Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:С-полиморфные варианты хромосом в механизме нарушения эмбрионального развития человека

ге ол

| О ДЕК 1995

На правах рукописи

КАРАТЕОРГИЙ НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

С-ПОЛИМОРФНЫЕ ВАРИАНТЫ ХРОМОСОМ В МЕХАНИЗМЕ . НАРУШЕНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКА

14.00.16 - Патологическая фиаишогия 03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 1995 г.

Работа выполнена в лаборатории цитогенетики НИИ медицинской генетики Томского научного центра РАМН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: д.б.н., профессор С.А.Назаренко

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: академик МАН ВШ, д.м.н., . профессор В.В.Новицкий

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: член-корр. РАМН, д.м.н., профессор А.М.Дьггай; к. б.н Н.Н.Плотникова

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - Медицинская академия им. И.М.Сеченова,

из заседании диссертационного совета Д 084.28.02 при Сибирском государственном медицинском университете (Томск-50, Московский тракт, 2).

С диссертацией ысжно оенакомиться в научной библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (г. Томск, пр. Ленина, 107).

Автореферат разослан "_"__ 1995 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, (

Москва .

Защита диссертации состоится "

.199 г. в _час

профессор

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА FABOTU

Актуальность проблемы. Одним из путей, расширяющих возможности игучения этнологии и патогенеза различных форм нарушения репродуктивной функции и изучения механизмов эмбриональной гибели у человека является применение генетических методов исследования, которое s последние года занимают все'Солее прочное место в клинической медицине. Благодаря ик использований стало возможным установление этиологии ряда заболеваний, возникновение которых ранее связывали с воздействием повре-тдамш факторов (Е.А.Кириллова, 1937). Если роль хромосомных аномалий и генных'мутаций в нарушении репродукттаной фунгщш не вызывает сомнений, то взаимосвязь полиморфизма готерохромаишовых районов (ГР) хромосом с патологией эмбрионального развития человека eue не достаточно ясна н представляется весьма актуальной проблемой.

Многочисленный;} исследованиями было установлено что ГР,' ло-калнвозанные s ценгромзриых, окодоцентроыериык и спутнкчгаа районах хромосс», в основном, не содержат структурных генов, а построена из многократно повторявшихся последовательностей ДНК. В гетерохроматиновых районах хромосом кроме различных фракций сателлитов ДНК (стДКК) обнаружены более сложно организованные последовательности. альфовднол IHK (А.А.Гннагулш!, 1934; Singer, 1SS2). Геном человека содердит не менее ЭОХ ДНК с повторгаздимися последовательностями, н около 1GX этой ДНК является Еысокоповторякщей-ся. Повторы представляют собой гигантский резервуар регуляторных последовательностей, потецццальш способных влиять на вахвейаше клеточные функции (А.Г.Ромгденко, 19В9).

Известно, что отдельные индивиды s популяциях человека отли-чгвтся широки» полиморфизмом по величине, положении, структуре и составу ДНК ГР.. Эти участки кроиосс-я 1, 0, 16 и У, выявляемые с псмоЕьа С-метода окра^аанйя, гвгг-отся наиболее крупными и вариабельными б генске человека. До насто.тазго гребена остается дискуссионна» вопрос о îou, связана ли вшжал зарпсЗельность содержания гетерохрояаТина с его генетической нейтральность-п- ми эга вариабельность составляет особенность тел функций, которые свойственны ГР (А.А.Пгдта5ьева-Бзльговская, 1CQ&).'

Для получения ^¿¡срмаша о ^оэмсаюй биологической роли ГР в течении последних 10-1Б лет провозидась цэленагрлвленкые исследования с-подиморфизиа у jsii с различна« формат сабодевзний, в том числе у лиц с наруиенияич репродуктивной функции. Практически

Bze работы, посвященные изучению этой проблемы, выполнены при исследовании хромосом лимфоцитов периферической кроеи супружеских пар. имеющих б анамнезе поьторные спонтанные аборты (а.ф.Захаров, М.Т.Цонева. 1932; Е.А.Кириллова. Т.Г.Цветкоьа. 1394; Д.П.Крошгаша и др., 1337: В1 Irnberg et al., 1Э8Е; Vulkova. 1ЭЗЗ). К сожалению, результаты этих работ противоречии и не дают однозначного ответа о связи С-полиморфных вариантов хромосом с внутриутробной гибелью у человека (Brecevic, Kern, 1938; Maes et al., 1983; Nielsen, 1978; Rodriques-Gomes et al., 1937). В этой-связи значительный интерес представляет сравнителькое изучение хромосомного полиморфизма при нормальном и патологическом развитии аародьага непосредственно на материале иедишяских (искусственных) и спонтанных (самопроизвольных) абортусов с нормальным кзриогипом. Существенный интерес представляет .также вопрос о роли с-вариаитов хромосом в происхождении аиеуплотш'у спонтанных абортусов. Изучение этих вопросов необходимо для выяснения возможного вклада С-полиморфиз-на хромосом в эмбриональную смертность.

Пель и задачи работы. Цель работы - установить роль С-полиморфизма хромосом в механизмах нарушения нормального процесса развития эмбриона человека и его гибели.

Основные задачи работы:

1) для выяснения возможной роли С-вариантов хромосом в механизмах нарушения развития эмбриона провести сравнительный анализ С-полиморфизма хромосом у спонтанных и медицинских абортусов с нормальным кариотипоы;

2) с целью выяснения возможной роли С-гетерохроматиновых районов в механизмах нерасхсодения хромосом провести сравнительный анализ -С-полиморфикх вариантов у спонщитх абортусов с -авеуплои-дией и у спонтанных абортусов с нормальным кариотилом;

3) оценить возможность возникновения de novo С-вариантов хромосом у спонтанных абортусов путем анализа характера сегрегации этик вариантов в семьях.

