Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Роль Toll-подобных рецепторов и ИЛ-10 в патогенезе экспериментального иерсиниоза

На правах рукописи

9г

Филиппова Наталья Андреевна

РОЛЬ То11-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ И ИЛ-10 В ПАТОГЕНЕЗЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ИЕРСИНИОЗА

14 00 36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□ ози АО .

Москва -2007

003070187

Работа выполнена на кафедре фармакологии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Иван Генрихович Козлов

Юрген Хисеманн

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Марина Александровна Стенина Виктор Фадеевич Семенков

Ведущая организация:

Государственный научный центр Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России

Защита состоится «о^ » чЛ^Ф^Я. 200 Уг в_часов на заседании диссертационного совета Д 208 072 05 при Российском государственном медицинском университете по адресу 117997, Москва, ул Островитянова, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу 117997, Москва, ул. Островитянова, д 1

Автореферат разослан «ЛЧ » ОП^и^Л- 200Хг

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук,

доцент Т Е Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность, цель и задачи исследования

Млекопитающие обладают множеством рецепторов для распознавания микробных агентов и немедленного запуска врожденного иммунного ответа В частности, к ним относятся так называемые toll-like рецепторы (TLRs), которые также известны как паттерн-распознающие (PRRs, pattern recognition receptors) В настоящее время у человека идентифицировано 10, а у мышей 9 TLRs [Ковальчук Л Н , Ганковс-кая Л В , 2005, Chuang Т, 2001, Vasselon Т, 2002] В норме система TLRs участвует в защите организма от непатогенных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, поддерживая иммунный гомеос-таз Характерной чертой ряда патогенных микроорганизмов является способность преодолевать первичную линию защиты, частью которой являются TLRs Во многом ответственным за неспособность врожденной иммунной системы справиться с патогеном является ИЛ-10

Одним из патогенных микроорганизмов, способных к подавлению иммунной защиты хозяина, является Yersinia enterocohtica Среди имму-носупрессивных воздействий этого патогена наибольшую роль отводят

• короткодистантному эффекту - прямое подавление синтеза фактора некроза опухоли-a (ФНО-а) через активацию TLRs, осуществляемое за счет аппарата секреции/транслокации III типа (TTS) и белков наружной мембраны У enterocohtica (Yops - Yersinia outer proteins),

• длиннодистантному эффекту - непрямое подавление синтеза ФНО-а, реализуемое через V-антиген Yersinia (LcrV) Несмотря на достаточное количество исследований, молекулярные

механизмы, лежащие в основе преодоления Y enterocohtica иммунологической защиты организма, остаются не до конца изученными Для ряда других патогенов они и вовсе неизвестны

Поэтому целью данной работы является изучение in vivo и in vitro иммуномодулирующих эффектов основного антигена У enterocohtica -LcrV

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи

1 Определение механизмов иммуносупрессивного действия Y enterocohtica на клетки врожденной иммунной системы и роли LcrV в этом процессе

2 Определение рецептора(ов) врожденного иммунитета, отвечающе-го(их) за взаимодействие с LcrV У enterocohtica

3 Выявление активного региона LcrV, ответственного за взаимодействие с рецептором

4 Выявление роли TLR2 в иерсиниозе и восприимчивости мышей разных линий к У enterocohtica

5 Сравнение значимости TLR2 и TLR4 в развитии инфекционного процесса при заражении животных У enterocohtica

Научная новизна работы

Выявлено, что V-антиген Y enterocohtica (LcrV) оказывает имму-носупрессивный эффект как in vitro, так и т vivo, который выражается в индукции ИЛ-10 и подавлении секреции ФНО-а

Впервые показано, что иммуносупрессивное действие LcrV проявляется при условии одновременной экспрессии на клетках хозяина CD 14 и TLR2 Установлено, что взаимодействие LcrV с рецепторным комплексом CD 14/TLR2 вызывает генерацию внутриклеточного сигнала и активацию NF-kB

Проведен анализ аминокислотной последовательности V-антиге-на Y enterocohtica, и обнаружен участок аа31-49 МН2-конца LcrV, обладающий наиболее выраженной иммуносупрессивной активностью

Впервые получены данные о восприимчивости линейных мышей к иерсиниозу в зависимости от их генотипа Показано, что линейные мыши с отсутствием экспрессии TLR2 являются более устойчивыми к иерсиниозу, чем животные, экспрессирующие этот рецептор Резистентность к инфицированию коррелирует с низкими уровнями продукции ИЛ-10 и высокими ~ ФНО-а, за исключением сублиний мышей СЗН

Обнаружено, что у мышей сублиний СЗН даже при отсутствии экспрессии TLR2 сохраняется повышенная восприимчивость к иерсиниозу, а цитокиновый ответ на rLcrV не изменяется

В результате сравнения инфекционного процесса, вызванного У enterocohtica у линейных мышей, установлено, что экспрессия TLR2 при иерсиниозе имеет более важное значение с точки зрения иммунного ответа организма на вторжение патогена по сравнению с экспрессией TLR4

Практическая значимость полученных результатов

Представленные исследования расширяют имеющиеся представления о механизмах иммуносупрессивного воздействия У enterocohtica на врожденные иммунные реакции человека и животных Кроме того, полученные в работе данные способствуют более глубокому пониманию

функционирования достаточно мало изученных рецепторов TLR2 и их возможной двоякой роли во врожденном иммунном ответе на бактериальные инфекции

