Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Формирование устойчивости опухолевых клеток линии IM-9 к цитотоксическоиу действию лимфокин-активированных киллерных клеток

ВИТЕБСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

РГБ ОД

^ДК 612.017.1(021) "

10 ИЮН 2002

Гринев Василий Викторович

Формирование устойчивости опухолевых клеток линии 1М-9 к цнтотоксическому действию лимфокин-активированных киллерных клеток

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г. Витебск, 2002 г.

Работа выполнена в Республиканском научно-практическом центре детско! онкологии и гематологии МЗ РБ и ГУ НИИ гематологии и переливания крош МЗ РБ.

Научный руководитель: доктор медицинских наук Потапнев М. П

заместитель директора по науке Республи канского научно-практического центр детской онкологии и гематологии МЗ РБ.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессо

Чиркин А. А., заведующий кафедро биологической химии Витебског

государственного медицинског

университета;

доктор биологических наук Мишаева Н. П руководитель лаборатории бешенства природно-очаговых вирусных энцефалитов Г НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ Р1

Оппонирующая организация: Международный государственный эколоп

ческий университет им. А. Д. Сахарова.

Зашита состоится " /у мая 2002 г. в 14'"' на заседании совета по защи диссертаций Д 03.16.04 при Витебском государственном медицинскс университете (210023, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27; тел. (0212) 24-24-46, (02! 22-53-80).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Витебско государственного медицинского университета.

Автореферат разослан " 15 " апреля 2002 г.

Кб -и ;

Ученый секретарь I /

совета по защите диссертаций ^

доктор медицинских наук ¿¿¿К^^2^^-^^^ Доценко М..

РоЧЧЛЧ.О ,

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Считается, что в среднем у одного з трех жителей Земли развиваются онкологические процессы, но только у ескольких человек из тысячи развиваются онкологические заболевания, ключающие около двухсот нозологических форм [Sikora К. et al., 1997]. На :астоящий момент наиболее признанной концепцией, объясняющей озникновение и развитие таких заболеваний, является теория [ногостадийного канцерогенеза. Согласно этой теории нормальная оматическая клетка, прежде чем стать полностью злокачественной и проявить ебя клинически, должна пройти как минимум две стадии развития - стадию ммортализации (инициации) и стадию трансформации (промоции) <\нисимов В. Н., 1990; TraverD. et al., 1998].

На первой стадии развития рака канцероген, взаимодействуя с ДНК /или ДНК-тропными белками, вызывает такие мутационные изменения в гноме нормальной клетки, которые определяют ее переход в редрасположенное к трансформации предраковое состояние (состояние атентной или иммортализованной клетки) [Baker S. J. et al., 1997; Bowen I. D. t al., 1998; Klangby U. et al., 1998]. По мнению большинства исследователей, альнейшая опухолевая прогрессия (переход на стадию трансформации и далее к стадии метастазирования) возможна благодаря клональной микроэволюции пухолевой ткани [Frank L. М. et al., 1997]. Ключевыми событиями этого роцесса являются формирование гетерогенной популяции опухолевых клеток отбор со стороны различных факторов микроокружения таких мутантных понов раковых клеток, которые имеют селективные преимущества в условиях анного организма. Предполагается, что среди множества факторов отбора пухолевых клеток in vivo одну из главных ролей играют цитотоксические ймфоциты и противоопухолевые антитела [Jager Е. et al., 1996; Engel А. М. et :., 1997]. Однако прямых и неопровержимых доказательств участия иммунной астемы в клональной микроэволюции опухолевой ткани нет. Остаются слабо зученными и возможные механизмы иммунной селекции опухолевых клеток, также вклад этого фактора отбора в конечный результат злокачественной эансформации.

Один из возможных механизмов иммунной селекции - отбор ятотоксическими лимфоцитами или опухоль-специфическими антителами тонов клеток, лишенных экспрессии иммунногенных опухоль-хоциированных антигенов (ОАА) [Trivedi Р. et al., 1994]. Другой механизм -глекция таких клонов, которые лишены экспрессии молекул межклеточной }гезии или молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС), ействительно, клинические исследования последних лет указывают на то, что

в большинстве \ случаев прогрессия , онкологического заболевания сопровождается нарушением экспрессии клеточных адгезионных молекул ш опухолевых клетках [Csanaky G. et al., 1997; Domingo A. et al., 1997]. Причем £ некоторых случаях изменение экспрессии этих молекул служит прогностическим маркёром течения заболевания [Domingo А. et al., 1997: Mielcarek М. et al, 1997]. Параллельно с изменением экспрессии молоку; адгезии на опухолевых клетках прогрессия заболевания может сопровождать« изменением уровня растворимых форм адгезионных молекул в сыворотке периферической крови больных, что также служит прогностическим маркеро?1 [Molica S. et al., 1997; Grothey А. et al., 1998]. Вызваны ли эти измененш экспрессии мембранных и растворимых форм молекул межклеточной адгезш иммунной селекцией или же другими причинами, не известно. Аналогична; ситуация сложилась и вокруг молекул главного комплекс; гистосовместимости, нарушение экспрессии которых отмечено при различны; нозологических формах рака [Klein В. et al., 1995; Vora A. R. et al., 1997].

Задача усложняется еще и тем, что устойчивость опухолевых клеток ] цитотоксическим лимфоцитам может развиваться не только в результат* иммунной селекции, но и под влиянием других факторов микроокружения например, лекарственных препаратов [Hirose М. et al., 1999]. Влияние цитостатиков на ' чувствительность трансформированных клеток ; эффекторным механизмам иммунной системы слабо изучено, а имеющиес: данные противоречивы и не позволяют разработать единой концепции. Знани же механизмов и закономерностей такого влияния позволило 6i оптимизировать протоколы химио- и иммунотерапии онкологически: заболеваний и повысить их эффективность.

Связь работы с крупными научными программами, темам» Научно-исследовательская работа по теме диссертации проведена в рамка НИР "Изменение экспрессии молекул межклеточного взаимодействия ка механизм устойчивости опухолевых клеток к цитотоксическому действш лимфоцитов человека", выполняемой по заданию Белорусског республиканского фонда фундаментальных исследований (договор Ш Б99-09 от 1 апреля 2000 г., номер госрегистрации №20003045) в период с 01.04.2000 j по 15.03.2002 г.

Цель исследования. Установить механизм формирования устойчивост опухолевых клеток' В-лимфобластной линии 1М-9 к цитотоксическом действию аллогенных лимфокин-активированных киллерных (ЛАК) клетс человека в процессе их иммунной и лекарственной селекции in vitro.

