирусу, адаптированному к культуре

клеток. В последующем животных массой 350-400 г использовали для получения иммунных сывороток.

На морских свинках массой 200-250 г проведено 7 серийных пассажей вируссодержащей культуральной жидкости при подкожном и внутрибрю-шинном способе заражения Начиная со второго пассажа, более выраженный лихорадочный период наблюдали у животных при внутрибрюшинном заражении. На 3 пассаже к 6—7 суткам со дня заражения отмечали подъем температуры тела до 40,2 "С. На уровне 5—7 пассажей инкубационный период инфекции сокращался до 3-5 дней.

Изучена также чувствительность морских свинок массой 200 г к заражению гепаринизированной кровью от животных, больных лихорадкой Марбург. Проведено 6 серийных пассажей. Уже на 1 —2 пассажах у животных развивалось лихорадочное состояние с подъемом температуры тела на 5—7 сутки до 39,6—40,6 °С. С увеличением числа пассажей инкубационный период сократился до 3-4 суток.

Так как в работе мы использовали штамм вируса, адаптированный к культуре клеток, представляло интерес изучить изменения чувствительности морских свинок к заражению на протяжении семи серийных пассажей. С увеличением числа пассажей наблюдается сокращение инкубационного периода с 7 суток на 2—3 пассажах до 3 суток на 5—7 пассажах. Такая же тенденция отмечается при использовании для серийных пассажей гепаринизированной крови. Полученные данные совпадают с опубликованными сообщениями по изучению не адаптированного к клеткам варианта вируса Марбург.

5.1.3. Применение иммуно-серологических методов для лабораторной диагностики. Для получения специфических сывороток нами изучена динамика индукции антител и испытано 8 схем иммунизации морских свинок, отличающихся по срокам, способам и дозе введения материала, а также использованием адъювантов (табл. 3).

Таблица 3

Активность антисывороток морских свинок к вирусу Марбург

Количество серий антисывороток

с титрами антител в НМФА Всего сывороток (п)

Номер схемы иммунизации сч е> ч- V 00 .— со ю С4 гч и> 1024 сгт

т-

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 3 5 4 2 0 0 14 6 36 ± 0.27

2 0 2 5 0 1 2 10 7 60 ± 0 48

3 0 2 4 4 5 0 15 7 80 ± 0 28

4 0 1 4 4 6 0 15 8 02 ± 0 26

5 0 1 1 8 3 2 15 8 27 ± 0 27

6 0 7 2 1 0 0 10 6 40 ± 0 22

7 0 1 2 6 2 2 13 8 15 ±0 32

8 0 0 4 8 0 0 12 7 67 ±0 14

Антисыворотки, полученные при схемах иммунизации 4, 5 и 7, имеют СГТ 8.02 ± 0.26; 8.27 ± 0 27 и 8.15 ± 0.32 соответственно. Эти показатели достоверно превышают (р < 0,05) показатели других схем. Применение данных схем иммунизации позволяет получить высокоактивные специфические иммунные сыворотки к вирусу Марбург с титром при использовании непрямого метода флюоресцирующих антител (НМФА) 1 : 1024 На референс слайд-антигенах, приготовленных из клеток Vero, инфицированных вирусом Марбург (СДС № 805600) они вызывали характерное яркое цитоплазматическое свечение. Антисыворотки не взаимодействовали с антигеном гетерологич-ного вируса Эбола.

Метол флюоресцирующих антител традиционно используется как основной при лабораторной диагностике геморрагической лихорадки Марбург Перед нами стояла задача отработки и оптимизации МФА для выявления специфических антител и антигенов вируса Марбург Первоначально за основу был взят опубликованный ранее метод [WulfTT.Y , Lange J.V. 1975.]. В качестве иммунных сывороток использовали сыворотку реконвалесцента СДС № 700808 и экспериментальную антисыворотку морской свинки. Оптимизированный и модифицированный метод применялся в лаборатории для тестирования специфических антител в сыворотках крови, при постановке контролей инактивированного материала на специфическую безопасность, а также для выявления антигенов вируса Марбург в клеточных культурах, зараженных различным вируссодержащим материалом.

Изучена динамика экспрессии антигенов вируса Марбург при заражении клеток Vero с множественностью 10 БОЕ/кл. Для этого была подработана методика выращивания клеток на покровных стеклах и их заражения в 24-луноч-ных планшетах Проведено сопоставление уровня экспрессии вирусных антигенов в клетках и продукции инфекционного вируса в культуральную жидкость Установлено, что при заражении клеток в дозе 10 БОЕ/мл, вирус в культураль-ной жидкости выявляется через 6 часов при мелкоточечном свечении антигена, а вирус с максимальным титром обнаруживается через 48 часов, когда отмечены крупные светящиеся гранулы антигена и цитодеструкция клеток. Приведенные данные являются своеобразным атласом, который показывает различные варианты свечения антигена вируса Марбург в инфицированных клетках, что существенно при проведении научно-исследовательских работ с применением МФА, а также при лабораторно-диагностических анализах

Существенный недостаток традиционного метода твердофазного ИФА связан с необходимостью получения очищенных антигенов вируса Марбург. Для наработки, концентрирования и очистки вирусных антигенов требуется дорогостоящее оборудование и оснащение, обеспечивающее режим работы на уровне максимальной биологической защиты, а также применение объемных и трудоемких методик. Для решения этих вопросов нами разработан метод клеточного иммуноферментного анализа. В этом случае значительно упрощается, ускоряется и удешевляется приготовление планшетов с сорбированным антигеном. Учет результатов возможен как визуально, так и инструментально Мы применили клеточный ИФА для выявления антител к вирусу Марбург в сыворотках крови морских свинок (п = 48). Эти же сыворотки параллельно исследовали в НМФА При анализе результатов, полученных

этими методами, наблюдалась корреляция (г = О 48) Положительным контролем служила сыворотка реконвалесцента. Метод прост в подготовке, не требует очищенного вирусного антигена, не дает неспецифических реакций с нормальной человеческой сывороткой и в 50—100 раз чувствительнее НМФА. Таким образом, клеточный ИФА может быть рекомендован для выявления специфических антител к вирусу Марбург.

5.2. Вирус Эбола

5.2.1. Репродукция в клеточных культурах. По результатам наших исследований к вирусу Эбола (шт. Заир) чувствительны клетки линий Vero и BGM. В обеих линиях клеток вирус Эбола вызывает цитопатические изменения, хорошо различимые при обычной световой микроскопии

На основании способности вируса Эбола вызывать цитопатические изменения в клеточных культурах мы разработали методы количественной оценки инфекционное™ по ЦПД и бляшкообразованию Мы использовали две линии клеток — Vero и BGM; первую — как наиболее чувствительную к вирусу Эбола, и BGM — как высокочувствительную к широкому спектру вирусов и рекомендуемую для оптимизации методов мониторинга вирусов в окружающей среде [Dahling D.R., Wright В.А., 1986] В линии клеток Vero мы, как и другие авторы, наблюдали ЦПД, которое в дополнение к известному подробно описали. Сообщения о ЦПД, индуцируемом вирусом Эбола в культуре клеток BGM, отсутствуют.

Динамику накопления вируса Эбола в культуральной жидкости клеток Vero при многоцикловой репродукции изучали с использованием неклони-рованных пулов вируса и множественности заражения 0,01 БОЕ/ кл.

Динамику накопления вируса Эбола при одноцикловой репродукции изучали в культурах клеток Vero и BGM Для заражения клеток использовали клонированные — «светлобляшечные» — варианты вируса при множественности заражения 10-20 БОЕ/кл. При определении методом подсчета «инфекционных центров» уровень зараженности клеток составил 100 %. Следовательно, данные, получаемые при одноцикловой репродукции, соответствуют уровню накопления вируса при одиночном цикле и позволяют определить выход вируса в расчете на одну клетку. Прирост инфекционных частиц вируса Эбола в культуре клеток Vero и BGM начинает регистрироваться через 6—7 ч после инокуляции вируса. В культуре клеток BGM выход вируса нарастает логарифмически в течение 30—36 часов инкубации. Максимальная продукция вируса, достигающая 100 БОЕ/кл., наблюдается через 42—48 ч после заражения. В культуре клеток Vero логарифмическая фаза выхода вируса продолжается до 48 ч инкубации. Максимальный выход, достигающий 50—60 БОЕ/кл , наблюдается через 60—66 ч после заражения. Следует отметить, что максимальный выход вируса в той и другой культуре совпадал по времени с началом цитодеструк-ции. Однако абсолютного лизиса клеток не наблюдали и в более отдаленные сроки. Возможно, это связано с выбором высоких инфицирующих доз, что в свою очередь могло привести к высокому уровню репродукции в клетках дефектных интерферирующих частиц. Этим же феноменом, а также большими размерами вирионов, можно объяснить и относительно невысокие уровни продукции инфекционных частиц вируса в расчете на клетку.

В результате инокуляции вируса Эбола в культуре клеток ВСМ формировались бляшки, различающиеся не только по размерам, но и по морфологии. После окрашивания монослоя клеток нейтральным красным, наряду со «светлыми» — неокрашенными бляшками (негативными колониями), формировались так называемые «красные» бляшки — участки клеточного монослоя, более интенсивно поглощающие краситель Причем, чаще всего наблюдалось соотношение числа «светлых» и «красных» бляшек как 110. При последующем клонировании и изоляции вируса из тех и других бляшек их типичная морфология сохранялась на протяжении 4—5 пассажей (срок наблюдения). Вирус Эбола, клонированный из «светлых» бляшек, вызывал характерное ЦПД через 2—3 суток после инокуляции. На 5 сутки инкубации наступала полная цитодеструкция. Напротив, вирус, клонированный из «красных» бляшек, практически не вызывал ЦПД в течение первых 3—5 суток. Затем характерная картина ЦПД развивалась медленно и степень деструкции монослоя к 15 суткам инкубации составляла около 50 % (в контрольных клетках монослой сохранялся полностью). По уровню репродукции клонированных вариантов вируса также были отмечены существенные различия. Титр вируса, клонированного из «светлой» бляшки на 5 сутки инкубации составил 4 х 107 БОЕ/мл, а вируса из «красной» бляшки — 5 х 105 БОЕ/мл.

Таким образом, есть основания полагать, что использованные в нашей работе популяции вируса неоднородны Выделенные клоны имеют явные фенотипические различия по типу бляшек, степени цитопатического действия на клетки и уровню репродукции в культуре клеток Можно предполагать наличие как минимум двух фенотипически отличающихся вариантов Полученные данные следует учитывать как при изучении биологических особенностей различных вариантов вируса Эбола, так и при проведении молекулярного клонирования генома.

5.2.2. Экспериментальные модели инфекции. Вируснейтрализующие антитела. Отработку лабораторной модели инфекции, вызываемой вирусом Эбола, проводили на морских свинках массой 200—250 г и 350—400 г Так как нами был получен лабораторный штамм вируса Эбола, выделенный в культуре клеток, то на первом этапе необходимо было провести его адаптацию к экспериментальным животным Заражение животных проводили вируссодержа-щей культуральной жидкостью в дозе от 50 до 5000 БОЕ на животное

На морских свинках массой 400 г проведены 3 серийных пассажа куль-турального вируса Независимо от метода заражения (подкожно или внутри-брюшинно) при всех трех пассажах лихорадочного состояния у животных не наблюдали, павших животных не было

На морских свинках массой 200 г провели 7 серийных пассажей Животных заражали культуральным вирусом в дозе 500 БОЕ на животное в объеме 0,5 мл подкожно и внутрибрюшинно. Также провели 7 серийных пассажей при инфицировании гепаринизированной кровью от больных животных

При подкожном заражении у животных на первом пассаже на 5—8 сутки отмечали подъем температуры до 40,2—41,0 °С Забор внутренних органов проводили на 10 сутки с момента заражения. На втором пассаже лихорадка развилась у одной свинки на 7 сутки. На 3—7 пассажах лихорадку наблюдали почти у всех животных, начиная с 7 суток. Сокращения инкубационного периода, а также гибели животных не отмечали.

При внутрибрюшинном заражении у животных первого пассажа лихорадочное состояние развивалось на 6—8 сутки, а с увеличением пассажного уровня инкубационный период сокращался до 4 суток. Гибель животных наблюдали на 7 пассаже.

При серийных пассажах гепаринизированной крови инфицированных животных получены данные, аналогичные таковым при внутрибрюшинном заражении 10% суспензией печени морских свинок (сроки инкубационного периода и лихорадки, летальность).

Чувствительной моделью для вируса Эбола являются морские свинки массой 200 г. Культуральный вирус не является патогенным для морских свинок. Для увеличения его вирулентности необходимо проведение 7—8 серий-р ных пассажей. Это согласуется с данными ряда исследований [Геморрагическая лихорадка Эбола в Судане, 1978; Геморрагическая лихорадка Эбола в Заире, 1978; Bowen Е Т., Platt G.S.,1980.]. Более чувствительным методом явля-f ется внутрибрюшинное инфицирование 10% гомогенатом печени, а также гепаринизированной кровью от больных животных. Выявлено, что на протяжении первых 7 серийных пассажей вируса Эбола на морских свинках уровень продукции вируса в печеночной ткани невысокий Только на 8—9 пассаже уровень продукции вируса резко возрастает, достигая почти 106 БОЕ/мл в 10% гомогенате печени. Отмечено также слабое ЦПД in vitro вируса из гомогената печени даже после проведение многократных пассажей in vivo, и доминирование в печеночном гомогенате вируса с «красным» фенотипом бляшек.

5.2.3. Применение иммуносерологических методов для лабораторной диагностики. Морские свинки являются одним из основных продуцентов антител к вирусу Эбола. На первом этапе изучена динамика антителообразования у морских свинок. Группу из 6 животных массой 350—400 г иммунизировали вируссо-держащей культуральной жидкостью в дозе 104 БОЕ на животное с реиммуни-зацией через 1,5 месяца. Через две недели после иммунизации титр специфических антител к вирусу Эбола был индивидуален и составлял в НМФА 1:128 — 1:1024, в клеточном ИФА 1 ■ 1280 — 1:51200. Высокий титр антител в сыворотках животных сохранялся 34 дня, затем снижался. Реиммунизация приводила к увеличению иммунного ответа. Максимум антителообразования наблюдали также через 2 недели Для статистической обработки подсчитывали Iog2 средней геометрического титра (СГТ) и вычисляли средний титр.

Для получения специфических сывороток нами испытано 8 схем иммунизации животных, отличающихся по срокам, способам и дозе введения матери* . ала, а также использованием адъювантов. Получены данные, схожие с представленными в таблице 3. Наиболее высокие СГГ антител получены при схемах иммунизации 4, 5, 7 и 8. Наибольшее количество сывороток — 12 — с титром антител к вирусу Эбола в НМФА 1:1024 получили при иммунизации вирусом в дозе 104 БОЕ/животное с полным адъювантом Фрейнда и реиммунизацией через 3—4 недели тем же вирусом, но без адьюванта. Увеличение иммунизирующей дозы до 106 БОЕ/животное не приводит к существенному нарастанию титра антител к вирусу Эбола Применение для иммунизации инактивированного вируса, а также увеличение кратности иммунизаций также не приводит к возрастанию титра антител. Полученные сыворотки к вирусу Эбола являются специфическими по результатам проверки с референс-слайдами (СДС№ 806106) и не взаимодействуют с антигенами вируса Марбург.

Проведена работа по оптимизации МФА для приготовления слайд-антигенов хорошего качества- подобрана множественность заражения клеток и определены оптимальные сроки инкубации инфицированных культур. В качестве иммунных сывороток использовали сыворотку обезьяны к вирусу Эбола СДС № 703076 и экспериментальную антисыворотку морской свинки. Схожие результаты получены при использовании клеток Vero Е-6 и BGM. Оптимизированный и модифицированный метод применялся в лаборатории для тестирования специфических антител в сыворотках крови, при постановке контролей инактивированного материала на специфическую безопасность, а также для выявления антигенов вируса Эбола в клеточных культурах, зараженных различным вируссодержащим материалом.

Изучена динамика экспрессии антигенов вируса Эбола при заражении клеток Vero с множественностью 10 БОЕ/кл. Для этого была подработана методика выращивания клеток на покровных стеклах и их заражения в 24-луночных планшетах. Показана возможность выявления в клеточных культурах, зараженных вирусом Эбола, вирусных антигенов при различных сроках инкубации, начиная сразу после адсорбции материала на клеточном монослое. Полученные данные указывают, что на различных этапах инфекции морфология вирусспецифических антигенов, выявляемых в НМФА, может существенно различаться. Эти сведения необходимо учитывать при проведении лабораторной диагностики лихорадок Марбург (глава 5 1 3) и Эбола, чтобы избежать ошибочных заключений.

Разработан метод клеточного иммуноферментного анализа. Клеточный ИФА применили для выявления антител к вирусу Эбола в сыворотках крови морских свинок (п = 42) Эти же сыворотки параллельно исследовали в НМФА. При анализе результатов использования двух методов титрования антисывороток к вирусу Эбола наблюдалась корреляция: коэффициент корреляции для сывороток к вирусу Эбола — 0.78. Титры антител в клеточном ИФА были выше, чем в РНИФ в среднем в 50 раз. Метод клеточного ИФА, обладая высокой чувствительностью, специфичностью и простотой исполнения, позволяет проводить массовый скрининг сывороток и может быть рекомендован в качестве простого теста для выявления антител к вирусу Эбола

Вируснейтрализуюшие антитела у морских свинок. Постановку РН с вирусом Эбола (шт Заир) в культуре клеток BGM проводили методом редукции бляшек. Разработанный нами метод бляшкообразования был адаптирован к постановке на 24-луночных планшетах, что позволяло проводить учет результатов РН на 5—6 сутки после внесения исследуемого материала В серии предварительных экспериментов проверили вируснейтрализующее действие нормальных неинактивированных сывороток крови человека, морской свинки, кролика, лошади, мыши и человеческого противокоревого гамма-глобулина. Установили, что нормальные сыворотки человека, лошади, морской свинки, а также человеческий гамма-глобулин не имеют активности, нейтрализующей вирус Эбола (титр в РН < 1:20). Оценить активность сывороток кролика и мыши не удалось, так как они оказались токсичными для клеток в разведениях от 1 20 до 180. В варианте РН с постоянной дозой вируса и сыворотки установили, что термоинактивированные иммунные сыворотки морских свинок (№ 119 и № 163) в разведении 110 обеспечивают 100 % редукцию бляшек вируса Эбола.

Исследовано 12 образцов сывороток иммунизированных животных. Среди исследованных образцов выявлены сыворотки как с относительно высоким (1:180), так и с низким (1:20) титром вируснейтрализующих антител. Обращает внимание тот факт, что ряд иммунных сывороток, обладающих определенным титром в НМФА, не имеют нейтрализующих антител (титр менее 120). Титры вируснейтрализующих антител в термоинактивированных и не обработанных сыворотках находятся примерно на одном уровне. Следовательно, нейтрализация вируса Эбола in vitro иммунными сыворотками морских свинок вероятнее всего обусловлена действием специфических противовирусных антител, а не какими-либо неспецифическими термолабильными субстанциями Существенного влияния схем иммунизации животных на титры вируснейтрализующих антител не отмечено Даже однократная инокуляция морской свинке 104 БОЕ культурального вируса вызывает у некоторых животных индукцию вируснейтрализующих антител. Эффект неспецифической нейтрализации обнаружили только в нормальных сыворотках морских свинок при 5—10% их концентрации. Схожее действие нормальных сывороток некоторых животных обнаружено в отношении авирулентных штаммов вируса Хунин [Kenyon R Н., Peters C.J., 1989].

Выявленные нами относительно невысокие уровни вируснейтрализующих антител в сыворотках экспериментальных животных могут быть вследствие аномально больших размеров вирионов Известно, что размеры инфекционных частиц вируса Эбола составляют 970 нм [KileyV.P., 1982], что в 5—Юраз больше, чем у вирусов с кубическим типом симметрии. Если предположить, что пространственная плотность ответственных за инфекционность антигенных детерминант вируса Эбола и вирусов с кубическим типом симметрии одинакова, то для эффективной нейтрализации вируса Эбола потребуется во столько же раз большее количество специфических антител. Оценка уровня вируснейтрализующих антител в сыворотках реконвалесцентов, применяемых для лечения, позволит более корректно проводить специфическую иммунотерапию фи-ловирусных геморрагических лихорадок. Применение РН в лабораторной диагностике, возможно, позволит выявлять тонкие антигенные различия среди представителей семейства Filoviride.

5.3. Инактивация инфекционного материала и его контроль на специфическую безопасность. Помещать вирусы Эбола и Марбург в жидкий азот запрещено из-за высокой аварийности этого способа хранения [Laboratory biosafety manual, 2003] На основании проведенных исследований можно сделать заключение, что хранение вируссодержащей культуральной жидкости до десяти дней при 4 °С не влияет на титр инфекционности вирусов Эбола и Марбург. Более длительное хранение вируса (срок наблюдения один год) с гарантией сохранения инфекционности требует замораживания материала при температуре — 70 °С.

Желательно иметь такой метод инактивации, который оказывает наименьшее денатурирующее действие. Мы исследовали инактивацию материала после прогревания в течение одного часа при 56 или 60 °С

Вынос инактивированного материала из инфекционной зоны возможен только после постановки контролей на специфическую безопасность. Ввиду отсутствия каких-либо инструктивно-методических указаний нами разработан

метод контроля полноты инактивации инфекционного материала (специфической безопасности) in vitro и in vivo. По нашим данным и литературным сведениям пермиссивными системами для вирусов Эбола и Марбург являются морские свинки массой 150—200 г (система in vivo) и некоторые линии клеток (Vero, Vero Е-6, BGM — система in vitro). Причем, переадаптация вируса от одной системы к другой требует проведения серийных пассажей Очевидно, что при работе с этими вирусами могут появляться штаммы (варианты) с измененными биологическими свойствами. С учетом этих соображений мы разработали методы контроля полноты инактивации инфекционного материала (специфической безопасности) параллельно in vivo и in vitro.

Инфекционный вирус выявили в одной пробе сыворотки крови морской свинки, инактивированной в течение одного часа при 56 °С. В этом случае при просмотре в НМФА слайд-антигенов, приготовленных из клеток второго и третьего, но не первого пассажа, обнаружили клетки с характерно светящимися гранулами специфического антигена вируса Марбург. Все материалы, инактивированные в течение одного часа при 60 °С прошли контроль на специфическую безопасность. Таким образом, в зависимости от биологических свойств используемого в работе варианта вируса можно избрать один из способов контроля полноты инактивации инфекционное™ или использовать оба метода одновременно.

5.4. Схема лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Эбола и Марбург. Лабораторная диагностика геморрагических лихорадок Эбола и Марбург включает комплекс исследований по выделению и идентафикации вируса, а также по выявлению вирусспецифических антагенов и антател (рис. 1). В последние годы к этим методам добавился ОТ-ПЦР и сиквенс генома. Коммерческие диагностические тест-системы отсутствуют. Работа с возбудителями первой группы патогенное™, в том числе диагностическая, может проводиться в ограниченном числе лабораторий, имеющих соответствующее разрешение. На основе собственных методических разработок, воспроизведения и оптимизации традиционных методов и данных литературы нами составлено «Методическое пособие по лабораторной диагностике возбудителей геморрагических лихорадок Эбола и Марбург» (утв. Заместителем председателя Госкомсанэпид-надзора России Г.Г. Онищенко 17.03.1996г. №01-19/35-17). В данной работе мы применяли те методы, которые можно было реализовать в условиях блока максимальной биологической защиты.

Чтобы максимально исключить возможность ложноотрицательных результатов при лабораторно-диагносгаческих исследованиях, мы предлагаем схему проведения анализа, основанную на параллельном использовании биопробных животных и клеточных культур в комплексе с методами выявления специфических антагенов и антател.

Вскрытие умерших от КВГЛ, а также забор материала от трупа для лабораторного исследования не производится в связи с большим риском заражения. Такие манипуляции допускаются в исключительных случаях на основании специального разрешения Главного государственного санитарного врача РФ. Забор проб от больных или подозрительных на заболевание геморрагическими лихорадками Эбола и Марбург проводят специалисты при соблюдении требований протавоэпидемического режима. Пробы следует брать в возможно более

ранние сроки в острый период заболевания Схема анализа включает этапы взятия материала от больных (трупа), подготовку проб для исследования, изоля-

Рис. 1. Схема лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Эбола и Марбург

Данная схема апробирована в лабораторных условиях, а также была применена на практике при анализе материала в 1992 г. от больной М. из г. Корсакова с диагнозом «геморрагическая лихорадка Марбург?». Больная М. была судовым врачом. Во время пребывания в одном из портов Кении она заболела лихорадкой неясной этиологии По прибытии судна в порт г. Корсакова больную госпитализировали. Лечащий врач и врач-консультант поставили диагноз «геморрагическая лихорадка Марбург9». Для исследования материалов от больной и подтверждения клинического диагноза были приглашены специалисты из лаборатории особо опасных вирусов Иркутского противочумного института. На месте проведено исследование сывороток крови в НМФА. Исследование материала от больной М. по полной схеме выполнено в лаборатории особо опасных вирусов. Инфекционный агент выделен не был, не выявлено вирусспецифических антигенов или антител. Таким образом, диагноз «геморрагическая лихорадка Марбург?» был снят.

5.5. Альфавнрусы

5.5.1. Характеристика вирионов и субвирусных компонентов вируса вене-суэльскогоэнцефаломиелита лошадей

Очистка вируса и физико-химические свойства вирионов. Для концентрирования и очистки вирионов использовали вируссодержащую культураль-ную жидкость с титром инфекционности 108,0-109,2 БОЕ/мл. Схема очистки и концентрирования вируса включала следующие этапы: исходная культу-ральная жидкость — осветление к^5тквд®1ьний--^кидкости — осаждение вируса

ijgr]

ультрацентрифугированием - седиментация вируса через 20% сахарозу — очистка вируса методом зональной седиментации — осаждение вируса ультрацентрифугированием — суспендирование осадка. Этапы очистки вируса тестировали по инфекционности фракций, общему белку во фракциях, а также по радиоактивной активности фракций вируса, меченного in vivo по РНК (ЗН-уридин) или по белку (14С-гидролизат хлореллы).

Наиболее чистые по белкам препараты вируса получаются после зональной седиментации вирионов в линейных градиентах плотности сахарозы. На этом этапе достигается очистка от 99,93 % белковых примесей. Степень очистки вируса, меченного ЗН-уридином, составляет 99,26 %, меченного 14С-гидролизатом хлореллы — 99,99 %. При ЭФ в ПААГ-ДСН в препаратах выявляются три полипептида. Молекулярная масса белка VP1 составляет 56-57 кД, VP2 - 48-49 кД и белка С - 35-36 кД.

Константа седиментации очищенного вируса ВЭЛ, определенная методом аналитического ультрацентрифугирования, составляет 265 S. Плавучая плотность вирионов в сахарозе 1,18—1,19 г/см3. Плавучая плотность вируса ВЭЛ, близкая к таковой мембран клетки, обусловлена тем, что формирующиеся почкованием вирионы содержат модифицированную клеточную мембрану. Особенность структурной организации оболочки ВВЭЛ исследована нами методом спин-меток. Анализ спектра электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) спин-меченных частиц вируса при 25 °С показывает, что он характерен для спектров, наблюдаемых при взаимодействии этого класса спиновых меток с биологическими и модельными мембранами в случае наличия бислойной липидной структуры. Мембраны инфицированных клеток и оболочки вирионов являются более жесткими, чем мембраны интактных клеток.

