Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Роль Т-регуляторных клеток при хронической обструктивной болезни легких

а правах рукописи 48480Ьи

КИРИЛЛОВА Наталья Алексацаровна

РОЛЬ Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ КЛЕТОК ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ

14.01.04 - внутренние болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 6 МАЙ 2011

Томск-2011

4848060

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Черногорюк Георгий Эдинович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Букреева Екатерина Борисовна

доктор медицинских наук, профессор, Черняк Борис Анатольевич заслуженный врач РФ

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «1-?» Ц^ИФ 2011 г. в ¿2 00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.02 при ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России по адресу: 634050, г. Томск, Московский тр., 2

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан « » # 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного советаТюкалова Л.И.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) - является одной из важнейших проблем здравоохранения. В России, по официальным данным Минздравсоцразвития, зарегистрировано более 2 миллионов больных ХОБЛ, в то же время, по данным эпидемиологических исследований, это число может превышать 11 миллионов человек [Клинические рекомендации, пульмонология, 2006]. Неутешительный факт - тенденция к росту заболеваемости и смертности от ХОБЛ. Так по прогнозам проведенного C.J. Murray et al. (2006) «Исследования глобального ущерба от заболеваний» ХОБЛ к 2020 г. выйдет на третье место среди причин смерти, в то время как в 1990 г. находилась на шестом [Murray C.J., 1997; López A.D., 2006].

В настоящее время особый интерес представляет наличие гетерогенных фенотипов ХОБЛ, различающихся по симптомам респираторного заболевания и состоянию здоровья, частоте и типу обострений, функции легких, структурным изменениям, местному и системному воспалению, ответу на терапию, а также системным проявлениям [Boschetto Р., 2003; Аверьянов А. В., 2009; Garcia-Aymerich J., 2009]. Еще в XIX веке А.С. Dornhorst, В. Burrovs, W. Jenner и С.П. Боткин предложили выделять три основных фенотипа болезни: эмфизематозный, бронхитический и смешанный [Dornhorst А.С., 1955; Авдеев С.Н., 2010]. Различные проявления болезни - фенотипы, вызванные одним повреждающим фактором (сигаретный дым), свидетельствуют о наличии отличных биомолекулярных и клеточных путей в патогенезе ХОБЛ. В литературе активно обсуждаются причины поддержания персистирующего воспаления при ХОБЛ [Lacoste J.Y., 1993; Keating V.M., 1996; Keatings V.M., 1996; Retamales I., 2001; Шмелев Е.И., 2003; Barnes, Р. J., 2003; Barnes, P.J., 2004], зачастую не принимается во внимание клиническая и патогенетическая гетерогенность болезни.

В последнее время все большее внимание уделяется изучению регуляторной субпопуляции Т-клеток, идентифицированной как Т-регуляторные клетки (T-reg), которые способны оказывать супрессорное влияние на различные типы иммунокомпетентных клеток - эффекторные Т-клетки, дендритные клетки, мононуклеары, нейтрофилы [Sakaguchi S., 2005; Kohm А.Р., 2006]. Основными маркерами T-reg является CD25 и FoxP3. Ряд авторов изучали содержание и функциональную активность T-reg в периферической крови и жидкости бронхоальвеолярного лаважа у пациентов с ХОБЛ, курящих без бронхиальной обструкции и здоровых некурящих [Barceló В., 2008; Isajevs S., 2009; Roos-Engstrand Е., 2009]. Однако в настоящее время отсутствуют данные об иммунологических особенностях, лежащих в основе клинической гетерогенности ХОБЛ.

Таким образом, можно говорить о наличии отличающихся друг от друга фенотипов ХОБЛ, характеризующихся разными клиническими, функциональными, морфологическими проявлениями, локализацией воспаления. В то же время недостаточно фундаментальных данных, демонстрирующих особенности иммунного ответа при отдельных клинических f

фенотипах данной болезни. Представляет интерес предопределение направлением иммунного ответа течения ХОБЛ, скорости прогрессирования данного заболевания, частоты обострений и ответа на базисную терапию. Значительный научный и практический интерес представляет изучение фенотипических особенностей больных ХОБЛ с позиции регуляции иммунного ответа и разработка патогенетически обоснованных фармакологических режимов представляет.

Цель: Установить роль субпопуляций Т-регуляторных клеток в формировании и поддержании воспаления при хронической обструктивной болезни легких для разработки оптимальной стратегии лечения.

Задачи:

1. Определить уровень отдельных субпопуляций Т-регуляторных клеток периферической крови методом проточной цитофлюориметрии с использованием панели моноклональных антител СВ4+/СБ25+/РохРЗ+ у больных ХОБЛ, в группах сравнения (бронхиальная астма) и контроля.

2. Определить ассоциацию уровней отдельных субпопуляций Т-регуляторных клеток с клинико-функциональными параметрами и фенотипами ХОБЛ. Установить зависимость уровня Т-регуляторных клеток от возраста, тендерной принадлежности, стажа и стадии болезни.

3. Оценить динамику течения ХОБЛ на фоне базисной терапии и сопоставить полученные клинические данные с уровнем отдельных субпопуляций Т-регуляторных клеток.

4. Систематизировать роль Т-регуляторных клеток в регуляции воспаления у больных хронической обструктивной болезнью легких для оптимизации подходов к базисной терапии.

Научная новизна. Впервые показано, что изменение содержания Т-регуляторных клеток при ХОБЛ и бронхиальной астме в крови имеет разнонаправленный характер. Продемонстрировано, что содержание Т-регуляторных клеток при ХОБЛ выше, чем в группе контроля, а при бронхиальной астме - ниже контрольных значений.

Впервые показано, что клинический ответ на бронхолитическую и противовоспалительную терапию при различных фенотипах ХОБЛ связан с различным содержанием иммуносупрессивных лимфоцитов крови.

Впервые показана возможность стратификации больных ХОБЛ по уровню субпопуляций Т-регуляторных клеток для прогнозирования течения болезни и ответа на базисную терапию.

Впервые установлена связь исходно высокого уровня С025+РохРЗ+ клеток в периферической крови у больных ХОБЛ с неблагоприятным течением болезни на фоне базисного лечения (частые обострения, требующие назначения антибактериальной терапии). Выявлена ассоциация низкого содержания СБ4+РохРЗ+ клеток при ХОБЛ с уменьшением клинических проявлений

болезни (частоты симптомов, интенсивности одышки, индекса BODE, оценки «влияния» по вопроснику госпиталя Святого Георгия) в результате лечения.

Впервые продемонстрировано, что исходно высокое относительное содержание CD4+FoxP3+ субпопуляции Т-клеток (>7% гейтированных мононуклеаров периферической крови) ассоциировано с худшим ответом на базисную терапию.

Практическая значимость. Результаты исследования позволяют рассматривать представленные иммунологические характеристики в качестве дополнительных критериев диагностики фенотипов ХОБЛ. Предложенные иммунологические методы могут быть использованы для прогнозирования течения болезни и ответа на терапию ХОБЛ.

Иммунологические фенотипы больных ХОБЛ, стратифицированные по уровню Т-регуляторных клеток, представляют практический интерес для новых подходов к разработке индивидуальных режимов противовоспалительной терапии ХОБЛ.

Отдельные субпопуляции Т-регуляторных клеток могут представлять практический интерес в качестве мишеней для разработки новых фармакологических средств лечения ХОБЛ.

Результаты настоящей работы могут быть рекомендованы для включения в учебные программы дипломной и последипломной подготовки врачей-терапевтов и пульмонологов. Результаты работы могут быть использованы в аллергологических, соматических, пульмонологических отделениях учреждений здравоохранения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Т-регуляторные клетки играют важную роль в регуляции воспаления при ХОБЛ. Содержание С04+С025ЫвЬ повышено при разных фенотипах ХОБЛ, вне зависимости от стадии и стажа болезни, тендерных характеристик, что в целом отражает активацию иммуносупрессивных механизмов у пациентов. Изменение содержания Т-регуляторных клеток при ХОБЛ и бронхиальной астме имеет разнонаправленный характер: содержание Т-регуляторных клеток при ХОБЛ выше, чем в группе контроля, при бронхиальной астме -ниже контроля.