Задачи исследования.

1. Разработать - метод иммунной (опосредованной ЛАК клеткам! селекции in vitro клеток линии IM-9 и получить сублинию опухолевых клето

стойчивых к цитотоксическому действию лимфокин-активированных иллерных клеток.

2. Изучить механизм устойчивости ЛАК-селектированной ЛАК-езистентной сублинии, опухолевых клеток IM-9 к цитотоксическому действию имфокин-активированных киллерных клеток.

3. Изучить модулирующий эффект цитостатика: этопозида (VP-16) на увствительность опухолевых клеток линии IM-9 к цитотоксическому ействшо ЛАК клеток при его кратковременном и длительном воздействии на летки-мишени.

4. Изучить механизм устойчивости этопозид-селектированной ЛАК-езистентной сублинии опухолевых клеток IM-9 к цитотоксическому действию имфокин-активированных киллерных клеток.

5. Оценить роль ключевых молекул межклеточной адгезии в механизме LAK-опосредованного киллинга опухолевых клеток линии IM-9.

Объект исследования. Опухолевые клетки В-лимфобластной линии vl-9, опухолевые клетки линии Raji лимфомы Беркнита, лейкозные клетки инии К562 бластного криза хронического миелоидного лейкоза и клетки оноцитарной линии U937 человека.

Предмет исследования. Механизм формирования устойчивости пухолевых клеток линии IM-9 к цитотоксическому действию аллогенных имфокин-активированных киллерных . клеток человека в процессе их ммунной и лекарственной селекции in vitro. .

Гипотеза. Иммунная и лекарственная селекция опухолевых клеток ожет приводить к развитию, их устойчивости к действию цитотоксических ямфоцитов. Вероятно, ключевую роль в этом процессе могут играть молекулы энтактного взаимодействия. .

Методология и методы проведенного исследования. В работе были :пользованы методы иммунной и лекарственной селекции опухолевых клеток vitro, цитотоксические и пролиферативные тесты, цитогенетический, шъюгационный и иммунофенотипический анализ, а также методы :атистической и математической обработки данных.

Научная новизна и значимость полученных результатов.

1. Впервые проведена иммунная селекция опухолевых клеток МНС-;рестрицированными цитотоксическими лимфоцитами. Установлено, что лмунная селекция приводит к снижению клональной гетерогенности эпуляции трансформированных клеток и их чувствительности к «токсическому действию клеток-эффекторов.

2. Впервые, показано, что формирование устойчивости опухолевых геток к ЛАК клеткам в процессе их иммунной селекции ассоциировано с эвышением экспрессии на трансформированных клетках молекул

CD1 la/CD 18 (LFA-1) и CD1 lc/CD18 (gp 150/95). Конъюгационная способность опухолевых клеток, а также экспрессия на них поверхностных молекул CD21 и CD58 (LFA-3) при этом снижается.

3. Впервые установлено, что селекция опухолевых клеток на устойчивость к этопозиду может индуцировать перекрестную резистентность этих клеток к лимфокин-активированным киллерным клеткам. Наблюдаемая устойчивость опухолевых клеток к клеткам-эффекторам ассоциирована со снижением экспрессии на трансформированных клетках молекул межклеточной адгезии LFA-1 и молекул костимуляции CD86 (В7.2).

4. Получены данные, согласно которым молекулы адгезии суперсемейства иммуноглобулинов LFA-3 и подсемейства р2-интегринов LFA-1 в JIAK-опосредованном киллинге опухолевых клеток выполняют разную функцию: первые обеспечивают межклеточную адгезию, вторые -костимуляцию клеток-эффекторов.

Практическая (экономическая, социальная) значимость полученных результатов. Полученные данные о возникновении перекрестной устойчивости опухолевых клеток к цитотоксическим лимфоцитам в процесс« лекарственной селекции требуют внимания и отражения при использование протоколов лечения, включающих химко- и иммунотерапию онкологически? заболеваний. Использованная методическая база может быть полезна дл> характеристики устойчивости опухолевых клеток (первичной опухоли рецидива) к иммунным цитотоксическим клеткам больного на ochobs независимого анализа параметров клеточной цитотоксичности конъюгационной способности или экспрессии молекул межклеточной взаимодействия (включая молекулы адгезии). Кроме того, материаль диссертации могут быть использованы в учебно-педагогическом процессе i научной работе в ВУЗах медицинского и биологического профиля.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Иммунная (опосредованная лимфокин-активированными киллерным! клетками) селекция in vitro опухолевых клеток линии IM-9 сопровождаете: снижением их клональной гетерогенности и развитием устойчивости i цитотоксическому действию ЛАК ■ клеток. Устойчивость иммуно селектированных опухолевых клеток линии IM-9 к лимфокин-активированныг киллерным клеткам обусловлена снижением их конъюгационной способности.

2. Кратковременная инкубация опухолевых клеток линии 1М-9 зпиподофилотоксином этопозидом повышает их чувствительность, длительное воздействии этого цитостатика на популяцию клеток-мишене индуцирует их устойчивость к цитотоксическому действию ЛАК клето! Устойчивость этопозид-селектированных опухолевых клеток линии IM-9 лимфокин-активированным киллерным клеткам ассоциирована со снижение:

экспрессии на клетках-мишенях молекул LFA-1 и В7.2. При этом конъюгационная способность этих клеток, а также экспрессия других поверхностных молекул контактного взаимодействия остаются без изменений.

3. В клеточной системе [JIAK]/[IM-9] молекулы суперсемейства иммуноглобулинов: LFA-3, экспрессированные на опухолевых клетках, обеспечивают межклеточную адгезию, а молекулы подсемейства р2-интегринов LFA-1 выполняют функцию костимуляции клеток-эффекторов.

Личный вклад соискателя. Все исследования выполнены автором самостоятельно. В диссертации не были использованы результаты исследований соавторов совместных публикаций (за исключением специально отмеченных случаев).

Апробация результатов диссертации. Результаты исследований, включенные в диссертацию, докладывались на VIII международном симпозиуме "Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии" (г. Минск, 27-29 апреля 2000 т.), Четвертой научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000" (г. Санкт-Петербург, 23-25 мая 2000 г.), IV съезде Белорусского научного общества иммунологов и аллергологов (г. Гомель, 15-16 июня 2000 г.), 14-ом Европейском иммунологическом симпозиуме EFIS 2000 (г. Познань, 23-27 сентября 2000 г.) и Международной научно-практической конференции ''Актуальные проблемы гематологии и трансфузиояогии" (г. Минск, 25-27 октября 2000 г.).