Выявленная в исследованиях ведущая роль ИЛ-10 в патогенезе иерсиниоза, а также имеющаяся к настоящему времени технология создания терапевтических моноклональных антител создают предпосылки для разработки новых подходов для лечения этого инфекционного заболевания С другой стороны, обнаруженный активный пептидный фрагмент LcrV, высокоэффективный в подавлении иммунного ответа на У enterocohtica, может послужить основой для создания нового им-муносупрессивного лекарственного препарата

Основные положения, выносимые на защиту:

1 V-антиген У enterocohtica (LcrV) и синтетические пептиды, отражающие часть его последовательности при взаимодействии с ре-цепторным комплексом CD 14/TLR2, обладают иммуносупрессив-ным эффектом как in vitro, так и in vivo, который проявляется в индукции ИЛ-10 и подавлении секреции ФНО-а

2 Линейные мыши с отсутствием экспрессии TLR2 являются более устойчивыми к иерсиниозу, чем животные, экспрессирующие TLR2 Резистентность к инфицированию коррелирует с низкими уровнями продукции ИЛ-10 и высокими - ФНО-а, за исключением сублиний мышей СЗН

3 Экспрессия TLR2 при иерсиниозе имеет более важное значение с точки зрения иммунного ответа организма на вторжение патогена по сравнению с экспрессией TLR4

Апробация работы

Настоящая работа выполнена при финансовой поддержке фонда DFG (Мюнхен, Германия), включена в проект программы Graduiertenkolleg «Механизмы подавления врожденной иммунологической защиты организма У enterocohtica»

Материалы диссертации неоднократно докладывались в Институте гигиены и медицинской микробиологии им М Петтенкофера ( Университет им Л Максимилиана, Мюнхен, Германия) в 2001 -2003 гг, на Съезде молодых ученых, работающих по программе Graduiertenkolleg фонда DFG (Ульм, Германия, 2001 г ) Основные результаты работы были представлены на Съезде Немецкого Общества гигиены и микробиологии, (6-10 октября 2002 г, Гейдельберг, Германия), 11-м Европейском совещании по

бактериальным белковым токсинам (ЕТОХ-11, 28 июня-3 июля 2003 г, Прага, Чехия), 8-й Конференции Международного эндотоксинового общества (15-18 ноября 2004 г, Киото, Япония), Конференции молодых ученых, посвященной памяти Н Н Кеворкова «Иммунитет и аллергия от эксперимента к клинике» (4-7 декабря 2006 г, Пермь, Россия)

Апробация работы проходила на совместном заседании кафедры фармакологии и кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Рос-здрава По результатам выполненных исследований опубликовано 8 печатных работ, в том числе 5 в центральной печати

Внедрение результатов исследования

Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры фармакологии и лекционном курсе кафедры и отдела иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в экспериментальной работе бактериологической лаборатории по исследованию вирулентных свойств У еШегосоЫгса Института гигиены и медицинской микробиологии им М Петтенкофера (Университет им Людвига Максимилиана, Мюнхен, Германия)

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав и заключения Работа содержит 19 рисунков и 2 таблицы В списке использованной литературы - 222 источника

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Часть работы выполнена в Институте гигиены и медицинской микробиологии им М Петтенкофера (Университет им Людвига Максимилиана, Мюнхен, Германия)

Экспериментальные животные. В работе были использованы мыши линий С57ВЬ/6, БУШ, СЗН/НеК и СЗН/Не; Характеристика линий по экспрессии ТГИ, и СО 14 была следующей

• СЗН/НеМ-ТЬК.4 - дикий тип мышей, экспрессирующий ТЫ14,

• СЗН/НеД-ТЫ12/4(+/с1) - мыши, имеющие мутацию в ТП14, но экспрессирующие Т1Л2,

. СЗН/НеЫ-ТЫ12(-/-), (ТЬ112/4(-/+)) - мыши с мутацией в Т1Л2, но экспрессирующие ТЫ14,

• СЗН/Не.}-ТГК2(-/-), (Т1Л2/4(-/с1)) - мыши с мутацией в ТЫ14 и с дополнительным отсутствием экспрессии ТЬ112,

• C57BL/6 - дикий тип,

• C57BL/6-TLR2(-/-) - мыши с мутацией в TLR2,

• C57BL/6-CD 14(-/-) - мыши с мутацией в CD 14,

• SV129 - дикий тип,

• SV129-TLR2(-/-) - мыши с мутацией в TLR2

Животные содержались в специальных апатогенных условиях В экспериментах были использованы самки в возрасте 4-6 недель

Получение перитонеальных макрофагов мышей. Для получения перитонеальных макрофагов были использованы мыши линий C57BL/6, SV129 и СЗН Животным интраперитонеально был введен 1 мл 10 % раствора пептона Через три дня был получен перитонеаль-ный клеточный экссудат Для проведения опытов in vitro клетки поддерживали культивированием в среде RPMI 1640, содержащей 2 тМ L-глютамина, 10 тМ Хепес-буфера, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ЕД/мл пенициллина и 10% инактивированную ЭТС при 37 °С и 5 % содержании С02 в окружающем воздухе

Поддержание клеточных линий Mono Мас-6, J774, НЕК 293. Клетки Mono Мас-6 были любезно предоставлены Dr Н WL Ziegler-Heitbrock, Институт иммунологии, Мюнхен, Германия Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10 % ЭТС, 2 гаМ L-глюта-мина, неэссенциальных аминокислот, 1 шМ пирувата натрия, 9 ug/мл коровьего инсулина, 200 ЕД/мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина Для экспериментов использовали 3-суточные культуры, концентрация клеток составляла 2х 105 клеток/мл

Клон макрофагальных клеток J774 был любезно предоставлен группой К Ruckdeschel, Институт медицинской микробиологии и гигиены им М Петтенкофера, Мюнхен, Германия Макрофаги культивировались в среде RPMI 1640 с добавлением 10 % ЭТС, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина Была использована концентрация 1x10®клеток/мл

