Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Влияние факторов острой фазы воспаления на активацию базофилов и тучных клеток человека in vitro

п

На правах рукописи

ПРОНИНА Анастасия Павловна

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ОСТРОЙ ФАЗЫ ВОСПАЛЕНИЯ НА АКТИВАЦИЮ БАЗОФИЛОВ И ТУЧНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА IN VITRO

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 ЯНВ 2077

Санкт-Петербург 2010

4843462

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины СевероЗападного отделения РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Назаров Пётр Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Самойлович Марина Платоновна; доктор медицинских наук, профессор Серебряная Наталья Борисовна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Государственный Научный Центр РФ Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России

Защита диссертации состоится 2011 г. в часов

на заседании Диссертационного совета ДМ 001.022.01 при НИИЭМ СЗО РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН.

Автореферат разослан " ^¿к^^Д^ 2010

года.

Учёный секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук ^, Нежинская Г.И.

Полученные новые данные о взаимодействии лигандов Fсу-рецепторов (агрегированного человеческого IgG, С-реактивного белка) с базофилами крови человека и тучными клетками линии НМС-1, а также о значении холинергиче-ского тонуса в модуляции их функциональной активности углубляют теоретические знания о факторах острой фазы воспаления, их цитотропных эффектах и роли в процессах иммунорегуляции.

Разработанная экспериментальная модель измерения активации базофи-лов крови и перевиваемой линии тучных клеток НМС-1 может быть в дальнейшем использована для оценки влияния на процесс активации и дегрануляции этих клеток новых фармакологических препаратов.

Результаты работы найдут применение в аллергологии и будут способствовать углублению представлений о роли и путях участия базофилов в иммунопатологических реакциях.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• Базофилы крови и тучные клетки человека линии НМС-1 высвобождают медиаторы (гистамин, IL-lß) при активации Fcy-рецепторов фактором острой фазы воспаления С-реактивным белком и агрегированным IgG.

• Лиганды Fcy-рецепторов агрегированный IgG, С-реактивный белок, а также антитела к CD 16 (к Fcy-рецептору III типа) активируют базофилы к секреции гистамина.

• Тучные клетки человека линии НМС-1, в отличие от базофилов крови, не отвечают на активацию комплексами IgE/aHTH-IgE, что согласуется с отсутствием на них полноценных Fce-рецепторов.

• Холинергическая стимуляция базофилов усиливает секрецию гистамина и зависит от активности ацетилхолиновых рецепторов муска-ринового и никотинового типа.

• Холинергический тонус клеток влияет на характер ответа базофилов на лиганды Fcy-рецепторов.

Реализация работы. По теме работы опубликовано 22 печатных работы, в том числе 5 оригинальных статей и 3 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК.

Личный вклад в проведение исследования. Личный вклад автора в выполненную работу включал самостоятельное проведение большинства исследований, разработку и адаптацию ряда методов исследования, а также интерпретацию полученных результатов. Вклад соавторов ограничивался помощью в постановке и освоении новых методов исследования, предоставлением в распоряжение автора ряда реактивов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора H.H. Кеворкова, «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006); на научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006, 2007); на 8-й международной школе-конференции по иммунологии имени Джона Хемфри (Москва, 2007); на Втором объединенном иммунологическом форуме (Санкт-

Петербург, 2008); на 3-й Китайско-Российской конференции по фармакологии (Харбин, 2008); на заседаниях научного общества иммунологов (Санкт-Петербург, 2008,2010).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 154 странице текста и состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения и выводов. Работа проиллюстрирована 18 рисунками и микрофотографиями и 29 таблицами. Список литературы содержит 214 источников, в том числе 38 работ отечественных и 176 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Объекты исследования. Исследования проведены на мононувслеарах периферической крови здоровых доноров, очищенных базофилах периферической крови здоровых доноров, а также на клеточной опухолевой линии тучных клеток человека НМС-1, любезно предоставленной Dr. J.H. Butterfield (Mayo Clinic, Rochester, MN, USA). Гепаринизированную кровь здоровых доноров получали в Отделении переливания крови Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова. Использована кровь 40 доноров.

Выделение мононуклеарных клеток из периферической крови доноров. Для выделения мононуклеаров использовали донорскую кровь, взятую из локтевой вены здоровых доноров обоих полов в возрасте от 20 до 50 лет. В качестве антикоагулянта использовали гепарин, 50 ЕД на 1 мл крови. Разделение фракций гранулоцитов и мононуклеарных лейкоцитов проводили путем осаждения клеток в градиенте плотности Ficoll-Paque (Pharmacia, Sweden). Мононук-леарные лейкоциты отмывали 3 раза ЗФР (забуференным физиологическим раствором) при центрифугировании. Жизнеспособность клеток определяли с помощью окраски 0,2% раствором трипанового синего, количество подсчитывали в камере Горяева. Мононуклеары ресуспендировали в среде RPMI-1640 («Био-лот», СПб, РФ), содержащей 10% инактивированной при 56 °С эмбриональной телячьей сыворотки (ICN, США), 50 мкг/мл сульфата гентамицина (АО «Самсон», СПб, РФ) и 2 мМ L-глутамина (ICN, США). Клеточность доводили до 3 млн/мл. Клеточную суспензию использовали для получения обогащенной базо-филами фракции.

Получение фракции мононуклеаров, обогащенной базофиламн, с помощью негативной селекции и магнитной сепарации. Для получения фракции, обогащенной базофилами, использовали коммерческую систему Basophil Isolation Kit II human (Miltenyi Biotec) для непрямого магнитного выделения не разрушенных и не активированных базофилов из суспензии человеческих мононуклеарных клеток периферической крови. Сепарацию проводили согласно инструкции фирмы-производителя. Суспензию мононуклеаров обрабатывали сначала коктейлем биотин-коньюгированных антител против спектра клеточных антигенов, отсутствующих на базофилах, но представленных на других клетках крови (CD3, CD4, CD7, CD14, CD15, CD16, CD36, CD45RA, HLA-DR и CD235a (гликофорин А)), а затем инкубировали с магнитными микробусами, конъюги-

Актуальность проблемы

Базофильные гранулоциты, или базофилы — малочисленная популяция лейкоцитов периферической крови, содержащая цитоплазматические гранулы, которые окрашиваются основными красителями. Впервые базофилы были описаны в 1879 г. П. Эрлихом, который годом раньше открыл морфологически подобные клетки в тканях, которые он назвал Mastzellen, или тучными клетки.

Число и морфология базофилов различаются у разных животных, но они есть у всех классов позвоночных. Это указывает на важность данных клеток в системах защиты. Базофилы участвуют в аллергических реакциях и антипаразитарном иммунитете.