Опубликованность результатов. По теме диссертации имеется 10 публикаций. Из них статей в научных журналах - 3, статей в сборниках яаучных материалов - 2, тезисов докладов и выступлений на конференциях - 5. Эбщий объем опубликованного материала - 35 страниц.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 114 страницах машинописного текста и содержит 15 иллюстраций, 12 таблиц и 5 приложений. Список использованных литературных источников включает 286 ссылок (в том числе 15 - на русском, и 271 - на английском языках). Диссертация включает : общую характеристику работы, обзор литературы, описание материалов и методов, три главы собственных данных, главу, юсвященную обсуждению результатов, заключение, список использованных источников.и приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Клеточные культуры. Все исследования были проведены на опухолевых клетках В-лимфобластной линии IM-9. В дополнительных экспериментах использовались клетки линии К562 властного криза хронического миелоидного лейкоза человека, клетки моноцитарной линии человека U937 и линии Raji лимфомы Беркнита. Источником естественных киллерных (ЕК) клеток служили свежевыделенные мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) здоровых людей. JIAK клетки получали по методу Yaanelli J. R. [1991].

Селекция опухолевых клеток in vitro. JIAK-резистентная сублиния IM-9/SL-15 получена нами в серии восьми последовательных смешанных культур ЛАК клеток и клеток исходной линии IM-9. Аналогичным образом ЕК-резистентная сублиния K562/NKR была получена в серии последовательных смешанных культур МПК и клеток исходной линии К562. Этопозид-резистентная сублиния опухолевых клеток IM-9/ER предоставлена Григоровичем С. А. (НИИ гематологии и переливания крови МЗ РБ).

Цитотоксические тесты. Для оценки чувствительности опухолевых клеток к ЕК- или ЛАК-индуцируемому апоптозу использовали JAM тест, как описано Matzinger Р. [1991]. Чувствительность клеток-мишеней к фактору некроза опухолей-а (ФНО-а) определяли в МТТ тесте [Niks М. et al., 1990]. Чувствительность опухолевых клеток к перфорин/гранзимам цитолитических гранул ЕК-клеточной линии RNK-16 изучали по методу Sutton V. R. [1997]. Кроме того, апоптотическая гибель •. клеток в специальных случаях детектировалась по конденсации хроматина с помощью флюоресцентной микроскопии, а также на проточном цитофлуориметрс FACScan с помощью пропидиум иодида или гель-электрофореза клеточной ДНК.

Цнтогенетический анализ. Цитогенетический анализ опухолевых клеток проводили (совместно с Морозом Ю. А., РНПЦДОГ) по стандартному G-методу с использованием красителя Гимза.

Пролиферативная активность опухолевых клеток. Пролиферативный потенциал клеток исходной линии IM-9 и ее сублинии 1M-9/SL-15 изучали двумя способами: методом проточной цитометрии с учетом распределения опухолевых клеток по фазам клеточного цикла пс методу Curnow S. J. [1994] и стандартным радиоактивным методом пс интенсивности включения клетками-мишенями метил-3Н-тимидина ([3H]-TdR).

Конъюгациоииый анализ. Конъюгационную способность опухолевы> клеток в отношении ЛАК клеток оценивали микроскопическим методом, ка!

зписано Cabrera L. [1996], а также на проточном цитофлуориметре FACScan по тротоколу Palucka А. К. [1996]. Кроме того, для сравнительной характеристики адгезионных свойств опухолевых клеток исходной линии IM-9 и двух ее :ублиний IM-9/SL-15 и IM-9/ER использовали метод подавления 1АК-опосредовашюго лизиса опухолевых клеток "холодной" мишенью, федложенный Vergelli М. [1996].

Иммунофепотипическнй анализ опухолевых клеток. Экспрессию шличных поверхностных антигенов определяли с помощью специфических юноклональных антител (МЬСА) в прямом или непрямом флуоресцентном шализе как описано Maghazachi А. А. [1996]. Внутриклеточную экспрессию штиапоптотического онкогена Вс1-2 изучали с помощью метода, описанного 'icker L. J. [1995].

Статистический и математический анализ данных. Все исследования гроводшга не менее чем в трех независимых повторах. Данные представляли ;ак средняя арифметическая + стандартная ошибка средней (М + т). Для щенки достоверности различий между двумя группами данных использовали ггандартный t-тест Стьюдента. Достоверными'считали различия при уровне начимости Р<0,05. Достоверность различия двух сравниваемых кривых :вязывания или кривых подавления лизиса определяли по F-тесту Фишера в юдификации Motulsky Н. J. и соавт. [1987]. Математическую обработку (энных конъюгационного анализа проводили в рамках двух моделей: (инамическое и равновесное состояние клеточной системы эффектор]/[мйшень]. Значения ати/рп1ах и у/5 для первой математической юдели находили с помощью нелинейного регрессионного анализа. Процедуру (елинейной регрессии проводили с помощью пакета прикладных программ 1TATISTICA для Windows'95.

Результаты и их обсуждение

1. Иммунная селекция опухолевых клеток in vitro под действием 1АК клеток. Для изучения механизмов иммунной селекции опухолевых леток in vitro нами была использована модель, которая включала 1) клетки 1-лимфобластной линии IM-9 как прототип иммортализованных клеток и ) 7-и суточные алло генные ЛАК ■ клетки человека как прототип ,итотоксических лимфоцитов. Такая модель иммунной селекции in vitro озволяет исследовать клональную микроэволюцию популяции опухолевых леток только под влиянием цитотоксических лимфоцитов иммунной системы, сключив воздействие других факторов.

В рамках представленной модели путем длительного совместного ультивирования in vitro клеток линии IM-9 с ЛАК клетками нами была

получена иммуно-селектированная сублиния опухолевых клеток 1М-9/БЬ-15. Ее селекционное происхождение имеет несколько подтверждений. Во-первых, чувствительность клеток 1М-9/8Ь-15 к ЛАК клеткам в 5,6 раз ниже чувствительности клеток исходной линии (рис. 1). Во-вторых, наблюдаемое снижение чувствительности клеток сублинии 1М-9/8Ь-15 было стабильным на протяжении длительного времени (не менее трех месяцев), что также

40 п ОЛАК

■ ЕК

30

120 Н

о

с <

10 -

Lit

1М-9 Ш-9/8Ы5(5)1М-9/8Ь-15(8) Рис. 1 Чувствительность опухолевых клеток исходной линии 1М-9 и ее сублинии 1М-9/8Ь-15 к цитотоксическому действию ЛАК клеток. Чувствительность клеток сублинии 1М-9/81.-15 к ЛАК клеткам изучалась после постановки пяти (5) или восьми (8) последовательных смешанных культур опухолевых клеток с лимфокин-активированными киллерными клетками. Представлены суммарные результаты четырех независимых экспериментов. Достоверность различия (*) при Р<0,05 и (**) Р<0,02.