4) оценить состояние Огетерохроматиновых районов хромосом в процессе длительного культивирования 'клеток;

Научная новизна. Епершэ исследовано состояние конститутивного полиморфизма хромосом культивируемых фиброОластов медишшс-ких и спонтанных абортусов с нормальным н аномальным кариотипом. Установлен факт стабильности с-вариантов-хромосом в процессе длительного (20 пассажей! культивирования клеток.' Показано, что ве-

шиа С-гетерохроматиновых сегментов по большинству исследсван-< хромосом одинакова у медицинских и спонтанных абортуссв с эмальнш карнотитом, что свидетельствует об отсутствии патоге-гической роли данных хромосомных вариантов в нарушениям внутри-зоОного разЕитил человека. В то хе Еремя обоснована возможная аь гетероморфизма гомологичных хромосом 1, 0 и 16 в механизмах эушения эмбриогенеза. При исследовании С-полиморфизма хрсмосом |>ибробластах спонтанных абортусов с аномальным каркотипоы не ?Елено различий в размерах С-сегментов хромосом 1,9, 16 по авиетно со спонтанными аборяусаыи с нормальным кариотипом, что зщает роль С-вариачтов в механизмах иерасхоздешя хромосом. В 5оте впервые проведен сегрегационный анализ С-вариантов в семь, тлеющих в. анамнезе самопроизвольные аборты. Не обнаружено зникнсвения de novo С-полиморфких вариантов хромосом.

Научно-практическая значимость. Полученные Данные по состоя-

0 С-полиморфизма хромосом в культивируемых In vitro фибробластах цнцинских н спонташш абортусов необходимы для понимания меха-змоз пренаташюи гибели эмбрионов и плодов у человека. Эти ре-п>таты полихеиы.в основу изданных Минздравом СССР (1990 г.) ме-5кческих рекомендаций "Цитогенетическое исследование аЗортируе-"о материала с целью прогноза состояния здоровья матери и полотна".

Результаты данной работы могут быть использованы при выборе годологии- исследования состояния хромосомного полиморфизма в ме и патологии.

■ Апробация работы. Основные положения диссертаций доложены и :уждены на всесоюзной конференции "Хромосомы человека в норме и гологиИ", Москва (1988); на I конференции (ИИ медицинской гене-си. ТНЦ AJ/H СССР, Томск (1989); на III национальном конгрессе по шкинской биологии и генетики в Варне, Болгария; на II всесоюз-* съезде медицинских генетиков, Алма-Ата (1990); на 8 междуна-5Ном коллоквиуме франкогозоряпда стран, Клермон-Ферран, Фран-J, (1995); на меоабораторном семинаре 1Ш медицинской генетики

1 РАМН (1995).

Положения. выносимые.на задшту:

1. Размеры С-вариантов хромосом не играют определяющей роли механизмах нарушения эмбриогенеза человека.

2. В механизме нарушения развития эмбриона важную роль игра-различия в размерах С-сегментов гомологов.

3. С-полиморфные варианты не участвуют в механизмах нерас-хождэния хромосом.

4. Семьям, имеющим в анаинезе самопроизвольные аборты, свойственны равное наследование крупных и мелких с-вариантов хромосом и отсутствие возникновения их de novo.

5. Разные ткани эмбрионов человека характеризуются различиями в размерах С-сегментов хромосом.

' 6. В процессе длительного культивирования клеток эмбриональных фибробластов сохраняется стабильность вариантов структурного полиморфизма хромосом. '- . ■

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ.

Объем' и структура диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3-х глав, заключения и выводов. В тексте использовано 31 таблица и 7 рисунков. Библиографический указатель включает 22L литературных источников, из них 50 отечественных и 171 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕЛСВАШЯ

Объектом исследования служили окрашенные по С-методу препараты метафазных хромосом лимфоцитов'периферической крови взрослых индивидов и эмбриональных фибробластов спонтанных и медицинских абортусои (табл. 1)- Медицинские абортусы были взяты or жеквдн, не имевших ни одного случая спонтанного прерывания беременности. Возраст женщин данной группы варьировал от 18 до 44 лет и в среднем составил 26,3±б,5 лет. Возраст медицинских эмбрионов находился в интервале от 7 до 12 недель и в среднем составил 9,б±1,5 не- ■ дель. . -

Спонтанно абортированные эмбрионы человека 5-Е2 недель беременности били получены безвыОорочно ив 'гинекологического отделения родильного дома N 2 г.. Томска за период 1986-1990 г.г. Всего было получено 613 спонтанных абортусов, из которых 190 были успешно культивированы с получением метафазных хромосом, пригодных для цитогенетического исследования. Возраст женщин, от кото-, рых был получен абортивный материал, варьировал от 17 до 39 лет и ь среднем составил 25,044,6 года. Средний возраст эмбрионов в исследуемой группе составил 10,б±3,7 недель. Среднее число беременностей у женщин исследуемой группы было 3,3+2,8, а у жеквян контрольной группа -.3,8 1 £,5.

Характеристика исследуемого материала

Таолица 1

Объект исследования Число Число исследуемых хромосом Тип ткани Тип клеток Цель исследования

1 • 9 16

Спонтанные с нормальным карио-типом 91 132 182 182 41 Эмеритальная (кожяо - мипечная); экстра-эмбриональная (плодные-оболочки) Сравнительный анализ С-полиморфизма хромосом у медицинских аОортусов и у спонтанных аОортусов с нормальным и аномальным карогипом; сегрегационный анализ; анализ изменчивости размеров с-вариантов хромосом в процессе куль газирования

Эмбрионы Спонтанные с аномальным карио-типом 23 46 46 46 9 Фибро-бласты

Медицинские 55 112 112 112 34 Эмбриональная (кежно-шаечнаа)

Здоровые ккдизиды 9 18 18 18 9 Периферическая крогь' Лимфоциты Морфометрический анализ С-сегментов хромосом

Супружеские пары с невынашиванием беременности 18 36. 36 36 9 Периферическая кровь Лимфоциты Сегрегационный анализ С-вариантов хромосом

Всего 197 394 394 394 102

- б -

Коню-кьщечяые фрагмента эмбриона или амниотические оболочки культивировали в среде Игла с добавлением глуташна, антибиотиков, 101 сыворотки крупного рогатого ск.ота и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Культивирование эмбриональных фибробластов медицинских л спонтанных аботусов проводили параллельно в идентичных условиях (на одних и тех же партиях сред и сывороток).