Подобно тучным клеткам, базофилы имеют высокоаффинные рецепторы для иммуноглобулина IgE (FceRI), перекрестная сшивка которых IgE и соответствующими антигенами (аллергенами) приводит к высвобождению множества медиаторов, общих для обоих типов клеток (Stevens R.L., Austen K.F., 1989).

До настоящего времени изучение базофилов затруднялось их очень низким содержанием в периферической крови (0,5-1% от числа лейкоцитов) и отсутствием удовлетворительных протоколов очистки и выделения.

Данные последних лет расширили представление о роли базофилов в аллергических заболеваниях и иммунной защите. Показано, что базофилы продуцируют и могут быстро выделять большое количество регуляторных цитоки-нов, таких как IL-1, IL-4 и IL-13 и др. (Li Н., Sim Т.С., 1996; Marone G. et al., 2005; Gilmartin L., Tarleton C.A. et al., 2008). Базофилы несут рецепторы CCR3 (De Lucca G.V. 2006) и под влиянием СС-хемокинов (эотаксина, эотаксина-2, RANTES, МСР-2, -3, -4) мигрируют в места реакции на антиген, где повышают число IL-4-продуцирующих клеток. Они экспрессируют CD 154 - лиганд CD40, с помощью которого контактируют с молекулой CD40 B-лимфоцитов, что, вместе с действием IL-4 и IL-13, способствует переключению В-клеток на синтез иммуноглобулинов класса IgE (Lee B.O.et al., 2003; Falcone F.H. et al., 2006). Эти данные расширили представление о базофилах, показав, что их роль не ограничивается эффекторными функциями в IgE-опосредованных реакциях.

Холинергическая регуляция активности тучных клеток и базофилов также мало изучена, особенно ввиду возрастающего внимания к автономной, не-нейрональной холинергической системе иммунокомпетентных клеток, которая включает такие элементы, как синтез ацетилхолина (АХ), его разрушение и АХ-рецепторы мускаринового и никотинового типа (м-АХР, н-АХР). Наличие н-АХР и м-АХР на базофилах и тучных клетках показано с помощью функциональных тестов, проточной цитометрии с меченым ФИТЦ лигандом а-бунгаротоксином, обычной и конфокальной микросокопией и подтверждено с помощью методов молекулярной биологии (Sudheer P.S. et al., 2006).

Практически ничего не известно о связи базофилов с факторами острой фазы воспаления, в частности, с С-реактивным белком (CRP), и о характере влияния CRP на механизмы реакций гиперчувствительности немедленного типа.

Повышенная экспрессия CRP - пентраксина и известного маркера острой фазы воспаления - сопровождает начало любой формы иммунного ответа. Однако, влияние CRP на развитие иммунных реакций изучено недостаточно.

Цель работы: изучение влияния факторов воспаления на активацию ба-зофилов крови и тучных клеток человека линии НМС-1. В процессе работы решались следующие задачи:

1. С помощью характерных маркеров и проточной цитометрии оценить эффективность метода выделения базофилов из крови человека негативной селекцией и магнитной сепарацией.

2. Изучить влияние факторов острой фазы воспаления - С-рсактивного белка, анафилатоксина СЗа, а также эндотоксина (ЛПС) гра-мотрицательных микробов и классического лиганда Fcy-рецепторов - агрегированного IgG - на выделение гистамина и цитокинов базофилами крови человека и тучными клетками человека линии МНС-1.

3. Изучить влияние холинергической активации и блокады аце-тилхолиновых рецепторов на спонтанную функциональную активность базофилов крови человека и тучных клеток линии НМС-1

4. Изучить влияние холинергической активации и блокады аце-тилхолиновых рецепторов на чувствительность базофилов крови человека и тучных клеток линии НМС-1 к стимуляции факторами острой фазы воспаления.

Научная новизна работы.

Впервые проведена комплексная сравнительная оценка влияния провос-палительных факторов (С-реактивного белка, анафилатоксина СЗа, бактериального ЛПС и ацетилхолиновой активации) на функциональную активность базофилов крови человека и тучных клеток человека линии НМС-1.

Впервые показано, что базофилы крови и тучные клетки человека линии НМС-1 высвобождают медиаторы (гистамин, IL-lß) при активации лигандами Fcy-рецепторов - фактором острой фазы воспаления С-реактивным белком и агрегированным IgG.

Впервые показано, что холинергическая стимуляция базофилов усиливает секрецию гистамина и зависит от ацетилхолиновых рецепторов мускаринового и никотинового типа.

Впервые показано, что холинергический тонус клеток влияет на характер ответа базофилов на лиганды Fcy-рецепторов.

Разработана и апробирована новая экспериментальная модель активации тучных клеток линии НМС-1 и базофилов крови человека и измерения выхода гистамина, пригодная для изучения влияния на эти клетки холинергических агентов, факторов воспаления, фармакологических препаратов.

Теоретическая и практическая значимость результатов работы. Исследование направлено на изучение «неаллергических» механизмов активации базофилов и тучных клеток человека, в частности, на оценку влияния факторов острой фазы воспаления на эти клетки.

рованными с антителами к биотину. Магнитную сепарацию производили в магнитном поле сепаратора (Miltenyi Biotec). Для этого в магнит помещали специальную LS-колонку, в которую вносили смесь клеток. Фракция, полученная после прохождения через колонку в магнитном поле, представляла собой обогащенные базофилы, которые мы рассматривали как интактные, так как они не контактировали с антителами.

Контроль чистоты базофилов. Контроль чистоты базофилов осуществляли под микроскопом, в мазках, приготовленных из полученной фракции клеток и окрашенных но Май-Грюнвальду, а также с помощью проточной цитомет-рии на цитофлюоримстре Epics Altra Cell Sorter (Beckman-Coulter) с использованием ФИТЦ-меченых моноклональных антител против антигенов CD203c и CD63 (Miltenyi Biotec, Германия), которые экспрессируются исключительно на человеческих базофилах и тучных клетках.

Культивирование клеток линии НМС-1. Использовали человеческую лейкозную линию тучных клеток НМС-1. Клетки этой линии по многим аспектам сопоставимы с незрелыми тучными клетками соединительной ткани человека и используются в большом числе исследовательских работ. Линия НМС-1 была любезно предоставлена J.H. Butterfíeld (Mayo Clinic, Rochester, MN, USA).

Клетки НМС-1 культивировали в среде Iscove (Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), Hyclone, США) с добавлением 10 % обогащенной железом фе-тапьной телячьей сыворотки (FCS, Hyclone, США), 1,2 мМ монотиоглицерола (Sigma, США) и антибиотика гентамицина (40 мкг/мл). Клеточную линию инкубировали в СОг-инкубаторе (содержащем 5 % СОг в атмосфере абсолютной влажности) при температуре 37 °С. Клетки пересевали каждые 3-4 дня. НМС-1 хранили в суспензионной культуре при клеточной плотности 5-7 * 105 Кл/мл.