свидетельствует о селекционной (но не индукционной) природе этой сублинии. В-третьих, согласно данным цитогенетического анализа линия IM-9 является гетерогенной популяцией, представленной четырьмя цитогенетически различимыми клонами диплоидных опухолевых клеток. В тоже время, популяция клеток сублинии IM-9/SL-15 представлена только одним клоном, маркированным нереципрокной транслокацией der (X) t (X; 1) (q21; qll-12) Два других клона, маркированных делецией del (1) (qll-12), нереципрокной транслокацией der (X) t (X; 1) (q21; qll-12), делецией del (3)(p23), инверсией : (3) (pl2; q28-29) и дупликацией dup (12) (ql2q24), а также клон с нормальны;, кариотипом, были утеряны в процессе иммунной селекции опухолевых клеток.

Выявленные различия по цитогенетическим маркерам i чувствительности к ЛАК клеткам клеток линии IM-9 и ее сублинии 1M-9/SL-H не были ассоциированы с изменением уровня пролиферации указанных клеток

Этот вывод подтверждается результатами анализа клеточного цикла в двух юпуляциях опухолевых клеток и оценки их способности включать

в том, ни в другом случае статистически достоверных различий между шумя типами клеток обнаружено не было.

Таким образом, длительное совместное культивирование in vitro клеток [инии IM-9 с лимфокин-активированными киллерными клетками юпровождается снижением их клональной гетерогенности и развитием табильной устойчивости к JIAK клеткам, что может быть обусловлено только [ммунной селекцией указанных опухолевых кйёток. Возможность прямой [ммунной селекции опухолевых клеток подтверждается и данными, которые ¡ыли получены нами на другой модели - модели селекции in vitro лейкозных ;леток линии К562 под действием естественных киллерных клеток 1ериферической крови здоровых людей.

2. Лекарственная селекция опухолевых клеток in vitro. Нами были юследованы биологические свойства опухолевых клеток этопозид-устойчивой ;ублинии IM-9/ER, полученной Григоровичем С. А. Эта сублиния была голучена путем длительного культивирования (на протяжении 6-и месяцев) шухолевых клеток линии IM-9 в полной питательной среде, содержащей радиентно-возрастающую концентрацию эпиподофилотоксина этопозида (от >0 до 400 нМ). Интересно отметить, что селекция на устойчивость к различным :имиотерапевтическим агентам показана практически для всех типов шухолевых клеток [Dalton W. S., 1997; Kern М. A. et al., 1997]. При этом в 1екоторых случаях формирование множественной лекарственной >езистентности сопровождается развитием перекрестной устойчивости расформированных клеток к эффекторным механизмам противоопухолевого шмунитета [Ilirose М. et al, 1999]. Однако на моделях селекции с этопозидом •акого феномена обнаружено не было [Treichel R. S. et al., 1992]. Как показали тши исследования, опухолевые клетки IM-9/ER характеризуются повышенной 'стойчивостью не только к этопозиду, но и к ЛАК клеткам (рис. 2 Б). В то же ¡ремя клетки сублинии IM-9/SL-15, устойчивые к ЛАК клеткам, остаются 1увствительными к данному эпиподофилотоксину.

Примечательно, что кратковременное культивирование (на протяжении !4 часов) опухолевых клеток исходной линии IM-9 с этопозидом (1 мкМ) ¡ызывает повышение чувствительности клеток-мишеней к ЛАК клеткам рис. 2 А). Аналогичные результаты были получены и другими авторами на шличных клеточных моделях [Yamamoto Т. et al, 2000; Deaglio S. et al., 2001]. Это позволяет предположить, что противоопухолевый эффект ряда штостатиков обусловлен не только их прямым цитостатическим или датотоксическим действием на опухолевые клетки, но и опосредован шмунной системой. В то же время обратный эффект - снижение под влиянием

цитостатика чувствительности опухолевых клеток к эффекторам противоопухолевого иммунитета, - может быть одной из причин развита« вторичных, обусловленных химиотерапией, форм рака [81апи11а М. й а!., 1997].

60

40 -

20

0

40 1

30

£ 20-

¡0

о

□ 1М-9 ШШ-9/ЕГ1

1М-9

1М-9/УР-16

ЛАК

ЕК

Рис. 2 Влияние этопозида на чувствительность клеток линии 1М-9 I цитотоксическим лимфоцитам. А) Изменение чувствительности клеток линш 1М-9 к ЛАК клеткам после 24-х часового культивирования с 1 мкМ этопозидг (клетки 1М-9Л/Р-16). Представлены суммарные результаты трех независимы? экспериментов. Достоверность различия (*) при Р<0,05. Б) Чувствительност) клеток 1М-9/ЕЯ к ЛАК и ЕК клеткам. Приведены суммарные результаты шест! независимых экспериментов. Достоверность различия (*) при Р<0,003.

3. Механизм устойчивости опухолевых клеток сублинии 1М-9/8Ь-1! к аллогенным ЛАК клеткам. Прямая устойчивость опухолевых клеток к ЛА1 клеткам может быть обусловлена нарушением одного или нескольких этапо] клеточной цитотоксичности. Исходя из этого положения для выяснен и: возможного механизма (-ов) развития устойчивости клеток линии 1М-9 к ЛА1 клеткам в процессе их иммунной селекции мы провели сравнительный анали ключевых этапов взаимодействия опухолевых клеток исходной линии 1М-9 ! ее сублинии 1М-9/8Ь-15 с клетками-эффекторами.

Для изучения первого этапа клеточной цитотоксичности (этап межклеточной адгезии или конъюгации) мы использовали конъюгационньп анализ и анализ конкурентного подавления "холодными" мишенями киллииг ЛАК клетками -меченых клеток исходной линии 1М-9. Полученны

результаты указывают на то, что, во-первых, конъюгационная способност клеток 1М-9/8Ь-15 достоверно ниже аналогичного показателя клеток исходно линии (табл. 1), и, во-вторых, эффективность подавления "холодными" (н меченными) клетками-конкурентами 1М-9/8Ь-15 лизиса ЛАК клеткам

'горячих" (меченных) клеток-мишеней 1М-9 достоверно ниже, чем 'холодными" клетками-конкурентами 1М-9 (рис. 3). Следовательно, в процессе ЛАК-опосредованной селекции происходит положительный отбор таких опухолевых клеток линии 1М-9, которые обладают сниженной способностью к межклеточной адгезии.