Для получения препаратов метгфазннх хромосом из культуры эмбриональных 4иьрсоластсв б культуральпкй флакон добавляли кол-цешщ в конечной концентрации 0,14 мкг/iu. Клетки снимали с подложки растворсы трипсин/версен (1:1) и фиксировали смесью мета-иоа/уксусиая кислота (3:1).

с целыо получения препаратов хромосом кэ лимфоцитов периферической крови взрослых индивидов кровь инкубировали в средо 193 с добавлением 20Х сыворотки крупного рогатого скота в течение 72 часов при 07'С. Колиеьшд добавляли в коикентраш-ш 10 мкг/ыл и фиксировали раствора,! ».;&хснод/уксусНач кислота.

Для приготовления С-окрашэншх препаратов хромосом исподьзевали модифицированный метод Sumner (1072).

С целыо прямого количественного анализа С-ГР хромосом я размеров релерией хромоогаа 2, метафазиие пластинки с помощью присоединенной к микроскопу микротелевизионной камеры выводились на экран дисплея с оСшим увеличением в 5550 раз. Для измерения хромосом с экрана монитора использовали штангенциркуль с ценой деления 0,1 ми. Каждое измерение повторяли по 5 раз. За длину С-сег-мента принимали расстояние "по диагонали" между точкой, расположенными в длинном и коротком плечах на границе С-сегмента по ре-комекдаши С. А.Подугслькиковой с'соавт. (1979).

Абсолютные размера С-сегменгов хромосом 1, 0, 16, Y определяли в метзфаэных пластинках в узком интервале спирализаиии хромосом, в пределах вариабельности длины хромосомы 2 от 6,5 до 8,Е мкм. От каждого эмбриона или индивида исследовали по 5 метафазиы) пластинок с последующим вычислением средних размеров С-гегерохро-ма тиковых блоков.

Статистическая обработка результатов исследования была проведена с использованием пакета статистических программ "СТАТГРАФ' на ПЭВМ IBM РСХТ. Методы статистического анализа определяли, исходя из структуры полученных данных.

- ? -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИИСЕДОВАНШ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ изменчивости . размеров С-сегментов в процессе длительного ку ль титрования клеток. С целью научения влияния условий культивирования и, б частности, номера пассажа клеточных культур на величину С-сегментов, с помощью количественного метода оценки были исследованы хромосомы эмбриональных фибробластов, подученные, при культивировании тканей 5 медицинских абортусов в течение 20 пассажей. ■ Это достаточно длительный срок для оценки динамики изменчивости С- полиморфных, вариантов хромосом в изучаемых клеточных популяциях и, в то же время, он является недостаточным для перехода культур в фазу дегенерации.

Средние значения размеров С-сегыентов хромосом 1,9, 16 и У эмбриональных клеток на разных стадиях культивирования представлены в таблице 2. Сравнительный анализ величины С-сегментов хромосом разных пассажей проводили с помощью 1-критерия Стыодента. Как видно из полученных данных, размеры С-ГР хромосом 1, 9, 16 и У существенно не ивменяются при длительном культивировании клеток. Из 48 попарных сравнений величины С-сегментов хромосом одних и тех же эмбрионов только в б случаях были отмечены некоторые . различия в величине хромосомных вариантов на разных пассажах. Отдельные различия в размерах С-сегментов хромосомы 9, выявленные у эмбрионов N164 и N151, и хромосомы 1 в N154 в разных пассажах имели разнонаправленный характер - как в сторону уменьшения, так и в сторону увеличения размеров, поэтому данные различия можно рассматривать как случайные.

Таким образом, проведенный анализ вариабельности с-полиморфных вариантов хромосом на протяжении 20 пассажей не выявил существенных изменений размеров С-сегментов в.процессе культивирования клеток. Это позволяет использовать для оценки состояния С-полймор-физма хромосом отдельных эмбрионов однократный анализ клеток, находящихся в культуре в любом из первых £0 пассажей.

2. Полиморфизм С-гетерохроматиновых районов хромосом 1,_

15 и V у медициною^ абортусов. Для оценки состояния и пределов вариабельности С-ГР в ходе нормального эмбрионального периода развития человека нами был изучен С-полиморфизм хромосом у 56 медицинских абортусов с нормальным кариотипом. Средний пассаж культур клеток медицинских абортусов составил 4,бЮ,4. Средняя длина ре-перной хромосомы 2 в анализируемых метафзгных пластинках раншяась

Таблица £

Сравнительный анализ размеров С-сегментов хромосом фибробласгов эмбрионоЕ человека на разных стадиях культивирования клеток

Номер эмбриона Номер пассата Размеры С-сегментов хромосом (мкм) Длина хромосомы 2

1' 1" 9' 9" 16' 16" Ч

МА-154 3 1,31 1,01 1,57 1,14 0,91 0,84 1,06 7,68

10 1,33 1,22 1,50 1,16 0,86 0,74 1,00 7,70

Р 0,84 0,01 0,39 0,73 0,52 0,09 0,64

МА-152 1 1,23 1,03 1,26 1,04 0,80 0,75 1,00 7,63

10 1,32 1,09 1,19 0,98 0,61 0,72 0,93 7,17

Р 0,41 0.22 0,45 6,10 0,85 0;59 0,18

МА-164 п £ 1,27 1,15 1,16 1.01 0,88 0,78 7,21

12 1,35 1,20 1,25 1;о2 0,90 0,79 7,53

Р 0,42 0,86 0,02 0,89 0,79 0,81

МА-162 6 1,67 1,42 1,13 1,00 0,72 0.64 1,11 7,78

20 ' 1,74 1,49 1,14 0,09 0,75 0,64 1,04 7,12

Р 0,42 0,44 0,91 0,83 0,39 0,93 0,30

МА-151 1 1,36 1,21 1.18 1.11 0,86 0.69 1,11 7,66

10 1,44 1,38 1.16 1,03 0,94 0,70 1,10 7,00 .

15 1,49 1,32 1.31 1.21 0,94 0,69 1,19 7,25

Р Г1-10) 0,33 0.01 0,7 3 0,36 0,13 0,00 0,68

Р (10-15) 0,84 0,27 0,02 0,03 0,97 0,95 0,13

Р (1-15) 0,18 0,14 0,08 0,03 0,40 0,96 0,38

Примечание: Р - уровень аначимости, МА - медицинские абортусы.