Во всех экспериментах жизнеспособность клеток составляла не менее 98% (при оценке с помощью трипанового синего).

Окрашивание базофилов, мононуклеаров и тучных клеток. Окраска по Май-Грюнвальду. Окраска эозиновокислым метиленовым синим (Дженпер и Май-Грюнвальд), без азура.

Окрашенные препараты просматривали под микроскопом Zeiss Axiolab, объектив Plan-NEOFLUAR lOOx и фотографировали с помощью камеры JVC ТК-С1380Е (JVC, Япония).

Активация клеток

Для активации базофилов использовали следующие препараты:

Очищенный С-реактивный белок человека, выделенный из асцитной жидкости больных раком (CRP; MB Biochemicals, США); липополисахарид S. typhi, лио-филизированный препарат (ЛПС, НИИ вакцин и сывороток, СПб); очищенный СЗа, выделенный из плазмы крови здоровых доноров (Гос НИИ ОЧБ ФМБА, СПб); нормальный человеческий донорский иммуноглобулин (IgG, НИИЭМ им. Пастера, СПб), агрегированный нами (в виде раствора в концентрации 10 мг/мл в ЗФР) нагреванием на водяной бане при 63 °С в течение 10 мин; мышиные мо-ноклональные антитела против CD16 человека («Медбиоспектр», Москва); очищенный IgE человека и антитела моноклональные мышиные против IgE человека двух клонов - 5D4 и 4F4 (препараты любезно предоставлены профессором

В.Б. Климовичем, ЦНИРРИ, СПб); Fc-фрагменты IgG человека, полученные из препарата нормального донорского гамма-глобулина (фракция IgG) (выделены и любезно предоставлены д.м.н. JI.A. Буровой, НИИЭМ СЗО РАМН, СПб); вещество 48/80 (Sigma) - стандартный либератор гистамина.

Для изучения влияния холинергических агентов на базофилы и тучные клетки линии НМС-1 использовали: неметаболизируемый химический аналог ацетилхолина (АХ) карбахолин (Sigma-Aldrich); блокатор ацетилхолиновых рецепторов никотинового типа - бензогексоний, 2,5%-ный раствор (Фармацевтическая компания «Здоровье», Украина); блокатор ацетилхолиновых рецепторов мускаринового типа - метацин (Ай Си Эн Октябрь, Россия); необратимый ингибитор ацетилхолинэстеразы - армин (0,01 %-ный раствор, ПО «Татхимфарм-препараты», Россия).

Алгоритм активации клеток. Опыты по изучению влияния препаратов на базофилы и тучные клетки НМС-1 ставили следующим образом. Суспензию клеток в количестве 105 в 800 мкл ЗФР вносили в пластиковые пробирки типа «эппендорф» вместимостью 1,5 мл. К суспензии добавляли исследуемые препараты в объеме 160 мкл. Разведения препаратов готовили на ЗФР. Негативным контролем служили пробирки с клетками, в которые добавляли адекватный объем ЗФР, позитивным - пробирки, куда добавляли неспецифический либератор гистамина вещество 48/80. Суспензии клеток с препаратами инкубировали 30 мин при 37 °С, после чего быстро охлаждали для остановки реакции, помещая на лед. Клетки осаждали центрифугированием при 600 g в течение 10 мин и отбирали супернатанты для измерения концентрации освободившегося гистамина.

Для количественной оценки гистамина в супернатантах использовали модифицированный метод Шора (Shore P.A.,1959), основанный на регистрации флюоресценции комплекса гистамина с ортофталевым альдегидом при помощи спектрофотометра Fluoroscan Accent FL (Thermo Fisher Scientific) при длинах волн 355/460 нм.

Оценка экспрессии мембранных маркеров клеток цитофлуориметри-ческим методом. Для оценки активации проводили учет интенсивности флуоресценции с помощью проточной цитофлюориметрии на цитофлюориметре Epics Altra Cell Sorter (Beckman-Coulter) с использованием ФИТЦ- и ФЭ-меченых моноклональных антител против антигенов CD14, CD16, CD63, CD123, CD203c. Антитела (Miltenyi Biotec, Германия, и «МедБиоСпектр», Москва) вносили по 10 мкл на 105 клеток в 50 мкл ЗФР с 0,1 % NaN3 («Helicon», Москва, РФ) и 10 мин инкубировали при 4 °С в темноте. После двукратной отмывки ЗФР, содержащим 0,1 % NaN3, проводили учет результатов с помощью проточной ци-тометрии. Результаты (степень активации) выражали в виде процента клеток, экспрессирующих исследуемые маркеры.

Количественная оценка цитокинов в культуральных жидкостях. Концентрацию IL-4, IFNy, IL-lß в супернатантах клеток определяли, используя коммерческие наборы ООО «Цитокин» (СПБ). Анализ проводили согласно рекомендациям производителя.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов лицензионных программ Excel, STATISTICA 5.0. Результаты экспериментов в ви-

де концентрации гистамина в супернатантах, в нг/мл, выражали как среднее арифметическое ± ошибка среднего, либо в виде отношения концентрации медиатора в опыте к концентрации в контроле, в условных единицах. Для статистической обработки и определения различий между независимыми группами нормально распределённых данных использовали парный (.-критерий Стьюден-та. Во всех экспериментах различие между контролем и опытом считали статистически достоверным при р<0,05.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХОБСУЖДЕНИЕ Получение фракции обогащенных базофилов. Применение метода негативной селекции и магнитной сепарации позволило получить фракцию клеток с содержанием базофилов около 80 %, что было показано с помощью проточной цитометрии и специфических для базофилов маркеров. На рис. 1 показана экспрессия маркера С0203с.

Рис. 1. Экспрессия CD203c, фенотипического маркера базофилов, после магнитной сепарации

Пунктиром обозначены немеченные клетки, сплошной линией - клетки, обработанные CD203c-FITC. 49,3 % клеток являются CD203c-FITC-позитивными.

Мембранный антиген CD203c - член мультигенного семейства эктонукле-отидпирофосфатаз/фосфодиэстераз (E-NPPs), экспрессируется исключительно на человеческих базофилах и тучных клетках (Bühring H.J., 2004; Ebo D.G., 2006; Ocmant А., 2007). CD203c - индуцируемый антиген, после активации базофилов его экспрессия возрастает.

Реакции базофилов на CRP, агрегированный IgG, антитела к FcyRIII (CD16), их комбинации. Оптимальной для стимуляции выхода гистамина из

базофилов была концентрация вещества 48/80 - 20 мкг/мл, которая и использовалась в дальнейших опытах в качестве позитивного контроля.