Клон клеток НЕК 293 (человеческие эмбриональные почечные клетки) культивировались в среде DMEM с добавлением 10 % инакти-вированной ЭТС Клетки линии НЕК 293 использовались для транс-фекции в концентрации 3x105 клеток/мл

Штамм Yersinia enterocolitica 08WA324. Бактерии культивировались на чашках Петри с агаром или в жидкой среде Luria-Bertani (LB-среда, 10 г триптона, 5 г дрожжей, 5 г NaCl, дистиллированная Н20 до 1 л, рН 7,4-7,6) с добавлением антибиотиков в 15 мл пробирках в инку-баторе-шейкере при 200 об/мин, 27 °С в течение 15 часов

Экспериментальное инфицирование мышей. Мышей инфицировали перорально штаммом Y enterocohtica 08 WA 324 в рабочей концентрации 5х107 CFU Через 5 дней животных забивали, выделяли печень и селезенку Органы помещали в пластиковые пробирки в 1 мл охлажденного раствора Хенкса, содержащего 1 % 3-[(3-холамидопропил)-ди-метил-аммонио]-1-пропансульфонат (CHAPS), затем гомогенизировали Суспензию осаждали центрифугированием Супернатанты были взяты для измерения уровня цитокинов

С целью определения числа бактерий в печени и селезенке органы гомогенизировали в 10 мл ФСБ, делали посевы разведений гомогена-тов на селективную среду для Yersinia и подсчитывали количество выросших колоний после инкубации в течение 40 часов при 27 °С, 5 % С02 Определение уровня цитокинов методом ELISA Уровни мышиного ФНО-а были определены в 96-луночных круглодонных иммуно-плейтах с использованием покровных крысиных-антимышиных антител к ФНО-а (G281-2626) и меченых биотином анги-ФНО-а антител (МР6ХТЗ) Уровень человеческого ФНО-а был измерен при помощи мышиных античеловеческих (mAbl) антител и меченых биотином анти-ФНО-а антител (mAbl 1) (BD PharMingen) Мышиный ИЛ-10 был изучен с помощью коммерческого набора (RLD systems) согласно рекомендациям производителя Измерение выполнялось с помощью DuoSet ELISA Development kit

Трансфекция клона клеток 293 НЕК. Культуру клеток НЕК 293 в концентрации 3x105 клеток/мл разносили в 6-луночный плейт и инкубировали при 37°С, 5% С02 в течение 12 часов Трансфекцию клеток проводили методом кальциево-фосфатной преципитации Клетки ли-зировали и измеряли активность люциферазы с использованием реагентов Promega Corp

Метод иммунофлуоресценции. Данный метод был использован для визуализации связывания LcrV с TLR2 в условиях живой культуры Иммунофлуоресценцию измеряли с помощью конфокального лазерного микроскопа

Выделение плазмиды с помощью Nucleobond АХ 100 Kit (Machery-Nagel). Для выделения высококачественной ДНК в высоких концентрациях (до 100 мкг) был использован Nucleobond АХ 100 Kit Принцип выделения ДНК основан на алкалиновом лизисе клеток, очищении нуклеиновых кислот на основе анионообменной хроматографии Процедура выделения проводилась согласно инструкциям производителя

С целью очистки ДНК от контамииирующих протеинов была применена экстракция фенолом Для очищения препарата ДНК от контаминации солями или концентрирования препарата ДНК был использован метод осаждения этанолом Концентрацию и чистоту ДНК определяли на основе метода спектрофотометрии Полученную ДНК ампли-фицировали с помощью ПЦР ПЦР-продукт анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле

Статистическая обработка результатов. При постановке всех экспериментов параллельно с опытными вели контрольные пробы Это позволило учитывать только те изменения, которые возникали в культуре клеток под влиянием специфических воздействий, а не являлись результатом естественных колебаний характеристик Для статистического анализа результатов использовалась программа «Microstat» (Ecosoft Inc )

Все результаты выражали как значения среднего ± стандартное отклонение Полученные в ходе экспериментов данные распределялись по нормальному закону, поэтому для оценки достоверности различий применяли критерий Стьюдента, вычисляя коэффициент достоверности Различие средних показателей считалось достоверным, если величина коэффициента достоверности соответствовала уровню значимости Р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ

Иммуномодулирующий эффект rLcrV на клетки хозяина вследствие экспрессии CD14. ЛПС бактерий активируют комплекс CD14/TLR.S в клетке хозяина [Ulevitch R J , 1999] Нами была поставлена задача установить, взаимодействует ли V-антиген Y entero-cohtica с CD 14 на клетках хозяина и связано ли это взаимодействие с индукцией синтеза ИЛ-10 Для реализации поставленной задачи были получены перитонеальные макрофаги мышей линии C57BL/6 с отсутствием экспрессии CD 14 (CD 14( / )) и мышей дикого типа, экс-прессирующих данный маркер (CD14(+/+)) Макрофаги разносили в планшет и стимулировали рекомбинантным LcrV (rLcrV) в концентрации 5 мкг/мл После окончания 2-часового культивирования су-пернатанты собирали и оценивали в них уровень ИЛ-10 с помощью ELISA

Как показали полученные результаты ннтактные макрофаги мышей дикого типа и животных, негативных по экспрессии CD 14 (CD14(-/-)