7,51±0,53 мкм. Сумма величины С-сегментов хромосом 1, 9, 16 в среднем составила 6,03±0,61 мкм на клетку. Средние размеры (Х±б) С-ГР хромосом 1, 9, 16 и У были равны 1,19Ю,£0 мкм, 1,07±0,19 мкм, 0,77±0,13 мкм и 1,04Ю,12 соответственно. Установлено, что у медицинских абортусов распределение С-вариантов подчиняется закону нормального распределения (Р * 0,66, 0,34, 0,60 и 0,35 соответственно для 1, 9, 16 и У хромосом). Сравнительный анализ размеров С-вариантов хромосом у эмбрионов мужского и женского пола не выявил достоверных различий ыевду полами.

Известно, что кроме полиморфизма, обусловленного вариабельностью размеров С-ГР, в популяциях человека отмечается полиморфизм, связанный с расположением гетерохроматинового блока на коротком и/или ка длинной плечах хромосом 1, 9 и 16 - так называемые частичные или полные инверсии С-сегментов. Мы обнаружили, что у нормально развивающихся эмбрионов человека частота частичных инверсий С-йлока хромосом 1. и 9 составляет 2.2Х и 6,52 соответственно. Не обнаружено полных инверсий гетерохроматинового блока данных хромосом, а такяе ни одной инверсии ГР хромосомы 16.

3. Полиморфизм С-гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9, 16 ■ у спонтанных абортусов с нормачьным кариотипом. С целью исследования состояния С-полиморфных районов хромосом у эмбрионов человека с патологией развития мы провели анализ данных вариантов хромосом в культивируемых фибробласгах 91 спонтанного абортуса с нормальным кариотипом. Средний пассаж культивируемых фибробластов составил 5,б±0,4, а средняя длина реперной хромосомы 2 - 7,50±0,39 мкм. Средние размеры С-сегментов 1. О, 16 и У хромосом (Х±б) были равны 1,231:0,£7, 1,03*0,19, 0,77±0,14 и 0,98±0,14 мкм соответственно. Наибольший' козйициент вариации бил характерен для хромосомы 1 -22,0%, наименьший - для С-блока У хромосомы - 14,ЗХ. Сумма величины С-гетерохроматиновых блоков хромосом 1, 9 и 16 в среднем составила б,30±0,71.мкм. Распределение чзстст размеров С-ГР исследуемых хромосом соответствовало нормальному закону, за исключением хромосомы 1 (Р « 0,0001, 0,61. 0,052 и 0,19 для хромосом 1, 9, 16 и У соответственно).

У спонтанных абортусов было выявлено 3,31 частичных инверсий ГР хромосомы 1 и 0,0% инверсий хромосомы 9. Не обнаружено ни одной инверсии С-блока хромосомы 16.

Поскольку для питогенетического исследования у спонтанных абортусоЕ использовали кожно-мышечные фрагменты, а при отсутствии •

эмбриона или его мацерации - экстаэмбриональные ткани зародышевых мешков го учитывая возможное влияние тканевого происхождения фиб-робластов на размеры С-ГР хромосом 1, 9, 16 и Y мы провели сравнительный анализ исследуемых структур в клетках абортусов человека разного тканевого происхождения. Условия культивирования клеток разных типое тканей, фиксации к/ль тур и приготовления хромосомных препаратов были одинаковыми.

Полученные данные по величине С-сегментов хромосом культивируемых клеток разных тканей абортусов' представлены в табл. 3. Как видно из таблицы, средняя величина спмрализации реперюй хромосомы £ в клетках разного тканевого происхождения оказалась Слизкой (Р>0,05). следовательно степень спирализации хромосом исследуемых выборках является одинаковой.

Сравнительный анализ показал, что.средние размеры С-сегментрв хромосом 1 и 16 в культивируемых клетках зкстраэмЬршнального происхождения у спонтанных абортусов статистически достоверно превышают величину соответствующих С-сегментов в клетках эмбрионального происхождения (t=2,77; п=162; Р-0,006 и t=4,90; П=162; Р=0,00006 соответственно для 1 и 16 хромосом). Для хромосом 9 и У различия оказались недостоверными (Р>0,05),

Полученные данные свидетельствуют о том, что величина ГР хромосом в разных тканях в эмбриональном периоде развития человека может существенно различаться, по крайней мере по некоторым хромосомам набора. Сопоставление полученных результатов с литературными данными дает основание предполагать, что межтканевые различия в величине С-гетерохроматическкх районов хромосом могут зависеть от особенностей их надмолекулярной компактизации, обусловленной разной степенью метилирования ДНК в разных тканях зародыша. Так, установлено, что ДНК трофоэктодермы деметилируется еще на стадии до-имллаягационнго периода развития, в то время как ДНК зародыша отличается большей.степенью метилирования и этот характер метилирования сохраняется на более поздних сроках эмбрионального развития (Razln, Cedar, 1984).

ДНК млекопитающих содержит модификатор хроматина 5-метилцито-зин (5-МЦ) в качестве минорного основания. Метилирование цитозино-еых остатков происходят энзиматичееки вскоре после репликации ДНК. Больное число наблюдений свидетельствует, что метилирование ДНК лежит в основе регуляции генной экспрессии, в том числе в эмбриональном периоде развития (Hancock. 1&9G). Известно, что 5-МЦ скон-

Таблица 3

Сравнительный анализ размеров С-гетерохроматиновых районов хромосом 1, Э, 16, У и величины реперюй хромосомы 2 (X ± б) в клетках спонтанных абортусов разного тканевого происхождения

I-1-1--1

I I - I • Хромосомы • I

I Тип | Число)-1-1-[-,-1

| ткани I эм- 1 | | I ] |

| |брио-1 lqh | 9qh 1 16qh I Yqh | 2 |

I I нов | | | | | |

I-1-1-1-1-i;-A-1

|Эмбрио- II I I l' I I

|нальная, | 61 11,1910,2411,0110,1710,7410,1310,9810,1417,4710,39!

|кожно-мы-| | ' | | | |

| шечная I I '1 • ( | 1 |

I-I;-b--1-1-1-1-1

|Экстраэм-| | II t i 1

|брионаяь-| | *| J ] I

|ная, nio-l 21 11,3210,3411,0710,1810,8510,1411,0310,1217,5410,351

|дные обо-| | I | I ' | I

|лочки || | 1 I | I i_i_i , i_i_i_i_i

Примечание. Средние размеры выражены в микрометрах;

* - Р<0,01; ** - Р<0,0001.