С очищенными вирионами вируса ВЭЛ ассоциировано три полипептида. Молекулярная масса белка VP1 составляет 56—57 кД, VP2 — 48—49 кД и белка С — 35—36 кД. Для выделения С-белка использовали сердцевины ВВЭЛ. Белок С элюируется с колонки гидроксилапатита в присутствии ДСН (ГАП-ДСН) при 0,29 М концентрации фосфатного буфера и достаточно хорошо отделяется от примеси белков оболочки вирионов. При ЭФ в ПААГ-ДСН материала, содержащегося во фракции «0,29 М», выявляется один полипептид с молекулярной массой 35 кД. Минорные полипептиды в этой фракции не обнаружены.

Дезинтеграцию вируса ВЭЛ проводили с использованием неионных детергентов тритона Х-100 и нонидета Р-40. В предварительных экспериментах установлено, что оба детергента действуют аналогично. При дезинтеграции вирионов неионными детергентами выявляется фракция субвирусных структур с константой седиментации 150—160 S. При седиментации материала, меченного радиоактивными изотопами по РНК и белкам, в градиентах плотности сахарозы наблюдается один пик радиоактивности, причем отмечено совпадение скоростей седиментации материала, меченного по РНК и по белкам Константа седиментации этих частиц S20,o, определенная аналитическим методом в ультрацентрифуге Бекман Е, составляет 153 S. Электронно-микроскопическое исследование материала показало наличие в препарате субвирусных структур, лишенных суперкапсидной оболочки вирионов. В таблице 4 суммированы полученные нами результаты по определению структурных параметров вирионов ВВЭЛ, полученные методом электронной микроскопии.

Таблица 4

Результаты электронно-микроскопического измерения параметров вирионов и сердцевин вируса ВЭЛ

Измеряемые структуры Размер структур в ангстремах

Диаметр цельных вирионов 600 ± 15

Диаметр вирионов без спайков 550 ± 15

Диаметр сердцевин вируса 400 ±15

Толщина оболочки сердцевины вируса 30 ± 10

Диаметр центрального электронноплотного тела сердцевины вирионов 100 ±50

Полученные данные показывают, что с сердцевинами вируса ВЭЛ ассоциирован белок с молекулярной массой 35 кД, тогда как фракции на вершине градиента содержат оболочечные белки вирионов с молекулярными массами 49 и 56 кД. Плавучая плотность сердцевин вируса в хлористом цезии составляет 1,41 — 1,43 г/см3. Плавучая плотность сердцевин вируса без фиксации определена нами в градиентах сахарозы, приготовленных на Д20, и составляет 1,34 г/см3. Оценочные расчеты на основании данных по плавучей плотности сердцевин вируса показывают, что соотношение белка и РНК в этих структурах составляют 2:1. Далее, учитывая, что молекулярная масса РНК вируса ВЭЛ равна 4,2 х 106 дальтон, можно рассчитать количество молекул белка в сердцевинах вируса. По проведенной оценке сердцевины вируса ВЭЛ содержат по 240 молекул белка с молекулярной массой 35 кД.

5.5.2. Структурные особенности и гетерогенность вирионов альфавиру-сов. Известно, что при пассажах вирусов происходит образование спонтанных мутантов и их селекция. В связи с этим лабораторные штаммы могут быть неоднородны, что негативно сказывается как при диагностических исследованиях, так и при разработке протективных препаратов. В препарате очищенного вируса ВЭЛ присутствуют как стандартные, так и полиплоидные вирионы, т.е. даже пул очищенных вирионов гетерогенен. Мы исследовали гетерогенность лабораторного штамма вируса ВЭЛ. Клонированием из бляшки был получен ряд клонов. Наиболее ярко выражены отличия между вирионами клона № 1 и клона № 2. Клон 1 характеризуется крупнобляшеч-ным фенотипом, клон 2 — мелкобляшечным. В культуре клеток ФЭК вирус клона 1 репродуцируется до более высоких титров инфекционности, чем вирус клона 2. Полная инактивация инфекционности вируса клона 1 происходит после 20 мин. инкубации при 54 °С, тогда как клона 2 - при 58 "С. При зональной седиментации в градиентах сахарозы отличия между вирусами разных клонов не выявлено. Это существенный момент, указывающий на то, что при очистке вирионов исходной популяции отличающиеся по ряду признаков вирионы попадут в один пул очищенного вируса. Молекулярные массы белков Е1 и С вирионов клонов 1 и 2 отличаются (табл. 5) При электрон-номикроскопическом исследовании препаратов очищенных концентрированных вирионов показано, что в случае клона 2 гликопротеиды формируют регулярную икосаэдрическую поверхностную решетку, соответствующую триангуляционному числу Т-4. На поверхности вирионов клона 1 не выявле-

на четкая структуризация пентамеров и гексамеров Поверхность вирионов клона 1 выглядит сглаженной. Совпадающие данные получены при изучении препаратов вируса, выращенного на клетках ФЭК и ВНК-21.

Таблица 5

Молекулярные массы структурных белков различных клонов вируса

ВЭЛ

Структурные белки Клон № 1 Клон №2 ВВЭЛ - 230

Е1 46,7 кД 43,7 кД 56-57 кД

Е2 40,3 КД 40,3 кД 48-49 кД

С 34,3 КД 35,5 кД 35-36 кД

Методом ЭПР показано, что мембраны клеток в процессе развития инфекции становятся более жесткими. По эффекту возрастания жесткости исследованные системы можно расположить в следующий ряд- интактные клетки; клетки, зараженные клоном № 1 вируса ВЭЛ; клетки, зараженные клоном № 2 вируса ВЭЛ Исследование подвижности спин-меток при различных температурах указывает на наличие размытого фазового перехода в интакт-ных клетках в области 25 "С, а в инфицированных клетках при 27-33 "С.

Полученные данные, помимо теоретического, имеют серьезное практическое значение при разработке протективных и диагностических препаратов, при проведении лабораторно-диагностических исследований. Работы, проведенные с гетерогенными штаммами, могут привести к ошибочным выводам. Поэтому, во всех случаях, в том числе при приведении моле-кулярно-генетических исследований, важно использовать клонированные _ варианты лабораторных штаммов вирусов.

Глава 6. Общий подход к анализу эпизоотий и эпидемических вспышек неясной, предположительно вирусной, этиологии (на примере расследования причин эпизоотии неизвестной этиологии)

6.1. Общие подходы и тактические приемы лабораторной диагностики при вспышке инфекционных заболеваний неясной, предположительно вирусной, этиологии. Следует отметить, что в соответствии с действующими санитарными правилами [Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенно-сти (опасности). СП 1.3.1285-03. - М., 2003 - 84 е.] все виды работ с вирусами I группы патогенности и микроорганизмами, таксономическое положение которых не определено, а степень опасности не изучена, а также аэробиологические исследования проводят в максимально изолированных лабораториях. Такое требование значительно ограничивает число лабораторий, способных проводить диагностические исследования.

Основная задача лабораторно-диагностических исследований при анализе вспышки инфекционных заболеваний (эпизоотий) неизвестной, предположительно вирусной, этиологии состоит в даче правильного заключения. Как показывает мировой опыт, отрицательный результат далеко не всегда означает, что этаология вспышки (эпизоотии) не связана с вирусным агентом В ряде случаев требуется проводить исследования в течение недель и месяцев, особенно когда эпидемическая вспышка (эпизоотия) вызвана неизвестным для науки «новым» вирусом. Эффективность исследования определяется, прежде

всего, наличием квалифицированного персонала с широким диапазоном методической подготовки, уровнем оснащенности лаборатории, наличием коммерческих или лабораторных диагностических тест-систем, обеспеченности клеточными культурами и лабораторными животными.

Общая схема проведения лабораторно-диагностических исследований включает следующие этапы (рис. 2). От больного человека или животного (трупа) следует брать материал, упаковывать и транспортировать его в соответствии с действующими инструктивно-методическими документами Следует отметить, что для вскрытия погибших от КВГЛ требуется специальное разрешение Главного государственного санитарного врача Полученный материал следует исследовать всеми доступными экспресс-методами. На этом этапе может быть эффективна электронная микроскопия (ЭМ), так как этот метод позволяет определить вирусы в материале, как минимум, до семейства, что сразу ограничивает диапазон поиска. При отсутствии экспресс данных о таксономическом положении возбудителя изоляцию вируса следует проводить с применением максимально возможного спектра лабораторных животных, а также на куриных эмбрионах и клеточных культурах Из клеточных культур наиболее часто используют линии Vero, VeroE-6, BGM

Рис. 2. Общая схема анализа материала при эпидемической вспышке (эпизоотии) неясной, предположительно вирусной, этиологии

При наличии информации о возможном природном хозяине целесообразно также использовать животных этого вида. При отсутствии гибели (заболевания) экспериментальных животных или куриных эмбрионов, а также отсутствии ЦПЭ в клеточных культурах проводят слепые серийные пассажи ма-

териала. Для трудно культивируемых вирусов разработана методология репрезентативного дифференциального анализа, которая заключается в сравнении первичных последовательностей РНК или ДНК, присутствующих в пораженной инфекционным агентом ткани и отсутствующих в здоровой ткани одного и того же организма. Следующим этапом исследования является идентификация вирусного агента, изучение его свойств и определение таксономического положения Наконец, на завершающем этапе воспроизводится экспериментальная инфекция с чистой культурой на чувствительных животных. По нашему мнению, при всей методической сложности и большом объеме исследований подобный подход позволяет максимально исключить возможность ложноотрицательных результатов.

6.2. Характеристика эпизоотии среди тюленей Байкала. В 1987 г. на озере Байкал зарегистрирована эпизоотия среди тюленей (нерпы) Phoca sibirica, в результате которой только в осенне-зимний период 1987—1988 it. погибло свыше 7 тысяч животных. Другие случаи массовой гибели водных млекопитающих животных в таких масштабах, как это произошло с нерпой озера Байкал, не были известны. С целью расследования причин эпизоотии была создана комплексная межведомственная комиссия (правительственная телеграмма № 14 663-54-10 от 16 декабря 1987 г.), которой было поручено организовать изучение причин массовой гибели тюленей. Несколько институтов различных ведомств были привлечены для отработки версий возможной гибели нерп от бактериальной, вирусной инфекций, токсинов или инвазий.

В декабре 1987 г первый материал для вирусологических исследований поступил в Иркутский НИПЧИ и параллельно в ряд ведущих научно-исследовательских институтов СССР. Ранее вирусологическое исследование байкальских нерп не проводили Банк сывороток крови этих животных отсутствовал, что исключало возможность проведения ретроспективного серологического анализа. С точки зрения санитарной охраны территории важным аспектом проблемы представлялась апробация комплекса вирусологических методов для первичной изоляции вируса в реальных условиях расследования эпизоотии неясной этиологии. Необходимо было выяснить причины массовой гибели нерп, установить степень опасности этой эпизоотии для популяции нерпы озера Байкал, человека, сельскохозяйственных, диких животных и окружающей среды. Таким образом, актуальность данного раздела работы определялась острой необходимостью изучения причин массовой гибели нерп озера Байкал, по масштабам не имевшей аналогов в мире среди водных млекопитающих, и оценки возможных последствий этой эпизоотии.

6.3. Выделение и идентификация вирусов. Стояла задача так спланировать проведение изоляции вирусных агентов, чтобы не сделать неправильного заключения об отсутствии вирусных инфекций в результате применения непермиссивных систем выделения вирусов. Погибшие животные были взяты из разных мест береговой линии Байкала. У одной больной нерпы удалось проследить клиническую картину болезни. Были исследованы органы от нерп № 2, 3, 4 и 6. Ни при проведении «слепых пассажей», ни при выдерживании оставшихся лабораторных животных в течение 30 дней, клинических проявлений заболевания не отмечено. Параллельно изоляцию вирусных агентов проводили на 9-дневных куриных эмбрионах При вскрытии

гибели эмбрионов не отмечали, однако, во всех случаях аллантоисная жидкость была мутной, коричневого цвета. Бактериальная контаминация была исключена. Полученные на куриных эмбрионах изоляты обозначены нами как На-2, На-3, На-4 и На-6. После проведения трех последовательных пассажей из аллантоисной жидкости получили препараты концентрированного и очищенного вируса для идентификации. Параллельно материал исследовали в культуре клеток. Проведено три «слепых» пассажа образцов исследуемого материала в культуре клеток ФЭК. Изменений монослоя клеток ФЭК по сравнению с контрольными клетками не отмечено. В перевиваемых культурах клеток Vero и Heia на первом пассаже исследуемого материала отмечены незначительные изменения клеток в виде округления. На втором пассаже в инфицированных культурах обнаружено образование гигантских клеток — синцитий. Наиболее выраженный цитопатический эффект получен в 3 пассаже исследуемых образцов материала из мозга нерп № 2, 3, 4 и 6. Полученные в культуре клеток инфекционные агенты обозначены нами как Н-2, Н-3, Н-4 и Н-6.

Таким образом, при первичной изоляции вируса на моделях морских свинок, взрослых белых мышей, мышей-сосунков и в культуре клеток ФЭК положительных данных не получено В куриных эмбрионах и в культурах клеток Vero и Heia из образцов суспензий мозга нерп 2, 3, 4 и 6 выделены инфекционные агенты. Примененный для первичной изоляции вирусов комплексный подход показал свою эффективность.

Идентификацию инфекционных агентов проводили методами ЭМ, НМФА и ИФА. В препаратах очищенного вируса с плавучей плотностью 1 18 г/ см3 при ЭМ выявлены сферические, гетерогенные по размерам частицы с диаметром около 100 нм. Результаты клинических наблюдений за нерпами и данные ЭМ указывали, что вирусный агент, вызвавший заболеваемость и смертность тюленей может быть близок к вирусу чумы плотоядных.

В таблице 6 приведены результаты идентификации концентрированных изо-лятов вирусов, выделенных в куриных эмбрионах Препаратами-антигенами сенсибилизировали 96-луночные планшеты для ИФА. В реакции применяли сыворотку каспийского тюленя как отрицательный контроль. Сыворотка Н-9 — от больной нерпы Сыворотка Н-123 получена от клинически здоровой байкальской нерпы в 1988 г. Сыворотки Z-563 и Z-611 получены от обыкновенного тюленя в Северном море и любезно предоставлены доктором А. Osterhaus, Нидерланды. Эти сыворотки имели титр антител 1:3000 в реакции нейтрализации против вируса чумы плотоядных Моноклональные антитела ВК-228 к шт. Ленинград-16 вируса кори и LEK-27 против вируса кори от пациента, страдающего подострым склеротизирующим панэнцефалитом, любезно предоставлены доктором Ф.Г Нагаевой (г. Москва).

Таким образом, при параллельной изоляции в различных по пермис-сивности системах — перевиваемых культурах клеток и куриных эмбрионах, из одного и того же исходного материала от больных и погибших нерп получены 4 штамма вируса рода Morbillivirus, каждый в «культуральном» и «аллантоисном» варианте. Выделенные вирусы названы нами морбилливи-русами байкальской нерпы (МБН) и далее обозначаются как МБН-2, МБН-3, МБН-4иМБН-6.

Таблица 6

Идентификация выделенных от нерп вирусных агентов методом твердофазного иммуноферментного анализа

№ Антитела (сыворотка) Изолят вируса

п/п На-2 На-3 На-4 На-6

1 Сыворотка нерпы Н-9 1280* 1280* 10240* 1280*

2 Сыворотка нерпы Н-123 100* 200* 800* 400*

3 г-563 отр** 200* 3200* 200*

4 г-611 отр** 200* отр** 400*

5 ВК-228 100* 400* 800* 400*

6 1.ЕК-27 отр** 100* 5200* 100*

7 Иммуноглобулины человека против кори 25600* 640* 400* 640*

8 Сыворотка каспийского тюленя отр" отр ** Отр ** отр **

Примечание: * - обратные титры антител, ** - отрицательный результат при исследовании сывороток.

6.4. Экспериментальное изучение изолятов морбилливирусов. Проведен анализ профиля взаимодействия использованных в работе антител с каждым из выделенных морбилливирусов. Обращают внимание схожие профили титров антител для изолятов МБН-3 и МБН-6, тогда как МБН-2 и МБН-4 отличаются как друг от друга, так и от МБН-3 и МБН-6. Интересно, что в сыворотке больной и клинически здоровой нерпы (Н-9 и Н-123) содержатся антитела ко всем четырем изолятам вируса в несколько варьирующих соотношениях. Сыворотки морских тюленей, содержащие нейтрализующие антитела к вирусу чумы плотоядных (Z-563 и Z-611), реагируют с МБН-3 и МБН-6 в практически равных титрах и совсем не взаимодействует с МБН-2. С МБН-4 активна только сыворотка Z-563. Моноклональные антитела к вирусу кори и про-тивокоревые иммуноглобулины по соотношению титров их взаимодействия отличают МБН-2 и МБН-4 от штаммов МБН-3 и МБН-6. Образец антител LEK-27 совсем не взаимодействует с МБН-2 и данные, полученные с использованием этих антител, подтверждают сходство МБН-3 с МБН-6 и их отличие от МБН-2 и МБН-4. Полученные результаты указывают, что в период массовой заболеваемости и гибели нерпы циркулирующие в популяции штаммы имели существенные отличия по антигенной структуре. В период эпизоотии циркулировало, как минимум, три антигенных варианта морбилливируса.

Для дальнейших экспериментов мы остановились на штамме МБН-6, так как этот штамм выделен из мозга больного животного, которого наблюдали до его смерти По антигенной структуре штамм МБН-6 похож на штамм МБН-3 и хорошо репродуцируется в культуре клеток, вызывая ЦПЭ.

Следующим этапом работы было получение концентрированных очищенных препаратов МБН-6 и изучение его иммунологической активности. Полученные результаты дают основание заключить, что вирионы МБН имеют плавучую плотность в градиенте плотности сахарозы 1,18 г/см3.

Изучение активности вируса МБН-6, полученного путем заражения культуры клеток Vero, проводили методом иммуноферментного анализа, непрямой иммунофлюоресценции и в реакции нейтрализации. Происхождение сы-

вороток и противокоревых иммуноглобулинов описано выше. Полученные данные показали возможность применения МБН-6 в качестве антигена или инфекционного вируса в НМФА, ИФА и PH. Эти результаты можно рассматривать также с точки зрения дополнительного типирования МБН, выделенного от нерп. На основе способности выделенных вирусов вызывать ЦПЭ в применяемых нами культурах клеток, был разработан метод количественной оценки инфекционности по ЦПЭ и бляшкообразованию.

Исследованные нами лабораторные животные оказались не чувствительны к МБН. Специальные лабораторные собаки, свободные от патогенов, в России отсутствуют. То же самое относится к норкам как лабораторным животным для вирусологических исследований. В связи с изложенным, была поставлена задача экспериментально воспроизвести инфекцию у природного хозяина после его заражения «чистой культурой» выделенного возбудителя По нашему мнению, такой эксперимент необходим для соблюдения постулатов Коха при расследовании причин эпизоотии. В опыт по экспериментальному инфицированию природного хозяина вирусом МБН, отобрали животных в возрасте 5 месяцев. Нерп отловили в мае 1990 г. в озере Байкал. После карантина в течение 2 недель и определения наличия антител отобрали двух нерп. Одно животное во время транспортирования погибло. Учитывая сложность добычи, транспортирования и содержания нерп, опыт поставлен на одном животном. Нерпу поместили в аквари-альную института ВНИИ экологической токсикологии (г. Байкальск), и инфицировали ее вирусом МБН-6, прошедшим 10 пассажей в культуре клеток Vero с титром 107 ТЦПД50/мл. Цельную вируссодержащую жидкость вводили одномоментно комбинированно- внутримышечно - 5,0 мл; интраназально и в конъюнктиву глаза по 0,5 мл. Проводили ежедневные наблюдения за клиническим состоянием животного — фиксировали изменения поведения, осматривали слизистые, регистрировали рекгально температуру тела, частоту дыхания (время пребывания под водой). В различные периоды после заражения брали пробы крови, из которой получали сыворотку и исследовали в реакции нейтрализации и иммуноферменгаом анализе. Кровь брали на 10, 13, 16, 20, 24, 33 и 39 дни после инфицирования вирусом. Описана клиническая картина заболевания. Через два месяца после заражения состояние животного нормализовалось Результаты тестирования специфических антител к МБН в РН и ИФА приведены в таблице 7.

Таблица 7

Продукция антител к морбилливирусу байкальской нерпы у экспериментально инфицированного природного хозяина

Время забора крови Обратные титры антител в ИФА Обратные титры антител в РН

До заражения отр отр

После заражения-10-й день 160 отр

13-й 160 отр

16-й 160 320

20-й 640 640

24-й 640 640

33-й 640 640

39-й 640 640

Данные таблицы показывают, что заражение МБН приводит к развитию инфекции и индукции у животного вируснейтрализующих антител в титрах 1:640. Наблюдаемая нами стертая картина клинических симптомов инфекции может быть связана с индивидуальной устойчивостью животного или с потерей вирулентных свойств вируса, поскольку для инокуляции использовали вирус, прошедший десять пассажей в культуре клеток.

Таким образом, выделенные от нерп вирусы МБН-2, МБН-3, МБН-4 и МБН-6 по результатам идентификации отнесены к роду Morbillivirus семейства Paramyxoviridae. Эти вирусы были названы нами морбилливируса-ми байкальской нерпы (МБН). При выполнении работы нами отработаны и определены условия прямой изоляции инфекционных агентов. Определена чувствительность к вирусу МБН лабораторных животных, клеточных культур и куриных эмбрионов. Проведена идентификация выделенных вирусных агентов. Показана антигенная гетерогенность выделенных штаммов МБН. Отработан метод концентрирования и очистки МБН дифференциальным и градиентным ультрацентрифугированием. Определена плавучая плотность вирионов в градиенте плотности сахарозы (1,18 г/см3). Отработаны методы количественной оценки инфекционности. Показана возможность использования МБН для определения специфических антител методами НМФА, твердофазного ИФА и в РН. Через три месяца из исходного материала, хранившегося в азоте, проведена реизоляция вирусов с аналогичными свойствами. Нами впервые проведен единственный до настоящего времени эксперимент по заражению тюленя чистой культурой морбилливируса, описано течение заболевания животного со стертыми симптомами, показана индукция у зараженного животного вируснейтрализующих антител.

6.5. Разработка методов лабораторной диагностики и мониторинг популяции тюленей. С применением вируса МБН-6 разработаны методы титрования специфических антител в РН и в клеточном ИФА. Следующим этапом работы было определение специфических антител к МБН у тюленей Байкала Помимо сбора сывороток определяли возраст и пол животных. Все животные были без видимых клинических признаков инфекции. Это первое применение гомологичной тест-системы для определения специфических антител к морбилливирусам водных млекопитающих. Разработанные методы применены для тестирования антител в сыворотках крови 436 нерп, собранных в 1989, 1990, 1993 и 1999 гг Установлено, что в 1990 г. доля сероположительных животных составила 76,3 ± 3,5 % и к 1999 г. снизилась до 52,2 ± 8,2 %, что указывает на возможность возникновения эпизоотии. Определено распределение специфических антител среди животных различного возраста и пола. Разработанный нами вариант клеточного ИФА с МБН проще и доступнее, чем традиционные варианты с очищенными антигенами или вариант метода, описанный ранее для вируса кори [Rice G.P.A et al , 1993]. Для морбилливирусов водных млекопитающих такие методы разработаны и применены впервые. Таким образом, предложенный нами подход позволил расследовать эпизоотию неизвестной этиологии и впервые доказать роль морбилливирусов в массовой гибели водных млекопитающих.

6.6. Оценка состояния лабораторной базы региона в связи с выполнением задач по санитарной охране территории в отношении вирусных инфекций. Основное внимание было уделено оценке готовности практических вирусологических лабораторий Сибири и Дальнего Востока к проведению диагностических исследований и работ по выявлению вирусов в объектах внешней среды. Для этого были разработаны анкеты и составлены паспорта на 24 вирусологических лаборатории региона. Судя по собранным материалам, уровень оснащенности и интенсивность работы вирусологических лабораторий значительно варьируют на разных территориях (табл 8). В настоящее время относительно лучше оснащены лаборатории в г.г. Омске и Хабаровске, определенные в качестве региональных центров по полиомиелиту и получающие целевые средства ВОЗ в связи с программой ликвидации этой инфекции В этих лабораториях имеется по 6 специалистов с высшим образованием, тогда как в других — от 1 до 4 врачей-вирусологов. Большая часть вирусологических лабораторий располагается в типовых помещениях общего здания ЦГСЭН, занимая крыло одного из этажей, и не имеет условий для работы с вирусами II группы пато-генности. Имеются варианты объединения с лабораторией ООИ (Читинская область) и бактериологической лабораторией (Сахалинская область). Лишь несколько лабораторий (около 20 %) оборудованы соответствующим образом и имеют разрешения на работу с вирусами II группы патогенности. Остальные имеют право лишь на работу с возбудителями III—IV групп патогенности. Основными препятствиями к обеспечению более высокого уровня защиты являются отсутствие изолированной приточно-вытяжной системы вентиляции и недостатки в планировке помещений. Для переоборудования необходимы значительные затраты.

Уровень приборного оснащения также сильно варьирует. Большая часть лабораторий имеет оборудование для постановки иммуноферментного анализа, около 80 % лабораторий имеют люминесцентные микроскопы и лишь две до 2003 г. были оснащены комплектами для постановки ПЦР. В течение 2003 г. после эпидемии ТОРС практически все лаборатории получили оборудование для ПЦР и приступили к его установке. Многие вирусологи прошли специальную подготовку по применению ПЦР, в том числе на курсах, организованных в Москве с участием специалистов ВОЗ. Однако практический опыт использования этой реакции для обнаружения РНК-содержащих вирусов в ЦГСЭН Сибири и Дальнего Востока минимален.

Почти все вирусологические лаборатории ЦГСЭН (за исключением Амурской области) имеют в распоряжении от 2 до 4 линий клеточных культур, которые используются, главным образом, для работы с энтеровирусами и аденовирусами Также, почти везде используются куриные эмбрионы для изоляции вирусов гриппа. Биопробные животные (белые мыши, морские свинки) используются лишь в 4—5 лабораториях, но чаще лабораторных животных содержат только для получения свежих эритроцитов для гемагглютинационных тестов Как и в целом в Российской Федерации, в структуре лабораторных исследований вирусологических лабораторий Сибири и Дальнего Востока абсолютно доминируют серологические методы Работа по выделению и типирова-нию вирусов проводится в отношении вирусов гриппа и энтеровирусов, значительно реже — вируса клещевого энцефалита и аденовирусов.

Загруженность и интенсивность работы сильно различаются на разных территориях' от 2000 (Камчатская область и Республика Алтай) до 40000 (Хабаровский край) анализов в год. В лабораториях, выполняющих большое количество анализов, основной удельный вес занимают исследования на вирусные гепатиты, ротавирусы, грипп, корь. Сравнительно равномерно распределена нагрузка по энтеровирусам. По этой группе вирусов выделяются региональные центры в г.г. Хабаровске и Омске. В двух лабораториях проводятся серологические исследования на ВИЧ-инфекцию Исследования на клещевой энцефалит проводятся далеко не во всех лабораториях ЦГСЭН, даже там, где эта инфекция представляет серьезную проблему для территории. Исследования на бешенство, ГЛПС и другие геморрагические лихорадки выполняются эпизодически. В целом, исследования на природноочаговые инфекции в вирусологических лабораториях ЦГСЭН имеют очень небольшой удельный вес. Основными объектами исследований, на которые до самого последнего времени были нацелены эти лаборатории, являлись вирусы III—ГУ групп пато-генности, не представляющие особого интереса с точки зрения СОТ.