макрофаги), практически не синтезировали ИЛ-10 При стимуляции rLcrV макрофаги мышей дикого типа скачкообразно усиливали продукцию цитокина Концентрация ИЛ-10 в супернатантах этих клеток при стимуляции возрастала почти в 10 раз Напротив, CD14(-/-) макрофаги на присутствие в среде rLcrV не реагировали и уровень продукции ИЛ-10 практически не отличался от нестимулированного контроля На основании этих данных можно сделать предположение об участии CD 14 в rLcrV-индуцированной экспрессии ИЛ-10

Подтверждением высказанного выше предположения явились результаты, полученные в экспериментах с клеточной линией Мопо-Мас-6 и оценкой продукции ФНО-а Клетки разносили в планшет и культивировали 13 часов За 1 час до конца культивирования в опытные лунки добавляли блокирующие связывание ЛПС с CD 14 анти-С014 мАт (ЬЮ-10 или МЕМ-18) в концентрации 10 мкг/мл В качестве контроля использовали культуры без добавления антител или с добавлением неблокирующих видоспецифических анти-С014 мАт (bIG 4 и МЕМ-15) в той же концентрации, что в опытных культурах Через 13 часов в культуры добавляли 5 мкг/мл rLcrV или 1 нг/мл липополисахаридов на 6 часов Затем проводили стимуляцию макрофагов 1 мг/мл зимозана А и через 12 часов в супернатантах определяли уровень секреции ФНО-а методом ELISA

1600

1400

1" 1200

| юоо

"5" 800

6 600 X

в 400 200

стимул _ rLcrV ЛПС

нет нет

антитела - ьюю МЕМ18 ью4 мем15 - ьюю menus -зимозан А+ + + + ++ + + +

Рис 1 Продукция ФНО-а культурой клеток Mono Мас-6 при их стимуляции зимозаном А в присутствии rLcrV или ЛПС в комбинации с блокирующими (bIG 10 и МЕМ-18) или неблокирующими анти-С014 (bIG4 и МЕМ18) мАт

Как видно из данных, представленных на рис 1, в контрольных культурах без добавления каких-либо стимуляторов продукция ФНО-а практически отсутствовала Стимуляция клеток линии Мопо-Мас-6 зимозаном вызывала многократное увеличение секреции цитокина В свою очередь, как гЬсгУ, так и ЛПС значительно угнетали стимулированную зимозаном продукцию ФНО-а макрофагами Мопо-Мас-6 Угнетающее действие обоих агентов отменялось при добавлении в культуры блокирующих анти-С014 мАт (ЬЮ-10 или МЕМ-18) и не изменялось в присутствии неблокирующих видоспецифичных мАт (для ЛПС данные не показаны)

Взаимодействие ЬсгУ с комплексом С014/ТЬЫ2. Активация ТЬИ млекопитающих микробными продуктами запускает внутриклеточные сигнальные пути в клетке хозяина, в результате чего происходит транскрипция генов, регулирующих развитие врожденного и приобретенного иммунного ответа [Ас1егет А , 2000, А1«га 5 ,2001] Целью этого фрагмента исследований явилось определение ТЫ1, который связывается с ЬсгУ У еШегосоЫгса, и вследствие активации которого ЬсгУ оказывает иммуномодулирующий эффект на клетки хозяина РЬАв-ме-ченые плазмиды (ТЫ11, ТЫ12 и ТЬЯ4/МБ2) и ЕЕАМ-1 -люциферазу трансфецировали в клетки линии НЕК 293 Предварительно для нормализации эффективности трансфекции клетки были трансфецирова-ны плазмидой, кодирующей КБУ-р-галактозидазу Ряд культур с транс-фецированными ТЫ1 были дополнительно котрансфецированы плазмидой, кодирующей СЭ14 Трансфекты в опытных культурах стимулировали в течение 6 часов гЬсгУ с или без полимиксина В В качестве контроля использовали нестимулированные клетки или клетки, обработанные инактивированным высокой температурой гЬсгУ Затем клетки лизировали и измеряли активность люциферазы с помощью хеми-люминометра

Из результатов, представленных на рис 2 видно, что среди котран-сфецированных клеток повышение активности люциферазы в ответ на гЬсгУ было отмечено только для одной комбинации рецепторов, а именно для СВ14/ТЫ12 Добавление в экспериментальную систему полимиксина В (рВ), который, как известно, является потенциальным ингибитором липополисахаридов, не влияло на активацию комплекса СБ 14/ТЫ12 У-антигеном Кроме того, термическая инактивация гЬсгУ полностью отменяла активацию люциферазы в СГЗ 14/ТЬК2-позитив-ных клетках (рис 3)

С014 Т|_Я1 ТЬЯ2 Т|_К4 ТЬт Т1_Р2 Т[_Р4 векторная +МР2 +М02 плазмида

Рис 2 Активность люциферазы в культуре клеток НЕК 293 при трансфекции в них плазмид, кодирующих М02, СБ 14 и ТТИз Белые столбцы - стимуляция гЬсгУ, черные - нестимулированные

клетки

+рВ термическая инактивация

Рис 3 Активность люциферазы в культуре клеток НЕК 293, котран-сфецированных С014/ТЬ112 при их стимуляции гЬсгУ (в присутствии и в отсутствии рВ), гРсгУ и синтетическими пептидами (У7-9-5), повторяющими аминокислотную последовательность региона

ЫН^-конца 1хгУ

Таким образом, распознавание ЬсгУ У еМегосоЫгса клетками хозяина осуществляется именно через ТЫ12 Необходимым условием распознавания и активации внутриклеточных сигнальных путей является коэкспрессия ТЫ12 с СЭ14