Известно, что CRP взаимодействует на лимфоидных клетках с Fc-рецепторами для IgG (Mortensen R.F, Duszkiewicz J.A., 1977). Представляло интерес сопоставление активирующей способности CRP с активностью IgG как активатора выброса гистамина из базофилов. Агрегированный IgG - известный лиганд Fcy-рецепторов.

Человеческий CRP вызывал дозозависимый стимулирующий эффект, с максимумом выброса гистамина при концентрации 50 мкг/мл (р<0,001). Нормальный человеческий IgG, агрегированный при 63 °С (300 мкг/мл в ЗФР), также вызывал значительное увеличение выброса гистамина базофилами (р<0,001) (табл. 1).

Таблица 1

Реакция базофилов, выделенных из крови здоровых доноров, на инкубацию с CRP и агрегированным IgG человека (выход гистамина, отношение к контролю, усл. ед.)

Стимулятор, доза Выход гистамина, усл. ед. п t Р

ЗФР 1±0,01 6

CRP, 10 мкг/мл 1,003±0,007 6 0,246011 >0,05

CRP, 20 мкг/мл 1,21±0,018 6 11,71565 <0,001

CRP, 50 мкг/мл 1,55±0,026 6 28,16355 <0,001

IgG, 300 мкг/мл 4,28±0,25 8 12,93 <0,001

48/80, 20 мкг/мл 3,49±0,062 6 32,52 <0,001

CRP и агрегированный IgG были сопоставимы по степени активации выброса гистамина с классическим либератором гистамина соединением 48/80.

Таким образом, как CRP, так и, особенно, агрегированный IgG способны индуцировать значительный выброс гистамина из базофилов при кратковременном контакте с клетками.

Однако при инкубации клеток с этими двумя препаратами одновременно -CRP и агрегированным IgG человека - усиления эффекта не наблюдалось (рис. 2), выброс гистамина был ниже, чем с любым из них по отдельности.

Это указывает на то, что CRP и IgG взаимодействуют с одними и теми же рецепторами базофилов и конкурируют за сайты связывания на поверхности клеток и/или за внутриклеточные мессенджеры. Это может указывать также на то, что одновременное воздействие на Fcy-рецепторы базофилов CRP и агрегированного IgG сопровождается супрессивным сигналом, подавляющим деграну-ляцию базофилов и существенно снижающим выброс гистамина.

Выброс гистамина в ответ на агрегированный гамма-глобулин in vitro может расматриваться как модель взаимодействия базофилов с IgG-содержащими иммунными комплексами в организме. Наблюдение, показывающее, что эффекты CRP и агрегированного IgG не суммируются, а, наоборот, ингибируют друг друга, может иметь значение для понимания реакции базофилов человека на

циркулирующие иммунные комплексы в условиях острой фазы воспаления, когда в крови появляется С-реактивный белок - новый лиганд Fcy-рецепторов. Это подтверждает имеющиеся в литературе данные о том, что CRP связывается с FcyRI с аффинитетом в 3 раза выше, чем IgG (Pepys М.В., Butler P.J., 1987).

Необходимы дальнейшие исследования для выснения других последствий взаимодействия острофазового пентраксина и IgG-содержащих иммунных комплексов (влияния на выброс других биологически активных веществ, продуцируемых базофилами) и механизма взаимной ингибиции базофилов при совместном действии двух Fcy-специфичных лигандов.

.....

* щшй,

CRP algG С016 CRP+algG CRP+CD16

Рис. 2. Ответ базофилов на одновременную активацию агрегированным IgG, CRP и антителами к CD16

CRP - 50 мкг/мл, агрегированный IgG человека - 300 мкг/мл, антитела к CD16 - финальное разведение 1/8. Содержание гистамина в контроле составляет 1,04±0,08. По оси ординат - концентрация гистамина в супернатанте клеток, нг/мл. Здесь и далее: * - достоверное отличие от контроля.

На рис. 2 показаны результаты совместного воздействия на мононуклеары человека CRP и моноклональных антител к CD 16 - одному из Fcy-рецепторов (FcyRIII, низкоаффинному). Стимулирующий эффект проявляли и антитела к CD 16. Видно, что лигация антигена CD 16 антителами оказывала статистически достоверный активирующий эффект и вызывала усиленный выброс гистамина из базофилов. Эти данные указывают на то, что агрегация Fcy-рецепторов, в том числе низкоаффинных рецепторов FcyRIII, стимулирует выброс гистамина из базофилов.

При инкубации мононуклеаров одновременно с анти-С016 и CRP ответ базофилов был выше, чем с каждым из агентов в отдельности (рис. 2), однако он статистически не отличался от расчетного эффекта, ожидаемого в случае отсутствия между ними какого-либо противодействия или взаимного усиления (р>0,05). Это может объясняться тем, что CRP не взаимодействует (или взаимодействует в малой степени) с рецепторами FcyRIII (CD 16), что низкоаффинные Fcy-рецепторы III типа базофилов крови не являются основными сайтами связывания данного пентраксина. Т.о., рецептор FcyRIII (CD16) либо не участвует в связывании CRP, либо лигация FcyRIII антителами не влияет на функцию дру-

гих Fcy-рецепторов, с которыми связывается пентраксин CRP. Таким образом, это позволяет предположить, что перекрестная сшивка Fcy-рецепторов молекулами CRP, с одной стороны, и рецепторов FcyRIII антителами к CD 16, с другой, происходят независимо и запускают различные сигнальные механизмы, ведущие к активации базофилов.

Реакция базофилов крови человека на ЛПС. Источником ЛПС (липо-полисахарида) в организме человека, помимо внешней инфекции, является нормальная грамотрицательная микрофлора кишечника. ЛПС - компонент внешней оболочки грамотрицательных бактерий. Тучные клетки - резидентные компоненты слизистых оболочек, в т.ч. слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, которая является крупнейшей внутренней поверхностью организма, контактирующей с внешней средой. Сигналинг ЛПС происходит, в основном, через То11-подобные рецепторы (TLR) иммунокомпетентных и других клеток. TLR4 является основным рецептором ЛПС, воспринимающим сигнал через связывание с липидной частью ЛПС. Известно, что тучные клетки экспрессируют TLR4 (Medzhitov R., 2001).

Таблица 2

Влияние ЛПС S. typhi на выброс гистамина из базофилов крови человека

Выход гистамина,

Стимулятор, доза нг/мл (М±т) п t Р

ЗФР 10,45±0,83 5

ЛПС, 25 мкг/мл 11,21 ±0,5 8 3 1,06 >0,05

ЛПС, 50 мкг/мл 12,05±0,85 3 U45 >0,05

ЛПС, 100 мкг/мл 16,74±1,82 3 3,14 <0,05

48/80, 20 мкг/мл 40,09±5,75 3 5,09 <0,01

Как показано в табл. 2, при концентрациях ЛПС 25 и 50 мкг/мл выброс гистамина практически не отличался от негативного контроля (для обеих доз р>0,05), и лишь при очень высокой концентрации ЛПС (100 мкг/мл) возрастал и становился достоверно выше уровня контроля (р<0,05). Эти данные указывают на то, что ЛПС грамнегативных бактерий не является значимым индуктором дегрануляции базофилов и способен проявлять активирующее действие на базофилы лишь в очень высокой концентрации.