2. В основе разных фенотипов ХОБЛ лежат разные иммунологические механизмы регуляции воспаления с участием Т-регуляторных клеток. Высокий уровень CD4+FoxP3+ ассоциирован с фенотипом ХОБЛ, который характеризуется редкими дневными и ночными симптомами, коротким стажем болезни, низким нутритивным статусом, отсутствием прироста ОФВ1 при лечении. Повышенный уровень CD25+FoxP3+ у пациентов, страдающих ХОБЛ, ассоциирован с частыми обострениями, требующими назначения антибактериальной терапии. Персистенция инфекции в этой группе больных, возможно, связана с выраженностью иммуносупрессии с участием Т-регуляторных клеток.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на X международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009), V Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2010), XX Европейском ежегодном респираторном конгрессе (Барселона, 2010), XX Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2010), совещании кафедры госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (Томск, 2011).

Внедрение полученных результатов. Результаты работы применяются в учебном процессе на кафедре госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России для студентов лечебного факультета, интернов и ординаторов, в учебном процессе кафедры внутренних болезней педиатрического факультета ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России для студентов педиатрического факультета, интернов и ординаторов, в учебном процессе кафедры общей врачебной практики ФПК и ППС ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России для врачей общей практики. Полученные результаты используются в работе отделения пульмонологии ОГУЗ Томская областная клиническая больница.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 3 полнотекстовых журнальных статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение «Способ ранней диагностики хронической обструктивной болезни легких» от 16 февраля 2011г. (заявка №2010122238/15(031550) от 31 мая 2010г.).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), материалов и методов исследования (глава 2), глав собственных наблюдений (3 - 4 главы), обсуждения (глава 5), выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 29 таблицами. Список источников цитируемой литературы включает в себя 210 работ, из которых 24 отечественных и 186 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клинические группы

Согласно поставленным целям было обследовано 97 лиц в возрасте от 35 до 70 лет, 60 из которых имели диагноз ХОБЛ (13 пациентов со II стадией, 23 -с III стадией и 24 - с IV стадией заболевания), 20 - персистирующей среднетяжелой бронхиальной астмы (группа сравнения), 17 - здоровых добровольцев (группа контроля). Работа выполнена на базе кафедры госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (зав. каф. - д-р

мед. наук, профессор Г.Э. Черногорюк), отделения пульмонологии ОГУЗ Томская областная клиническая больница (зав. отделения пульмонологии -канд. мед. наук Е.А. Устюжанина, гл. врач - М.Н. Заюков). Иммунологические методы исследования проводились на базе подразделения иммунологии, гематологии и морфологии Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (заведующий -д-р мед. наук, профессор А.Н. Банков). Исследование выполнено в соответствии с протоколом, одобренным независимым локальным комитетом по этике ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (заключение № 1032 от 15.06.2009). Работа выполнена при частичной финансовой поддержке ФЦП ГК № 02.740.11.0083 и ГК№ 02.740.11.0716.

Критерии включения:

1. Мужчины и женщины в возрасте от 35 до 70 лет;

2. Получение от пациента до участия в исследовании письменного информированного согласия, подписанного с указанием даты;

3. Документально подтвержденный клинический диагноз хронической обструктивной болезни легких длительностью как минимум 6 месяцев перед началом исследования;

4. Диагноз ХОБЛ II - IV стадии стабильного течения (отсутствие обострения на момент визита 1 и на протяжении предыдущих 4 недель перед визитом 1), установленный на основании симптомов и данных спирометрии, согласно классификации GOLD 2009:

Стадия II. Среднетяжелая ХОБЛ - характеризуется ухудшением ограничения скорости воздушного потока (ОФВ1/ФЖЕЛ <0,70; 50% < ОФВ1 < 80% от должных значений) с одышкой, которая, как правило, развивается во время физической нагрузки, а также кашлем и продукцией мокроты;

Стадия III. Тяжелое течение ХОБЛ. Характеризуется выраженным ограничением скорости воздушного потока (ОФВ1/ФЖЕЛ <0,70; 30% < ОФВ1 < 50% от должных значений), усилением одышки, снижением способности к физическим нагрузкам, утомляемостью и повторяющимися обострениями, которые почти всегда влияют на качество жизни пациента;

Стадия IV. Крайне тяжелая ХОБЛ - характеризуется тяжелыми ограничениями скорости воздушного потока (ОФВ1/ФЖЕЛ <0,70; ОФВ1 <30% от должного или ОФВ1<50% от должного), в сочетании с хронической дыхательной недостаточностью или правожелудочковой недостаточностью;

5. Для группы сравнения (бронхиальная астма - БА): Документально подтвержденный диагноз «Бронхиальная астма, среднетяжелая персистирующая», установленный на основании симптомов и данных спирометрии, согласно классификации GINA 2009: объем терапии соответствует среднетяжелой астме, на фоне терапии: отсутствие дневных симптомов (или <2 эпизодов в неделю); отсутствие ограничений

повседневной активности, включая физические нагрузки; отсутствие ночных симптомов или пробуждений из-за БА; отсутствие потребности в препаратах неотложной помощи (или <2 эпизодов в неделю); нормальные или почти нормальные показатели функции легких; отсутствие обострений;

6. Для группы контроля: подходящие под определение «практически здоровые».

Фармакотерапевтические режимы

После включения в исследование больным ХОБЛ (п=60) была назначена базисная ингаляционная терапия, соответствующая степени тяжести болезни и рекомендациям регламентирующих документов [GOLD, 2009] (рис. 1).

Методы исследования

Клинико-анамнестические методы. Диагностика ХОБЛ и БА, оценка степени тяжести, а также оценка клинической эффективности терапии определялись согласно критериям документов GOLD, 2009 и GINA, 2009 путем объективного осмотра, ежедневного мониторирования симптомов, потребности в бронхолитиках, при помощи САТ-теста (COPD Assessment Test). Одышка оценивалась по шкале Médical Research Council Dyspnea Scale (MMRC), качество жизни больных с бронхо-легочной патологией по вопроснику для больных с заболеваниями органов дыхания госпиталя Святого Георгия (The St George's Respiratory Questionnaire, SGRQ).

4 недели ± 3 дня 8 недель ± 3 дня 12 недель ± 3 дня

Рис. 1. Схема исследования.

Оценка функции внешнего дыхания. Тест выполнялся в соответствии с требованиями ATS (American Thoracic Society - Американское Торакальное Общество) [Miller M.R., 2005].

Функциональные тесты. Для оценки функциональной состоятельности пациентов и эффективности лечения проводился тест 6-минутной ходьбы (6-MWD— 6 minute walking distance) в соответствии со стандартным протоколом. Для прогнозирования последующей выживаемости больных ХОБЛ проводили

вычисление индекса BODE (Body mass index, Obstruction, Dyspnea, Exercise -индекс массы тела, обструкция, одышка, физическая нагрузка). Для оценки гипертрофии и дилатации правых отделов сердца проводили двухмерную эхокардиографию (ЭхоКГ) по стандартной методике на аппарате Logiq 7 (GE Healthcare, Германия).

Цитологический метод. Цитологическое исследование индуцированной мокроты по стандартной методике: использовались мазки, окрашенные модифицированным методом Пигаревского [Пигаревский В.Е., 1981].

Иммунологические методы. Материалом для иммунологического исследования служила периферическая кровь с гепарином (20 мл), полученная от здоровых респондентов, больных ХОБЛ и среднетяжелой БА.

Выделение мононуклеаров периферической крови (МНПК) проводили путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (пл. 1,077 г/мл, Р052, ПанЭко, г.Москва). Выделенные мононуклеары окрашивали для последующего анализа на проточном цитофлюориметре (FACSCalibur Becton Dickinson, США), используя моноклональные антитела CD4 (FITC, «Сорбент», г. Москва), CD25 (РЕ-Су7, № 335824, BD Bioscinces, США) и FoxP3 (РЕ, № 556855, BD PharmingenTM, США). В рамках иммунологического обследования пациентов оценивали относительное содержание популяций Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+, CD4+CD25hig\ CD4+FoxP3+, CD25+FoxP3+) в периферической крови. Результат представлен в виде процентного содержания соответствующей субпопуляции лимфоцитов по отношению к гейтированным МНПК.