Кроме лабораторий ЦГСЭН в регионе имеется несколько вирусологических лабораторий в НИИ и противочумных учреждениях, непосредственно подчиненных Минздраву России, имеющих условия и большой опыт работы с вирусами II группы патогенности, в том числе лаборатории в Иркутском НИПЧИ, Хабаровской и Читанской ПЧС, Омском НИИ природноочаговых инфекций. В зависимое™ от квалификации и интересов вирусологов сложилась специализация некоторых лабораторий и распределение функций там, где на территории имеется более одной вирусологической лаборатории. Например, в г. Хабаровске лаборатория ЦГСЭН имеет большой опыт работы с энтеро-вирусами и является опорной базой НИИ гриппа, тогда как исследования на природноочаговые вирусные инфекции проводятся, в основном, в вирусологической лаборатории Хабаровской протавочумной станции Примерно такое же распределение функций существует в г. Омске между ЦГСЭН и Омским НИИПИ. В Приморском крае в лаборатории ЦГСЭН, напротав, накоплен большой опыт работы с арбовирусами; и исследования на клещевой энцефалит проводятся в большом объеме, несмотря на наличие арбовирусной лаборатории во Владивостокском ИЭМ ДВФ СО РАМН.

Основной базой в азиатской части России для проведения исследований с вирусами I группы патогенное™, включая вирус натуральной оспы, является НПО «Вектор» (г Новосибирск). Составлена карта-схема размещения базовых лабораторий для обслуживания 20 администратавных территорий Сибири и Дальнего Востока. Материалы анализа с паспортами лабораторий направлены в Минздрав России Исх. № 139 от 30.03.01. Учитывая размещение и технические возможное™ вирусологических лабораторий центров ГСЭН и вирусологических лабораторий в других учреждениях Минздрава РФ, а также географические особенное™ региона, в этой справке подчеркивалась необходимость укрепления сета региональных лабораторий и налаживания системы пересылки патогенного материала из практических учреждений здравоохранения в специализированные вирусологические центры.

В качестве региональных баз по диагностике энтеровирусных инфекций, гриппа и других вирусных антропонозов могут быть закреплены лабо-

Таблица 8

Основные сведения о вирусологических лабораториях ЦГСЭН региона

Территория Врачи г Лаборанты Помещение <мг) Уровень защиты Работа с клетками Работа с животными Работа с эмбрионами Общее кол-во анализов в год

Тюменская обл 2 5 200,0 2 Нер-2 1.В Мыши, гуси, петухи, бараны Да 9300

Омская обл 6 9 270,0 3-4 Нер-2 (Ш, 120 В Нет Да Более 24000

Новосибирская обл 3 5 310,0 2 Нер-2 ЯШ Гуси Да 4600

Кемеровская обл 3 3 300,0 2 Нер-2 (Ю МДСК Нет Да Более 13000

Республика Алтай 1 2 156,0 Ъ-4 Нер-2 ЯО Нет Да 1800

Алтайский край 3 6 240,0 2 Нер-2 КО Гуси, свинки, бараны, петухи Да Более 25000

Республика Хакасия 1 2 182,0 3-4 Нет Нет Нет Нет данных

Республика Тыва 1 2 160,0 2 Нет Нет Нет 10000

Красноярский край 4 4 250,0 3-4 Нер-2 КО Мыши, гуси, бараны Да 20700

Иркутская обл 2 3 235,0 3-4 Нер-2 (Ю 1_40 Нет Нет 10000

Читинская обл 3 3 225,0 2 Нер-2 ЯО Мыши Да 11500

Республика Бурятия 3 3 180,0 3-4+ Нер-2 Нет Да 5900

Амурская обл 1 2 362,0 3-4 Нет Нет Нет Нет свел

Республика Саха (Якутия) 2 3 240,0 3-4 Нер-2 ЯО Петухи Да 3700

Хабаровский край 6 3 230,0 3-4 Нер-2 КО, 120В 141 Нет Да Более 40000

Приморский край 3 6 243,0 3-4 Нер-2 ЯО Нет Да 15500

Сахалинская обл 3 6 400,0 3-4 ЯР Нет Да 22000

Магаданская обл 3 7 206,0 3-4 Нер-2 ЯО Мыши Да 28500

Камчатская обл 1 2 135,0 3-4 Нер-2 ФЭЧ Петухи, голуби Да 1500

ратории в Омске (Западная Сибирь) и Хабаровске (Дальний Восток). После завершения программы ликвидации полиомиелита эти лаборатории могут быть переориентированы на другие задачи, связанные с антропонозными вирусными инфекциями Региональные базы для диагностики природнооча-говых вирусных инфекций II группы патогенности целесообразно организовать на базе вирусологических лабораторий ЦГСЭН в Красноярске (для Восточной Сибири) и Владивостоке (для Тихоокеанского побережья и островных территорий), а также вирусологических лабораторий в Омском НИИ природноочаговых инфекций (Западная Сибирь), в Читинской (Забайкалье) и Хабаровской противочумных станциях (Дальний Восток). Эти региональные базы должны иметь возможность для изоляции и типирования вирусов

II группы в культуре клеток и на лабораторных животных из материала, поступающего с закрепленной за ними территории. Функции организационно-методического центра в пределах региона, подготовку кадров вирусологов, хранение коллекций клеточных культур и диагностических штаммов для нужд практических лабораторий целесообразно возложить на Иркутский НИПЧИ, который имеет в своем составе лабораторию особо опасных вирусов и занимается этой работой Таким образом, реорганизация восьми существующих в учреждениях Минздрава России вирусологических лабораторий, их дополнительное оснащение позволило бы улучшить качество диагностики вирусных инфекций в регионе.

С учетом положений данной работы представляются целесообразными следующие направления оптимизации и совершенствования СОТ от ООВИ:

х Круг инфекций, на которые следует распространять мероприятия по СОТ, необходимо расширить и пополнять по мере появления новых научных и оперативных данных. Для пересмотра круга ООВИ, на которые распространяются мероприятия по СОТ, можно использовать предложенные «Критерии значимости ООВИ для СОТ». Можно рекомендовать для рассмотрения перечень инфекций, приведенный в таблице 2.

* Пересматривать Перечень возбудителей ООВИ 1-ГУ групп патогеннос-ти и пополнять его по мере появления новых данных и ООВИ. Из возбудителей «новых» инфекций это было оперативно сделано для коронавируса ТОРС. Есть основания рекомендовать для включения в I группу патогенности возбудители Крымской, Калифорнийской, Бразильской и Венесуэльской геморрагических лихорадок, а также хантавирусного легочного синдрома. Во II группу патогенности целесообразно включить вирусы Нипа, Хендра, Тогото.

* Определить место каждой ООВИ среди «Категорий ООВИ в соответствии с их значимостью для СОТ». На данном этапе рассмотрения можно рекомендовать такое распределение ООВИ, как указано в таблице 2.

х При анализе возможной роли ООВИ в ЧС и составлении прогнозов также можно рекомендовать применение подхода, реализованного для «Категорий ООВИ в соответствии с их значимостью для СОТ».

х Разработать три варианта профилактических и противоэпидемических мероприятий для включения в «Комплексный план по санитарной охране территории от завоза и распространения карантинных и других особо опасных инфекций» (для контагиозных ООВИ I группы патогенности, контагиозных ООВИ II группы патогенности, неконтагиозных ООВИ II группы патогенности).

х Определить сеть медицинских учреждений для изоляции и лечения больных с учетом трех вариантов профилактических и противоэпидемических мероприятий.

х При появлении новых, не известных мировой науке ООВИ, возможно применение одного из трех вариантов профилактических и противоэпидемических мероприятий.

х На основе имеющейся лабораторной базы Минздрава РФ с учетом мирового опыта создать сеть лабораторий, способных выполнять весь комплекс исследований, включая изоляцию и идентификацию возбудителей ООВИ, в том числе и при расследовании эпидемических вспышек неизвестной, предположительно вирусной, этиологии.

* Определить необходимый перечень диагностических тест-систем к ООВИ и места их производства.

* Совершенствовать систему эпиднадзора за эндемичными для территории Российской Федерации ООВИ с постоянным мониторингом циркулирующих в природных очагах вариантов возбудителей, видового спектра хозяев и переносчиков.

* Постоянно проводить детальный анализ эпидпотенциала каждой из ООВИ с учетом новых научных и оперативных данных, а также возможности их заноса и укоренения на неэндемичной территории.

х Для оптимизации системы СОТ от ООВИ и обоснования принимаемых решений целесообразно создать действующие на постоянной основе комплексные группы аналитиков из специалистов различных профилей.

Таким образом, разработан общий подход к анализу значения (актуальности) особо опасных вирусных инфекций для санитарной охраны территории. Выделены критерии и признаки, по которым проводится анализ, что позволяет рассматривать и сопоставлять различные инфекции по одному плану Определены шесть категорий особо опасных вирусных инфекций, применение которых предусматривает три варианта уровней биологической защиты при планировании и проведении профилактических и противоэпидемических мероприятий.

С применением предложенных критериев, признаков и категорий впервые проведен сравнительный анализ 34 особо опасных вирусных инфекций с учетом общих принципов эпидемиологической оценки их актуальности для санитарной охраны территорий. Определен перечень 17 особо опасных вирусных инфекций (в том числе 9 контагиозных), в отношении которых целесообразно проведение мероприятий по санитарной охране территории, и дано распределение инфекций по категориям.

На основе изучения биологических и молекулярно-биологических свойств фило- и альфавирусов (вирус ВЭЛ) намечены общие подходы и тактические приемы совершенствования лабораторной диагностики вызываемых ими инфекций На моделях вирусов Эбола и Марбург оптимизирован метод флюоресцирующих антител для выявления специфических антигенов и антител, разработан метод клеточного иммуноферментного анализа. Предложена схема лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Эбола и Марбург. Схема апробирована в лабораторных условиях и на практике при анализе материала от больной М. из г Корсакова с диагнозом «геморрагическая лихорадка Марбург?».

Разработана общая схема лабораторного исследования материала при эпидемической вспышке (эпизоотии) неясной, предположительно вирусной, этиологии. Схема апробирована при изучении причин массовой гибели байкальской нерпы. Впервые установлена этиологическая роль морбилливирусов при эпизоотии водных млекопитающих, выделены и изучены штаммы морбилли-вируса, получившего название морбилливирус байкальской нерпы, проведено заражение природного хозяина и серологический мониторинг популяции.

Намечены направления дальнейшей оптимизации и совершенствования санитарной охраны территории от особо опасных вирусных инфекций.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны общие подходы по научному обоснованию санитарной охраны территории от особо опасных вирусных инфекционных болезней. Определены три критерия и 16 признаков для формирования перечня болезней, в отношении которых необходимо проведение мероприятий по санитарной охране территории.

2. Выделены три категории (группы) особо опасных вирусных инфекций, для которых требуется проведение однотипных профилактических и противоэпидемических мероприятий по санитарной охране территорий (контагиозные особо опасные инфекции I группы патогенности, контагиозные особо опасные инфекции II группы патогенности и неконтагиозные особо опасные инфекции).

3. На основании сравнительного анализа 34 особо опасных вирусных инфекций с учетом эпидемиологической оценки их актуальности для санитарной охраны территорий определен перечень 17 (в том числе 9 контагиозных), в отношении которых целесообразно проведение мероприятий по санитарной охране территории, и дано распределение инфекций по категориям. Установлено, что в случае заноса девяти возбудителей особо опасных вирусных инфекций на территории Сибири и Дальнего Востока имеются предпосылки формирования вторичных очагов.

4. На моделях возбудителей геморрагических лихорадок Эбола и Мар-бург in vivo и in vitro впервые изучены или уточнены их биологические свойства, что послужило основой для разработки и совершенствования методов лабораторной диагностики вызываемых ими заболеваний.

5. Изучена динамика экспрессии антигенов вирусов Марбург и Эбола в клетках Vero. Показана внутриштаммовая гетерогенность этих вирусов. Оптимизирован непрямой метод флюоресцирующих антител для выявления антигенов и антител к вирусам Эбола и Марбург. Разработан метод клеточного иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусам Эбола и Марбург и реакция нейтрализации для вируса Эбола. Отработан режим инактивации и методы контроля полноты инактивации вируссодержащего материла. На основе разработанных методов предложена схема лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Эбола и Марбург.

6. На модели вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей с применением комплекса биологических, биохимических, физико-химических и молекулярно-биологических методов детально изучена структура и свойства вирионов, субвирусных структур и белков Показана гетерогенность лабораторного штамма вируса по ряду свойств вирионов. Полученные данные являются основой для разработки диагностических тест-систем и проведения лабораторно-диагностических исследований.

7. Предложена общая схема анализа эпидемических вспышек (эпизоо-тий) неизвестной, предположительно вирусной, этиологии, включающая спектр систем первичной изоляции вируса, пермиссивных для известных эпидемически значимых вирусных агентов.

8. Схема исследования апробирована при расследовании причин эпизоотии среди байкальской нерпы. Впервые от водных млекопитающих выделены морбилливирусы и доказана их этиологическая роль. Изучены биологические свойства выделенных изолятов морбилливируса байкальской нерпы. На основе выделенных штаммов впервые для морбилливирусов водных млекопитающих отработаны реакция нейтрализации и непрямой метод флюоресцирующих антител, а также метод клеточного иммуноферментного анализа для определения специфических антител. С применением разработанных тест-систем проведен серологический мониторинг популяции нерпы.

9. Изучено состояние лабораторной базы региона Сибири и Дальнего Востока в связи с необходимостью выполнения задач по санитарной охране территории в отношении вирусных инфекций. Региональные базы для лабораторной диагностики возбудителей инфекций II группы патогенности целесообразно организовать на базе вирусологических лабораторий ЦГСЭН в г. Красноярске (для Восточной Сибири) и г. Владивостоке (для Тихоокеанского побережья и островных территорий), а также вирусологических лабораторий в Омском НИИ природноочаговых инфекций (Западная Сибирь), в Читинской (Забайкалье) и Хабаровской противочумных станциях (Дальний Восток) с возложением функций регионального организационно-методического центра на Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Соколова Т.М., ТитенкоА.М., ПосеваяТ.А., Петровский Г.В. Моле-кулярно-биологическая характеристика вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Сообщение 1. Очистка и физические свойства вируса// Арбо-вирусы. - М., 1975. - Вып. 2. - С. 95-98.

2. СоколоваТ.М., ЕршовФ.И., УрываевЛ.В., ТитенкоА.М., Клименко С.М., Посевая Т.А., Петровский Г.В. Молекулярно-биологическая характеристика вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Сообщение 2. Выделение и свойства вирионного РНП // Арбовирусы. — М., 1975. - Вып. 2. — С. 99-102.

3. YershovF.I., SokolovaТ.М., TitenkoA.M. Properties of virions and ribonucleoproteins of Venezuelan equine encephalomyelitis virus // Acta virologica. -1977. - Vol. 21. - P. 213-221.

4. Титенко A.M., Ершов Ф.И., Чепулис Г.К.С., Емельянов Б.А. Мяснен-ко A.M. Препаративное получение внутреннего белка вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей // Труды ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР. — 1979.-4 с.

5. ТитенкоА.М., МаныкинА.А., ЕршовФ.И. Выделение и некоторые свойства нуклеоидов вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей // Труды ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР. - 1979. - 4 с.

6. Емельянов Б. А., Чепулис Г.К.С., ТитенкоА.М., Мясненко A.M., Новохатский A.C. Приготовление антигенов и преципитирующих к ним сывороток для индикации вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей / / Труды ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР. - 1979. - 8 с.

7. Титенко А.М., Ершов Ф.И., Чепулис Г.К.С., Емельянов Б.А., Мяснен-коА.М. Сравнительное изучение различных методов концентрирования и очистки вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей // Труды ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР. - 1979. - 5 с.

8. Маныкин А.А., Титенко А.М., Ершов Ф.И. Электронно-микроскопическое исследование сердцевин альфавирусов и их РНК // Одиннадцатая всесоюзная конференция по электронной микроскопии. Тез. докл. — М.: Наука, 1979. -Т. 2.-С. 65.

9. Титенко А.М., Маныкин А.А., Ершов Ф.И., Клименко С.М. РНК ат-тенуированного варианта вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей // Стратегия генома РНК-содержащих вирусов животных. Тез. докл. межд. симп. -М., 1980.-С. 40-41.

10. Титенко А.М., Чумаков В.М., Ершов Ф.И., Калмансон А.Э. Изучение структурных характеристик оболочки вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей методом электронного парамагнитного резонанса // Вопр. вирусол. - 1980. - № 6. - С. 715-720.

11. Grigoriev V.B., TitenkoA.M, Tsilinsky Ya.Ya., KlimenkoS.M. The surface structure of Venezuelan equine encephalomyelitis virus // Arch. Virol. — 1980.-Vol. 63. -P. 165-169.

12. GrigorievV.B., TitenkoA.M., TsilinskiYa.Ya., KlimenkoS.M. Investigation about the surface structure of some viruses by the freeze-etching and freeze-drying methods // Acta gistochemica. — Suppl. — Bd. XXIII. — 1981. — S. 249-251.

13. Титенко A.M., Чумаков B.M., Ершов Ф.И., Калмансон А.Э. Исследование структурных характеристик белково-липидных оболочек некоторых вирусов методом ЭПР и спин-меток // Магнитный резонанс в биологии и медицине: Материалы Второго Всесоюзного симп., Тез. докл. — М., Черноголовка. - 1981. - С. 147-148.

14. Чумаков В.М., Титенко А.М., Цилинский Я.Я., Калмансон А.Э. Исследование методом спинового зонда модификации клеточных мембран, индуцируемой вирусами // Первый Всесоюзный биофиз. съезд Тез. докл. — М., 1982. -Т. 4, № 2558. -С. 102.

15. Зорин B.JL, КотенкоЮ.Г., КумаревВ.П., Титенко А.М., Борисова Т.И., ИшбаеваР.И. Иммунохимический анализ вирусной инфекции байкальской нерпы // Первая Верещагинская Байкальская междунар конф. -Иркутск, 1989. - 1 с.

16. Титенко А.М., Борисова Т.И., Зорин B.JL, Кумарев В.П. Эпизоотия у байкальских тюленей: изоляция морбилливируса и его возможная роль в заболеваемости животных // Морские млекопитающие: Материалы Десятого Всесоюзного совещания по изучению, охране и рациональному использованию морских млекопитающих. — М., 1990. — С. 297—298.

17. Титенко А.М., Зорин В.JI., Борисова Т.И., Солодун Ю.В., Кумарев В.П. Серологическое исследование сывороток крови нерп P. sibirica на присутствие антител к морбилливирусу байкальской нерпы // Иркутск. НИПЧИ. - Иркутск, 1990. - 19 с. - Деп. в ВИНИТИ 11.06.90 № 3297 - В В90.

18. Титенко А.М., БорисоваТ.И., Зорин В.Л., Солодун Ю.В., Петров Е.А., Иванов М.К., Маликов Н.Г., Котенко Ю.Г., Кумарев В.П. Антите-

ла к морбилливирусу у природного хозяина // Вопр. вирусол. - 1990. - N° 6. -С. 502-503.

19. ТитенкоА.М., БорисоваТ.И., Зорин В.JI., Чипанина В.М., Колесник В С., Колесник P.C., ИшбаеваР.И., Капустин Ю.М., Грачев М.А., Го-лубинский Е.П., БеймА.М., КуделинВ.М., Кумарев В П. Выделение мор-билливируса от байкальской нерпы P.sibirica и его предварительная характеристика // Вопр вирусол. - 1991. - № 1. - С. 57-59.

20 Титенко A.M. Геморрагическая лихорадка Марбург // Журн. микро-биол. - 1991. - № 5. - С. 67-71.

21 Титенко AM., Борисова Т.И., БеймА.М., Новожилов С.С., Куде-лин В.М., Зорин В JI., Колесник B.C. Экспериментальное заражение нерпы Р sibirica морбилливирусом // Вопр. вирусол. - 1991. — № 6. — С. 511—512.

22. Борисова Т.И., ТитенкоА.М. Морбилливирусная инфекция у байкальских тюленей // Состояние здоровья населения города Иркутска в связи с техногенным загрязнением окружающей среды: Матер, конф. — Иркутск, 1991.-С. 26.

23. ТитенкоА.М., Борисова Т.И., Зорин В. JI., Чипанина В.М., Кумарев В.П Изоляция морбилливируса от нерпы P. sibirica // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. - Новосибирск: Наука, 1992 - С. 47-51.

24. ТитенкоА.М, Зорин В.Л., БорисоваТ.И , Солодун Ю.В., Кумарев В.П. Серологическое исследование сывороток байкальской нерпы на присутствие антител к ее морбилливирусу // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. - Новосибирск: Наука, 1992. - С. 53-60.

25. Титенко A.M., Новожилов С.С., АндаевЕ.И., Борисова Т.И., Куликова Е В Репродукция вируса Эбола в клеточных культурах // Вопр. вирусол.-1992 — № 2. — С. 110-113.

26. ТитенкоА.М., Борисова Т.И., Андаев Е.И , Новожилов С.С., Куликова Е.В. Культивирование вируса Марбург в клетках Vero // Иркут. НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока. - Иркутск, 1992. - 13 с. - Деп. ВИНИТИ 22.05.92.№1897-В92.

27. Андаев Е. И., Куликова Е В., Новожилов С.С., Борисова Т.И., ИшбаеваР.И , ТитенкоА.М. Получение и характеристика иммунных сывороток к вирусам Марбург и Эбола // Иркут. НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока. - Иркутск, 1992. - 12 с. - Деп. ВИНИТИ 22.05.92.№1697-В92.

28. ТитенкоА.М., АндаевЕ.И., ИшбаеваР.И, Борисова Т.И., Новожилов С.С., Куликова Е.В. Клеточный иммуноферментный метод анализа специфических антител к вирусам Марбург и Эбола // Иркут. НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока. - Иркутск, 1992 — 10 с. - Деп ВИНИТИ 22.05.92.№1698-В92.

29. Новожилов С.С., Титенко A.M., Борисова Т.И., Андаев Е.И., Куликова Е В , Ишбаева Р И Вируснейтрализуюшие антитела в сыворотках морских свинок, иммунизированных вирусом Эбола (штамм Заир) // Иркут. НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока - Иркутск, 1992. - 14 с - Деп ВИНИТИ 22.05.92, № 1699-В92.

30. ТитенкоА.М, Новожилов С С., АндаевЕ.И, БорисоваТИ., ИшбаеваР.И., Куликова Е.В., Кононенко Е.В. Вирулентность филовирусов (Марбург и Эбола) в эксперименте и лабораторная диагностика этих ин-

фекций // Генет и биохим. вирулен. возб. особо опасн. инф.: Матер Всесоюзной конф - Волгоград, 1992. - С. 169.

31. Титенко A.M., Новожилов С.С., Андаев Е.И., Борисова Т.И., Куликова Е.В., Ишбаева Р.И. № Г.Р. 01880009517. «Изучение биологических и мо-лекулярно-биологических свойств вирусов семейства филовириде» // Иркут. НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока. — Иркутск, 1992. - 130 с.

32. Титенко А.М , БорисоваТ.И. Массовая гибель байкальских нерп, вызванная морбилливирусом // Проблемы патологии и охраны здоровья диких животных: Матер, междунар. симп. — М., 1992. — С. 52—54.

33. Barrett Т., CrowtherJ., Osterham A.D.M.E., Subbarao S M., Groen J., HaasL., MamaevL.V , TitenkoA.M., Visser I.K.G., BostockC.J. Molecular and serological studies on the recent seal virus epizootics in Europe and Siberia // Science of the total Environment. - 1992. -Vol. 115. - P. 117-132.

34. Новожилов С.С., Андаев Е.И., Борисова Т.И., Ишбаева Р.И., Титенко A.M. Стандартизация метода бляшкообразования для титрования инфекционное™ вирусов Марбург и Эбола // Материалы конференции, посвященной 70-летаю образования санэпидслужбы Иркутской обл. — Иркутск,

1993.-С. 75-77.

35. Андаев Е.И., Новожилов С.С., Титенко A.M., Борисова Т.И., Куликова Е.В., Ишбаева Р.И. Динамика антателообразования у морских свинок, инфицированных вирусами Марбург и Эбола // Материалы конференции, посвященной 70-летаю образования санэпидслужбы Иркутской обл. — Иркутск, 1993. - С. 77-78.

36. Титенко А.М., Андаев Е.И., Новожилов С.С., Борисова Т.И., Куликова Е В., Кононенко Е В. Лабораторная диагностака инфекций, вызываемых вирусами Марбург и Эбола // Материалы конференции, посвященной 70-летаю образования санэпидслужбы Иркутской обл. — Иркутск, 1993. — С. 78—80.

37. Борисова Т.И., Лескова В.В., Новожилов С.С., Титенко A.M. Нейтрализующие морбилливирус антатела в популяции байкальских нерп // Вопр. вирусол. -1993. - № 1. - С. 28-30.

38. Борисова Т И., Титенко A.M. Выявление специфических антател к морбилливирусу байкальской нерпы методом клеточного иммунофермент-ного анализа // Проблемы природноочаговых и зоонозных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке: Матер, конф. - Чита, 1993 - С. 18-19.

39. Титенко А. М. Геморрагическая лихорадка Эбола//Журн. микроби-ол. - 1993. - № 3. - С. 99-105.

40. Борисова Т.И., Титенко А М. Антатела к морбилливирусу у тюленей Байкала через шесть лет после начала эпизоотаи // Актуальные проблемы проф особо опасн природно-очаговых инфекц болезней. — Иркутск, 1994. -С. 15-16.

41. TitenkoA.M., BorisovaT.I. Morbillivirus infection in Lake Baikal Phoca sibirica population // Ninth International Conference on Negative Strand Viruses. - Estoril, Portugal, 1994. - P. 155.

42. Куликова E В., Андаев E И., Борисова Т.И., Титенко A.M. Чувствительность морских свинок к вирусам Эбола и Марбург // Актуальные проблемы проф. особо опасн природно-очаговых инфекц. болезней. — Иркутск,

1994.-С. 85-86.

43 Титенко A.M., Трухина А.Г. Итоги и перспективы вирусологических исследований в Иркутском противочумном институте // Актуальные проблемы проф особо опасн. природно-очаговых инфекн. болезней: Тез. докл. — Иркутск, 1994. - С. 154-156.

44. Титенко A.M., Ботвинкин А.Д. Задачи противочумных учреждений в системе эпиднадзора за вирусными инфекциями в Сибири и на Дальнем Востоке // Актуальные проблемы проф особо опасн природно-очаговых инфекц. болезней: Тез. докл. — Иркутск, 1994. — С. 150—151.

45. Титенко AM , Андаев Е.И , Борисова Т.И., Куликова Е.В. Вирусы Эбола и Марбург и лабораторная диагностика вызываемых ими заболеваний // Матер. Всероссийской науч.-практич. конф , посвящ. 100-летию образования противочумной службы России. — Саратов, 1997. — Т. 2. — С. 222—223.

46 Титенко A.M., Ботвинкин А.Д. Эпиднадзор за особо опасными вирусными инфекционными болезнями в Сибири и на Дальнем Востоке // Журн. инф. патол. - Иркутск, 1997. - Т. 4, № 1. - С. 36-38.

47. Титенко A.M., Андаев Е.И., Куликова Е.В., Борисова Т.И. Вирусы Марбург и Эбола: биологические свойства и разработка методов лабораторной диагностики // Журн. инф. патол. - Иркутск, 1998. - Т. 5, № 4 - С. 75-79.

48 Титенко А.М , Борисова Т.И , Андаев Е.И., Куликова Е.В. Культивирование вируса Марбург в клетках Vero // Журн. инф. патол. — Иркутск, 1998. -Т. 5, №4. -С. 80-82.

49. Онищенко Г.Г., Ботвинкин А.Д., Голубинский Е.П., Данилен-коА.Ф., ИвановаJI.К., ИнокентьеваТ.И., Калиновский А.И., Макеев С.М., Марамович A.C., Мирончук Ю.В., Михеев В Н., Родзиковский A.B., Титенко A.M., Урбанович Л.Я , Чеснокова М.В. Актуальные проблемы эпидемиологии инфекционных болезней в Сибири / Под ред член-корр. РАМН, проф. Г.Г. Онищенко. - М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 213 с.