Это позволяет предположить, что низкие, физиологические концентрации эндотоксина в организме не ведут к мощному выбросу гистамина базофилами.

С другой стороны, уместно напомнить, что в наших экспериментах инкубация базофилов с исследуемыми веществами (в том числе с ЛПС) проводилась в бессывороточной среде, т.е. в отсутствие сывороточного ЛПС-связывающего белка, являющегося, как известно из литературы, кофактором при активации базофилов липополисахаридами через Toll-рецепторы. Это обстоятельство может объяснять, почему в наших условиях эффект ЛПС был столь слабо выражен.

В любом случае, полученные данные означают, что при проведении опытов in vitro в бессывороточных условиях присутствие следов ЛПС в тех или

иных исследуемых препаратах не оказывает влияния на выброс гистамина из базофилов, а значит и на результаты экспериментов.

Реакции базофилов крови человека на агонисты ацетилхолиновых рецепторов. Данные литературы последних лет показали, что так называемая автономная холинергическая система, состоящая из мембранных ацетилхолиновых рецепторов (АХР) и внутриклеточных ферментов, обеспечиващих синтез и разрушение ацетилхолина (АХ), присутствует во всех иммунокомпетентных клетках, где ацетилхолин выполняет роль сигнальной молекулы, активирующей пролиферацию клеток, секрецию цитокинов, и другие реакции. Наличие элементов холинергичсской системы показано и в базофилах и тучных клетках (Ка\уа-БЫта К., Ищи Т., 2000).

Нами данные показывают, что агонист ацетилхолиновых рецепторов -неметаболизируемый и не проникающий в клетки химический аналог АХ карбахолин - обладает свойствами либератора гистамина в оптимальной концентрации 15 мкг/мл.

Были изучены два варианта опыта, обеспечивавшие создание в клетках (и/или в микроокружении) избытка АХ и усиление ацетилхолиновой сигнализации: 1) путем добавления в среду аналога АХ карбахолина и 2) путем блокады разрушения эндогенного АХ (добавлением ингибитора ацетилхолинэстера-зы армина). Оба варианта дали сходный результат (табл. 3). В обоих случаях, как и ожидалось, наблюдалось достоверное усиление выброса гистамина из базофилов, имевшее близкую по уровню интенсивность.

Эти данные позволяют заключить, что АХ обладает провоспалительной активностью и вызывает выброс провоспалительных веществ (гистамина) из базофилов.

Антагонисты АХР мускаринового и никотинового типа - метацин и бен-зогексоний, соответственно, по отдельности активировали клетки, но их совместное действие приводило к глубокой ингибиции выхода гистамина (рис. 3).

Таблица 3

Сравнение реакции базофилов на избыток ацетилхолина, достигаемый разными путями: добавлением экзогенного аналога АХ - карбахолина и блокадой разрушения эндогенного АХ с помощью армина (необратимого

Препарат, доза п Путь создания избытка АХ Выход гистамина, нг/мл (М±ш) 1 Р

ЗФР 3 Контроль 9,36±0,42

Армин, 2 мкг/мл 3 Блокада АХЭ 15,21±1,88 3,03 <0,05

Карбахолин, 15 мкг/мл 3 Экзогенный источник 16,69±2,26 3,20 <0,05

тяштш

Контроль БГ,0,8мг/мл Мет, 3,4 мкг/мл БГ+Мет

Рис. 3. Реакция базофилов на блокаду никотиновых и мускариновых АХ-рецепторов

Это свидетельствует о взаимозаменяемости мускаринового и никотинового путей регуляции активности базофилов и о возможности компенсаторной сигнализации через любой из них при выключении другого. Блокада рецепторов обоих типов, по-видимому, обрывает холинергическую сигнализацию, и АХ не может активировать клетки. Это может указывать на АХ-зависимость деграну-ляции базофилов, т.е. на то, что сигналинг АХ является необходимым условием для выделения гистамина.

Активация базофилов комплексами ^Е/анти-1§Е (выход гистамина). При исследовании ответа базофилов на стимуляцию ^Е человека и монокло-нальными антителами к разным эпитопам ^Е человека использовали очищенные базофилы крови человека, препарат 1§Е человека, а также два препарата моноклональных антител к разным эпитопам ^Е человекз (4Р4 и 504). Препараты 1§Е и моноклональных антител к 1§Е были любезно предоставлены профессором В.Б. Климовичем (ЦНИРРИ, Санкт-Петербург).

Данные, представленные на рис. 4, получены при использовании ^Е-зависимого способа активации. Схема постановки экспериментов с ^Е/анти-^Е была следующей. Взвесь базофилов (160 мкл), полученных из фракции моно-нуклеаров крови здоровых доноров методом негативной селекциии и магнитной сепарации, инкубировали с 40 мкл препарата ^Е человека. Перед добавлением антител к ^Е пробы центрифугировали 10 мин при 300 g, отбрасывали суперна-тант, добавляли 90 мкл ЗФР с 10 мкл антител 5Б4 или 4Б4 и инкубировали еще 20 минут при 37 °С. Затем центрифугировали 10 минут при 300 g, отбирали су-пернатанты для оценки содержания в них гистамина.

Таким образом, ацетилхолиновая сигнализация и сама по себе является стимулом для выделения гистамина, и кроме того, она необходима для ответа тучных клеток на стимуляцию через другие рецепторы.

Продукция 1Ь-1р базофилами крови человека и ТК линии НМС-1. Данные предыдущих разделов показали, что воздействие на базофилы и ТК человека лигандом Рсу-рецепторов агрегированным оказывает на оба типа клеток активирующее действие и вызывает выброс в среду одного из компонентов содержимого их цитоплазматических гранул. Для изучения способности ба-зофилов и ТК человека отвечать на стимуляцию Рсу-рецепторов выбросом других веществ, было изучено выделение некоторых цитокинов.

А) Б)

Рис. 6. Выброс цитокина 1Ь-1р (пг/мл) при стимуляции безофилов крови (А) и тучных клеток человека линии НМС-1 (Б) агрегированным ^С человека (300 мкг/мл) и веществом 48/80 (20 мкг/мл)

Как показали результаты (рис. 6), базофилы крови человека и тучные клетки человека линии НМС-1 показали достоверное увеличение выброса цитокина IL-1|3 в ответ на инкубацию с человеческим агрегированным IgG или веществом 48/80 в течение 30 минут при 37 °С.