Статистические методы. Для статистической обработки результатов исследования использован пакет программ Statistica for Windows version 6.0. При сравнении частот качественных признаков использовался критерий у2 или 2-сторонний критерий Фишера. Для оценки различия средних в попарно не связанных выборках применяли U-критерий Манна-Уитни, в связанных -критерий Вилкоксона. Для сравнения показателей в трёх несвязанных группах проводили дисперсионный анализ ANOVA Крускала-Уоллиса, в трёх связанных - анализ Фридмана. Степень взаимосвязи между признаками оценивали, вычисляя коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Для оценки вероятностей использовалась программа Statcalc version 6.

Качественные данные представлены в виде абсолютных или относительных (%) частот, количественные в виде X ± х, где X - среднее арифметическое, х - ошибка среднего. Разницу значений считали значимой при р < 0,05. Данные группировались в соответствии с задачами исследования [Гланц С., 1999; Реброва О.Ю., 2002].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клинко-функциональная характеристика больных, включенных в исследование

Клиническая характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в табл. 1. Статистически значимых различий по возрасту и росту между группами пациентов с ХОБЛ, БА и здоровых зарегистрировано не было,

что свидетельствует об однородности сравниваемых выборок. Среди больных основной группы (ХОБЛ) превалировали мужчины (83%), пациенты группы сравнения (40% мужчин) и контроля (53% мужчин) были сопоставимы по полу. С момента установления диагноза в среднем прошло 10,7 ± 1,06 лет у больных ХОБЛ, что не отличалось от этого показателя в группе сравнения (БА). Больные II - IV стадий ХОБЛ стратифицировались на клинические фенотипы, согласно классификации предложенной Dornhorst A.C. и дополненную Burrows et al. (1966), в исследование было включено 13 пациентов с эмфизематозным фенотипом ХОБЛ, 28 пациентов с бронхитическим фенотипом, 19 пациентов со смешанным фенотипом. Основная группа характеризовалась более длительным стажем курения в сравнении со здоровыми и группой БА. Пациенты с ХОБЛ предъявляли жалобы на одышку (90% этой группы), ограничение физической активности - 90%, отделение мокроты - 73%, кашель - 65%, свистящее дыхание - 62% и ночные приступы удушья - 43%. Больные ХОБЛ и БА характеризовались более высоким индексом массы тела (ИМТ) в сравнении со здоровыми добровольцами. Пациенты основой группы обладали более низким питательным статусом по отношению к группе сравнения. Обратимость бронхиальной обструкции у обследованных пациентов с БА в тесте с бронхолитиком (прирост ОФВ1, %) составила 15,8±0,79% (373,5±20,02 мл), что является подтверждением основного диагноза. Толерантность к физической нагрузке у пациентов с ХОБЛ и БА была ниже в сравнении со здоровыми добровольцами (р<0,001). Уровень сатурации крови кислородом (Sp02), как исходный, так и после теста с 6-минутной ходьбой, у больных ХОБЛ был ниже, чем у здоровых. В группе контроля сатурация крови кислородом до и после пробы на толерантность к физической нагрузке была выше данного показателя в группе сравнения (БА).

При анализе клинико-функциональных параметров лиц основной группы, стратифицированных по тендерному признаку, выявлено, что женщины характеризовались более ранним началом и соответственно более длительным временем течения болезни (р<0,05). При этом анамнез по длительности и интенсивности курения (пачка-лет) у лиц женского пола был меньше, чем в группе мужчин (р<0,05). Следовательно, ХОБЛ у женщин инициируется при более коротком и менее интенсивном воздействием табачного дыма, по сравнению с мужчинами. Вероятно, у женщин заболевание протекает с более частыми эпизодами обострений: они чаще прибегали к вызову скорой медицинской помощи на протяжении предыдущего года (р<0,05), чаще получали курсы системных глюкокортикостероидов (р<0,05). Несмотря на то, что обе сравниваемых группы были сопоставимы по показателям ФВД (р>0,05), у женщин заболевание протекало с более выраженными клиническими симптомами. Женщины ниже, по сравнению с мужчинами, оценивали качество жизни по данным1 вопросника SGRQ (р<0,05). Кроме того, отмечали более выраженный уровень одышки (шкала MMRC, р<0,05), более высоким баллом оценивали влияние ХОБЛ на состояние здоровья согласно результатам САТ-теста (р<0,05). В тесте 6-MWD женщины проходили более короткий путь за отведенный отрезок времени (р<0,05). Это, наряду с высоким баллом по шкале

MMRC, способствовало росту индекса BODE (р<0,05), что в конечном итоге отражало более выраженную клинику болезни у женщин.

Анализ клинических параметров у пациентов с разными степенями тяжести было выявлено, что пациенты с IV стадией ХОБЛ имели более низкие параметры питательного статуса, показатели функции внешнего дыхания, толерантность к физической нагрузке и сатурацию крови кислородом.

Таблица 1

Клиническая характеристика пациентов и данные функциональных

Параметры ХОБЛ II-IV стадий (п=60) Среднетяжелая БА (п=20) Контроль (п=17)

Возраст (лет) 57,8 ± 1,10 54,1 ±2,17 52,9 ± 3,64

Продолжительность заболевания (лет) 10,7 ± 1,06 10,0 ± 1,64 -

Продолжительность курения (пачка-лет) 45,6 ±3,51* 4,7 ± 1,88 4,7 ±2,01

Индекс массы тела (кг/м2) 25,8 ± 0,65* 30,6 ± 1,93* 22,9 ± 0,78

ОФВ1, %к должным значениям 37,2 ± 1,88* 79,2 ±3,02* 103,4 ±2,42

ФЖЕЛ, % к должным значениям 61,2 ±2,49* 85,5 ±3,11** 100,4 ±2,21

ОФВ1/ФЖЕЛ, % 48,5 ± 1,39* 75,3 ±2,49* 87,1 ± 1,25

6-ММ), м 338,4 ±11,7* 380,0 ±21,9* 575,7 ± 15,6

8р02,до6-МШ> (%) 96,0 ±0,31* 97,6 ±0,18* 99,0 ±0,15

8р02, после 6-М\УО (%) 95,1 ± 0,45* 97,5 ±0,17* 98,8 ±0,10

Примечание:

*р<0,05 по сравнению с показателями в группе контроля

2. Иммунологическая характеристика обследованных лиц 2.1 Исследование популяции активированных Т-клеток (CD4+CD25+) периферической крови продемонстрировало более высокий (р<0,05) их уровень у пациентов с бронхо-обструктивными заболеваниями в сравнении с группой здоровых добровольцев. Как известно, экспрессия на клеточной мембране молекул CD25, являющихся а-цепью рецептора к ИЛ-2, характерна не только для субпопуляции Т-регуляторных клеток, но и для активированных Т-лимфоцитов [Hogg J.C., 2004]. Повышение уровня активированных CD4+CD25+ Т-лимфоцитов свидетельствует об их участии в поддержании

воспаления в дыхательных путях при БА и ХОБЛ. Показано, что С04+ Т-клетки находятся в большом количестве в дыхательных путях и легочной паренхиме при ХОБЛ. Хемотаксис клеток, отвечающих за врожденный (макрофаги, нейтрофилы и эозинофилы) и приобретенный (Т- и В-лимфоцитов) иммунный ответ в легких курильщиков при ХОБЛ, опосредован ТЫ направленностью дифференцировки СП4+ Т-клеток, и регулируется специфичными рецепторами хемокинов [ОгитеШ в., 2004].

% 9 -, 8 7 6 -

5 -4

3

2 H

8,37

8,1

2,82

1,87

1,56

«*

2,58

2,23

1,89

,56

CD4+CD25high

CD4+FoxP3+

CD25+FoxP3+

Ш ХОБЛ (n=60) □ БА (n=20) □ Контроль (n=l 7) .