50. TitenkoA.M., BotvinkinA.D., AndaevE.I. Tick-borne encephalitis epidemiology in some provinces of Siberia // Zent. Bakteriol. - 1999. - Vol. 289. -P. 595-604.

51. Титенко A.M. Санитарно-эпидемиологическая охрана территории от вирусных инфекций и туризм // Актуальные проблемы обеспечения здоровья международных путешественников: Матер, междунар. научно-практической конф., Улан-Уде, 7-8 августа 2001. - Иркутск, 2001. - С. 46-48.

52. Титенко A.M., БахумС.В., Андаев Е И., Борисова Т.И Природно-очаговые инфекции Байкальского региона как факторы риска для туристов // Актуальные проблемы обеспечения здоровья международных путешественников: Матер, междунар научно-практической конф , Улан-Уде, 7-8 августа 2001.-Иркутск, 2001.-С. 130-131.

53. Титенко AM , Андаев Е.И. Актуальные проблемы санитарной охраны территории от завоза и распространения новых и вновь возникающих вирусных инфекций человека // Журн инф патол. - Иркутск, 2001. - Т. 8, № 2-3. - С. 32-43

54. Титенко A.M., Андаев Е.И., Борисова Т.И. Динамика экспрессии антигенов вирусов Марбург и Эбола в инфицированных клетках Vero // Вопр. вирусол. - 2001. - Т. 46, № 6. - С. 43-45.

55. Титенко А.М., Андаев Е.И., Борисова Т.И. Определение специфических антител к вирусам Эбола и Марбург методом клеточного иммунофер-ментного анализа // Биотехнология. - 2002. — № 2. - С. 75—78.

56. TitenkoA.M., Botvinkin A.D., AndaevE.I. Tick-borne diseases in the Lake Baikal region // Int. J. Med. Microbiol. - 2002. - Vol. 291, N 33. - P. 187.

57. Титенко A. M. Филовирусные геморрагические лихорадки: лихорадка Эбола // Журн. микробиол. - 2002. - № 5. - С. 116-122.

58. Титенко A.M. Общие для человека и животных особо опасные вирусные инфекции как источник возникновения чрезвычайных ситуаций // Ветеринарная патология. - 2002. — № 2. — С. 111—114.

59. Титенко A.M. Санитарная охрана территории от завоза и распространения вирусных инфекций. Сообщение 1. Современные подходы // Пробл. особо опасных инфекций: Сб. науч. тр. / Под ред. В. В. Кутырева. — Саратов, 2002. - Вып. 84. - С. 144-150.

60. Титенко A.M., Борисова Т.И. Антигенная характеристика изолятов морбилливируса байкальской нерпы // Вопр. вирусол. - 2003. — № 2. — С. 46—48.

61. Титенко А.М., Ботвинкин А.Д., Андаев Е.И. Санитарная охрана территории от завоза и распространения вирусных инфекций. Сообщение 2. Критерии для анализа нозологических форм // Пробл. особо опасных инфекций: Сб. науч. тр. / Под ред. В.В. Кутырева. - Саратов, 2003. - Вып. 85. - С. 41-49.

62. Титенко А.М. Общие подходы к санитарно-эпидемиологической охране территории от завоза и распространения особо опасных вирусных инфекций // Бюл. ВСНЦ СО РАМН - 2003. - № 3. - С. 180-185.

63. Титенко А.М. Санитарная охрана территории от завоза и распространения вирусных инфекций. Сообщение 3. Дифференциация инфекций по категориям значимости // Пробл. особо опасных инфекций: Сб. науч. тр. / Под ред. В.В. Кутырева. - Саратов, 2004. - Вып. 86. - С. 48-53.

64. Титенко А.М. Факторы, способствующие появлению и обнаружению новых вирусных инфекций // Эпидемиол. и инф. болезни. — 2004. — № 1. — С. 51-55.

65. Онищенко Г Г., Титенко A.M. Актуальные направления совершенствования санитарно-эпидемиологической охраны территории от завоза и распространения особо опасных вирусных инфекций // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. — 2004. — Т. 4, № 1.-С. 110-116.

66. Онищенко Г.Г., Голубинский Е.П., Ботвинкин А.Д., Марамович А.С., Титенко A.M., КосилкоС.А. Тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС) — новое инфекционное заболевание и основные проблемы, связанные с его профилактикой в азиатской части России // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. -2004.-Т. 4, №1.- С. 7-17.

67. Андаев Е.И., Титенко A.M., Ботвинкин А.Д. Эпидемиологический надзор за особо опасными вирусными инфекциями в Восточной Сибири // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2004. - Т. 3, № 1. - С. 79-85.

68. Титенко А.М., Андаев Е.И. Оценка вероятности завоза контагиозных особо опасных вирусных инфекций на территорию Российской Федерации / / Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны: Материалы конф. посвящ. 70-летию Противочумного центра. — М., 2004. — С. 221—224.

Подписано в печать 11.07.2005 Бумага офсетная. Формат 60x84V16-Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,1 _Тираж 100 экз. Заказ № 102-05_

РИО НЦ PBX ВСНЦ СО РАМН (Иркутск, ул Борцов Революции, 1. Тел. 29-03-37)

f f 8 117.

РНБ Русский фонд

2006-4 16696

Оглавление диссертации Титенко, Алексей Михайлович :: 2005 :: Иркутск

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К САНИТАРНОЙ ОХРАНЕ ТЕРРИТОРИИ ОТ ЗАВОЗА И РАСПРОСТРАНЕНИЯ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ.

1.1. Международные и национальные медико-санитарные правила.

1.2. Изменения эпидемиологической активности вирусных инфекций. Новые и вновь возвращающиеся особо опасные вирусные инфекции.

1.3. Изучение фундаментальных свойств возбудителей особо опасных вирусных инфекций и разработка методов их лабораторной диагностики как одна из основных составляющих санитарной охраны территории.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Сбор и анализ эпидемиологических данных.

2.2. Экспериментальные животные и клеточные культуры.

2.3. Методы работы с филовирусами.

2.4. Методы работы с альфавирусами.

2.5. Методы работы с морбилливирусами.

ГЛАВА 3. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ОЦЕНКИ ЗНАЧИМОСТИ ОСОБО ОПАСНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ДЛЯ САНИТАРНОЙ ОХРАНЫ ТЕРРИТОРИИ.

3.1. Разработка критериев и признаков для анализа нозологических форм особо опасных вирусных инфекций.

3.2. Категории особо опасных вирусных инфекций в соответствии с их значимостью для санитарной охраны территории.

ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОСОБО ОПАСНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ С УЧЕТОМ ОБЩИХ ПРИНЦИПОВ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ИХ АКТУАЛЬНОСТИ ДЛЯ САНИТАРНОЙ ОХРАНЫ ТЕРРИТОРИИ.

4.1. Оценка вероятности заноса контагиозных особо опасных вирусных инфекций с эндемичных территорий.

4.2. Контагиозные инфекции.

4.3. Неконтагиозные инфекции.

4.4. Новые и малоизученные инфекции.

4.5. Особо опасные вирусные инфекции, эндемичные для отдельных территорий России.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО - БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСОВ, РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОСОБО ОПАСНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ (НА МОДЕЛЯХ ФИЛОВИРУСОВ И АЛЬФАВИРУСОВ).

5.1. Вирус Марбург.

5.1.1. Репродукция в клеточных культурах.

5.1.2. Экспериментальные модели инфекции.

5.1.3. Применение иммуио-серологических методов для лабораторной диагностики.

5.2. Вирус Эбола.

5.2.1. Репродукция в клеточных культурах.

5.2.2. Экспериментальные модели инфекции.

5.2.3. Применение иммуно - серологических методов для лабораторной диагностики.

5.3. Инактивация инфекционного материала и его контроль на специфическую безопасность.

5.4. Схема лабораторной диагностики геморрагических лихорадок

Эбола и Марбург.

5.5. Альфавирусы.

5.5.1. Характеристика вирионов и субвирусных компонентов вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей.

5.5.2. Структурные особенности и гетерогенность вирионов альфавирусов.

ГЛАВА 6. ОБЩИЙ ПОДХОД К АНАЛИЗУ ЭПИЗООТИЙ И ЭПИДЕМИЧЕСКИХ ВСПЫШЕК НЕЯСНОЙ, ПРЕДПОЛОЖИТЕЛЬНО ВИРУСНОЙ ЭТИОЛОГИИ (НА ПРИМЕРЕ РАССЛЕДОВАНИЯ ПРИЧИН ЭПИЗООТИИ НЕИЗВЕСТНОЙ ЭТИОЛОГИИ).

6.1. Общие подходы и тактические приемы лабораторной диагностики при вспышке инфекционных заболеваний неясной, предположительно вирусной этиологии.

6.2. Характеристика эпизоотии среди тюленей Байкала.

6.3. Выделение и идентификация вирусов.

6.4. Экспериментальное изучение изолятов морбилливирусов.

6.5. Разработка методов.лабораторной диагностики и мониторинг популяции тюленей.

6.6. Оценка состояния лабораторной базы региона в связи с выполнением задач по санитарной охране территории в отношении вирусных инфекций.

Введение диссертации по теме "Эпидемиология", Титенко, Алексей Михайлович, автореферат

Актуальность проблемы

Санитарная охрана территории (СОТ) представляет систему общегосударственных мероприятий, направленных на предотвращение заноса из-за рубежа и распространения на территории страны особо опасных инфекций, ограничение и ликвидацию очагов этих болезней при их выявлении [111]. Проблема СОТ -комплексная, решается органами законодательной и исполнительной власти, а также специалистами различной направленности [20, 80, 87, 102, 127].

Как известно, вспышки особо опасных вирусных инфекций (ООВИ) регистрируются не только в пределах естественных нозоареалов, но и на неэндемичных территориях вследствие заноса вирусов людьми или животными. Перечень ООВИ, на которые распространяются правила по СОТ, традиционно определяется контагиозностью, тяжестью заболевания, уровнем летальности, а также количеством больных при эпидемических вспышках [26, 43, 87, 139]. В настоящее время в этот перечень в РФ входит семь ООВИ. Вместе с тем, по действующим Санитарным правилам СП 1.3. 1285 - 03 к особо опасным вирусам I-II групп патогенности отнесены свыше 90 инфекционных агентов. Проведение анализа значения ООВИ для СОТ и планирование противоэпидемических мероприятий осложняется тем, что, как отмечал ранее Б.Л. Черкасский, «. не приведены критерии, согласно которым возбудитель отнесен к той или иной группе патогенности. Не определено, чем эти возбудители отличаются друг от друга (кроме их таксономического положения) и почему регламентируется разной степени строгости режим работы с ними» [132]. Накопленные за последние годы сведения по целому ряду ООВИ существенно меняют представления о реальной опасности некоторых инфекций.

Таким образом, актуальность работы определяется необходимостью комплексного анализа накопленной за последние 20-30 лет информации об ООВИ с точки зрения возможности их завоза на территорию РФ и возникновения вторичных очагов инфекций. В условиях расширения и активизации международных связей такая работа позволит дать обоснованные рекомендации по повышению готовности органов и служб здравоохранения к проведению мероприятий по СОТ. Для реализации такого подхода целесообразно определить критерии и признаки, которые позволили бы провести анализ каждой конкретной ООВИ, уточнить и обосновать круг инфекций, в отношении которых целесообразно проведение мероприятий по СОТ, а также сгруппировать их по значимости в пределах перечня. Это даст возможность, с одной стороны, наиболее полно определить круг вирусных инфекций, которые представляют опасность с точки зрения завоза и распространения на территории РФ, с другой, - в каждом случае конкретизировать необходимый и достаточный комплекс профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Важной составляющей проблем СОТ представляется изучение общих биологических свойств и структуры возбудителей ООВИ. Такие сведения, помимо их фундаментального значения, важны еще в нескольких аспектах. Во-первых, на их основе разрабатываются методы лабораторной диагностики ООВИ, без чего невозможно решение вопросов СОТ. Во-вторых, накапливаются данные о высокой степени гетерогенности циркулирующих в природе вариантов, по крайней мере, некоторых возбудителей ООВИ, что необходимо учитывать при проведении полноценного лабораторно-диагностического исследования. В-третьих, для большинства ООВИ характерно отсутствие специфических симптомов, что не позволяет поставить корректный диагноз и реализовать этиологический подход в рамках СОТ без лабораторно-диагностических исследований. Наконец, вопросы изоляции и идентификации возбудителей ООВИ постоянно возникают в связи с выделением группы «новых и вновь возвращающихся инфекций», большая часть которых вызывается вирусными агентами [43, 58, 63, 65, 88, 112, 136, 137, 243]. Важно оперативное включение данных по этой группе ООВИ для рассмотрения их актуальности в плане СОТ. Серьезные вопросы возникают в связи с возможным применением ООВИ в диверсионно-террори-стических целях [89]. В этой связи особое внимание должно уделяться расследованию причин эпидемий и эпизоотий неизвестной, предположительно вирусной этиологии. Следовательно, целесообразна отработка общих подходов к эпид-расследованию подобных ситуаций и анализ возможной роли ООВИ в возникновении чрезвычайных ситуаций (ЧС).

Цель исследования

Задачи исследования

1. Разработать критерии и обоснования для дифференцированного анализа особо опасных вирусных инфекций с точки зрения их актуальности для санитарной охраны территории.

Научная новизна исследований

Изучены биологические свойства вирусов Эбола и Марбург. В плане разработки экспериментально-биологической модели изучена чувствительность морских свинок различного возраста к заражению вирусами Марбург и Эбола. Показано, что при серийных пассажах вирусов Эбола и Марбург возрастает вирулентность вирусов с сокращением инкубационного периода. Впервые показаны изменения морфологии бляшек, образованных вирусами после серийных пассажей на морских свинках. Изучена динамика образования специфических антител у морских свинок, иммунизированных вирусами Марбург и Эбола. Получены антисыворотки морских свинок с высоким титром специфических антител. Впервые показана индукция вируснейтрализующих антител у морских свинок, инфицированных вирусом Эбола, и разработан метод их определения.

С целью оптимизации подходов к лабораторной диагностике ООВИ изучены культуральные свойства вирусов Эбола (штамм Заир) и Марбург (штамм Voege), адаптированных к перевиваемым клеточным культурам Vero и BGM. Отмечено и описано цитопатогенное действие вирусов. Впервые изучена динамика репродукции вирусов Марбург и Эбола в культуре клеток при высокой и низкой множественности инфицирования. Определены сроки максимального накопления вируса в культуральной жидкости, его титры. Впервые показана гетерогенность популяции вирусов Марбург и Эбола по признаку формирования бляшек и по репродукции в культуре клеток Vero. Впервые изучена динамика экспрессии антигенов вирусов Марбург и Эбола в клетках Vero. Полученные данные послужили основанием для оптимизации непрямого метода флуоресцирующих антител. Впервые разработаны для вирусов Эбола и Mapбург диагностические методы - клеточный иммуноферментный анализ для выявления антител и реакция нейтрализации (для вируса Эбола). Отработаны режимы инактивации вируссодержащего материла, контролей полноты инактивации. На основе разработанных методов предложена схема лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Эбола и Марбург.

Проведено детальное изучение структуры и состава вирионов и субвирусных компонентов вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ). Впервые определен или уточнен ряд физико-химических параметров вирионов вируса ВЭЛ. Установлено, что константа седиментации вирионов составляет 265 S, плавучая плотность в сахарозе - 1,18-1,19 г/см3, в хлористом цезии -1,19-1,21 г/см , изоэлектрическая точка вирионов - pl=6,5. Методом электронного парамагнитного резонанса показано, что вирионы ВЭЛ содержат двухслойную липидную мембрану, жесткость которой выше, чем у цитоплазмати-ческих мембран клетки-хозяина. Разработаны методы препаративного получения очищенных вирионов вируса ВЭЛ, оболочек и сердцевин вируса. Впервые определен белковый состав исследованного штамма вируса ВЭЛ и разработан метод получения миллиграммовых количеств высокоочищенного белка С -группоспецифического антигена альфавирусов. Впервые показано, что вири-онный рибонуклеопротеид (РНП) существует в форме сердцевин вируса и при действии высокой температуры, замораживания-оттаивания, малых концентраций додецилсульфата натрия и ЭДТА распадается на РНК и белок. Впервые определены физико-химические параметры сердцевин вируса и проведено детальное исследование их структуры и стабильности. Константа седиментации сердцевин вируса ВЭЛ - 153 S, плавучая плотность в сахарозе (на ДгО) - 1,34 г/см3, в хлористом цезии - 1,41 г/см3. Выделенные вирусные антигены пригодны для получения кроличьих антисывороток, что закладывает основу для конструирования диагностических тест-систем. С применением комплекса вирусологических, молекулярно-биологических и электронно-микроукопических методов впервые показано, что лабораторные пулы вируса ВЭЛ одного и того же штамма гетерогенны по биологическим свойствам, полипептидному составу и особенностям структуры вирионов.

Предложена и апробирована общая схема анализа материала при расследовании вспышки инфекционного заболевания неизвестной, предположительно вирусной, этиологии. С применением этой схемы проведено изучение причин массовой гибели тюленей Байкала с целью определения опасности эпизоотии для населения и животных. Впервые доказана этиологическая роль морбилливи-русов при эпизоотиях водных млекопитающих. От больных и павших животных выделены и охарактеризованы 4 штамма неизвестного ранее вируса, который получил название морбилливирус байкальской нерпы (МБН). Показана антигенная гетерогенность вариантов МБН, циркулирующих в популяции байкальских тюленей. На основе выделенных штаммов МБН сконструирована иммунофер-ментная тест-система для серодиагностики МБН и впервые проведен серологический мониторинг популяции.

Теоретическая и практическая значимость

Разработка критериев значимости ООВИ для СОТ позволяет дать теоретическое обоснование для определения группы патогенности ООВИ и отбора ООВИ для включения в перечень «санохранных» инфекций. Выделение категорий ООВИ дает теоретическую основу разработки трех вариантов профилактических и противоэпидемических мероприятий, отличающихся по жесткости проводимых действий. Применение аналогичного подхода дает основания для рассмотрения значения ООВИ как непосредственной причины возникновения ЧС, так и в плане усугубления ЧС неинфекционного характера эпидосложне-ниями, а также для планирования мероприятий по ликвидации ЧС. Теоретический интерес представляют также полученные в ходе выполнения работы фундаментальные данные по биологическим и молекулярно-биологическим свойст вам фило-, альфа- и морбилливирусов. Эти результаты послужили основой для формирования схемы лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Эбола и Марбург, также как и общей схемы исследования мате-риала при эпидемии (эпизоотии) неизвестной, предположительно вирусной, этиологии. В целом проведенное исследование закладывает теоретические основы совершенствования мероприятий по СОТ от ООВИ.

Практическое значение работы заключается в следующем. На моделях вирусов Эбола и Марбург усовершенствованы подходы к лабораторной диагностике вызываемых ими инфекций. Отмеченный цитопатический эффект вирусов Эбола и Марбург на клетках Vero и BGM позволяет титровать инфекционность вируса по цитопатогенному действию. С использованием метода образования бляшек возможно определять инфекционную активность при изучении процессов размножения вируса. Способность вируса формировать бляшки под агаровым покрытием также может быть использована для получения клонированных пулов вирусов. Сведения о гетерогенности популяции вируса по признаку формирования бляшек позволяют изучать генетические различия вирусных клонов. Данные по экспрессии вирусспецифических антигенов в культуре клеток дают возможность определить оптимальные сроки приготовления слайд-антигенов и правильно оценивать результаты выявления антигенов вирусов Эбола и Марбург в инфицированных клетках методом флуоресцирующих антител. Разработанный метод клеточного ИФА применен при выявлении антител к вирусам Эбола и Марбург в сыворотках крови. Метод имеет преимущество перед традиционным твердофазным иммуноферментным анализом, так как для его постановки не требуется получения очищенного антигена в условиях максимальной биологической защиты. Полученные данные по чувствительности морских свинок различного возраста к заражению вирусами Эбола и Марбург позволили подобрать эффективные схемы иммунизации и дали возможность получить специфические высокоактивные антисыворотки к этим вирусам. Выявление у зараженных морских свинок нейтрализующих вирус Эбола антител дает основания для разработки вакцин и специфических противовирусных иммунопрепаратов. Получены варианты вирусов Эбола и Марбург с различной вирулентностью для морских свинок, а также адаптированные к клеточным культурам. Эти варианты вирусов хранятся в музее живых культур Иркутского НИПЧИ.

С учетом мирового опыта и в результате собственных разработок создана лабораторная система максимальной биологической защиты, которая подтвердила свою эффективность при работе с возбудителями геморрагических лихорадок Эбола и Марбург. Разработанный и апробированный метод контроля на специфическую безопасность in vivo и in vitro позволяет проводить оценку полноты инактивации инфекционного материала, что при работе с вирусами I-II групп патогенности является необходимым этапом при выносе инактивированного материала на чистую зону.

На моделях геморрагических лихорадок Эбола и Марбург разработана схема лабораторной диагностики этих инфекций, позволяющая при исследовании материала выявлять как вирулентные, так и слабовирулентные варианты вирусов и проводить их идентификацию. Схема отработана в лабораторных условиях и испытана на практике при обследовании больной М. из г. Корсакова с диагнозом «геморрагическая лихорадка Марбург?».

С целью отработки методических подходов к созданию лечебно-профилактических и диагностических препаратов на модели вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей показана необходимость проведения комплексного моле-кулярно-биологического изучения вирионов и структурных компонентов вируса. Результаты определения физико-химических параметров вирионов и структурных компонентов вируса ВЭЛ и разработанные методы выделения и очистки указанных структур имеют практическую значимость для учреждений, занимающихся исследованием альфавирусов. Методы очистки вирионов, препаративного получения оболочек и сердцевин вируса, а также группоспецифического антигена альфавирусов - белка С - могут быть использованы в лабораториях, занимающихся получением антигенов альфавирусов как для их диагностики, так и при разработке субъединичных вакцин. Выявленная гетерогенность как лабораторных штаммов (вирус ВЭЛ и филовирусы), так и вариантов вируса, циркулирующих одновременно во время эпизоотии (морбилливирусы), имеет серьезное практическое значение при планировании и проведении лабораторно-диагно-стических исследований.

Определены подходы к расшифровке вспышек инфекционных заболеваний неясной, предположительно вирусной этиологии. Разработана комплексная схема изоляции вирусов в системах с различной пермиссивностью. Схема анализа материала апробирована при расследовании причин массовой гибели байt кальской нерпы. От больных и погибших животных выделен возбудитель и определена его таксономическая принадлежность. Четыре авторских штамма МБН, выделенные от тюленей, хранятся в музее живых культур Иркутского НИПЧИ. С использованием выделенных нами штаммов разработан метод клеточного иммуноферментного анализа и применен для серодиагностики этой инфекции и мониторинга популяции нерпы в озере Байкал.

Результаты исследований нашли отражение в приведенных ниже документах:

1. Методические рекомендации по проверке герметичности боксов биологической защиты и эффективности работы бактериальных фильтров в системе вентиляции (утверждены заместителем Председателя Госкомсанэпиднадзора России Г.Г. Онищенко № 01-19/41-17 от 17.03.96).

2. Руководство по противоэпидемическому режиму работы с особо опасными вирусами I группы. Иркутск, 1991, 22 с. (одобрено ученым советом Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока 24.06.91 и утверждено директором института Е.П. Голубинским 15.07.91).

3. Методическое пособие по лабораторной диагностике возбудителей геморрагических лихорадок Эбола и Марбург (утверждено заместителем Председателя Госкомсанэпиднадзора России Г.Г. Онищенко № 01-19/35-17 от 17.03.96).

4. Методическое пособие «Мониторинг морбилливирусов у тюленей Байкала» (утверждено заместителем Председателя Госкомсанэпиднадзора России Г.Г. Онищенко № 01 - 19/32 - 17 от 17.03.96.

5. Программа цикла усовершенствования врачей «Актуальные проблемы эпиднадзора за особо опасными и природно-очаговыми вирусными инфекциями» (утверждена заместителем начальника Управления подготовки и использования кадров Госкомсанэпиднадзора России 14 августа 1995 г.).

6. Руководство по специальной подготовке специализированных противоэпидемических бригад для работы в чрезвычайных ситуациях (утверждено Первым заместителем Министра здравоохранения РФ, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31.01.99 г.

3.4.1028-01. Минздрав России. Москва, 2002. (утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 06.04.01 г.).

8. Эпидемиология. Санитарно-эпидемиологические правила. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). СП 1.3. 1285 -03 (утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12.03.03 г.).

10. Материалы исследований широко используются при чтении лекций по микробиологии и вирусологии на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при Иркутском НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока.

Основные положения диссертации, выносимые на защит}'

2. Систематизированы важные с точки зрения санитарной охраны территории сведения для 34 особо опасных вирусных инфекций. Уточнен^ ареалы возбудителей, круг хозяев и переносчиков, вероятность заноса инфекции с формированием вторичных очагов. Пересмотрен перечень болезней, в отношении которых целесообразно проведение мероприятий по санитарной охране территории.

3. Получены новые фундаментальные данные о биологических свойствах вирусов 1-Й групп патогенности (филовирусы, альфавирусы), имеющих значение для совершенствования методов лабораторной диагностики и биологической защиты. Результаты исследований послужили основой разработки методов и схемы лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Эбола и Марбург, пригодных для применения в очагах инфекиий.

4. Разработана общая схема лабораторного исследования материала при эпидемических вспышках (эпизоотиях) неизвестной, предположительно вирусной, этиологии. На примере внезапно возникшей массовой гибели нерп Байкала апробированы принципиальные подходы к расследованию причин эпидемических вспышек (эпизоотий) неизвестной этиологии.

Апробация материалов диссертации

Результаты исследований представлены:

- Одиннадцатая Всесоюзная конференция по электронной микроскопии. -М., 1979;

- Стратегия генома РНК-содержащих вирусов животных. Международный симпозиум. - М., 1980;

- Второй Всесоюзный симпозиум «Магнитный резонанс в биологии и медицине». - Черноголовка, 1981;

- Первый Всесоюзный биофизический съезд. - М., 1982;

- Первая Верещагинская Байкальская международная конференция. - Иркутск, 1989; f

- 10 Всесоюзное совещание по изучению охране и рациональному использованию морских млекопитающих. - М., 1990;

- Состояние здоровья населения города Иркутска в связи с техногенным загрязнением окружающей среды. - Иркутск, 1991;

- Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. - Волгоград, 1992;

- Международный симпозиум «Проблемы патологии и охраны здоровья диких животных». - М., 1992;

- Научно-практическая конференция, посвященная 70-летию образования санэпидслужбы Иркутской области. - Иркутск, 1993;

- Научно-практическая конференция «Проблемы природноочаговых и зоо-нозных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке». - Чита, 1993;

- Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы профилактики особо опасных природно-очаговых инфекционных болезней». - Иркутск, 1994;

- Ninth International Conference on Negative Strand Viruses. - Estoril, Portugal, 1994;.International Scientific conference "Tick-borne viral, rickettsial and bacterial infections". - Irkutsk, 1996;

- Научно-практическая конференция, посвященная 100-летию образования противочумной службы России. - Саратов, 1997;

- 5-th International Potsdam Symposium on Tick-borne Diseases. «Tick-borne Encephalitis and Lyme Borreliosis». - Berlin, Germany, 1999;

- Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы обеспечения здоровья международных путешественников». - Улан-Удэ, 2001;

- 6-th International Potsdam Symposium on Tick-borne Diseases. - Berlin, Germany, 2001;

- Научно-практическая конференция «Здоровье населения Иркутской области: проблемы и пути решения». - Иркутск, 2003;

- Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны: Материалы конференции, посвященной 70-летию Противочумного центра - М., 2004; ^

- Научные конференции института в 1987-2005 гг. В завершенном виде работа доложена на научной Конференции Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока 23.12.2004 г.