ВЫВОДЫ

1. Метод выделения базофилов из крови людей с помощью негативной селекции и магнитной сепарации позволяет получить популяцию клеток, обладающую характерными маркерам базофилов, интактную и способную к адекватным реакциям на активацию IgE и антителами к IgE и другими веществами.

2. Факторы острой фазы воспаления (С-реактивный белок, анафила-токсин СЗа), ЛПС грамотрицательных бактерий, а также препарат сравнения -классический лиганд Fcy-рецепторов агрегированный IgG в опытах in vitro индуцируют базофилы крови человека и тучные клетки человека линии НМС-1 к выделению провоспалительных медиаторов - гистамина и IL-ip.

3. Агонист ацетилхолиновых рецепторов карбахолин и ингибитор аце-тилхолинэстеразы армин, усиливающие ацетилхолиновую сигнализацию, активируют базофилы крови и тучные клетки человека к выделению медиаторов.

4. Ацетилхолиновая сигнализация участвует в обеспечении ответа базофилов человека на другие активаторы дегрануляции. Снижение холинергиче-

ского тонуса клеток путем блокады никотиновых и мускариновых ацетилхоли-новых рецепторов (бензогексонием, метацином) снижает ответ базофилов крови человека in vitro на активацию лигандом FcY-рецепторов агрегированным IgG и неспецифическим либератором гистамина веществом 48/80.

5. Блокаторы н- и м-ацетилхолиновых рецепторов метацин и бензогек-соний, являющиеся производными триметиламмония, в меньшей степени влияют in vitro на ответ базофилов крови человека на реактант острой фазы воспаления С-реактивный белок из-за его связывающих свойств в отношении четвертичных аммониевых соединений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Пронина А.П., Назаров П.Г. Тучные клетки: роль в воспалении и иммунных процессах // Вести. Уральск, мед. акад. науки. - 2006. - 3-1 (14). -С. 193-195.

2. Пронина А.П., Назаров П.Г. Активация базофилов крови человека ли-гандами Fcy-рецепторов: холинергический тюнинг // Цитокины и воспаление. 2008. - Т. 7, № 4. - С. 40-46.

3. Пронина А.П., Назаров П.Г. Влияние пентраксинов и агрегированного IgG на выброс гистамина из базофилов человека при блокаде АХ-рецепторов // Росс, аллергол. журн. - 2008. - № 1. - С. 237-238.

4. Nazarov P.G., Pronina А.Р., Trulioff A.S. C-reactive protein: Fc-gamma receptor-mediated effects on human peripheral blood basophils in vitro. - In: C-Reactive Protein: New Research. Ed. S. Nagasawa. - Nova Sei. Publ., 2009. - P. 147-169.

5. Гусельникова В.В., Пронина А.П., Назаров П.Г., Полевщиков A.B. Происхождение тучных клеток: современное состояние проблемы // Сб. науч. тр. «Вопросы морфологии XXI века». К 80-летию со дня рожд. проф. A.A. Кли-шова,-2010. -Вып. 2. - С. 108-115

Тезисы докладов:

1. Пронина А.П., Назаров П.Г. Тучные клетки как мишень противовоспалительной активности пентраксинов // Мед. иммунол. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 169.

2. Назаров П.Г., Бутюгов A.A., Пронина А.П. Пентраксины в процессах апоп-тоза // Цитология. - 2006. - Т. 48, № 9. - С. 783-784.

3. Назаров П.Г., Бутюгов A.A., Пронина А.П., Трулев A.C. Пентраксины, пептиды, противовоспалительные средства // Russ. J. Immunol. - 2006. - Vol. 9, suppl. 3. - P. 29.

4. Пронина А.П., Назаров П.Г. Холинергическая модуляция выброса гистамина из базофилов человека, индуцированного пентраксинами и агрегированным IgG // Психофармакол. биол. наркол. (Мат. III съезда фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению»). - 2007. - Т. 7, спец. вып., 4.2.-С. 1907-1908.

S и

4

u

5-

ro I s

5

Контроль igE, 3 ME IgE, 30 ME

4F4, 0,4 мкг/мл

lgE3+4F4 lgE30+4F4

Рис. 4. Ответ человеческих базофилов на комплексы IgE/aHTH-IgE (анти-IgE антитело клона 4F4,10 мкг/мл)

По отдельности ни человеческий IgE, ни антитела к нему не вызывали достоверного выброса гистамина. Совместная же инкубация с ними базофилов приводила к резкой активации клеток и интенсивному ответу (рис. 4).

Таким образом, как показали полученные данные, ответ базофилов на агрегированный IgG, измеряемый по выбросу гистамина в среду, не уступает по своему уровну ответу этих клеток на классический, IgE-зависимый способ активации. Уровни выброса гистамина под действием агрегированного IgG и IgE-содержащего иммунного комплекса были практически одинаковы.

Активация ТК линии НМС-1 факторами острой фазы воспаления (выход гистамина). При инкубации лейкозных ТК линии НМС-1 в присутствии CRP (25 мкг/мл), ЛПС (100 мкг/мл) и КХ (20 мкг/мл) также наблюдалось достоверное увеличение выхода гистамина.

По литературным данным, присутствие рецептора для СЗа показано и на клеточной поверхности человеческих тучных клеток линии НМС-1 (Nilsson G. et al., 1994). СЗа-субкомпонент комплемента является хемоаттрактантом для базофилов и тучных клеток линии НМС-1.

Таблица 4

Количество гистамина, выделенного тучными клетками человека в ответ на стимуляцию субкомпонентом комплемента СЗа (отношение к кон-

Стимулятор, доза Выход гистамина, нг/мл п t Р

ЗФР 1,00±0,004 4

СЗа, 10 нг/мл 1,20±0,13 3 1,54 >0,05

СЗа, 166,6 нг/мл 2,19±0,13 3 9,15 <0,05

СЗа, 1,6 мкг/мл 2,03±0,17 3 6,06 <0,05

48/80, 20 мкг/мл 10,84±0,13 3 76,0 <0,01

Исходя из полученных данных, можно заключить, что СЗа проявляет сильное воздействие на выброс гистамина тучными клетками линии НМС-1. Наши данные подтверждают данные других авторов, полученные с клетками линии НМС-1 с использованием в качестве индуктора активности анафилаток-сина СЗа (Богип А. й а1., 2008).

Блокада никотиновых или мускариновых АХР достоверно снижает ответ тучных клеток на стимуляцию как агрегированным гамма-глобулином, так и веществом 48/80. Особенно глубокая (высоко достоверная) супрессия выделения гистамина наблюдалась при одновременной блокаде и никотиновых, и мускариновых рецепторов (рис. 5).