Активация комплекса CD14/TLR2 синтетическими пептидами, полученными из LcrV. На основании результатов исследований в нашей лаборатории было установлено, что активный регион LcrV, ответственный за активацию CD 14/TLR2 и индукцию ИЛ- 10-зависимого подавления выработки ФНО-а в клетке хозяина, в аминокислотной последовательности LcrV располагается где-то между аа31-70 Нами сделана попытка уточнить локализацию региона LcrV, ответственного за активацию комплекса CD 14/TLR2 При анализе аминокислотной последовательности гомолога LcrV Pseudomonas auruginosa - PcrV, было установлено, что регион aal -39 является неактивным в отношении активации CD 14/TLR2 Мы предположили, что данный регион является неактивным и у LcrV В связи с этим, были синтезированы 3 синтетических полипептида, соответствующие следующим локусам LcrV V5 (аа27-43), V7 (аа31-49), V9 (аа39-57) Данные пептиды были добавлены в концентрации 10 мкг/мл в культуры трансфецированных CD14/TLR2 клеток НЕК 293 и их эффект на активацию люциферазы сравнивали с эффектами LcrV и PcrV (оба агента добавляли в концентрации 5 мкг/мл) В контрольные культуры добавляли полимиксин В или инактивированный LcrV

Из полученных результатов видно (рис 3), что при стимуляции клеток синтетическим полипептидом V7 активность люциферазы достигала того же уровня, как и при стимуляции rLcrV, в то время как пептид V5 и rPcrV не вызывали ответа клеток Менее выраженная активность люциферазы наблюдалась при стимуляции клеток НЕК 293 пептидом V9 Таким образом, было показано, что синтетический пептид V7, повторяющий аминокислотную последовательность региона ааЗ 1 -49 NH2-конца LcrV, является той самой структурой, которая обеспечивает активацию комплекса CD14/TLR2

Опосредованное через TLR2 влияние LcrV на продукцию ИЛ-10. Взаимосвязь экспрессии TLR2 с восприимчивостью мышей к иерси-ниозу. Для подтверждения того, что распознавание LcrV Y enterocolitica TLR2 приводит к ранее наблюдаемой индукции ИЛ-10 в клетке хозяина, были получены периюнеальные макрофаги от мышей гибридов SV129 х B57BL/6 (далее SV129) и линии C57BL/6, как экспрессирующих (TLR2(+/+>), так и неэкспрессирующих (TLR2(-/-)) TLR2 Как было обнаружено, макрофаги обеих линий мышей, нокаутированных по генам TLR2, в отличие от клеток животных дикого типа не обладали способностью отвечать на стимуляцию rLcrV усилением продукции ИЛ-10 (рис 4) Таким образом, иммуносупрессорный эффект LcrV опосредуется именно через TLR2 и проявляется как индукция экспрессии противовоспалительного цитокина ИЛ-10

В одной из предыдущих работ нашей лаборатории было продемонстрировано, что мыши с отсутствием экспрессии ИЛ-10 (ИЛ-10(-/-)) имеют высокую резистентность к иерсиниозу [Sing А, 2002] На основании этого было сделано предположение, что и животные с дефектом в экспрессии TLR2 также будут менее восприимчивы к инфицированию Y enterocohtica Для подтверждения этого предположения была спланирована серия экспериментов, в которой сравнивали иерсиниозную колонизацию печени и селезенки у мышей-нокаутов по TLR2 и животных тех же линий, но дикого типа, после перорального инфицирования 5xl07CFU Y enterocohtica 08 (штамм WA-314)

C57/BL6

350 300 250 200 150 100 50 0

TLR 2 -/- TLR 2 +/+

т

т

■

Рис 4 ЬсгУ-индуцированная продукция ИЛ-10 перитонеальными макрофагами Т1Л2(-/-) и ТЬЯ2(+/+) мышей линии С57ВЬ/6 при их стимуляции гЬсгУ Белые столбцы - стимуляция гЬсгУ, черные -интактные клетки, Р < 0,001

ЭУ129 ___

селезенка

Рис 5 Число бактерий в селезенке и печени Т1Л2(-/-) и ТХК2(+/+) мышей линии 8У129 при их пероральном инфицировании У епСегосокиса Черные столбцы - количество бактерий в органах Т1Л2(-/-) мышей, белые - число иерсиний в органах ТЦ12-позитивных животных

Было показано, что количество бактерий в селезенке и печени TLR2-негативных мышей линий SV129 и C57BL/6 были примерно на 2 порядка ниже, чем в органах TLR2(+/+) мышей тех же линий (рис 5) Таким образом, было установлено, что мыши линий SV129 и C57BL/6 с отсутствием экспрессии TLR2 являются более устойчивыми к иерсиниозу, чем мыши данных линий, экспрессирующих этот тип PRR Данные представляют результаты, по крайней мере, 2-х независимых экспериментов, где использовались группы по 5-10 мышей (Р < 0,05)

Взаимодействие TLR2 с LcrV. Для исключения возможных неучтенных в предыдущих разделах факторов необходимо было напрямую визуализовать связывание LcrV с TLR2 в условиях живой культуры В связи с этим был отработан комплекс методов с использованием латек-сных микросфер Латексные частицы, представляющие собой сульфатные микросферы 4 мкм в диаметре, были покрыты путем нековалентного взаимодействия рекомбинантными LcrV и PcrV Молекулярная масса rLcrV была подтверждена при помощи MALDI-MS (matrix-assisted laser desorption-ionization mass spectrometry analysis) (Toplab) Препарат rLcrV не содержал липополисахариды, что было установлено с помощью limulus amebocyte assay (Pyroquant) Оставшиеся сайты неспецифического связывания забивали альбумином Частицы отмывали, эффективность взаимодействия была протестирована с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания микросфер сначала специфическими анти-rLcrV или анти-rPcrV антителами, а затем вторичными FITC-меченными козьими антикроличьими антителами Покрытые rLcrV и rPcrV микросферы осаждали центрифугированием на перитонеальные макрофаги мышей C57BL/6, инкубировали 30 минут при температуре 37 °С, фиксировали формальдегидом и лизировали тритоном Для окрашивания в качестве первичных антител были использованы поликлональные кроличьи антимышиные TLR2-aHTm^a или поликлональные кроличьи анти-FLAG антитела Alexa 586- или 350-меченные козьи антикроличьи или ослиные антикозьи антитела были использованы в качестве вторичных Флуоресценцию оценивали под конфокальным лазерным микроскопом