Публикации

Диссертация выполнена в рамках четырех тем НИР (№№ ГР 01.8.80009517; 01.9.30009498; 01.9.80010187; 01.9.80010188), а также в период работы комплексной межведомственной комиссии, которой было поручено организовать изучение причин массовой гибели тюленей Байкала (правительственная телеграмма № 14 663-54-10 от 16 декабря 1987 г.), при непосредственном участии соискателя в качестве руководителя и ответственного исполнителя. Результаты исследований нашли отражение в двух монографиях. По теме диссертации опубликовано 68 работ, в том числе 21 - в журналах, рекомендованных ВАК, 12 - в материалах международных, всесоюзных и всероссийских конференций, 6 - в зарубежных журналах.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов, заключения, выводов, списка использованной литературы. Работа изложена на 321 странице машинописного текста, содержит 34 таблицы и 68 рисунков. Библиографический указатель включает 357 информационных источников, в том числе 141 -отечественных и 216 - зарубежных.

Заключение диссертационного исследования на тему "Санитарная охрана территории от завоза и распространения особо опасных вирусных инфекций"

289 ВЫВОДЫ

3. На основании сравнительного анализа 34 особо опасных вирусных инфекций с учетом эпидемиологической оценки их актуальности для санитарной охраны территорий определен перечень 17 (в том числе 9 контагиозных), в отношении которых целесообразно проведение мероприятий по санитарной охране территории, и дано распределение инфекций по категориям. Установлено, что в случае заноса девяти возбудителей особо опасных вирусных инфекций на территории Сибири и Дальнего Востока имеются предпосылки для формирования вторичных очагов.

4. На моделях возбудителей геморрагических лихорадок Эбола и Марбург in vivo и in vitro впервые изучены или уточнены их биологические свойства, что послужило основой для разработки и совершенствования методов лабораторной диагностики вызываемых ими заболеваний.

6. На модели вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей с применением комплекса биологических, биохимических, физико-химических и молекулярно-биологических методов детально изучена структура и свойства вирионов, субвирусных структур и белков. Показана гетерогенность лабораторного штамма вируса по ряду свойств вирионов. Полученные данные являются основой для разработки диагностических тест-систем и проведения лабораторно-диагностических исследований.

7. Предложена общая схема анализа эпидемических вспышек (эпизоотий) неизвестной, предположительно вирусной этиологии, включающая спектр систем первичной изоляции вируса, пермиссивных для известных эпидемически значимых вирусных агентов.

8. Схема исследования апробирована при расследовании причин эпизоотии среди байкальской нерпы. Впервые от водных млекопитающих выделены морбил-ливирусы и доказана их этиологическая роло. Изучены биологические свойства выделенных изолятов морбилливируса байкальской нерпы. На основе выделенных штаммов впервые для морбилливирусов водных млекопитающих отработаны реакция нейтрализации и непрямой метод флюоресцирующих антител, а также метод клеточного иммуноферментного анализа для определения специфических антител. С применением разработанных тест-систем проведен серологический мониторинг популяции нерпы.

9. Изучено состояние лабораторной базы региона Сибири и Дальнего Востока в связи с необходимостью выполнения задач по санитарной охране территории в отношении вирусных инфекций. Региональные базы для лабораторной диагностики возбудителей инфекций II группы патогенности целесообразно организовать на базе вирусологических лабораторий ЦГСЭН в г. Красноярске (для Восточной Сибири) и г. Владивостоке (для Тихоокеанского побережья и островных территорий), а также вирусологических лабораторий в Омском НИИ природноочаговых инфекций (Западная Сибирь), в Читинской противочумной станции (Забайкалье) и Хабаровской противочумной станции (Дальний Восток) с возложением функций регионального организационно-методического центра на Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенного исследования в соответствии с поставленными задачами можно сгруппировать по следующим разделам:

I. Разработать критерии и обоснования для дифференцированного анализа вирусных особо опасных инфекций, в отношении которых необходимо проведение мероприятий по санитарной охране территории.

Имеется одна работа с предложением критериев отбора инфекций, на которые распространяются правила по СОТ. Ю.М. Федоров, A.M. Кокушкин [125] отметили общие признаки, по которым отличаются особо опасные инфекции:

1. Принадлежность к различным типам микроорганизмов-возбудителей (бактерии, вирусы, риккетсии, простейшие).

2. Принадлежность к различным эпидемиологическим классам (антропо-нозные и зооантропонозные) инфекционных болезней.

3. Отличие преимущественных механизмов распространения среди населения (аэрогенный, алиментарный, трансмиссивный, контактный) инфекционных болезней.

4. Степень разработанности и наличия у здравоохранения средств специфической и неспецифической профилактики, а также этиотропного и патогенетического лечения. Авторы отметили, что имеются общие черты, которые способны служить критериями оценки принадлежности инфекций болезней к категории болезней, подлежащих особому международному и/или национальному контролю и в отношении которых необходимо проведение мероприятий по санитарно-эпидемиологической охране территории.

На основании этого предложены критерии для включения тех или иных заболеваний в перечень «санохранных». Таких критериев выделено шесть:

1. Отсутствие убиквитарного (повсеместного) распространения инфекционных болезней и необычность эпидемических проявлений инфекционной болезни для охраняемой территории.

2. Высокая патогенность микроорганизмов-возбудителей для человека, классифицируемая по степени их индивидуальной и общественной опасности в соответствии с международными и национальными правилами.

3. Биологическая и социальная обеспеченность реализации преимущественных механизмов эпидемического (аэрогенного, трансмиссивного, алиментарного) распространения инфекционной болезни среди населения на охраняемой территории.

4. Высокая восприимчивость людей .тс возбудителю, способствующая не только тяжелому клиническому течению болезни с высокой летальностью (без стационарного лечения), но также широкому эпидемическому распространению с охватом больших масс охраняемого населения (вспышки, эпидемии).

5. Отсутствие практического опыта диагностики и борьбы с эпидемическими проявлениями инфекционной болезни у практических работников территориальных учреждений национального здравоохранения и населения.

6. Чрезвычайная социально-экономическая значимость последствий эпидемических проявлений инфекционной болезни, выражающаяся совокупностью отрицательных сдвигов в состоянии общественной жизни, здоровья, спокойствия населения и в народном хозяйстве.

По-видимому, проблематично выделить общие критерии для различных групп патогенных организмов (бактерии, вирусы, риккетсии, простейшие). Например, цитируемые выше авторы [125] на основании предложенных ими критериев рекомендуют включить в перечень «санохранных» только геморрагические лихорадки JIacca, Марбург и Эбола. Желтая лихорадка как конвенционная инфекция должна включаться в этот перечень автоматически.

При таком подходе все остальные ООВИ выпадают из сферы санитарно-эпидемиологического контроля. Не учтены такие особенности ООВИ, как большое число нозологических форм и разнообразие структурно-функциональной организации этой группы патогенов, высокая степень внутривидовой гетерогенности возбудителей, неспецифичность клинических симптомов вызываемых заболеваний, а также сложности клинической и лабораторной диагностики. В случае контагиозных ООВИ эпидемические осложнения могут возникнуть не только как локальные вспышки при завозе хозяев или переносчиков возбудителя, но и при завозе инфекции единичным больным. В случае неконтагиозных ООВИ локальные эпидемиологические осложнения могут возникнуть при завозе хозяев или переносчиков возбудителя, но при наличии благоприятных условий существует угроза формирования вторичного очага. Занос на эндемичные территории РФ новых (измененных) вариантов уже циркулирующего возбудителя также может привести к обострению эпидемической ситуации.

В связи с этим нами предложены критерии и признаки для анализа ООВИ с целью определения их актуальности для СОТ, которые, на наш взгляд, более полно отражают специфику и разнообразие ООВИ (раздел 3.1).

В анализ были взяты тридцать четыре ООВИ I и II групп патогенности. Это инфекции, возбудители которых, по определению экспертов ВОЗ, представляют группу патогенов 3 - «высокий индивидуальный и низкий общественный риск» и группу патогенов 4 - «высокий индивидуальный и высокий общественный риск» [237]. Следует учитывать, что как отечественная классификация патогенов, так и рекомендованная ВОЗ касаются биологической защиты при проведении лабораторных исследований.

С точки зрения СОТ, многие ООВИ II группы патогенности (3 группы в классификации ВОЗ) в случае формирования вторичных очагов представляют высокий индивидуальный и высокий общественный риск. Наиболее показателен пример недавнего завоза лихорадки Западного Нила в США с формированием вторичных очагов [145, 344, 346]. Рассмотрение ООВИ на соответствие предложенным нами критериям и признакам позволяет по одному плану, сопоставимо рассматривать различные инфекции с учетом уровня их изученности, а также давать рекомендации и обоснования по перечню инфекций, на которые распространяются правила по СОТ и по изменению перечня возбудителей, входящих в I-II группы патогенности.

II. Выделить категории (группы) ООВИ, для которых требуется проведение однотипных профилактических и противоэпидемических мероприятий по СОТ.

Для удобства анализа и с учетом действующих нормативных документов, регламентирующих различные аспекты работы с ООВИ и их возбудителями, нами предложено выделить шесть категорий ООВИ (табл. 4). Вместе с тем, для реализации задач СОТ достаточно выделить три варианта действий (с контагиозными ООВИ I группы патогенности, с контагиозными ООВИ второй группы патогенности и с неконтагиозными ООВИ II группы патогенности) и учесть это в КП. При таком подходе достаточно определить какой вариант мероприятий по СОТ применять в каждом конкретном случае. Полагаем, что при большом числе известных и «новых» ООВИ такой подход более оправдан, чем разработка мероприятий для каждой отдельной инфекции, и может быть применен как при син-дромном, так и при этиологическом принципе оповещения о заболеваемости.

Следует отметить, что такой подход не исключает возможность разработки комплекса профилактических и противоэпидемических мероприятий для хорошо изученных ООВИ с отработанной системой лабораторной диагностики.

В данной работе мы брали в анализ те инфекции, которые или ранее были или в настоящее время входят в перечень «санохранных», а также ООВИ, которые проявляли или проявляют наибольшую эпидемическую активность в мире. Если же рассмотреть все ООВИ II группы патогенности, то существенная их часть будет отнесена к 4 категории. В силу незначительного эпидемиологического потенциала ООВИ 4 категории не имеют значения для СОТ. Контроль ООВИ 6 категории (эндемичные для отдельных территорий страны) осуществляется в рамках эпиднадзора. Значение ООВИ 5 категории для СОТ определяется по оперативным данным. Из утвержденного в настоящее время перечня «санохранных» ООВИ желтая лихорадка относится к третьей категории, ТОРС - ко второй, а остальные инфекции - к первой категории. Таким образом, достаточно предусмотреть три варианта профилактических и противоэпидемических мероприятий по СОТ от ООВИ.

Предложенные нами категории значимости ООВИ для СОТ (табл. 4) позволяют также анализировать возможную роль этой группы инфекций в возникновении чрезвычайных ситуаций (ЧС). Очевидно, что занос инфекции на неэндемичные территории с последующими эпидемиологическими осложнениями представляет собой ЧС. Мероприятия по СОТ должны быть направлены на предупреждение эпидемических осложнений этого типа, а при их возникновении на локализацию и ликвидацию вспышек. Кроме того, ООВИ категории 6 (табл. 4) могут усугублять возникающие на эндемичных территориях ЧС техногенного или природного характера.

С точки зрения СОТ традиционно рассматриваются возможные пути заноса инфекции естественным путем или в результате хозяйственной деятельности человека. Вместе с тем, в последние годы активно обсуждаются проблемы биотерроризма. Для оценки вероятности использования биоагентов в качестве биологического оружия А.А. Воробьев [32] предложил применять критериально-рейтинговый подход. Были сформулированы 10 критериев с диапазоном оценки их выраженности от 1 до 5 баллов. Проведена оценка вероятности применения различных биоагентов и выделены три группы. Из вирусных инфекций к первой группе (высокая вероятность использования) отнесены оспа, вирусный энцефалит лимфоцитарный, геморрагическая лихорадка Марбург и грипп. Во вторую группу (возможно использование) включены японский энцефалит и желтая лихорадка. К третьей группе (слабая вероятность использования) отнесены бешенство и ВИЧ.

В задачи данной работы не входит анализ проблем биотерроризма. Преднамеренный занос теоретически может быть осуществлен для всех ООВИ. Однако, на наш взгляд, в зависимости от целей (терроризм или длительные диверсии) с наибольшей вероятностью могут использоваться либо контагиозные ООВИ, либо неконтагиозные ООВИ, в отношении которых на территории имеются предпосылки образования вторичных очагов и укоренения инфекции (глава 4). Круг этих ООВИ может составлять основу для анализа возможности использования их возбудителей для террористических и диверсионных целей.

Проведенный нами анализ также дает основания для предложений по включению возбудителей ООВИ и «новых» инфекций в ту или иную группу патогенности. Полагаем, что возбудителей бразильской, венесуэльской, калифорнийской, Крымской геморрагических лихорадок, оспы обезьян и ГЛЛС следует отнести к первой группе патогенности. Во вторую группу патогенности следует включить возбудителей лихорадки/геморрагической лихорадки Денге (четыре серотипа), вирусы Нипа, Хендра, Тогото. Часть наших предложений учтена при переработке нормативных документов.

Таким образом, применение критериев, признаков и категорий ООВИ дает I алгоритм рассмотрения инфекций с точки зрения их значения для СОТ, что определяет необходимый объем профилактических и противоэпидемических мероприятий и дает обоснования необходимого уровня биологической защиты.

III. Оценить вероятность заноса особо опасных вирусных инфекций с эндемичных территорий.

Как отметил В.И. Прометной [102], среди прибывших из эндемичных по особо опасным инфекциям стран могут находиться инфицированные, если их пребывание связано с территориями с интенсивностью 0,6-16 на 100 тысяч населения. Если допустить что это так, то из действующего перечня «санохранных» инфекций не представляют опасности геморрагические лихорадки Марбург и Боливийская (табл. 6).

Вместе с тем, при контагиозных ООВИ появление даже единичного больного может привести к эпидемическим осложнениям. Проведенный нами анализ контагиозных ООВИ показал, что они существенно различаются. В группу инфекций с показателем заболеваемости в эндемичных странах выше 1,0 на 100 000 населения относятся геморрагические лихорадки Ласса, Аргентинская, Эбола, заболевание ТОРС и лихорадка Нипа (табл. 6). Частоты инфицирования одного человека существенно отличаются в зависимости от страны и ООВИ. Так, для геморрагической лихорадки Ласса они находятся в пределах от 1/519 до 1/4494; для геморрагической лихорадки Эбола - от 1/ 19 238 до 1/ 133 647, для ТОРС - от 1/ 12 075 до 1/ 1 125 428. В группу с показателем заболеваемости от 0,1 до 1,0 входят геморрагические лихорадки Марбург, Боливийская, Венесуэльская и оспа обезьян. При этом частоты данных заболеваний для одного человека варьируют от 1/125 527 до 1/1 009 285. К третьей группе с показателем заболеваемости ниже 0,1 относятся геморрагические лихорадки Бразильская, Калифорнийская, Крымская геморрагическая лихорадка и геморрагическая лихорадка с легочным синдромом. В отношении первых двух отмечены только спорадические случаи заболеваний. То же самое относится к энцефалиту, вызываемому вирусом В обезьян. Для геморрагических лихорадок с легочным синдромом и Крымской частоты заболевания одного человека составляют соответственно 1/5 193 075 и 1/2 995 170. ,

При оценке опасности завоза ООВИ, людьми, прибывающими из эндемичных стран, полезно пользоваться показателем вероятности заболевания одного человека, т.к. эта цифра более наглядно отражает реальную опасность ввоза инфекции людьми, чем показатель заболеваемости на 100 тыс. населения. Особенно важно это может быть при активизации экономических и туристических связей. Такой показатель позволяет не только оценить вероятность выноса инфекции аборигенным населением, но также и оценить вероятность инфицирования прибывающих в эндемичные по ООВИ страны туристов, в том числе и при краткосрочных турах.

IV. В соответствии с разработанными критериями и категориями провести сравнительный эпидемиологический анализ особо опасных вирусных инфекций с точки зрения их актуальности для санитарной охраны территорий.

Контагиозные ООВИ, в зависимости от группы патогенности, отнесены нами к первой и второй категории значимости ООВИ для СОТ (глава 3). Очевидно, что в случае контагиозных ООВИ эпидемическую опасность может представлять даже единичный больной. При завозе (больными людьми, носителями или переносчиками) на территорию Сибири и Дальнего Востока возбудителей геморрагических лихорадок Ласса, Хунин, Мачупо, ГЛЛС и ККГЛ имеются предпосылки для формирования вторичных очагов этих инфекций. При завозе вируса В больными людьми или животными формирование вторичных очагов невозможно. В случае завоза оспы обезьян больными людьми или животными (обезьяны, белки) формирование вторичных очагов этой инфекции маловероятно. В отношении геморрагических лихорадок Эбола, Марбург, Калифорнийской, Бразильской, Венесуэльской достаточные для проведения анализа данные отсутствуют. Рассмотренные контагиозные ООВИ (за исключением энцефалита В обезьян, БрГЛ и КаГЛ) соответствуют всем или первому и третьему критериям значимости и актуальны для СОТ.

Неконтагиозные ООВИ, за исключением бешенства и ГЛПС, представлены арбовирусами. Распространение арбовирусов и их распределение в различных климатических зонах, эпизоды завоза арбовирусов и их переносчиков на неэндемичные территории детально анализируются в монографиях С.П. Чунихина, Г.Н. Леоновой [135] и Д.К. Львова с соавт. [60].

По мнению Д.КЛьвова с соавт. [60], на территории Сибири и Дальнего Востока период, благоприятный для активной циркуляции арбовирусов, весьма короток. Перезимовывание возбудителя затрудняется суровыми условиями продолжительного зимнего периода, поэтому здесь скорее возможно образование сезонных очагов, «.более вероятен эпизодический занос вирусной популяции перелетными птицами с мест зимовок или механический занос комаров воздушными массами» [60].

По площади территория Сибири и Дальнего Востока приблизительно поровну делится на две зоны, характеризующиеся разной суммой эффективных температур. Северная - менее 1000 °С , куда включаются наиболее суровые части материка с суммой эффективных температур менее 400 °С, и южная - от 1000 до 2000 °С. На юге Западной Сибири, в Забайкалье и в приграничной части Дальнего Востока имеются локальные участки с суммой эффективных температур от 2000 до 3000 °С [4].

Известно [60], что сумма эффективных температур при среднесуточной >10° от 1600° до 3800° недостаточна для внешнего инкубационного периода ар-бовирусов, распространенных в экваториальном, субэкваториальном и субтропическом поясах. Кроме того, в Сибири и на Дальнем Востоке коротким является период с температурой >20 °С и составляет менее 60 дней. По мнению Д.К. Львова, А.Д. Лебедева [цит. 60, с. 281], ареал передаваемых комарами вирусов ограничивается суммой эффективных температур при среднесуточной >10 °С в 2000 °С. Однако имеются данные, что вирусы комплекса калифорнийского энцефалита способны репродуцироваться в комарах при более низких температурах - 4-13 °С [60]. Так что этот вопрос требует дальнейшего исследования.

По требованиям к температурным условиям вирусы, связанные с клещами, весьма неоднородны. Так, амплитуда тепловых условий, в границах которой существуют очаги ККГЛ, относительно велика: 3000 °С < сумма эффективных температур < 5000 °С, а по условиям увлажненности - это зона, переходная между степью и пустыней [3, 16, 25]. Клещевой энцефалит менее требователен к температурным условиям, и его ареал, примерно соответствующий изотерме 1400 °С, в значительной мере зависит от распространения основных переносчиков [60].

Следует также учитывать возможность завоза носителей и переносчиков вирусов с транспортными средствами. Например, в действующих в настоящее время санитарных правилах указано, что «.получатель груза, прибывшего из районов, зараженных Болезнями, обнаруживший при вскрытии контейнера или лихтера насекомых или грызунов, ставит в известность об этом территориальные учреждения государственной санитарно-эпидемиологической службы» [109]. Ранее на необходимость контроля контейнерных и лихтерных перевозок обращали внимание С.Г. Дроздов, В.П. Сергиев [43]. Вместе с тем, не совсем понятно, кто контролирует получателей груза, знает ли получатель районы, зараженные болезнями. По-видимому, дератизационные и дезинсекционные мероприятия следует проводить во всех случаях выявления в контейнерах и лихтерах грызунов и насекомых. Другой пример связан с тем, что в Лондоне при проверке самолетов, прибывших из тропических стран, комары обнаружены в 12 из 67 авиалайнеров. Комары, домашние мухи и колорадские жуки обнаружены живыми в полости шасси самолета после перелета в течение 9 часов при температуре окружающего воздуха -42 °С [303]. По-видимому, в аэропортах стран, эндемичных по трансмиссивным (передающихся комарами) ООВИ, перед взлетом целесообразно обрабатывать шасси и грузовые отсеки самолетов инсектицидами.

Рассмотрение неконтагиозных ООВИ на соответствие критериям их актуальности для СОТ выявило различия между ними. Завоз инфекций этой группы (категории 3 и 4; глава 3) возможен больными людьми, хозяевами вируса и переносчиками. Больной человек опасности для окружающих не представляет. Однако он должен быть изолирован от кровососущих членистоногих и возможных хозяев вируса на неэндемичной территории. Ограничения должны быть направлены на ввоз хозяев вируса и переносчиков, что может привести к возникновению локальных вспышек ООВИ. Такие вспышки не дадут дальнейшего эпидемического распространения инфекции, если на неэндемичной территории отсутствуют условия для формирования вторичных очагов и укоренения инфекции. В случае лихорадок желтой, Денге, Чикунгунья, о'ньонг-ньонг, долины Рифт, энцефалита долины Муррея предпосылки для образования вторичных очагов отсутствуют. Для энцефалита Сент-Луис образование вторичных очагов маловероятно, так как предпосылки имеются только в подвальных помещениях, заселенных комарами Culex pipiens. При заносе возбудителей АЭ и КЛБ имеются предпосылки для формирования вторичных очагов.

При эндемичных, по крайней мере, для некоторых территорий Сибири и Дальнего Востока ГЛПС, ЯЭ, ООВИ комплекса калифорнийского энцефалита, бешенстве, ЛЗН имеются предпосылки как для заноса в природные очаги новых (измененных) вариантов возбудителя, что может способствовать активизации очагов, так и для образования вторичных очагов на неэндемичных территориях. Из группы ООВИ, эндемичных для территории России, к контагиозным инфекциям относится только ККГЛ. Геморрагический синдром у заболевших отмечен в случае ККГЛ, ГЛПС, ОГЛ и КЭ. Контроль всех этих инфекций осуществляется в рамках эпиднадзора. Важно проведение тщательной дифференциальной диагностики этих инфекций с экзотическими КВГЛ.

Из группы рассмотренных новых или малоизученных ООВИ наибольшую эпидемическую опасность представляют заболевания, вызываемые вирусами ТОРС, Нипа и Тогото. С точки зрения СОТ, не представляется актуальным заболевание, вызываемое вирусом Хендра. При сегодняшнем уровне знаний заболевание, вызываемое вирусом Менангле, не представляет эпидемической опасности, но может иметь значение для организации ветеринарного контроля. Так как природные очаги лихорадки Тогото и ККГЛ во многом совпадают, имеются общие хозяева и переносчики инфекции, можно полагать, что есть предпосылки образования вторичных очагов в случае заноса возбудителя на неэндемичные территории. Кроме того, имеющиеся в настоящее время ограниченные данные указывают на то, что возбудители заболеваний, вызываемых вирусами Нипа, Хендра и Менангле, следует отнести ко второй группе патогенности. Необходим постоянный мониторинг природных очагов, в том числе с анализом как переносчиков, так и циркулирующих вариантов возбудителя.

V. На моделях филовирусов и альфавирусов изучить биологические и мо-лекулярно-биологические свойства возбудителей как основы для разработки методов лабораторной диагностики. Разработать подходы к совершенствованию лабораторной диагностики филовирусов. I

Экспериментальные исследования проведены с вирусами I группы патогенности (вирусы Эбола и Марбург) и вирусами II группы патогенности (альфа-вирусы, преимущественно на модели вируса ВЭЛ). При этом получены новые научные данные по биологическим и молекулярно-биологическим свойствам этих вирусов, а также осуществлен ряд методических разработок, имеющих значение для лабораторной диагностики вызываемых ими инфекций.

Определены физико-химические параметры вирионов вируса ВЭЛ. Установлено, что константа седиментации вирионов Бго.о» составляет 265 S, плавучая плотность вирионов в сахарозе - 1,18-1,19 г/см3 , а в хлористом цезии - 1,191,21 г/см3. Изоэлектрическая точка вирионов pi = 6,5. Показано, что вирионы вируса ВЭЛ содержат двуслойную липидную мембрану. Жесткость вирионной мембраны выше, чем цитоплазматических мембран клетки-хозяина. В состав вирионов входят три структурных полипептида с молекулярными массами 35,49 и 56 кД. Соотношение белков в вирионах отличается от эквимолярного. Разработан метод, позволяющий получать препаративные количества С-белка, который, по литературным данным, является группоспецифическим антигеном альфави-русов. Показано, что обработка вирионов неионными детергентами позволяет получить два типа структур - оболочки и сердцевины (нуклеокапсиды) вирионов. Разработана методика препаративного разделения этих структур. Впервые определен ряд физико-химических параметров сердцевин (нуклеокапсидов) вируса ВЭЛ. Установлено, что константа седиментации S2o,w равна 153 S, плавучая плотность в хлористом цезии - 1,41 г/см3, плавучая плотность в сахарозе, приготовленной на ДгО, равна 1,34 г/см3. Впервые установлено, что вирионный РНП существует в форме сердцевин (нуклеокапсидов) вируса и при действии повышенной температуры, замораживания-оттаивания, малых концентраций доде-цилсульфата натрия и ЭДТА распадается ни линейные структуры при электронно-микроскопическом исследовании схожие с вирионной РНК. Разработана высокоэффективная методика препаративного концентрирования и очистки альфа-вирусов, позволяющая получать электрофоретически чистые препараты вирионов. При использовании предложенной схемы степень очистки вируса по белку составляет 99,93 %. Полученные данные важны при изоляции и идентификации альфавирусов в случае возникновения вспышек заболеваний илц при мониторинге территорий и закладывают методические основы получения диагностических тест-систем.

При изучении вирусов Эбола и Марбург нами получены следующие основные результаты. Модифицирована методика определения инфекционной активности методом бляшек. Показана гетерогенность лабораторных штаммов вирусов Эбола и Марбург по морфологии бляшек. Получены клонированные варианты вирусов, обладающие более высокой репродуктивной способностью in vitro, чем исходные штаммы. Впервые изучена динамика репродукции вирусов Эбола и Марбург при низкой и высокой множественности заражения, что позволяет направленно планировать эксперименты по наработке биомассы этих возбудителей. Изучена чувствительность морских свинок разного возраста к заражению вирусами Эбола и Марбург. Наиболее чувствительны к вирусам морские свинки массой 200 г. Показано, что при серийных пассажах возрастает вирулентность этих вирусов при сокращении инкубационного периода. Методом флуоресцирующих антител впервые изучена динамика экспрессии специфических антигенов вирусов Эбола и Марбург в клетках Vero. Полученные данные послужили основанием для оптимизации непрямого метода флуоресцирующих антител, позволяющего проводить лабораторную диагностику и оценивать специфичность выявляемого свечения на различных этапг\х инфицирования клеток. Впервые разработан метод клеточного ИФА для определения специфических антител к вирусам Эбола и Марбург. Этот метод в 50-100 раз чувствительнее НМФА, прост в исполнении и не требует получения очищенных антигенов в условиях максимальной биологической защиты. Изучена динамика образования специфических антител у морских свинок, иммунизированных вирусами Эбола и Марбург. Получены специфические антисыворотки к этим вирусам с титрами антител 1:1024 в НМФА и 1:51200 - в клеточном ИФА. У морских свинок, инфицированных вирусом Эбола, выявлены вируснейтрализующие антитела. Отработаны щадящие условия инактивации инфекционного материала и методы его контроля на специфическую безопасность. Проведенные исследования позволили получить лабораторные серии диагностических препаратов, которые были испытаны в лабораторных условиях и при обследовании больной М. из г. Корсакова с диагнозом «геморрагическая лихорадка Марбург?».