Контроль 300 БГ, 0,8мг/мл Мет, 3,4 ^З+БГ ^б+Мет |0б+БГ+Мст

мкг/мл мкг/мл

160

*

Контроль 48/80,20 БГ, 0,8 Мет, 3,4 46/80+БГ 48/80+Мет 48/80»6Г+Мет ■ мкг/мл м г/мл мкг/мл

Рис. 5. Реакция тучных клеток НМС-1 на холинергические агенты и их комбинации с и веществом 48/80 (выход гистамина, нг/мл)

5. Pronina A., Nazarov P. Cholinergic modulation of histamine release from human basophils induced by pentraxins and aggregated IgG // 8th John Humphrey advanced summer programme in immunology. Immunology and viral infection. Moscow.-2007.-P. 45.

6. Пронина А.П., Назаров П.Г. Роль ацетилхолина в активации базофилов крови человека in vitro II Росс, аллергол. журн. (Тр. VIII Контр. «Соврем, пробл. аллергол., иммунол. и иммунофармакол.»). - 2007. -№ 3, прил. 1. - С. 33.

7. Назаров П.Г., Пронина А.П. Механизмы не-нейрональной холинергической регуляции активности базофилов крови человека in vitro // Росс, аллергол. журн. (Тр. VIII Конгр. «Соврем, пробл. аллергол., иммунол. и иммунофармакол.»). - 2007. - № 3, прил. 1. - С. 31.

8. Назаров П.Г., Пронина А.П. Холинергическая активация нормальных базофилов крови in vitro II Мед. иммунол. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 155-156.

9. Nazarov P.G., Pronina А.Р., Trulioff A.S. Cholinergic regulation of anaphylaxis. The parasympathetic and autonomous mechanisms // Abstr. Int. Symp. «Interaction of the Nervous and Immune Systems in Health and Disease». - 2007. - P. 5455.

Ю.Пронина А.П., Назаров П.Г. Модернизация методов изучения базофилов // Росс, аллергол. журн. - 2008. - Т. 2, № 2-3. - С. 124.

П.Пронина А.П., Назаров П.Г. Количественная оценка выхода гистамина из базофилов как основной метод определения их активности // Цитокины и воспаление (Тез. IV научно-практ. конф. Южного фед. округа «Акт. пробл. клин, иммунол. аллергол.», Пятигорск). - 2008. - Т. 7, № 3. - С. 60-61.

12.Пронина А.П., Назаров П.Г., Трулев А.С. Активация базофилов крови ли-гандами Fсу-рецепторов и ее холинергическая модуляция // Сиб. мед. журн. -2008. - Т. 23, № 3, вып. 1. - С. 108.

13.Nazarov P.G., Pronina А.Р., Trulioff A.S. Activation of human blood basophils by Fc gamma receptor-specific ligands and its cholinergic modulation // Asian J. Pharmacodyn. Pharmacokinet. - 2008. - Vol. 8, № 3. - P. 184.

14.Пронина А.П. Назаров П.Г. Экспрессия CD63 и CD203 при активации базофилов периферической крови человека, выделенных методом магнитной сепарации // Бюлл. Северн, гос. мед. ун-та. - 2008 - 01-вып. XX. - С. 73-74.

15.Назаров П.Г., Пронина А.П., Трулев А.С., Пузырева В.П., Попов В.Г. Пен-траксины в защитных реакциях и процессах иммунорегуляции // Мед. иммунол. (Мат. XIII Всеросс. научн. Форума с междунар. участием им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»), - 2009. - Т. 11, № 4. - С. 326-327.

16.ПронинаА.П., Назаров П.Г. Сравнение выброса цитокинов из тучных клеток линии НМС-1 и базофилов крови человека после стимуляции различными агентами // Тез. докл. 1П междунар. молодежи, мед. конгр. «Санкт-Петербургские научн. чтения-2009». - 2009. - С. 116-117.

17.ПронинаА.П., Назаров П.Г. Холинергическая регуляция активности базофилов // Тез. докл. LXX научно-практ. конф. СПбГМУ «Акт. вопр. эксперим. и клин. мед. - 2009». - С. 60-61.

Подписано в печать 17.12.10 Формат 60х841/],6 Офсетная Печ. л. 1.5 Уч.-изд.л. 1.5 Тираж 100 Заказ 01/12 печать

Отпечатано в титмрафии «Фалкон Принт»

(191015, г. Санкт-Петербург, ул. Шпалерная, дом 51, офис 345)

Актуальность проблемы

Базофильные гранулоциты, или базофилы - малочисленная, популяция лейкоцитов; периферической; крови, содержащая цитоплазматические гранулы, которые окрашиваются основными красителями.

Подобно тучным клеткам, базофилы имеют высокоаффинные рецепторы для иммуноглобулина (ЕсвЩ), перекрестная сшивка которых соответствующими 1§Е и антигенами (аллергенами) приводит к высвобождению;множества медиаторов, общих для обеих клеточных линий!.

Число и морфология базофилов различаются у разных животных, но они есть у всех классов позвоночных. Это указывает на важность данных клеток в системах защиты. Базофилы участвуют в аллергических реакциях и-антипаразитарном иммунитете.

До настоящего времени изучение базофилов затруднялось их очень низким содержанием в периферической крови (0,5-1% от числа лейкоцитов)^ и отсутствие удовлетворительных протоколов очистки и выделения.

Данные последних лет расширили представление о роли, базофилов; в аллергических заболеваниях и иммунной защите. Показано, что базофилы продуцируют и могут быстро выделять большое количество регуляторных цитокинов, таких какЛЬ-4 и Ш-13: Базофилы несут рецепторы ССЮ и под влиянием СС-хемокинов (эотаксина, эотаксина-2, КАЫТЕЗ, МСР-2, 3, 4) мигрируют в места реакции на антиген, где повышают число Ш-4-продуцирующих клеток. Они экспрессируют СО 154 - лиганд С040, с помощью которого контактируют; с молекулой СП40 В-лимфоцитов, что, вместе с действием 1Ь-4 и 1Ь-13, способствует,, переключению В-клеток на синтез иммуноглобулинов класса Эти данные расширили представление о базофилах, показав; что их роль не ограничивается эффекторными фикциями в ^Е-опосредованных реакциях.

Холинергическая. регуляция активности тучных клеток и базофилов также мало изучена, особенно с точки зрения^ возрастающего вниманиям к автономной, не-нейрональной холинергической- системе иммунокомпетентных клеток, которая включает такие элементы, как синтез ацетилхолина (АХ), его разрушение w АХ-рецепторы мускаринового и никотинового типа (м-АХР, н-АХР). Наличие н-АХР на базофилах и,тучных клетках было показано с помощью функциональных тестов, проточной цитометрии с меченым ФИТЦ лигандом а-бунгаротоксином, обычной и конфокальной^ микросокопии и подтверждено с помощью РТ-ПЦР и количественной ПЦР. Мускариновые АХ-рецепторы были охарактеризованы для человеческих тучных клеток, локализованных в тканях верхних дыхательных путей.