центрирован в геноме в высокоповторяхшхся последовательностях сателлитной ДНК (стДНК), которые связаны на кетгфазнах хромосомах с районами конститутивного гетерохроматина (Miller et al,, 1974). Для ГР индивидуальных хромосом характерна преимущественная локализация в них определенных сателлитов - в С-сегментах хромосом 1 и 16 содержится преимущественно сателлит 11, в хромосоме 9 - сателлит III, BY хромосоме - все 4 типа сателлита. Показано, что как при обработке клеток ингибитором метилирования - 5-аааиитидином, так и при мутации метилирования у больных с синдромом ICP (ишуно-дефицит, центромерная нестадильность, лицевые аномалии) гипомети-лирование ЛНК может сопровождаться сильным растяжением прицентро-мерных районов хромосом 1 и 16 и, в меньшей степени, хромосома 9 (Mlniou. 1994). По-видимому, из всех типов стДНК, сателлит II является наиболее чувствительной мишенью, отвечающей большей сте-

- ш -

пенью декоыпактигашш при гшюметилирсвакии цитоьиновых остатков ДНК. Таким образом, можно предположить, ■ что причина наблюдаемых нами межтканевых различий размеров С-сегментов может заключаться в уменьшении надмолекулярной комлактизации хроматина клеток экстраэмбриональных тканей, обусловленной их гилометилировашюм. Обнаруженный нами Факт существования тканевых различий в величине С-сег-ментов хромосом необходимо учитывать при выборе методологии исследования Бгашосвяэи С-полиморфизма хромосом с различными патологическими состояниями человека в пре- и псстнатальноы периоде развития.

Анализ гетероморфизма гомологичных хрсиосоы фабробластов спонтанных абортусов, культивированных" из эмбриональных и здотраэыбри-онадьных тканей, был проведен .двумя способами: а) по разнице абсолютных размеров С-ГР гомологичных хроаоссу, варагеняой в икро^ет-рах; б) по числу эмбрионов и'плодов с различиями в размерах С-сегментов гомологов, равными или аревщгодини 20, 25 и Э0%-ву» разаи-цу. Установлено, что по уровни гетероморфизма гадагогичВД крсмо-сом разные ткани раввиващегося гародыга человека (амбрноаальшуэ и экстраэыбрданальные) не отличаогся друг от друга. Отсутствие медг-каневых различий гетероморфизма гомологов дьет возможность соединения полученных данных по частотам гетероморфизма гомологичных хромосом в разных тканях зародцией.

4. Сравнительный анализ С-подшорФиаиа хромосом у сякчййрцу и медицинских абортусов с нормальным карвотийом. Для изучения возможной роли мезшндиввдуальаого хромосомного подгалорфизиа а механизмах нарушения эмбрионального развития ш провели сравнительное исследование С-ГР хромосом 1, 9,16 нЧ у споитаазш; и додо&щсккх абортусов с нормальным кариотшюм. Учитызал существенное вдиание тканевого происхождения клеток на величину С-ГР, этот еаализ был проведем только для клеток эмбрионального происхождения (зьйрцо-нажьные фибробласты). Следует указать, что достоверных различай . между группами медицинских и спонтанных абортусов как по сроку беременности, так и по среднему числу пассажей культивируемых клеток не выявлено (Р>0,05).' ■.

В таблице 4 приведены результаты.сравнительного исследования размеров С-сегментов 1,9, 16 и У хромосом фибробластов 61 спонтанного и 56 медицинских эмбрионов. Различий по длина реперной хромосомы 2 в проанализированных мегафагных пластинках, фибробдас-тов двух групп -эмбрионов не обнаружено. С помощью I-критерия Сть-

Таблица 4 •

Сравнительный анализ размеров С-сегментов хромосом 1, 9.,16 и У и величины реперной хромосомы 2 (Х±б) в фибробластах медицинских и спонтанных абортусов с нормальным кариотипом

Группа абортусов 1 ...... Хромосомы

1 1 1 | 9д11 1 1 16дГ1 | Уф 1 2 1

Спонтанные П=61; N=122) 1 I1,19±0,24|1,01±0,17 1 1 0,74Ю,13|0,98Ю,14 . I (п=34) 1 7,4710,39|

Медицинские П=56; N=112) 1 11 И. 19Ю,20|1,07±0,19 1 1 - 1 0.7710,1411,0410,12 1 (П-34) 1 7,51±0,39|

Р 1 I 1 0,92 | 0,013 < ' 1 0,05 | 0,07 • 0,59 | 1

римэчание. Средние размеры вырат.енц в микрометрах;'

п - число абортусов; И - число хромосом; Р - уровень значимости.

ента установлено, что сравниваете группы эмбрионов не отлича-ся по размера! С-сегментов 3 из 4 исследованных хромосом, за ияочением хрокоссш 0, где средние размеры С-ГР были достоверно же у спонтслпих сйсртусов го сравнена с медицинскими (1=2.51; 232; Р-0,013). Сравниваемые группы эмбрионов яе отличались также суннзрндау количеству гетерохроматнна (Р»0,99).

Результата сразвотельного анализа размеров С-вариантов хромо-н 1, 9 и 16 ыегщу спонтанными И медицинскими эмбрионами мужского венского пола представлены в табл. 5. Полученные данные свиде-льствуют об отсутствии статистически значимых различий размеров сегментов по большинству проведенных сравнений. Средние размеры ГР хромосош 9 были аиачгаю ниже у спонтанных абортусов мужского ла по сравнен™ с контрольной группой медицинских абортусов яского пола (Р-0,03). В го же время у абортусов женского пола зличий в размерах С-сегментов хромосомы 9 не выявлено. Средние змеры С-сегментов хромосомы 16 у спонтанных абортусов женского ла были ниже по сравнению с медицинскими, однако у эмбрионов • какого пола различий в размерах С-ГР этой хромосомы не выявлено.