Особый интерес для лабораторно-диагностических исследований представляет выявление гетерогенности лабораторных штаммов вирусов ВЭЛ, Эбола и Марбург по биологическим свойствам. Как отмечено в разделе 1.2, такая информация накапливается для многих РНК-содержащих возбудителей ООВИ и должна учитываться при разработке методов лабораторной диагностики, вакцин и профилактических препаратов.

VI. Разработать общий подход к расследованию эпидемических вспышек (эпизоотий) неизвестной, предположительно вирусной этиологии и апробировать его.

В случае эпидемической вспышки неизвестной, предположительно вирусной, этиологии схема анализа должна включать такой спектр систем первичной изоляции вируса, которые являются пермиссивными для всех известных эпидемически значимых вирусных агентов. Общая схема анализа материала приведена на рис. 61. Она включает изоляцию и идентификацию вируса, выявление вирусных антигенов и антител. Изоляцию ведут в соответствующих пермиссивных системах - лабораторных животных, куриных эмбрионах и на культуре клеток.

Использование широкого спектра систем биологического накопления позволяет успешно изолировать большинство возбудителей вирусных инфекций. Желательно провести три последовательных пассажа исследуемого материала. Типирование инфекционного агента после биологического накопления проводят различными методами, включая электронную микроскопию и ОТ-ПЦР. При наличии диагностических тест-систем с высокой чувствительностью и специфичностью предварительную идентификацию вирусов можно проводить также с исходным клиническим материалом, до этапа биологического накопления. Однако положительный результат на этом этапе не исключает необходимости выделения и идентификации инфекционного агента в чистой культуре. При выявлении антител необходимо исследовать парные сыворотки от больных. В первые дни заболевания сыворотки исследуют на IgM.

Следует отметить, что применение различных вариантов электронно-микроскопического исследования позволяет быстро и достоверно провести идентификацию инфекционного агента, как минимум, до семейства, а в некоторых случаях - и до вида. Например, дифференциацию вирусов Эбрла и Марбург можно проводить электронно-микроскопически [198]. Широкое использование этой группы методов ограничивается высокой стоимостью прибора, отсутствием подготовленных специалистов и технического персонала.

Общий подход апробирован нами при расследовании причин массовой гибели тюленей Байкала. Ко времени начала данного исследования не имелось сведений о морбилливирусных инфекциях водных млекопитающих, в том числе тюленей, поэтому в качестве возможного этиологического агента эпизоотии можно было предполагать вирусы самых различных систематических групп.

Для первичной изоляции вируса от нерп нами использован широкий спектр лабораторных животных, куриные эмбрионы, первичные и перевиваемые культуры клеток. По нашему мнению, такой подход следовало применить для того, чтобы не дать ошибочного вирусологического заключения по расследованию причин массовой заболеваемости и гибели нерп. В течение двух недель после начала исследования от погибших животных нами были выделены четыре штамма морбилливируса. При этом каждый из инфекционных агентов выделен прямой изоляцией в трех вариантах: в культуре клеток Vero и Hela и в куриных эмбрионах. Идентификация выделенных у тюленей вирусов проведена нами с иммуноглобулинами против вируса кори, моноклональными антителами к вирусу кори больного подострым склеротизирующим панэнцефалитом, сывороткой к вирусу чумы плотоядных, а также с сывороткой байкальских и морских тюленей. Это первый случай изоляции морбилливируса от водных млекопитающих. При расследовании причин эпизоотии неясной этиологии нами применен комплексный подход к первичной изоляции вирусных агентов с использованием отличающихся по пермиссивности систем, что показало свою эффективность. По нашему мнению, только таким путем можно результативно и в сжатые сроки расследовать эпидемические вспышки неясной этиологии у людей и эпизоотии у животных.

При расшифровке вспышек инфекционных заболеваний необходимо следовать постулатам Коха [58]. Ключевой момент - изоляция и идентификация возбудителя. Это очень важно еще и потому, что углубленное изучение вновь выделенных штаммов позволяет иметь более полную картину вариабельности генома данного вида вируса.

VII. Оценить состояние лабораторной базы региона в связи с выполнением задач по санитарной охране территории в отношении вирусных инфекций.

Уровень оснащенности и интенсивность работы вирусологических лабораторий значительно варьируют на разных территориях. Исследования на клещевой энцефалит проводятся далеко не во всех лабораториях ЦГСЭН, даже там, где эта инфекция представляет серьезную проблему для территории. Исследования на природноочаговые заболевания - бешенство, ГЛПС и другие геморрагические лихорадки - выполняются эпизодически и имеют очень небольшой удельный вес, тогда как основной объем лабораторных исследований занимают исследования на вирусы III-IV групп патогенности, не представляющие особого интереса с точки зрения СОТ: вирусные гепатиты, ротавирусы, энтеровирусы, грипп, корь.

Вместе с тем, имеющаяся в регионе лабораторная база может послужить основой для организации сети лабораторий, способных проводить диагностику актуальных для СОТ ООВИ. Исходя из вышеизложенного, считаем целесообразным организовать региональные базы для диагностики ООВИ II группы патогенности на базе вирусологических лабораторий ЦГСЭН в г. Красноярске (для Восточной Сибири) и г. Владивостоке (для Тихоокеанского побережья и островных территорий), а также вирусологических лабораторий в Омском НИИ при-родноочаговых инфекций (Западная Сибирь), на Читинской противочумной станции (Забайкалье) и Хабаровской противочумной станции (Дальний Восток). Функции организационно-методического центра в пределах региона, подготовку кадров вирусологов, хранение коллекций клеточных культур и диагностических штаммов для нужд практических лабораторий можно возложить на Иркутский НИПЧИ, который имеет в своем составе лабораторию особо опасных вирусов и занимается этой работой.

Целесообразность и своевременность наших рекомендаций полностью подтвердились во время проведения мероприятий по предотвращению заноса и распространения на территорию России нового коронавируса ТОРС в 2003 г. Это нашло отражение в документах Минздрава России по диагностику ТОРС и оснащению вирусологических лабораторий современным оборудованием для мо-лекулярно-генетических исследований (лаборатории ПЦР). Опыт работы медицинской службы в период эпидемии ТОРС продемонстрировал явно недостаточную готовность вирусологических лабораторий региона, медицинских кадров и системы транспортировки проб, вирусных изолятов и МИБП.

В ходе проверок готовности клинической базы к проведению мероприятий по СОТ в гг. Иркутске и Красноярске выявлена особенность некоторых типовых проектов инфекционных больниц. Помимо обычного централизованного отопления, там предусмотрена принудительная централизованная подача теплого воздуха в палаты и боксы от расположенного на чердачном помещении здания калорифера. В этом случае в боксах и палатах для содержания больных создается избыточное положительное давление (вместо требуемого отрицательного), воздух выдувается из боксов в коридоры и внешнюю среду, создавая все условия для инфицирования персонала, посетителей и внешней среды. Очевидно, что дефекты такого проекта и построенных по нему инфекционных больниц следует незамедлительно исправлять.

VIII. Определить принципиальные направления совершенствования организации и проведения мероприятий по СОТ для особо опасных вирусных инфекций.

- Круг инфекций, на которые следует распространять мероприятия по СОТ, необходимо расширить и пополнять по мере появления новых научных и оперативных данных. Для пересмотра круга ООВИ, на которые распространяются мероприятия по СОТ, можно использовать предложенные «Критерии значимости ООВИ для СОТ». Можно рекомендовать для рассмотрения перечень инфекций, приведенный в таблице 17.

- Пересматривать Перечень возбудителей ООВИ I-IV групп патогенности и пополнять его по мере появления новых данных и ООВИ. Из возбудителей «новых» инфекций это было оперативно сделано для коронавируса ТОРС. Есть основания рекомендовать для включения в I группу патогенностИ| возбудителей Крымской, Калифорнийской, Бразильской и Венесуэльской геморрагических лихорадок, а также хантавирусного легочного синдрома. Во II группу патогенности целесообразно включить вирусы Нипа, Хендра, Тогото.

- Определить место каэвдой ООВИ среди «Категорий ООВИ в соответствии с их значимостью для СОТ». На данном этапе рассмотрения можно рекомендовать такое распределение ООВИ, как указано в таблице 17.

- При анализе возможной роли ООВИ в ЧС и составлении прогнозов также можно рекомендовать применение подхода, реализованного для «Категорий ООВИ в соответствии с их значимостью для СОТ».

- Разработать три варианта профилактических и противоэпидемических мероприятий для включения в «Комплексный план по санитарной охране территории от завоза и распространения карантинных и других особо опасных инфекций» (для контагиозных ООВИ I группы патогенности, контагиозных ООВИ II группы патогенности, неконтагиозных ООВИ II группы патогенности).

- Определить сеть медицинских учреждений для изоляции и лечения больных с учетом трех вариантов профилактических и противоэпидемических мероприятий.

- При появлении новых, не известных мировой науке ООВИ, возможно применение одного из трех вариантов профилактических и противоэпидемических мероприятий.

- На основе имеющейся лабораторной базы Минздрава РФ с учетом мирового опыта создать сеть лабораторий, способных выполнять весь комплекс исследований, включая изоляцию и идентификацию возбудителей ООВИ, в том числе и при расследовании эпидемических вспышек неизвестной, предположительно вирусной этиологии.

- Определить необходимый перечень диагностических тест-систем к ООВИ и места их производства.

- Совершенствовать систему эпиднадзора за эндемичными для территории Российской Федерации ООВИ с постоянным мониторингом циркулирующих в природных очагах вариантов возбудителей, видового спектра хозяев и переносчиков.

- Постоянно проводить детальный анализ эпидпотенциала каждой из ООВИ с учетом новых научных и оперативных данных, а также возможности их заноса и укоренения на неэндемичной территории.

- Для оптимизации системы СОТ от ООВИ и обоснования принимаемых решений целесообразно создать действующие на постоянной основе комплексные группы аналитиков из специалистов различных профилей.

Таким образом, разработан общий подход к анализу значения (актуальности) особо опасных вирусных инфекций для санитарной охраны территории. Выделены критерии и признаки, по которым проводится анализ, что позволяет рассматривать и сопоставлять различные инфекции по одному плану. Определены шесть категорий особо опасных вирусных инфекций, применение которых предусматривает три варианта уровней биологической защиты при планировании и проведении профилактических и противоэпидемических мероприятий.

На основе изучения биологических и молекулярно-биологических свойств филовирусов и альфавирусов намечены общие подходы и тактические приемы совершенствования лабораторной диагностики вызываемых ими инфекций. На моделях вирусов Эбола и Марбург оптимизирован метод флеоресцирующих антител для выявления специфических антигенов и антител, разработан метод клеточного иммуноферментного анализа. Предложена схема лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Эбола и Марбург. Схема апробирована в лабораторных условиях и на практике при анализе материала от больной М. из г. Корсакова с диагнозом «геморрагическая лихорадка Марбург?».

Разработана общая схема лабораторного исследования материала при эпидемической вспышке (эпизоотии) неясной, предположительно вирусной этиологии. Схема апробирована при изучении причин массовой гибели байкальской нерпы. Впервые установлена этиологическая роль морбилливирусов,при эпизоотии водных млекопитающих, выделены и изучены штаммы морбилливируса, получившего название морбилливирус байкальской нерпы, проведено заражение природного хозяина и серологический мониторинг популяции.

Изучена готовность вирусологических лабораторий ЦГСЭН и НИИ на территории Сибири и Дальнего Востока к выполнению задач по санитарной охране территории. Даны рекомендации по совершенствованию лабораторной базы. Намечены направления дальнейшей оптимизации и совершенствования санитарной охраны территории от особо опасных вирусных инфекций.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2005 года, Титенко, Алексей Михайлович

1. Алексеев А.Ф. Крысы на судах СССР заграничного плавания и в портах Азово-Черноморского бассейна / А.Ф. Алексеев, В.И. Чирний, Л.С Арутю-нян и др. // Синантропия грызунов и ограничение их численности. М., 1992.-С. 142-150.

2. Антонюк В.Я. Пути расселения серой крысы в Сибири и меры предупреждения этого процесса / В.Я. Антонюк, Н.В. Олькова // Новые материалы по биологии серой крысы. М., 1990. - С. 124.

3. Аристова В.А. Экология вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки и особенности ее клиники на территории России и сопредельных стран / В.А. Аристова, Л.В. Колобухина, М.Ю. Щелканов, Д.К. Львов // Вопр. ви-русол.-2001.- № 4.-С. 7-14.

4. Атлас географический справочный / Под ред. И.А.Кутузова. М.: Главное управление геодезии и картографии при Совете Министров СССР, 1987. -296 с.

5. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях/И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. Л.: Гос. изд-во мед. лит., 1962. - 180 с.

6. Баранова Л.В. Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы / Л.В. Баранова, A.M. Бейм, С.И. Беликов, О.И. Белых, и др. Новосибирск.: Наука, Сиб. отд-ние, 1992. - 70 с.

7. Баранова Л.В. Эпизоотии и болезни тюленей / Л.В. Баранова // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1992.-С. 7-12.

8. Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы / З.С. Баркаган. -М.: Медицина, 1988. 528 с.

9. Бароян О.В. Очерки по мировому распространению важнейп/их заразных болезней человека / О.В. Бароян. М.: Гос. Изд-во мед. лит., 1962. - 207 с.

10. Безопасность работы с микроорганизмами 1-Й групп патогенности: Санитарные правила СП 1.2.011 94. - М.: Госкомсанэпиднадзор России, 1994. -152 с.

11. Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности): Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285 03. - М., 2003. -84 с.

12. Бейм A.M. О клинической симптоматике эпизоотии в популяции байкальской нерпы / A.M. Бейм, B.C. Колесник, В.М. Куделин и др. // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1992.-С. 26-30.

13. Беланов Е.Ф. Выживаемость вируса натуральной оспы в корочках от больных / Е.Ф. Беланов, А.А. Гуськов, Е.В. Сокунова и др. // Докл. Акад. наук. -1997. Т. 354, № 6. - С. 832-834.

14. Беланов Е.Ф. Сохранение инфекционности вируса Марбург на контамини-рованных поверхностях и в аэрозоле / Е.Ф. Беланов, В.П. Мунтянов, В.Д. Крюк и др. // Вопр. вирусол. 1996. - № 1. - С. 32-34.

15. Беляков В.Д. Эпидемиология: Учебник / В.Д. Беляков, Р.Х. Яфаев. М.: Медицина, 1989.-416 с.

16. Бируля Н.Б. Ареал природных очагов КГЛ / Н.Б. Бируля, Л.И. Залуцкая,

17. B.Д. Перелатов // Вирусные геморрагические лихорадки: Труды ИПВЭ АМН СССР.-М., 1971.-Т.19. -С. 180-185.

18. Боев Б.В. Прогноз эпидемии ВИЧ-инфекции в России / Б.В. Боев, В.М. Бон-даренко//Журн. микробиол.- 1999.-№4. -С. 115-118.

19. Ботвинкин А.Д. Новые и возвращающиеся инфекции / А.Д. Ботвинкин,

20. C.П. Меринов, О.В. Мельникова, Т.Т. Шкаруба // Журн. инфекционной па-тол. Иркутск, 2001. -№ 2-3. - С. 5-17.

21. Ботвинкин А.Д. Особенности эпидемиологии гидрофобии и экология вируса бешенства в условиях преобладания очагов природного типа: Дис. докт. мед. наук в форме науч. докл.: 14.00.30 / А.Д. Ботвинкин; НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. М., 1992. - 58 с.

22. Брюханова Г.Д. Актуальные аспекты эпидемиологии и микробиологии чумы в современных условиях: Автореф. дис. . докт. мед. наук: 14.00.30; 03.00.07 / Ставропольский н.-и. Ставрополь, 2004. - 50 с.

23. Бургасов Н.П. Натуральная оспа / Н.П. Бургасов, Г.П. Николаевский М.: Медицина, 1972.-207 с

24. Бусыгин Ф.Ф. Итоги разработки проблемы арбовирусов в Западной Сибири / Ф.Ф. Бусыгин, В.В. Якименко, О.Б. Калмин и др. // Природноочаговые болезни человека: Респ. сб. науч. работ. Омск, 1996. - С. 18-30.

25. Бусыгин Ф.Ф. Омская геморрагическая лихорадка, современное состояние проблемы / Ф.Ф. Бусыгин // Вопр. вирусол. 2000. - Т. 45, № 3. - С. 4-9.

26. Бутенко A.M. Дальнейшее изучение циркуляции хантавирусов в Российской Федерации / A.M. Бутенко, Т.А. Быченкова, О.И. Вышемирский и др. // Вопр. вирусол. 1997. - Т. 42, № 2. - С. 74-76.

27. Варгина С.Т. Мониторинг природных очагов арбовирусов в Киргизии / С.Т. Варгина, И.Т. Брейнингер // ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Сер.: Вирусология.-М., 1991.-Т. 24.-С. 15-16.

28. Васильев К.Г. От санитарной охраны границ к санитарной охране территории / К.Г. Васильев, Э.Ю. Гольд, Л.М. Марчук. М.: Медицина, 1974. -208 с.

29. Вершинина Т.А. Иксодовые клещи Азиатской России / Т.А. Вершинина // Опыт создания карты иксодовых клещей Азиатской России. Иркутск, 1974.-С. 17-37.

30. Вирусные геморрагические лихорадки / Под ред. М.П. Чумакова. М., 1971.- 512с.

31. Вирусные геморрагические лихорадки // Докл. комитета экспертов ВОЗ, Женева, 1986.-120 с.

32. Вирусология. Методы: Пер с англ./ Под ред. Б. Мейхи. М.: Мир, 1988. -С.113-116.

33. Владыко А.С. Сравнение методов флюоресцирующих антител и твердофазного иммуноферментного анализа при выявлении антител к вирусу Марбург / А.С. Владыко, А.А. Чепурнов, Р.Ф. Марьянкова и др. // Вопр вирусол. -1991.-№ 4.-С. 326-328.

34. Воробьев А.А. Оценка вероятности и использования биоагент<ов в качестве биологического оружия / А.А. Воробьев // Эпидемиол. и инф. болезни. -2001.-№ 6.-С. 54-56.

35. Вотяков В.И. Клещевые энцефалиты Евразии / В.И. Вотяков, В.И. Злобин, Н.П. Мишаева. Новосибирск: Наука, 2002. - 437 с.

36. Впервые возникающие инфекционные болезни: Меморандум совещания ВОЗ // Бюл. ВОЗ. 1994. - Т. 72, № 6. - С. 10-16.

37. Гавринев С.А. Контагиозные вирусные геморрагические лихорадки / С.А. Гавринев, А.В. Горобец, И.А. Беспалов, Э.А. Москвитина // Эпидеми-ол. и инф. болезни. 2000. - № 2. - С. 49-52.

38. Гайдамович С.Я. Идентификация выделенного на Дальнем Востоке арбови-руса из группы А, сходного с вирусом леса Семлики / С.Я. Гайдамович, Е.Э. Мельникова, В.И. Агафонов и др. // В кн.: Арбовирусы. М., 1974. -Вып.1.- С. 93-95.

39. Галузо И.Г. Аргасовые клещи (аргазиды) и их эпизоотологическое значение (систематика, биология, вредоносность и меры борьбы) / И.Г. Галузо. -Алма-Ата, 1957.- 131 с.

40. Гвоздев Е.В. Млекопитающие Казахстана / Е.В. Гвоздев, Е.И. Страутман. -Казах. ССР: Наука, 1981. Т. 2, Ч. 1. - 243 с.

41. Геморрагическая лихорадка Эбола в Заире в 1976 г. // Бюл. ВОЗ. 1978. -Т. 56,№2.-С. 213-236.

42. Геморрагическая лихорадка Эбола в Судане в 1976 г.//Там же. С. 189-212.

43. Дейвис Ф.Дж. Обилие осадков и эпизоотии лихорадки Рифт-Валли / Ф.Дж. Дейвис, К.Дж. Линтикум, А.Д. Джеймс // Бюл. ВОЗ. 1985. - Т. 63, №5.-С. 77-79.

44. Дроздов С.Г. Защита неэндемичных территорий от тропических вирусных геморрагических лихорадок / С.Г. Дроздов, В.П. Сергиев. М.: Медицина, 1984.- 288 с. •

45. Евстафьев И.Л. Итоги 20-летнего изучения клещевого энцефалита в Крыму / И.Л. Евстафьев // Журн. микробиол. 2001. - № 2. - С. 111-114.

46. Ежек 3. Оспа и эпидемиологический надзор за ней в постликвидационный период / 3. Ежек, Л.К. Ходакевич, Д.Ф. Уикетт // Бюл. ВОЗ. 1987. - Т. 65,4.-С. 1-9.

47. Жданов В.М. Вирусология / В.М. Жданов, С.Я. Гайдамович. М.: Медицина, 1976.- 480 с.

48. Злобин В.И. Клещевой энцефалит: этиология, эпидемиология и профилактика в Сибири / В.И. Злобин, 0.3. Горин. Новосибирск: Наука, 1996. -177 с.

49. Иванова JI.M. Эпидемиологическое проявление природных очагов и задачи по профилактике клещевого энцефалита в СССР / JI.M. Иванова // Мед. па-разитол. 1982. -№ 3. - С. 3-7.

50. Иванова JI.M. Современная эпидемиология природно-очаговых инфекций в РСФСР / JI.M. Иванова // Мед. паразитол. 1984. - № 2. - С. 17-21.

51. Иофф И.Г. Определитель блох Восточной Сибири и Дальнего Востока и прилегающих районов / И.Г. Иофф, О.Н. Скалон. М.: Медгиз, 1954. -275 с.

52. Кажал Н. Из истории борьбы против микробов и вирусов / Н. Кажал, Р. Иф-тимович. Бухарест: Науч. изд-во, 1968. - 402 с.

53. Каталог млекопитающих СССР. Плиоцен-современность / Под ред. И.М. Громова, Г.И. Барановой. -JL: Наука, 1981.-456 с.

54. Кирис И.Д. Белка / И.Д. Кирис. Киров, 1973. - 448 с.

55. Колесник B.C. Клинико-анатомическая характеристика эпизоотии в популяции байкальской нерпы / B.C. Колесник, A.M. Бейм, Р.С. Колесник и др. // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1992. - С. 30-36.

56. Колонии Г.В. Распространение иксодовых клещей / Роды Dermacentor, Anocentor, Cosmiomma, Dermacentonomma, Nosomma, Rhipicentor, Rhipice-phalus, Boophilus, Margaropus, Anomalohimalaya / Г.В. Колонии. M.: Наука, 1984.-95 с.

57. Коренберг Э.И. Районирование вируса клещевого энцефалш4 / Э.И. Корен-берг, Ю.В. Ковалевский // Итоги науки и техники: сер. Медицинская география.-М., 1981.-Т. 2.- 148 с.

58. Кухарчук Л.П. Кровососущие комары (Diptera, Culicidae) Сибири / Л.П. Кухарчук. Новосибирск: Наука, 1980. - 232 с.

59. Лашкевич В.А. Современные доказательства инфекционной этиологии болезней и постулаты Коха / В.А. Лашкевич, Г.А. Королева, А.Н. Лукашев // Журн. микробиол. 2002. - № 6. - С. 117-121.

60. Лоскутова З.Ф. Виварий / З.Ф. Лоскутова. М.: Медицина, 1980. - 93 с.

61. Львов Д.К. Арбовирусы и арбовирусные инфекции / Д.К. Львов, С.М. Клименко, С.Я. Гайдамович и др. М.: Медицина, 1989. - С. 236-239.

62. Львов Д.К. Выделение вируса лихорадки Западного Нила от больных в период эпидемической вспышки в Волгоградской и Астраханской областях / Д.К. Львов, A.M. Бутенко, О.И. Вышемирский и др. // Вопр. вирусол. -2000.-Т. 45, №3.- С. 9-12.

63. Львов Д.К. Лихорадка Западного Нила / Д.К. Львов // Там же. 2000. -Т. 45, №2.-С. 4-9.

64. Львов Д.К. Новые и вновь возникающие вирусные инфекции / Д.К. Львов //Там же.-№4.-С. 4-7.

65. Львов Д.К. Эпидемические вспышки менингита и менингоэнцефалита в Краснодарском крае и Волгоградской области, вызванные вирусом Западного Нила (предварительные сообщения) / Д.К. Львов, A.M. Бутенко, С.Я. Гайдамович и др. // Там же. № 1. - С. 37-38.

66. Львов Д.К. Значение вновь возвращающихся инфекций в биобезопасности / Д.К. Львов // Там же. 2002. - Т. 47, № 5. - С. 4-7.

67. A.Ф. Джаркенов, В.А. Аристова и др. // Там же. № 4. - С. 32-36.

68. Малашенкова И.К. Синдром хронической усталости / И.К. Малашенкова, Н.А. Лидковский // Рус. мед. журн. 1997. - Т. 5, № 12. - С. 756-757.

69. Марамович А.С. Актуальные вопросы санитарной охраны 1ерритории Сибири и Дальнего Востока / А.С. Марамович, С.А. Косилко, Г.А. Воронова,

70. B.И. Погорелов // Журн. инф. патологии. Иркутск, 2001. - Т. 8, № 2-3.1. C.18-32.

71. Маренникова С.С. К 10-летию ликвидации оспы: итоги эпидемиологического и вирусологического надзора и исследований в постэрадикационный период / С.С. Маренникова // Журн. микробиол. 1989. - № 6. - С. 23-29.

72. Маркин В.А. Вирусные геморрагические лихорадки эволюция эпидемического потенциала / В.А. Маркин, В.И. Марков // Журн. микробиол. - 2002. -№ 1.-С. 91-98.

73. Международные медико-санитарные правила (1969). 3-е аннотированное изд. - Женева: ВОЗ, 1985. - 78 с.

74. Мейнелл Д. Экспериментальная микробиология (теория и практика) / Д. Мейнелл, Э. Мейнелл; Пер с анг. М.: Мир, 1967. - 347 с.

75. Методические рекомендации по ограничению численности и предупреждению распространения серой крысы в северных районах Сибири. Иркутск, 1988.-С. 6-7.

76. Никитин А.Я. Прогноз динамики заболеваемости населения Иркутска клещевым энцефалитом / А.Я. Никитин, A.M. Антонова, Г.А. Чистофорова и др. // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2002. - № 4, Т. 2. - С. 83-86.

77. Новохатский А.С. Факторы, определяющие уровень продукции вирусов. Сообщение 1. Влияние множественности инфекции на продукцию вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей / А.С. Новохатский, Ф.И. Ершов // Вопр. вирусол. 1970. - № 3. - С. 265-268.

78. Новохатский А.С. Получение высокоактивного вируссодержащего материала / А.С. Новохатский // Под ред. В.М. Жданова, Ф.И. Ершова М.: Медицина, 1973.-С. 52-68.

79. О введении в действие Правил по санитарной охране территории СССР: Приказ Минздрава СССР от 20.07.1983 г. № 858. М.: Минздрав СССР.