Практически ничего не известно о связи базофилов с факторами острой: фазы воспаления, в частности, с С-реактивным белком (CRP) и, о характере влияния CRP на реакции гиперчувствительности немедленного типа.

Повышенная экспрессия CRP, пентраксина и известного маркера острой фазы воспаления, сопровождает начало любой формы» иммунного ответа. Однако, влияние CRP на развитие иммунных реакций не до конца ясно.

Цель работы: Изучение влияния факторов воспаления на активацию базофилов крови человека и тучных клеток линии НМС-1. В процессе работы решались следующие задачи:

1. С помощью характерных маркеров и проточной цитометрии оценить эффективность метода выделения базофилов из крови человека негативной селекцией и магнитной сепарацией.

2. Изучить влияние факторов острой фазы воспаления — С-реактивного белка, анафилатоксина СЗа, эндотоксина (ЛПС) грамотрицательных микробов, и классического лиганда Fcy-рецепторов агрегированного IgG на выделение гистамина и цитокинов базофилами крови человека и тучными клетками человека линии МНС-1.

3. Изучить влияние холинергической активации и блокады ацетилхолиновых рецепторов на функциональную активностть базофилов крови человека и тучных клеток линии НМС-1

4. Изучить влияние холинергической активации и блокады ацетилхолиновых рецепторов на чувствительность базофилов крови человека и тучных клеток линии НМС-1 к стимуляции факторами* острой фазы воспаления.

Научная новизна работы.

Впервые проведена комплексная сравнительная оценка влияния провоспалительных факторов (С-реактивного белка, анафилатоксина СЗа, бактериального ЛПС и ацетилхолиновой активации) на функциональную активность базофилов крови человека и тучных клеток человека линии НМС-1.

Впервые показано, что базофилы крови и тучные клетки человека линии НМС-1 высвобождают медиаторы (гистамин, 1Ь-1Р) при активации лигандами Рсу-рецепторов фактором острой фазы воспаления С-реактивным белком и агрегированным 1§0.

Впервые показано, что холинергическая стимуляция базофилов усиливает секрецию гистамина и зависит от активности ацетилхолиновых рецепторов мускаринового и никотинового типа.

Впервые показано, что холинергический тонус клеток влияет на характер ответа базофилов на лиганды Рсу-рецепторов.

Разработана и апробирована новая экспериментальная модель активации и измерения выхода гистамина из тучных клеток линии НМС-1 и базофилов крови человека, пригодная для изучения влияния эти клетки холинергических агентов, факторов воспаления, фармакологических препаратов.

Теоретияеская и практическая значимость результатов работы.

Исследование направлено на изучение неаллергических механизмов активации базофилов и тучных; клеток человека, в частности на оценку влияния факторов острой фазы воспаления на эти клетки.

Полученные новые данные о взаимодействии лигандов Fcy-рецепторов (агрегированного? человеческого IgG, С-реактивного белка) с базофилами крови человека и тучными клетками линии НМС-1, а также о значении холинергического тонуса в модуляции их функциональной активности углубляют теоретические знания о факторах острой фазы воспаления, , их цитотропных эффектах и роли в процессах иммунорегуляции.

Разработанная экспериментальная модель, измерения активации базофилов крови и перевиваемой линии тучных клеток. НМС-1 может быть в дальнейшем использована для, оценки влияния, на процесс активации и дегрануляции этих клеток новых фармакологических препаратов.

Результаты работы найдут применение в аллергологии и будут способствовать углублению представлений о роли и путях участия базофилов в иммунопатологических реакциях.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту: s • ' • -

• Базофилы крови и тучные клетки, человека линии НМС-1 высвобождают медиаторы (гистамин, IL-lß) при активации Fcy-рецепторов фактором острой фазы воспаления С-реактивным белком и агрегированным IgG.

• Тучные клетки человека линии НМС-1, в отличие от базофилов крови, не отвечают на активацию комплексами IgE/aHTH-IgE, что согласуется с отсутствием на них полноценных Fcs-рецепторов.

• Лиганды Fcy-рецепторов агрегированный IgG, С-реактивный белок, а также антитела к CD16 (Fcy-рецептору III типа) активируют базофилы к секреции гистамина.

• Холинергическая стимуляция базофилов усиливает секрецию гистамина и зависит от активности ацетилхолиновых рецепторов мускаринового и никотинового типа.

• Холинергический тонус клеток влияет на характер ответа базофилов на лиганды Fcy-рецепторов:

Апробация работы. Материалы- диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной" памяти профессора H.H. Кеворкова "Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике" (Пермь, 2006); на- научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006, 2007); на 8-ой международной школе-конференции по иммунологии имени Джона Хемфри (Москва, 2007); на Втором объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); ,на 3-й' Китайско-Российской конференции по фармакологии (Харбин, 2008), на заседаниях общества иммунологов (РНОИ) (Санкт-Петербург, 2008, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 печатных работы, в том числе 5 оригинальных статей и 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 154 странице текста и состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения и выводов. Работы проиллюстрированы 18 рисунками и 29 таблицами. Список литературы состоит из 214 наименований.

132 ВЫВОДЫ

1. Метод выделения базофилов из крови людей с помощью негативной селекции и магнитной сепарации позволяет получить популяцию клеток, обладающую характерными маркерам базофилов, интактную и способную к адекватным реакциям на! активацию IgE и антителами к IgE и другими веществами.

2. Факторы острой фазы воспаления (С-реактивный белок, анафилатоксин СЗа), ЛПС грамотрицательных бактерий, а также препарат сравнения — классический лиганд Fcy-рецепторов агрегированный IgG в опытах in vitro индуцируют базофилы крови человека и тучные клетки человека линии НМС-1 к выделению провоспалительных медиаторов -гистамина и IL-ip.

3. Агонист ацетилхолиновых рецепторов карбахолин и ингибитор ацетилхолинэстеразы армии, усиливающие ацетилхолиновую сигнализацию, активируют базофилы крови и тучные клетки человека к выделению медиаторов.

4. Ацетилхолиновая сигнализация участвует в обеспечении ответа базофилов человека на активаторы дегрануляции. Снижение холинергического тонуса клеток путем блокады никотиновых и мускариновых ацетилхолиновых рецепторов (бензогексонием, метацином) снижает ответ базофилов крови человека in vitro на активацию лигандом Fcy-рецепторов агрегированным IgG и неспецифическим либератором гистамина веществом 48/80.

5. Блокаторы н- и м-ацетилхолиновых рецепторов метацин и бензогексоний, являющиеся производными триметиламмония, в меньшей степени влияют in vitro на ответ базофилов крови человека на реактант острой фазы воспаления С-реактивный белок из-за его связывающих свойств в отношении четвертичных аммониевых соединений.