Рис. 2. Уровень T-reg у пациентов, включенных в исследование

Примечание:

* р<0,05 по сравнению с показателями в группах контроля и среднетяжёлой БА,

** р<0,05 по сравнению с показателями в группах контроля и ХОБЛ

У человека супрессорной активностью обладает только малая часть CD4+ клеток, характеризующаяся высоким уровнем экспрессии С025-антигена (CD4+CD25hi8h) [Beacher-Allan С., 2001]. В связи с этим на следующем этапе работы определялся уровень CD4+CD25hlgh в периферической крови. Установлено, что уровень CD4+CD25hlsh Т-клеток у пациентов, страдающих ХОБЛ, составил 2,82±0,24%, вне зависимости от степени тяжести болезни и статистически значимо был выше такового в сравнении с группой пациентов, страдающих БА 1,87±0,47% (р=0,004) и группой контроля 1,56±0,24% (р=0,005) (рис. 2). Полученные нами результаты о повышении уровня CD4+CD25h'gh при ХОБЛ не противоречат данным литературы [Barcelô В., 2008; Bon J.M., 2009]. Так Roos-Engstrand Е. и соавторы (2009) продемонстрировали увеличение числа T-reg с фенотипом CD4+CD25h'gh в бронхо-альвеолярном лаваже у здоровых курящих, а также при ХОБЛ [Roos-Engstrand Е., 2009]. Другими авторами показано увеличение популяции CD4+CD25higb Т -reg у курильщиков с нормальной функцией легких в сравнении с группой здоровых некурящих и курящих при ХОБЛ [Barcelö В., 2008].

Специфичным внутриклеточным маркером идентификации индуцибельных T-reg считается транскрипционный фактор (factor forkhead box РЗ - FoxP3), который также важен для развития и функциональной активности T-reg [Fontenot J.D., 2005]. Продемонстрировано, что FoxP3 блокирует способность транскрипционных факторов NFAT и NFkB индуцировать их гены,

и, как следствие, подавляет транскрипцию гена ИЛ-2 и других генов провоспалительных цитокинов (ИЛ-4 и ИНФ-у), тем самым инактивируя иммунные клетки [Betteiii Е., 2005]. Дальнейший анализ фенотипа T-reg периферической крови показал, что пациенты, страдающие ХОБЛ, и здоровые участники сопоставимы по уровню T-reg с фенотипом CD4+FoxP3+ (р=0,500). В то же время продемонстрирована положительная корреляционная связь между относительным количеством CD4+FoxP3+ в периферической крови и продолжительностью (в годах) (г=0,31; р=0,017) и интенсивностью (пачка-лет) курения (г=0,32; р=0,01) в группе пациентов с ХОБЛ. В литературе также есть указания на положительную корреляцию между продукцией FoxP3 в крупных дыхательных путях и длительностью курения, согласно индексу курения [Isajevs S., 2009].

Сравнение процентного содержания в периферической крови Т-клеток отдельных фенотипов в обследуемых группах продемонстрировало, что как бронхиальная астма, так и ХОБЛ характеризуются активацией CD4+CD25+ Т-лимфоцитов. Вместе с тем, при БА отсутствие роста уровня CD4+CD25hlgh и низкое содержание CD4+FoxP3+ T-reg указывает на нарушение клеточно-опосредованных механизмов иммуносупрессии. Считается, что T-reg ингибируют развитие Т-клеток в направлении Th2, секретирующих ИЛ-4 [Фрейдлин И. С., 2005]. В литературе активно обсуждается вопрос о роли низкого уровня отдельных субпопуляций T-reg и их цитокинов - ИЛ-10, TGF-ß в развитии аллергических болезней [Hawrylowicz С.М., 2005; Lärche М., 2007].

Результаты дискриминантного анализа продемонстрировали значительные различия между группами контроля, астмы и ХОБЛ, как по функциональным, так и по иммунологическим характеристикам.

Таким образом, основной иммунологической характеристикой ХОБЛ является высокое процентное содержание CD4+CD25high Т -клеток в сравнении с пациентами, страдающими БА и группой контроля.

2.2 При сравнительном анализе уровней Т-регуляторных клеток у больных ХОБЛ разного пола и в зависимости от степени тяжести статистически значимых различий по отдельным субпопуляциям T-reg выявлено не было (р>0,05). Пациенты со стажем болезни более 5 лет характеризовались более высоким содержанием CD25+FoxP3 (2,57±0,42%) в сравнении с лицами со стажем болезни 5 лет и менее (1,68±0,29%) (р<0,05). Больные старше 60 лет характеризуются высоким уровнем (2,47±0,27%) клеток с фенотипом CD4+CD25hieh, что не выявлено у лиц 60 лет и младше (3,38±0,41%) (р<0,05). При этом содержание CD4+CD25hi8h повышено при ХОБЛ, вне зависимости от стадии и стажа болезни, тендерных характеристик, что в целом отражает активацию иммуносупрессивных механизмов у пациентов.

Проведенный анализ процентного содержания CD4+CD25+ клеток в периферической крови больных ХОБЛ с разными фенотипами не выявил статистически значимых отличий (р>0,05).

В группе пациентов с эмфизематозным фенотипом относительное количество регуляторных клеток CD4+CD25 gh (3,44±0,40%) было

статистически значимо выше по сравнению с группой лиц с бронхитическим (2,83±0,22%, р=0,021) и смешанным фенотипами ХОБЛ (2,38±0,22%, р=0,014). При этом высокий уровень С04+С025г"кг' клеток положительно коррелировал с редкими ночными симптомами, низким нутритивным статусом, отсутствием поражения сердечнососудистой системы у пациентов с ХОБЛ (рис. 3).

Статистически значимых различий при анализе С04+РохРЗ+ Т-ге§ между группами пациентов с разными вариантами течения ХОБЛ и когортой здоровых участников не выявлено.

В группе пациентов с бронхитическим вариантом течения ХОБЛ был увеличен уровень СЭ25+РохРЗ+ - клеток в сравнении с лицами, страдающими двумя другими вариантами течения болезни (рис. 3). Выявлена ассоциация низких значений обратимости бронхиальной обструкции при ХОБЛ и значимо высокого уровня СЭ25+РохРЗ+ клеток в периферической крови (р<0,05).

Фенотипы ХОБЛ - эмфизематозный, бронхитический и смешанный, отличаются по процентному содержанию отдельных субпопуляций регуляторных клеток периферической крови. Так, в случае эмфизематозного фенотипа ХОБЛ преобладают С04+СВ25Ы8\ тогда как бронхитический вариант течения болезни характеризуется высоким уровнем СЭ25+РохРЗ+ клеток.

^Эмфизематозный фенотип О Бронхитический фенотип О Смешанный фенотип

Рис. 3. Уровень Т-ге§ у пациентов с различными фенотипами ХОБЛ

Примечание:

* р<0,05 по сравнению с бронхитическим и смешанным фенотипами;

** р<0,05 по сравнению с эмфизематозным и смешанным фенотипами

Таким образом, содержание С134+С025'1"еЬ повышено при разных фенотипах ХОБЛ, вне зависимости от стадии и стажа болезни, тендерных характеристик, что в целом отражает активацию иммуносупрессивных механизмов у пациентов.

3. Динамика клинико-функциональных показателей на фоне использования базисной терапии у пациентов с ХОБЛ.

3.1 Исходно пациенты, получающие лечение в группах 1,2,3 были сопоставимы по клинико-функциональным параметрам (табл. 2).

Эффективность назначаемой терапии оценивали на основании клинико-функциональных критериев. Клиническую оценку эффективности выполняли с учетом показателей ФВД (ОФВ1), баллов MMRC, SGRQ, CAT, расчета индекса BODE.