Как видно из результатов, представленных на рисунке б, часть ла-тексных микросфер локализовалась вблизи мембраны макрофагов При этом rLcrV-покрытые микросферы были окружены специфической флуоресценцией, в то время как концентрирования окраски вокруг rPcrV-частиц не отмечалось Таким образом, удалось подтвердить целый ряд вышеприведенных данных и провести непосредственную визуальную оценку rLcrV-TLR2 взаимодействия

тьнг ^

■Я. V ■■ : :

1 ■ ■ ауШъ»

- - 1 ... ¿¿«г

-х' . - ...г ^»'¿ТЙР

♦ ;

л- 1 . - ., " ; •••■■ • 8

- "

+/+ 1_сгУ

Рйе. 6. Иммунофлуоресцентное о кр аш и ванн еТ Ь ЕЙ при добавлении к пери тон сальным макрофагам микросфер покрытых 1хгУ (верхняя часть рисунка или РсгУ (нижняя часть рисунка)

Индукция гЬсгУ выработки ИЛ-10 при экспрессии ТЫ12 тьюо.

Чтобы проанализировать, стимулирует ли т гаю гЬа V продукцию ИЛ-10 через взаимодействие с ТЬК2, были использованы мыши линии С57ВЬ/6 с отсутствием экспрессии Т[.Я2 и мыши этой же линии, экс пресс и ру ющи е данный рецептор. Животкйм делали однократную в ну тр ибр юцш н ну ю инъекцию 100 мкг гЬсгУ.

В одной из публикаций упоминалось, что наибольшая продукция ИЛ 10 наблюдалась через 90 минут после введения мышам фузион протеина, состоящего из V-антиген а и полигистидииа (V* Ь) | Ыакарта К., 1995). В связи с этим в этом фрагменте работы использовался тот же срок. Через 1,5 часа после введения г1хгУ мыши были забиты, печень и селезенка выделены, гомогенизирован !>[ и супернлтан гы были взяты для измерения уровня ИЛ-10 с помощью

Анализ уровня ЙЛ-10в пробах показал некоторое снижение уровня цитокина в селезенках мышей линии С57 ВЬ/б с отсутствием ;жсп-

рессии TLR2 по сравнению с продукцией цитокина в селезенках мышей той же линии, экспрессирующих TLR2 Аналогичное, но незначительное различие в уровнях ИЛ-10 было обнаружено в печени TLR2-HOKay-тов и животных дикого типа

Таким образом, rLcrV активирует TLR2, в результате чего возникает индукция ИЛ-10 in vivo

Влияние активации TLR2 на продукцию ИЛ-10 и ФНО-а у мышей линии C57BL/6 при инфицировании Y. enterocolitica. На данном этапе исследования были использованы мыши линии C57BL/6 с отсутствием экспрессии и экспрессирующие TLR2 Животных инфицировали перорально Y enterocolitica, через 5 дней забивали и оценивали уровни ИЛ-10 и ФНО-а в супернатантах гомогенатов печени и селезенки

Как и ожидалось, после инфицирования уровень ИЛ-10 в селезенке и печени мышей, экспрессирующих TLR2, был значительно выше, чем у TLR2 -/- животных Напротив, продукция ФНО-а в селезенке зараженных мышей с отсутствием экспрессии TLR2 была значительно более высокой по сравнению с диким типом животных (рис 7, 8) Аналогичные, но менее выраженные различия в продукции цитокинов наблюдались в печени инфицированных мышей

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что при инфицировании мышей линии C57BL/6 Y enterocolitica происходит активация TLR2, вследствие чего возникает индукция экспрессии ИЛ-10 в клетках хозяина, который, в свою очередь, подавляет продукцию ФНО-а

Роль TLR2 и TLR4 в иерсиниозе. Для выявления роли TLR2 и TLR4, как ЛПС-распознающих рецепторов, во врожденной иммунной защите организма при иерсиниозе в исследовании были использованы следующие линии мышей C3H/HeN - TLR4-дикий тип мышей, экспрес-сирующий TLR4 и TLR2 (TLR2/4(+/+)). C3H/HeJ - (TLR2/4(+/d)) мыши, имеющие мутацию в TLR4, но экспрессирующие TLR2 На основе данных линий были созданы следующие мутантные линии мышей C3H/HeN-TLR2(-/~) (TLR2/4(-/+)) - мыши с мутацией в TLR2, но экспрессирующие TLR4, C3H/HeJ-TLR2(-/-) (TLR2/4(-/d)) - мыши с мутацией в TLR4 и с дополнительным отсутствием экспрессии TLR2 Инфицирование мышей и подготовку супернатантов проводили по аналогичной с предыдущим разделом результатов методике Супернатанты в различных разведениях высевали на селективную среду для Yersinia, инкубировали в течение 40 ч при 27 °С, 5 % С02 и подсчитывали количество выросших колоний