Таблица 1

Параметры конъюгации клеток-мишеней для клеточной системы [ЛАК]/[1М-9]

H[JIAK]/[IM-9/SL-15]

Параметр конъюгации Клеточная система

[ЛАК]/[1М-9] [JflAK]/[IM-9/SL-15]

^тах 86,2 ±3,8 69,5 ± 4,4*

) 0,584 ± 0,058 0,995 ± 0,039**

CD' xlO"s 0,286 ± 0,090 0,682 ±0,013*

ШС' [0,5] 317,4+11,5 223,8 ± 16,6**

Примечание: достоверность различия при (*) Р<0,05 и (**) Р<0,01.

Клетки-конкуренты, 1000/лунку

Рис. 3 Эффективность подавления "холодными" мишенями (не печеными опухолевыми клетками 1М-9 или IM-9/SL-15) лизиса ЛАК клетками опухолевых клеток исходной линии IM-9. Эффективность подавления лизиса, зыраженную в процентах, оценивали в стандартном 4-х часовом JAM тесте. Представлены суммарные результаты трех независимых экспериментов. Кривые достоверно различаются при Р<0,001, определенному по модифицированному F-тесту Фишера.

Нарушение межклеточной адгезии как механизм избегания трансформированными клетками иммунного распознавания и лизиса отмечается многими исследователями [Palucka А. К. et al., 1993; Chaperot L, et al., 1997]. Однако при этом не обсуждается вопрос о происхождении такого изменения свойств опухолевых клеток. Наши результаты позволяют предположить, что это может быть обусловлено иммунной селекцией иммортализованных клеток во время их клональной микроэволюции.

Изменение конъюгационных свойств опухолевых клеток и, как следствие, их чувствительности к цитотоксическим лимфоцитам, некоторые исследователи связывают с нарушением экспрессии молекул межклеточной адгезии [Becker J. С. et al., 1995; Garrido F. et al., 1997]. В нашем случае также наблюдаются изменения экспрессии на клетках сублинии IM-9/SL-15 молекул LFA-1, gp 150/95, LFA-3 и CD21. Однако снижение экспрессии отмечено только для последних двух типов молекул. Экспрессия же CD lia, CDllc и CD 18 на опухолевых клетках IM-9/SL-15 достоверно повышена (табл. 2).

Таблица 2

Экспрессия молекул контактного взаимодействия на опухолевых клетках линии 1М-9 и ее сублинии 1М--9/8Ь-15

Кластер IM-9 IM-9/SL-15

дифференци-ровки Антигенположи-тельные клетки, % СИФ, у. е. Антигенположи-тельные клетки, % СИФ, у. е.

CDlla 35,8 ±1,9 67,0 ± 7,0 96,5 ± 20,2* 123,0+14,6

CDllc 13,9 ±0,4 89,0 ± 18,0 22,4 ± 1,9* 82,0 + 7,3

CD18 35,8 ± 1,75 161,0 ±23,7 95,3 ± 9,8* 254,8 ±39,1

CD21 84,4 ± 4,2 475,7 ± 117,5 60,4 ± 2,4* 462,7 ±33,2

CD58 94,8 ± 0,6 158,2+10,3 68,0 ± 4,9* 163,2 ±33,3

CD86 73,7 ± 12,6 697,5 ± 247,8 71,4+11,9 630,5 ± 286,С

Примечание: достоверность различия (*) при Р<0,05.

Мы полагаем, что за межклеточную адгезию клеток линии 1М-9 с ЛАК клетками ответственны поверхностные адгезионные молекулы суперсемейства иммуноглобулинов, но не подсемейства р2-интегринов. Наши результаты подтверждаются данными других исследователей. Так, СЬарего! Ь. с соавторами [1997] показали, что чувствительность

В-лимфобластных клеточных линий к ЛАК клеткам коррелирует с экспрессией

молекул ICAM-1, но не LFA-1. Схожие результаты получены Gwin J. L. с коллегами [1996]. Эта группа исследователей установила, что чувствительность опухолевых клеток к ЛАК клеткам прямо коррелирует со степенью экспрессии на их поверхности молекул LFA-3.

Проведенные нами эксперименты с блокированием молекул CD11а и CD18 с помощью специфических МКА показали, что молекулы LFA-1 функционально активны в цитотоксических тестах, хотя и не принимают участия в конъюгации клеток IM-9 с ЛАК клетками (рис. 4). Основываясь на этих данных, а также положении о том, что молекулы межклеточной адгезии обеспечивают не только конъюгацию опухолевых клеток с цитотоксическими лимфоцитами, но и костимуляцию последних, мы заключаем, что в клеточной системе [ЛАК]/[1М-9] молекулы LFA-1, экспрессированные на опухолевых клетках, выполняют функцию костимуляции ЛАК клеток.

Когпроль Анти- Ainu- Анти- Контроль Atrm- Анти-

CDlla CD18 CD86 CDlla CD1S

Рис. 4 Влияние МКА к молекулам LFA-1 и В7-2 на взаимодействие teжду опухолевыми клетками линии IM-9 и ЛАК клетками. А) Модуляция чувствительности клеток линии IM-9 к цитотоксическому действию ЛАК леток с помощью МКА к CDlla, CD18 и CD86. Представлены суммарные »езультаты трех независимых экспериментов. Достоверность различия (*) при '<0,01. Б) Частота конъюгации клеток IM-9, обработанных МКА к CDlla и Ю18, с ЛАК клетками. Частоту конъюгации определяли с помощью муоресцентной микроскопии при соотношении эффекторов и мишеней 1:1. 1редставлены суммарные результаты трех независимых экспериментов.

Для идентификации дополнительных, не связанных с конъюгационной пособностью опухолевых клеток, путей ЛАК-опосредованной селекции леток линии IM-9 мы изучили возможные нарушения других этапов цитолиза тих клеток ЛАК клетками. Однако нами не было обнаружено изменения

экспрессии на опухолевых клетках сублинии IM-9/SL-15 молекул главного комплекса гистосовместимости (HLA-DR), молекул костимуляции В7.2, а также Fas-рецептора и антиапоптотического онкогена Вс1-2, принимающих участие в реализации этапов распознавания, активации и собственно цитолиза, соответственно. Кроме того, клетки исходной линии IM-9 и сублинии IM-9/SL-15 не различались между собой по чувствительности к ФНО-а или перфорин/гранзимам цитолитических гранул ЕК клеток.