Таблица 2

Клинические показатели (исходно и в динамике) у пациентов с ХОБЛ отдельных групп лечения, включённых в исследование

Исследуемые параметры 1 группа (п=20) 2 группа (п=20) 3 группа (п=20)

Исходно После лечения Исходно После лечения Исходно После лечения

1 2 3 4 5 6

Возраст (лет) 58,7± 1,51 - 58,7± 1,92 - 56,2± 2,24 -

Продолжительность заболевания (лет) 11,1± 1,58 - 13,1± 2,37 - 7,9± 1,27 -

Продолжительность курения (пачка-лет) 45,8± 6,05 - 47,9± 6,78 - 43,3± 5,60 -

Рост (см) 170,7± 170,7± 169,3± 169,4± 170,4± 170,4±

1,44 1,44 1,87 1,86 1,38 1,45

Вес (кг) 77,6± 77,9± 66,7± 66,2± 79,9± 80,9±

3,43 . 3,38 2,43 2,76 4,24 4,29

Индекс массы тела 26,5± 26,7± 23,3± 23,2± 27,4± 27,7±

(кг/м2) 1,02 1,03 0,91 1,04 1,26 1,27

Количество 0,08± 0,06± 0,09± 0,03± 0,09± 0,04±

госпитализаций (в 0,01 0,02 0,02 0,01 0,02 0,02*

месяц)

Оценка влияния, 49,6± 43,6± 56,5± 56,6± 48,4± 43,7±

Ба«} (балл) 4,92 4,29* 3,92 3,17 4,36 5,54

Балл САТ-теста 19,6± 19,3± 23,4± 24,0± ]9,5± 19,5±

1,71 1,68 1,83 1,60 2,04 1,96

Одышка по шкале 2,1± 2,1± 2,2± 2,3± 1,8± 1,7±

ММЯС 0,21 0,24 0,19 0,20 0,23 0,24

ОФВ1,% 33,2± 42,6± 39,0± 41,2± 39,5± 49,3±

2,59 3,39* 4,01 3,56 2,99 3,94*

ФЖЕЛ, % 56,2± 62,7± 66,6± 62,4± 60,8± 70,1±

3,79 3,41* 4,95 3,29* 3,99 4,06*

Примечание:

* р<0,05 по сравнению с исходными показателями

В результате лечения ХОБЛ на протяжении 6 месяцев в группе лечения 1 (Серетид в дозе 1000 мкг в сутки по ФП) и группе 3 (Беродуал) отмечена статистически значимая положительная, динамика клинико-функционапьных

показателей. Статистически значимых изменений клинико-функциональных параметров в когорте пациентов в группе лечения 2, получающих лечение Спиривой, отмечено не было (табл. 2).

3.2 В то же время в каждой из групп лечения были выявлены пациенты со снижением ОФВ1 за период наблюдения (24 недели) при регулярной терапии, соответствующей рекомендациям GOLD, 2009 и Клиническим рекомендациям (Пульмонология) под ред. А.Г. Чучалина, 2006 - 21 пациент.

Для определения факторов, ассоциированных с худшим эффектом лечения, когорта пациентов была разделена по факту прироста ОФВ1 к окончанию периода наблюдения. Установлено, что исходный уровень T-reg клеток пациентов, характеризующихся отсутствием прироста ОФВ1 к окончанию периода лечения, составлял 9,8±1,30% (CD4+FoxP3+) и 2,4±0,06% (CD25+FoxP3+). У больных, с приростом ОФВ1, исходный уровень Т-клеток с фенотипом CD4+FoxP3+ составлял 6,1±1,03% при уровне CD25+FoxP3+ -1,7±0,37%. Учитывая, что при разделении по исходу между группами были зарегистрированы статистически значимые отличия по уровню CD4+FoxP3+ клеток (9,8±1,30% vs 6,1±1,03%; р=0,012) и процентному содержанию CD25+FoxP3+ на момент включения (2,4±0,06% vs 1,7±0,37%; р=0,0195), была проведена стратификация пациентов по этим двум признакам.

В когорту пациентов с низкими показателями иммуносупрессии вошли пациенты с уровнем субпопуляции T-reg (CD4+FoxP3+)<7% (п=27). В группу с высокими регуляторными показателями были включены пациенты с уровнем субпопуляции T-reg (CD4+FoxP3+)>7% (n=33).

При стратификации больных ХОБЛ по уровню CD4+FoxP3+ T-reg установлено, что лица со значениями процентного содержания этих клеток менее 7%, характеризовались значимым снижением частоты симптомов (р<0,05), балла оценки «влияния» по SGRQ с 53,29±0,36 балла на Визите 1 до 48,24±4,13 балла на визите 4 (р=0,031); стабильным ростом ОФВ1 с 37,7±3,08% (Визит 1) до 46,63±3,39% (Визит 4) - критерий Фридмана р=0,00058; снижением индекса BODE с 4,10±0,37 балла (Визит 1) до 3,46±0,43 балла (Визит4) (р=0,045). Особенно выраженный прирост ОФВ1 отмечался в группах лечения 1 и 3. У больных ХОБЛ со значениями уровня CD4+FoxP3+ выше 7% положительной динамики клинико-функциональных параметров в результате 24-недельного лечения во всех трех группах терапии не наблюдалось (р>0,05).

Таким образом, исходно низкое содержание CD4+FoxP3+ клеток при ХОБЛ ассоциировано с уменьшением клинических проявлений болезни (частоты симптомов, интенсивности одышки, индекса BODE, оценки «влияния» по SGRQ) в результате лечения. Исходно высокое относительное содержание CD4+FoxP3+ субпопуляции Т-клеток (>7% гейтированных мононуклеаров периферической крови) ассоциировано с худшим ответом на базисную терапию.

При стратификации пациентов, страдающих ХОБЛ, по содержанию CD25+FoxP3+ выявлено, что уровень этих клеток более 2% (п=20) увеличивал вероятность возникновения обострения ХОБЛ, требующего назначения

антибактериальной терапии в 4,5 раза ((Ж 4,50; 95% С1 1,20-17,81), в сопоставлении с лицами, имеющими уровень С025+РохРЗ+ менее 2% (п=40).

Таким образом, больные ХОБЛ с исходно высоким уровнем С025+РохРЗ+ клеток в периферической крови на фоне базисного лечения характеризуются неблагоприятным течением болезни (частые обострения, требующие назначения антибактериальной терапии).

Высокий уровень иммуносупрессии при ХОБЛ ассоциирован с низким эффектом противовоспалительной терапии.

Концепция работы

При ХОБЛ в ответ на постоянный контакт с факторами табачного дыма и чрезмерную продукцию провоспалительных цитокинов участниками иммунного ответа (МФ, НФ, ТЫ, В-лимфоцитами) инициируется недостаточно контролируемое хроническое воспаление. Наряду с этим происходит компенсаторная активация T-reg и запуск в них генетической программы клеточно-клеточного механизма ингибирования Т-эффекторных клеток посредством экскреции Гранзимов А и В. Следствием этого является запуск программы апоптоза в Т-клетках. Течение и прогноз заболевания при гетерогенных клинических фенотипах различны. Наиболее благоприятно события развиваются при эмфизематозном типе. Это связано с двумя основными обстоятельствами. Во-первых, достаточная альвеолярная вентиляция не инициирует тотальный спазм артериол малого круга кровообращения в результате чего длительное время не развивается синдром легочного сердца. Во-вторых, не происходит гиперпродукции мокроты, что препятствует инфекционному процессу. При бронхитическом варианте течения ХОБЛ из-за дискринии и нарушения клиренса мокроты, имеет место выраженная тотальная бронхообструкция с нарушением вентиляции альвеол. Альвеолярная гипоксия включает рефлекс тотального спазма артериол малого круга и последующую перегрузку правых отделов сердца. Кроме того избыточная продукция мокроты и нарушение ее клиренса способствует бактериальной колонизации дыхательных путей.

Возможно, что в основе различных сценариев развития болезни лежат генетически детерминированные особенности иммунного ответа. Повреждение бронхиального эпителия сигаретным дымом у отдельных предрасположенных к ХОБЛ лиц приводит к избыточному синтезу провоспалительных цитокинов, в частности ИЛ-8, ФНО, ИНФ-гамма, привлечению в ткань большого количества нейтрофилов и макрофагов, что инициирует по принципу обратной связи активацию и созревание Т-регуляторных клеток. Так, у всех пациентов, страдающих ХОБЛ, имеет место высокий уровень СВ4+СВ25Ь'8Ь. Этот пул клеток путем клеточно-клеточного взаимодействия и при помощи продуцируемых цитокинов препятствует созреванию эффекторных клеток, способствует запуску программы апоптоза в созревших ТЬ, нейтрофилах. Подтверждением этому является высокое процентное содержание С04+С025Ь'6Ь и СЭ4+РохРЗ+ у курящих, а также положительная ассоциация уровней СВ4+СВ25Ь'8Ь и СБ4+РохРЗ+ с длительностью и интенсивностью

курения. У отдельной когорты пациентов активное неконтролируемое нейтрофильное воспаление приводит к излишнему накоплению клеток, продуцирующих РохРЗ (ингибитор продукции провоспалительных цитокинов на внутриклеточном уровне - антагонист №АТ). Повышенный уровень СБ25+РохРЗ+ у пациентов, страдающих ХОБЛ, ассоциирован с частыми обострениями, требующими назначения антибактериальной терапии. Персистенция инфекции в этой группе больных, возможно, связана с выраженностью иммуносупрессии с участием Т-регуляторных клеток, что снижает местную защиту и может быть причиной колонизации респираторного тракта инфекционными агентами (рис. 4).