Рис 7и8 ПродукцияИЛ-10иФНО-априпероральноминфицировании мышей линии С57ВЬ/6 У еМегосокиса Черные столбцы - уровень цитокинов в селезенке ТЫ12(-/-) мышей, белые - уровень ци-токинов в селезенке мышей дикого типа Для рис 7- Р<0,01,длярис 8 - Р<0,05 Данные представляют средние значения, полученные в независимых экспериментах, в которых использовались группы из

4-х мышей

Из результатов, представленных на рис 9, видно, что в органах мышей линии СЗН с отсутствием экспрессии ТЬЯ4 выявлено большее количество колоний У еМегосокиса, чем в печени и селезенке животных линии СЗН, экспрессирующих ТЫ14 Таким образом, мыши генотипа СЗН, не экспрессирующие ТЫ14 являются более восприимчивыми к иерсиниозу, чем мыши с экспрессией данного рецептора

Неожиданные результаты были получены при сравнении негативных и позитивных по экспрессии ТЫ12 мышей линий СЗН В отличие от наших прежних результатов, полученных в экспериментах с мышами С57ВЬ/6, мыши линии СЗН, не экспрессирующие ТЫ12 (СЗН/НеЫ ТЫ12(-/-). CЗH/HeJ ТЬ112(-/-)), оказались более восприимчивыми к пероральному инфицированию У еШегосоЫгса, чем животные дикого типа той же линии Более того, активация ТЫ12 в клетках хозяина представляется более важной с точки зрения иммунного ответа организма

на внедрение У. емегисоГтса ко сравнению с активацией ТЫМ, т.к. в селезенке и печени мышей С311/Ис| с отсутствием экспрессии ТЬЯ4 было обнаружено меньшее количество бактерий, чем у СЗ Н/НеИ мышей с мутацией в "ТХК.2. Соответственно, у мышей, не экспрессирующих ТЫ<4 и с дополнительным отсутствием экспрессии Т1.К2 (СЗН/Не| ТЬК2( /■); Т1,К2/4(-/с1)), наблюдалось большее количество бактерий в селезенке и печени, чем у мышей, имеющих мутацию только и ТЬКЛ (СЗН/Не|| Т1.К2/4(+/1Ш> тогда как дополнительное присутствие или отсутствие ТЬК4 у мышей с дефектом ТЬК2 не Имело значительного влияния на количество иерсиний (риг. 9).

10s 1

10'- ю'- ш * ю'- ю5-ю4' рХ I i г*.

селезенка печень

Рис, У. Число бактерий в селезенке и печени мышей линии СЗН при их перо рал ьном инфицировании К enterocolitica. Обозначения: СЗП/ HeN (TLR2/4(+/+>, черные столбцы), C3H/HeJ (TLR2/4(+/d), белые столбцы), C3H/HeN-TLR2(-/-) (TLR2/4(-/+)> серые столбцы) и C3H/HeJ-TLR2( / ) (TLR2/4(-/tt). заштрихованные;столбцы). Данные представляет средние значения 7 различных экспериментов, в которых использовались группы из 5 мышей

Зависимость продукции ИЛ-10 от активации TLR2 рекомбинан-тным LcrV в перитонеальных макрофагах мышей линии СЗН. В связи с тем, что нами были выявлены линейные различия относительно роли TLE2 ири иерсипщзной инфекции между мышами C57BL/6 и СЗН, следующей задачей данной работы являлось определение взаимосвязи между активацией TLR2 и индукцией экспрессии ИЛ-10 в клетках мышей линии СЗП. Для решения поставленной задачи перитоне-альные макрофаги мышей СЗН (C3H/HeN, СЗП/lIeJ) стимулировали in vitro рекомбинантным LcrV и оценивали уровень ИЛ-10.

Как и в полученных нами ранее результатах, в экспериментах с пери-тонеальными макрофагами от мышей генотипов SV129 и С57 В L/6 продукция ИЛ-10 была резко снижена в rLci У-стимулированпых макрофагах мышей C3II/IIeN TLR2( / ) (рис. 10) и СЗН/IIcJ TLR2( /-).

Т1_Я 2 -/- ПК 2 +/+

Рис 10 ЬсгУ-стимулированная продукция ИЛ-10 перитонеальны-ми макрофагами мышей линии СЗН, экспрессирующими и не эксп-рессирующими ТЫ12 Белые столбцы - уровень ИЛ-10 при стимуляции перитонеальных макрофагов гЬсгУ, черные - продукция ци-токина интактными клетками Данные представлены средними значениями, полученными в 3-х различных экспериментах (Р< 0,05)

Таким образом, из приведенных данных следует, что наблюдаемые различия в исходе кишечного иерсиниоза у мышей генотипов С57ВЬ/б и СЗН не вызваны различным влиянием активации ТЫ12 на индукцию ИЛ-10 у мышей этих линий

Зависимость продукции ИЛ-10 от активации ТЫ12 у мышей генотипа СЗН, перорально инфицированных У. епЬегосоНИса. Далее была проанализирована продукция ИЛ-10 в селезенке мышей генотипов СЗН/НеК (Т1Л2/4(+/+)) и СЗН/Не; (ТЬ112/4(+/с1)), экспресси-рующих ТЫ12, и мышей той же линии с отсутствием экспрессии ТЫ12 (СЗН/НеИ ТЫ12(-/-) - ТЫ12/4( /+)), СЗНД^ Т1Л2(-/-) - ТЫ12/ 4(-/с1)) Мышей инфицировали и измеряли уровень ИЛ-10 в суперна-тантах гомогенатов органов, как описано выше

В результате исследования наблюдали более низкую продукцию ИЛ-10 в селезенке мышей СЗН/НеИ и СЗН/НеХ не экспрессирующих ТЫ12, по сравнению с уровнем цитокина в селезенке мышей указанных линий, экспрессирующих Т1Л2, что соответствовало данным полученным в экспериментах с мышами линии С57ВЬ/б