Таблица 5

Сравнительный анализ размеров и вариабельности С-ГР хромосом X, Э, 16 и У фибросластов спонтанных (СА) и ыеаитнских (МА) абортусов мужского и женского пола

г - • i- ..... 1 ! I [Группа | Пол | абор- | |тусов 1 1 1 1 Хромосомы .. __., , ... .. 1 Размер | хром. 2 | («км) |

| 1^1) I

1 X ± б | V. 1 >< 1 б IV 1 X ± б IV 1 X ± б |

1 1 1 1 СА 1 1Сп-34) 1 1,Ш0,24|20,2 1 1 1. 1,0010,16116,0 1 1 ........ 1 0,7б±0,11|14,5 1 1 7,5210,411

I ...... 1 МА 1 |(П«34) 1 1,20±0,22118,3 1 ) 1 1,07*0,18116,8 1 ' 1 1 0,7610,19125,0 1 | 7,5210,421

1 Р 0,87 0,03 0,63 0,98 1

1 1 I 1 СА 1 1(П»27) • 1 1,10±О,24|2О,2 1 1 1,03*0,19|18,5 1 1 0,7210,14119,4 Г 1 7,.49Ю,38|

1 1 МА 1 |(П-22) 1 1 ) 1,'17±0,17|14,5 1 i 1 1,08±0,21Ц9,4 1 • 1 0,79Ю,13|16,5 . 1 1 7,49±0,35|

1 Р 0,70 . 0.19 , . - 0,02 0,93 | 1......— 1

Примечание. Средние' значения и стандартные отклонения выражены в микрометрах, коэффициент вариации - в процентах; Р.- уровень значимости.

Учитывая эти данные, . выявленные различия, вероятно, следует рассматривать как случайные.

Таким образом, впервые с использованием количественных методов оценки проведен сравнительный анализ размеров С-сегментов хромосом 1, 9, 16 и У фибррбластов спонтанных и медицинских абортусов с нормальным кариотипом. Поскольку полученные данные не обнаруживают специфических и однонаправленных различий в размерах С-сегментов большинства из исследуемых хромосом сравниваемых групп емб-

рионов, мокко сделать шеоД об отсутствии влияния вариабельности размеров прицентромерных ГР хромосом и гетерохроматинового .блока длинного плеча Y-хромосомы на внутриутробную гибель эмбрионов и плодов.

Отсутствие селективного значения размеров С-вариантов хромосом ь пренатальном онтогенезе вытекает татаэ и из результатов сегрегационного анализа С-вариантов хромосом в семьях, имеюсих в анамнезе самопроизвольные аборты. Анализ наследования С-сегментов хромосом от родителей к эмбриону не показал возникновения de novo ми преимущественной передачи каких-либо с-вариантов хромосом 1, 9 и 16.

Для изучения роли различий по длине гомологичных хромосом, в механизмах иарунешм эмбриогенеза и эмбриолегалькости, нами было проведено сравнительное исследование гетероморфизма С-сегментов гомологов 1, 9 и 16 пар хромосом фибробластов спонтанных и медицинских. абортусов с нормальным кариотипом (табл. б). С помощью критерия хи-квадрат были обнаружены достоверные различия по всем 3 исследованным'хромосомам только на 25%-ном уровне гетероморфизма гомологов. Однако при объединении данных по всем трем парам хромосом, достоверные различия обнаруживались ухе на всех трех уровнях гетероморфизма с заметным преобладанием частота гетероморфных гомологов у спонтанно абортированных эмбрионов и плодов.

Данные по сравнительному анализу гетероморфизма гомологичных фомосом двух изучаемых выборок в случае, когда гетероморфизм определяли по разнице абсолютных размеров С-ГР 1,9, 10 хромосом 1редставлены в таблице 7. С.помощью t-критерия Ставдента достоверные различия между группами спонтанных й индуцированных' аборгусоз 5ыля выявлены по длине С-сегментсв гомологична; хромосом-1 и 16. с треобладанием большей разницы в величине С- блоков у спонтанно абортированных эмбрионов и плодов. По хромосоме 9 таких различий ie обнаружено.

Таким образом, - подводя итоги сравяитеглюго анализа гетеро-юрфизма гомологов v спонтанных я медицинских абортусов следует отметить, что различия э величине гомологичных хромосом, обуслов-ганные разницей в размерах С-сегментсв, суцэствгню) сказываются на эмбриональном развитии зародыша человека: чем вютэ разница з селиги не гомологичных хромссом v зародыша, тем больке вероятность его ■нутриутробной гибели и спонтанного прерывания беременности.

Сходные результаты, полученные при применении двух разных ме-

Таблица 6

Частота гетероморфизма гомологичных хромосом 1, 9 и 16 по 3 уровням различий длины С-гетерохроматиновых блоков у спонтанных и медицинских абортусоБ

-г-1---1-1

Гетероморфизм гомологов по длине С-блока I

Группа айортусоз

Хромосомы

Ь

>ZOZ

>25%

число | X | число I I

-1--Ч-1-

47 I 51,6 I 33 * | 42,9

48 f 52,6 | 34 * | 37,4 37 | 40,7 i 31 а | 34,1

>20%

число

Спонтанны« (п.91)

1 s 16

28 24 22

30,8 26,4 24,1

+

+

Всего

132 а | 48,4 | 104 л | 38,1

74**

27,1

4-

Ыедищшсгае (п=5б)

1

9 16

24' i 42,9 I 15 | 28,6 24 | 42,0 1 18 | 32,1 14 i 25;0 I 10 | 17,9

11 11

7

19,6 19.6 12,5

Всего

62 | 36,9 | 43 | 25,6 _i__i_i--—

29

17,3

Примечание: *Р<0,05; ** - Р<0,01.