Рис. 4. Каскад активации Т-регуляторных клеток при ХОБЛ

Нарушение процесса созревания дендритной клетки (ДК) под воздействием сдерживающего влияния T-reg (связывание MHC-II на поверхности ДК LAG-3, продукция IDO при контакте CTLA-4 - CD80/CD86) может приводить к «неполной» стимуляции зрелых ThO на периферии и давать начало популяции индуцибельных T-reg, продуцирующих преимущественно TGF-p. При дифференцировке ThO в условиях наличия TGF-p происходит формирование индуцибельных T-reg с цитокиновым механизмом действия. Повреждение эпителия дыхательных путей также приводит к продукции TGF-P в целях репарации поврежденных тканей. Наряду с противовоспалительными эффектами, TGF-P стимулирует фибробласты, увеличивая продукцию ими белков межклеточного матрикса (коллагена и фибронектина). Так как процесс повреждения при ХОБЛ носит хронический характер, в условиях избыточного количества TGF-P происходит нарушение процессов репарации легочной ткани, фиброз и, как следствие, ремоделирование ткани легкого. Так, уровень TGF-P в

периферической крови у больных ХОБЛ положительно коррелирует со степенью необратимой обструкции дыхательных путей [Суркова Е.А., 2008].

Воспаление при БА имеет ряд особенностей, характерных для всех аллергических заболеваний. К этим особенностям относятся активация тучных клеток, увеличение количества активированных эозинофилов, Т-лимфоцитов -естественных киллеров, экспрессирующих инвариантный рецептор Т-клеток, а также Th2, высвобождающих медиаторы, участвующие в развитии симптомов заболевания. Так, при БА воспаление, преимущественно с вовлечением Th2, теряет контроль в отсутствии достаточного количества T-reg.

Полученные новые сведения могут быть теоретическим обоснованием клеточно-молекулярных механизмов развития ХОБЛ и формирования вариантов её клинического течения.

Таким образом, клинический полиморфизм хронической обструктивной болезни легких подтвержден новыми фундаментальными данными, раскрывающими дифференцированный вклад иммунологических механизмов воспаления.

ВЫВОДЫ

1. Хроническая обструктивная болезнь легких характеризуется высоким уровнем иммуносупрессивных клеток с фенотипом CD4+CD25h,gh при сопоставлении с группами контроля и сравнения (бронхиальная астма).

2. При ХОБЛ высокий уровень CD4+CD25h,gh клеток ассоциирован с редкими ночными симптомами, низким нутритивным статусом пациентов. С низкими показателями обратимости бронхиальной обструкции при ХОБЛ ассоциирован значимо больший уровень CD25+FoxP3+ клеток в периферической крови.

3. Больные ХОБЛ с исходно высоким уровнем CD25+FoxP3+ клеток в периферической крови на фоне базисного лечения характеризуются неблагоприятным течением болезни (частые обострения, требующие назначения антибактериальной терапии). Исходно низкое содержание CD4+FoxP3+ клеток при ХОБЛ ассоциировано с уменьшением клинических проявлений болезни (частоты симптомов, интенсивности одышки, индекса BODE, оценки «влияния» по SGRQ) в результате лечения. Исходно высокое относительное содержание CD4+FoxP3+ субпопуляции Т-клеток (>7% гейтированных мононуклеаров периферической крови) ассоциировано с худшим ответом на базисную терапию (отсутствие прироста ОФВ1, снижения индекса BODE).

4. Хроническая обструктивная болезнь легких характеризуется высоким уровнем иммуносупрессии, что отрицательно сказывается на эффективности противовоспалительной терапии. С позиции полученных новых данных о регуляции иммунного ответа при ХОБЛ в когорте пациентов с исходно низкими уровнями CD4+FoxP3+ предпочтительным является назначение базисной противовоспалительной терапии в связи с лучшим терапевтическим эффектом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Диагностику фенотипов ХОБЛ рекомендуется дополнить стратификацией пациентов по уровню субпопуляций Т-регуляторных клеток CD4+FoxP3+. Так в когорте больных с высоким уровнем CD4+FoxP3+, характеризующихся редкими дневными и ночными симптомами, коротким стажем болезни, низким нутритивным статусом, следует ожидать отсутствие прироста спирометрических показателей при назначении базисной терапии.

2. Пациентам с вариантом течения ХОБЛ, характеризующимся уровнем CD4+FoxP3+ более 7% необходимо отдавать предпочтение комбинированным лекарственным формам (длительнодействующие ß2-агонисты в комбинации с ингаляционными глюкокортикостероидами).

3. При организации и проведении мониторирования больных ХОБЛ учитывать высокую вероятность развития обострений ХОБЛ, требующих назначения антибактериальной терапии у лиц с уровнями CD25+FoxP3+ более 2%.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Обострение хронической обструкгивной болезни легких: функциональная активность нейтрофилов индуцированной мокроты и региона асептического воспаления [Текст] / И.А. Баулина, H.A. Иванова, И.А. Мандель и др. // Сборник статей по материалам Всероссийской 64-й итоговой научной конференции им. Н.И. Пирогова. - 2005. - С. 141 - 142.

2. Функциональная активность нейтрофилов индуцированной мокроты, региона асептического воспаления при хронической обструкгивной болезни легких и у здоровых с критическим индексом курения [Текст] / C.B. Федосенко, И.А. Мандель, H.A. Иванова и др. // Сборник статей по материалам Всероссийской 64-й итоговой научной конференции им. Н.И. Пирогова. - 2005. - С. 171 - 172.

3. Системные отношения миелопероксидазной активности нейтрофилов различных регионов с клиническими характеристиками хронической обструкгивной болезни легких [Текст] / C.B. Федосенко, H.A. Иванова, К.О. Пелымская и др. // Сборник статей по материалам Всероссийской 65-й итоговой научной конференции им. Н.И. Пирогова. - 2006. - С. 225 - 227.

4. Проявление внеантибиотических свойств кларитромицина при обострении хронической обструктивной болезни легких [Текст] / C.B. Федосенко, H.A. Кириллова, Г.Э. Черногорюк и др. // Научные труды X международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации: инновационные технологии в биологии и медицине». -Москва. - 2009. - С. 772.

5. Апоптоз нейтрофилов в регионе асептического воспаления как проявление системной реакции при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) [Текст] / H.A. Кириллова, C.B. Федосенко, Г.Э. Черногорюк и др. // Научные труды X международного конгресса «Здоровье и образование в

XXI веке; концепции болезней цивилизации: инновационные технологии в биологии и медицине». - Москва. - 2009. - С. 773.

6. The improvement of the macrophages morphological characteristics in bronchial region in stable COPD patients under the influence of tiotropium bromide [Текст] / C.B. Федосенко, Г.Э. Черногорюк, H.A. Кириллова и др. // Сборник тезисов XX Европейского ежегодного респираторного конгресса. - Барселона. - 2010г. - С. 719.

7. Малая величина макрофагов индуцированной мокроты — предиктор формирования хронической обструктивной болезни легких у курящих [Текст] / Г.Э. Черногорюк, Е.П. Рослякова, H.A. Кириллова и др. // Материалы V Национального конгресса терапевтов. - 2010. - С. 248-249.

8. Уровень Т-регуляторных клеток при разных фенотипах хронической обструктивной болезни легких [Текст] / H.A. Кириллова, Е.Э. Кремер, И.А. Деев и др. // Материалы V Национального конгресса терапевтов. - 2010. -С. 282.

9. Иммунорегуляторные Т-клетки при хронической обструктивной болезни легких и бронхиальной астме [Текст] / Л.М. Огородова, Г.Э. Черногорюк, H.A. Кириллова и др. // Материалы V Национального конгресса терапевтов. - 2010. - С. 288.