4. Механизм устойчивости опухолевых клеток сублинии IM-9/ER к аллогенным ЛАК клеткам. Изучение механизма (-ов) устойчивости опухолевых клеток этопозид-селекшрованной сублинии IM-9/ER к цитотоксическому действию ЛАК клеток проводилось по схеме, аналогичной схеме исследования устойчивости клеток сублинии IM-9/SL-15.

Как и в случае с клетками IM-9/SL-15 при изучении этапа конъюгации на модели с опухолевыми клетками IM-9/ER было использовано несколько подходов. Однако ни один из предложенных методов не выявил достоверных различий в конъюгационной способности между клетками исходной линии 1М-9,.?и ее сублинии IM-9/ER. Наши исследования показали, что кривые связывания опухолевых клеток IM-9 и IM-9/ER с ЛАК клетками достоверно не различаются. Нет достоверных различий и по параметрам конъюгации, рассчитанным на основе кривых связывания. Аналогичные результаты были получены и при изучении конкурентного подавления "холодными" клетками-мишенями (не меченными клетками IM-9 или IM-9/ER) киллинга ЛАК клетками [3Н]-ТсШ.-меченых клеток исходной линии 1М-9: достоверных различий между двумя типами опухолевых клеток нами не обнаружено.

Однако, несмотря на отсутствие различий в конъюгационной способности, анализ экспрессии некоторых ключевых молекул контактногс взаимодействия на клетках IM-9 и IM-9/ER выявил достоверные различи? между этими типами опухолевых клеток (табл. 3). По сравнению с клеткамf IM-9 на клетках IM-9/ER достоверно снижена экспрессия молекул LFA-1 i CD86, причем для сублинии IM-9/ER характерно не только снижена« количества LFA-1- и С086-положительных клеток, но и мнтенсивносп экспрессии этих молекул на поверхности опухолевых клеток. Наблюдаемы« изменения экспрессии молекул адгезии LFA-1 и костимуляции CD86 ю клетках сублинии IM-9/ER имеют селекционную, но не индукционную природу, поскольку такой фенотип опухолевых клеток подцерживалс: длительное время (не менее двух недель культивирования) после удалена этопозида из культуральной среды. Интересно отметить, что дефект экспрессш молекул LFA-1 на лейкозных клетках с высокой частотой встречается ; больных, страдающих острым лимфобластным лейкозом В-клеточноп происхождения [Geijtenbeek Т. В. Н, et al., 1999].

Таблица 3

Экспрессия молекул контактного взаимодействия на опухолевых клетках линии 1М-9 и ее сублинии 1М-9/ЕЯ

Кластер IM-9 IM-9/SL-15

аифференци-ровки Антигенположи-тельные клетки, % СИФ, у. е. Антигенположи-тельные клетки, % СИФ, у. е.

CDlla 35,8 ± 1,9 67,0 ± 7,0 10,5 ± 1,2* 20,0 ± 10,6*

CD18 35,8 ± 1,75 161,0 ±23,7 9,7 ±5,3* 25,2 ± 4,8*

CD58 94,8 ± 0,6 158,2 ±10,3 69,8 ± 30,4 180,0 ±79,9

CD86 73,7 ± 12,6 697,5 ± 247,8 27,4 ± 9,9* 336,0 ±9,6**

Примечание: достоверность различия (*) при Р<0,05 и (**) Р<0,01.

В то же время, как было нами установлено, экспрессия поверхностных молекул CD22, LFA-3, CD95, молекул главного комплекса гистосовместимости I и И классов, а так же внутриклеточного белка Вс1-2 на опухолевых клетках сублинии IM-9/ER остается стабильной. Без изменений остается и их чувствительность к ФНО-а или перфорин/гранзимам цитолитических гранул.

Исходя из результатов изучения экспрессии молекул LFA-1 на клетках сублинии IM-9/ER, анализа их функциональной активности в клеточной системе [ЛАК]/[1М-9], а также выявленному снижению экспрессии молекул В7-2 на этопозид-селектированных клетках мы предполагаем, что устойчивость опухолевых клеток IM-9/ER к ЛАК клеткам может быть обусловлена нарушением третьего этапа клеточной цитотоксичности - этапа активации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Иммунная (опосредованная ЛАК клетками) селекция in vitro опухолевых клеток В-лимфобластной линии IM-9 характеризуется снижением их гетерогенности и чувствительности к цитотоксическому действию ЛАК клеток (из четырех цитогенетически идентифицируемых клонов исходной линии 1М-9 ЛАК-селектированная ЛАК-резистентная сублиния IM-9/SL-15 представлена только одним; клетки сублинии IM-9/SL-15 в 5,6 раза менее чувствительны к ЛАК клеткам, чем опухолевые клетки исходной линии) [2, 6].

2. Устойчивость иммуно-селектированных клеток IM-9/SL-15 к ЛАК клеткам обусловлена нарушением первого этапа клеточной цитотоксичности -этапа межклеточной адгезии (конъюгации). По параметрам связывания атах,

Зтах, 7, S, KD и AUC, конъюгационная способность клеток исходной линии IM-9 достоверно выше аналогичного показателя для клеток сублинии IM-9/SL-15. Эффективность подавления "холодными" клетками-конкурентами IM-9/SL-15 киллинга ЛАК клетками "горячих" клеток-мишеней IM-9 достоверно ниже, чем "холодными" клетками-конкурентами IM-9 [2, 5, 8].

3. Кратковременное (на протяжении 24 часов) воздействие ингибитора топоизомеразы II этопозвда на опухолевые клетки В-лимфобяастной линии IM-9 повышает чувствительность клеток-мишеней к ЛАК-индуцируемому апоптозу (с 27,7 ± 5,6% до 40,5 ± 8,9% специфической гибели после 4-х часов взаимодействия с клетками-эффекторами). Длительная (на протяжении 6~и месяцев) лекарственная селекция клеток IM-9 на устойчивость к этопозиду индуцирует перекрестную устойчивость этих клеток к ЛАК клеткам (чувствительность опухолевых клеток этопозид-селектированной сублинии IM-9/ER к ЛАК клеткам в 6,4 ниже, чем клеток исходной линии) [3, 4, 7,9].