80. О введении в действие перечня инфекционных заболеваний, требующих проведения мероприятий по санитарной охране территории Российской Федерации: Приказ МЗ РФ от 02.07.1999 г. № 263. М.: Минздрав России.

81. Оленев Н.О. О географическом распространении персидскЬго клеща в СССР / Н.О. Оленев // Ветеринарный труженик. JL, 1926. -№ 12. - С.5-14.

82. B.В. Кутырева. Саратов: Изд-во Саратовского ун-та, 1998. - С. 3-6.

83. Онищенко Г.Г. О неотложных мерах по борьбе с распространением заболеваний, вызываемых вирусом иммунодефицита человека / Г.Г. Онищенко, О.А. Беклемишева, М.И. Наркевич // Журн. микробиол. 1999. - № 1.1. C. 5-9.

84. Онищенко Г.Г. Распространение вирусных природно-очаговых инфекций в Российской Федерации и меры по их профилактике / Г.Г. Онищенко // Эпи-демиол. и инф. болезни. 2000. - № 4. - С. 4-8.

85. Онищенко Г.Г. Крымская-Конго геморрагическая лихорадка в Ростовской области: эпидемиологические особенности вспышки / Г.Г. Онищенко, Г.Т. Айдинов, Э.А. Москвитина и др. // Журн. микробиол. 2000. - № 2. -С. 36-39.

86. Онищенко Г.Г. Новые стратегии в предупреждении распространения ВИЧ-инфекции в России / Г.Г. Онищенко, М.И. Наркевич // Там же. № 4. -С. 5-9.

87. Онищенко Г.Г. Эпидемиологические особенности Крымской геморрагической лихорадки в Ставропольском крае в 1999-2000 гг. / Г.Г. Онищенко,

88. B.И. Ефременко, Н.Г. Ковалев и др. // Там же. 2001. - № 6 (приложение).1. C. 86-89.

89. Онищенко Г.Г. Атипичная пневмония (SARS, ТОРС) и санитарная охрана территории / Г.Г. Онищенко, Ю.М. Федоров, В.П. Топорков и др. // Пробл. особо опас. инфекций. Саратов, 2003. - Вып. 85. - С. 3-19.

90. Онищенко Г.Г. Противодействие биологическому терроризму: Практ. рук-во по противоэпидемическому обеспечению / Г.Г. Онищенко, А.А. Шапошников, В.Г. Субботин, Н.И. Батрак и др.; Под ред. академика РАМН проф. Г.Г.Онищенко М.: «Петит-А», 2003. - 301 с.

91. Осиповский А.И. Учебник паразитологии с энтомологией / А.И. Осипов-ский.-М.: Медгиз, 1959.-220 с.

92. Остерхауз А.Д.М.Е. Заражение собак чумой плотоядных материалом от байкальской нерпы / А.Д.М.Е. Остерхауз, И.К.Г. Визер, В.Л. Зорин и др. // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1992. - С. 52-53.

93. Павловский Е.Н. О природной очаговости инфекционных и паразитарных болезней: Доклад на общем собрании АН СССР / Е.Н. Павловский // Вестн. АН СССР. 1939. - № 10.-С. 98-108.

94. Павловский Е.Н Учение о природной очаговости болезней. К 20-летию его существования / Е.Н Павловский // Природная очаговость болезней и вопр.паразитологии. Алма-Ата, 1961. - Вып. 3. - С. 11-18.

95. Пастухов В.Д. Нерпа Байкала / В.Д. Пастухов // Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1993.-270 с.

96. Померанцев Б.И. Паукообразные. Иксодовые клещи (Jxodidae) / Фауна СССР. Б.И. Померанцев. - М.-Л., 1950. - Т. 4, вып. 2. - С. 223.

97. Попов В.Ф. Стратегия борьбы с корью на современном этапе / В.Ф. Попов // Журн. микробиол. 1991- № 5.- С. 50-54.

98. Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов 1-4 групп патогенности: Санитарные правила СП 1.2.036 95. - М.: Госком-санэпиднадзор России, 1996. - 80 с.

99. Прометной В.И. Научные основы информационного обеспечения санитарной охраны территории Российской Федерации: Автореф. дис. . докт. мед. наук: 14.00.30 / В.И. Прометной; Ростовский НИПЧИ. Ростов-на-Дону, 2003.-46 с.

100. Пронин Н.М. Оценка масштабов гибели байкальских тюленей в 1987/88 г. / Н.М. Пронин, Д.П. Кабанов // Вспышка чумы плотоядных у байкальской нерпы.-Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1992-С. 12-20.

101. Ю4.Реймерс Н.Ф. Насекомоядные и грызуны Верхней Лены / Н.Ф. Реймерс, А.Г. Воронов. Иркутск, 1963. - 191 с.

102. Романова Г.А. Пути распространения и характер населения серой крысы в Якутии / Г.А. Романова, С.В. Верещагина, Г.Н. Ушницкий // Материалы 4 съезда Всесоюз. териол. об-ва. М., 1986. - Т. 3. - С. 285-288.

103. Руководство по медицинской энтомологии / Под ред. В.П.' Дербеневой-Уховой. М.: Медицина, 1974 - 360 с.

104. Руководство по противоэпидемическому обеспечению населения в чрезвычайных ситуациях. М., 1995. - 440 с.

105. Санитарная охрана территории Российской Федерации. Санитарные правила и нормы. СанПиН 3.4.035-95. М.: Интер СЭН, 1996. - 51 с.

106. Санитарная охрана территории Российской Федерации: Санитарные правила, утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко от 25 мая 2003 г. // СП 3.4.1328-03. М.: Госкомсанэпиднадзор России. - 19 с.

107. Серая крыса / Под ред. В.Е. Соколова, Е.В. Карасева. М.: Наука, 1990. -122 с.

108. Сергиев В.П. Санитарная охрана территории СССР / В.П. Сергиев // Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. М.: Медицина, 1993. -Т. 1.-С. 209-220.

109. Смирнов Е.И. Войны и эпидемии / Е.И. Смирнов, В.А. Лебединский, Н.С. Гарин М.: Медицина, 1988. - 240 с.

110. Смородинцев А.А. Вирусные геморрагические лихорадки / А.А. Сморо-динцев, Л.И. Казбинцев, В.Г. Чудаков. Л.: Изд-во мед. лит., 1963. - 292 с.

111. Соколова Т.М. Формирование и свойства структур вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей: Дис. канд. биол. наук: 03.00.04 / Н.-и. ин-т вирусологии им. Д.И. Ивановского. Москва, 1974. - 192 с.

112. Сэртис Г. Выживание и развитие тропического комара Aedes aegypti в Южной Англии / Г. Сэртис, М. Хилл, Дж. Бродфут // Бюл. ВОЗ. 1972. -Т. 44, № 5. - С. 704-707.

113. Таежный клещ Ixodes persulcatus Schulze (Acarina, Ixodidae) / Под ред. Н.А.Филипповой. М.: Наука, 1985.-420 с.

114. Титенко A.M. Геморрагическая лихорадка Марбург / A.M. Титенко //

115. Журн. микробиол. 1991. - № 5. - С. 67-71.

116. Титенко A.M. Геморрагическая лихорадка Эбола / A.M. Титенко // Журн. микробиол. 1993 - №3. - С.99-105.

117. Титенко A.M. Актуальные проблемы санитарной охраны территории от завоза и распространения новых и вноьь возникающих вирусных инфекций человека / A.M. Титенко, Е.И. Андаев // Журн. инф. патол., Иркутск. 2001.- Т.8, № 2-3. С.32-43.

118. Титенко A.M. Филовирусные геморрагические лихорадки: лихорадка Эбола / A.M. Титенко // Журн. микробиол. 2002. - № 5. - С. 116-122.

119. Тихонов Н.Г. Биологический терроризм (проблемы противодействия) / Н.Г. Тихонов, А.В. Липницкий // Природноочаговые инфекции в Нижнем Поволжье. Волгоград, 2000. - С. 265-271.

120. Федоров Ю.М. Санитарная охрана территории Российской Федерации: научные основы, современные принципы и нормативно-методическое обеспечение: Автореф. дис. . докт. мед. наук: 14.00.30 / НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. М., 2004. - 50 с.

121. Филиппова Н.А. Аргасовые клещи (Argasidae) / Н.А.Филиппова // Фауна

122. СССР. Паукообразные. M.,JI.: Наука, 1966. - Т. 4, вып. 3. - 255 с.

123. Харитонова Н.Н. Омская геморрагическая лихорадка / Н.Н.Харитонова, Ю.А. Леонов. Новосибирск., 1978. - 220 с.

124. Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика бешенства / Б.Л. Черкасский. -М.: Медицина, 1985.-288 с.

125. Черкасский Б.Л. Инфекционные и паразитарные болезни человека / БЛ.Черкасский. М.: Изд-во Мед. газета, 1994. - 617 с.

126. Черкасский Б.Л. Особо опасные инфекции / Б.Л. Черкасский. М.: Медицина, 1996.- 160 с.

127. Черкасский Б.Л. Руководство по общей эпидемиологии / Б.Л. Черкасский. М.: Медицина, 2001. - 560 с.

128. Чернеску К. Корь. Патогенез и профилактика / К. Чернеску, Й. Шор док, Н. Кажал. Бухарест: АН СРР, 1981.- 242 с.

129. Чунихин С.П., Леонова Г.Н. Экология и географическое распространение арбовирусов / С.П. Чунихин, Г.Н. Леонова. М.: Медицина, 1985. - 128 с.

130. Шевченко Ю.Л. Роль современных факторов во взаимодействии человека и микроорганизмов. Значение национального здравоохранения в профилактике и лечении инфекционных болезней / ЮЛ.Шевченко // Журн. микро-биол. 2000. - № 6. - С. 3-6.

131. Шевченко Ю.Л. Микроорганизмы и человек. Некоторые особенности их взаимодействия на современном этапе / Ю.Л. Шевченко, Г.Г. Онищенко // Там же. 2001. - № 2. - С. 94-104.

132. Шоуп Р.Э. Распространение лихорадки Рифт-Валли и подходы к борьбе с нею / Р.Э. Шоуп, С.Дж. Петере, Ф.Г. Дэвис и др. // Бюл. ВОЗ. 1982. - Т. 60, № 3. - С. 1-6.

133. Щепин О.П. Международный карантин / О.П. Щепин, В.В. Ермаков. М.: Медицина, 1982.-320 с.

134. Юргенсон П.Б. О влиянии лесной куницы на численность белки в северной тайге / П.Б. Юргенсон // Зоолог, журн. 1954. - Т. 33, № 1.

135. Якименко В.В. О распространении хантавирусов в Западной Сибири / В.В. Якименко, А.Е. Деконенко, М.Г. Малькова и др. // Мед. паразитол. и паразит, болезни. 2000. -№ 3 - С. 21-28.

136. Aberle S.W. Nephropathia epidemina and Puumala virus in Austria / S.W. Aberle, P. Lehner, M. Ecker et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Inf. Dis. -1999.-Vol. 18.-P. 467-472.

137. Aedes albopictus introduction into continental Africa, 1991 // Morb. Mortal. Wkly. Rep. 1991. - Vol. 40. - P. 836-838.

138. Anderson N.G. Global screening for human viral pathogens / N.G. Anderson, J.L. Gerin, N.L. Anderson // Emerg. Inf. Dis. 2003. - Vol. 9, N 7. - P. 768-773.

139. Anthony A.M. Widespread West Nile Virus Activity, Eastern United States, 2000 / A.M. Anthony, R.P. Lyle, E. Millicent et al. // Ibid. 2001. - Vol. 7, N 4. -P. 730-735.

140. Axthelm M.K. Canine distemper virus induced thrombocytopenia / M.K. Ax-thelm, S. Krakowka // Am. J. Vet. Res. 1987. - Vol. 48, N 8. - P. 1269-1275.

141. Ayers J.R. An epizootic attributable to western equine encephalitis virus infection in emus in Texas / J.R. Ayers, T.L. Lester, A.B. Angulo // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1994. - Vol. 205, N 4. - P. 600-601.

142. Baron R.C. Ebola virus disease in southern Sudan: hospital dissemination and intrafamilial spread / R.C. Baron, J.B. McCormick, O.A. Zubeir // Bull. WHO. -1983.-Vol. 61, N 6. P. 997-1003.

143. Bhat H.R. Transmission of Kyasanur forest disease virus by Rhipicephalus hae-maphysaloides ticks / H.R. Bhat, S.V. Naik, M.A. Ilkal, K. Banerjee // Acta Virol. 1978. - Vol. 22, N 3. - P. 241-244.

144. Bhat H.R. Transmission of Kyasanur forest disease virus by the soft tick, Orni-thodoros crossi / H.R. Bhat, M.K. Goverdhan // Ibid. 1973. - Vol. 17, N 4. -P. 337-342.

145. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories / U.S. Government printing office, Washington. 1999. - 270 p.

146. Blixenkrone-Moller M. Infection studies in milk with seal-derived morbillivirus / M. Blixenkrone-Moller, V. Svansson, P. Have et al. // Arch. Vfrol. 1989. -Vol. 106.-P. 165-170.

147. Bolivian haemorrhagic fever / Wkly. Epidem. Rec. 1975. - Vol. 70, N 3. -P. 16-17.

148. Bowen E.T. Viral haemorrhagic fever in the Sudan, 1976: human virologicaland serological studies / E.T. Bowen, G.S. Piatt, G. Lloyd et al. // Ebola virus haemo-rrhagic fever / Ed. S.R. Pattin. Amsterdam; New York. - 1978. - P. 143156.

149. Bowen E.T. A comparative study of strains of Ebola virus isolated from southern Sudan and northern Zaire in 1976 / E.T. Bowen, G.S. Piatt, G. Lloyd et al. // J. Med. Virol. 1980. - Vol. 6, N 2. - P. 129-138.

150. Brummer-Korvenkontio M. Epidemiological study of nephropathia epidemica in Finland 1989-96 / M. Brummer-Korvenkontio, O. Vapalahti, H. Henttonen et al. // Scand. J. Infect. Dis. 1999. - Vol. 31. - P. 427-435.

151. Byrd R.G. Fatal illness associated with a New World Arenavirus California, 1999-2000 / R.G. Byrd, L.A. Cone, B.C. Commess et al. // Morb. Mortal Wkly. Rep. - 2000. - Vol. 49, N 31. - P. 709-711.

152. Calderon G. Hantavirus Reservoir Hosts Associated in Argentina / G. Calderon, N. Pini, J. Bolpe et al. / Emerg. Inf. Dis. 1999. - Vol. 5, N 6. - P.792-797.

153. Calisher C.H. Taxonomy, classification and geographic distribution of California serogroup bunyaviruses // California Serogroup viruses / Eds C.H. Calisher, W.H. Thompson. New York, 1983. - P. 1-16.

154. Campbell J.J. A comparison of measles and canine distemper viral polypeptides / J.J. Campbell, S.L. Cosby, I. Scott // J. Gen. Virol. 1980. - Vol. 48. -P. 144-159.

155. Cattaneo R. Biased hipermutation and other genetic changes in defective measles viruses in human brain infection / R. Cattaneo, A. Schmid, D. Eschle et al. // Cell. 1988. - Vol. 55. - P. 255-265.

156. Centers for Disease Control and Prevention. Update: outbreak of hantavirus infection-southwestern United States // Morb. Mortal. Wkly. Rep. 1993. - N 42. -P. 441-443.

157. Centers for Disease Control and Prevention. Update: raccoon rabies epizootic -United States, 1996 // Ibid. 1997. - Vol. 45. - P. 1117-1144. »

158. Clement J. The hantaviruses of Europe: from the bedside to the bench / J. Clement, P. Heyman, P. Mc Kenna et al. // Emerg. Inf. Dis. 1997. - Vol. 3. -P. 205-211.

159. Cooper G.L. Egg production drops in breeder turkeys associated with western equine encephalitis virus infection / G.L. Cooper, H.A. Medina // Avian. Dis.1999. Vol. 43, N 1. - P. 136-141.

160. Cornet J.P. Experimental transmission of the Yellow fever virus by the tick Am-blyomma variegatum (F.) / J.P. Cornet, M. Huard, J.L. Camicas et al. // Bull. Soc. Path. Exot. 1982. - Vol. 75. - P. 136-140.

161. Cyranoski D. Virus detectives seek source of SARS in China's wild animals / D. Cyranoski, A. Abbott // Nature 2003. - Vol. 423 (6939). - P. 467.

162. Summary table of SARS cases by country, 1 November 2002-7 August 2003. http://www.who.iht/csr/sars/country/en/country 2003, August 15.

163. Dahling D.R. Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment / D.R. Dahling, B.A. Wright //Appl. Environ. Microbiol. 1986. - Vol. 51, N 4. - P. 790-812.

164. De Albuquerque C.M. First report of Aedes albopictus in areas of Mata Atlan-tica, Recife, PE, Brazil / C.M. de Albuquerque, M.A Melo-Santos, M.A. Bezerra et al. // Rev. Saude. Publica. 2000. - Vol. 34, N 3. - P. 314-315.

165. De Manzione N. Venezuelan hemorrhagic fever: clinical and epidemiological studies of 165 cases / N. De Manzione, R.A. Salas, H. Paredes et al. / Clin. Inf. Dis. 1998. - Vol. 26, N 2. - P. 308-313.

166. Deinhardt F. Transmission of viral hepatitis to nonhuman primates / F. Deinhardt, A. W. Holmes, L. Wolfe, U. Junge // Vox Sanguinis. 1970. -N19.-P. 261-269.

167. Dengue/dengue haemorrhagic fever. Situation in 2000 // Wkly. Epidem. Rec.2000. Vol. 75, N 24. - P. 193-196.

168. Dietz R. Mass deaths of harbor seal (Phoca vitulina) in Europe / R. Dietz, M.P. Heide-Jorgensen, T. Markonen // Ambio. 1989. - Vol. 18, N 5. -P. 258-264.

169. Domingo E. Quasispecies structure and persistence of RNA viruses / E. Domingo, E. Baranowski, C.M. Ruiz-Jarabo // Emerg. Inf. Dis. 1998.1. Vol. 4, N4.- P. 521-527.

170. Drosten C. SARS: Reference / C. Drosten, W. Preiser // Flying Publisher, 2003. 146 p. www.SARSreference.com (23 июля 2003).

171. Duarte E.A. RNA virus quasispecies: significance for viral disease and epidemiology / E.A. Duarte, I.S. Novella, S.C. Weaver et al. // Inf. Agents Dis. 1994. -Vol.3,N4.-P. 201-214.

172. Ebola, Uganda (update) / Wkly. Epidem. Rec. 2000. - Vol.75, N 50. - P. 409.

173. Ecker M. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia / M. Ecker, S.L. Allison, T. Meixner, F.X. Heinz //J. Gen. Virol.- 1999.-Pt. l.-P. 179-1C5.

174. El Mekki A.A. A comparison of indirect immunofluorescence and electron microscopy for the diagnosis of some haemorrhagic viruses in cell cultures / A. A. El Mekki, G. Van der Groen //J. Virol. Meth. 1981. - Vol.3. - P. 61-69.

175. El-Azazy O.M. Crimean-Congo haemorrhagic fever virus infection in the western province of Saudi Arabia / O.M. el-Azazy, E.M. Scrimgeour// Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1997. - Vol. 91, N 3. - P.275-278.

176. Elliott L.H. Isolation of a causative agent of hantavirus pulmonary syndrome / L.H. Elliott, T.G. Ksiazek, P.E. Rollin et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1994. -Vol. 51.-P. 102-108.

177. Elswood B. F. Polio vaccines and the origin of AIDS / B.F. Elswood, R.B. Strieker // Med Hypotheses. 1995. - Vol. 44, N 3. - P. 226.

178. Elvinger F. Protection of pigs by vaccination of pregnant sows against eastern equine encephalomyelitis virus / F. Elvinger, C.A. Baldwin, A.D. Liggett et al. // Vet. Microbiol. 1996. - Vol. 51, N 3-4. - P. 229-239.

179. Emond R.T.D. A case of Ebola virus infection / R.T.D. Emond, B. Evans, E.T.W. Bowen, G. Lloyd //Brit. Med. J. 1977. - Vol. 2. - P. 541-544.

180. Enders J.F. Propogation in tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles / J.F. Enders, T.C. Preebles // Proc. Soc. Exp. Biol. 1954. -Vol. 8.-P. 473-508.

181. Enserink M. Infectious diseases. Clues to the animal origins of SARS / M. En-serink// Science. 2003. - Vol. 300. - P. 1351. - http://www.sciencemag.org.

182. Ewald P.W. Guarding against the most dangerous emerging pathogens: insightsfrom evolutionary biology / P.W. Ewald // Emerg. Inf. Dis. 1998. - Vol. 2, N 4. -P. 245-256.

183. Filovirus infection among persons with occupational exposure to nonhuman primates // Wkly. Epidem. Rec. 1990. -N 24. - P. 185-186.

184. Fisher S.G. Cancer risk associated with simian virus 40 contaminated polio vaccine / S.G. Fisher, L. Weber, M. Carbone // Anticancer Res. 1999. - Vol. 19, N3(B).-P. 2173-2180.

185. Fisher-Hoch S.P. Review of cases of nosocomial Lassa fever in Nigeria: the high price of poor medical practice / S.P. Fisher-Hoch, O. Tomori, A. Nasidi et al. // B.M.J. 1995. -Vol. 311, N 7009. - P. 857-859.

186. Fisher-Hoch S.P. Effective vaccine for Lassa fever / S.P. Fisher-Hoch, L. Hut-wagner, B. Brown, J.B. McCormick // J. Virol. 2000. - Vol. 74, N 15. -P. 6777-6783.

187. Fleischer K. Lassa fever / K. Fleischer, B. Kohler, A. Kirchner, J. Schmid // Med. Clin. 2000. - Vol. 95. - P. 340-345.

188. Fontenille D. New vectors of Rift Valley fever in West Africa / D. Fontenille, M. Traore-Lamizana, M. Diallo et al. // Emerg. Inf. Dis. 1998. - Vol.4, N 2. -P. 289-293.

189. Frey Т.К. Molecular biology of rubella virus / Т.К. Frey // Adv. Virus Res. -1994.-Vol. 44.-P. 69-160.

190. Frey Т. K. Present status of rubella virus Microbe hunters: then and now / Eds. H. Koprowski, M.B.A. Oldstone // Medi-Ed Press. - 1996. - P. 269-282.

191. Geisbert T.W. Differentiation of filoviruses by electron microscopy / T.W. Geis-bert, P.B. Jahrling // Virus. Res. 1995. - Vol.39, N 2-3. - P. 129-150.

192. Georges-Courbot M.C. Ebola: a virus endemie to central Africa? / M.C. Geor-ges-Courbot, E. Leroy, H. Zeller // Med Trop (Mars). 2002. - Vol.62, N 3. -P. 295-300.

193. Georges-Courbot M.C. Isolation and phylogenetic characterizatic/n of Ebola viruses causing different outbreaks in Gabon / M.C. Georges-Courbot, A. Sanchez, C.Y. Lu et al. // Emerg. Inf. Dis.-1997. Vol.3, N 1. - P. 59-62.

194. Geraci J.R. Mass mortality of harbor seals: pneumonia associated with influenza A virus / J.R. Geraci, D.J. St.Aubin, I.K. Barker et al. // Science. 1982.1. Vol. 215. P. 1129-1131.

195. Gligic A. Belgrade virus: a new hantavirus causing vere hemorrhagic fever with renal syndrome in Yugoslavia / A. Gligic, N. Dimkovic, S.Y. Xiao et al. // J. Inf. Dis.- 1992. -Vol. 166.-P.l 13-120.

196. Gomes Ad. Aedes albopictus in rural zone of Brazil and its implication in the wild yellow fever transmission / Ad. Gomes, M.D. Bitencourt, D. Natal et al. // Rev. Saude. Publica. 1999. - Vol.33. - P. 95-97.

197. Gonzalez J.P. Genetic characterization and phylogeny of Sabia virus, an emergent pathogen in Brazil / J.P. Gonzalez, M.D. Bowen, S.T. Nichol, R. Rico-Hesse // Virology. 1996. - Vol. 221. - P. 318-324.

198. Gonzalez J.P. Ebola and Marburg virus antibody prevalence in selected population of the Central African Republic / J.P. Gonzalez, E. Nacoune, W. Slenczka et al. // Microbes infect. 2000. - Vol. 2, N 1. - P. 39-44.

199. Goverdhan M.K. Reaction of Rattus rattus wroughtony to Kyasanur forest disease virus / M.K. Goverdhan, C.R. Anderson // Indian J. Med. Res. 1978. -Vol. 67.-P. 5-10.

200. Goverdhan M.K. The reaction of Funambulus tristriatus, Rattus blanfordi and Suncus murinus to Kyasanur forest disease virus / M.K. Goverdhan, C.R. Anderson // Indian J. Med. Res. 1981. - Vol. 74. - P. 141-146.

201. Grachev M.A. Distemper virus in Baikal seals / M.A. Grachev, V.P. Kumarev, L.V. Mamaev et al. // Nature. 1989. - Vcl. 338. - P. 209.

202. Groen J. Hantavirus infections in the Netherlands: epidemiology and disease / J. Groen, M.N. Gerding, J.G. Jordans et al. // Epidemiol. Inf. 1995. - Vol. 114. -P. 373-383. •

203. Gubler D.J. Emergence of epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health problem in the Americas / D.J. Gubler, D.W. Trent // Inf. Agents Dis. -1993. Vol. 2, N 6. - P. 383-393.

204. Gubler D.J. Dengue/dengue hemorrhagic fever: the emergence of a global healthproblem / D.J. Gubler, G.G. Clark I I Emerg. Inf. Dis. 1995. - Vol.1. - P. 55-57.

205. Gunther S. Imported Lassa fever in Germany: molecular characterization of a new Lassa virus strain / S. Gunther, P. Emmerich, T. Laue et al. // Emerg. Inf. Dis. 2000. - Vol. 6, N 5. - P. 466-476.

206. Guy J.S. Experimental infection of young broiler chickens with eastern equine encephalitis virus and Highlands J virus / J.S. Guy, H.J. Barnes, L.G. Smith // Avian Dis. 1994. - Vol. 38, N 3. - P. 572-582.

207. Halstead S.B. The pathogenesis of dengue molecular epidemiology / S.B. Hal-stead // Americ. J. Epidemiol. 1981. - Vol. 114. - P. 632-648.

208. Hantavirus pulmonary syndrome United states, 1993 // Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 1994. - Vol. 43, N 3. - P. 45-48.

209. Hepatitis A associated with consumption of frozen strawberries Michigan, March 1997 // Ibid. - 1997. - Vol. 46. - P. 288-295.

210. Horwood J. Lessons from the seal epidemic. As the great seal epidemic finally abates, now is the time to evaluate what we have learnt from the whole episode / J. Horwood // New Scientist. 1989. - P. 3 8-40.

211. Hsing G. Plaque formation with poliomyelitis, Coxsackie and orphan (ECHO) virus in bottle cultures of monkey epithelial cells / G. Hsing, I. Melnick // Virology. 1955.-Vol. l.-P. 533-542.

212. Human monkeypox Kasai Oriental, Democratic Republic of Congo, February 1996-October 1997 // Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 1997. - Vol. 46, N 49. -P. 1168-1171.

213. Igarashi A. A hypothesis on the geographical distribution of arboviruses / A. Igarashi // Trop. Med. 1981. - Vol. 26, N 4. - P. 173-179.

214. International catalogue of arboviruses including certain viruses of vertebrates. Third edition. / Ed. by N. Karabatsos. San Antonio, Texas, 1985. With supplement, 1991.

215. Jager M. Experimental inoculation of Beagle dogs permits serol6gical differentiation of phocine and canine distemper virus / M. Jager, B. Liess, T. Harder et al. // Wiener Tierarztliche Monatsschrift. 1989. - Vol. 77, N 4. - P. 105-108.