10. Изменения нутритивного статуса и дисфункция скелетных мышц при ХОБЛ - взгляд на проблему у российских пациентов [Текст] / М.С. Санжаровская, А.Ю. Фисенко, H.A. Кириллова и др. // Сборник трудов XX Национального конгресса по болезням органов дыхания. - 2010. - С. 430.

11. Влияние тиотропия бромида, на цитоморфометрические характеристики макрофагов индуцированной мокроты у больных хронической обструктивной болезнью легких [Текст] / H.A. Кириллова, Г.Э. Черногорюк, C.B. Федосенко и др. // Сборник трудов XX Национального конгресса по болезням органов дыхания. - 2010. - С. 435.

12. Внеантибиотические эффекты макролидов в лечении обострений хронической обструктивной болезни легких [Текст] / Г.Э. Черногорюк, C.B. Федосенко, H.A. Кириллова и др. // Сборник трудов XX Национального конгресса по болезням органов дыхания. - 2010. - С. 436.

13. Федосенко, C.B. Влияние тиотропия бромида на качество жизни больных ХОБЛ тяжелого и очень тяжелого течения [Текст] // C.B. Федосенко, Г.Э. Черногорюк, H.A. Кириллова // Сборник трудов XX Национального конгресса по болезням органов дыхания. -2010. - С. 439.

14. Динамика газовыделений больных тяжелой бронхиальной астмой на фоне базисной противовоспалительной терапии [Текст] / Л.А. Краснобаева, П.А. Селиванова, H.A. Кириллова и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2010. - №6. - С. 55-61.

15. Субпопуляции Т-регуляторных клеток при бронхиальной астме и гетерогенных фенотипах хронической обструктивной болезни легких [Текст] // H.A. Кириллова, И.А. Деев, Е.Э. Кремер и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - №1. - С. 48 - 54.

16. Федосенко, С.В. Влияние лечения тяжелой хронической обструктивной болезни легких тиотропия бромидом на коморбидные соматогенные тревожно-депрессивные расстройства [Текст] / С.В. Федосенко, Н.А. Кириллова // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - №1. - С. 92 - 96.

17. Уровень Т-регуляторных клеток при разных фенотипах хронической обструктивной болезни легких [Текст] / Н.А. Кириллова, Е.Э. Кремер, И.А. Деев и др. // Терапевт. - 2011. - №2. - С. 45.

Условные сокращения

БА - бронхиальная астма

ДК - дендритная клетка

ИКС - ингаляционные кортикостероиды

ИЛ - интерлейкин

ИМТ - индекс массы тела

ИНФ - интерферон

МНПК - мононуклеары периферической крови

ОФВ1 - объём форсированного выдоха за первую секунду

CAT - COPD Assessment Test (тест оценки ХОБЛ)

ФВД - функция внешнего дыхания

ФЖЕЛ - функциональная жизненная емкость легких

ФП - флутиказона пропионат

ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких

ЭхоКГ - двухмерная эхокардиография

6-MWD - 6 minute walking distance (тест 6-минутной ходьбы)

BODE - Body mass index, Obstruction, Dyspnea, Exercise (индекс массы тела, обструкция, одышка, физическая нагрузка) CI - confidence interval

CTLA-4 - Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4 (антиген цитотоксических Т-лимфоцитов) FoxP3 - factor forkhead box P3

GINA - Global Initiative for asthma (регламентирующий документ «Глобальная инициатива по астме»)

GOLD - Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (регламентирующий документ «Глобальная инициатива по ХОБЛ»)

IDO - indoleamine 2,3-dioxygenase (индолеамин 2,3 - диоксигеназа)

LAG-3 - lymphocyte-activation gene 3 (ген активации лимфоцитов - 3)

MHC-II - major histocompatibility complex class II (главный комплекс гистосовместимости

класс 2)

MMRC - Medical Research Council Dyspnea Scale (модифицированная шкала одышки Медицинского исследовательского совета)

NFAT - nuclear factor of activated T cells (ядерный фактор активации Т-клеток) NFkB - nuclear factor-кВ (ядерный фактор кВ)

SGRQ - the St George's Respiratory Questionnaire, вопросник госпиталя Святого Георгия TGF-p - transforming growth factor beta (трансформирующий фактор роста бета) Th - T-helper (Т-хелпер)

T-reg - T-regulatory cells (Т-регуляторные клетки)

Выражаю благодарность д-ру мед. наук, профессору, член-корреспонденту РАМН Огородовой Людмиле Михайловне за участие в научной дискуссии по результатам проведенного исследования.

Подписано в печать 12.05.2011 г. Усл.печ.листов 0,65 Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-08 Заказ №179 Тираж 100 экземпляров

Актуальность проблемы

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) - является одной> из важнейших проблем здравоохранения. В России, по официальным данным Минздравсоцразвития, зарегистрированы более 2 миллионов больных ХОБЛ, в то же время по данным эпидемиологических исследований это число может превышать 11 миллионов человек [13]. Неутешительный факт — тенденция к росту заболеваемости и смертности от ХОБЛ. Так по прогнозам «Исследования глобального ущерба от заболеваний» [73; 149] ХОБЛ, к 2020 г. выйдет на третье место среди причин смерти от хронических заболеваний, в то время как в 1990 г. находилась на шестом.

В настоящее время особый интерес представляет наличие гетерогенных фенотипов ХОБЛ, различающихся по симптомам респираторного заболевания и состоянию здоровья, частоте и типу обострений, функции легких, структурным изменениям, местному и системному воспалению, ответу на терапию, а также системным проявлениям [16, 158]. Еще в XIX веке А.С.ОогпЬогз^ В, Виггоуб, Теппег и С. П. Боткин, предложили выделять три основных фенотипа болезни: эмфизематозный, бронхитический и смешанный [1, 90]. Различные проявления болезни - фенотипы, вызванные одним повреждающим фактором (сигаретный дым), свидетельствуют о наличии отличных биомолекулярных и клеточных путей в патогенезе ХОБЛ. В литературе активно обсуждаются причины поддержания персистирующего воспаления при ХОБЛ [23, 42, 49, 53, 87, 137], но часто не принимается во внимание клиническая и патогенетическая гетерогенность болезни. В последнее время все большее внимание уделяется изучению регуляторной субпопуляции Т-клеток, идентифицированной как Т-регуляторные клетки (Т-ге§), которые способны оказывать супрессорное влияние на различные типы иммунокомпетентных клеток - эффекторные Т-клетки, дендритные клетки, мононуклеары, нейтрофилы [80, 173]. Основными маркерами Т-ге^ является

С025 и БохРЗ. Ряд авторов изучали содержание и функциональную актив6 ность Т-ге§ в периферической крови и жидкости бронхоальвеолярного лава-жа (БАЛ) у пациентов с ХОБЛ, курящих без бронхиальной обструкции и здоровых некурящих [82, 128, 157]. Однако в настоящее время отсутствуют данные об иммунологических особенностях, лежащих в основе клинической гетерогенности ХОБЛ.

Таким образом, можно говорить о наличии отличающихся друг от друга фенотипов ХОБЛ, характеризующихся разными клиническими, функциональными, морфологическими проявлениями, локализацией воспаления. В то же время недостаточно фундаментальных данных, демонстрирующих особенности иммунного ответа при отдельных клинических фенотипах данной болезни. Представляет интерес предопределение направлением иммунного ответа течения ХОБЛ, скорости прогрессировать данного заболевания, частоты обострений и ответа на базисную терапию. Изучение фенотипических особенностей больных ХОБЛ с позиции регуляции иммунного ответа и разработка патогенетически обоснованных фармакологических режимов представляет значительный научный и практический интерес.

Цель

Установить роль субпопуляций Т-регуляторных клеток в формирова нии и поддержании воспаления при хронической обструктивной болезни легких для разработки оптимальной стратегии лечения.