тодсв определения гетероморфизма гомологичных хромосом позволяют Еыдвинуть предположение, что дисбаланс в размерах С-гетерохроыати-швых районов гомологичных хромосом не безразличен для нормального развития зародыша. Получение данные свидетельствуют о том, -что на нормальное развитие эмбриона влияют нз столько абсолютные размеры С-сегментов отдельных хромосом, сколько соотноиенкке в размерах • С-блоков гомологичных хромосом.- В настоящее время с поноаыо моле-кулярно-генетических методов исследования установлено, что цитологическая вариабельность размеров гетерохроматических районов хромосом обусловлена различным содержанием в них'альфоидных и сател-литных ДНК (А.Р.Круминя и др., 1S87; 1989). У многих„индивидов выявлен гетероморфизм гомологичных хромосом по содержанию альфа-сателлит ньк ДНК, причем в некоторых случаях различия между гомологами достигают до £-3 раз (Ю.А.Юров и др., 1987). Путем клонирования

Таблица 7

Сравнительный анализ гетероморфизма гомологичных хромосом 1, Э и 16 в фибробластах спонтанных и медицинских аборгусов по разнице абсолютных размеров С-сегментов

Группа абсртусов I г 1 1 1 |_ Хромосомы 1

1 г 1 Число | 1 1 lqh 1 1 9qh 1 16qh J

1 > 1 1 1 I X ± б 1 X ± б X ± б |

Спонтанные I 1 i 1 1 91 | * 0,£Э±0,£2 I 0,£2±0,13 * | 0,15±0,03 |

Медицинские 1 I" 1 1 1 56 | • < 0,22*0,12 1 о,гг±о,15 ■ 1 0,12±0,07 1 ■

римечание. * - Р<0,05.

ледователыюстей стДНК III человека из него были выделены' два гиента. Один из них содержи последовательности, гибридизуювяе-ln situ только с пркцентрскертш ГР хромосомы 1, последователь-ти другого гнбрйдизуются толыта с Y хромосомой. Эти данные поз-яют высказать предположение, что высокоспецифические стДНК поиграть важную роль в узнавании гомологов (А.А.Прокофьева-Вельская, 1036) и негомологов. С другой сторона, известно, что оди-оаая ми сходная молекулярная организация гетерохроматиновых онов делает возможным их коньюгаш® в пределах одной хромосомы между разными хромосомами на всех стадиях клеточного цикла, годаря ГР расположение хромосом в интерфазном ядре неслучайно, чительная часть ГР формирует в интерфазном ядре хромоцентры, положенные во всем объеме ядра и прилегаете к ядрыпку. Имеются *е данные, что ГР могут быть участками прикрепления хромосом к зной мембране. Следовательно, они играют важную роль в органики трехмерной структуры интерфазного ядра (А.А.Прокофьева-Вельская , 1936). На значение ГР в организации трехмерной структуры досом указывают данные о роли стДНК в укладке хроматина по длн-лолекулы ДНК.' Высказывается предположение о том. что стДНК не- ' в себе "код укладки хроматина", обусловленный особой фнзичес-

«ой конфигурацией' и ее вгаиыодейсггиаш! с белками (Vogt, 1В30>. Основываясь на данных о роли повторявшихся последовательностей в •организации хромосомного материала, некоторые авторы связываат эти последовательности с важными морфогеаеткческими функциями и постулируют их роль в морфрогенетичесгай информации о структуре ядра (Л.Ф.Макашовский, 1989).

Кроме увеличения частоты гетероморфизма гомологов отдельных хромосом у эмбрионов с патологией развития, в нашем исследовании была ЕыяЕлена тенденция к увеличению сочетания гетероморфных вариантов С-сегментов хромосом 1, 9 и 16 в одном карнотипе у спонтанно абортированных эмбрионов по сравнения с медицинскими. Эти данные косвенно свидетельствуют не только о возможной функциональной значимости ГР в раннем эмбриогенезе, а.также о том, что ГР разных хромосом могут, по-видиыому, функционировать в комплексе. Это предположение хорошо согласуется с последними мадекулярно-генети-чгскиш исследованиям, показавшими наличие транс-взаимодействий гетерохроматиновых повторов, локализованных в разных хромосомах D. cielanogaster' IB./.Гвоздев, 1993). Мозшо предположить, что увеличение разницы в размерах С-сегментов гомологичных хромосом за некоторые "нормальные" пределы, обусловленное различным содержанием сателлитных и аяьфа-сателлитных ДНК В ГР гомологов, приводит к изменении упаковки хроматина по длине молекулы ДНК, нарушению нормальной коныогацам ГР гомологичных и негшологичнш хроыосом, изменению трехмерной структуры хромосом и трехмерной структуры ядра. Эти изменения, в свою очередь, могут приводить к аномальному функционированию интерфазного ядра и нарушении морфогенеза органов и тканей эмбриона, вплоть до его гибели. Результаты нашего исследования подтверждают предположение А.С.Вахарова (1082) о тон, что в геноме ГР разных хромосом (по нашим данным - пар хромосом) опери-.руют как^сиотема и для правильного функционирования генома в индивидуальном развитии. важнее сохранять баланс разных компонентов системы, чем иметь избыток или недостаток гетерохроматина по отдельным хромосомам.

5. С-полиморфизм ' хромосом у ааеуплоидных спонтанных аборту-'. . сов. Известно, что ряд заболеваний у человека обусловлен численными изменениями в эволюционно слолшвшемся хромосомном наборе. Кроме того, в настоящее время установлёно, что примерно половина спонтанных абортусов имеет хромосомные аномалии, большинство из которых составляют три- я нсносомии, возникшие'в результате нарушения

Тгблитда 8

Сравни!эльный ачализ размеров С-сегментов хромосом 1. 9 и 16 у' спонтанных абортусов с анеуплоилией и с нормэлыш кариотипом

Группа Величина С-сегментов хрс юсом (Х±б) 1

пснгачных Длина 1

1

абортусов 1 1 9 1 16 хромосомы 21

анеуплои- 1 1

ней; 1,30 i 0,25| 1,16 ± 0,13 0,85 t 0,14 7,45±0,28 I

=14; N=28. 1 N=32

ез анеу- 1

лоидии; 1,32 i 0,31| 1,07 ± 0,18 0,85 ± 0,14 7,53±0,С5 |

=21; N=42 1 1

Р 1 0,65 | 0,052 I 0,95 0,43 | >

Примеч&чпэ: п - число эибрйонов; tl - число хромосом;

Р - уровень значимости;

хождения хромосом в мейозе у родителей. Одна:» причины и >;еха-мы, приводящие к возшкиовеиют анеуплоидии остается неясными, выяснения возможной роли С-вариантов в нарушении сегрегации носом, мы провели сравнительное исследование размеров С-сегмэн-хромосои фибробластоз спонтанных абортусов с анеупгоидией и с малыш кариотипом.