Таким образом, весь комплекс экспериментальных данных позволяет сделать заключение, что бактериальный, нелипидированный вирулентный рекомбинантный протеин ЬсгУ (гЬсгУ) и синтетические пептиды, отражающие часть его последовательности, вызывают индукцию экспрес-

сии ИЛ-10 вследствие активации в клетке рецепторного комплекса CD 14/ TLR2 В результате индукции ИЛ-10 происходит подавление выработки ФНО-а Вероятно, данный процесс, происходящий в клетке хозяина при воздействии на нее V-антигена, является механизмом, с помощью которого Y enterocohtica удается уклоняться от врожденного иммунного ответа

ВЫВОДЫ

1 V-антиген Y enterocohtica (LcrV) обладает иммуносупрессивным эффектом как in vitro (макрофаги мыши и человека), так и in vivo, который проявляется в индукции ИЛ-10 и подавлении секреции ФНО-а

2 Необходимым условием иммуносупрессивного действия LcrV является одновременная экспрессия на клетках CD 14 и TLR2 Взаимодействие LcrV с рецепторным комплексом CD14/TLR2 приводит к генерации внутриклеточного сигнала и активации NF-kB

3 Синтетический пептид, соответствующий участку ааЗ 1-49 последовательности NHj-конца LcrV, обладает наиболее выраженной иммуносупрессивной активностью

4 Линейные мыши с отсутствием экспрессии TLR2 являются более устойчивыми к иерсиниозу, чем животные, экспрессирующие TLR2 Резистентность к инфицированию коррелирует с низкими уровнями продукции ИЛ-10 и высокими - ФНО-а, за исключением сублиний мышей СЗН

5 Отсутствие экспрессии TLR2 у мышей сублиний СЗН сопровождается повышением восприимчивости к иерсиниозу при таком же цитокиновом ответе на rLcrV, как и у других линейных мышей

6 У мышей СЗН экспрессия TLR2 при иерсиниозе имеет более важное значение с точки зрения иммунного ответа организма на вторжение патогена по сравнению с экспрессией TLR4

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Sing А , Tvardovskaia N. (Filippova N ), Rost D , Kirschning С J , Wagner H , Heesemann J Contribution of toll-like receptors 2 and 4 in an oral Y enterocohtica mouse infection model // Int J Med Microbiol - 2003 -V 293 - P 341-8

2 Sing A, Rost D , Tvardovskaia N. (Filippova N ), Roggenkamp A, Geiger A M , Kirschning С J , Wiedemann A , Aepfelbacher M , Heesemann J Mechanisms of Yersinia enterocohtica evasion of the host innate immune response by V-Antigen//Adv Exp Med Biol -2003 V 529 - P165-7

3 Sing A , Rost D , Tvardovskaia N. (Filippova N ), Roggenkamp A , Kirschmng С J , Wiedemann A , Aepfelbacher M , Heesemann J Yersinia V-antigen exploits toll-like receptor 2 and CD 14 for interleukin 10-mediated immuno-suppression //J Exp Med -2002 -V 196 -P1017-24

4 Reithmeier-Rost D , Bierschenk S , Filippova N., Schroeder-Braunstein J , Sing A Yersinia V-antigen induces both homo- and heteiotolerance in an IL-10-involving manner//Cell Immunol -2005 - V 231 -P 63-64

5 Sing A, Rost D, Tvardovskaia N. (Filippova N ), Roggenkamp A, Geiger A M , Kirschmng С J , Wiedemann A , Aepfelbacher M , Heesemann J Mechanisms of Yersinia enterocolitica evasion of the host innate immune response by V-Antigen // 54 Tagung der Deutschen Geselschaft fuer Hygiene und Mikrobiologie, Heidelberg, Germany, Oct 6-Oct 10 2002 - P 52-53

6. Sing A, Rost D, Tvardovskaia N. (Filippova N ), Roggenkamp A, Geiger A M, Wiedemann A, Aepfelbacher M , Heesemann J Mechanisms of Yersinia enterocolitica evasion of the host innate immune response by V-Antigen //11th European Workshop on Bacterial Protein Toxins (ETOX-11), Celakovice/ Prague, Czech Republic, Jun28-Jul 3,2003 -P 131-132

7 Reithmeier-Rost D, Bierschenk S, Filippova N., Schroeder-BraunstemJ , Sing A Yersinia V-Antigen induces both TLR homo- and heterotolerance in an IL-10-involving manner // 8th Conference of The International Endotoxin Society, Kyoto japan, Nov 15-18,2004 - P 33

8 Филиппова H. A., Sing A , Heesemann J , Козлов И Г РольТо11-ре-цепторов и ИЛ-10 в патогенезе экспериментального иерсиниоза на мышиной модели // Вестник Уральской медицинской академической науки - 2006 - № 3 (1) - С 256-258

Список сокращений

ИЛ - интерлейкин

КОЕ (CFU) - колониеобразующие единицы

ЛПС - липополисахариды

мАт - моноклональные антитела

ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

PRR - паттерн-распознающий рецептор

rLcrV - рекомбинантный LcrV

TLR - toll-подобный рецептор

TTS - система секреции/транслокации протеинов III типа Yops - белки наружной мембраны иерсиний

Подписано в печать 26 04 2007. Уч-издл 1,0 Гарнитура Ре1егзЬи^СТТ Тираж 100 Заказ 12 Редакционно-издательский центр Тверской государственной медицинской академии 170642, Тверь, Советская, 4 Тиражирование методом ризографирования в РИЦ ТГМА