Задачи

1. Определить уровень отдельных субпопуляций Т-регуляторных клеток периферической крови методом проточной цитофлюориметрии с использованием панели моноклональных антител СВ4+/СБ25+/РохРЗ+ у больных ХОБЛ, в группах сравнения (бронхиальная астма) и контроля

2. Определить ассоциацию уровней отдельных субпопуляций Тг • регуляторных клеток с клинико-функциональными параметрами и фенотипами ХОБЛ. Установить зависимость уровня Т-регуляторных кле7 t ток от возраста, тендерной принадлежности, стажа и стадии болезни

3. Оценить динамику течения ХОБЛ на фоне базисной терапии и сопоставить полученные клинические данные с уровнем отдельных субпопуляций Т-регуляторных клеток

4. Систематизировать роль Т-регуляторных клеток в регуляции воспаления у больных хронической обструктивной болезнью легких для оптиt мизации подходов к базисной терапии

Научная новизна

Впервые показано, что изменение содержания Т-регуляторных клеток при ХОБЛ и бронхиальной астме в крови имеет разнонаправленный характер. Продемонстрировано, что содержание Т-регуляторных клеток при ХОБЛ выше, чем в группе контроля, а при бронхиальной астме — ниже контрольных значений.

Впервые показано, что клинический ответ на бронхолитическую и противовоспалительную терапию при различных фенотипах ХОБЛ связан с различным содержанием иммуносупрессивных лимфоцитов крови.

Впервые показана возможность стратификации больных ХОБЛ по уровню субпопуляций Т-регуляторных клеток для прогнозирования течения болезни и ответа на базисную терапию.

Впервые установлена связь исходно высокого уровня CD25+FoxP3+ клеток в периферической крови у больных ХОБЛ с неблагоприятным течением болезни на фоне базисного лечения (частые обострения, требующие назначения антибактериальной .терапии). Выявлена ассоциация низкого содержания CD4+FoxP3+ клеток при ХОБЛ с уменьшением клинических проявлений болезни (частоты симптомов, интенсивности одышки, индекса BODE, оценки «влияния» по вопроснику госпиталя Святого Георгия) в результате лечения.

Впервые продемонстрировано, что исходно высокое относительное содержание CD4+FoxP3+ субпопуляции Т-клеток (>7% гейтированных моно8 нуклеаров периферической крови) ассоциировано с худшим ответом на баг зисную терапию. I

Практическая значимость

Результаты исследования позволяют рассматривать представленные иммунологические характеристики в качестве дополнительных критериев диагностики фенотипов ХОБЛ. Предложенные иммунологические методы могут быть использованы для прогнозирования течения болезни и ответа на терапию ХОБЛ.

Иммунологические фенотипы больных ХОБЛ, стратифицированные по уровню Т-регуляторных клеток, представляют практический интерес для новых подходов к разработке индивидуальных режимов противовоспалительной терапии ХОБЛ. .

Отдельные субпопуляции Т-регуляторных клеток могут представлять практический интерес в качестве мишеней для разработки новых фармакологических средств лечения ХОБЛ.

Результаты настоящей работы могут быть рекомендованы для включер ния в учебные программы дипломной и последипломной подготовки врачей-терапевтов и пульмонологов. Результаты работы могут быть использованы в аллергологических, соматических, пульмонологических отделениях учреждений здравоохранения.

Внедрение

Результаты работы применяются в учебном процессе на кафедре госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России для студентов лечебного факультета, интернов и ординаторов, в учебном процессе кафедры внутренних болезней педиатрического факультета ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России для студентов педиатрического факультета, интернов и ординаторов, в учебном процессе кафедры общей врачебной практики

ФПК и ППС ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России для врачей общей практики. Полученные результаты используются в работе отделения пульмонологии ОГУЗ Томская областная клиническая больница.

Положения, выносимые на защиту

1. Т-регуляторные клетки играют важную роль в регуляции воспаления при ХОБЛ. Содержание С04+СВ25Ь'8Ь повышено при разных фенотипах ХОБЛ, вне зависимости от стадии и стажа болезни, тендерных характеристик, что в целом отражает активацию иммуносупрессивных механизмов у пациентов. Изменение содержания Т-регуляторных клеток при ХОБЛ и бронхиальной астме имеет разнонаправленный характер: содержание Т-регуляторных клеток при ХОБЛ выше, чем в группе контроля, при бронхиальной астме - ниже контроля.

2. В основе разных фенотипов ХОБЛ лежат разные иммунологические механизмы регуляции воспаления с участием Т-регуляторных клеток. Высокий уровень СЭ4+РохРЗ+ ассоциирован с фенотипом ХОБЛ, который характеризуется редкими дневными и ночными симптомами, коротким стажем болезни, низким нутритивным статусом, отсутствием прироста ОФВ1 при лечении. Повышенный уровень СВ25+РохРЗ+ у t пациентов, страдающих ХОБЛ, ассоциирован с частыми обострениями, требующими назначения антибактериальной терапии. Персистенция инфекции в этой группе больных, возможно, связана с выраженностью иммуносупрессии с участием Т-регуляторных клеток.

Апробация

Основные результаты работы доложены и обсуждены на X международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009), V Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2010), XX Европейском ежегодном респираторном конгрессе (Барселона, 2010), XX Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2010), совещании кафедры

10 госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (Томск, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 3 публикации «Перечня.» ВАК РФ.

Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение «Способ ранней диагностики хронической обструктивной болезни легких» от 16 февраля 2011г. (заявка №2010122238/15(031550) от 31 мая 2010г.).

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке ФЦП ГК №

02.740.11.0083 и ФЦП ГК № 02.740.11.0716.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц, иллюстрирована 27 рисунками и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), материалов и методов исследования (глава 2), результатов исследования (главы 3, 4), обсуждения (глава 5), выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиографический указатель содержит 210 источников литературы, из которых 24 на русском языке, 186 на английском языке.

выводы

1. Хроническая обструктивная болезнь легких характеризуется высоким уровнем иммуносупрессивных клеток с фенотипом CD4+CD25hlgh при сопоставлении с группами контроля и сравнения (бронхиальная астма).

2. При ХОБЛ высокий уровень CD4+CD25hlgh клеток ассоциирован с редкими ночными симптомами, низким нутритивным статусом пациентов. С низкими показателями обратимости бронхиальной обструкции при ХОБЛ ассоциирован значимо больший уровень CD25+FoxP3+ клеток в периферической крови.

3. Больные ХОБЛ с исходно высоким уровнем CD25+FoxP3+ клеток в периферической крови на фоне базисного лечения характеризуются неблагоприятным течением болезни (частые обострения, требующие назначения антибактериальной терапии). Исходно низкое содержание CD4+FoxP3+ клеток при ХОБЛ ассоциировано с уменьшением клинических проявлений болезни (частоты симптомов, интенсивности одышки, индекса BODE, оценки «влияния» по SGRQ) в результате лечения. Исходно высокое относительное содержание CD4+FoxP3+ субпопуляции Т-клеток (>7% гейтированных мононуклеаров периферической крови) ассоциировано с худшим ответом на базисную терапию (отсутствие прироста ОФВ1, снижения индекса BODE).

4. Хроническая обструктивная болезнь легких характеризуется высоким уровнем иммуносупрессии, что отрицательно сказывается на эффективности противовоспалительной терапии. С позиции полученных новых данных о регуляции иммунного ответа при ХОБЛ в когорте пациентов с исходно низкими уровнями CD4+FoxP3+ предпочтительным является назначение базисной противовоспалительной терапии в связи с лучшим терапевтическим эффектом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Диагностику фенотипов ХОБЛ рекомендуется дополнить стратификацией пациентов по уровню субпопуляций Т-регуляторных клеток С04+РохРЗ+. Так в когорте больных с высоким уровнем С04+РохРЗ+, характеризующихся редкими дневными и ночными симптомами, коротким стажем болезни, низким нутритивным статусом, следует ожидать отсутствие прироста спирометрических показателей при назначении базисной терапии.

2. Пациентам с вариантом течения ХОБЛ, характеризующимся уровнем С04+РохРЗ+ более 7% необходимо отдавать предпочтение комбинированным лекарственным формам (длительнодействующие 62-агонисты в комбинации с ингаляционными глюкокортикостероидами).

3. При организации и проведении мониторирования больных ХОБЛ учитывать высокую вероятность развития обострений ХОБЛ, требующих назначения антибактериальной терапии у лиц с уровнями С025+РохРЗ+ более 2%.