4.. Экспрессия молекул межклеточной адгезии LFA-1 и молекул костимуляции В7.2 на опухолевых клетках сублинии IM-9/ER достоверно ниже экспрессии этих молекул на клетках исходной линии IM-9. Устойчивость эюпозид-селектированных клеток IM-9/ER к цитотоксическому действию ЛАК клеток, . вероятно, обусловлена нарушением третьего этапа клеточной цитотоксичности - этапа активации клеток-эффекторов [3, 5, 6, 8].

5. В клеточной системе [ЛАК]/[1М-9] молекулы суперсемейства иммуноглобулинов LFA-3, экспрессированные на опухолевых клетках, обеспечивают межклеточную адгезию, а молекулы подсемейства р2-интегринов LFA-1 выполняют функцию костимуляции клеток-эффекторов [1,2, 8, 10].

6. Математическая обработка данных конъюгационного анализг взаимодействия клеток-эффекторов и клеток-мишеней позволяет рассчитал ряд констант (Sb, ow, pmax, у, 5, Kd и AUC), характеризуют® конъюгационную способность этих клеток. В свою очередь, по рассчитаннь» константам возможно проведение сравнительного анализа конъюгационнор способности различных типов клеток-мишеней [2, 3, 5].

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах.

1. Потапнев М. П., Гринев В. В. Противоопухолевый иммунитет иммунотерапия больных с онкологическими и онкогематологическим заболеваниями. // Здравоохранение. - 2000. - № 7. - С. 34-37.

2. Grinev V. V., Smolnykova V. V., Moroz J. A., Potapnev M. P. Markers of i vitro induced resistance of B-lymphoblastoid cell line IM-9 to lysis t

Iymphokine-activated killer (LAK) cells. // Experimental Oncology. - 2001. -Vol.23,№3.-P. 197-203. 3. Grinev V. V., Grigorovich S. A., Shman Т. V., Sheleg S. V., Smolnikova V. V., Potapnev M. P. Svimovski A. I. Different mechanisms of resistance to Iymphokine-activated killer (LAK) cells in leukemic cell sublines selected by etoposide or by LAK cells. //Hematology. - 2001. - Vol. 6, N* 5. - P. 321-329.

Статьи в сборниках научных материалов.

к Потапнев М. П., Гринев В. В., Григорович С. А., Кустанович А. М., Мороз Ю. А., Шман Т. В. Механизм и роль селекции опухолевых клеток в онкогенезе // Теория и практика медицины: Сборник научных трудов. -Выпуск 1 / Под редакцией И. Б. Зеленкевича и Г. Г. Шанько. - Минск, 1999. - С. 47-48.

>. Гринев В. В., Шман Т. В., Шелег С. В., Потапнев М. П. Изменение параметров связывания опухолевых клеток с цитотоксическими лимфоцитами в процессе их иммунной, но не лекарственной селекции in vitro // Актуальные вопросы детской онкологии и гематологии: Материалы VIII международного симпозиума, Минск, 27-29 апреля 2000 г. - Минск, 2000. - С. 38-40.

Ч'Зисы докладов и выступлений на конференциях.

Гринев В. В., Григорович С. А., Потапнев М. П. Развитие резистентности опухолевых клеток к лимфокин-активированным киллерным клеткам как результат их иммунной и лекарственной селекции in vitro // Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000: Тезисы докладов Четвертой научной конференции с международным участием, Санкт-Петербург. 23-25 мая 2000 г. ! Медицинская иммунология. - 2000. - Том 2, №2. -С. 157-158.

Гринев В. В., Григорович С. А. Модулирующий эффект этопозида на чувствительность клеток В-лимфобластоидной линии IM-9 к лимфокин-активированным киллерным (ЛАК) клеткам // Актуальные вопросы иммунологии и аллергологии: Материалы IV съезда Белорусского научного общества иммунологов и аллергологов, Гомель, 15-16 июня 2000 г. - Гомель, 2000. - С. 98-99.

Гринев В. В., Григорович С. А., Шман Т. В., Шелег С. В., Потапнев М. П. Закономерности изменения биологических свойств лейкозных клеток человека в процессе иммунной и лекарственной селекции in vitro // Актуальные вопросы иммунологии и аллергологии: Материалы IV съезда

Белорусского научного общества иммунологов и аллергологов, Гомель, 15-16 июня 2000 г. - Гомель, 2000. - С. 99-101.

9. Григорович С. А., Гринев В. В., Шман Т. В., Шелег С. В., Свирновский А. И. Резистентность к этопозиду сопровождается снижением чувствительности к таксотеру и JTAK-опосредованному цитолизу у клеток миеломной линии IM-9 // Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии: Сборник материалов международной научно-практической конференции, Минск, 25-27 октября 2000 г. - Минск, 2000. -С. 283-284.

10. Grinev V. V., Grigorovich S. A., Potapnev M. P. Differential expression of LFA-1 due to drug or immune selection in vitro of B-lymphoblastoid cell line IM-9 // Abstracts of the 14th European Immunology Meeting EFIS 2000 / Immunology Letters. - 2000. - Vol. 73, № 2-3 (Special Issue). - P. 124.

19

РЭЗЮМЭ

Грынёу Вас1ль BiicTapani't Фарлнраванне устойл»васш пухлшавых клетак лиш IM-9 да цытатакачнага дзеяння л1мфакш-актываваных ктлерных клетак

Ключавыя словы: пухлшавыя клетю лiнii IM-9, ЛАК клетю, этапазщ, •елекдыя, устойл^васць, пам!жклеткавая кан'югацыя, малекулы адгезп.

Цэль даследавання: устанав1ць мехашзм фарм1равання устошнвасц1 ¡ухлшавых клетак лши IM-9 да цытатакачнага дзеяння л1мфакш-актываваных мерных (ЛАК) клетак у працэсе ix ¡муннай ni лекавай селекцьн in vitro.

Метады даследавання: культуральныя, фснатышчныя, (ытагенетычныя, прал1фератыуныя, цытатакачныя, кан'югацыйныя i татыстычныя метады даследаванняу.