216. Jainkittivong A. Herpes В virus infection / A. Jainkittivong, R.P. Langlais // Oral. Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 1998. - Vol. 85.1. P. 399-403.

217. Johnson E.D. Characterization of a new Marburg virus isolated from a 1987 fatal case in Kenya / E.D. Johnson, B.K. Johnson, D. Silverstein et al. // Arch. Virol. Suppl.-1996.-Vol. 11.-P. 101-114.

218. Johnson K.M. Isolation and some properties of Ebola virus (Zaire) / K.M. Johnson, P.A. Webb, J.V. Lange, F.A. Murphy // Lancet. 1977. - Vol. 1. -P. 569-571.

219. Johnson K.M. Ecology of Ebola virus: a first clue? / K.M. Johnson, C.L. Scrib-ner, J.B. McCormick // J. Inf. Dis. 1981. - Vol. 143, N 5. - P. 749-751.

220. Johnson K.M. Haemorragic fever threats in the 1980 // Proc. 3 th Sympos. Ar-. bovir. Res. In Australia / Ed. T.D. St. George, B:H. Kay. Australia: Commonwealth Sci. Industr. Res. Org. and QueeAnsi. Inst. Med. Res. - 1982. -P. 203-215.

221. Keana I.F. A new versatile ketone spin label / I.F. Keana, S.B. Keana, D.A. Beetham // J. Amer. Chem. Soc. 1967. - Vol. 89. - P. 3055-3056.

222. Kenyon R.H. Actions of complement on Junin virus / R.H. Kenyon, C.J. Peters // Rev. Infect. Dis. 1989. - Vol. 11, N 4. - P. 771-776.

223. Khodakevich L. Monkeypox virus: ecology and public health significance / L. Khodakevich, Z. Ezek, D. Messinger // Bull. World Health Organ. 1988. -Vol. 66,N6.-P. 747-752.

224. Kiley M.P. Ebola virus: identification of virion structural proteins / M.P. Kiley, R.L. Regnery, K.M. Johnson // J. Gen. Virol. 1980. - Vol.49, N 2. - P. 333-341.

225. Kiley M.P. Filoviridae: a taxonomic home for Marburg and Ebola viruses? / M.P. Kiley, E.T.W. Bowen, G.A. Eddy et al. // Intervirology. 1982. - Vol. 18. -P. 24-32.

226. Kwik G. So that can we learn about epidemics after recovering from SARS / G. Kwik // A publication of the John Hopkins Center for Civillian Biodefense Strategies. Biodefense Quarterly. 2003. - Vol. 5 (2). - P. 1-2.

227. Laboratory biosafety manual / World Health Organization, Geneva. 1983. -124 p.

228. Laboratory biosafety manual / World Health Organization, Geneva. 2003. -99 p.

229. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmly // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

230. Lang G. Isolation of an influenza A virus from seals / G. Lang, A. Gagnon, J.R. Geraci // Arch. Virol. -1981.- Vol. 68. P. 189-195.

231. Lassa fever // Wkly. Epidem. Rec. 1997. - Re.20:145-146.

232. Le Guenno B. Hantavirus epidemic in Europe, 1993 / B. Le Guenno, M.A. Camprasse, J.C. Guilbaut et al. // Lancet. 1994. - Vol. 343. - P.l 14-115.

233. Lederberg J. Infectious diseases as an evolutionary paradigm / J. Lederberg // Emerg. Inf. Dis. 1997. - Vol. 3, N 4. - P. 417-423.

234. Lederberg J. Emerging infections: an evolutionary perspective / J. Lederberg // Ibid. 1998. - Vol. 4, N 3. - P. 366-371.

235. Levins R. Hantavirus disease emerging / R. Levins, P.R. Epstein, M. E. Wilson et al. // Lancet. 1993. - Vol. 342. - P. 1292.

236. Li R.C.C. Hantavirus infection in Hong Kong / R.C.C. Li, Т. Мок // Publ. Health. Epid. Bull. 1998. - Vol. 7. - P. 34-25.

237. Ijaz M.K. Development of methods to study the survival of airborne viruses / M.K. Ijaz, Y.G. Karim, S.A. Sattar, C.M. Johnson-Lussenburg // J. Virol. Meth. 1987.-Vol. 18,N2-3.-P. 87-106.

238. Mackenzie J.S. Emerging Viral Diseases of Southeast Asia and the Western Pacific / J.S. Mackenzie, K.B. Chua, P.W. Daniels et al. // Emerg. Inf. Dis. 2001. -Vol. 7. - P.497-504.

239. Mahy B.W.J. Human viral infections: an expanding frontier / B.W.J. Mahy // Antiviral Res. 1997. - Vol. 36. - P. 75-80.

240. Maiztegui J.I. Protective efficacy of a live attenuated vaccine agdinst Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group / J.I. Maiztegui, K.T.Jr. McKee, J.G. Oro Barrera et al. // J. Inf. Dis. 1998. - Vol. 177, N 2. - P. 277-283.

241. Marburg Fever, Democratic Republic of the Congo // Wkly. Epidem. Rec. -1999.-Vol. 74, N 19.-P. 145.

242. Martini G.A. Marburg virus disease / G.A. Martini, R. Sitgert eds. New York, 1971.-231 p.

243. McCarthy M. Newer viral encephalitides / M. Mc Carthy // Neurolog. 2003. -Vol. 9.-P.189-199.

244. McClain M.E. Plague morphology and pathogenicity of vesicular exanthem virus / M.E. McClain, A.J. Hackett, S.H. Madin // Science. 1958. - Vol. 127. -P. 1391-1392.

245. McCormick J.B. Biologic differences between strains of Ebola virus from Zaire and Sudan / J.B. McCormick, S.P. Bauer, L.H. Elliott et al. // J. Inf. Dis. 1983. -Vol.147, N 2. -P.264-267.

246. McCormick J.B. Lassa fever. Effective therapy with ribavirin / J.B. McCormick, I.J. King, P.A. Webb et al. // N. Engl. J Med. 1986. - Vol. 14. - P. 20-26.

247. McCormick J.B. A prospective study of the epidemiolody and ecolody of Lassa fever / J.B. McCormick, P.A. Webb, J.W. Krebs et al. // J. Inf. Dis. 1987. -Vol. 155.-P. 437-444.

248. Mcintosh B.M. Epidemics of West Nile and Sindbis viruses in South Africa with Culex univittatus Theobald as Vector / B.M. Mcintosh, P.G. Jupp, I.D. Santos, G.M. Meenehan // South Africa J. Science. 1976. - Vol. 72. - P. 295-300.

249. Media reports of Crimean-Congo haemorrhagic fever, Pakistan // Wkly Epidem. Rec.-2001.-Vol. 76,N41.-P. 318.

250. Miralles R. Diminishing returns of population size in the rate of RNA virus adaptation / R. Miralles, A. Moya, S.F. Elena // J. Virol. 2000. - Vol. 74, N 8. -P. 3566-3571.

251. Мое J.B. Plaque assay for Ebola virus / J.B. Мое, R.D. Lambert, H.W. Lupton //J. Clin. Microbiol. 1981.-Vol. 13, N4.-P. 791-793.

252. Monath T.P. Ecology of Marburg and Ebola viruses: speculations and directions for future research / T.P. Monath // J. Infect. Dis. 1999. - Vol. 179 (Suppl 1). -P. 127-138. *

253. Morris C.D. Comparison of chickens and pheasants as sentinels for eastern equine encephalitis and St. Louis encephalitis viruses in Florida / C.D. Morris,• W.G. Baker, L. Stark et al. // Am. Mosq. Control Assoc. 1994. - Vol. 10, N 4. -P. 545-548.

254. Morris J.G. Emergence of new pathogens as a function of changes in host susceptibility / J.G. Morris, M. Potter // Emerg. Inf. Dis. 1997. - Vol. 3, N 4. -P. 435-441.

255. Morse S.S. Looking for a link / S.S. Morse // Nature. 1990. - Vol. 344. -P. 297.

256. Morse S.S. Factors in the emergence of infectious diseases / S.S. Morse //Emerg. Inf. Dis.- 1995.-Vol.1, N 1.-P. 11-19.

257. Morzunov S.P. A newly recognized virus associated with a fatal case of hantavirus pulmonary syndrome in Louisiana / S.P. Morzunov, H. Feldmann, C.F. Spiropoulou// J. Virol. 1995.-Vol.69.-P. 1980-1983.

258. Moss B. Hydroxylapatite chromatography of protein-SDS complexes. A new method for the separation of polypeptide subunits / B. Moss, E.N. Rosenblum // J. Biol. Chem. 1972. - Vol. 247. - P. 5194-5198.

259. Nermut M.V. Freeze-drying and freeze-etching of viruses // Eds. E.L. Benedetti, P. Favard. In Freeze-etching, techniques and applications. Paris, 1973. -P. 135-150.

260. Nichol S.T. Genetic identification of a hantavirus associated with an outbreak of acute respiratory illness / S.T. Nichol, C.F. Spiropoulou, S. Morzunov et al. // Science. 1993. - Vol. 262. - P. 914-917.

261. Niklasson B. Epidemiology of nefropathia epidemica in Sweden / B. Niklasson, J. LeDuc // J. Inf. Dis. 1987. - Vol. 155. - P. 269-276.

262. Nipah virus // Wkly Epidem. Rec. 2002. - Vol. 77, N. 36. - P. 297-299.

263. Nipah virus outbreak(s) in Bangladesh, January-April 2004 // Wkly Epidem. Rec. -2004.-N 17.-P. 161-172.

264. Nuttall P.A. Adaptations of arboviruses to ticks / P.A. Nuttall, L.D. Jones, M. Labuda, W.R. Kaufman // J. Med. Entomol. 1994. - Vol. 31, N 1. - P. 1-9.

265. Ogen-Odoi A. Isolation of thogoto virus (Orthomyxoviridae) fr6m the banded mongoose, Mongos mungo (Herpestidae), In Uganda/ A. Ogen-Odoi, B.R. Miller, C.M. Happ, G.O. Maupin et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999. - Vol. 60, N 3.-P. 439-440.

266. Okello G.B. Outbreak of yellow fever in Kenya / G.B. Okello, N. Agata,

267. J. Ouma et al. // Lancet. 1993. - Vol. 341, N 8843. - P. 489.

268. Osterhaus A.D.M.E. Canine distemper virus in seals / A.D.M.E. Osterhaus, J. Groen, P. Vries et al. // Nature. 1988. - Vol. 335. - P. 403-404.

269. Osterhaus A.D.M.E. Identification of virus causing recent seal deaths / A.D.M.E. Osterhaus, E.J. Vedder // Nature. 1988. - Vol. 335. - P. 20.

270. Osterhaus A.D.M.E. Distemper virus in Baikal seals / A.D.M.E. Osterhaus, J. Groen, F.G.C.M. Uytdehaag et al. // Ibid. 1989. - Vol. 338. - P. 209-210.

271. Osterhaus A.D.M.E. Seal vaccination success / A.D.M.E. Osterhaus, F.G.C.M. Uytdehaag, J.K.G. Visser et al. //Nature. 1989. - Vol. 337. - P. 21.

272. Ostrowski S.R. B-virus from Pet Macaque Monkeys: An Emerging Threat in the United States? / S.R. Ostrowski, M.J. Leslie, T. Parrott et al. // Emerg. Inf. Dis. -1998.-Vol. 4,N l.-P.l 17-121.

273. Outbreak of Ebola haemorrhagic fever, Uganda, August 2000-January 2001 // Wkly. Epidem. Rec. 2001. - Vol. 76, N 6. - P. 41 -46.

274. Outbreak of Hendra-like virus Malaysia and Singapore, 1998-1999 // Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 1999. - Vol. 48, N 13. - P. 265-269.

275. Pacsa A.S. Hantavirus-specific antibodies in rodents and humans living in Kuwait / A.S. Pacsa, E.A. Elbishbishi, U.C. Chaturvedi et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 3. - P. 139-142.

276. Pattanayak S. Japanese encephalitis in India: incidence based on reported cases (1979-1980) / S. Pattanayak, R.G. Roy, N. Choudhury // J. Indian Ass. Communis Dis. 1981.-Vol. 4.-P. 26-31.

277. Pepperell C. West Nile virus infection in 2002: morbidity and m6rtality among patients admitted to hospital in southcentral Ontario / C. Pepperell, N. Rau, S. Krajden, R. Kern et al.//CMAJ. 2003. -Vol. 168, N 11. - P. 1399-405.

278. Peters C.J. Arenaviruses / C.J. Peters: Clinical virology / Ed. By: D. Richman, R.J. Whitley, F.G. Hayden. New York, Churchill Livingstone. - 1997.1. P. 973-996.

279. Petersen L.R. West Nile Virus: A Reemerging Global Pathogen / L.R. Petersen, J.T. Roehrig // Emerg. Inf. Dis. 2001. - Vol.7, N 4. - P. 611-614.

280. Pilaski J. Haemorrhagic fever with renal syndrome in Germany / J. Pilaski, C. Ellerich, T. Krentzer et al. // Lancet. -1991. Vol.337. - P. 111.

281. Porterfield J.S. Togaviridae / J.S. Porterfield, J. Casals, M.P. Chumakov, S.Y. Gaidamovich // Intervirology. 1978. - Vol. 9, N 3. - P. 129-148.

282. Powers A.M. Re-emergence of chikungunya and o'nyong-nyong viruses: evidence for distinct geographical lineages and distant evolutionary relationships / A.M. Powers, A.C. Brault, R.B. Tesh, S.C. Weaver // J. Gen. Virol. 2000. -Vol. 81.-P. 471-479.

283. Prevention of B-virus infection: a safety program for macaque monkey handlers,1999, http://www.haz-map.com/Prevent.html (9 anp. 1999).

284. Rappole J.H. Migratory birds and spread of West Nile virus in the Western Hemisphere / J.H. Rappole, S.R. Derrickson, Z. Hubalek // Emerg. Inf. Dis.2000. Vol. 4. - P. 319-328.

285. Re-emergence of Bolivian haemorrhagic fever // Wkly Epidem. Rec. 1995. -Vol. 70,N3.-P. 16-17.

286. Reiter P. First recorded outbreak of yellow fever in Kenya, 1992-1993. II. Ento-mologic investigations / P. Reiter, R. Cordellier, J.O. Ouma et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1998. - Vol. 59, N 4. - P.650-656.

287. Rice G.P.A. A new solidphase enzyme-linked immunosorbent assay for specific antibodies to measles virus / G.P.A. Rice, P. Casali, M.B.A. Oldstone // J. Inf. Dis.- 1993.-Vol. 147, N6.-P. 1055-1059.

288. Rocco I.M. Brief communication. First isolation of Denge 3 in Brazil from an imported case / I.M. Rocco, B.B. Kavakama, C.L.S. Santos // Rev. Inst. Med. Trop S. Paulo.-2001. Vol. 43. - P. 55-57.

289. Rodriguez L.L. Molecular investigation of a multisource outbreak of Crimean-Congo hemorrhagic fever in the United Arab Emirates / L.L. Rodriguez, G.O. Maupin, T.G. Ksiazek et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1997. - Vol. 57,- N5.-P. 512-518.

290. Rodriques L.L. Persistence and genetic stability of Ebola virus during outbreakin Kikwit, Democratic Republic of the Congo, 1995 / L.L. Rodriques, A. De Roo, Y. Guimard etal.//J. Inf. Dis.- 1999.-Vol. 179 (Suppl.l). P. 170-176.

291. Rollin P.E. Hantavirus epidemic in Europe, 1993 / P.E. Rollin, D. Coudrier, P. Sureau // Lancet. 1994. - Vol. 343. - P. 115-116.

292. Ruiz-Jarabo C.M. Memory in viral quasispecies / C.M. Ruiz -Jarabo, A. Arias, E. Baranowski et al. // J. Virol. 2000. - Vol. 74, N 8. - P. 3543-3547.

293. Russel P.K., Nisalak A., Suckanavachana P., Vivona S. A plaque reduction test for dengue virus neutralizing antibodies // J. Immunol. 1967. - Vol. 99. -P. 285-290.

294. Russell R.C. Survival of insects in the wheel bays of a Boeing 747 В aircraft on flights between tropical and temperate airports / R.C. Russell // Bull. WHO. -1987.-Vol. 65.-P. 659-662.

295. Rwaguma E.B. Emergence of epidemic o'nyong-nyong fever in southwestern Uganda, after an absence of 35 years / E.B. Rwaguma, J.J. Lutwama, S.D.K. Sempala et al. // Emerg. Inf. Dis. 1997. - Vol. 3, N 1. - P. 77.

296. Salas R.A. Ecological studies of enzootic Venezuelan equine encephalitis in north-central Venezuela, 1997-1998 / R.A. Salas, C.Z. Garcia, J. Liria et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2001. - Vol. 64, N 1-2. - P. 84-92.

297. Sanders E.J. Yellow fever: an emerging threat for Kenya and other east African countries / E.J. Sanders, P.M. Tukei // East. Afr. Med. J. 1996. - Vol. 73, N 1. -P. 10-12.

298. Schlauder G.G. Molecular and serologic analysis in the transmission of GB hepatitis agent / G.G. Schlauder, G.J. Dawson, J.N. Simons et al. // J. Med. Virol. 1995.-Vol.46.-P. 81-90.

299. Schmaljohu C. Hantaviruses: a global disease problem / C. Schmaljohu, B. Hjelle // Emerg. Inf. Dis. 1997. - Vol. 3. - P. 95-105.

300. Schulze I.T., Schlesinger R.W. // Virology. 1963. - Vol. 19. - P. 40-48.

301. Siegert R. Nachweis des Marburg virus patienten / R. Siegdrt, H.-L. Shu, W. Slenczka // Dtch. med. Wschr. - 1968. - Vol. 93. - P. 616-619.

302. Siegert R. Laboratory diagnosis and pathogenesis / R. Siegert, W. Slenczka // Marburg virus disease / Eds. G.A. Martini, R. Siegert. - Berlin, Heidelberg,

303. New York. 1971. - P. 157-160.

304. Siegert R. Marburg virus / R. Siegert. New York, 1972. - Vol. 11. -P. 97-153.

305. Simons J.N. Identification of two flavivirus-like genomes in the GB hepatitis agent / J.N. Simons, T.J. Pilot-Matias, T.P. Leary et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 2. - P. 3401-3405.

306. Simons J.N. Isolation of novel virus like sequences associated with human hepatitis / J.N. Simons, T.P. Leary, G. J. Dawson et al. // Nature Med. - 1995. -N l.-P. 564-569.

307. Simpson D.I. Vervet monkey disease. Experimental infection of guinea pigs and monkeys with causative agent / D.I. Simpson, I. Zlotnik, D.A. Rutter // Br. J. Exp. Pathol. 1968. - Vol. 49. - P. 458-464.

308. Slenczka W. Biological properties of the Marburg virus / W. Slenczka, G. Wolff // Marburg virus disease / Eds. G.A. Martini, R. Siegert. Berlin, Heidelberg, New York. - 1971. - P. 105-108.

309. Smallpox eradication. Destruction of variola virus stocks // Wkly. Epidem. Rec. 1999. - Vol. 74, N 24. - P. 188-191.

310. Smallpox eradication. WHO Advisory Committee on variola virus research // Wkly. Epidem. Rec. 2000. - Vol. 75, N 6. - P. 45-48.

311. Starke G. Serological relationships between certain avian and animal paramyxoviruses / G. Starke, D.J. Alexander, P. Nymadawa, Konstantinow Siebilsit // Acta Virol. 1977. - Vol. 21, N 6. - P. 503-506.

312. Strauss J. The alphaviruses: gene expression, replication, evolution / J. Strauss, E.G. Strauss//Microbiol. Rev. 1994.-Vol. 58.-P. 491-562.

313. Takada A. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications / A. Takada, Y. Kawaoka // Rev. Med. Virol. 2003. - Vol.13, N 6 - P. 387-398.

314. Tengelsen L.A. Response to and efficacy of vaccination against eastern equine encephalomielitis virus in emus / L.A. Tengelsen, R.A. Bowen, M.A. Royals et al. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 2001. - Vol. 218, N 9. - P. 1469-1473.

315. Ternovoi V.A. Tick-Borne Encephalitis with Hemorrhagic Syndrome, Novosi-. birsk Region, Russia, 1999 / V.A. Ternovoi, G.P. Kurzhukov, Y.V. Sokolov,

316. G.Y. Ivanov et al. // Emerg. Inf. Dis. 2003. - Vol. 9, N 6. - P. 743-746.

317. Thonnon J. Re-emergence of yellow fever in Senegal in 1995 / J. Thonnon, D. Fontenille, A. Tall et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1998. - Vol. 59. - P. 108114.

318. Titenko A.M. Tick-borne encephalitis epidemiology in some provinces of Siberia / A.M. Titenko, A.D. Botvinkin, E.I. Andaev // Zent. Bakteriol. 1999. -Vol. 289.-P. 595-604.

319. Tomori O. Impact of yellow fever on the developing world / O. Tomori //Adv. Virus. Res. 1999.- Vol. 53. - P. 5-34.

320. Truant A.L. Development of an immunofluorescence focus assay for Ebola virus / A.L. Truant, R.L. Regnery., M.P. Kiley // J. Clin. Microbiol. 1983. -Vol.18, N2.-P. 416-419.

321. Update: outbreak of Nipah virus Malaysia and Singapore, 1999 //Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 1999. - Vol. 48. - P. 335-337.

322. Update: West Nile virus activity Eastern United States, 2000 // Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 2000. - Vol. 49. - P. 1044-1047.

323. Van der Groen G. Ebola virus Haemorrhagic Fever / G. Van der Groen, P. Webb, K. Johnson et al.; Ed. S.R. Pattin. Amsterdam; New York. - 1978. -P. 255-260.

324. Van der Groen G. Use of betapropiolactone inactivated Ebola, Marburg and Lassa intracellular antigens in immunofluorescent antibody assay / G. Van der Groen, L.H. Elliot // Ann. Soc. Belg. Med. Trop. 1982. - Vol. 62. - P. 49-54.

325. Vapalahti O. Inko and Tahyna, the European California serogroup bunyavi-rusws: sequence and phylogeny of the S RNA segment / O. Vapalahti, A. Plyus-nin, Y. Cheng et al. // J. Gen. Virol. 1996. - Vol. 77, Part 8. - P. 1Г769-1774.

326. Vasconcelos P.F.C. Yellow fever in Para State, Amazon region of Brazil, 19981999: entomologic and epidemiologic findings / P.F.C. Vasconcelos,

327. A.P.A.T. Rosa, S.G. Rodrigues // Emerg. Inf. Dis. 2001. - Vol. 7, N 3 (Suppl.). -P. 566-569.

328. Vassilev Tch. A reference preparation for human immunoglobulin against Crimean-Congo haemorrhagic fever / Tch. Vassilev, V. Valchev, G. Kazarov et al. //Biologicals. 1991. -Vol. 19, N l.-P. 57-59.

329. Vicens R. Yellow fever epidemic in the extreme North of Cameroon in 1990: first yellow fever virus isolation in Cameroon / R. Vicens, V. Robert, D. Pignon et al. // Bull. World. Health. Organ. 1993. - Vol. 71(2). - P. 173-176.

330. Viral Haemorrhagic Fever Marburg, Democratic Republic of the Congo // Wkly. Epidem. Rec. - 1999. - Vol. 74, N 20. - P. 157-158.

331. Viral Haemorrhagic Fever / Marburg, Democratic Republic of the Congo (update) // Wkly. Epidem. Rec. 2000. - Vol. 75, N 14. - P. 109.

332. Visser I.K.G. Comparison of two morbilliviruses isolated from seals during outbreaks of distemper in North West Europe and Siberia / I.K.G. Visser, V.P. Ku-marev, C. Orvell et al.//Arch. Virol. 1990. - Vol. 11 l.-P. 149-164.

333. Visser I.K.G. Virus infections of seals and other pinnipeds / I.K.G. Visser, J.S. Teppema, A.D.M.E. Osterhaue // Revs. Med. Microbiol. 1991. - Vol. 2. -P. 105-114.

334. Webb P.A. Some observations on the properties of Ebola virus / P.A. Webb, K.M. Johnson, H. Wulff, J.V. Lange // Ebola virus Haemorrhagic Fever / Ed. S.R. Pattin. Amsterdam; New York. - 1978. - P. 91-94.

335. Weber K. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl-sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis / K. Weber, M. Osborn // J. Biol. Chem. -1969.-Vol. 244,N 16.-P. 4406-4412.

336. Webster R.G. Characterization of an influenza A virus from seals / R.G. Webster, V.S. Hinshaw, W.J. Bean et al. // J. Virology. 1981. - Vol. 113. - P. 712724.

337. Weekly Up date: West Nile virus activity United States, 2001 // Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 2001. - Vol. 50, N 41. - P. 897-898.

338. Wells R.M. An unusual hantavirus outbreak in southern Argentiha: person-to-person transmission? / R.M. Wells, S.S. Estani, Z.E. Yadon et al. // Emerg. Inf. Dis.- 1997.-Vol. 3.-6 p.

339. West Nile virus, Canada-update; West Nile virus, United States of America // Wkly. Epidem. Rec. 2002. - Vol. 77, N 39. - P. 325.

340. Wilesmith J.W. Bovine spongiform encephalopathy / J.W. Wilesmith, G.A.H. Wells IIСуш. Top. Microbiol. Immunol. 1991. - Vol. 172.-P. 21-38.

341. Wilesmith J.W. Bovine spongiform encephalopathy: epidemiological studies on the origin / J.W. Wilesmith, J.B.M. Ryan, M.J. Atkinson // Vet. Res. — 1991. — Vol.128. -P.199-203.

342. Will R.G. A new variant of Creutzfeld-Jakob disease in the UK / R.G. Will, J.W. Ironside, M. Zeidler et al. // Lancet. 1996. - Vol. 347, N 9006. - P. 921925.

343. Willems W.R. Semliki Forest Virus: cause of a fatal case of human encephalitis / W.R. Willems, G. Kalusa, C.B. Boschek et al. // Science. 1979. - Vol. 203. -P. 1127-1129.

344. Wilson M.E. Travel and the emergence of infectious diseases / M.E. Wilson // Emerg. Inf. Dis. 1996. - Vol.1, N2.-109-121.

345. Wolfe N.D. Wild primate populations in emerging disease research: the missing line? / N.D. Wolfe, A.A. Escalante, W.B. Karesh et al. // Ibid. 1998. - Vol. 4, N2.-P. 149-158.

346. Wulff H.T. Indirect immunofluorescence for the diagnosis of Lassa fever infection / H.T. Wulff, J.V. Lange // Bull. WHO. 1975. - Vol. 52. - P. 429-436.

347. Yanagihara R. Hantavirus infection in the United States: epizootology and epidemiology / R.Yanagihara // Rev. Inf. Dis. 1990. - Vol.12. - P. 449-457.

348. Yellow fever//Wkly. Epidem. Rec.- 1995.-N 10.-P. 65-70.

349. Zoller L. Seroprevalence of hantavirus antibodies in Germany as determined by a new recombinant enzyme immunoassay / L. Zoller, M. Faulde, H. Meisel et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Inf. Dis. 1995. - Vol. 14. - P. 305-313.

350. Zuskerman A.J. The new GB hepatitis viruses / A.J. Zuskerman // Lancet. -1995. Vol. 345. - P.1453-1454.1. БЛАГОДАРНОСТИ

351. Выражаю сердечную признательность и благодарность научному консультанту работы академику РАМН, доктору медицинских наук, профессору Г.Г. Онищенко.

352. Благодарю директора Иркутского НИПЧИ заслуженного деятеля науки РФ, доктора медицинских наук, профессора Е.П. Голубинского за предоставленную возможность выполнения диссертации, помощь и поддержку в работе.

353. Выражаю глубокую и искреннюю благодарность всем соавторам опубликованных работ.