Следует откатить, что хромосомные препараты от 14 спонтанных ртусов с анеушшдйсй были получены из фибробластов культявиро-ных зкстразмбрзданалъных ткачэй зг.роднла, так как в абортивном ериалэ отсутствовал;! эибриояалый» ткани. Учитыват суиествова-опйсгнпш нами ранее мелткатгич различил размеров С-всркачтсз косом 1, 9, 13 и Y становится очсешли, что в качествэ гяек-ного контроля к спонтаккш оборгусам с анеуплоидлей могут вкс-ать только спонтанно абортированные эмрриопы с нормальным кари-пом, полученные при культивировании клеток из пледках оболочек. Данные по сравнительному анализу размеров С-сегментов хромосоя. 9 и 16 у спонтачных аборт/сов с анеуплояяией и с нормальным га-

- "<_U -

риотипом предстаалгны ь табл. 3. Анализ представленных душах свидетельствует об отсутствии различий В размерах С-ГР хроыэот.! 1, 9 и 16 двух сравниваемых групп эмбрионов. Сравнительное исследование гетероморфизма гомологичных хрс&госом б данных выборках также не ьиязило различий нд по одной цз исследовании/. пар хромосом. Полученные данные свидетельствуют сб отсутствии связи С-сегмэитов хромосом 1, 3, 16 и гекрэмарвизма гомологов ь механкгиах нарушения расхождения хромосом в иейозе у родителей.

ВЫВОДЫ

1. С-варианти хромосом ке играют определяюй'-й роли в механизма нарушения акбргсцальвого развития чсаогека. иа что указывает одинаковая ех деднака по богьшшетеу нсследовгшшх. хроиосом у медицинских и спонтанных абортусов с нормальный карнотшюы.

2. Одикн из Еоаиакних изхалкгаоз нарушения нормального развития эмбрионов являются различия в размерах С-сэгуектов гоыало-гоз, о чеы свидетельствует увсличегше частот гетерсыорфизыа гомологичных хромосом 1, Э и 16 в группе спсшгпньк аЗортусоз с гармадышм кариотипоа по сразненкз с издкшшеккми.

3. Механизм нерасхскденкя хроыэсси не связей с С-сегыектаки, на что указывает одинаковая велавиша С-гетерохрокзадгазых блоков хромосом 1, 9 и 1С у спонтанных абортусов с аноыашш н иоршль-ным (сардагшюи. . .

4. Со ta и, кмеичке в аяаьяеза сеиопроизгольше аборты, цг отличаются повьгзецной частотой вовапшоьеииа С-полиморфных вариантов хромосом de novo.

5. У э1йр2сиоЕ человека с корцалькци карновдгаы, сукесгвуш уежгкзневыв'различия в размерах С-сигкзктов хроцосон, на что указывает, существенное увеличение растров С-сегызн?оз кроьасац l i 16 в экзтраокЗрйональних тканях по сразнешйз с амбраднальньш.

6. В процессе длательногд куж.тк№роаг:щя зхЗркоиалыйи фкб-робдастов структурный полишрфкзи ах хромосои ' остается стабильным. • •

Список работ, опубликованных по теме•диссертации

1. Назареико С.А. ,• Баранова Б. А.. Кертгшева О.Г., Кгратеор гий Н.М. Цитогеветика-наруиеяия репродуктивной функции человека практике медико-генетического коссультерования // I Волгаро-сс

- Si -

ветский симпозиум "Организация, проблемы и достижения медико-генетического консультирования". Тезисы докл. Болгария. Варна, 1987. С. 10. .

2. Назаренко С.Д., Карагеоргий И.М., Суханова H.H. Прямая количественная оценка размеров С-сеГментов хромосом .человека // Бюлл. зкспер. биологии И медицины. 1988. N 10. С. 483-484.

3. Назаренко С.А., Карагеоргий Н.М. Полиморфные варианты хромосом в раннем эмбриогенезе человека // "Хромосомы человека в норме и патологии". Конф. памяти А.Ф.Захарова. М.: Наука, 1988. С. 35-43. ' - '

4. Карагеоргий Н.М. Вариабельность С-гетерохроматиновых районов хромосом при спорадическом и привычном невынашивании беременности // Тезисы докл. tfll Национального конгресса по мед. биологии-и генетике. Болгария. Варна, 1990. С. 44.

5. Назаренко С.А.-, Карагеоргий Н.М. Исследование связи гетерохроматиновых районов хромосом с эмбриональностью у человека // "Генетика человека и патология". Вып. I. Томск, 1990. йзд-во Томского ун-та. С. 76-83.

6. Назаренко.С.А., Карагеоргий Н.М., Картаиева О.Г: Струк-турна-функциональный полиморфизм' .хромосом и пренатальный отбор у человека // ! I Всесоюзн. съезд медицинских генетиков. Тезисы докл. М., 1990. С. 313-314.

7. Назаренко С.А., Карташева О.Г., Карагеоргий И.М. Цитоге-нетическое исследование абортивного материала с целью прогноза состояния здоровья матери и потомству У/ Методические рекомендации. ш СССР., М. 1990. 16 с*

8. Карагеоргий Н.М,, Наваренко С. А. Сравнительный анализ гетероморфизма гомологичных хромосом 1, 9, 16 it У у спонтанных и медицинских абортусов // Ешлетень Томского Научного Центра. Под ред. в.и.пуаырева. Вып. б. Томск. 1995. С. 08-108.

е. Nazarenko S.A., Karageorque К.И. Yariabllyte des structures heterochromatlques chnrosonaues r.fmz 1' cirbrycn himan. Rols possible йз la nethylatlcn de 1'ADM // Essusres 8 colloqua association des cytogeneticlens de la sue Francalse. Cleraont-Ferrand, France. 1995. P. 1Б7.

10. Назаренко С.А., Карагеоргий H.Li. Цежгканевые различия С-полиюрфаад райолоэ ярсмссом у змбриойсз человека: возможая роль метилирования. ДНК // Генетика. 1955. Т. 31. м 11. С. 1678-1581, '