BbiHÎKi даследавання. 1мунная (апасродкаваная ЛАК клеткам!) елекдыя in vitro пухлшавых клетак IM-9 вядзе да зшжэння ix кланальнай етзрагеннасщ i успрымальнасщ да цытатакачнага дзеяння ЛАК клетак. Для муна-селектаваных клетак л1н11 IM-9 (або субл1н11 IM-9/SL-15) характэрна :авел1чэнне утрымання CDlîa+, CD lie''" i CD18+ клетак, зтжэнне частаты устракальнасф CD21+ i CD58+ клетак, a таксама парушэнне ix кан'гогацыйнай дольнасцт У той жа самы час пам1Ж клеткам! IM-9 i IM-9/SL-15 не знойдзена озшцы па прал1фератыунай актыунасц1, успрымадыисц! да ФНО-а, ;ерфарын/гранз1мам, экспрэсн паверхневых малекул CD95/Fas ды нутрыклеткавага бялку Вс1-2. Лекавая (апасродкаваная этапаздам) селекцыя т vitro пухлшавых клетак IM-9 таксама выклкае ix устойл1васць да ытататачнага дзеяння ЛАК клетак. На этапазщ-селектаваных клетках лши VI-9 (або сублшп IM-9/ER) зшжана экслрзая паверхневых малекул CDlla, 'D18 i CD86, але гэта не суправаджаецца парушэннем ix кан'югацыйнай цольнасщ. Пры гэтым пам1ж клеткам! IM-9 i IM-9/ER не знойдзена розшцы па рал!фератыунай актыунасщ, успрымальнасщ да ФНО-а, перфарьш/rparoiMaM, кспрэсп малекул CD95 щ Вс1-2.

Выкарыстанне вышкау: магчыма выкарыстанне дасягненняу ысертацьн у, разпрацоуцы новых пратаколау \\и\я- ды ¡мунатэрапи жалапчных захворванняу.

Вобласць выкарыстання: 5муналопя, анкалопя.

20

РЕЗЮМЕ

Гринев Василий Викторович

Формирование устойчивости опухолевых клеток линии IM-9 к цитотоксическому действию лифбкин-активированных киллерных клеток

Ключевые слова: ' Опухолевые клетки линии IM-9, ЛАК клетки, этопозид, селекция, устойчивость, межклеточная конъюгация, молекулы адгезии. ' '''

Цель исследования: установить механизм формирования устойчивости опухолевых клеток линии IM-9 к цитотоксическому действию лимфокин-активированных киллерных (ЛАК) клеток в процессе их иммунной или лекарственной селекции in vitro.

Методы исследования: культуральные, фенотипические, цитогенетические, пролиферативные, цитотоксические, конъюгационные и статистические методы исследований.

Результаты исследования. Иммунная (опосредованная ЛАК клетками) селекция in vitro опухолевых клеток IM-9 приводит к снижению их клональной гетерогенности и чувствительности к цитотоксическому действию ЛАК клеток. Для иммуно-селектированных клеток линии IM-9 (названных сублинией IM-9/SL-15) характерно повышение содержания CDlla+, CDllc+ и CD18+ клеток, снижение частоты встречаемости CD21+ и CD58T клеток, а также нарушение их конъюгационной способности. В то же время клетки исходной линии IM-9 и ее сублинии IM-9/SL-15 не различаются между собой пс пролиферативной активности, чувствительности к ФНО-а и перфорин/гранзимам, экспрессии поверхностных молекул CD95/Fa; и внутриклеточного белка Вс1-2. Лекарственная (опосредованная этопозидом^ селекция in vitro опухолевых клеток IM-9 также формирует их устойчивость i цитотоксическому действию ЛАК клеток. На этопозид-селектированньп клетках линии IM-9 (названных-сублинией IM-9/ER) снижена экспрессш поверхностных молекул CD IIa, CD 18 и CD86, но это не сопровождаете) нарушением их конъюгационной способности. Сравнение клеток IM-9 i IM-9/ER между собой не выявило различий в их пролиферативной активности чувствительности к ФНО-а, перфорин/гранзимам, экспрессии молекул CD95 i Bcl-2.

Использование результатов: полученные результаты могут быт: использованы в экспериментальных и клинических исследованиях направленных на разработку новых протоколов химио- и иммунотерапи! онкологических больных.

Область применения: иммунология, онкология.

21

SUMMARY

Vasily Viktorovith Grinev Formation of resistance of tumor cell line IM-9 to cytotoxic activity of lymphokine-activated killer cells

Key words: tumor cell line IM-9, LAK cells, etoposide, selection, resistance, cell-to-cell conjugation, adhesion molecules.

Aim of the study: to define the mechanism of formation the resistance of tumor cell line IM-9 to cytotoxic action of lymphokine-activated killer (LAK) cells as a result of their immune or drug selection in vitro.

Methods: cultural methods, immunophenotyping, karyotypic analysis, cell proliferation assessment, cytotoxicity tests, effector-to-target cell conjugation and statistical analysis were used.

Results. The in vitro immune (LAK cells-mediated) selection of tumor cell line IM-9 resulted in decrease of clonal heterogeneity and susceptibility of target cells to cytotoxic action of LAK cells. Immunoselected IM-9 cells (termed as subline [M-9/SL-15) were characterized by the increased amount of GDI la\ CDllc+ and CD18+ cells and decreased frequency of CD21+ and CD58+ cells. Moreover, 1M-9/SL-15 cells revealed decreased conjugation rate with LAK cells. At the same :ime no significant difference between IM-9 and IM-9/SL-15 cells was found in the level of cell proliferation, sensitivity to TNF-a or perforin/granzyme and expression }f surface CD95/Fas and intracellular Bcl-2 proteins. In vitro drug (etoposide-nediated) selection of tumor cell line IM-9 induced the concomitantly resistance of umor cells to LAK cell killing. The expression of surface molecules CD1 la, CD18 md CD86 in etoposide-selected cell line IM-9 (termed as subline IM-9/ER) was lecreased, but it is not accompanied by decrease in conjugation capacity of tumor ;ells. At the same time the level of cell proliferation, sensitivity to TNF-a or lerforin/granzyme and expression of molecules CD95 and Bcl-2 in IM-9 and M-9/ER cells were similar

Result application: the results may be used in experimental and clinical nvestigation targeted on the development of new protocols of chemo- and mmunotherapy of patients suffering from malignant diseases.

Field of application: immunology, oncology.

Подписано в печать 2.04.2002. Формат 60x84 1/16. Тираж 100 экз. Зак. № 406.

Белорусский государственный университет. Лицензия ЛВ № 315 от 14,07.98. 22050, Минск, пр. Ф. Скорины, 4.

Отпечатано с готового оригинала-макета заказчика в Республиканском унитарном предприятии «Издательский центр Белорусского государственного университета». Лицензия ЛП № 461 от 14.08.2001. 220030, Минск, ул. Красноармейская, 6.